WO1993003365A1

WO1993003365A1 - Dosage immunologique, anticorps monoclonal et hybridome

Info

Publication number: WO1993003365A1
Application number: PCT/JP1992/001021
Authority: WO
Inventors: Shiro Matsuura; Yutaka Takagaki; Yonekazu Hamano; Ken Fukushi; Keigo Kabasawa; Hiroshi Kita
Original assignee: Iatron Laboratories, Inc.; Osakafu
Priority date: 1991-08-09
Filing date: 1992-08-10
Publication date: 1993-02-18
Also published as: CA2093521A1; EP0554458A1; US5525476A; DE69228739T2; CA2093521C; FI113205B; EP0554458B1; FI931581A0; FI931581A; JP3154724B2; EP0554458A4; DE69228739D1

Description

明細書免疫学的測定方法、モノクローナル抗体及びハイプリドーマ技術分野

本発明は、脂溶性化合物の測定方法に関し、特には、試料から有機溶媒で脂溶性化合物を抽出し、その脂溶性化合物に対する有機溶媒耐性抗体を用いて、有機溶媒存在下で抗原抗体反応を行うことにより脂溶性化合物を免疫学的に測定する方法に関する。

更に、本発明は、下痢性貝毒に特異的なモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ、及びそのモノクローナル抗体を用いる下痢性貝毒の検出方法に関する。本発明による前記モノクローナル抗体は、特には、有機溶媒耐性抗体である。背景技術

農薬や毒素等の有害物質からホルモン等の重要な生理活性物質にいたるまでの各種有機化合物の中には、多くの水難溶性な脂溶性化合物が存在する。従来、これらの水難溶性脂溶性化合物の定性的及び定量的測定を実施する場合には、試料の中から検査対象の水難溶性脂溶性化合物を適当な有機溶媒で抽出し、更に精製してから、各種の機器分析等を行なっていた。これらの操作は、定性的及び定量的測定を直接行うことができる水溶性化合物の場合と比較して、煩雑で時間のかかるものであった。例えば、水産物に含まれている毒素の 1種であり、特にホタテ貝等の二枚貝に含まれている下痢性貝毒であるオカダ酸を測定する場合には、アセトン、エーテル、エチルアルコール又はメチルアルコールで抽出操作を行い、必要に応じてその抽出液を濃縮した後、高速液体クロマトダラフィ一で測定を行っていた。

また、前記の水難溶性脂溶性化合物を免疫学的な手法によつて測定する場合には、検査に先立ち、検査目的対象物を含有している可能性のある試料を、目的対象物の脂溶性の程度に応じて選択した有機溶媒によって抽出する必要があった。これらの操作は、水溶性化合物の場合と比較して、煩雑で時間のかかるものであった。更に、抽出に用いた有機溶媒が存在すると、その濃度によって免疫反応が妨害され全く反応を起こさないか、あるいは極めて不正確な測定結果を招くことがあった。この不正確な免疫反応を防止するために、脂溶性化合物の有機溶媒抽出液を水で希釈して、免疫反応が正確に進行する濃度まで有機溶媒含有量（例えば 4 0 %以下）を低下させると、免疫反応を正確に進行させることはできても、脂溶性化合物自体の溶解性が低下して、正確な測定ができなくなるという問題があつた。従って、本発明の 1つの目的は、水難溶性の脂溶性化合物を、抗体を用いて免疫学的に迅速かつ特異的に測定することのできる手段を提供することにある。

ところで、オカダ酸、ジノフィシストキシン一 1及びジノフィシストキシン一 3. (即ち、 7— 0—ァシル一ジノフィシストキシン— 1 ) の 3種の下痢性貝毒の内、オカダ酸は黒磯海綿の一 ¾ (Halichondria-okadai及び Halidiondna-meranodocia )か、ンノフィシストキシン一 1は渦鞭毛藻（Dinophysis fortii ) が産生する脂溶性化合物である。また、ジノフィシストキシン一 3は、前記ジノフィシストキシン一 1が貝の体内で変換されて生成する脂溶性化合物である。これらの化合物は、或る時期又は地域の食用二枚貝の中腸腺に蓄積し、貝を毒化する。食中毒の発生件数ではフグに次いで第二位であるが、患者数では第一位であり、食品衛生上、大きな問題である。

従来、下痢性貝毒の検査法としてはマウスを用いた致死活性測定法が公定法として用いられているが、動物の管理、検出感度、精度及び特異性等の面で問題があった。一方、この検査を、高感度で、簡便かつ短時間に行うことを目的とした手法の開発が試みられている。

例えば特開平 1一 9ら 1 9 9号公報には、オカダ酸群に対するモノクローナル抗体及びその製法が開示されている。しかしながら、該抗体は、下痢性貝毒のうち、オカダ酸及びジノフィシストキシン一 1に対して特異的に反応する抗体ではあるが、ジノフィシストキシン— 3とは反応しないので、検出 ·測定することはできない。また、前記特開平 1—9 6 1 9 9号公報には、有機溶媒存在下で活性を維持することのできるモノクロ一ナル抗体を得ることに鬨して一切記載がなく、それを示唆する記載もない。

本発明者は、日本における貝毒による食中毒の主原因はジノフィストキシン一 3であること、及び、前記の各貝毒はいずれも脂溶性物質であるので、被検試料から貝毒成分を抽出するには有機溶媒の使用が避けられず、操作工程を簡略化するには、有機溶媒存在下で免疫反応を行うことが望ましいことに鑑み、これらの課題を解決するべく鋭意研究したところ、前記下痢性貝毒本体のオカダ酸、ジノフィシストキシン一 1及びジノフィシストキシン一 3に特異的であり、しかも有機溶媒に耐性を示すマウスモノクローナル抗体を見出すことに成功し、このモノクローナル抗体を用いると、有機溶媒存在下でも免疫学的に迅速かつ特異的に下痢性貝毒を検出することができることを見出した。従って、本発明は、前記のモノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を分泌するハイブリド一マ及びそのモノク口ーナル抗体を用いる測定方法にも関する。発明の開示

本発明は 1つの観点では、有機溶媒に対する耐性を有する抗体を用い、有機溶媒の存在下で抗原抗体反応を実施することを特徴とする、脂溶性化合物の測定方法に関する。特には、本発明方法は、検査対象の脂溶性化合物を充分に溶解することのできる量の有機溶媒を含有する有機水性系又は有機系中で正確な抗原抗体反応を進行させることのできる抗体を用いて脂溶性化合物を免疫学的に測定することを特徴とするものである。

また、本発明は別の観点では、少なくともオカダ酸、ジノフイシストキシン一 1及びジノフィシストキシン一 3 (即ち、 7 —〇一ァシルージノフィシストキシン一 1 ) に特異的なモノクローナル抗体に関する。

更に、本発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び前記モノクローナル抗体を用いることを特徴とする下痢性貝毒の免疫学的検出方法にも閬する。図面の簡単な説明

第 1図は、各種メチルアルコール水溶液におけるオカダ酸の濃度と吸光度との関係を示すグラフである。

第 2図は、メチルアルコールとエタノールとの各種濃度の混合溶液における才力ダ酸の濃度と吸光度との関係を示すグラフである。

第 3図は、メチルアルコールとアセトンとの各種濃度の混合溶液における才力ダ酸の濃度と吸光度との閼係を示すグラフである。

第 4図は、メチルアルコールとジェチルエーテルとの各種濃度の混合溶液におけるオカダ酸の濃度と吸光度との関係を示すグラフである。

第 5図は、メチルアルコールとベンゼンとの各種濃度の混合溶液における才力ダ酸の濃度と吸光度との関係を示すグラフである。

第 6図は、メチルアルコール濃度 0〜4 0 %の溶液中にてォ力ダ酸を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。

第 7図は、メチルアルコール濃度 5 0〜1 0 0 %の溶液中にてオカダ酸を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。

第 8図は、メチルアルコール濃度 0〜4 0 %の溶液中にてジノフィシストキシン— 1を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。

第 9図は、メチルアルコール濃度 5 0〜1 0 0 %の溶液中にてジノフィシストキシン一 1を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。

第 1 0図は、メチルアルコール濃度 0〜4 0 %の溶液中にてジノフィシストキシン一 3を非競合法により測定した場合の検置線を示すグラフである。

第 1 1図は、メチルアルコール濃度 5 0〜1 0 0 %の溶液中にてジノフィシストキシン— 3を非競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。

第 1 2図は、オカダ酸を競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。

第 1 3図は、ジノフィシストキシン一 1を競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。

第 1 4図は、ジノフィシストキシン一 3を競合法により測定した場合の検量線を示すグラフである。発明を実施する最良の形態

本発明による脂溶性化合物の測定方法は、有機溶媒に対して耐性を有する抗体を用いること、及び有機溶媒の存在下で抗原抗体反応を実施することを除けば、それ以外の点では従来公知の免疫学的測定方法にそのまま適用することができる。

従って、前記の脂溶性化合物測定方法は、具体的には例えば、

( 1 )試料を有機溶媒で処理して有機溶媒抽出液を諷製するェ程、

( 2 )検査対象脂溶性化合物に対して特異性を有すると共に前記有機溶媒に対する耐性を有する抗体と、前記有機溶媒抽出液とを接触させる工程、

( 3 )標識を有する既知量の検査対象脂溶性化合物を前記工程 ( 2 ) と同時又は前記工程（ 2 ) の終了後に前記抗体と接触させる工程、 ( 4 ) 前記抗体と結合した標識化脂溶性化合物と、前記抗体と結合していない標識化脂溶性化合物とを分離する工程、

( 5 ) 前記工程（ 4 ) で分離したいずれか一方の標識化脂溶性化合物が有する標識からの信号を測定する工程を含む、試料中の脂溶性化合物の測定方法からなる。この測定方法は、通常、競合法及び非競合法と呼ばれているものに、本発明を適用したものである。

更に、前記の脂溶性化合物測定方法の具体的態様としては、例えば、

( 1 ) 試料を有機溶媒で処理して有機溶媒抽出液を調製するェ程、

( 2 ) 検査対象脂溶性化合物に対して特異性を有すると共に前記有機溶媒に対する耐性を有する第 1抗体を、不溶性担体に固定させる工程、

( 3 ) 検査対象脂溶性化合物を含む有機溶媒抽出液を、前記ェ程（ 2〉の固定化第 1抗体に接触させる工程、

( 4 ) 前記検査対象脂溶性化合物に対して前記第 1抗体とは異なる部位で結合すると共に標識を有する第 2抗体を過剰量で添加する工程、

( 5 ) 第 1抗体と検査対象脂溶性化合物との複合体に結合した第 2抗体上の標識の信号を測定する工程を含む、試料中の脂溶性化合物の測定方法も含まれる。この測定方法は、通常、サンドィツチ法と呼ばれている。本発明は、その他公知の免疫反応測定方法に広く応用することができる。

本発明による前記の脂溶性化合物測定方法で用いることのできる有機溶媒は、例えばアルコール類、ケトン類、エーテル類、ベンゼン若しくはそれらの混合物である。また、無水の有機溶媒だけでなく、各有機溶媒と水との混合物、更に前記有機溶媒混合物と水との混合物を用いることもできる。なお、水混和性又は水非混和性のいずれの有機溶媒も用いることができる。有機溶媒としては検查対象脂溶性化合物の抽出に用いる溶媒を用いると、有機溶媒で抽出工程を行ってから、そのまま直接、抗原抗体反応を有機溶媒中で実施することができるので便利である。また、水混和性の有機溶媒を用いると、有機水性溶媒で抽出工程を行うか、又は有機溶媒で抽出して水で希釈してから、抗原抗体反応を有機水性溶媒中で実施することができるので好ましい。水混和性有機溶媒としては、例えば、アルコール化合物（例えば、炭素原子 1〜3個の低級アルコール、特には、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール）、ケトン化合物（例えば、炭素原子 1〜3個の低級脂肪族ケトン、特には、メチルェチルケトン又はアセトン）或いはこれらの混合物を挙げることができる。

検査対象となる脂溶性化合物に対して特異性を有すると共に前記の有機溶媒に対して耐性を有する抗体は、その脂溶性化合物によって免疫した動物の血清から調製する抗血清でもよいが、その脂溶性化合物によって免疫した動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得るモノクローナル抗体が好ましい。これらの抗体の調製は常法で行うことができる。有機溶媒に対して耐性を有する抗体の選択は、異なる濃度で有機溶媒を含む有機水性溶媒に抗体を加えた後に、脂溶性化合物を添加し、抗原抗体反応が正常に進行することを確認することにより行った。

本発明方法で測定することのできる脂溶性化合物は、水に難溶性で前記の有機溶媒で抽出することのできる有機化合物であり、試料、例えば、生物学的試料、特には、動物（特にヒ卜）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、尿、膿）、臓器、組織、又は動植物それ自体もしくはそれらの乾燥体に含まれるものである。それらの脂溶性化合物は、例えば、毒素（例えば、下痢性貝毒）、薬剤（例えば、甲状腺ホルモン）である。本発明方法は、特に、水産物中の毒素、農産物中の残留農薬、動物体液中のホルモン又は医薬品等の免疫学的測定に用いるのが好ましい。

本発明では、検査対象となる脂溶性化合物を含有するおそれのある試料を有機溶媒（適当な場合には有機溶媒と水との混合物）で処理して、検査対象脂溶性化合物（試料中に含まれている場合）を抽出する。抽出用の有機溶媒は、検査対象脂溶性化合物の種類に応じて適当に選ぶことができる。得られた有機抽出液又は有機水系抽出液をそのまま又は水で希釈して次の接触工程に用いる。

一方、検査対象脂溶性化合物に対して特異性を有する抗体であって、その検査対象脂溶性化合物の抽出に用いた有機溶媒に対する耐性を有する抗体を、前記の方法で予め調製しておく。この抗体（サンドイッチ法では第 1抗体）と前記有機（又は有機水系）抽出液とを接触させると、その有機抽出液中に検査対象脂溶性化合物（抗原）が存在する場合には、有機溶媒の存在下で抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、前記の有機溶媒存在下で実施することを除けば、通常の抗原抗体反応と同様に行うことができる。例えば、抗体を適当な不溶性支持体 (例えば、ゥエル又はラテックス粒子）上に担持させ、有機抽出液中の抗原と特異的に反応させる。

本発明方法を競合法又は非競合法で実施する場合には、既知量の標識化抗原（即ち、検査対象脂溶性化合物）を用いて検査対象脂溶性化合物の存在の確認又は定量を行うことができる。また、サンドイッチ法を用いる場合には、過剰量の標識化第 2 抗体を用いる。検査対象脂溶性化合物の標識には、公知の標識体、例えば、放射性同位体（例えば、 ³²P、 ^3S S、 ³H ) 、酵素 (例えば、ペルォキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）、ビタミン（例えば、ビォチン）、蛍光物質（例えば、 F I TC ) 、化学発光物質（例えば、ァクリジニゥム）を用いることができる。

標識化抗原は、前記抗体と有機抽出液との接触工程が終了してから（即ち、前記抗体と有機抽出液中の抗原との抗原抗体反応が終了してから）（非競合法）、あるいは前記抗体と有機抽出液との接触工程と同時に（即ち、前記抗体と有機抽出液中の抗原との抗原抗体反応と同時に）（競合法）、反応系に加えることができる。非競合法では、有機抽出液中の検査対象脂溶性化合物と結合していない抗体が標識化抗原と結合する。一方、競合法では、既知量の標識化抗原と前記有機抽出液中の未知量の抗原とが拮抗的に抗体と結合する。サンドイッチ法では、第 1抗体を前記有機抽出液と接触させた後に非結合抗原を洗浄除去してから、標識化第 2抗体を加えると、第 1抗体と抗原との複合体に対して標識化第 2抗体が結合する。

前記の抗体と有機溶媒抽出液との接触工程、及び標識化抗原又は標識化第 2抗体の添加工程では、脂溶性化合物（抗原）の溶解度と標識の不活性化とを考慮して有機溶媒の濃度を選択する。即ち、有機溶媒の濃度が高ければ高い程、脂溶性化合物の溶解度は維持されるが、標識の中には有機溶媒によりその活性が失われるものもある。従って、脂溶性化合物の種類と標識の種類とによって有機溶媒の種類及び水中濃度を適宜決定する。なお、非競合法においては、抗原抗体反応を実施する条件と異なる条件下（例えば、水を添加して有機溶媒濃度を低下させる力あるいは水系に完全に置き換える）で、前記標識化抗原を添加することもできる。一方、競合法では標識化抗原を前記抗原抗体反応と同時に行うので、その反応系に存在する有機溶媒によって標識が不活性化しないようにする必要がある。例えば、有機溶媒によって全く影響を受けない標識（例えば、蛍光標識）を使用するか、あるいは有機溶媒の濃度を低くして標識（例えば、酵素、アビジン）の失活を防止する。

競合法及び非競合法では、標識化抗原と抗体との反応が終了した後で、抗体と結合した標識化抗原と、抗体と結合しなかつた標識化抗原とを分離する。分離は、例えば、沪過、遠心処理又は緩衝液による洗淨によって行うことができる。サンドィッチ法では、第 1抗体結合抗原と標識化第 2抗体との反応が終了した後で、第 1抗体結合抗原と結合しなかった標識化第 2抗体を除去し、続いて、第 1抗体結合抗原と結合した標識化第 2抗体の標識からの信号を測定する。

こうして分離した標識化抗原のいずれか一方又は両方の標識に由来する信号（競合法又は非競合法）、或いは、第 1抗体結合抗原と結合した標識化第 2抗体の標識に由来する信号（サンドィツチ法）を測定する。信号を測定する際には、標識化抗原を含む反応系を信号測定に好ましい条件に変えるのが好ましい。例えば、標識として酵素、アビジンを用いた場合には、反応系を水系に変えてから基質を加え、酵素活性を測定する。また、標識として蛍光又は化学発光物質を用いた場合には、消光が起こらない条件で信号を測定する。

次に、本発明の第 2の観点であるモノクローナル抗体、ハイプリドーマ及び免疫学的検出方法について順に説明する。

本発明によるモノクローナル抗体及びノ、ィブリドーマの調製は常法、例えば、続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会鎘）に記載の方法で行うことができる。具体的には、免疫原としては、オカダ酸、ジノフィシストキシン一 1及びジノフィシストキシン一 3に特異的なモノクローナル抗体をもたらすものを任意に用いることができるが、特には、オカダ酸、ジノフィシストキシン一 1及びジノフィシストキシン一 3、並びに、これらの塩類、更には、これらを生体高分子（例えば、ゥシ血清アルブミン又は免疫グロブリン）担体に結合させたものを用いるのが好ましい。これらの免疫原溶液を用いて哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ又はゥマ）をイン- ビボ免疫法により免疫する。例えば、免疫原溶液を等量のフロィンド氏完全アジュバント又は不完全アジュバントと乳化混合し、マウスの皮下に投与する（第 1回免疫）。以後、 2〜4週間の間隔で同様の操作を行い、数回免疫する。最終免疫から数日後に脾臓を無菌的に取り出し、ステンレスメッシュなどで押しつぶして脾臓細胞を諷製し、細胞融合工程に用いる。

細胞融合のもう一方の親細胞であるミエローマ細胞（骨髄腫細胞）としては、各種の公知の細胞株、例えば、 P 3 ( P 3 / X 6 3 - A g 8 ) 〔 Nature, 256,495-497 (1975)〕、 p 3 ~ U 1 CCurrent Topics inMicorobiologyandlmmunology, 81； 1-7(1978)〕、 N S - 1 〔 Eur.丄 Immunol" 6;51レ 519(1976) 〕、 M P C -l l Cell, 8;405-415(1976) 、 S P 2 / 0 〔 Nature, 276; 269-270 (1978)〕、 F O C J. Immunol. Metk, 35; 1-21(1980) 、 X 63. 6.55.3 〔 J. Immunol" 123; 1548-1550(1979)〕、 S 194 〔丄 Exp. Med" 148;313-323(1978)〕、又はラットにおける R 210 Nature, 277; 131-133(1979)〕などを使用することができる。

細胞融合は通常の方法、例えば、公知の融合促進剤（ポリエチレングリコールなど〉及び場合により補助剤（ジメチルスルホキシドなど）を用いて行うことができ、使用比率も常法と同様に、例えば、ミエローマ細胞に対して脾臓細胞を約 1〜1 0 倍程度の量で用いる。融合用培地としては、例えば、 4 0 %

( w/ v ) ポリエチレンダリコールを含むダルべッコ改変ィ一グル培地（ D M E M ) を用いることができる。融合は、前記の培地内で免疫脾臓細胞とミエローマ細胞とをよく混合することによって行う。

続いて、選別用培地（例えば、 H A T培地）を用いてハイブリドーマ以外の細胞を除去し、ハイプリドーマ培養上清の抗体 (即ち、オカダ酸とジノフイシストキシン一 1とジノフィシストキシン一 3とに同時に特異性を示すモノクローナル抗体）産生の有無を、例えば E L I S A法によって検出 '測定し、目的とするハイプリドーマを分離する。特に、有機溶媒（好ましくは水混和性有機溶媒）に対して耐性を有するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを選別する場合には、各種の濃度で前記有機溶媒を含む有機水性溶液ないし無水有機溶媒中に抗体を入れた後、下痢性貝毒を添加し、抗原抗体反応が正常に進行することを確認することによって、有機溶媒耐性モノクロ一ナル抗体を産生するハイプリドーマを選別する。

こうして得られた、目的のモノクローナル抗体を分泌する本発明のハイプリドーマは、通常の培地で継代培養することができ、また液体窒素等の中で容易に長期間保存することができる。ハイプリドーマを培養する培地としては、ハイプリドーマの培養に適した任意の培地を用いることができ、例えば D M E にゥシ胎児血清、 L—グルタミン、 L一ピルビン酸及び抗生物質 (ペニシリン Gとストレアトマイシン）を含む培地が用いられる。ハイプリドーマの培養は、イン' ビトロの場合には例えば培地中で 5 %C 02濃度及び 3 7でで約 3日間、またイン-ビボ例えばマウスの腹腔中で培養する場合には約 1 4日間実施するのが好ましい。

前記のハイプリドーマを常法によって培養した培養液から、あるいはハイプリドーマを投与した適当な哺乳動物（例えばマウス又はラット）の腹水から、目的とするモノクローナル抗体を分離し、精製することが可能である。培養液又はマウスの腹水からモノクローナル抗体を分離、精製する場合にはタンパク質の単離、精製に一般的に用いられる方法を用いることが可能である。そのような方法としては硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトダラフィ一、プロティン A又はプロティン G結合多糖類等を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、凍結乾燥の方法等がある。

本発明による下痢性貝毒検出方法は、前記の本発明のモノクローナル抗体（即ち、オカダ酸とジノフィシストキシン一 1とジノフィシストキシン一 3とに同時に特異性を示すモノクロ一ナル抗体）を用いて実施するので、下痢性貝毒を漏れなく検出することができる。また、本発明の下痢性貝毒検出方法の好ましい態様では、有機溶媒耐性モノクローナル抗体を用いるので、検査対象の下痢性貝毒を充分に溶解することのできる量の有機溶媒を含有する有機水性系又は有機系中で正確な抗原抗体反応を進行させることができる。

本発明の下痢性貝毒検出方法は、オカダ酸とジノフィシストキシン一 1とジノフィシストキシン一 3とに同時に特異性を示すモノクローナル抗体を用いること、そして好ましくは有機溶媒耐性抗体を用いること（従って、有機溶媒の存在下で抗原抗体反応を実施すること）を除けば、それ以外の点では従来公知の免疫学的検出方法にそのまま適用することができる。従って、本発明の下痢性貝毒検出方法は、前記の脂溶性化合物測定方法における「検査対象脂溶性化合物に対して特異性を有すると共に前記有機溶媒に対する耐性を有する抗体」として、「下痢性貝毒に対して特異性を有すると共に前記有機溶媒に対する耐性を有する抗体」を用いる競合法及び非競合法、並びにサンドィツチ法などの公知の免疫反応検出方法に広く応用することができる。

本発明下痢性貝毒検出方法で用いる有機溶媒も、前記の脂溶性化合物測定方法と同様にアルコール類又はケトン類であって、検査対象の下痢性貝毒を試料から抽出する際に用いる溶媒である。また、前記の脂溶性化合物測定方法と同様の水混和性の有機溶媒を用いるのが好ましい。

本発明の下痢性貝毒検出方法を具体的に実施する際には、最初に食用二枚貝の中腸腺検体を前記の有機溶媒で抽出する。得られた抽出液をそのまま又は水で希釈して次の接触工程に用いる。次に、例えば、マウスモノクローナル抗オカダ酸抗体であつて、水混和性有機溶媒に対し耐性を有する抗体を、前記の方法で予め調製しておく。この抗体（サンドイッチ法では第 1抗体）と前記有機溶媒抽出液とを接触させると、その有機溶媒抽出液中に下痢性貝毒（抗原）が存在する場合には、有機溶媒存在下で抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体 ^応は、有機溶媒存在下で実施することを除けば、通常の抗原抗体反応と同様に行うことができる。例えば、抗体を適当な不溶性支持体（ゥェル又はラテックス粒子）上に担持させ、有機溶媒抽出液中の抗原と特異的に反応させる。

本発明の下痢性貝毒検出方法を競合法又は非競合法、あるいはサンドィツチ法で実施する場合にも、前記の脂溶性化合物測定方法と同様の試薬及び操作手順を用いることができる。実施例

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

実施例 1 ：モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作成

下痢性貝毒の一種であるオカダ酸（和光純薬）（以下、 O A と称す） 2mg、 N—ヒドロキシサクシニミド 0 . 3 1 mg及び N , N—ジシクロへキシルカルボジイミド 0 . 5 7 mgをジメチルホルムアミド（以下、 D M Fと称す） 1 2 0〃 1に溶かし、室温で 2時間反応させた。得られた反応液を 2分割し、一方の反応液 3 9 Iにヒト I g G l , 5mgを加えて溶解し、他方の反応液 81 JU 1にはゥシ血清アルブミン（以下、 BS Aと称す） 1. 9mgを加えて溶解し、各々を室温で更に 2時間反応させた。最後に、得られた反応液のゲル沪過を、 PBS (pH7. 4 ) で平街させたセフアデックス G— 25カラムによって行った。得られた OA—ヒト I gG及び OA— B SAをそれぞれ

0. 82 GmgZml及び 1. 04 mgZmlの濃度で生理食塩水に溶かし、 OA—ヒト I gGを免疫原、 OA— B S Aを分析用抗原として用いた。

OA— I gG溶液 300〃 1に同量のフロインド完全アジュバントを加え、良く混合して均質のゾルを調製した。このゾル 200/^ 1を雌マウス（4週令； AZJ ) の腹腔内に投与した。 2力月後に、同様に調製した抗原ゾルを同じ量で腹腔内に投与した。

血清中の抗 OA抗体の力価の高くなつたマウスの脾臓を摘出し、 5%ゥシ胎児血清を含んだ T一 2培地によりシャーレ内で摘出脾臓を 3回洗浄した後、注射針で傷を付けてから、絞り出すようにして単細胞の懸濁液を調製した。単細胞懸濁液をメッシュで沪過して大きな固形物を除いた。得られた沪液に、マウスのミエローマ細胞 P3X— 63— Ag8— 6. 5. 3を細胞数の比で 1 ： 5 (ミエローマ細胞：脾臓細胞）になるように混ぜ、遠心（ 300Xg，4分）して細胞を集めた。次に、血清を含まない T一 3培地に前記の沈殿細胞を再懸濁し、同じ条件で遠心し、遠心管を指で弾いて沈渣を攪拌してから、 37°Cに暖めておいた 50%ポリエチレングリコール（分子量 1，500 ) 溶液 lmlを、遠心管を回転させながら、 60秒かけてゆっくり加えた。細胞融合の停止は、細胞融合が進行している遠心管に、血清を含まない T一 3培地を 3回に分けて添加する（最初は前記培地 3πύ、次に前記培地 9ml、そして最後に前記培地 38ml をそれぞれ 30秒かけて添加する〉ことにより行った。前記培地の添加が終了した後、 37°Cで 2分間、及び室温で 8分間保持してから遠心し、得られた細胞を細胞数が 2X10⁶Zmlになるように T一 2培地に懸濁した。この細胞懸濁液を 96穴のプラスチックプレートに 100 1 /ゥエルの量で分注して、 37 ^eCにて 5%二酸化炭素— 95%空気の気相で培養した。 24時閭後に、 T一 4培地を 100 1Zゥエルの量で添加して、更に 10日間から 14日間、同じ条件で培養を続けた。培養液中の抗 OA抗体の活性を調べ、目的とする抗体を産生しているゥエルの細胞について、 24穴のプラスチックプレ一トで、 HT培地を用い、限外希轵法によりハイプリドーマのクロー二ングを行った。クローニングした結果、抗 OA抗体を産生しているハイプリドーマ（融合細胞） 14株を得た。

実施例 2 ：モノクローナル抗体の調製

実施例 1で選抜したハイブリドーマ 14株の各々を、ぺニシリン、ストレプトマイシン及びファンギゾンをそれぞれ 2. 5 JUL g /mlづっ含む組織培養用無血清培地セルグロッサー H (ハイブリドーマ用）（住友製薬）で培養した。得られた細胞を同じ培地に懸濁し、抗 OA抗体を産生させる目的でミリポアダイナセルカルチャーシステム（ミリポア社）を用いて 5%二酸化炭素一 95%空気の気相の下で、 37°Cにて培養した。培養終了後、培養液を硫安分画し、得られたモノクローナル抗体を 0. 9%NaC 1含有 5mMトリス塩酸緩衝液（pH7. 5) に溶かして透析した。実施例 3 ：モノクローナル抗体の選定

14株のハイプリドーマが産生した各抗 OAモノクローナル抗体を用いて E L I S A用アレートを作成した。即ち、実施例 2で調製した抗〇Aモノクローナル抗体を 10〃 gZmlになるように、 0. 0831\¾硼酸舍有生理食塩水（ ^18. 0) (以下、 B B Sと称す）に溶かし、 96穴プレートに 1 O OAC 1 ゥェルの量で分注し、室温で 1時間放置して抗体を固定した。各ゥエルを BBS250〃 1で 3回洗浄した後、 BBSに溶かしたゼラチン溶液（ 1 OmgZml) 250 1を各ゥエルに分注し、室溫で 1時間放置してブロッキングを行った。

一方、水中のメチルアルコール濃度を 0% (水）から 100 % (無水アルコール）まで 10%ずつ徐々に変化させて調製したメチルアルコール水溶液のシリーズの各々に、既知の濃度で 0 Aを溶解して 0 A標準アルコ一ル性水溶液を調製した。

前記の各 E L I SA用プレートに、前記の〇A標準アルコール性水溶液 100 1を各ゥエルに加え、室温に放置して抗原抗体反応を進行させた。一時間後に各ゥエルを B B S 2 50 U 1で 5回洗浄した。次に、パーォキシダーゼで標識した〇 A (以下、 OA— PODと称す） 25〜： L 0 OngZmlを含む溶液 ( 1. 0%ゼラチンを含む BBS) 100 1を各ゥエルに加え、室温で一時間放置した。続いて、 BBS 250 1で 5回洗浄してから、基質溶液〔3, 3' , 5， 5' —テトラメチルベンチジン 10 Omgを DMF 10mlに溶かした溶液 10◦ u lを 0. 1 M酢酸ナトリウム溶液（pH5. 5 ) 9. 9mlで希釈した後、 3%過酸化水素水溶液 15 1を加えて調製した；以下、 TMBZ溶液と称す〕 100 1を各ゥエルに分注し、室温で 5〜40分間反応させ、 1 N硫酸 100 1を加えて反応を止めた。反応液の吸光度を 45 Onm又は 415nmにて分光光度計（日立分光光度計 U— 1100) で測定し、検量線を作成した。

その結果、ハイブリドーマ OA— 423株が産生する抗 OA モノクローナル抗体（以下、 OA— 423抗体と称す）が 100 %メチルアルコール中でも正しく抗原を認識して、正常な抗原抗体反応を行うことが分かった。前記ハイプリドーマ OA— 4 23は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（あて名：〒305日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号）に 1991年 10月 25日から国内寄託〔微ェ研菌寄第 12585号（FE RM P— 12585) 〕され、 1992年 7月 27日から ffl 際寄託〔微工研条寄第 3943号（FERM BP— 3943) 〕に移管されている。

このハイプリドーマ OA— 423株が産生する抗 OAモノクローナル抗体（OA— 423抗体）はメチルアルコール量が 0 % (0. 083M硼酸含有生理食塩水）〜 100%中で正しく抗原を認識して正常な抗原抗体反応を行なう。なお、ハイブリドーマ OA— 127株及び 227株が産生する各抗 OAモノクローナル抗体は 50%以下のメチルアルコールを含む水溶液中で正しく抗原を認識して正常な抗原抗体反応を行なった。

前記の OA— 423抗体の免疫グロプリンクラスをマウス I gサブクラス識別甩ビォチン標識抗体（ I g、 I gM、 I gG 1、 I gG2a、 I gG2b、 I gG3、 I gA、 λ型 L鎖、型 L鎖〉を用いて EL I SA法で調べたところ、 I gGl A;であつた。実施例 4 ：オカダ酸の検定

50%. 60%、 70%、 80%及び 90%メチルアルコール水溶液並びに 100%メチルアルコールに、 OAを各種の既知濃度で溶解して調製した◦ A標準溶液と、実施例 3に記载した条件で作成した OA— 423抗体の EL I SA用プレートを用いて、実施例 3と同様の手順に従い検量線を作成した。即ち、 OA— 423抗体 10 1 mlをゥエルに固定し、 OA— PO D 50ng/mlを用い、そして 22. 5。C〜26. 5。Cにて 8〜 20分間酵素反応を行った。なお、対照試験用にはマウス I g Gl ( 10 l Zml) を用いた。結果を第 1図に示す。

第 1図から明らかなとおり、 OA— 423抗体は〇 Aと 100 %メチルアルコール中においても正常な抗原抗体反応を行う。従って、 OAのメチルアルコール抽出液をそのまま用いて定量を行えることが明らかになった。

実施例 5 ：オカダ酸の検定

100%メチルアルコールに、エタノール、アセトン、エーテル、ベンゼンを各々、 0〜90%、 0〜50%、 0-20% 加えた混合液に、〇 Aを各種の既知濃度で溶解して調製した〇 A標準溶液と、実施例 3に記載した条件で作成した 0 A 423 抗体の EL I S A用プレートを用いて、実施例 3と同様の手順に従い検量線を作成した。即ち、 OA423抗体 10 gZ m lをゥヱルに固定し、 OA— P OD 50 n gZm 1を用い、そして 22〜25^eCにて 20〜30分間酵素反応を行なった。結果を第 2図〜第 5図に示す。

実施例 6 ：非競合法による下痢性貝毒の測定

非競合法により、 OA、ジノフィシストキシン一 1 (以下、 DTX1と称す〉及びジノフィシストキシン一 3 (7— O—ノ、。ルミトイルー DTX1 ) (以下、 DTX3と称す）の標準品を測定した。使用した EL I S A用プレートは OA— 423抗体を用いて、実施例 3に記載した条件下に調製した。標準試料溶液は、実検体からの抽出操作を考慮し、下痢性貝毒の 100% メチルアルコール溶液を一度乾固させた後、各々の濃度のメチルアルコールを含む B B Sに再溶解する方法で調製して用いた。前記 OA— 423抗体を担持した EL I SA用プレートを用いて、実施例 3に記載した非競合法により OA、 DTX1及び DTX3の標準品を測定した。メチルアルコール濃度を 10% 刻みで 0%から 100%までの 11段階について調べ、検量線を作成し、結果を第 6図〜第 11図に示した。

OAの非競合法による測定結果に対するメチルアルコール濃度の影響は、メチルアルコールの濃度が 10%以下の領域では差がなく、 0 Aの定量範囲は 0. 1〜3. OngZmlで感度良く定量することができる。しかし、メチルアルコール濃度を 20 %に上げると感度が低下し、定量範囲は 0. 3〜 1 OngZrnlになる。メチルアルコール濃度が 40%以上になると、それ以上の感度の低下はほとんど見られず、定量範囲は 3. 0〜100 Ong/mlである（以上、第 6図参照）。ただし、メチルアルコール濃度が 50 %以上になると、バックグラウンドの値が高くなる傾向がある（第 7図）。

DTX1の測定結果によれば、 D T X 1は 0 Aと比較して感度が低く、メチルアルコール濃度が 40%以下でも、定量範囲は 10〜3,000ng/ml、あるいは 10〜10，000ngZmlである (第 8図）。メチルアルコール濃度を 50%以上にすると、定量範囲は 100〜： lO'OOOngZmlとなり、 OAの場合と同様に、これ以上の感度低下は見られない（第 9図）。

DTX 3の測定結果によれば、メチルアルコール濃度が 20 %以下の領域ではメチルアルコールの影響を殆ど受けず、 DT X3の濃度が 1. 0〜3 OngZmlの範囲で定量が可能である。メチルアルコール濃度が 20%を越えると、測定結果にメチルアルコールの影響が出る。メチルアルコール濃度が 30%になると感度が低下し、定量範囲は 10〜30 Ong/mlになる（第 10図）。更に、メチルアルコール濃度を上げて 40%以上にすると、定量範囲は 1 0 O〜3,000ngZml、あるいは 1 00〜 10，000ngZmlになる（第 1 0図及び第 1 1図）。

以上の 0A、 DTX 1及び DTX3の測定実験の結果より、各メチルアルコール濃度における OA— 423抗体の 3種の下痢性貝毒に対する反応性を第 1表にまとめた。メチルアルコール濃度を 20%以下にすると、 OA— 423抗体が OA及び D TX 3と定量的反応を示す貝毒の低濃度領域で、 OA— 423 抗体は DTX 1と反応しない。従って、メチルアルコール濃度を選択することにより、 OA及び DTX3のみを定量することができる。

メチルアル OA DTX 1 DTX3 コール濃度（％)

0 0. 0006 0 07 10 0. 002 0 13

20 0. 005 0 17

30 0. 0 17 40 0 06 0. 05

50 0 07 0. 27

60 0 03 0. 31

70 0 17 0. 50

80 0 03 0. 05

90 0 04 0. 14 00 0 08 0. 23 実施例 7 ：競合法による下痢性貝毒の測定

実施例 6に記載した方法で調製した標準品溶液と、実施例 3 の条件で作成した OA— 423抗体を担持した EL I SA用プレートを用いて、 OA、 DTX1及び DTX3の競合法による測定を、メチルアルコール濃度を 10%刻みで0%から70% までの 8段階で行い、檩準曲線を作成した。その結果を第 12 図〜第 14図に示す。 3種の貝毒では何れも、メチルアルコール濃度が 50%を越えると、定量曲線が描けなくなる。これは固相化された OA— 423抗体に対する OA、 DTX1及び D TX3の反応性が、 OA— PODよりも相対的に弱くなり、競合反応が成立しないためと考えられる。メチルアルコール濃度を 30 %以下にすると、測定系として満足できる結果を得ることができた。

0 Aの競合法による測定によれば、メチルアルコール濃度が 0〜20%の領域で定量範囲は 0. 3〜3 OngZmlである。メチルアルコール 30 %での測定範囲は 1. 0〜 10 OngZmlであり、非競合法による測定よりは高感度で定量ができる（第 12図）。 DTX1の場合では、メチルアルコール濃度が 10%以下の領域での定量範囲は 1. 0〜10 Ong/mlである。メチルアルコール濃度を 30%に上げると、 3 O S.OOOngZmlに低下する（第 13図）。

DTX3の場合には、低濃度のメチルアルコールによる影響が大きい。 DTX3の定量範囲は、メチルアルコール濃度が 1 0%以下で 1. 0〜30 OngZmlである。メチルアルコール濃度を 30%に上げると、 10〜： UOOOngZmlに低下する（第 14図）。

〇A、 DTX 1及び DTX3の OA— 423抗体に対する反応性とメチルアルコール濃度の鬨係を第 2表に示した。即ち、メチルアルコール濃度が 0〜40%の範囲では、いずれの条件下でも、 OA423抗体と OAと DTX1及び DTX3との反応性の比は、 OAを 1とした場合に、 DTX1及び DTX3はそれぞれ少なくとも約 1 10又はそれ以上となった。第 2表

メチルアル OA DTX 1 DTX3 コール濃度（％)

0 0 5 0. 09

10 0 33 0. 10

20 1 0 08 0. 08

30 1 0 10 0. 10

40 1 0 16 0. 23 産業上の利用可能性

従来は、水難溶性脂溶性化合物を測定する場合に、試料の中から検査対象の水難溶性脂溶性化合物を適当な有機溶媒で抽出し、更に精製してから、各種の機器分析などを行なっていた。これに対して、本発明の脂溶性化合物測定方法では、試料を有機溶媒で処理して得た抽出液をそのまま直接、又は水で単に希釈しただけで、免疫学的な測定用試料とすることができ、その抽出液中に含まれている脂溶性化合物と、その脂溶性化合物に対する有機溶媒耐性抗体との抗原抗体反応を行うことができるので、極めて簡便に正確で精度の高い測定を莠施することができる。

また、下痢性貝毒を測定する従来の致死活性測定法には、動物の管理、検出感度や精度及び特異性に問題があり、従来の競合酵素免疫学的測定法にも、下痢性貝毒のうちの D T X 3を検出 -測定することができないという欠点があつた。これに対し、本発明によれば、 O A、 D T X 1及び D T X 3の 3種の下癞性貝毒の全てに特異性を有するモノクローナル抗体が提供されるので、従来法の欠点を解消することができる。また、前記モノク口ーナル抗体が有機溶媒耐性を有する場合には、試料からの有機溶媒抽出液をそのまま又は単に希釈するだけで検出又は測定工程に用いることができるので、検出又は測定工程が簡便になるだけでなく、高精度及び高感度を達成することができる。従って、食品衛生等に貢献することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 有機溶媒に対する耐性を有する抗体を用い、有機溶媒の存在下で抗原抗体反応を実施することを特徴とする、脂溶性化合物の測定方法。

2 . 検査対象の脂溶性化合物を充分に溶解することのできる量 · の有機溶媒を含有する有機系中で正確な抗原抗体反応を進行させることのできる抗体を用いる請求項 1記載の方法。

3 . ( 1 ) 試料を有機溶媒で処理して有機溶媒抽出液を調製する工程、

( 2 ) 検査対象脂溶性化合物に対して特異性を有すると共に前記有機溶媒に対する耐性を有する抗体と、前記有機溶媒抽出液とを接触させる工程、

( 3 ) 標識を有する既知量の検査対象脂溶性化合物を前記工程 ( 2 ) と同時又は前記工程（ 2 ) の終了後に前記抗体と接触させる工程、

( 4 ) 前記抗体と結合した標識化脂溶性化合物と、前記抗体と結合していない標識化脂溶性化合物とを分離する工程、

( 5 ) 前記工程（ 4 ) で分離したいずれか一方の標識化脂溶性化合物が有する標識からの信号を測定する工程

を含む、請求項 1記載の方法。

4 . ( 1 ) 試料を有機溶媒で処理して有機溶媒抽出液を調製する工程、

( 3 ) 検査対象脂溶性化合物を含む有機溶媒抽出液を、前記ェ程（2 ) の固定化第 1抗体に接触させる工程、

( 4 )前記検査対象脂溶性化合物に対して前記第 1抗体とは異なる部位で結合すると共に標識を有する第 2抗体を過剰量で添加する工程、

( 5 )第 1抗体と検査対象脂溶性化合物との複合体に結合した第 2抗体上の標識の信号測定する工程

を含む、請求項 1記載の方法。

5 . 才力ダ酸に特異的なモノクローナル抗体を用いる請求項 1 記載の方法。

6 - 少なくともオカダ酸、ジノフィシストキシン一 1及びジノフィシストキシン一 3に特異的なモノクローナル抗体。

7 . 有機溶媒に対する耐性を有する請求項 5記載のモノクロ一ナル抗体。

8 . 請求項 5記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリド一マ。

9 - 請求項 5記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、下痢性貝毒の免疫学的検出方法。

1 0 . 請求項 5記載のモノクローナル抗体の、下痢性貝毒の免疫学的検出方法における使用。