JPH07233158A - 新規化合物Ｆ−１０４６３ａ - Google Patents
新規化合物Ｆ−１０４６３ａInfo
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- JPH07233158A JPH07233158A JP31786894A JP31786894A JPH07233158A JP H07233158 A JPH07233158 A JP H07233158A JP 31786894 A JP31786894 A JP 31786894A JP 31786894 A JP31786894 A JP 31786894A JP H07233158 A JPH07233158 A JP H07233158A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】本発明は、下記式で表わされる新規化合物 F-1
0463a ： 【化１】 に関する。 【効果】本発明の新規化合物 F-10463a は、抗ＨＩＶ
剤、抗糖尿病剤、抗動脈硬化剤、抗骨粗しょう症剤、抗
血栓剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、利尿剤、そして、呼吸
器系疾患、甲状腺疾患、アルツハイマー病、肝炎、腎
炎、白血病、及びカケクシアに対する予防薬、治療薬と
して使用できる。
0463a ： 【化１】 に関する。 【効果】本発明の新規化合物 F-10463a は、抗ＨＩＶ
剤、抗糖尿病剤、抗動脈硬化剤、抗骨粗しょう症剤、抗
血栓剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、利尿剤、そして、呼吸
器系疾患、甲状腺疾患、アルツハイマー病、肝炎、腎
炎、白血病、及びカケクシアに対する予防薬、治療薬と
して使用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、スフィンゴミエリナー
ゼを阻害し各種医薬として有用な新規化合物F-10463aお
よびその製造法に関する。
ゼを阻害し各種医薬として有用な新規化合物F-10463aお
よびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】インターロイキン−１β（以下、「ＩＬ
−１β」という。）の生物作用は多様であり、一般には
生体の恒常性維持に必須な生体物質と考えられている。
ところが、ＩＬ−１βの産生調節機能に異常が発生し、
ＩＬ−１βが過剰に生産されると、種々の疾患の原因と
なる。また、腫瘍壊死因子−α（以下、「ＴＮＦ−α」
という。）はある種の腫瘍細胞やウイルス感染細胞を死
滅させたり、顆粒球の抗細菌性作用を増強させる等の作
用を有するが、ＴＮＦ−αも過剰に生産された場合に
は、幾つかの疾患の主要な病因となる。
−１β」という。）の生物作用は多様であり、一般には
生体の恒常性維持に必須な生体物質と考えられている。
ところが、ＩＬ−１βの産生調節機能に異常が発生し、
ＩＬ−１βが過剰に生産されると、種々の疾患の原因と
なる。また、腫瘍壊死因子−α（以下、「ＴＮＦ−α」
という。）はある種の腫瘍細胞やウイルス感染細胞を死
滅させたり、顆粒球の抗細菌性作用を増強させる等の作
用を有するが、ＴＮＦ−αも過剰に生産された場合に
は、幾つかの疾患の主要な病因となる。
【０００３】この二つのサイトカインは全く異なる遺伝
子の産物で、その構造に類似性はなく、各々に対応した
独自の受容体を有するが、それらの標的細胞、生物活性
には重複する点が多い。例えば、両サイトカインは生体
内に入ったエンドトキシン（ＬＰＳ）によって起こる敗
血症性ショックの主要原因であり〔Tracy K.J. et al.
Science, 234, 470 (1986)、Tracey K.J. et al. Natur
e(London), 330, 662(1987)〕、その他、肉芽腫〔Kobay
ashi K. et al. J. Immunol., 134, 358 (1985)〕、髄
膜炎菌髄膜炎やマラリア感染〔Curfs J.H.A. et al. J.
Exp.Med., 172,1287 (1990)〕等、外来性の微生物、寄
生虫及びウイルス等に由来する感染症に密接に関係す
る。この様な急性期炎症反応に於ける主要な各段階、即
ち、局所への炎症細胞の浸潤〔Gamble J.R. et al. Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 82, 8667(1985) 、宮坂 昌
之ら Annual Review 免疫’91, 57 中外医学社 (199
1) 〕、発熱〔Dinarello C.A. Lymphokines, 14, 1 (1
987) 〕、急性期蛋白の誘導〔Perimutter D.H. et al.
J.Clin.Invest., 78,1349 (1986) 〕、プロスタノイ
ド、特にPGE2 産生の促進に〔Dayer J.-M. et al. J.E
xp.Med., 162, 2163 (1985) 、Turinsky J. et al. Am.
J.Physiol. 262, E476 (1992)、Ballou L.R. et al.
J.Biol.Chem. 267, 20044 (1992)〕、両サイトカイン
は積極的な役割を担っている。
子の産物で、その構造に類似性はなく、各々に対応した
独自の受容体を有するが、それらの標的細胞、生物活性
には重複する点が多い。例えば、両サイトカインは生体
内に入ったエンドトキシン（ＬＰＳ）によって起こる敗
血症性ショックの主要原因であり〔Tracy K.J. et al.
Science, 234, 470 (1986)、Tracey K.J. et al. Natur
e(London), 330, 662(1987)〕、その他、肉芽腫〔Kobay
ashi K. et al. J. Immunol., 134, 358 (1985)〕、髄
膜炎菌髄膜炎やマラリア感染〔Curfs J.H.A. et al. J.
Exp.Med., 172,1287 (1990)〕等、外来性の微生物、寄
生虫及びウイルス等に由来する感染症に密接に関係す
る。この様な急性期炎症反応に於ける主要な各段階、即
ち、局所への炎症細胞の浸潤〔Gamble J.R. et al. Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 82, 8667(1985) 、宮坂 昌
之ら Annual Review 免疫’91, 57 中外医学社 (199
1) 〕、発熱〔Dinarello C.A. Lymphokines, 14, 1 (1
987) 〕、急性期蛋白の誘導〔Perimutter D.H. et al.
J.Clin.Invest., 78,1349 (1986) 〕、プロスタノイ
ド、特にPGE2 産生の促進に〔Dayer J.-M. et al. J.E
xp.Med., 162, 2163 (1985) 、Turinsky J. et al. Am.
J.Physiol. 262, E476 (1992)、Ballou L.R. et al.
J.Biol.Chem. 267, 20044 (1992)〕、両サイトカイン
は積極的な役割を担っている。
【０００４】また、ＩＬ−１βとＴＮＦ−αは慢性の炎
症疾患、例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）発症及び進
展に関与し、滑膜組織に於けるリンパ球浸潤の活性化、
滑膜細胞の増殖促進、及び軟骨細胞の破壊、破骨細胞の
活性化による骨吸収の促進作用を示す〔Mizel S.B. et
al. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78, 2474 (1980) 、Mi
yasaka N. et al. Arthritis Rheum., 31, 480 (198
8)、Arend W.P. and Dayer J.-M. Arthritis Rheumatis
m., 33, 305 (1990)〕。その他、同じリウマチ性疾患で
ある膠原病〔Tanaka Y. et al. J.Immunol., 143, 1584
(1989) 〕、全身性血管炎を主体とする川崎病〔Leung
D.Y.M. et al. J.Exp.Med., 164, 1958 (1986)〕、肉芽
腫とそれに続く線維症に伴う慢性炎症にも関わることが
知られている〔Le J. and Vilcek J. Lab.Invest., 56,
234 (1987) 〕。現在、慢性炎症性疾患の治療剤として
使用されているグルココルチコイドは、その作用一部が
これらサイトカインの産生抑制にあることが知られてい
るが〔Lew W. et al. J.Immunol., 140, 1895 (1988)
〕、グルココルチコイドは、その多様な生理作用によ
り種々の危篤な副作用を誘起する不利を併せ持つ。
症疾患、例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）発症及び進
展に関与し、滑膜組織に於けるリンパ球浸潤の活性化、
滑膜細胞の増殖促進、及び軟骨細胞の破壊、破骨細胞の
活性化による骨吸収の促進作用を示す〔Mizel S.B. et
al. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78, 2474 (1980) 、Mi
yasaka N. et al. Arthritis Rheum., 31, 480 (198
8)、Arend W.P. and Dayer J.-M. Arthritis Rheumatis
m., 33, 305 (1990)〕。その他、同じリウマチ性疾患で
ある膠原病〔Tanaka Y. et al. J.Immunol., 143, 1584
(1989) 〕、全身性血管炎を主体とする川崎病〔Leung
D.Y.M. et al. J.Exp.Med., 164, 1958 (1986)〕、肉芽
腫とそれに続く線維症に伴う慢性炎症にも関わることが
知られている〔Le J. and Vilcek J. Lab.Invest., 56,
234 (1987) 〕。現在、慢性炎症性疾患の治療剤として
使用されているグルココルチコイドは、その作用一部が
これらサイトカインの産生抑制にあることが知られてい
るが〔Lew W. et al. J.Immunol., 140, 1895 (1988)
〕、グルココルチコイドは、その多様な生理作用によ
り種々の危篤な副作用を誘起する不利を併せ持つ。
【０００５】さらに、ＩＬ−１βとＴＮＦ−αは単球の
血管内皮細胞への接着、内皮下への遊走〔Pober J.S. e
t al. J.Immunol., 137, 1893 (1986)、Nelken N.A. et
al.J.Clin.Invest. 88, 1121 (1991) 〕、血管平滑筋
細胞の内膜での異常増殖を促進する等〔Raines E.W. et
al. Science 243, 393 (1989)〕、粥状動脈硬化の発
症、進展に関与する。
血管内皮細胞への接着、内皮下への遊走〔Pober J.S. e
t al. J.Immunol., 137, 1893 (1986)、Nelken N.A. et
al.J.Clin.Invest. 88, 1121 (1991) 〕、血管平滑筋
細胞の内膜での異常増殖を促進する等〔Raines E.W. et
al. Science 243, 393 (1989)〕、粥状動脈硬化の発
症、進展に関与する。
【０００６】また、ＩＬ−１βとＴＮＦ−αは、血小板
活性化因子（ＰＡＦ）の産生促進、組織因子の内皮細胞
膜表面への誘導、トロンボモジュリンプロテインＣの減
少、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１の
産生抑制をきたし、全体として血小板凝集と血液凝固を
招来して血栓形成の原因となる〔Bevilacqua M.P. eta
l. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 83, 4533 (1986) 、Le
J. and Vilcek J. Lab.Invest., 56, 234 (1987) 、佐
藤 靖史 現代医療, 23, 3163 (1991) 〕。
活性化因子（ＰＡＦ）の産生促進、組織因子の内皮細胞
膜表面への誘導、トロンボモジュリンプロテインＣの減
少、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１の
産生抑制をきたし、全体として血小板凝集と血液凝固を
招来して血栓形成の原因となる〔Bevilacqua M.P. eta
l. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 83, 4533 (1986) 、Le
J. and Vilcek J. Lab.Invest., 56, 234 (1987) 、佐
藤 靖史 現代医療, 23, 3163 (1991) 〕。
【０００７】インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）で
は、その発症に至る過程に潜在的、慢性的、自己免疫的
な炎症が膵島、特に膵β細胞に起こっているが、ＩＬ−
１βやＴＮＦ−αはそれに関与する〔Nerup J. et al.
Diabetes Care., 11, 16 (1988) 。一方、インスリン非
依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に際しても、ＴＮＦ−αは
脂肪細胞での産生を介して筋肉、肝細胞に作用し、イン
スリン抵抗性を発揮することに関与する〔Spiegelman
B.M. et al. J. Biol.Chem., 268, 6823 (1993)〕。
は、その発症に至る過程に潜在的、慢性的、自己免疫的
な炎症が膵島、特に膵β細胞に起こっているが、ＩＬ−
１βやＴＮＦ−αはそれに関与する〔Nerup J. et al.
Diabetes Care., 11, 16 (1988) 。一方、インスリン非
依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に際しても、ＴＮＦ−αは
脂肪細胞での産生を介して筋肉、肝細胞に作用し、イン
スリン抵抗性を発揮することに関与する〔Spiegelman
B.M. et al. J. Biol.Chem., 268, 6823 (1993)〕。
【０００８】糸球体腎炎発症の主体を成すメサンギウム
細胞の増殖と基質の増生にＩＬ−１βとＴＮＦ−αは深
く関与する〔Werber H.I. et al. J.Immunol., 138, 32
07 (1987) 、Baud L. et al. Kidney Int., 41, 600 (1
992)〕。
細胞の増殖と基質の増生にＩＬ−１βとＴＮＦ−αは深
く関与する〔Werber H.I. et al. J.Immunol., 138, 32
07 (1987) 、Baud L. et al. Kidney Int., 41, 600 (1
992)〕。
【０００９】ＩＬ−１βやＴＮＦ−αはＴ細胞からのＩ
Ｌー２産生やその分泌、その受容体発現を促し、また、
その他の免疫細胞に作用してその働きを高めることで免
疫能を賦活化する〔Gillis S. and Mizel S.B. Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A. 78, 1133 (1981)、Scheurich P. e
t al. J.Immunol., 138, 1786 (1987)〕。この作用によ
り両サイトカインは、例えば移植の際に生じる移植片対
宿主病（ＧＶＨＤ）発症の一因となる。
Ｌー２産生やその分泌、その受容体発現を促し、また、
その他の免疫細胞に作用してその働きを高めることで免
疫能を賦活化する〔Gillis S. and Mizel S.B. Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A. 78, 1133 (1981)、Scheurich P. e
t al. J.Immunol., 138, 1786 (1987)〕。この作用によ
り両サイトカインは、例えば移植の際に生じる移植片対
宿主病（ＧＶＨＤ）発症の一因となる。
【００１０】ＴＮＦ−αは、慢性の感染症やガン患者に
於いて脂肪細胞のリポプロテインリパーゼ活性を抑制し
て食欲不振を引き起こすことにより、極度の体重減少・
消耗を引き起こし（cachexia）、そのためＴＮＦ−αは
カケクチン（cachectin ）と呼ばれている〔Beutler B.
et al. Nature(London), 316, 552 (1985) 〕。
於いて脂肪細胞のリポプロテインリパーゼ活性を抑制し
て食欲不振を引き起こすことにより、極度の体重減少・
消耗を引き起こし（cachexia）、そのためＴＮＦ−αは
カケクチン（cachectin ）と呼ばれている〔Beutler B.
et al. Nature(London), 316, 552 (1985) 〕。
【００１１】ＴＮＦ−αは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイ
ルス）感染細胞において、染色体内に挿入されたＨＩＶ
のウイルスゲノム末端：ＬＴＲ：からの転写を転写因子
ＮＦ−κＢを介して活性化させ、ＨＩＶの増殖をこう進
させる〔Nabel G. et al. Nature, 326, 711 (1987) 、
Schreck R. et al. EMBO Journal, 10, 2247 (199
1)〕。
ルス）感染細胞において、染色体内に挿入されたＨＩＶ
のウイルスゲノム末端：ＬＴＲ：からの転写を転写因子
ＮＦ−κＢを介して活性化させ、ＨＩＶの増殖をこう進
させる〔Nabel G. et al. Nature, 326, 711 (1987) 、
Schreck R. et al. EMBO Journal, 10, 2247 (199
1)〕。
【００１２】その他、ＩＬ−１βやＴＮＦ−αの過剰生
産に基づく疾患として、劇症肝炎〔Muto Y. et al. Lan
cet II, 72 (1988) 〕、喘息、特発性肺線維症〔Kelley
J.Am.Rev.Respir.Dis., 141(3), 765 (1990)〕、ＡＲ
ＤＳ（adult respiratory distress syndrome ）〔Mill
ar A. et al. Lancet II, 712 (1989)〕等の呼吸器系疾
患、自己免疫性甲状腺疾患〔江口 勝美ら 最新医学か
らのアプローチ１ サイトカインから, メジカルビュー
社, 38 (1991) 〕、ライム病〔Habicht G.S. et al. J.
Immunol., 134, 3147 (1985)〕、アルツハイマー病〔Gr
iffin W.S.T. at al. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 86,
7611 (1989)〕、クローン病〔八木田旭邦 医学のあゆ
み, 147, 375 (1988) 〕、中毒ショック症候群〔Ikejim
a T. et al. J.Clin.Invest., 73, 1312 (1984) 〕、骨
粗しょう症〔Pacifici R. et al. Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A., 86, 2398 (1989) 〕、痛風〔Di Giovine F.S.e
t al. J.Immunol., 138, 3213 (1987) 〕、急性骨髄性
白血病〔Sakai K. et al. J.Exp.Med., 166, 1587 (198
7)〕、子宮内膜炎〔Romero R., et al. Am.J.Obstet.Gy
nercol. 160, 1117 (1989)〕などが挙げられる。
産に基づく疾患として、劇症肝炎〔Muto Y. et al. Lan
cet II, 72 (1988) 〕、喘息、特発性肺線維症〔Kelley
J.Am.Rev.Respir.Dis., 141(3), 765 (1990)〕、ＡＲ
ＤＳ（adult respiratory distress syndrome ）〔Mill
ar A. et al. Lancet II, 712 (1989)〕等の呼吸器系疾
患、自己免疫性甲状腺疾患〔江口 勝美ら 最新医学か
らのアプローチ１ サイトカインから, メジカルビュー
社, 38 (1991) 〕、ライム病〔Habicht G.S. et al. J.
Immunol., 134, 3147 (1985)〕、アルツハイマー病〔Gr
iffin W.S.T. at al. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 86,
7611 (1989)〕、クローン病〔八木田旭邦 医学のあゆ
み, 147, 375 (1988) 〕、中毒ショック症候群〔Ikejim
a T. et al. J.Clin.Invest., 73, 1312 (1984) 〕、骨
粗しょう症〔Pacifici R. et al. Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A., 86, 2398 (1989) 〕、痛風〔Di Giovine F.S.e
t al. J.Immunol., 138, 3213 (1987) 〕、急性骨髄性
白血病〔Sakai K. et al. J.Exp.Med., 166, 1587 (198
7)〕、子宮内膜炎〔Romero R., et al. Am.J.Obstet.Gy
nercol. 160, 1117 (1989)〕などが挙げられる。
【００１３】スフィンゴミエリナーゼは、生体内の細胞
膜系および核内に含まれるコリン含有脂質の一つである
スフィンゴミエリンを基質として、このものをセラミド
とホスホリルコリンに分解する酵素である。本酵素は、
当初は酸性域に至適ｐＨを有するリソソームの水解酵素
の一つとして見い出されたが、最近では中性域に至適ｐ
Ｈを有する同酵素活性がミクロソーム画分、形質膜にも
見い出されており〔Allan D. et al. Biochim.Biophys.
Acta., 693, 53 (1982) 、T-Koizumi K. and Kojima K.
J.Biochem., 99, 1803 (1986)、これらの諸酵素が生体
内のスフィンゴミエリンの代謝に実際的に関与している
ものと考えられる。
膜系および核内に含まれるコリン含有脂質の一つである
スフィンゴミエリンを基質として、このものをセラミド
とホスホリルコリンに分解する酵素である。本酵素は、
当初は酸性域に至適ｐＨを有するリソソームの水解酵素
の一つとして見い出されたが、最近では中性域に至適ｐ
Ｈを有する同酵素活性がミクロソーム画分、形質膜にも
見い出されており〔Allan D. et al. Biochim.Biophys.
Acta., 693, 53 (1982) 、T-Koizumi K. and Kojima K.
J.Biochem., 99, 1803 (1986)、これらの諸酵素が生体
内のスフィンゴミエリンの代謝に実際的に関与している
ものと考えられる。
【００１４】上記反応の生成物の一つセラミドは更にセ
ラミダーゼにより加水分解され、脂肪酸とスフィンゴシ
ンを生じる。そして、スフィンゴミエリンが哺乳動物体
内で代謝されて、セラミドさらにスフィンゴシンとなる
ことは in vivo の実験で確かめられている〔Schneide
r P.B. and Kennedy E.P. J.Lipid Res., 9, 58 (196
8)〕。スフィンゴミエリンの分解産物であるこのセラミ
ドやスフィンゴシンは、細胞の増殖・分化、及び、それ
らに密接に関連をもつ情報伝達の制御機構に関与してい
ることが示され〔小島清秀と小泉恵子 蛋白質 核酸
酵素, 36, 629 (1991)〕、この反応経路はスフィンゴミ
エリン経路と呼ばれている。
ラミダーゼにより加水分解され、脂肪酸とスフィンゴシ
ンを生じる。そして、スフィンゴミエリンが哺乳動物体
内で代謝されて、セラミドさらにスフィンゴシンとなる
ことは in vivo の実験で確かめられている〔Schneide
r P.B. and Kennedy E.P. J.Lipid Res., 9, 58 (196
8)〕。スフィンゴミエリンの分解産物であるこのセラミ
ドやスフィンゴシンは、細胞の増殖・分化、及び、それ
らに密接に関連をもつ情報伝達の制御機構に関与してい
ることが示され〔小島清秀と小泉恵子 蛋白質 核酸
酵素, 36, 629 (1991)〕、この反応経路はスフィンゴミ
エリン経路と呼ばれている。
【００１５】ＩＬ−１βやＴＮＦ−αが標的細胞の受容
体に結合し、その後、細胞内にてシグナル伝達がされる
ときに、このスフィンゴミエリン経路が関与しているこ
とが示されている〔Dressler K.A. et al. Science, 25
5, 1715 (1992)、Mathias etal. Science, 259, 519 (1
993) 〕。
体に結合し、その後、細胞内にてシグナル伝達がされる
ときに、このスフィンゴミエリン経路が関与しているこ
とが示されている〔Dressler K.A. et al. Science, 25
5, 1715 (1992)、Mathias etal. Science, 259, 519 (1
993) 〕。
【００１６】従って、スフィンゴミエリナーゼ活性の阻
害物質によりこれらＴＮＦαやＩＬ１βのシグナル伝達
を遮断することができ、これらサイトカインが関与する
病態を改善することができる。
害物質によりこれらＴＮＦαやＩＬ１βのシグナル伝達
を遮断することができ、これらサイトカインが関与する
病態を改善することができる。
【００１７】一方、スフィンゴミエリナーゼの反応物が
シクロオキシゲナーゼを活性化し、これを介してPGE2産
生を促進していることが示されている（Ballou L.R. et
al.J. Biol. Chem. 267, 20044, (1992)）。
シクロオキシゲナーゼを活性化し、これを介してPGE2産
生を促進していることが示されている（Ballou L.R. et
al.J. Biol. Chem. 267, 20044, (1992)）。
【００１８】また、スフィンゴミエリナーゼ反応そのも
のが、粥状動脈硬化の発症に関わるＬＤＬや変性ＬＤＬ
の末梢細胞内への取り込みを促進し、コレステロール・
エステル合成及びその細胞内蓄積を増加させ〔Stein O.
et al. Biochim. Biochim. Acta., 1126, 291 （199
2）、Chatterjee S. J.Biol.Chem., 268, 3401 （199
3）〕、本病態の進展に関わることが予想されている。
のが、粥状動脈硬化の発症に関わるＬＤＬや変性ＬＤＬ
の末梢細胞内への取り込みを促進し、コレステロール・
エステル合成及びその細胞内蓄積を増加させ〔Stein O.
et al. Biochim. Biochim. Acta., 1126, 291 （199
2）、Chatterjee S. J.Biol.Chem., 268, 3401 （199
3）〕、本病態の進展に関わることが予想されている。
【００１９】さらに、スフィンゴミエリナーゼの活性化
は腎臓の近位尿細管に於いてジヌソイド側の頂端膜内に
あるスフィンゴミエリン含量を減らし、Ｎａ依存性に機
能するリン酸や糖の取り込みを減少させる〔Vrtovsnik
F. et al. Kidney International., 41, 983（199
2）〕。
は腎臓の近位尿細管に於いてジヌソイド側の頂端膜内に
あるスフィンゴミエリン含量を減らし、Ｎａ依存性に機
能するリン酸や糖の取り込みを減少させる〔Vrtovsnik
F. et al. Kidney International., 41, 983（199
2）〕。
【００２０】また、ＨＩＶに感染したＣＥＭ細胞でセラ
ミドの量が亢進していることが示され[Veldhoven P.P.
V. et al. Biochem. Biophys. Res. Comm., 187, 209
(1992)] 、生体内のＨＩＶ感染細胞でスフィンゴミエリ
ナーゼが活性化していることが示されている。
ミドの量が亢進していることが示され[Veldhoven P.P.
V. et al. Biochem. Biophys. Res. Comm., 187, 209
(1992)] 、生体内のＨＩＶ感染細胞でスフィンゴミエリ
ナーゼが活性化していることが示されている。
【００２１】以上の事実から、スフィンゴミエリナーゼ
に対する特異的な阻害物質は、抗ＨＩＶ剤、抗糖尿病
剤、抗動脈硬化剤、抗骨粗しょう症剤、抗血栓剤、抗炎
症剤、免疫抑制剤、利尿剤、そして、呼吸器系疾患、甲
状腺疾患、アルツハイマー病、肝炎、腎炎、白血病、及
びカケクシアに対する予防薬、治療薬として使用でき
る。
に対する特異的な阻害物質は、抗ＨＩＶ剤、抗糖尿病
剤、抗動脈硬化剤、抗骨粗しょう症剤、抗血栓剤、抗炎
症剤、免疫抑制剤、利尿剤、そして、呼吸器系疾患、甲
状腺疾患、アルツハイマー病、肝炎、腎炎、白血病、及
びカケクシアに対する予防薬、治療薬として使用でき
る。
【００２２】しかしながら、スフィンゴミエリナーゼに
対して特異的かつ強力な阻害物質は現在まで見い出され
ていない。
対して特異的かつ強力な阻害物質は現在まで見い出され
ていない。
【００２３】従来、ＩＬ−１β作用を特異的に阻害する
物質としては、可溶性ＩＬ−１レセプターやＩＬ−１レ
セプターアンタゴニストが見いだされ、これらを用いて
の敗血症性ショック患者やＲＡ患者での症状改善がみら
れている。
物質としては、可溶性ＩＬ−１レセプターやＩＬ−１レ
セプターアンタゴニストが見いだされ、これらを用いて
の敗血症性ショック患者やＲＡ患者での症状改善がみら
れている。
【００２４】また、ＴＮＦ−α作用を特異的に阻害する
可溶性ＴＮＦ受容体、抗ＴＮＦ抗体を用いての、エンド
トキシンショックや急性ＧＨＶＤなどを対象とした臨床
試験が実施され、その有効性が観察されている〔Vincen
t J.-L. et al. Chest, 101,810 (1992) 、Herve P. et
al. Blood, 79, 3362 (1992)〕。
可溶性ＴＮＦ受容体、抗ＴＮＦ抗体を用いての、エンド
トキシンショックや急性ＧＨＶＤなどを対象とした臨床
試験が実施され、その有効性が観察されている〔Vincen
t J.-L. et al. Chest, 101,810 (1992) 、Herve P. et
al. Blood, 79, 3362 (1992)〕。
【００２５】しかし、これらは何れもペプチド性もしく
は高分子量の物質であるため、薬剤としての体内への吸
収性や血中での安定性等に於いて欠点を有する。かかる
観点より、スフィンゴミエリナーゼに対して特異的な阻
害活性を有する、低分子生理活性物質が望まれていた。
は高分子量の物質であるため、薬剤としての体内への吸
収性や血中での安定性等に於いて欠点を有する。かかる
観点より、スフィンゴミエリナーゼに対して特異的な阻
害活性を有する、低分子生理活性物質が望まれていた。
【００２６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは微生物代
謝産物中よりスフィンゴミエリナーゼ阻害活性を有する
物質を検索し、枯死した草本の茎より分離した Dasyscy
phus 属に属するDasyscyphus mollissimus(Lasch) Den
nis 株の培養液中にスフィンゴミエリナーゼ阻害活性を
有する新規化合物F-10463aが生産されることを見出し、
本発明を完成した。
謝産物中よりスフィンゴミエリナーゼ阻害活性を有する
物質を検索し、枯死した草本の茎より分離した Dasyscy
phus 属に属するDasyscyphus mollissimus(Lasch) Den
nis 株の培養液中にスフィンゴミエリナーゼ阻害活性を
有する新規化合物F-10463aが生産されることを見出し、
本発明を完成した。
【００２７】
【課題を解決するための手段】本発明の F-10463a は下
記の構造式および性状を有する。
記の構造式および性状を有する。
【００２８】構造式
【００２９】
【化２】
【００３０】物理化学的性状 1) 性質；無色油状物質、 2) 溶解性；メタノール、酢酸エチル、クロロホルムな
どの有機溶媒に可溶、水に不溶 3) 呈色試験；50% 硫酸、ヨウ素に陽性。
どの有機溶媒に可溶、水に不溶 3) 呈色試験；50% 硫酸、ヨウ素に陽性。
【００３１】4) 分子式； C29H43NO5 5) 分子量；485 （高分解能FABMS 法により [M+H]+ 48
6.3199 (測定値) ） （計算値：486.3204） 6) 比旋光度；[ α] +64.44 (c 0.09 in MeOH) 7) 紫外線吸収スペクトル；（メタノール中）300 nm(
ε41500) 8) 赤外線吸収スペクトル；（クロロホルム中） 3410, 1655, 1608, 1508 cm-1 9) 1H- 核磁気共鳴スペクトル；( 重メタノール中:PP
M, TMS 基準) 7.15(m, 2H), 6.53(dd, J=14.9, 10.7Hz, 1H), 6.25(d
d, J=14.9, 11.1Hz, 1H),6.15(dd, J=15.1, 10.7Hz, 1
H), 6.07(dd, J=9.8, 1.6Hz, 1H),5.89(d, J=14.8Hz, 1
H), 5.70(dd, 15.1, 8.7Hz, 1H),4.8(HDO のシグナルの
下に隠れている、 1H), 4.05(m, 1H),3.67(d, J=3.9Hz,
1H), 3.59(m, 1H), 3.52(dd, J=10.9, 5.1Hz, 1H),3.4
5(dd, J=10.9, 5.8Hz, 1H), 2.35(m, 1H), 2.27(m, 1
H),2.08(dd, J=14.7, 3.6Hz, 1H), 1.89(m, 2H), 1.79
(dd, 13.1, 7.1Hz, 1H),1.59(m, 1H), 1.54(d, J=1.3H
z, 3H), 1.33(m, 2H), 1.19(m, 1H),〜1.1(m, 1H), 1.0
0(d, J=6.7Hz, 3H), 0.91(d, J=6.6Hz, 3H),0.86(t, J=
7.4Hz, 3H), 0.83(d, J=6.5Hz, 3H) 10) 13C-核磁気共鳴スペクトル；( 重メタノール中:PP
M, 重メタノール基準) 200.1(s),169.0(s),146.6(d),146.4(d),142.9(d),141.9
(d),134.7(d),134.0(s) 132.5(d),130.4(d),129.9(d),124.3(d),78.0(s),66.1
(t),58.7(d),50.1(t),49.8(d),48.5(d),45.7(t),40.3
(t),36.7(d),35.9(d),32.2(t),30.0(d),22.4(q) 22.0(q),20.4(q),16.9(q),13.0(q) 11) 高速液体クロマトグラフグラフィー 保持時間:5.65 分 カラム: ナカライテスク製コスモシール 5 C18-AR, 4.6
φX150mm 溶媒: 70% アセトニトリル- 水 流速: 1ml/ml 検出: UV 210nm生産菌 本発明において用いられる Dasyscyphus 属に属する菌
株としては、例えばDasyscyphus mollissimus(Lasch) D
ennis SANK13892株(FERM BP-4491 ) を挙げることがで
き、この菌株の菌学的性状は次のとおりである。
6.3199 (測定値) ） （計算値：486.3204） 6) 比旋光度；[ α] +64.44 (c 0.09 in MeOH) 7) 紫外線吸収スペクトル；（メタノール中）300 nm(
ε41500) 8) 赤外線吸収スペクトル；（クロロホルム中） 3410, 1655, 1608, 1508 cm-1 9) 1H- 核磁気共鳴スペクトル；( 重メタノール中:PP
M, TMS 基準) 7.15(m, 2H), 6.53(dd, J=14.9, 10.7Hz, 1H), 6.25(d
d, J=14.9, 11.1Hz, 1H),6.15(dd, J=15.1, 10.7Hz, 1
H), 6.07(dd, J=9.8, 1.6Hz, 1H),5.89(d, J=14.8Hz, 1
H), 5.70(dd, 15.1, 8.7Hz, 1H),4.8(HDO のシグナルの
下に隠れている、 1H), 4.05(m, 1H),3.67(d, J=3.9Hz,
1H), 3.59(m, 1H), 3.52(dd, J=10.9, 5.1Hz, 1H),3.4
5(dd, J=10.9, 5.8Hz, 1H), 2.35(m, 1H), 2.27(m, 1
H),2.08(dd, J=14.7, 3.6Hz, 1H), 1.89(m, 2H), 1.79
(dd, 13.1, 7.1Hz, 1H),1.59(m, 1H), 1.54(d, J=1.3H
z, 3H), 1.33(m, 2H), 1.19(m, 1H),〜1.1(m, 1H), 1.0
0(d, J=6.7Hz, 3H), 0.91(d, J=6.6Hz, 3H),0.86(t, J=
7.4Hz, 3H), 0.83(d, J=6.5Hz, 3H) 10) 13C-核磁気共鳴スペクトル；( 重メタノール中:PP
M, 重メタノール基準) 200.1(s),169.0(s),146.6(d),146.4(d),142.9(d),141.9
(d),134.7(d),134.0(s) 132.5(d),130.4(d),129.9(d),124.3(d),78.0(s),66.1
(t),58.7(d),50.1(t),49.8(d),48.5(d),45.7(t),40.3
(t),36.7(d),35.9(d),32.2(t),30.0(d),22.4(q) 22.0(q),20.4(q),16.9(q),13.0(q) 11) 高速液体クロマトグラフグラフィー 保持時間:5.65 分 カラム: ナカライテスク製コスモシール 5 C18-AR, 4.6
φX150mm 溶媒: 70% アセトニトリル- 水 流速: 1ml/ml 検出: UV 210nm生産菌 本発明において用いられる Dasyscyphus 属に属する菌
株としては、例えばDasyscyphus mollissimus(Lasch) D
ennis SANK13892株(FERM BP-4491 ) を挙げることがで
き、この菌株の菌学的性状は次のとおりである。
【００３２】SANK13892 は、1991年5 月、青森県におい
て採集された枯死した草本の茎から分離したものであ
る。
て採集された枯死した草本の茎から分離したものであ
る。
【００３３】子嚢盤は直径最大で0.2mm の無柄の平坦な
円盤状で、灰橙色〜黄色を呈する。子嚢盤の周縁に毛を
有し、縁は盛り上がらない。托外皮層は多角菌組織様を
呈し、淡褐色で薄膜の細胞よりなる。托髄層は密に絡み
合って外壁とやや平行な菌糸よりなり、絡み合い菌組織
を呈する。毛は托外皮層の最外層の細胞より生じて真直
ぐに伸長し、円筒形であり、薄膜、多数の隔壁を有し、
最大長200 μm 、太さ3.5 μm である。その先端はほと
んど鈍頭である。表面はほとんど平滑で、樹脂状の不定
形物質が散在・付着する。子嚢はクランプより生じ、円
筒形、8 胞子性で、大きさ58-66 x 5-6.5 μm である。
その先端はメルツァー試薬にて青変する。側糸は細い槍
型であり、 大きさ74.5-100 x 3.5-4μm 、子嚢より約
20μm 上に伸長する。子嚢胞子は桿形から紡錘形、単細
胞、無色であり、大きさ18-26.5x 2.5-5 μm である。
円盤状で、灰橙色〜黄色を呈する。子嚢盤の周縁に毛を
有し、縁は盛り上がらない。托外皮層は多角菌組織様を
呈し、淡褐色で薄膜の細胞よりなる。托髄層は密に絡み
合って外壁とやや平行な菌糸よりなり、絡み合い菌組織
を呈する。毛は托外皮層の最外層の細胞より生じて真直
ぐに伸長し、円筒形であり、薄膜、多数の隔壁を有し、
最大長200 μm 、太さ3.5 μm である。その先端はほと
んど鈍頭である。表面はほとんど平滑で、樹脂状の不定
形物質が散在・付着する。子嚢はクランプより生じ、円
筒形、8 胞子性で、大きさ58-66 x 5-6.5 μm である。
その先端はメルツァー試薬にて青変する。側糸は細い槍
型であり、 大きさ74.5-100 x 3.5-4μm 、子嚢より約
20μm 上に伸長する。子嚢胞子は桿形から紡錘形、単細
胞、無色であり、大きさ18-26.5x 2.5-5 μm である。
【００３４】ＰＤＡ上の生育は、23℃、10日で 1.5 cm
に達する。表面は淡澄色〜澄白色を呈し、コロニー中央
部にてやや盛り上がる。気菌糸の発達はあまり旺盛でな
く、絡み合って菌糸束を形成する。表面は粉状となる。
裏面は、淡澄色〜澄白色を呈する。さらに培養を継続す
ることによって、より濃色となる。分生子は観察されな
い。
に達する。表面は淡澄色〜澄白色を呈し、コロニー中央
部にてやや盛り上がる。気菌糸の発達はあまり旺盛でな
く、絡み合って菌糸束を形成する。表面は粉状となる。
裏面は、淡澄色〜澄白色を呈する。さらに培養を継続す
ることによって、より濃色となる。分生子は観察されな
い。
【００３５】以上のような菌学的特徴から、本菌に該当
するものを検索したところ、Otani(1967) Notes on som
e cup fungi of the Hyaloscyphaceae collected in Ho
kkaido,Japan. Trans.Mycol. Soc. Japan 8:33-42.に記
載されているDasyscyphus mollissimus (Lasch) Dennis
（ダシスキファス・モリシムス・ラッシュ・デニス）に
一致した。よって本菌をDasyscyphus mollissimus (Las
ch) Dennisと同定し、Dasyscyphus mollissimus (Lasc
h) Dennis SANK13892 と命名した。本菌は、１９９３
年１２月１０日に通産省工業技術院生命工学工業技術研
究所に国際寄託され、寄託番号 FERM BP-4491 が付され
た。
するものを検索したところ、Otani(1967) Notes on som
e cup fungi of the Hyaloscyphaceae collected in Ho
kkaido,Japan. Trans.Mycol. Soc. Japan 8:33-42.に記
載されているDasyscyphus mollissimus (Lasch) Dennis
（ダシスキファス・モリシムス・ラッシュ・デニス）に
一致した。よって本菌をDasyscyphus mollissimus (Las
ch) Dennisと同定し、Dasyscyphus mollissimus (Lasc
h) Dennis SANK13892 と命名した。本菌は、１９９３
年１２月１０日に通産省工業技術院生命工学工業技術研
究所に国際寄託され、寄託番号 FERM BP-4491 が付され
た。
【００３６】培養法及び精製法 本発明の新菌株を分離するに際し使用される分離培地と
しては炭素源、窒素源、無機イオンおよび有機栄養源等
より選択されたものを適宜含有する培地であれば合成ま
たは天然培地の何れでも使用可能である。F-10463aは S
ANK13892 株を適当な培地で培養し、それから採取する
ことによって得られる。栄養源としては、従来、真菌類
の培養に利用されている公知のものが使用できる。例え
ば、炭素源としてはグルコース、シュクロース、澱粉、
グリセリン、水飴、糖蜜、大豆油などが使用できる。ま
た、窒素源としては大豆粉、コーンスチープリカー、イ
ーストエキス、麦芽エキス、ジャガイモ、硫酸アンモニ
ウム、硝酸ナトリウム等を使用しうる。このほか必要に
応じて炭酸カルシウム、リン酸塩等の無機塩類を添加す
るほか、菌株の発育を助け、F-10463aの生産を促進する
ような有機および無機物を適当に添加することができ
る。培養法としては、一般の抗生物質を生産する方法と
同じく液体培養法、特に深部培養法が最も適している。
培養は、好気的条件下で行なわれ、培養に適当な温度は
１５ー３０℃であるが、多くの場合２３℃付近で培養す
る。F-10463aの生産は、振盪培養で通常5-8 日で最高値
に達する。
しては炭素源、窒素源、無機イオンおよび有機栄養源等
より選択されたものを適宜含有する培地であれば合成ま
たは天然培地の何れでも使用可能である。F-10463aは S
ANK13892 株を適当な培地で培養し、それから採取する
ことによって得られる。栄養源としては、従来、真菌類
の培養に利用されている公知のものが使用できる。例え
ば、炭素源としてはグルコース、シュクロース、澱粉、
グリセリン、水飴、糖蜜、大豆油などが使用できる。ま
た、窒素源としては大豆粉、コーンスチープリカー、イ
ーストエキス、麦芽エキス、ジャガイモ、硫酸アンモニ
ウム、硝酸ナトリウム等を使用しうる。このほか必要に
応じて炭酸カルシウム、リン酸塩等の無機塩類を添加す
るほか、菌株の発育を助け、F-10463aの生産を促進する
ような有機および無機物を適当に添加することができ
る。培養法としては、一般の抗生物質を生産する方法と
同じく液体培養法、特に深部培養法が最も適している。
培養は、好気的条件下で行なわれ、培養に適当な温度は
１５ー３０℃であるが、多くの場合２３℃付近で培養す
る。F-10463aの生産は、振盪培養で通常5-8 日で最高値
に達する。
【００３７】培養終了後、培養液中の菌体あるいはロ液
に存在するF-10463aを培養液の容量程度のアセトン、ア
セトニトリルのような有機溶媒を添加し混合することに
より抽出する。抽出物中に存在する固形部分を珪藻土を
ろ過操作助剤とするろ過操作または遠心分離によって分
別し、そのろ液または上清中に存在するF-10463aを、ス
フィンゴミエリナーゼ阻害活性を指標にして、その物理
化学的性状を利用し抽出精製する。例えば、この抽出液
中に存在するF-10463aは、まず濃縮操作で混在する有機
溶媒を除去した後に、水と混和しない有機溶剤、例えば
ｎーブタノール、メチルエチルケトン、酢酸エチル、ク
ロロホルム、塩化エチレン、塩化メチレンなどの単独ま
たは、それらの組み合わせにより抽出精製することがで
きる。あるいは吸着剤として、例えば活性炭または吸着
用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４
（ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨ
Ｐー１０、ＨＰー２０、ＣＨＰー２０Ｐ、ＨＰー５０
（三菱化成（株）製）等を使用する事ができる。F-1046
3aを含む液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純
物を吸着させて取り除くか、またはF-10463aを吸着させ
た後、メタノール水、アセトン水、ｎ−ブタノール水な
どを用いて溶出させることにより得られる。このように
して得られたF-10463aは、更にシリカゲル、フロリジル
のような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、
セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）などを
用いた分配カラムクロマトグラフィ、セファデックスＧ
−２５（ファルマシア製）などを用いたゲルろ過クロマ
トグラフィ、および順相、逆相カラムを用いた高速液体
クロマトグラフィ等で精製することが出来る。
に存在するF-10463aを培養液の容量程度のアセトン、ア
セトニトリルのような有機溶媒を添加し混合することに
より抽出する。抽出物中に存在する固形部分を珪藻土を
ろ過操作助剤とするろ過操作または遠心分離によって分
別し、そのろ液または上清中に存在するF-10463aを、ス
フィンゴミエリナーゼ阻害活性を指標にして、その物理
化学的性状を利用し抽出精製する。例えば、この抽出液
中に存在するF-10463aは、まず濃縮操作で混在する有機
溶媒を除去した後に、水と混和しない有機溶剤、例えば
ｎーブタノール、メチルエチルケトン、酢酸エチル、ク
ロロホルム、塩化エチレン、塩化メチレンなどの単独ま
たは、それらの組み合わせにより抽出精製することがで
きる。あるいは吸着剤として、例えば活性炭または吸着
用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４
（ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨ
Ｐー１０、ＨＰー２０、ＣＨＰー２０Ｐ、ＨＰー５０
（三菱化成（株）製）等を使用する事ができる。F-1046
3aを含む液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純
物を吸着させて取り除くか、またはF-10463aを吸着させ
た後、メタノール水、アセトン水、ｎ−ブタノール水な
どを用いて溶出させることにより得られる。このように
して得られたF-10463aは、更にシリカゲル、フロリジル
のような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、
セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）などを
用いた分配カラムクロマトグラフィ、セファデックスＧ
−２５（ファルマシア製）などを用いたゲルろ過クロマ
トグラフィ、および順相、逆相カラムを用いた高速液体
クロマトグラフィ等で精製することが出来る。
【００３８】スフィンゴミエリナーゼ阻害活性は以下の
方法で測定できる（ J. Lipid Res.20, 456 (1979)）。
方法で測定できる（ J. Lipid Res.20, 456 (1979)）。
【００３９】即ち、先ず、基質溶液として１０μｌの
［Ｎ−メチル−14Ｃ］スフィンゴミエリン（牛、５２ｍ
Ｃｉ／ｍｍｏｌ、２５μＣｉ／ｍｌ；アマシャム社）と
２００μｌのスフィンゴミエリン（牛、２０ｍＭ、シグ
マ社）を窒素ガスで乾固させた後、２００μｌの１Ｍト
リスー塩酸（ｐＨ７. ５）、４０μｌの１０％（ｖ／
ｖ）トリトンＸ−１００、２０μｌの０. ５Ｍ MgCl
2 、及び１. ２４ｍｌのＨ2Ｏを加えて４８℃、３０分
のインキュベーションを行い、プローブ型超音波破砕装
置で、２０Ｗの出力条件下、１５秒、２回の超音波処理
を施し、［14Ｃ］スフィンゴミエリンを含む混合ミセル
系を作成した。
［Ｎ−メチル−14Ｃ］スフィンゴミエリン（牛、５２ｍ
Ｃｉ／ｍｍｏｌ、２５μＣｉ／ｍｌ；アマシャム社）と
２００μｌのスフィンゴミエリン（牛、２０ｍＭ、シグ
マ社）を窒素ガスで乾固させた後、２００μｌの１Ｍト
リスー塩酸（ｐＨ７. ５）、４０μｌの１０％（ｖ／
ｖ）トリトンＸ−１００、２０μｌの０. ５Ｍ MgCl
2 、及び１. ２４ｍｌのＨ2Ｏを加えて４８℃、３０分
のインキュベーションを行い、プローブ型超音波破砕装
置で、２０Ｗの出力条件下、１５秒、２回の超音波処理
を施し、［14Ｃ］スフィンゴミエリンを含む混合ミセル
系を作成した。
【００４０】スフィンゴミエリナーゼ反応は、この様に
して用意した基質溶液１５０μｌに検体溶液１０μｌを
混合し、ウイスターイマミチ系雄性ラット脳のミクロソ
ーム画分（２５、０００×ｇ〜１００、０００×ｇ、蛋
白質濃度３〜４ｍｇ／ｍｌ）４０μｌを酵素溶液として
加えて３７℃、４０分インキュベーションすることによ
り行った。反応終了後、クロロホルム：メタノール
（２：１、ｖ／ｖ）を５００μｌ加えて抽出操作を施
し、得られた水層１５０μｌを３ｍｌのピコフローTM４
０（パッカードジャパン株式会社）と混合して反応物で
ある［14Ｃ］ホスフォリルコリン量を液体シンチレーシ
ョンカウンターで測定した。スフィンゴミエリナーゼ活
性は、この測定値からスフィンゴミエリナーゼ反応に必
要なMgCl2 を除いた場合での測定値を差し引いた値とし
て計算される。
して用意した基質溶液１５０μｌに検体溶液１０μｌを
混合し、ウイスターイマミチ系雄性ラット脳のミクロソ
ーム画分（２５、０００×ｇ〜１００、０００×ｇ、蛋
白質濃度３〜４ｍｇ／ｍｌ）４０μｌを酵素溶液として
加えて３７℃、４０分インキュベーションすることによ
り行った。反応終了後、クロロホルム：メタノール
（２：１、ｖ／ｖ）を５００μｌ加えて抽出操作を施
し、得られた水層１５０μｌを３ｍｌのピコフローTM４
０（パッカードジャパン株式会社）と混合して反応物で
ある［14Ｃ］ホスフォリルコリン量を液体シンチレーシ
ョンカウンターで測定した。スフィンゴミエリナーゼ活
性は、この測定値からスフィンゴミエリナーゼ反応に必
要なMgCl2 を除いた場合での測定値を差し引いた値とし
て計算される。
【００４１】
【実施例】次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれに限定されない。
明するが、本発明はこれに限定されない。
【００４２】実施例１. F-10463a物質の精製 (1) 培養 Dasyscyphus mollissimus(Lasch) Dennis SANK13892 株
を無菌的に、滅菌した後述の組成の培養培地１００ ml
を含む５００ ml の三角フラスコ（種フラスコ）に接種
した。次いでこれを５日間、２００rpm のロータリー振
とう機で前培養を行った。
を無菌的に、滅菌した後述の組成の培養培地１００ ml
を含む５００ ml の三角フラスコ（種フラスコ）に接種
した。次いでこれを５日間、２００rpm のロータリー振
とう機で前培養を行った。
【００４３】
【表１】 培地組成 グリセロール 50g ジャガイモ 50g イ−スト・イクストラクト 5g マルト・イクストラクト 5g 消泡剤(CB-442) 0.2g イオン交換水 1000ml pH 無調整 本培養は以下のように行った。滅菌した上述の組成の培
養培地１００ ml を含む５００ ml の三角フラスコ 15
本に種培養液をそれぞれ５ml入れ、２３℃で７日間、２
００rpm のロータリー振とう機で培養を行った。
養培地１００ ml を含む５００ ml の三角フラスコ 15
本に種培養液をそれぞれ５ml入れ、２３℃で７日間、２
００rpm のロータリー振とう機で培養を行った。
【００４４】 （２）スフィンゴミエリナーゼ阻害活性の測定法 スフィンゴミエリナーゼの酵素標品の調製は、基本的に
は Gatt S.(Biochem.biophys. Res. Commun. 68, 235
(1976)）の方法に従って行った。すなわち、スフィンゴ
ミエリナーゼの酵素源としてラット脳を用い、先ず、以
下の様にそのミクロソーム画分を調製した。１０匹のウ
イスターイマミチ系雄性ラット（９週齢）を頚動脈放血
後、全脳を摘出した。迅速に、小脳を除去後、予め４℃
に冷却したバッファーＡ（０. ２５Ｍ 蔗糖、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭＰＭＳＦ（Phenylmethylsulfonyl Flu
oride ）、０. １ｍＭ ロイペプチン、５ｍＭ トリス
ー塩酸緩衝液、ｐＨ７. ４）１３０ｍｌを加え、４℃条
件下、ポッターのホモジナイザーを用いて脳細胞の破砕
を行った。次に、得られた細胞破砕液を４℃条件下、７
００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、その上清を更
に、４℃条件下、２５、０００×ｇで１０分間の遠心分
離を行った。最後に、得られた上清を４℃条件下、１０
０、０００×ｇで６０分間の超遠心分離を行い、その沈
澱物をミクロソーム画分とした。尚、この画分はスフィ
ンゴミエリナーゼの活性測定時まで液体窒素下で凍結保
存し、使用時にバッファーＡで蛋白質濃度３〜４ｍｇ／
ｍｌ程度になる様に調製した。
は Gatt S.(Biochem.biophys. Res. Commun. 68, 235
(1976)）の方法に従って行った。すなわち、スフィンゴ
ミエリナーゼの酵素源としてラット脳を用い、先ず、以
下の様にそのミクロソーム画分を調製した。１０匹のウ
イスターイマミチ系雄性ラット（９週齢）を頚動脈放血
後、全脳を摘出した。迅速に、小脳を除去後、予め４℃
に冷却したバッファーＡ（０. ２５Ｍ 蔗糖、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭＰＭＳＦ（Phenylmethylsulfonyl Flu
oride ）、０. １ｍＭ ロイペプチン、５ｍＭ トリス
ー塩酸緩衝液、ｐＨ７. ４）１３０ｍｌを加え、４℃条
件下、ポッターのホモジナイザーを用いて脳細胞の破砕
を行った。次に、得られた細胞破砕液を４℃条件下、７
００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、その上清を更
に、４℃条件下、２５、０００×ｇで１０分間の遠心分
離を行った。最後に、得られた上清を４℃条件下、１０
０、０００×ｇで６０分間の超遠心分離を行い、その沈
澱物をミクロソーム画分とした。尚、この画分はスフィ
ンゴミエリナーゼの活性測定時まで液体窒素下で凍結保
存し、使用時にバッファーＡで蛋白質濃度３〜４ｍｇ／
ｍｌ程度になる様に調製した。
【００４５】スフィンゴミエリナーゼ活性は混合ミセル
系を使って、Hostetler K.Y. と Yazaki P.J. の方法
（J. Lipid Res. 20, 456 (1979)）を参考にして、以下
の様に測定した。即ち、先ず、混合した１０μｌの［Ｎ
−メチル−14Ｃ］スフィンゴミエリン（牛、５２ｍＣｉ
／ｍｍｏｌ、２５μＣｉ／ｍｌ；アマシャム社）と２０
０μｌのスフィンゴミエリン（牛、２０ｍＭ、シグマ
社）を窒素ガスで乾固させた後、２００μｌの１Ｍトリ
スー塩酸（ｐＨ７. ５）、４０μｌの１０％（ｖ／ｖ）
トリトンＸ−１００、２０μｌの０. ５Ｍ MgCl2、及び
１. ２４ｍｌの H2Oを加えて４８℃、３０分のインキュ
ベーションを行った。そして、プローブ型超音波破砕装
置で、２０Ｗの出力条件下、１５秒、２回の超音波処理
を施し、［14Ｃ］スフィンゴミエリンを含む混合ミセル
系を作成した。
系を使って、Hostetler K.Y. と Yazaki P.J. の方法
（J. Lipid Res. 20, 456 (1979)）を参考にして、以下
の様に測定した。即ち、先ず、混合した１０μｌの［Ｎ
−メチル−14Ｃ］スフィンゴミエリン（牛、５２ｍＣｉ
／ｍｍｏｌ、２５μＣｉ／ｍｌ；アマシャム社）と２０
０μｌのスフィンゴミエリン（牛、２０ｍＭ、シグマ
社）を窒素ガスで乾固させた後、２００μｌの１Ｍトリ
スー塩酸（ｐＨ７. ５）、４０μｌの１０％（ｖ／ｖ）
トリトンＸ−１００、２０μｌの０. ５Ｍ MgCl2、及び
１. ２４ｍｌの H2Oを加えて４８℃、３０分のインキュ
ベーションを行った。そして、プローブ型超音波破砕装
置で、２０Ｗの出力条件下、１５秒、２回の超音波処理
を施し、［14Ｃ］スフィンゴミエリンを含む混合ミセル
系を作成した。
【００４６】スフィンゴミエリナーゼ反応は、この様に
して用意した基質溶液１５０μｌに検体溶液１０μｌを
混合し、先に供述した酵素溶液４０μｌを加えて３７
℃、４０分インキュベーションすることにより行った。
反応終了後、クロロホルム：メタノール（２：１、ｖ／
ｖ）を５００μｌ加えて抽出操作を施し、得られた水層
１５０μｌを３ｍｌのピコフローTM４０（パッカードジ
ャパン株式会社）と混合して反応物である［14Ｃ］ホス
フォリルコリン量を液体シンチレーションカウンターで
測定した。スフィンゴミエリナーゼ活性は、この測定値
からスフィンゴミエリナーゼ反応に必要なMgCl2 を除い
た場合での測定値を差し引いた値として計算される。
して用意した基質溶液１５０μｌに検体溶液１０μｌを
混合し、先に供述した酵素溶液４０μｌを加えて３７
℃、４０分インキュベーションすることにより行った。
反応終了後、クロロホルム：メタノール（２：１、ｖ／
ｖ）を５００μｌ加えて抽出操作を施し、得られた水層
１５０μｌを３ｍｌのピコフローTM４０（パッカードジ
ャパン株式会社）と混合して反応物である［14Ｃ］ホス
フォリルコリン量を液体シンチレーションカウンターで
測定した。スフィンゴミエリナーゼ活性は、この測定値
からスフィンゴミエリナーゼ反応に必要なMgCl2 を除い
た場合での測定値を差し引いた値として計算される。
【００４７】この方法で測定した、スフィンゴミエリナ
ーゼ反応を 50% 阻害するのに必要な F-10463a の濃度
は 20 μg/mlであった。
ーゼ反応を 50% 阻害するのに必要な F-10463a の濃度
は 20 μg/mlであった。
【００４８】(3) 単離 三角フラスコ 15 本分の培養液を 6N 塩酸で pH 3 に調
整し、続いて 3000 回転、10 分、遠心分離を行った。
得られた菌体に 80% アセトンを 500 ml 加え、1 時間
攪拌した。この混合物を 3000 回転、10 分、遠心分離
を行い、上清を減圧濃縮してアセトンを除去した。次に
これを等量の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層
を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、
減圧濃縮して褐色の油状物を 430 mg 得た。このうち 4
00mg を少量の塩化メチレンーメタノール、100:1 の溶
媒に溶解し、同じ溶媒で平衡化した80ml のシリカゲル
カラムにチャージした。このカラムを 240ml の 塩化
メチレンーメタノール、100:1 の溶媒で溶出し、さらに
240 ml の 50:1, 20:1 及び 10:1 の溶媒で溶出し、そ
れぞれの溶出液を分画した。酵素阻害活性は 20:1 の分
画に認められたのでこの分画を濃縮し、78mg の褐色の
油状物質を得た。これを少量のメタノールに溶解し、以
下のように調製用 HPLC で精製した。すなわち、約 20m
g ずつ、70%アセトニトリル水溶液で平衡化した HPLC
カラム（ナカライテスク製コスモシル5C18-AR, 20 φX2
50mm）にチャージし、同じ溶媒で 10ml/min. の流速で
展開した。210 nm の吸収を検出し、約 30 分にでるピ
ークを分取した。分取した溶液を減圧濃縮し、22mg の
F-10463a 物質を得た。
整し、続いて 3000 回転、10 分、遠心分離を行った。
得られた菌体に 80% アセトンを 500 ml 加え、1 時間
攪拌した。この混合物を 3000 回転、10 分、遠心分離
を行い、上清を減圧濃縮してアセトンを除去した。次に
これを等量の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層
を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、
減圧濃縮して褐色の油状物を 430 mg 得た。このうち 4
00mg を少量の塩化メチレンーメタノール、100:1 の溶
媒に溶解し、同じ溶媒で平衡化した80ml のシリカゲル
カラムにチャージした。このカラムを 240ml の 塩化
メチレンーメタノール、100:1 の溶媒で溶出し、さらに
240 ml の 50:1, 20:1 及び 10:1 の溶媒で溶出し、そ
れぞれの溶出液を分画した。酵素阻害活性は 20:1 の分
画に認められたのでこの分画を濃縮し、78mg の褐色の
油状物質を得た。これを少量のメタノールに溶解し、以
下のように調製用 HPLC で精製した。すなわち、約 20m
g ずつ、70%アセトニトリル水溶液で平衡化した HPLC
カラム（ナカライテスク製コスモシル5C18-AR, 20 φX2
50mm）にチャージし、同じ溶媒で 10ml/min. の流速で
展開した。210 nm の吸収を検出し、約 30 分にでるピ
ークを分取した。分取した溶液を減圧濃縮し、22mg の
F-10463a 物質を得た。
【００４９】
【発明の効果】本発明の新規化合物 F-10463a は、抗Ｈ
ＩＶ剤、抗糖尿病剤、抗動脈硬化剤、抗骨粗しょう症
剤、抗血栓剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、利尿剤、そし
て、呼吸器系疾患、甲状腺疾患、アルツハイマー病、肝
炎、腎炎、白血病、及びカケクシアに対する予防薬、治
療薬として使用できる。
ＩＶ剤、抗糖尿病剤、抗動脈硬化剤、抗骨粗しょう症
剤、抗血栓剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、利尿剤、そし
て、呼吸器系疾患、甲状腺疾患、アルツハイマー病、肝
炎、腎炎、白血病、及びカケクシアに対する予防薬、治
療薬として使用できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/335 ＡＢＪ ＡＢＸ ＡＣＢ ＡＣＤ ＡＣＳ ＡＣＸ ＡＤＰ ＡＤＶ ＡＤＹ ＡＥＤ ＡＥＧ (Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 細矢 剛 茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社 内 (72)発明者 古谷 航平 茨城県つくば市御幸が丘33 三共株式会社 内
Claims (3)
- 【請求項１】下記式で表わされる新規化合物 F-10463a
： 【化１】 - 【請求項２】Dasyscyphus属に属するF-10463a生産菌を
培養し、その培養物よりF-10463aを採取することを特徴
とする F-10463a の製造法。 - 【請求項３】Dasyscyphus属に属する F-10463a 生産菌
が Dasyscyphus mollissimus(Lasch) Dennis SANK13892
株（FERM BP-4491）である、請求項２に記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31786894A JP3623266B2 (ja) | 1993-12-27 | 1994-12-21 | 新規化合物Ｆ−１０４６３ａ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-330613 | 1993-12-27 | ||
| JP33061393 | 1993-12-27 | ||
| JP31786894A JP3623266B2 (ja) | 1993-12-27 | 1994-12-21 | 新規化合物Ｆ−１０４６３ａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07233158A true JPH07233158A (ja) | 1995-09-05 |
| JP3623266B2 JP3623266B2 (ja) | 2005-02-23 |
Family
ID=26569168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31786894A Expired - Fee Related JP3623266B2 (ja) | 1993-12-27 | 1994-12-21 | 新規化合物Ｆ−１０４６３ａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3623266B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1234816A1 (de) * | 2001-02-23 | 2002-08-28 | Hans-Peter Dr. Deigner | Scyphostatin-Analoga als SMase-Inhibitoren |
| DE10352449A1 (de) * | 2003-11-07 | 2005-06-16 | Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg | Mittel zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Morbus Alzheimer |
-
1994
- 1994-12-21 JP JP31786894A patent/JP3623266B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1234816A1 (de) * | 2001-02-23 | 2002-08-28 | Hans-Peter Dr. Deigner | Scyphostatin-Analoga als SMase-Inhibitoren |
| DE10352449A1 (de) * | 2003-11-07 | 2005-06-16 | Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg | Mittel zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Morbus Alzheimer |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3623266B2 (ja) | 2005-02-23 |
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