明 細 書
口腔用組成物 技術分野
本発明は、 う蝕や歯周病の予防又は治療効果を有する抗 体を含有する 口腔用組成物に関 し、 更に詳述すれば長期保 存して も上記抗体の効果が満足に発揮され、 かつ良好な使 用感を有する 口腔用組成物に関する。
背景技術
従来よ り、 う蝕の予防の有効成分と してス ト レプ ト コ ッ カ ス ' ミ ュ ー タ ンス Streptococcus mutans) 菌に 特異的に作用 し、 こ の菌体の歯面への付着阻止、 歯垢形成 阻止作用のある抗体を歯磨等の口腔用組成物中に配合する 研究が行われている。
ま た、 歯周病の予防の有効成分と して歯周病原因菌に特 異的に作用 し、 こ の歯周病原因菌の口腔内への定着を抑制 する効果のある抗体を歯磨等の口腔用組成物中に配合する 研究も行われている。
しか し、 上記抗体は口腔用組成物中に含まれるァニオ ン 活性剤等の影響で失活 しゃすい問題があ り 、 こ のため抗体 の安定化配合技術が以前から種々検討されている。
一方、 口腔用組成物は、 口腔内で使用される も のであ る から使用感の優れている ものでなければな らない。 それ故、 消費者の嗜好のタイプ等,に応じて使用感の向上のために種々 の香料成分を配合する必要があるが、 香料成分の多く は、 抗
体の安定性に好ま し く な い影響を与え る と い う 問題があ つ た。
こ の た め、 抗体安定性及び使用感に優れた 口腔用組成物 の開発が望ま れる。
発明の開示
本発明は抗体安定性に優れ、 長期間保存 して も抗体の効 果が満足に発揮さ れる上、 良好な使用感を有する抗体含有 口腔用組成物を提供する こ とを 目 的 とする。
本発明者は上記目的を達成する ため鋭意検討を重ねた結 果、 血中抗体、 卵中抗体及び乳汁中抗体か ら選ばれる抗体 を含有する 口腔用組成物に、 カルボ ン、 ァネ ト 一ル、 シネ オ ール、 メ チルザ リ シ レ ー ト 、 オイ ゲ ノ ール、 ェチルプチ レー ト及びシ ンナ ミ ッ ク アルデ ヒ ドか ら選ばれる香料成分 と — メ ン ト ールとを重量比で 1 : 9〜8 : 2 の比率で併用す る こ と に よ り 、 意外に も上記抗体が安定に保持さ れ、 長期 間保存後 も満足に抗体活性が残存 してそ の効果が十分に発 揮さ れる上、 使用感に優れた口腔用組成物を得る こ と がで き る こ と を知見 し、 本発明をなすに至っ た。
従っ て、 本発明は、 血中抗体、 卵中抗体及び乳汁中抗体 か ら選ばれる抗体を含有する 口腔用組成物に、 カルボ ン、 ァ ネ ト 一ノレ、 シ ネ オ ール、 メ チノレサ リ シ レ ー ト 、 オ イ ゲ ノ ー ノレ、 ェチルブチ レ 一 ト 及びシ ンナ ミ ッ ク アルデ ヒ ドカ、 ら選 ばれる香料成分と ^ ー メ ン ト ールとを重量比で 1 : 9〜8 : 2 の比率で配合 した こ と を特徴とする 口腔用組成物を提供す る n
本発明の口腔用組成物は、 練歯磨、 潤製歯磨、 粉歯磨、 液 状歯磨等の歯磨類、 マウ ス ゥ ォ ッ シ ュ等の液状口中清涼剤、 ト ロ ー チ等の固形状口中清涼剤、 チ ュ ーイ ン ガム等と して 調製ざれる も ので、 有効成分と して血中抗体、 卵中抗体及 び乳汁中抗体か ら選ばれる抗体を含有する と共に、 カルボ ン、 ァネ ト 一ル、 シネ オール、 メ チルザ リ シ レ ー ト 、 オイ ゲノ 一ノレ、 ェチルブチ レ一 ト及びシ ンナ ミ ッ ク ァノレデ ヒ ド か ら選ばれる香料成分と — メ ン ト ールとを重量比で 1 : 9 〜 8 : 2 の比率で併用 してな る も のであ る。
こ こ で、 上記抗体と しては、 種々 の抗原に対する抗体を 使用 し得る。 例えば、 う 蝕原因菌の種々 の抗原に対する抗 体を使用 し得る。 う蝕原因菌と して は、 ス ト レプ ト コ ッ カ ス · ミ ュ ータ ンス菌等の抗体を使用 し得る。
ま た、 歯周病原因菌の種々 の抗原に対する抗体を使用 し 得る 。 こ こ でい う 歯周病原因菌と しては、 一般に歯周病と 病因論的因果関係が深い と考え られている ァ ク チ ノ ノ チル ス · ァ ク チ ノ マイ セテム コ ミ タ ンス、 ポノレフ イ ロ 乇ナス * ジ ン ジ ノく リ ス、 ァ ク チノ マイ セス * ピス コ一サス、 プ レボテー ラ ' イ ン タ ー メ デ ィ ア、 フ ゾノ ク テ リ ゥ ム ' ヌ ク レ ア タ ム、 キ ヤ プノ サイ 卜 フ ァ ガ属菌種、 オイ ケネ ラ ' コ ロ ー デ ンス、 キ ャ ン ピ ロノく、 ク タ一 · レ ク タ ス、 ノ ク テ ロ イ デス · フ ォ ー サイ サス、 ト レポネ ーマ · デンテ ィ コ ー ラ な どのス ピロへ一 タ等を用 い る こ と ができ る 。
上記抗体は、 上記う 蝕原因菌ゃ上記歯周病原因菌の全菌 体、 線毛、 莢膜、 菌体抽出物又は菌体表層由来多糖な どを
抗原と し、 こ れを哺乳動物に免疫する こ と に よ っ て得 られ る血中抗体又は乳汁中抗体、 あ る いは家禽に免疫する こ と によ っ て得られる卵中抗体を用いる こ とができ る。 ま た、 公 知の方法に準 じて調製 したモ ノ ク ロ ーナル抗体を用いて も 差 し支えない。
上記抗体の調製方法、 即ち動物への免疫方法、 抗体の精 製方法等と しては通常の方法を採用する こ と ができ る。 な お、 そ の具体的な調製例を後述の参考例に示 した。
本発明の口腔用組成物において、 上記抗体は、 その 1種を 単独で配合 して も よ く 、 2種以上を併用 して も よい。 ま た、 上記抗体の配合量は特に制限さ れないが、 通常口腔用組成 物中に 0 . 0 0 0 1〜 1 0 % (重量%、 以下同様)、 好ま し く は 0 . 0 0 2〜 5 %配合する こ とができ る。
本発明では、 上記抗体含有口腔用組成物に、 カルボ ン、 ァ ネ ト ール、 シネオ ール、 メ チルザ リ シ レ ー ト 、 オ イ ゲ ノ 一 ル、 ェチルプチ レ ー ト 及び シ ン ナ ミ ッ ク アルデ ヒ ドか ら選 ばれる 1種類又は 2種類以上を配合する ものであるが、 中で もァネ ト ールが好適に使用 し得る。
ま た、 上記香料成分は、 それぞれを単体と して配合 して も よ いが、 こ れ らを含む精油等、 例えばカ ルボ ンの場合は スペア ミ ン ト 油等を配合 して も よ い。
更に、 上記香料成分と併用する ー メ ン ト ールについて も、 単体と して配合 して も よいが、 これを含有する精油等、 例えばペパー ミ ン ト油、 和種ハ ツ 力油等を配合 して も よい。
上記香料成分と ー メ ン ト ール と の配合割合は、 重量比
で 1 : 9〜 8 : 2、 好ま し く は 2 : 8〜 7 : 3の比率とする も の で、 こ の比率範囲内で配合する こ と に よ り 、 抗体を安定配 合する こ と がで き 、 かつ清涼感、 コ ク 、 か ら味な どを適当 な も のに して使用感を向上さ せる こ とができ る。 こ れに対 し、 上記香料成分の配合割合が上記範囲よ り 少な い と、 コ ク 、 か ら味が不足 して使用感が低下 し、 ま た上記香料成分 が上記範囲よ り 多い と、 抗体の安定性が低下 し、 かつ清涼 感も不足 して本発明の 目 的を達成でき ない。
ま た、 上記香料成分の配合量は、 組成物全体の 0.01〜0. 5 % とする こ とが望ま し く 、 0.01 %に満たない と使用感が 低下する場合があ り 、 0.5 %を越える と抗体の安定性が低下 する と共に使用感が低下する場合があ る。
更に、 本発明では、 上記香料成分と ー メ ン ト ール と の 合計配合量を組成物全体の 0.1〜 5 %、 特に 0.3〜3 %とす る こ とが望ま しい。 合計配合量が 0.1 %に満たない と コ ク 、 清涼感が不足する場合があ り 、 5 %を越える とか ら味が強く な り 過ぎる こ とがあ り 、 かつよ り 多 く 配合 して も抗体の安 定性がそれ以上向上 しな い場合があ る。
本発明の 口腔用組成物には、 有効成分と して上記抗体に 加え、 デキス ト ラ ナ ー ゼ、 ア ミ ラ ー ゼ、 プ ロ テア ー ゼ、 ム タ ナーゼ、 リ ゾチーム、 溶菌酵素等の酵素、 ク ロルへキ シ ジ ン類、 ト リ ク ロ サ ン、 セ チノレ ピ リ ジニ ゥ ム ク ロ ラ イ ド等 の殺菌剤、 アルカ リ 金属モ ノ フ ルォ ロ ホ ス フ ヱ 一 ト 、 フ ッ 化ナ ト リ ウ ム、 フ ッ化第 1錫等の フ ッ化物、 第 1錫化合物、 ィ プ シ ロ ン ア ミ ノ カ プ ロ ン酸、 ト ラ ネ キサ ム酸、 ア ラ ン ト
イ ン 、 ァ ノレ ミ ニ ゥ ム ク ロ ノレ ヒ ド ロ キ シ ア ラ ン ト イ ン 、 ジ ヒ ド ロ コ レ ス テ ロ一ノレ、 ダ リ チ ノレ リ チ ン塩、 ァ ズ レ ン 、 ビ 夕 ミ ン E、 塩化ナ ト リ ゥム、 水溶性無機リ ン酸化合物等を配合 し得る。 特に上記抗体に ソ ジゥ ムモ ノ フ ルォ ロ ホス フ エ一 ト等のアルカ リ 金属モ ノ フ ルォ ロ ホス フ ヱ一 ト を併用する と、 抗体をよ り安定化 し、 長期保存後におけ る抗体残存率 を高 く 維持する こ とができ る ので望ま しい。 こ の場合、 ァ ル カ リ 金属モ ノ フ ルォ ロ ホ ス フ ヱ一 卜 の添加量は、 フ ッ素 と して 1 0 p p m〜1 0 0 0 0 p p m とする こ とが好ま しい。 なお、 水溶性無機リ ン酸化合物と しては、 正 リ ン酸、 ピロ リ ン酸、 ポ リ リ ン酸のカ リ ウ ム塩、 ナ ト リ ウ ム塩等が例示されるが、 特に上記 リ ン酸の力 リ ゥ ム塩が好ま しい。
ま た、 上記香料成分に加え、 炭素数 7〜1 7 の脂肪族ア ル コ ー ノレや そ の エ ス テル、 テ ルペ ン系炭化水素、 フ ヱ ノ ー ル エーテル、 アルデ ヒ ド、 ケ ト ン、 ラ ク ト ンな どの他の香料 成分、 精油を本発明の効果を妨げな い範囲で配合 して も差 し支えな い。
本発明組成物には、 その他の成分と して組成物の種類に 応 じて通常使用 さ れる成分を配合 し得る。 例えば歯磨類の 場合には、 研磨剤と して酸化ア ル ミ ニ ウ ム 、 水酸化アル ミ 二ゥ ム、 第 2 リ ン酸カルシ ウ ム · 2水和物又は無水物、 シ リ 力 ゲル、 ジ ノレ コ ノ シ リ ケ 一 卜 、 無水ゲ イ酸、 ァ ノレ ミ ノ シ リ ゲ ー ト 、 炭酸カ ノレ シ ゥ ム 、 ピ ロ リ ン酸カ ノレ シ ゥ ム 、 ゲ イ 酸 アル ミ ニ ウ ム 、 不溶性メ タ リ ン酸ナ ト リ ウ ム 、 第 3 リ ン酸マ グネ シ ゥ ム 、 炭酸マ グネ シ ウ ム 、 硫酸カ ル シ ウ ム 、 合成樹
脂等の 1種又は 2種以上を通常全体の 2 0〜 9 0 %、 特に練歯 磨の場合には 2 0〜 6ひ%の配合量において配合し得る。 なお、 本発明では、 シ リ 力系化合物を主研磨剤と して使用する こ とが好ま し く 、 こ れに よ り 抗体及び歯磨自体の安定性を更 に確実に向上さ せる こ とができ る。 シ リ カ系化合物と して は、 例えば沈降性シ リ カ、 シ リ カ ゲル、 アル ミ ノ シ リ ケ一 卜 、 ジノレコ ノ シ リ ケ一 ト 等を挙げる こ と ができ、 ま た、 そ の粒径は 1 〜 3 0 m である こ と が使用性の点か ら好ま しい。
ま た、 歯磨組成物には、 力 ラ ゲナ ン 、 カ ルボキ シ メ チル セルロ ー スナ ト リ ウ ム、 アルギ ン酸ナ ト リ ウ ム等をアルギ ン酸アルカ リ 金属塩、 ガム類、 ポ リ ビニルアルコール、 ビー ガム等を配合 し得る (配合量通常 0 . 3〜5 % )。 特に有効成 分と して アルカ リ 金属モ ノ フ ルォ ロ ホ ス フ エ 一 卜 を配合す る と き は、 組成物の安定性、 使用感の面か ら 力 ラ ゲナ ン と アルギン酸アルカ リ 金属塩とを併用する こ とが望ま しい。 こ の場合、 力 ラゲナ ン と しては、 通常の力 ラゲナ ン (カ ツノ 一
Zィ ォタ ー混合系) に比べてカ ツ ノ、。一力 ラ ゲナ ン ( c — 力 ラ ゲナ ン) が歯磨組成物の肌あれ防止の点で効果的であ る こ とか ら、 と り わけ c 一 力 ラ ゲナ ンを使用する こ とが好ま しい。
更に、 粘稠剤と して ソノレ ビ ッ ト 、 グ リ セ リ ン、 プロ ピ レ ング リ コ ーノレ、 1, 3 — ブチ レ ング リ コ 一ノレ、 ポ リ エチ レ ング リ コ ー ノレ、 キ シ リ ツ 卜 、 マ ルチ ッ 卜 、 ラ ク チ ッ 卜 等を配合 し得る (配合量通常 1 0〜7 0 % )。 こ の場合、 粘稠剤分散液 と してプロ ピレ ング リ コールを用いる こ とが望ま しいが、 多
量に配合する と保存に よ る抗体残存率が低下する ため、 主 粘稠剤と して ソ ル ビ ッ ト を配合 し、 プロ ピ レ ン グ リ コ ール を併用する こ とが望ま しい。
ま た更に、 ソ ジ ゥ ム ラ ウ リ ノレサノレフ エ 一 卜 、 ラ ウ ロ イ ル ザノレコ シネ ー ト 、 ひ 一ォ レ フ イ ンスノレフ ォ ネ ー ト 、 タ ウ レー 卜 、 ラ ウ リ ノレモ ノ グ リ セ ラ イ ドサノレフ ェ ー ト 、 ラ ウ リ ノレモ ノ グ リ セラ イ ドスルフ ォ ネー ト 、 石鹼等のァニオ ン活性剤、 ラ ウ リ ン酸ジエ タ ノ ー ルア ミ ド、 ス テア リ ルモ ノ グ リ セ ラ ィ ド、 シ ョ 糖脂肪酸エステル、 ラ ク ト ー ス脂肪酸エステル、 ラ ク チ ト ール脂肪酸エス テル、 マルチ ト ール脂肪酸エス テ ル、 ポ リ オキ シエチ レ ン ソ ノレ ビタ ン モ ノ ス テ ア レ ー ト 等の ノ ニオ ン活性剤、 ベタ イ ン型、 ア ミ ノ 酸型等の両性活性剤
(配合量通常 0 . 5〜 7 % )、 サ ッ カ リ ンナ ト リ ウ ム、 ス テ ピオ サイ ド、 ネオヘスペ リ ジノレジ ヒ ドロ 力ノレコ ン、 タ ウマチ ン、 グ リ チル リ チ ン、 ペ リ ラルチ ン等の甘味剤、 パラオキ シ安 息香酸エス テル、 安息香酸ナ ト リ ウ ム等の防腐剤、 ゼラ チ ン、 ペプ ト ン等の成分を配合 し得る。
練歯磨を製造する場合は、 上記成分を適当量の水と練合 する こ と に よ り 製造 し得る。 なお、 こ の よ う に して得 られ た練歯磨組成物は、 アル ミ ニ ウ ム チ ュ ー ブ、 アル ミ ニ ウ ム 箔の両面をプラ スチ ッ ク 等でラ ミ ネ 一 ト した ラ ミ ネ 一 ト チ ユ ーブ、 プラスチ ッ ク チ ュ ーブや、 ボ トル状容器、 エア ゾ一 ル容器等の所定の容器内に収容 して使用する こ とができ る。
ま た、 練歯磨以外の 口腔用組成物 も通常用い られる基材 を使用 し、 常法に従っ て製造する こ とができ る。
本発明の口腔用組成物は、 血中抗体、 卵中抗体及び乳汁 中抗体が安定に保持されてその効果が長期間にわた っ て有 効に発揮される上、 香料成分を幅広 く 選択でき、 使用感が 良好な も のであ る。
以下、 実施例と比較例を示して本発明を具体的に説明す るが、 本発明は下記の実施例に制限される も のではない。
なお、 各例中の%はいずれも重量%である。
〔抗体調製法 A〕
まず、 下記方法で抗原を調製した。
(l) PAc抗原の調製
PAc抗原の調製はレーナ一らの方法(J. General Microbiology, 122,217 - 225,1981 ) に準じて行い、 S.mutans 10449 を T P Y透析培地 20 リ ッ ト ルで培養し、 遠心して得られた 上清を 60 %硫酸ア ンモニゥムを用いて分画し、 沈澱を採取 した。 こ の沈澱を 10mMの ト リ ス —塩酸緩衝液 (pH7.5) に溶解させ、 同緩衝液で透析し、 DEAE — Sephacel カラ ムク ロマ ト グラ フ ィ ーに吸着させ、 NaC ^ の濃度勾配によ り溶出させた。 更に、 目的分画を濃縮後、 Sepharose6B に よ る ゲルろ過に よ っ て精製した。
(2) 全菌体抗原の調製
S.mutans 10449を TTY培地 20 リ ッ ト ルで好気条件 下 37 °Cで 18時間静置培養した。 培養液を 8000rpm、 20 分の遠心分離によ り菌体と培養上清とに分離した。 集菌後、 リ ン酸緩衝液 (PBS) にて 3回洗浄し、 更に滅菌蒸留水に て 3回洗浄後、 凍結乾燥さ せた。
(3) 菌体結合ダルコ シル ト ラ ンス フ ヱ ラ ーゼ (GTF) の調 製
S.mutans 10449を TTY培地 20 リ ッ ト ルで好気条件 下 37 °Cで 18時間静置培養した。 ±咅養液を 8000rpm、 20 分の遠心分離によ り菌体と培養上清とに分離した。 集菌後、 生理食塩水にて 3回洗浄し、 4M尿素と 0.5M食塩を含む液 で室温で 1時間ゆっ く り と撹拌しながら抽出を行った。 遠心 (8000rpm,20分) によ り菌体から分離し、 10mMの リ ン 酸緩衝液 ( p H 6.0 ) にて透析した。 生じた沈澱を遠心によ り除去し、 上清に 60 %飽和硫安沈澱処理を行い、 得られた 沈澱物を上記の遠心条件で回収した。 こ の沈澱物を上記緩 衝液に溶解させ、 同緩衝液で透析し、 透析内液の沈澱物を 遠心によ り除去し、 上清を 0.22 mのろ過滅菌膜でろ過滅 菌し、 免疫用抗原と した。
(4) 水溶性グルカ ン合成酵素 (GTF — S) の調製
S.mutans 10449を TTY培地 20 リ ッ ト ルで好気条件 下 37 °Cで 18時間静置培養した。 培養液を 8000rpm、 20 分の遠心分離によ り菌体と培養上清とに分離した。 培養上 清に 55 %飽和の硫安沈澱処理を行い、 得られた沈澱を遠心 分離法によ り回収した。 次に、 こ の沈澱物を Histidine— HC 緩衝液 (pH6.0) に溶解し、 同溶液に透析した。 生 じた沈澱を遠心分離法にて除去し、 上清を 0.22 mの ろ過 滅菌膜でろ過滅菌後、 ポ リ ノくッ フ ァ ー P B E 94 (フ アルマシ ァ社製) の 2.5 X 25cmの カ ラ ム にかけた。 カ ラ ム に吸着 した分画は、 ポ リ バ ッ フ ァ ー 74 (フ ァ ノレマ シ ア社製) を用
いた pH勾配によ って選択的に溶出させた。 pH5.5〜4.9の 分画に強い GTF活性が認められた。 この分画を集め、 80 % 飽和硫安沈澱処理を行い、 沈澱物を得た。 沈澱物を 10mM リ ン酸緩衝液 (pH6.0) に溶解し、 同溶液に対して透析し た。 更に、 溶液中に生じた沈澱を遠心分離法によ り除去し、 上清を抗原と した。
なお、 GTF活性は、 試料 10 cz を基質と して 20mM 〔" Cー グノレコ ー ス〕 シ ユ ーク ロー ス (O.OSciZmol) を含む 0.2M リ ン酸緩衝液 (pH6.0) 10 z と混合し、 37 °Cで 1時間反応後、 反応液液全量を濾紙 (1 X lcm) にスポ ッ ト し、 これをメ タ ノ ールで洗浄後、 濾紙上に残ったメ タ ノ ー ルに不溶性のグルカ ン中に取り込まれた放射能量を測定し て G T F活性を算出 し、 1分間に 1 m o 1のグルコースをグ ルカ ン に転移させる活性を 1単位と した。
次に、 下記方法で上記で得られた各抗原に対する鶏卵抗 体、 抗血清抗体、 母乳抗体を調製した。
(1) 鶏卵抗体の調製
上記抗原を lmgZm 含む液 0.5m と FIA (フ ロイ ン 卜不完全アジュバン ト) 0.5m £ を 1 : 1の割合で混合して W / 0型のェマルジ ヨ ン と した。 得られたェマルジ ヨ ンを鶏 の左右の胸筋に 0.5m ずつ注射し、 初回免疫を行った後、 更に 1週間ごとに免疫を続け、 1 ヶ月後から採卵した。 なお、 抗体価が低下したときは適宜免疫を繰り返し、 約 1年間採卵 を続けた。 次に、 卵から分離した卵黄に等量の水を加え、 更 に等量の 0.5 %ス 一力ラギーナンの懸濁液を加えて撹拌後、
8000rpmで 20分間遠心 して上清を得、 こ れを抗体含有画 分 ( W S F ) と し、 その抗体価を測定して利用 した。 以上の 操作から鶏卵抗体 80〜 320単位/ m £ (lmg/m ί ) の 液 10 m _β が得られた。
(2) 母乳抗体の調製
抗原を 50 β g/m i 〜200mg m ί の濃度に調製して 等量のフ ロ イ ン ト不完全ア ジュバ ン ト と混合し、 これを妊 娠ャギ、 ゥサギ、 ゥ シ、 ゥマの背部皮下に 1個体当た り 0. 3 m となる よ う に注射して免疫し、 更に 2〜 4週間おきに 抗原と フ ロ イ ン ト不完全ア ジ ュバ ン とを混合した も ので 3回免疫した後、 出産後に初乳を採取した。 次に、 上記初乳 サンプルに等量の 0.9 %食塩水を加え、 1200rpmで 60分 間遠心分離した後、 上層の脂肪と沈澱物を除いて中間の液 成分を採取し、 これに濃塩酸を加えて pH4に調製した。 更 に、 5000rpmで 30分間遠心分離し、 その上清を 卜 リ スハ ィ ドロキ シァ ミ ノ メ タ ンで中和 した後、 硫酸ア ンモニ ゥ ム を加えて 75 %飽和にし、 得られた沈澱物を採取した。 この 沈澱物を リ ン酸緩衝液で透析して母乳の抗体成分 (内液) を 得た。 初乳抗体 10〜 20単位 Zm £ (lmg/m £ ) の液が 得られた。
(3) 抗血清抗体の調製
上記と同様に 4回免疫後採血して凝固させ、 その遠心上清 をサ ンプルと した。 こ の抗血清に硫酸ア ン モニゥ ムを加え て 50 %飽和と して得られた沈澱物を リ ン酸緩衝液で透析し、 抗血清の抗体 (内液) を得た。 血清抗体約 80〜 320単位/
m i ( 1 m g / m i ) の液が得られた。
なお、 上記各抗体の抗体価は菌体凝集試験法を使用 して 下記方法で測定した。 抗体価の測定法 :
(1) 菌体浮遊液
TYC寒天培地上の S.mutans 10449の コ ロニー 1〜2 個を 200m の BHI液体培地に接種し、 37 °Cで 18時間嫌 気的に培養後、 集菌し、 0.1 %牛血清アルブミ ンを添加した 生理食塩水 (BSA生食水) で 3回洗浄した。 洗浄した菌体 を BSA生食水に浮遊させ、 0 D55。nm 1.0 に調整した。 菌体浮 遊液は、 用時調製と した。
(2) 試料抗体
抗体を希釈倍率 20、 30、 50、 70、 90で希釈したものを それぞれ 2n倍希釈した。
(3) 操作法
マイ ク ロ プレー ト上で 50 ^ の希釈抗体と 50 ^ の菌 体浮遊液を混合して撹拌後、 37 °Cで 3時間、 更に 4 °Cで一 夜静置した。
(4) 菌体凝集の判定
一夜静置後、 マイ ク ロプレー ト底を観察、 菌体のスポ ッ 卜が出現しない場合を凝集陽性と し、 わずかなスポ ッ 卜で も観察された場合は凝集陰性と した。
〔実施例 1〜 9、 比較例 1, 2〕
表 1に示す処方の練歯磨組成物を調製し、 調製直後及び 40 °Cで 1 ヶ月保存した後の抗体量を免疫抗原を用いて ELISA 法によ り測定し、 抗体の残存率を求めた。 結果は、 配合直
後値を 100 %と して分母に し、 40 °C保存後の値を分子に し た残存活性と して求めた。 ま た、 こ れ ら の練歯磨組成物の 使用感を専門パネルにて官能試験で評価した。 結果を表 1 に 示す。
(表 1)
抗体残存率評価基準 使用感評価基準
〇:残存率 70 %以上 〇:良好
△:残存率 30 %以上 70 %未満 X :香味が単調で使用感悪い
X :存在量 30 %未満 V:清涼感不足し使用感悪い
(表 2)
実施例 実施例 実施例 実施例 実施例 実施例 歯 磨 組 成 物 成 分 4 5 6 7 8 9 無 水 ゲ イ 酸 20 % 20 % 20 % 20 % 20 % 20 % ノゲ リノ セ りノ ン"^ 30 30 30 30 30 30 ゝ , レ、、 "
ノ ノレ ッ 卜 9Π n Δ onυ カルボキシメチルセル l.U 八
ロースナ ト リウム 1.八0 1.0 i.U l.U
、 / ノ
つ ノ ^ ノ ノ \ソ] /し
ノ / ノレ 1.2 1.2 1.2 1.2 サルフ ヱ一 ト 1.2 1.2
フゥリノレンエタノーノレ 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 アマイ ド
ゼ ラ チ ン 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 カ ル ボ ン 0.4 ― 一 ― ― 一 シ ネ オ 一 ル ― 0.3 ― 一 ― 一 メ チルサ リ シ レー ト ― ― 0.5 一 ― ― オ イ ゲ ノ ー ル ― ― ― 0.1 ― ― ェ チ ル ブチ レ 一 ト ― ― 一 ― 0.1 ― シンナミックアルデヒド ― ― ― ― ― 0.3
£ 一 メ ン ト ー ル 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 サ ッ カ リ ン 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 オ レ ン ジ 油 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 ベ ン ズ ア ルデ ヒ ド 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 フ ツ イヒ ナ ト リ ウ ム 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 P A c 八
抗 馬血清抗体 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 水 残
計 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 抗 体 残 存 率
(40°C,1ヶ月保存) 〇 〇 〇 〇 〇 〇 使 用 感 〇 〇 〇 〇 〇 〇
〔抗体調製法 B〕
まず、 下記の方法で抗原を調製した。
( 1 ) ボルフ イ ロモナ ス · ジ ン ジバリ ス の全菌体抗原の調製 ポノレフ ィ ロ モナス · ジ ン ジノ リ ス 381株 (FERM BP— 1027 ) をへ ミ ン及びメ ナジオンを加えた ト ツ ドへビッ トブ ロスで 2 日間培養後、 集菌した。 これを PBS (リ ン酸緩衝 液 ; pH7.4) で洗浄後、 0.5 %のホルマ リ ンで一晩処理し、 PBSで 3回洗浄して、 全菌体抗原と した。
(2) ボルフ イ ロモナス ' ジ ン ジバ リ ス の線毛抗原の調製 上記と同様に 2 日間培養したポルフ ィ ロモナス · ジ ン ジバ リ スを集菌、 洗浄後 PBS中でガラス ビーズと共に 2 日間ゆ るやかに撹拌し、 注射針 (No.25) 中を 3回通過させて、 菌 体よ り線毛を分断した。 次いで、 8,000rpm,15分間の遠 心で上清の線毛層を分離し、 透析後、 凍結乾燥した ものを 線毛抗原と した。
(3) ボルフ イ ロ モナ ス · ジ ン ジバ リ ス の莢膜抗原の調製 上記と同様に集めた菌体を 0.01M EDTAを含む PBSに 懸濁 し、 60 °Cにおいて 30分間反応させた後、 注射針中を 3回通過させて、 菌体より莢膜を分離した。 次いで、 8,000rpm, 15分間の遠心分離で菌体を除去した上清を更に 40,000rpm, 2時間超遠心分離し、 そ の沈渣を莢膜抗原と した。
(4) ァ ク チ ノ チノレス · ァ ク チ ノ マ イ セ テ ム コ ミ タ ン スの 菌体表層多糖抗原の調製
ァ ク チ ノ バチルス · ァ ク チ ノ マイ セテム コ ミ タ ンス Y4株 ( ATCC 43718) を 1 %酵母エキスを加えた ト ッ ドへビッ
ト ブロスに接種し、 5 % C02を含むイ ンキュベータ 一中で 37 °C, 3 日間.培養した。 集菌後、 生理食塩水で 3回洗浄して生 理食塩水に懸濁し、 121 °C,15分間オー ト ク レープ処理を行 つ た。' 冷却後、 10, 000 X gで 20分間遠心 して上清を分取 し、 沈渣には再度生理食塩水を加えて上述の抽出操作を繰 り返 した。 得られた上清を集め、 蒸留水に対して十分透析 し、 凍結乾燥した。 こ れを菌体表層多糖抗原と した。
次に、 上記で得られた各抗原に対する鶏卵抗体、 抗血清 抗体、 母乳抗体を調製した。
(1) 鶏卵抗体の調製
上記抗原を lmgZm i含む液 0.5m と FIA (フ ロイ ン 卜不完全アジュバン ト) 0.5m を 1 : 1 の割合で混合して W / 0型のェマルジ ヨ ン と した。 得られたェマルジ ヨ ンを鶏 の左右の胸筋に 0.5m ずつ注射し、 初回免疫を行った後、 更に 1週間ごとに免疫を続け、 1 ヶ月後から採卵した。 なお、 抗体価が低下したときは適宜免疫を繰り返し、 約 1年間採卵 を続けた。 次に、 卵から分離した卵黄に等量の水を加え、 更 に等量の 0.5 % λ —力ラギーナ ンの懸濁液を加えて撹拌後、 8000 r p mで 20分間遠心 して上清を得、 これを鶏卵抗体標 σ と した
(2) 抗血清抗体の調製
抗原を ノ m 〜 200mgZm の濃度に調製して 等量のフ ロ イ ン ト不完全ア ジ ュバ ン ト と混合し、 こ れをャ ギ、 ゥサギ、 ゥ シ、 ゥマ、 ヒ ッ ジの背部皮下に 1個体当た り 0.3m £ となる よ う に注射して免疫し、 更に 2〜4週間おき
に抗原と フ ロ イ ン ト不完全ア ジュ ノ ン 卜 とを混合した もの で 3回免疫した後、 血液を採取して凝固させ、 その遠心上清 を集めて抗血清サ ン プルと した。 こ の抗血清に硫酸ア ン モ 二ゥムを加えて 50 %飽和と して得られた沈澱物を リ ン酸緩 衝液で透析した も のを抗血清抗体標品と した。
(3) 母乳抗体の調製
妊娠したャギ、 ゥ シ、 ヒ ッ ジに対して上記と同様の方法 で 4回免疫した後、 出産後に初乳を採取した。 次に、 上記初 乳サンプルに等量の 0.9 %食塩水を加え、 1200rpmで 60 分間遠心分離した後、 上層の脂肪と沈澱物を除いて中間の 液成分を採取し、 こ れに濃塩酸を加えて PH4.0に調製した。 更に、 5000rpmで 30分間遠心分離し、 その上清を ト リ ス ノヽィ ド ロ キ シ メ チルァ ミ ノ メ タ ン で中和 した後、 硫酸ア ン モニゥムを加えて 75 %飽和に し、 得られた沈澱物を採取し た。 こ の沈澱物を リ ン酸緩衝液で透析した ものを母乳抗体 ネ α口 と し / 0
〔実施例 10〜: L 8、 比較例 3, 4〕
表 3,4 に示す処方の練歯磨組成物を調製し、 調製直後及 び 40°Cで 1ヶ月保存した後の抗体量を免疫抗原を用いて ELISA 法によ り測定し、 抗体の残存率を求めた。 結果は、 調製直 後値を 100 %と して分母に し、 40 °C保存後の値を分子に し た残存率と して求めた。 ま た、 こ れ ら の練歯磨組成物の使 用感を専門パネルにて官能試験で評価した。 結果を表 3,4に 示す。 なお、 下記例で配合量 (% ) はいずれも重量%を示 す。 ま た、 Agはァ ク チ ノ ノく チルス ' ァ ク チ ノ マイ セテム コ
ミ 夕 ン ス 、 P g は ポ ノレ フ イ ロ モ ナ ス · ジ ン ジ ノ《 リ ス 、 A V は ァ.ク チ ノ マ イ セス · ピス コ一サス、 P i はプ レ ボテー ラ · ィ ン 夕 一 メ デ ィ ア、 F n は フ ゾノく ク テ リ ウ ム · ヌ ク レ ア タ ム、 C r はキ ャ ン ピロ ノ ク タ一 · レク タス、 B f はノ ク テロ イ デス · フ ォ ーサイ サス、 T d は 卜 レポネーマ ' デ ンテ ィ コ ー ラ を示 す。
(表 3)
抗体残存率評価基準 使用感評価基準
〇:残存率 70 %以上 〇:良好
△:残存率 30 %以上 70 %未満 X :香味が単調で使用感悪い
X :残存率 30 %未満 V:清涼感不足し使用感悪い
(表 4)
第 2 リ ン酸カ ル シ ウ ム · 2水和物 50 .0 %
\ ?1. レ、、 、、, L
ノ ノレ に ッ P 10 .0
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ソ 7 ノ 10 .0 ^ + 、
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ノ Γ ―一 ノ jし
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ノ 卜 /田 rb 0 .6 オ イ ゲ ノ ― ル 0 .03 ァ ネ ト ー ル 0 .17 サ ッ カ リ ン 0 .1 エ タ ノ ー ル 2 .0 デキ ス 卜 ラ ナ ー ゼ 0 .02 抗 PAcャギ乳抗体又は抗 Pg菌体 0 .2 表層多糖羊血清抗体
水.
100. 0 %
〔実施例 20〕 歯磨剤
無水ゲ イ酸 30 .0 % グ リ セ リ ン 30 .0 ソ ノレ ビ ッ 卜 20 .0 カ ノレ ボ キ シ メ チ ノレセ ノレ ロ ー ス 1 .0 ソ デ ィ ゥ ム ラ ゥ リ ゾレサ ノレ フ ェ ー ト 1 • 2 ー メ ン ト ー ル 0 • 1 力 ノレ ボ ン 0 .05
ス ペ ア ミ ン ト油 0.4 ぺノ、。 一 ミ ン ト油 0.3 サ ッ カ リ ン 0.1 エ タ ノ ー ノレ 2.0 フ ッ 化ナ ト リ ウ ム 0.1 抗 PAc馬血清抗体又は抗 Pg全菌体 0.1 馬血清抗体
Zi
100.0 %
〔実施例 21〕 歯磨剤
水酸化ア ル ミ ニ ウ ム 45.0 % ソ ノレ ビ ッ ト 20.0 力 ラ ゲ ナ ン 0.5 カ ノレ ボ キ シ メ チ ノレセ ノレ ロ ー ス 1.0 ラ ウ リ ノレ ジ エ タ ノ ー ル ァ マ イ ド 1.0 シ ョ 糖モ ノ ラ ウ レ ー ト 2.0 ー メ ン ト ー ル 0.6 ペパー ミ ン ト油 0.2 シ ネ オ一ノレ 0.4 サ ッ カ リ ン 0.1 抗 P A c牛乳抗体 0.3
^
00.0 %
〔実施例 22〕 歯磨剤
水酸化ア ル ミ ニ ウ ム 45.0 %
ソ ノレ ビ ッ ト 20.0 力 ラ ゲ ナ ン 0.5 カ ノレ ボ キ シ メ チ ノレセ ノレ ロ ー ス 1.0 ラ ウ リ ノレ ジ エ タ ノ ー ル ァ マ イ ド 1.0 シ ョ 糖モ ノ ラ ウ レ ー ト 2.0 一 メ ン ト ー ル 0.6 ぺノ、°一 ミ ン ト油 0.2 シ ネ オ一ソレ 0.4 サ ッ カ リ ン 0.1 抗 Pg線毛馬血清抗体 0.2 抗 A a線毛馬血清抗体 0.2
Ζί
100.0 %
〔実施例 23〕 歯磨剤
第 2 リ ン酸カ ノレ シ ゥ ム 45.0 % カ ル ボ キ シ メ チ ルセ ル ロ ー ス 1.0 力 ラ ゲ ナ ン 0.5 ソ ノレ ビ ッ ト 35.0 プ ロ ピ レ ン グ リ コ ー ノレ 3.0
Ν —ラ ウ ロ イ ノレ メ チ ル タ ウ リ ン ナ ト リ ウ ム 0.5 ゼ ラ チ ン 1.0 パ ラ ォ キ シ安息香酸ェ チ ル 0.2 サ ッ カ リ ン ナ ト リ ウ ム 0.1 £ ー メ ン ト ー ノレ 0.6 メ チ ルサ リ シ レ ー ト 0.3
モ ノ フ ノレオ 口 リ ン酸ナ ト リ ウ ム 0.7 抗 P A c鶏卵抗体又は抗 A V線毛卵抗体 0.4 水 _ 1_
100.0 %
〔実施例 24〕 歯磨剤
水酸化ア ル ミ ニ ウ ム 40.0 % カ ノレ ボ キ シ メ チ ノレセ ノレ 口 ー ス ナ ト リ ウ ム 1.0 力 ラ ゲ ナ ン 0.5 ソ ノレ ビ ッ 卜 35.0 プ ロ ピ レ ン グ リ コ ー ル 3.0
N — ミ リ ス ト イ ノレ メ チ ノレタ ウ リ ン ナ ト リ ウ ム 0.5 ぺ プ タ イ ド 1.0 パ ラ ォ キ シ安息香酸メ チ ル 0.2 サ ッ カ リ ン ナ ト リ ウ ム 0.1 一 メ ン ト ー ル 0.5 ぺ ノ、。一 ミ ン ト油 0.2 シ ン ナ ミ ッ ク ァ ノレデ ヒ ド 0.15 ス ノ、° イ ス ミ ッ ク ス フ レ ー ノ 一 0.05 抗 PAc羊血清抗体又は抗 Pi菌体 0.5 表層多糖羊血清抗体
上フ
00.0 %
〔実施例 25〕 歯磨剤
無水ゲ イ酸 20.0 % カ ノレ ポ キ シ メ チ ルセ ル ロ ー ス ナ ト リ ゥ ム 1.0
ソ ノレ ビ ッ ト 50.0 ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル 5.0
N—パル ミ ト イ ノレ メ チ ル タ ウ リ ン ナ ト リ ウ ム 0.5 カ ゼイ ン 1.0 パ ラ ォ キ シ安息香酸ナ ト リ ウ ム 0.2 サ ッ カ リ ン ナ ト リ ウ ム 0.1
^ — メ ン ト ー ノレ 0.3 シ ネ オ ーソレ 0.1 ェ チ ル プ チ レ ー ト 0.01 フ ツ イ匕ナ ト リ ウ ム 0.2 抗 GTF鶏卵抗体 0.3 l 残
100.0 %
〔実施例 26〕 歯磨剤
無水ゲ イ酸 20.0 % 力 ノレ ボ キ シ メ チ ルセ ル ロ ー ス ナ ト リ ウ ム 1.0 ソ ノレ ビ ッ ト 50.0 ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル 5.0 N —パノレ ミ ト イ ノレ メ チ ル タ ウ リ ン ナ ト リ ウ ム 0.5 カ ゼ イ ン 1.0 パ ラ ォ キ シ安息香酸ナ ト リ ウ ム 0.2 サ ッ カ リ ン ナ ト リ ウ ム 0.1 ー メ ン ト ー ノレ 0.3 シ ネ オ 一 ノレ 0.1 ェ チ ル ブチ レ一 卜 0.01
ト ラ ネ キ サ ム酸 0.1 抗 Fn全菌体鶏卵抗体 0.3 2l
100.0 %
〔実施例 27〕 洗口剤
エ タ ノ ー ノレ 20.0 % 一 メ ン ト ー ノレ 0.2 ぺノ、。一 ミ ン ト油 0.2 オ イ ゲ ノ ー ル 0.1 シ ネ オ一ル 0.05 ァ ネ ト ー ル 0.03 サ ッ カ リ ン 0.05 ラ ウ リ ル ジ ェ タ ノ 一 ノレ ア マ ィ ド 0.3 ク 口 ノレへ キ シ ジ ングノレ コ ン酸塩 0.01 抗 GTF馬血清抗体又は抗 Cr菌体 0.1 表層多糖ャギ血清抗体
Ζί ;
100.0 %
〔実施例 28〕 洗口剤
ソ ノレ ビ ッ ト 10.0 % エ タ ノ ー ノレ 20.0 Ν — ミ リ ス 卜 イ ノレ メ チ ノレ タ ウ リ ン ナ ト リ ウ ム 0.5 シ ョ 糖ス テ ア リ ン酸エ ス テ ル 1.0 ぺ プ タ イ ド 0.5 パ ラ ォ キ シ安息香酸メ チ ル 0.1
ス テ ピオ サ イ ド 0.1 ,ー メ ン ト ー ル 0.2 メ チ ノレサ リ シ レ ー ト 0.3 シ ン ナ ミ ッ ク ァ ノレデ ヒ ド 0.1 ェ チ ノレ ブ チ レ一 ト 0.05 デキ ス ト ラ ナ ー ゼ 0.2 フ ッ 化ナ ト リ ウ ム 0.2 抗 Aa表層多糖鶏卵抗体 0.2 Z
100.0 %
〔実施例 29〕 洗口剤
ソ ノレ ビ ッ ト 10.0 % エ タ ノ ー ゾレ 20.0 Ν— ミ リ ス ト イ ノレ メ チ ル タ ウ リ ン ナ ト リ ウ ム 0.5 シ ョ 糖ス テ ア リ ン酸エ ス テ ル 1.0 ぺ プ タ イ ド 0.5 パ ラ ォ キ シ安息香酸メ チ ル 0.1 ス テ ピオ サ イ ド 0.1 ー メ ン ト 一 ノレ 0.2 メ チ ルザ リ シ レ ー ト 0.3 シ ン ナ ミ ッ ク ァ ノレデ ヒ ド 0.1 ェ チ ノレ ブ チ レ ー ト 0.05 デキ ス ト ラ ナ ー ゼ 0.2 塩化セ チ ル ピ リ ジ ニ ゥ ム 0.05 抗 B f 全菌体鶏卵抗体 0.2
100.0 %
〔実施例 30〕 洗口剤
ソ ル ビ ッ ト 10.0 % エタ ノ ーノレ 20.0 N—ス テ ア ロ イ ノレ メ チ ノレ タ ウ リ ン ナ ト リ ウ ム 0.5
POE (20) ソ ル ビ タ ン モ ノ ォ レ ー ト 1.0 コ ラ ー ゲ ン 0.5 パ ラ ォ キ シ安息香酸メ チ ル 0.1 サ ッ カ リ ン ナ ト リ ウ ム 0.1 一 メ ン ト ー ノレ 0.05 力 ノレ ボ ン 0.1 ス ペ ア ミ ン ト油 0.3 ぺノ、。一 ミ ン ト油 0.3 抗 PAc牛乳抗体又は抗 Td菌体 0.4 表層多糖牛乳抗体
Z :
00.0 %
〔実施例 31〕 タ ブ レ ツ ト
ア ラ ビア ゴム 6.0 % ブ ドウ糖 72.0 ゼ ラ チ ン 3.0 一 メ ン ト ー ノレ 0.2 シ ネ 才一ノレ 0.1 ベ ン ズ ア ルデ ヒ ド 0.05
ア ル コ ノレ ビ ン酸ナ ト リ ウ ム 0.1 抗 P A c羊.乳抗体又は抗 Aa莢膜羊乳抗体 0.1
100.0 %
〔実施例 32〕 ガ ム
ガ ム ベ ー ス 43.9 % 炭酸カ ル シ ウ ム 2.0 水ァメ 15.0 砂糖 29.0 シ ョ 糖パル ミ テ ィ ト 1.0 フ ノレ ク ト ー ス 4.0 ァ ノレ ド ー ス 3.0 ー メ ン ト ー ノレ 0.6 力 ノレ ボ ン 0.4 フ ノレ 一 ッ ミ ッ ク ス フ レ一ノく ー 1.0 抗 P A c鶏卵抗体又は抗 P g線毛鶏卵抗体 0.1
Ζί
00.0 %