WO1993009109A1 - Compound ms-444 - Google Patents

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WO1993009109A1
WO1993009109A1 PCT/JP1992/001337 JP9201337W WO9309109A1 WO 1993009109 A1 WO1993009109 A1 WO 1993009109A1 JP 9201337 W JP9201337 W JP 9201337W WO 9309109 A1 WO9309109 A1 WO 9309109A1
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medium
culture
growth
color
solvent
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PCT/JP1992/001337
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English (en)
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Inventor
Satoshi Nakanishi
Shigeru Chiba
Isao Kawamoto
Yumiko Aotani
Yutaka Saito
Koji Yamada
Yuzuru Matsuda
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/77—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D307/92—Naphthofurans; Hydrogenated naphthofurans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/29—Micromonospora

Definitions

  • the present invention relates to a compound MS-444 produced by a microorganism belonging to the genus Micromonospora and having a vasodilatory effect.
  • Invention compound MS-444 is a novel substance, and there is no report of a substance having the same structure.
  • Solubility Soluble in acetate, ethyl acetate, methanol, black form, hexane and dimethyl sulfoxide, insoluble in carbon tetrachloride and water
  • the physicochemical data was measured with the following equipment.
  • MS-444 was a novel compound.
  • R i value of the thin-layer mouth matrix of MS-444 using various developing agents in the following experiments 1 to 3 are shown in Table 1. Detection was performed by iodine reaction or UV irradiation at 253.7 nm.
  • Kieselgel 60 F 254 (Merck, Art.5628)
  • Thin layer RP-18 F 254 s (Merck, Art.13724)
  • Specimens were placed in a Magnus tube 3 2 t of Krebs 'Ha Nzerai preparative (iCrebs-Henzeleit) solution [' aCl 6.92 g / 1, KC1 0.3ag / 1, MgS0 4 * 7H 2 0 0.29 g / 1, CaCl 2 - 2H 2 0 0.37 g / 1, KH 2 P0 4 0.16 g / 1, NaHCOa 2.1 / 1, immersed in glucose 1.0 g / 1], through 95% ⁇ 2, 5% C 0 2 gas. Specimens were allowed to stabilize for 1 to 2 hours before use in experiments.
  • M S—4 4 4 belongs to the genus Miku Monospora, and M S—2.
  • a wild strain or a wild strain can be mutated by an artificial mutation method, for example, ultraviolet irradiation, X-ray irradiation, treatment with a mutagenic agent, or naturally.
  • Any microorganism, such as a mutated mutant can be used as long as it belongs to the genus Micromonospora and has the ability to produce MS-4444.
  • micromonospora sp. NK-3091 strain hereinafter referred to as 3 ⁇ -309 1 share).
  • ⁇ 3-3091 strain is a commonly used agar medium, which has septum and forms branched base hyphae. The formation and formation of aerial hyphae No special fragmentation of the hypha was observed. Spores and sclerotium were not found.
  • NK-3091 ⁇ shows normal or vigorous growth on commonly used synthetic and natural media, and the underlying mycelium shows an orange or brown color.
  • the medium may produce a brown soluble pigment
  • Soluble pigment slightly produced, light brown
  • Soluble pigment slightly produced, light brown
  • Soluble pigment slightly produced, light brown ,
  • Soluble pigment slightly produced, light brown
  • Soluble pigment produced, dark brown
  • Soluble pigment slightly produced, light brown
  • the physiological properties of the NK-3091 strain are shown below.
  • the growth temperature range describes the results after culturing for 6 days, and the others describe the results after culturing for 2 to 3 weeks.
  • the basal medium used had the following composition. gSD4-7H 2 0 0.5g 2 HP0 4 0. Oog
  • Trace salt solution is the composition of trace salt solution of ISP medium ⁇ 'o.4 L-arabinose, D-xylose, D-glucose, sucrose, and roughinose are assimilated, but D-fructoose, ramnoose, and ino. Sitol and D-mannitol do not assimilate.
  • Kawamoto et al.'S method Alanine, glutamate, and mesodiamino from the cell wall prepared by the method described in U. Bacteriol., 146, 527 (1981). Pimelic acid and glycine were detected.
  • spores are formed only on the basal hypha, and the cell wall is type II (methodylaminobimeric acid, glycine). It is classified into the genus ⁇ monospora. (Edited by the Actinomycetes Society of Japan, Actinomycetes identification experiment method, Showa 63 edition)
  • the usual culturing method used for culturing actinomycetes is applied.
  • the medium to be used any natural medium or synthetic medium can be used as long as the medium has a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, etc. which can be assimilated by bacteria.
  • Carbon sources include carbohydrates such as glucose, sucrose, stabilose, starch, dextrin, mannose, maltose, molasses, organic acids such as citric acid, lingoic acid, acetic acid, fumaric acid, and the like. Metanole, Alcohols such as ethanol, methane, ethane, pun, n-hydrocarbons such as raffin, amino acids such as glutamic acid, or glycerol Is used c
  • Nitrogen sources include ammonium salts such as ammonium chloride, sulfuric acid, ammonium nitrate, and phosphoric acid, aspartic acid, glutamine, cistine, and arani. Amino acids, urea, peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, corn 'Steep' liqueur, soybean flour solvable ⁇ Vegetable protein, cottonseed meal, soybean Casein, cisamino acid, and pharma media are used.
  • ammonium salts such as ammonium chloride, sulfuric acid, ammonium nitrate, and phosphoric acid, aspartic acid, glutamine, cistine, and arani.
  • Amino acids, urea, peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, corn 'Steep' liqueur, soybean flour solvable ⁇ Vegetable protein, cottonseed meal, soybean Casein, cisamino acid, and pharma media are used.
  • Inorganic substances include potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, Ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, cobalt sulfate, calcium sulfonate, calcium sulfate, ammonium sulfate, lithium aluminum sulfate, barium carbonate , Calcium carbonate, cobalt chloride, salt, etc.
  • a substance which promotes the growth of cells or the productivity of MS-444 such as vitamin, for example, Saimin, may be added to the medium.
  • microorganism used requires specific substances, it is necessary to add what is needed for growth.
  • the cultivation is carried out by shaking culturing, aeration stirring culturing, etc., at a temperature of 1535 ° C and a pH around neutrality.
  • MS-444 accumulated in the culture is collected from the culture, the usual method of collecting a bioactive substance produced by a microorganism from the culture is applied. In other words, extraction of cell components with organic solvents such as acetone and methanol, removal of cells by filtration, centrifugation, etc., adsorption resin, silica gel, silica gel, and silica gel , Reverse layer silica gel, aluminum, Adsorption / desorption treatment of active substances by column chromatography or thin-layer chromatography using cellulose, silicate soil, magnesium gayate, gel filtration agent, ion-exchange resin, etc., partitioning with an appropriate solvent system, etc. MS- 4 4 4 can be singulated.
  • organic solvents such as acetone and methanol
  • the cells are separated by filtering or centrifuging the culture.
  • the obtained cells are treated with a suitable solvent such as methanol or acetate to obtain a cell extract.
  • the obtained bacterial cell extract is concentrated under reduced pressure to remove the solvent, thereby obtaining a permanent solution.
  • a water-immiscible solvent such as ethyl acetate or butyl acetate is added to the aqueous solution to extract the active substance.
  • silica gel column chromatography is performed repeatedly to purify the active substance.
  • the elution solvent use an appropriate solvent such as chloroform, ethyl acetate, methanol, and acetone alone or as a mixture.
  • the eluate containing the active substance is concentrated under reduced pressure, and then the active substance is further purified by repeatedly performing Sakagaya Shiri gel ram chromatography.
  • an elution solvent an appropriate solvent such as acetone, methanol, water or the like is used alone or in combination.
  • fluorescent agent-containing sheet re dim (key Zerugeru F 2 5 4, manufactured by Merck) was attached to Ususokuguchima Togurafi chromatography using iodine reaction or 2 5 This is performed by a 3.7 nm ultraviolet irradiation method.
  • Micromonospora sp.K-3091 was used as the inoculum, glucose 1 gZdl, soluble starch 1 g / dl, Bactotrip Ton (manufactured by Difco) 0.5 / d U yeast extract 0.5 gZ dl, meat extract 0.3 gZ dl and calcium carbonate 0.2
  • a medium having a composition of g / dl (H7.2) was used.
  • One platinum loop of the inoculum was inoculated into 1 ml of the above-mentioned type I medium placed in a large test tube, and cultured with shaking at 28 t for 5 days (type I culture).
  • 1 O ml of the culture solution obtained by the first-class culture was inoculated into 5 ml of a second-type medium in a 30-Oml triangular flask.
  • the composition of the type 2 medium is the same as the composition of the type 1 medium.
  • the second seed culture was inoculated into the main fermentation medium 5 0 nil containing the two days of the second kind culture 5 0 ml obtained c made in 2 8 3 0 ⁇ ml Erlenmeyer flasks.
  • the main fermentation medium is glucose 2.5 g / dK corn 'steep' liquid 1.5 gZd1, Soluble 'vegetable' protein 1 g / d1, cottonseed oil 0.5 g / d 1, a medium having a composition of cobalt chloride ⁇ hexahydrate 1 mgZdl, magnesium phosphate ⁇ octahydrate 50 mg / dl (pH 7.0) was used.
  • the main fermentation culture was performed by shaking culture at 28 t for 6 days.
  • the cells were obtained by centrifuging 15 liters of the fermentation end solution. 7.5 liters of methanol was added to the separated cells, and the mixture was stirred and filtered. The obtained methanol extract was concentrated under reduced pressure to obtain an aqueous solution, and 1500 ml of ethyl acetate was added in 500 ml portions, and extracted three times. A red-brown solid (3.35 g) obtained by concentrating the ethyl acetate layer under reduced pressure was dissolved in a small amount of acetone, and a small amount of kieselguhr was added.
  • YMC-0 DS gel 60-260 manufactured by Yamamura Chemical Laboratory
  • the YMC-0DS gel filled with ice-cold solution was loaded on the top of 20 O ml and eluted with a solvent (1 liter) of the same composition.
  • MS-444 was eluted in fractions No. 4 to No. 28. These fractions were collected, and the same YMC-ODS column chromatography was repeated. The obtained eluate was concentrated under reduced pressure to dryness to obtain a yellow powder MS-444. 33 mg were obtained.
  • compound MS-444 having a vasodilatory action can be provided.

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Description

明 細 書
化合物 M S - 4 4 4
技 術 分 野
本発明は、 ミ ク ロモノ スポラ (Micromonospora) 属に属する微生物 により生産され、 血管拡張作用を有する化合物 M S — 4 4 4 に関する。 背 景 技 術
発明化合物 M S— 4 4 4 は新規物質であり、 同一構造を有する物 質の報告はない。
M S — 4 4 4 に類似した構造を有する物質と しては、 下記 2つの物 質が、 ジャ ーナル ' ォ ブ ' ケ ミ カ ル ' リ サーチ、 シノ プシス誌（Journa of Chemical Research, Synopses) 300-301 頁， 1979年およびコ ―テ • ラテ 'ィ · デ · セァーゼ · テ '、ュ ' ラ カデ ミ · テ'、 ' シ了一ゼ ' · セ リ · C 誌 tComptes Rendus des Seances de 1 A c a d e m ι e des Science, Ser ι e C ) 27 巻, 1410-141 頁， 1972年に報告されているが、 その生物活 性についてなんら報告されていない。
Figure imgf000003_0001
Figure imgf000003_0002
発 明 の 開 示
新規な血管拡張作用物質を取得するために、 数多く の微生物の生産 物について研究を行った結果、 新たに土壌より分離した微生物を培地 に培養することにより得られた物質が、 血管拡張作用を有する新規生 理活性物質であることを見出した。
本発明によれば、 血管拡張作用を有する下記式で表わされる化合物 M 5 - 4 4 4を提供することができる。
Figure imgf000004_0001
β下に本発明化合物 MS - 4 4 4の理化学的性質を詳細に説明する 性犹 ： 黄色粉末
分子量 ： 230
分 ； C 13 H 1004
質量分析 （EIMS法） ： m/z ： 230 (Mつ
高分解能 EIMSスぺク トル ：
実測値 230.0596
計算値 230.0579 (C13H10C )
融 点： 155 : (分解）
紫外部吸収スぺク トル （メタノール中） ： ¾rnax(nm) 203 ( ε = 17, 000) , 245 ( ε =12， 000) , 319 ( ε = 6, 000) 387 ( e = 3， 800)
赤外部吸収スぺク トル （KBr錠剤法） ： (cm-1) 3388, 1620, 1604, 1564, 1473, 1327, 1300, 1273, 1257
- NMRスぺク トル OOMHz, アクセン ト _ds,内部標準 TMS) ： d (pptn) ： 12.60(1H, s), 8.28(1H, s), 7.53(1H, t, J = l.7Hz), 7.13(1H, d, J=8.8Hz), 6.69(1H, td, J=8.8, 0.9Hz), 3.93(2H, dd, J=l.7, 0.9Hz), 2.68 (3H, s)
130關!¾スぺク ト ル （100MHz , アセ ト ン - d6 ，内部標準 TMS) ：
δ (ppm) ： 189. Us), 159.2(s), 158.6(s), 147.8(s), 138.0(d), 128.0(s), 124.6(d), 122.9 (s), 118.2(s), 117.5 (s), 116.4(d), 20.4(t), 14.6(q)
呈色反応 ： 50%硫酸、 ョ ー ドまたはァニス アルデヒ ド .こよ る呈色 反応に陽性
溶解性 ： アセ ト ン、 酢酸ェチル、 メ タ ノ ール、 ク ロ 口 ホルム、 へキサンおよびジメ チルスルホキシ ドに可溶， 四塩化炭素および水に 不溶
なお、 理化学的データ は以下の機器により測定した。
マススペク ト ル ： 日立製作所 M - 80B質量分析装置
紫外部吸収スぺク ト ル ： 島津製作所 L'V - 220G分光光度計
赤外部吸収スぺク トル ： 日本電子 JIR- RFX3001赤外線分光光度計 NMRスぺグ ト ル ： ブル力 — AM400 核磁気共鳴装置
融点 ： 柳本製作所 ミ ク α融点測定装置
以上のデータより M S— 4 4 4 は新規化合物である ことが判明した = つぎに、 下記実験 1 〜 3の各種展開剤による M S— 4 4 4 の薄層ク 口マ トグラフ ィ 一の R i値を第 1表に示す。 検出はヨ ウ素反応も し く は 2 5 3. 7 nmの紫外線照射法により行った。
実験 1
薄層 ； キーゼルゲル 6 0 F 254 (メ ルク社製、 Art.5628)
展開溶媒 ； ク ロ 口 ホルム ： アセ ト ン = 9 5 ： 5
展開方法 ； 室温、 上昇法、 1 5〜 3 0分間
実験 2
薄層 ； キーゼルゲル 6 0 F 254 (メ ルク社製、 Art.5628) 展開溶媒 ；酢酸ェチル ： へキサン = 1 ： 1
展開方法 ；室温、 上昇法、 1 5〜 3 0分間
実験 3
薄層 ； R P— 1 8 F 254 s (メルク社製、 Art.13724)
展開溶媒 ； 6 Q %ァセ ト ン Z水
展開方法 ；室温、 上昇法、 1 5〜 6 Q分間
1
R f 値 実験 1
実験 2 6 7 - 1
実験 3
Figure imgf000006_0001
つぎに、 M S— 4 4 4の血管拡張作用を試験例で説明する。
試験例 1 ゥサギ胸部大動脈標本における血管収縮抑制作用
白色雑系ゥサギ （雄、 体重 2〜 3 kg) の腹部正中線を切開し、 大動 脈を腹部から約 2〜 2. 5 cmの長さで切り出し、 幅 3〜 4 mmの螺旋状条 片を作成した。 両端を絹糸で結紮し、 下端は固定棒、 上端は張力 ト ラ ンスデューサー （日本光電社製 T B— 6 1 2 T) につなぎ、 初期張力 1. 5 gで懸垂した。 標本をマグヌス管に入れた 3 2 tのクレプス 'ハ ンゼライ ト （iCrebs-Henzeleit ) 液 〔 'aCl 6.92 g/1 ， KC1 0.3a g/1, MgS04*7H20 0.29 g/1, CaCl2-2H20 0.37 g/1, KH2P04 0.16 g/1 , NaHCOa 2.1 /1, グルコ ース 1.0 g/1] 中に浸し、 9 5 %〇 2, 5 % C 02ガスを通じた。 標本は 1〜 2時間安定させた後実験に供した。 血管収縮物質として、 塩化力 リ ゥムを終濃度 2 0 mMになるように マグヌス管に添加した。 惹起された収縮反応は、 張力 ト ラ ンスデュー サーを介して等尺性にポ リ ダラフ （日本光電社製 AM— 6 0 0 0 ) に 記録した。 また、 MS— 4 4 4を 3 0 mgZmlとなるようにジメチルス ルホキシドに溶解し、 クレブス · ノ ンゼライ ト液で適宜希釈したもの を、 塩化力 リ ウム適用の 3 0分前にマグヌ ス管に添加した。
M S — 4 4 4無添加のときの収縮高を 1 0 0 %と して、 各濃度の M S - 4 4 4を添加したときの収縮高の割合 （収縮率） を第 2表に示す 第 2 表
- 1
o o
M S - 4 4 4 g / m 1 収縮率 （％)
Figure imgf000007_0001
^ 第 2表から明らかなよ う に、 M S — 4 4 4 は摘出血管の収縮抑制作 一
用を有することが確認された。
o - _ 1
M S— 4 4 4 は、 ミ ク □モノ スポラ属に属し M S — 2。 4
Co o一 4 4生産能を 有する微生物を培地に培養し、 培養液中に M S — 4 4 4 を生成蓄積さ せ、 該培養物から M 5 - 4 4 4 を採取する ことによって得る ことがで
¾る。
M S — 4 4 4生産性微生物と しては野生株または野生株を人工的変 異方法、 たとえば紫外線照射、 X線照射、 変異誘発剤処理などによつ て変異させた変異株あるいは自然的に変異した変異株など、 ミ ク ロモ ノ スポラ属に属し M S — 4 4 4生産能を有していればいずれの微生物 でも用いることができる。 具体的に好適な例と しては、 土壌よ り新た に分雛した ミ ク ロモノ スポ ラ ♦ エス ピー （ M i cromonospora sp. ) N K - 3 0 9 1 株 （以下、 Ν Κ— 3 0 9 1 株と称する） があげられる。
Ν Κ - 3 0 9 1 株の形態、 各種培地上での生育状態、 生理的性質に おける特徵は次の通りである。
I . 形態
Ν Κ - 3 0 9 1 株は、 一般に使用されている寒天培地で、 隔壁を有 し、 分岐する基生菌糸を形成する。 なお、 気中菌糸の形成および基生 菌糸の特徵的な分断はみられない。 又、 胞子囊及び菌核の形成は見い
/こさ い
胞子は基生菌糸より単純分枝した胞子柄に 1個形成され、 その形態 は球形である = 成熟した胞子は大きさが 0. 5 ~0. 7 mであり、 その 表面は平滑、 または疣状の突起が見られることもある c
II. 各種培地上での生育状態
N K - 3 0 9 1祙は、 一般に使用されている合成および天然培地で 普通もしく は旺盛な生育を示し、 基生菌糸は橙色系あるいは茶色を示 す。 培地により茶色系統の可溶性色素が産生されるこ ともある
各種培地上で 2 8 1：、 1 4 日間培養したときの生育および色の特徴 を下言己に示す。 なお、 色の表示は Color Harmony Manual (Container Corporation of America; ·ίこよ 色の分類 ίこ従った c
1. グルコ ース · 了スパラギン寒天培地
生育 ；普通
基生菌糸の色 ； ダークラゲージタ ン pg) '
可溶性色素 ； 僅かに産生、 薄茶色
. グ リ セロ ール ' ァスパラギン寒天培地
生育 ； やや貧弱
基生菌糸の色 ； ブライ トメ πンイエロー（3 i a)
可溶性色素 ；無し
. シュクロース ·硝酸塩寒天培地
生育 ； やや貧弱
基生菌糸の色 ； コ一クタ ン （4ie)
可溶性色素 ；僅かに産生、 薄茶色
. スターチ *無機塩寒天培地
生育 ； やや良好
基生菌糸の色 ； セ ピアブラ ウ ン（3ΡΠ)
可溶性色素 ； 僅かに産生、 薄茶色 ，
5. チ n シ ン寒天培地
生育 ； 普通
基生菌糸の色 ； ブライ ト メ ロ ンイ エ π —（31 a)
可溶性色素 ； 無し
6. 栄養寒天培地
生育 ； 貧弱
基生菌糸の色 ； タ イ ルレ ツ ド（5ne)
可溶性色素 ； 僅かに産生、 薄茶色
7. 麦芽エキス · 酵母エキス寒天培地
生育 ； 普通
基生菌糸の色 ； ダークブラ ウ ン （4pn)
可溶性色素 ； 産生、 こげ茶色
8. オー ト ミ ール寒天培地
生育 ； やや良好
基生菌糸の色 ； オ レ ンジ ラ ス ト （4pe)
可溶性色素 ； 僅かに産生、 薄茶色
III. 生理的性質
N K - 3 0 9 1株の生理的諸性質を以下に示す。 生育温度範囲は 6 日間培養後の結果を、 その他は 2 ~ 3週間培養後の結果を記述する。 (1) 炭素源の利用性 ；
基礎培地と しては以下の組成のものを使用した。 gSD4-7H20 0.5g 2HP04 0. Oog
NaCl 0.5g 微量塩液 * 1 ml
(NH4)2S04 1. Og 精製水 1000ml
CaC03 1. Og ( H 7.2)
*微量塩液は I S P培地 \'o.4 の微量塩液の組成 N K - 3 0 9 1株は、 Lーァラビノ ース、 D—キシロース、 D—グ ルコース、 シュク ロース、 ラフイ ノ 一スは資化するが、 D—フルク ト ース、 ラ ムノ ース、 イ ノ シ トール、 D—マンニ ト ールは資化しない。
(2) ミルクに対する作用 ： 凝固あり、 液化あり
(3) 穀粉の加氷分解作用 ： あり
(4) 生育温度範囲 ： 9 t：〜 4 0 t
(5) メ ラノィ ド色素 生成 ： 所定の培地 （チ α シン寒天培地、 ぺプト ン · ィ 一ス ト鉄寒天培地） では見られない =
(6) ゼラチンの液化作用 ： あり
I V. 細胞壁組成
川本らの方法 ：：ジャ一ナル ' ォブ ' バクテ リ ォロジ一 U. Bacter i o l . )， 146, 527 (1981) ： によって調製した細胞壁中からはァラニン、 グル タ ミ ン酸、 メ ソージァ ミ ノ ピメ リ ン酸およびグリ シンが検出された。
以上、 胞子が基生菌糸上にのみ形成されることおよび細胞壁が I I型 (メ ソ一ジ了ミ ノ ビメ リ ン酸、 グリ シン） であることから、 本菌株は 放線菌の中でミ ク πモノ スポラ属に分類される。 （日本放線菌学会編、 放線菌の同定実験法 昭和 6 3年度版）
従って、 本菌株をミ クロモノ スボラ · エス ピー （ Mi cromonospora sp. ) N K - 3 0 9 1 と命名し、 工業技術院微生物工業技術研究所に平成 3 年 1 0月 2 9 日付けで微ェ研条寄第 3 6 2 3号 （F E R M B P—
3 6 2 3 ) として寄託した。
微生物の培養に際しては放線菌の培養に用いられる通常の培養方法 が適用される。 使用する培地は菌の資化しうる炭素源、 窒素源、 無機 物などを程よく舍有する培地であれば天然培地、 合成培地いずれでも 用いることができる。
炭素源としては、 グルコース、 シユークロース、 スタ ビロース、 澱 粉、 デキス ト リ ン、 マンノ 一ス、 マル トース、 糖蜜などの炭氷化物、 クェン酸、 リ ンゴ酸、 酢酸、 フマール酸などの有機酸、 メ タ ノ ール、 エタ ノ ールなどのアルコ ール、 メ タ ン、 ェ タ ン、 プ ン、 n — ラ フ ィ ンなどの炭化水素、 グルタ ミ ン酸な どのァ ミ ノ 酸ある いはグ リ セ ロ ールなどが用い られる c
窒素源と しては塩化了 ンモニゥ ム、 硫酸了 ンモニゥ ム、 硝酸ア ンモ 二ゥ 厶、 リ ン酸了 ンモニゥ ムなどのア ンモニゥ 厶塩、 ァスパラ ギン酸、 グルタ ミ ン、 シスチ ン、 ァ ラ ニ ンなどのア ミ ノ 酸、 尿素、 ペプ ト ン、 肉エキス、 酵母エキス、 乾燥酵母、 コ ー ン ' スチープ ' リ カ ー、 大豆 粉 ソ ルブル ♦ ベジタ ブル · プロ テイ ン、 綿実粕、 大豆カ ゼイ ン、 力 ザ ミ ノ 酸、 フ ァ ーマメ ディ 了などが用い られる。
無機物と しては リ ン酸一水素カ リ ウ ム、 リ ン酸二水素カ リ ウ ム、 リ ン酸ニ水素ナ ト リ ウ ム、 リ ン酸マグネ シ ウ ム、 硫酸マグネ シ ウ ム、 硫 酸第一鉄、 硫酸マ ンガン、 硫酸銅、 硫酸コ バル ト 、 硫酸亜 パン ト テ ン酸カ ルシウ ム、 モ " ブデン酸了 ンモニゥ ム、 硫酸アル ミ ニウ ム力 リ ウム、 炭酸バ リ ウ ム、 炭酸カ ルシウ ム、 塩化コ バル ト 、 食塩などが 用 、りれ 。
その他必要に応じて培地にビタ ミ ンたとえばサイ 了 ミ ンなど、 菌体 の増殖あるいは M S — 4 4 4 の生産性を促進する物質を加える こと も できる。
用いられる微生物が特定の物質を要求する場合は、 生育に必要なも のを加えることが必要である。
培養は振盪培養法、 通気攪拌培養法などによ り、 温度 1 5 3 5 °C にて、 中性付近の p Hで行われる。
3 1 5 日間の培養によって、 VI S— 4 4 4 の蓄積は最大に達する。 培養物中に蓄積した M S— 4 4 4 を培養液から単雜採取するに際 し ては、 通常の微生物生産生理活性物質を培養液から採取する方法が適 用される。 すなわち、 アセ ト ン、 メ タ ノ ールなどの有機溶媒による菌 体成分の抽出、 ろ過、 遠心分雜 どによる菌体の除去、 吸着樹脂、 シ リ カゲル、 シ ラ ナイ ズ ド シ リ 力ゲル、 逆層 シ リ カ ゲル、 アル ミ ニウ ム、 セルロース、 ケィ藻土、 ゲイ酸マグネシウム、 ゲルろ過剤、 イ オン交 換樹脂などを用いるカラムクロマ トグラフィーもしく は薄層クロマ ト グラフィ 一による活性物質の吸脱着処理、 適当な溶媒系による分配な どによって M S— 4 4 4を単雜することができる。
培養液から M S— 4 4 4を単離する一例は次の通りである。
培養液をろ過もしく は遠心分雜することによって菌体を分離する。 得られた菌体をメタノ 一ル、 アセ ト ンなどの適当な溶剤で処理するこ とにより菌体抽出液を得る。 得られた菌体抽出液を減圧下で濃縮する ことにより溶剤を除去し永溶液とする。 ついで、 この水溶液に水と混 和しない溶媒、 例えば酢酸ェチル、 酢酸ブチルなどを添加して活性物 質を抽岀する。 抽出波を減圧下で濃縮した後、 シ リ カゲルカ ラムクロ マ トグラフィ一を緩り返して行い、 活性物質を精製する。 溶出溶媒と しては、 クロ口ホルム、 酢酸ェチル、 メ タノ ール、 ァセ ト ンなどの適 当な溶剤を単独あるいは混合して用いる。 活性物質を含む溶出液を減 圧下で濃縮し、 次に、 逆栢シリ力ゲル力ラムクロマ トグラフィ ーを鑤 り返して行うことにより活性物質をさらに精製する。 溶出溶媒と して は、 アセ ト ン、 メタノ ール、 水などの適当な溶媒を単独あるいは混合 して用いる。 M S— 4 4 4を含む画分を集めて減圧下、 濃縮乾固する ことにより、 M S— 4 4 4の黄色粉末を得ることができる c
精製工程中の M S - 4 4 4の検出は、 蛍光剤入り シ リ カゲル （キー ゼルゲル F 2 5 4 、 メルク社製） を用いた薄層ク口マ トグラフィ ーに付 し、 ヨウ素反応または 2 5 3 . 7 nmの紫外線照射法により行う。
癸明を実施するための最良の 態
実施例 1
種菌と して、 ミ ク αモノスポラ ·■ エスビー (Mi cromonospora sp. K - 3 0 9 1を用い、 第一種培地としてグルコース 1 gZ d l、 可溶 性澱粉 1 g/ dl、 バク ト ト リ プ ト ン （ディ フコ社製） 0. 5 / d U 酵 母エキス 0. 5 gZ dl、 肉エキス 0. 3 gZ d lおよび炭酸カルシゥム 0. 2 g /dl ( H 7. 2 ) の組成からなる培地を用いた。 種菌 1 白金耳を太 型試験管に入れた上記第一種培地 1 ΰ mlに植菌し、 2 8 tで 5 日間振 盪培養した （第一種培養） 。
第一種培養により得られた培養液 1 O mlを 3 0 O ml容三角フ ラスコ に入った 5 ϋ mlの第二種培地に植菌した。 第二種培地の組成は第一種 培地の組成と同じである。 第二種培養は 2 8 で 2 日間行った c 得られた第二種培養液 5 0 mlを 3 0 ϋ ml容三角フ ラスコ に入った 5 0 nilの主発酵培地に植菌した。 主発酵培地と して、 グルコ ース 2. 5 g/dK コ ーン ' スチープ ' リ カ一 1. 5 gZ d 1、 ソルブル ' ベジタ ブル ' プロテイ ン 1 g/ d 1、 綿実油 0. 5 g/ d 1、 塩化コバル ト · 6水 塩 1 mgZdl、 リ ン酸マグネシウム · 8水塩 5 0 mg/dl ( p H 7. 0 ) の 組成からなる培地を用いた。 主発酵培養は 2 8 tで 6 日間振盪培養に より行った。
発酵終了液 1 5 リ ッ トルを遠心分離することによ り菌体を取得した。 分別した菌体に 7. 5 リ ッ ト ルのメ タ ノ ールを加え攪拌後ろ過した。 得 られたメ タ ノ ール抽出液を減圧下で濃縮し水溶液と した後に、 1500ml の酢酸ェチルを 5 0 0 mlずつ加えて 3回抽出を行った。 酢酸ェチル層 を減圧下で濃縮して得られた赤褐色固体 （ 3. 3 5 g ) を少量のァセ ト ンに溶解し、 少量のケィ藻土を加えて減圧乾固したものを 1 %メ タ ノ 一ルを舍むク ロ 口ホルムを用いて充塡した 1 リ ッ トルのシ リ カゲル力 ラム ヮコ ーゲル C一 2 0 0 (和光純薬工業社製） の上端にのせ、 同 じ組成の溶媒 （ 3 リ ッ ト ル） で活性物質を溶出した。
溶出液をすベて集め、 減圧下で濃縮乾固すると 2. 5 3 g の赤橙色固 体が得られた。 この物質を少量のアセ ト ンに溶解し、 少量のケィ藻土 を加えて減圧乾固したものを 5 %ァセ ト ンを含むク ロ 口ホルムを用い て充塡したシ リ カゲルカ ラ ム ヮコ 一ゲル C— 2 0 0 (和光純薬工業 社製） 5 0 0 mlの上端にのせ、 同じ組成の溶媒 （ 2 リ ッ ト ル） を用い て溶出した。 溶出液を 2 0 g ずつ分取すると M S— 4 4 4は面分蕃号 3 7から 84 に溶出された。 これらの画分を集めた後、 さ らに、 同様のシ リ カゲル カ ラムクロマ トグラフィ一を繰り返し、 得られた溶出液を減圧下、 濃 縮乾面することにより 3 7 ？ mgの黄色粉末を得た。 これを、 少量のァ セ ト ンに溶解し、 少量の YMC— 0 D Sゲル 6 0 — 2 6 0 7 0 ( 山村化学研究所社製） を加えて減圧乾固したものを 6 0 %アセ ト ン氷 溶液を用いて充塡した YMC— 0 D Sゲル 2 0 O mlの上端に乗せ、 同じ組成の溶媒 （ 1 リ ッ トル） を用いて溶出した。
溶出液を 1 0 g ずつ分取すると M S— 4 4 4は画分蕃号 4から 28 に溶出された。 これらの画分を集め、 さ らに、 同様の YMC— O D S カラムクロマ トグラフィ ーを籙り返し、 得られた溶出液を減圧下、 濃 縮乾固することにより黄色粉末の M S— 4 4 4を 2 3 3 mg得た。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 血管拡張作用を有する化合物 M S - 4 4 4を提供 することができる。

Claims

BH 求 の
(1) 下記式で表わされる化合物 M S — 4 4 4
0H 0
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J. CHEM. RES., Synop., (9), 300-1. *

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