JPH02171187A - 酵素の活性維持方法 - Google Patents
酵素の活性維持方法Info
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- JPH02171187A JPH02171187A JP32642288A JP32642288A JPH02171187A JP H02171187 A JPH02171187 A JP H02171187A JP 32642288 A JP32642288 A JP 32642288A JP 32642288 A JP32642288 A JP 32642288A JP H02171187 A JPH02171187 A JP H02171187A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
Ａ、産業上の利用分野
本発明は有機溶媒中で酵素の活性を維持する方法に関す
るものである。
るものである。
Ｂ０発明の概要
本発明は、有機溶媒中で酵素の活性を維持する方法にお
いて、 有機溶媒として、アミド、アルコール系あるい；よスル
ホキシド系のいずれかであって、水和可能なものを用い
、 酵素として、酵素免疫測定法により生体成分を測定する
ときに使用する酵素を用いることによって、 酵素の失活を防止しようとするものである。
いて、 有機溶媒として、アミド、アルコール系あるい；よスル
ホキシド系のいずれかであって、水和可能なものを用い
、 酵素として、酵素免疫測定法により生体成分を測定する
ときに使用する酵素を用いることによって、 酵素の失活を防止しようとするものである。
Ｃ１従来の技術及び発明が解決しようとする課題
酵素はタンパク質よりなる生体内触媒であって、生体内
で起こっている多数の化学反応に関与している。その特
徴は一般の化学触媒とは異なり、常温、常圧といった緩
和な条件下に効率よく触媒作用を発揮する。しかもその
作用特異性が非常に高いことである。しかし酵素はタン
パク質からできているために、一般に熱３強酸１強アル
カリ、有機溶媒などに不安定である。また生体外で酵素
反応を行うのに適した環境においてら比較的早く失活す
る。そのため反応時間の経過とともに反応速度が低下す
るという欠点がある。
で起こっている多数の化学反応に関与している。その特
徴は一般の化学触媒とは異なり、常温、常圧といった緩
和な条件下に効率よく触媒作用を発揮する。しかもその
作用特異性が非常に高いことである。しかし酵素はタン
パク質からできているために、一般に熱３強酸１強アル
カリ、有機溶媒などに不安定である。また生体外で酵素
反応を行うのに適した環境においてら比較的早く失活す
る。そのため反応時間の経過とともに反応速度が低下す
るという欠点がある。
ここで有機溶媒を用いる場合としては次の■。
■等の例があげられる。
■膜の脂溶性成分を有機溶媒で抽出した後、水性溶媒で
蛋白質を可溶化するか、あるいは蛋白質を直接に有機溶
媒中へ抽出することによって、蛋白質の可溶化を図る。
蛋白質を可溶化するか、あるいは蛋白質を直接に有機溶
媒中へ抽出することによって、蛋白質の可溶化を図る。
■蛋白質の結晶化には、塩、ポリエヂレングリコール、
有機溶媒などが多用される。有機溶媒は塩とは全く異な
る影響を蛋白質へ及ぼす。したがって蛋白質の塩による
結晶化が成功しないときにしばしば有機溶媒を用いて蛋
白質の結晶化を図る。
有機溶媒などが多用される。有機溶媒は塩とは全く異な
る影響を蛋白質へ及ぼす。したがって蛋白質の塩による
結晶化が成功しないときにしばしば有機溶媒を用いて蛋
白質の結晶化を図る。
このように有機溶媒は、蛋白質に対して頻繁に用いられ
るが、タンパク質の高次構造の破壊の可能性がある。よ
って、触媒機能を重視する酵素では、できる限り有機溶
媒の使用が避けられる傾向にあった。そのため不溶性の
有機化合物を蛋白質水溶液に溶解する必要があるとき、
有機化合物をできるだけ少量の有機溶媒に溶かし、添加
する努力が払われてきた。
るが、タンパク質の高次構造の破壊の可能性がある。よ
って、触媒機能を重視する酵素では、できる限り有機溶
媒の使用が避けられる傾向にあった。そのため不溶性の
有機化合物を蛋白質水溶液に溶解する必要があるとき、
有機化合物をできるだけ少量の有機溶媒に溶かし、添加
する努力が払われてきた。
本発明の目的は、例えば有機化合物を酵素の水溶液に溶
解するために予め有機化合物を有機溶媒に溶かす場合、
有機溶媒量が増えても酵素活性か失活することのない方
法を提供することにある。
解するために予め有機化合物を有機溶媒に溶かす場合、
有機溶媒量が増えても酵素活性か失活することのない方
法を提供することにある。
０６課題を解決するための手段
本発明では、有機溶媒として、アミド系、アルコール系
あるいはスルホキシド系のいずれかであって水和可能な
ものを用い、例えばジメチルホルムアミド、エタノール
、ＤＭＳＯ等が該当する。
あるいはスルホキシド系のいずれかであって水和可能な
ものを用い、例えばジメチルホルムアミド、エタノール
、ＤＭＳＯ等が該当する。
また酵素として、酵素免疫測定法によりガンマーカ、ホ
ルモン、抗体等の生体成分を測定するときに使用する酵
素を用い、例えばグルコースオキシダーゼ、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコー
ス６リン酸脱水素酵素等が該当する。ここで酵素免疫測
定法とは、例えば人体の血清中の抗原のｍを測定するた
めに、対応する抗体を固相に吸着させておき、この固相
上の抗体に抗原を特異的に吸着させ、更にこの抗原に抗
体を特異的に吸着させて抗原を抗体で挟み込み、外方側
の抗体に酵素よりなる標識体を付着し、標識体の量を測
定して間接的に抗原の量を求める方法である。本発明で
用いる酵素は、この標識体となる酵素である。
ルモン、抗体等の生体成分を測定するときに使用する酵
素を用い、例えばグルコースオキシダーゼ、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコー
ス６リン酸脱水素酵素等が該当する。ここで酵素免疫測
定法とは、例えば人体の血清中の抗原のｍを測定するた
めに、対応する抗体を固相に吸着させておき、この固相
上の抗体に抗原を特異的に吸着させ、更にこの抗原に抗
体を特異的に吸着させて抗原を抗体で挟み込み、外方側
の抗体に酵素よりなる標識体を付着し、標識体の量を測
定して間接的に抗原の量を求める方法である。本発明で
用いる酵素は、この標識体となる酵素である。
Ｅ、実施例
酵素としてグルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）、有機溶
媒としてＮ、Ｎジメチルホルムアミドを夫々用いた場合
の実験例について述べる。
媒としてＮ、Ｎジメチルホルムアミドを夫々用いた場合
の実験例について述べる。
■６ ｍ９７ ｍ１２ＣＯＤ （東洋紡製１０３Ｕ／ｍ
９Ｌｏｔ７３２５０）を含む０．１ｍ＆／ｆ２リン酸緩
衝液（ｐ ）−１７、０） ｌ ｍ Ｑを入れた試験管
を７本用念する。
９Ｌｏｔ７３２５０）を含む０．１ｍ＆／ｆ２リン酸緩
衝液（ｐ ）−１７、０） ｌ ｍ Ｑを入れた試験管
を７本用念する。
■各々にＮ１Ｎジメチルポルムアミド（国産化学製）を
０．２０，４０，６０，１００，２００゜３００μρ加
え、３０℃で１時間静置する。
０．２０，４０，６０，１００，２００゜３００μρ加
え、３０℃で１時間静置する。
■０．１ｍｏｆ２／１２リン酸緩衝液（ｐＨ７１０）を
加え、最終体積を２．５ｍ＋２とする。
加え、最終体積を２．５ｍ＋２とする。
■■の反応液をＮＡＰ−１０（ファルマシア製Ｌｏｔｌ
７−０８５４−０１）で脱塩する。溶出液は０．１ｍ
ｏＱ／１２リン酸緩衝液（ｐ！（６，０）を用いる。各
々のＣＯＤａ度を比色法で測定する。
７−０８５４−０１）で脱塩する。溶出液は０．１ｍ
ｏＱ／１２リン酸緩衝液（ｐ！（６，０）を用いる。各
々のＣＯＤａ度を比色法で測定する。
■各々のＣＯＤ酵素活性を化学発光法で求める。
（イ）各々の反応液を０．Ｏ１ｍｏ１２／１２酢酸緩衝
液（ｐＨ４，５）で１０万倍に希釈する。
液（ｐＨ４，５）で１０万倍に希釈する。
（ロ）希釈液を０．１ｍ１２とり、０．５ｍｏ（！／Ｑ
グルコースを含む０．０１ｍｏＣ／１２酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４，５）０．３ｍＱを加え、３７℃で２時間反応させ
る。
グルコースを含む０．０１ｍｏＣ／１２酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４，５）０．３ｍＱを加え、３７℃で２時間反応させ
る。
（ハ）（ロ）の反応液０．１ｍＣをとり、２ＸＩＯ−’
ｍｏＱ／１２ルミノールを含む０．２ｍｏ１２＃！炭酸
緩衝液（ｐＨ９，８）０．５ｍ１２．６ＸｌＯ−３ｍｏ
ｆ２／Ｑフェリシアン化カリウム水溶液０．５ｒｒｌを
順次加え、１６〜４５秒間の発光量を測定する。
ｍｏＱ／１２ルミノールを含む０．２ｍｏ１２＃！炭酸
緩衝液（ｐＨ９，８）０．５ｍ１２．６ＸｌＯ−３ｍｏ
ｆ２／Ｑフェリシアン化カリウム水溶液０．５ｒｒｌを
順次加え、１６〜４５秒間の発光量を測定する。
０．２０，４０，６０，１００，２００，３００μｍ２
Ｎ、 Ｎジメチルホルマイドを添付したときの、ＧＯＤ
比活性を第１図に示す。ＣＯＤ比活性とは、Ｎ、Ｎジメ
チルホルムアミドがＯμＱのときの化学発光量を１００
とすると、これに対する各添加量における化学発光量の
比である。このＧＯＤ比活性については、化学発光量の
代わりに比色法で求めたＣＯＤ１ａ度の比の値を用いて
も同様の結果が得られた。
Ｎ、 Ｎジメチルホルマイドを添付したときの、ＧＯＤ
比活性を第１図に示す。ＣＯＤ比活性とは、Ｎ、Ｎジメ
チルホルムアミドがＯμＱのときの化学発光量を１００
とすると、これに対する各添加量における化学発光量の
比である。このＧＯＤ比活性については、化学発光量の
代わりに比色法で求めたＣＯＤ１ａ度の比の値を用いて
も同様の結果が得られた。
第２図は、上述実験例においてＣＯＤとしてベーリンガ
ーマイハイム製３０５ Ｕ／ｍｇＬｏｔｌ １０５９０
２１−４２を用いたときの結果である。
ーマイハイム製３０５ Ｕ／ｍｇＬｏｔｌ １０５９０
２１−４２を用いたときの結果である。
これらの結果からＣＯＤにＮＳＮジメチルホルムアミド
を添加すると、その添加量が４０μＱを越えたときに急
激に酵素活性が上昇し、以後約１４０〜１５０％で一定
となっていることがわかる。
を添加すると、その添加量が４０μＱを越えたときに急
激に酵素活性が上昇し、以後約１４０〜１５０％で一定
となっていることがわかる。
Ｎ、Ｎジメチルホルムアミド添加がＣＯＤ比活性増大に
起因する理由については、Ｎ、Ｎジメチルホルムアミド
により酵素活性部位の立体構造が変化し、基質であるグ
ルコースをグルコン酸にする反応を増大させ、またＮ、
Ｎジメチルホルムアミドが酵素自身に由来する酵素活性
阻害物除去を促進したのではないかと考えられる。
起因する理由については、Ｎ、Ｎジメチルホルムアミド
により酵素活性部位の立体構造が変化し、基質であるグ
ルコースをグルコン酸にする反応を増大させ、またＮ、
Ｎジメチルホルムアミドが酵素自身に由来する酵素活性
阻害物除去を促進したのではないかと考えられる。
Ｆ０発明の効果
本発明によれば、実験例かられかるように酵素の水溶液
中に有機溶媒を添加したときに酵素活性が失活しない。
中に有機溶媒を添加したときに酵素活性が失活しない。
第１図及び第２図は本発明方法における実験結果を示す
グラフである。 外２名 第１図 大過爽テ゛−タのγラフ ジメナルホルマイトオ１７１１］１（μの第２図 突、跨１１−）つり“フッ
グラフである。 外２名 第１図 大過爽テ゛−タのγラフ ジメナルホルマイトオ１７１１］１（μの第２図 突、跨１１−）つり“フッ
Claims (1)
- （１）有機溶媒中で酵素の活性を維持する方法において
、 有機溶媒として、アミド系、アルコール系あるいはスル
ホキシド系のいずれかであって水和可能なものを用い、 酵素として、酵素免疫測定法により生体成分を測定する
ときに使用する酵素を用いることを特徴とする酵素の活
性維持方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32642288A JPH02171187A (ja) | 1988-12-23 | 1988-12-23 | 酵素の活性維持方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32642288A JPH02171187A (ja) | 1988-12-23 | 1988-12-23 | 酵素の活性維持方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02171187A true JPH02171187A (ja) | 1990-07-02 |
Family
ID=18187616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32642288A Pending JPH02171187A (ja) | 1988-12-23 | 1988-12-23 | 酵素の活性維持方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02171187A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993003365A1 (fr) * | 1991-08-09 | 1993-02-18 | Iatron Laboratories, Inc. | Dosage immunologique, anticorps monoclonal et hybridome |
-
1988
- 1988-12-23 JP JP32642288A patent/JPH02171187A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993003365A1 (fr) * | 1991-08-09 | 1993-02-18 | Iatron Laboratories, Inc. | Dosage immunologique, anticorps monoclonal et hybridome |
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