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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur prophylaktischen und/oder
therapeutischen Behandlung der Alzheimerschen Krankheit (Morbus Alzheimer).
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Die
Alzheimer Krankheit stellt mit 50-70% aller Demenzerkrankungen die
häufigste
neurodegenerative Erkrankung dar. Neben dem persönlichen Leid handelt es sich
bei der Alzheimer Krankheit um ein enormes sozialmedizinisches und
volkswirtschaftliches Problem, denn die klinische Phase kann sich über einen
Zeitraum von mehr als 15 Jahren erstrecken kann, und die betroffenen
Patienten sind während
dieser Zeit häufig
auf fremde Hilfe angewiesen, so dass gewaltige Pflegekosten entstehen.
Hinzu kommt, dass die durchschnittliche Lebenserwartung aufgrund
der verbesserten Hygiene, Ernährung und
medizinischen Versorgung weiter ansteigt. Mit zunehmendem Alter
steigt aber auch die Zahl der Demenzerkrankten. Im Fall der Alzheimer
Krankheit steigt die Prävalenzrate
von 4 % bei den 70- bis 74-jährigen
auf etwa 30% bei den 85- bis 89-jährigen.
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Neuropathologisch
ist die Alzheimer Krankheit (AD) durch das massive Auftreten von
Proteinablagerungen in den Gehirnen von Alzheimer Patienten gekennzeichnet.
Diese Ablagerungen treten in Form von extrazellulären amyloiden
Plaques (amyloid plaque core, APC), intrazellulären Fibrillen in Neuronen (neurofibrillary
tangles, NFT) und als vaskuläres
Amyloid in den Wänden
der Blutgefäße (amyloid of
the congophilic angiopathy, ACA) auf. Hauptbestandteil der amyloiden
Plaques sowie des vaskulären
Amyloid ist das Peptid Aβ.
Die Primärstruktur
von Aβ und
Isolationsverfahren zur Gewinnung von Aβ sind bekannt.
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Aβ entsteht
durch den enzymatischen Abbau des Amyloid-Vorläufer-Proteins APP (amyloid
precursor protein), eines glykosylierten TypI-Transmembranproteins,
welches Mitglied einer Familie homologer Proteine darstellt.
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APP
wird innerhalb seiner Ektodomäne durch
die Sekretasen α und γ oder β und γ zu Aβ-Peptiden
prozessiert.
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Die γ-Sekretase
Prozessierung führt
primär zur
Freisetzung des 40 bzw. 42 Aminosäuren langen Peptids Aβ (Aβ40 und Aβ42). Aβ Peptide,
die sowohl in der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) als auch im Nährmedium
eukaryontischer Zellkulturen nachgewiesen werden können, enden
zum größten Teil
mit Aminosäure
Val40, lediglich ein kleiner Teil endet mit Aminosäure Ala42.
Dennoch kann Aβ42
aufgrund folgender Befunde als die pathogene Aβ Spezies der Alzheimer Krankheit
bezeichnet werden: Erstens, die amorphen und neuritischen Plaques
im Gehirn von Alzheimer Patienten und Down-Syndrom Patienten enthalten überwiegend
Aβ42. Zweitens,
die beiden zusätzlichen
Aminosäuren
Ile41 und Ala42 führen dazu,
dass Aβ42
deutlich hydrophober ist als Aβ40 und
in vitro schneller aggregiert als Aβ40. Drittens, Patienten mit
einer erblichen Form der Alzheimer Krankheit und frühen klinischen
Symptomen besitzen im Vergleich zu Patienten mit sporadischer Alzheimer Krankheit
erhöhte
Aβ42 Konzentrationen
in der Cerebrospinalflüssigkeit.
Viertens, die meisten Mutationen bei der erblichen Form der Alzheimer
Krankheit (FAD Mutationen) führen
zu einer Verschiebung des Aβ42/40
Verhältnisses
zugunsten der längeren
Aβ Spezies
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Die
bisherigen Therapien der Alzheimer Krankheit basieren auf einem
symptomatischen Ansatz und lassen sich in folgende Strategien gliedern.
- 1. Cholinerge Strategien: Durch Cholinesterase-Hemmer
und Muskarin-M1-Agonisten
wird die Konzentration des Neurotransmitters Acetylcholin kurz-
und mittelfristig erhöht.
Typische Vertreter sind Donepezil, Rivastigmin und Galanthamin. Diese
führen
zu einer kurzfristigen Unterstützung kognitiver
Fähigkeiten.
- 2. Nicht-cholinerge Ansätze
(Nootropika): Hierzu gehören
Neuroprotektiva und Antioxidantien wie Gingko und Vitamin E, zentrale
Calciumblocker (Nimodipin), Glucose-Stoffwechsel-„Enhancer" (Piracetam), Glutamat-Modulatoren (Memantin), Vasotherapeutika
und Antiphlogistika (NSAR),
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Durch
die Gabe der genannten Medikamente kann kurzfristig die Lebensqualität der Patienten gesteigert
werden, jedoch ohne dass dauerhaft die Progression der Krankheit
aufgehalten werden kann. Eine Heilung der Alzheimerschen Krankheit
ist mit den bekannten medikamentösen
Ansätzen
nicht möglich.
Zudem besitzen diese Medikamente teilweise gravierende Nebenwirkungen.
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Bedingt
durch die immense Bedeutung der Alzheimerschen Krankheit wurden
in der Vergangenheit immer wieder chemische oder biochemische Substanzen
publiziert, denen eine therapeutische Wirkung (auch) bei der Behandlung
der Alzheimerschen Krankheit zugeschrieben wurde. So ist auch in der
WO 94/03178, die die Substanz Phosphoryl-L-Serin-N-Acyl-Sphingosin
als universell einsetzbaren Wirkstoff zur Behandlung diverser Krankheiten beschreibt,
die Eignung von Phosphoryl-L-Serin-N-Acyl-Sphingosin zur Behandlung der Alzheimerschen
Krankheit erwähnt.
Nachweise für
eine tatsächliche
Beeinflussung der Alzheimerschen Krankheit durch diese Substanz
sind jedoch nicht beschrieben, ebensowenig diesbezügliche Tests
oder sonstige Beobachtungen, die die Behauptung ihrer Eignung als
Arzneimittel gegen Morbus Alzheimer stützen könnten.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen,
das eine kausale Therapie der Alzheimerschen Krankheit ermöglicht.
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Eine
Lösung
dieser Aufgabe besteht in dem Mittel der eingangs genannten Art,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass es (a) Sphingomyelin und/oder
(b) einen Aktivator der körpereigenen Sphingomyelin-Synthese
und/oder (c) einen Inhibitor des körpereigenen Sphingomyelin-Abbaus
als Wirkstoffenthält.
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Die
Erfindung basiert auf der überraschenden
Erkenntnis, daß eine
Erhöhung
der Sphingomyelin-Konzentration im menschlichen bzw. tierischen Körper, insbesondere
im Nervengewebe (neuronalen Gewebe), zu einer Absenkung der Konzentration
an pathogenem Aβ (insbesondere
auch an Aβ42)
führt bzw.
die Bildung von pathogenem Aβ hemmt.
Die Erhöhung
des Sphingomyelin-Spiegels kann durch Einnahme bzw.
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Verabreichung
von Sphingomyelin, beispielsweise im Zuge einer entsprechenden Diät, eventuell
als Nahrungsergänzungsstoff,
erfolgen. Alternativ besteht die Möglichkeit, durch die Verabreichung
von Aktivatoren der Sphingomyelin-Synthese oder von Hemmstoffen
des Sphingomyelin-Abbaus indirekt die Sphingomyelin-Konzentration
im Körper der
betreffenden Alzheimer Patienten oder Alzheimer gefährdeter
Personen zu erhöhen.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Mittels
ist wenigstens einer der Wirkstoffe ein Aktivator für wenigstens
eines der körpereigenen
Sphingomyelin synthetisierenden Enzyme. Zu diesen Enzymen zählen insbesondere
die Serin-Palmitoyl-CoA-Transferase, die Sphingosin-Acyltransferase
(EC 2.3.2.24), die Sphingosin-Cholinphosphotransferase (EC 2.7.8.10)
und die Acylsphingosin-Desacylase
(EC 3.5.1.23).
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Bei
einer ebenso bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Mittels
ist wenigstens einer der Wirkstoffe ein Inhibitor wenigstens eines der
körpereigenen
Sphingomyelin abbauenden Enzyme. Zu diesen abbauenden Enzymen zählen insbesondere
die Sphingomyelin-Phosphodiesterase und Ceramidasen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt damit ein sehr effektives, einfach
herzustellendes und unaufwendig zu verabreichendes Mittel – das heißt insbesondere
Arzneimittel oder Nahrungsergänzungsmittel – für einen
kausalen und nicht nur symptomatischen Therapieansatz zur Behandlung
der Alzheimerschen Krankheit zur Verfügung. Sie offenbart darüber hinaus
neue Zielenzyme zur Bekämpfung
der Alzheimerschen Krankheit, nämlich
die am Auf- und Abbau von Sphingomyelin beteiligten Enzyme, insbesondere
die Serin-Palmitoyl-CoA-Transferase, die Sphingomyelin-Phosphodiesterase
(EC 3.1.4.12), die Sphingosin-Acyltransferase (EC 2.3.2.24), die Sphingosin-Cholinphosphotransferase
(EC 2.7.8.10) und die Acylsphingosin-Desacylase (EC 3.5.1.23) sowie die Ceramidasen.
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Diese
Verabreichung von Sphingomyelin an die betreffenden Patienten findet
vorzugsweise im Rahmen einer Diät
statt. Die Verabreichung durch eine Diät ist kostengünstig und
für den
Patienten und die Pfleger einfach und schonend. Eine solche Diät eignet
sich außerdem
sehr gut als präventive
Maßnahme
zur Vermeidung einer Erkrankung an Morbus Alzheimer. Bei der Behandlung
von Alzheimer Patienten durch die Gabe von Sphingomyelin sind nur geringe
Nebenwirkungen zu erwarten, da es sich um ein körpereigenes Lipid handelt.
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Die
Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen und graphischen
Darstellungen näher
erläutert.
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Bei
den graphischen Darstellungen zeigen
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1:
Die schematische Darstellung der proteolytischen Prozessierung des
in die Zellmembran integrierten Amyloid-Vorläufer-Proteins APP.
[Graues
Kästchen:
Aβ Domäne; weißer Balken:
restlicher Teil des APP-Moleküls; hellgrauer
Balken: Transmembrandomäne
(TM)]
Die Schnittstellen der Sekretasen sind durch senkrechte
Pfeile und die griechischen Buchstaben α, β und γ symbolisiert. Die Spaltung
von APP innerhalb der Aβ Domäne durch
die α-Sekretase
führt zur
Freisetzung von α-sekretorischem APP
(sAPPα)
und dem C-terminalen Fragment α-CTF.
Eine nachfolgende γ-Sekretase
Prozessierung des membranständigen α-CTF führt zur
Freisetzung von p3. Die Prozessierung von APP durch die β-Sekretase
führt zur
Bildung von β-sekretorischem
APP (sAPPβ)
sowie der häufigen
C-terminalen Fragmente β1-CTF und β11-CTF. γ-Sekretase
Spaltung der membranständigen
C-terminalen Fragmente β1-CTF
und β11-CTF führt zur
Freisetzung von Asp1-Aβ und
Glu11-Aβ.
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2:
Exposition von SPA4CT transfizierten COS7-Zellen mit Sphingomyelin
im Konzentrationsbereich von 10 bis 100 μM.
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3:
Exposition von COS7-Zellen, die mit humanem APP695 stabil transfiziert
wurden, mit Sphingomyelin im Konzentrationsbereich von 10 bis 100 μM.
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4:
Exposition von primären
Neuronen, die mit Hilfe des Semliki-forest-Virus mit APP695 bzw.
SPA4CT infiziert wurden, mit 50 μM
Sphingomyelin.
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5:
Exposition von SPA4CT transfizierten COS7-Zellen mit dem neutralen
Sphingomyelinase Inhibitor GW4869.
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6:
Strukturformel des neutralen Sphingomyelinase Inhibitors GW4869
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7:
Strukturformel von Sphingomyelin
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Beispiel 1: Untersuchung
der Wirkung von (a) Sphingomyelin und (b) eines Hemmstoffs des Sphingomyelin-Abbaus
auf die Aβ-Konzentration
in Zellkultursystemen
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Von
zwei Ansätzen
COS7-Zellen wurde der eine mit humanem APP695 und der andere mit
humanem SPA4CT stabil transfiziert, wobei dem Fachmann geläufige Verfahren
angewendet wurden.
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Das
Zielgen APP695 ist dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt
(Kang, J., Lemaire, H.-G., Unterbeck, A., Salbaum, J.M., Masters
C.L., Grzeschik K.-H., Multhaup, G., Beyreuther K., Müller-Hill,
B., 1987, Nature, 325: 733-736,
US 20020104104 ).
Gleiches gilt für
das Zielgen SPA4CT (Dyrks, T., Dyrks, E., Mönning, U., Urmoneit, B., Turner,
J., Beyreuther, K., FEBS 13297, 335: 89-93). SPA4CT ist eine verkürzte Form
von APP und wird nur noch durch die gamma-Sekretase (γ-Sektretase) prozessiert.
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Zur
Transfektion wurden die Konstrukte pCEP4-SPA4CT und pCEP4-APP695
verwendet.
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Die
Herstellung bzw. Klonierung des Konstrukts pCEP4-SPA4CT erfolgte
durch Restriktion des im Stand der Technik bekannten Vektorkonstrukts
pBS/SPA4CT (FEBS Lett. 1999 Jun25;453(3):288-82) und des ebenfalls
im Stand der Technik bekannten Klonierungsvektors pCEP4 (Invitrogen® Life
technologies, San Diego, CA) mit KpnI und HindIII und anschließender Ligation.
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Die
Herstellung bzw. Klonierung des pCEP4-APP695 Konstruktes erfolgte
per Restriktion des im Stand der Technik bekannten Vektorkonstrukts
pSP65-APP695 (Dyrks, T. Dyrks, E., Masters, C., Beyreuther K., 1992,
FEBS 11478, 309:20-24) mit SmaI und HindIII und des bereits erwähnten Klonierungsvektors
pCEP4 mit SmaI und PvuII und anschließender Ligation.
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Auf
die Inhalte der zitierten Publikationen wird ausdrücklich Bezug
genommen. Von beiden transfizierten COS7-Zelllinien wurden Einzelklone generiert.
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Als
zusätzliches
Zellsystem wurden primäre Neurone
aus E14-Mäusen
(Stamm C57B16) präpariert
und in einer Dichte von 106 Neurone pro
10 cm-Zellkulturschale für
7 Tage kultiviert. Mit Hilfe des Semliki-Virus wurde ein Ansatz
der primären
Neurone mit humanem APP und ein zweiter Ansatz mit humanem SPA4CT
infiziert. Das Semliki-forest-Virus als Shuttle-System für die beiden
Zielgene ist aus Tienari et al. bekannt (Tienari, P.J., De Strooper,
B., Ikonen, E., Simons, M., Weidemann, A., Czech, C., Hartmann,
T., Ida, N., Multhaup, G., Masters, C.L., Van Leuven, F., Beyreuther,
K., Dotti, C.G., 1996, EMBO J. 15: 5218-5229), seine Benutzung erfolgte analog
der von Fassbender et al. beschriebenen Vorgehensweise (Fassbender,
K., Simons, M., Bergmann, C., Stroick, M., Lutjohann, D., Keller,
P., Runz, H., Kuhl, S., Bertsch, T., von Bergmann, K., Hennerici,
M., Beyreuther, K. & Hartmann,
T., 2001, Proc Natl Acad Sci USA. 98: 5856-5861). Auf die Inhalte
dieser beiden Publikationen wird ausdrücklich Bezug genommen.
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Die
Kultivierung der COS7-Zellen erfolgte in Dulbecco's modified eagles
medium (DMEM) mit 10% FCS. Die Neurone wurden in N2-MEM kultiviert. Während des
Lipidexpositionsexperimentes wurden die Neurone in N-MEM, die COS7-Zellen
in DMEM mit 0,1 % delipidiertem FCS inkubiert.
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(a) Verabreichung von
Sphingomyelin:
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Die
Inkubation mit Sphingomyelin (Strukturformel siehe 7)
erfolgte für
16 und 24 h in einem Konzentrationsbereich von 10 bis 100 μM. Das Medium
wurde alle 4 h gewechselt.
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(b) Verabreichung eines
Hemmstoffs des Sphingomyelin-Abbaus:
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Zur
Hemmung der neutralen Sphingomyelinase wurden die oben beschriebenen
COS7-Zelllinien
24 h mit einem Inhibitor der neutralen Sphingomyelin-Phosphodiesterase,
nämlich
mit dem Inhibitor GW 4869 (Strukturformel siehe 6)
inkubiert. Die Exposition fand in 5 ml DMEM, 10% FCS, 1 μM Inhibitor
statt; das Medium wurde nach 12 und 20 h gewechselt. Darauf wurde
für die
Aβ Bestimmung
das Medium 4 h in Anwesenheit des Inhibitors konditioniert.
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Bestimmung des Sphingomyelin-Gehalts:
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Der
Effekt auf die Lipidkomposition, insbesondere auf Sphingomyelin,
wurde mittels Massenspektroskopie verifiziert.
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Hierfür wurden
die Lipide nach einer modifizierten Methode nach Bligh und Dyer
extrahiert.
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Nach
BCA-Normierung wurden die Proben in einem Gesamt-Volumen von 400 μl ddH2O aufgenommen und in ein Glasröhrchen überführt. Die
Extraktion erfolgte durch Zugabe von 3,75 ml CHCl3/MeOH/HCL
(5 : 10 : 0,075). Nach Vortexen der Proben für 30 min wurde 1 ml Chloroform
zugegeben, erneut für
30 min gevortext und 1 ml ddH2O zugesetzt. Die organische Phase
wurde in ein neues Glasröhrchen überführt und
nach oben beschriebenem Protokoll erneut extrahiert.
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Bestimmung des Aβ-Gehalts:
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Zur
Aβ Bestimmung
wurden nach erfolgter Sphingomyelin- und Inhibitorinkubation die
Zellen auf Eis gestellt und das Zellkulturmedium (konditioniertes
Medium) zum Nachweis von Aβ in
Eppendorf-Reaktionsgefässe überführt. Anschließend wurden
die Zellen dreimal mit 5 ml 4°C
kaltem DMEM (Dulbecco's
modified eagles medium) gewaschen. Nach jedem Waschschritt wurde
das Medium verworfen. Danach wurden die Zellen in 5 ml DMEM mit
einem Gummizellschaber von der Zellkulturschale abgelöst und in
ein Falcon-Gefäß überführt und
bei 750 g, 4°C zentrifugiert.
Der Überstand
wurde verworfen, das Zellsediment in 1 ml Lyse-Puffer [150 mM NaCl;
50 mM Tris/HCl pH 7,5 – 8;
1% (v/v) Nonidet-P40; 1% (v/v) Triton X-100; 2 mM EDTA; vor dem
Aufschluss der Zellen wurde dem Lyse-Puffer ein Protease-Inhibitor-Mix
(10fach Stocklösung;
Roche, Mannheim) im Verhältnis
1:10 zugegeben] resuspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert.
Nach erfolgter Lyse der Zellen wurde die Suspension in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und
die Zellkerne sowie Zelltrümmer bei
13000 g, 4°C
abzentrifugiert. Der Überstand
wurde in der Immunpräzipitation
eingesetzt.
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Zur
Konzentrationsbestimmung der erhaltenen Proteinlösung (Zell-Lysat) wurde zu
2 μl Probe 200 μl BCA-Reagenz
gegeben, welches durch eine 1:40 Verdünnung einer 4%igen CuSO4 × 5
H2O-Lösung
in der BCA-Lösung
der Firma SIGMA zuvor hergestellt wurde. Nach einer Inkubation für 15 min
bei 37°C
und anschließend
für 15
min bei Raumtemperatur (RT) wurde die Probe bei einer Wellenlänge von 562
nm in einem Spektralphotometer vermessen. Zur Erstellung einer Eichkurve
wurden verschiedene BSA-Verdünnungen
eingesetzt, die analog behandelt wurden. Somit konnte für den Aβ-Nachweis
für jede Probe
eine definierte Proteinmenge eingesetzt werden.
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Zur
Analyse der freigesetzten Aβ Menge wurde
die entsprechende Menge konditioniertes Medium bzw. Zell-Lysat mit
5 μg/ml
Antikörper
W02 (The Genetics Company, 8952 Schlieren, Schweiz) der ein Epitop
im Bereich der Aminosäuren
1 bis 10 der Aβ-Sequenz
erkennt, und mit 20 μl
Protein-G-Sepharose versetzt und über Nacht bei 4°C in einem Überkopfschüttler inkubiert.
Nach erfolgter Antikörperinkubation
wurden die Immunpräzipitate
1 min bei 13000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das
Sediment je einmal mit 1 ml Waschpuffer A (10 mM Tris/Cl pH 7,5;
150 mM NaCl; 0,2% (v/v) Nonidet P-40; 2 mM EDTA), Waschpuffer B
(10 mM Tris/Cl pH 7,5; 500 mM NaCl; 0,2% (v/v) Nonidet P-40; 2 mM
EDTA) und Waschpuffer C (10 mM Tris/Cl pH 7,5) gewaschen. Nach jedem
Waschschritt wurde 1 min bei 13000 g zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Das Sediment wurde nach dem letzten Waschvorgang mit
15 μl Proteinprobenpuffer (187,5
mM Tris/HCl pH 6,8; 6% (w/v) SDS; 30% (v/v) Glyzerin; 15% β-Mercaptoethanol;
0,03% (w/v) Bromphenolblau) versetzt und 10 min bei 95°C erhitzt.
Es wurde erneut 1 min bei 13000 g zentrifugiert und der Überstand
auf ein 10-20%iges Tricine-Gel der Firma Invitrogen aufgetragen.
Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Proteine im verwendeten
Gelsystem wurden die Proteine mittels Western Blot Transfer auf
eine Nitrozellulosemembran transferiert. Der 45-minütige Transfer
der Proteine erfolgte im Wet-Blot-Verfahren bei einer Stromstärke von
380 mA bei 4°C
in 1-mal Transferpuffer (25 mM Tris; 192 mM Glycin; 20% Methanol;
0,025% (w/v) SDS; pH 8,7). Die durch SDS negativ geladenen Proteine wandern
in Richtung positiver Ladung (Anode) und werden dadurch auf die
Nitrozellulose transferiert.
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Auf
der Nitrozellulosemembran erfolgte der spezifische Nachweis der
Proteine durch Inkubation mit geeigneten Erst- und Zweitantikörpern. Nach
erfolgtem Transfer der Proteine auf die Nitrozellulosemembran wurde
diese für
5 min in 400 ml PBS (8,1 mM Na2HPO4 × 2
H2O; 1,5 mM KH2PO4; 0,137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; der pH-Wert
liegt bei pH 7,5) in der Mikrowelle gekocht. Um unspezifische Bindungen
des Antikörpers
zu vermeiden, wurde die Membran anschließend mit 10% Milchpulver in
PBS inkubiert. Nach erfolgter Inkubation wurde zweimal für 5 min
mit PBS gewaschen. Anschließend
wurde die Membran 1,5 h mit dem Antikörper W02 (1 μg/ml in PBS)
inkubiert. Danach wurde dreimal für 5 min mit PBS gewaschen.
Die Inkubation mit dem Zweitantikörper (rabbit-anti-mouse der
Firma DAKO), der an das Enzym Meerrettich-Peroxidase gekoppelt ist,
erfolgte für
45 min in 1-mal PBS. Für
die Inkubation wurde der Zweitantikörper 1:5000 in PBS verdünnt. Anschließend wurde
erneut viermal für
10 min mit PBS gewaschen. Die Nitrozellulosemembran wurde 1 min
in Amersham ECL-Lösung
(1:1) inkubiert. Die Membran wurde im Fotolabor auf ECL-Hyperfilm
exponiert und entwickelt.
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Ergebnisse:
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Die
Inkubation mit Sphingomyelin im Konzentrationsbereich von 10 bis
100 μM ergab
bei SPA4CT transfizierten Zellen eine signifikante Absenkung des
Aβ Spiegels
um 20 bis 50% (siehe hierzu 2).
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Bei
APP transfizierten Zellen wurde der Aβ Spiegel bei Inkubation von
Sphingomyelin im Konzentrationsbereich von 10 bis 100 μM deutlich
geringfügiger
gesenkt. Die Absenkung betrug 10 bis 20% (siehe hierzu 3).
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In
Neuronen bestätigte
sich das Ergebnis. Bei 50 μM
Sphingomyelin ergab sich in SPA4CT infizierten Zellen eine Absenkung
von ca. 40%, in APP695 infizieren Zellen eine Absenkung um ca. 15%
(siehe hierzu 4).
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Durch
Inkubation mit dem neutralen Sphingomyelinase-Inhibitor in einer
Konzentration von 1 μM
konnte in COS7-Zellen, die SPA4CT stabil exprimierten, die Sphingomyelinmenge
um 15% gesteigert werden. Dies hatte eine Absenkung des Aβ-Spiegels
von ca. 15% zur Folge (siehe hierzu 5).