JPH09178755A - ビリルビンの定量方法及び定量試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 臨床検査上有用であるビリルビンを含む生体
試料中のビリルビン定量方法及び定量用試薬に関する。 【解決手段】 ビリルビンを含む生体試料にアスコルビ
ン酸オキシダーゼを作用させビリルビンを酸化し、それ
により生じるビリルビンの量的変化を光学的に測定する
ことにより該試料中のビリルビンを定量する方法におい
て、反応促進化合物の存在下でアスコルビン酸オキシダ
ーゼを作用させることを特徴とするビリルビンの定量法
及び反応促進化合物とアスコルビン酸オキシダーゼを含
む定量用試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査上有用で
あるビリルビンを酵素的に定量する方法及び定量用試薬
に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビリルビンは、ヘムの生理的代謝産物で
胆汁中に最も多く存在する色素である。血清中では直接
型ビリルビンと間接型ビリルビンとして存在するが、こ
れらを分別定量することは臨床検査上非常に重要であり
古くから行われている。従来より臨床検査で測定される
ビリルビンは、総ビリルビンと直接型ビリルビンであ
り、間接型ビリルビンはこれらの差として求められてい
る。

【０００３】ビリルビンの化学的定量法としては、ビリ
ルビンとジアゾ試薬の反応で生成するアゾビリルビンを
比色定量する方法が知られている。しかし、この方法は
操作が煩雑である、ジアゾ試薬が被検液中に存在するビ
リルビン以外の生体成分と反応するため正確性に欠ける
などの問題点が指摘されている。

【０００４】一方、酵素を用いたビリルビンの定量方法
としては、菌茸由来のビリルビンオキシダーゼでビリル
ビンを酸化させ、このときの吸光度の減少を測定し定量
する方法（特開昭５６−２７６５６号公報）や、ミロセ
シウム属（Myrothecium）の微生物由来のビリルビンオ
キシダーゼを用いビリルビンの吸光度の減少を測定し定
量する方法（特開昭５７−１５９４８７号公報）が報告
されている。また、ビリルビンオキシダーゼ、アスコル
ビン酸オキシダーゼ、ラッカーゼ及びチロシナーゼから
なる群より選ばれる酵素と界面活性剤、芳香族カルボン
酸、サルファ剤及びプロテアーゼからなる群より選ばれ
る化合物を反応促進物質として併用した総ビリルビン又
は直接型ビリルビンの定量方法（特開昭５９−１７９９
９号公報）も報告されている。

【０００５】

【本発明が解決しようとする課題】酵素を用いたビリル
ビンの定量方法においては、ビリルビンオキシダーゼは
安定性が悪く、凍結乾燥品であるため測定直前に試薬調
製を必要とし、また調製後は使用可能な期間が短いとい
う欠点を有している。アスコルビン酸オキシダーゼ等、
ビリルビンオキシダーゼ以外の酸化酵素を用いる場合
は、ビリルビンの酸化反応はほとんど認められず、しか
も既知の反応促進物質を添加しても酸化反応はあまり促
進されない。

【０００６】本発明は、安定性の高い酵素アスコルビン
酸オキシダーゼと優れた反応促進効果を持つ化合物を併
用することによって、ビリルビンを迅速かつ正確に測定
する方法及び安定な定量用試薬を提供するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、（Ａ）少なく
とも２個の同一又は異なって、置換もしくは非置換アミ
ノ又はヒドロキシで置換されている置換芳香族炭化水
素、少なくとも２個の同一又は異なって、置換もしくは
非置換アミノ又はヒドロキシで置換されている置換芳香
族複素環及び有機鉄化合物からなる群より選ばれる反応
促進化合物を選択すること、（Ｂ）水性媒体中、試料中
のビリルビンをアスコルビン酸オキシダーゼ及び反応促
進化合物と共存させ、それによりビリルビンを酸化する
こと、（Ｃ）水性媒体の吸光度の変化を測定すること、
及び（Ｄ）吸光度の変化を検量線と比較することからな
る試料中のビリルビンの定量方法に関する。

【０００８】さらに本発明は、（Ａ）少なくとも一つの
置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシ及び酵素的に
切断される保護基で保護されている少なくとも一つの置
換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシで置換されてい
る置換芳香族炭化水素並びに少なくとも一つの置換もし
くは非置換アミノ又はヒドロキシ及び酵素的に切断され
る保護基で保護されている少なくとも一つの置換もしく
は非置換アミノ又はヒドロキシで置換されている置換芳
香族複素環からなる群より選ばれる反応促進化合物の前
駆体を選択すること、（Ｂ）水性媒体中、試料中のビリ
ルビンをアスコルビン酸オキシダーゼ、反応促進化合物
の前駆体及び反応促進化合物の前駆体から保護基を切断
する活性を有する酵素と共存させ、それによりビリルビ
ンを酸化すること、（Ｃ）水性媒体の吸光度の変化を測
定すること、及び（Ｄ）吸光度の変化を検量線と比較す
ることからなる試料中のビリルビンの定量方法に関す
る。

【０００９】また、本発明はアスコルビン酸オキシダー
ゼ及び少なくとも２個の同一又は異なって、置換もしく
は非置換アミノ又はヒドロキシで置換されている置換芳
香族炭化水素、少なくとも２個の同一又は異なって、置
換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシで置換されてい
る置換芳香族複素環及び有機鉄化合物からなる群より選
ばれる反応促進化合物からなるビリルビン定量用試薬に
関する。

【００１０】更に本発明は、アスコルビン酸オキシダー
ゼ、少なくとも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒ
ドロキシ及び酵素的に切断される保護基で保護されてい
る少なくとも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒド
ロキシで置換されている置換芳香族炭化水素並びに少な
くとも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシ
及び酵素的に切断される保護基で保護されている少なく
とも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシで
置換されている置換芳香族複素環からなる群より選ばれ
る反応促進化合物の前駆体及び反応促進化合物から保護
基を切断する活性を有する酵素からなるビリルビン定量
用試薬に関する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明で、単にビリルビンという
ときは間接型ビリルビン、直接型ビリルビン又は総ビリ
ルビンの何れをも示す。間接型ビリルビンとは、遊離型
のビリルビン（Ｃ₃₃Ｈ₃₆Ｎ₄ Ｏ₆ ）を示し、直接型ビリ
ルビンとは、間接型ビリルビンのカルボキシル基のモノ
あるいはジグルクロニドを示す。総ビリルビンとは、間
接型ビリルビンと直接型ビリルビンの和を示す。

【００１２】水性媒体とは、緩衝液、生理食塩水等水を
含有する液体を例示できるが緩衝液が好ましい。緩衝液
としては、公知の何れの緩衝液も使用され得るが、測定
する対象が直接型ビリルビンか総ビリルビンかによりｐ
Ｈ範囲の異なるものが用いられる。即ち、反応液のｐＨ
を変えることにより、直接型ビリルビンと総ビリルビン
とを分別定量することができ、総ビリルビンと直接型ビ
リルビンの差から間接型ビリルビンを求めることができ
る。緩衝液の濃度としては好ましくは１ｍＭ〜１Ｍ、よ
り好ましくは１０〜２００ｍＭである。

【００１３】直接型ビリルビンの測定には、好ましくは
ｐＨ２．０〜４．５、より好ましくはｐＨ２．５〜４．
０の緩衝液が用いられ、例えば乳酸緩衝液、クエン酸緩
衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グリシン緩衝液、
３，３−ジメチルグルタル酸緩衝液等があげられる。こ
の反応液のｐＨ範囲は、間接型ビリルビンが実質的に酸
化されない条件となり、直接型ビリルビンが測定でき
る。

【００１４】一方、総ビリルビンの測定には、好ましく
はｐＨ５．０〜１２．０、より好ましくはｐＨ６．５〜
９．５の緩衝液が用いられ、例えば乳酸緩衝液、クエン
酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝
液、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、ジエ
タノールアミン緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝
液、バルビツール緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン−塩酸緩衝液等があげられ、リン酸緩衝
液、トリエタノールアミン緩衝液、ジエタノールアミン
緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、バルビツール
緩衝液又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−
塩酸緩衝液が好ましく用いられる。この反応液のｐＨ範
囲は、直接型ビリルビン及び間接型ビリルビンが実質的
に酸化される条件となり、総ビリルビンが測定できる。

【００１５】ビリルビンを含む試料とは、水性媒体に混
和する試料であればどのようなものでもよいが生体試
料、例えば血漿、血清、尿等を例示することができる。

【００１６】本発明におけるアスコルビン酸オキシダー
ゼには、動物、植物又は微生物から採取したアスコルビ
ン酸オキシダーゼあるいはそれらを遺伝子工学的手法に
より改変し製造した酵素が含まれる。本酵素は、ビリル
ビンを酸化する活性が非常に低くビリルビン酸化酵素と
しては実用的ではないが、反応促進化合物の存在下では
活性が非常に高くなり、実質的にビリルビンを酸化する
酵素として用いることができる。

【００１７】アスコルビン酸オキシダーゼの濃度として
は、好ましくは５〜１０００Ｕ／ｍｌさらに好ましくは
１０〜５００Ｕ／ｍｌである。

【００１８】本発明で用いられる反応促進化合物として
は、少なくとも２個の同一又は異なって、置換もしくは
非置換アミノ又はヒドロキシで置換されている置換芳香
族炭化水素、少なくとも２個の同一又は異なって、置換
もしくは非置換アミノ又はヒドロキシで置換されている
置換芳香族複素環又は有機鉄化合物をあげることができ
る。

【００１９】芳香族炭化水素としては、ベンゼン、ナフ
タレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン等があ
げられ、好ましくはべンゼン、ナフタレン又はアントラ
セン、より好ましくはベンゼン又はナフタレンを用いる
ことができる。

【００２０】芳香族複素環としては、ピリジン、ピラジ
ン、ピリミジン、ピリダシン、キノリン、イソキノリ
ン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、フタラジ
ン、ナフチリジン、インドール、アクリジン等の含窒素
芳香族複素環があげられ、好ましくはピリジン、ピラジ
ン、ピリミジン、ピリダシン、キノリン、イソキノリ
ン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、フタラジ
ン又はナフチリジン、より好ましくはキノリンを用いる
ことができる。

【００２１】置換アミノの置換基は、同一又は異なっ
て、置換数１〜２の、例えば置換もしくは非置換のアル
キル、アルコキシ、アシル、アルケニル、置換もしくは
非置換のアリール又は置換もしくは非置換の芳香族複素
環基等があげられ、置換もしくは非置換アルキルを用い
ることが好ましい。

【００２２】置換もしくは非置換アルキル及びアルコキ
シにおけるアルキル部分は、直鎖又は分岐状の、炭素数
１〜１０のアルキル、さらに好ましくは炭素数１〜６の
アルキルであり、例えばメチル、エチル、プロピル、イ
ソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ
ｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、
ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等があげられる。

【００２３】アシルとしては直鎖又は分岐状の炭素数１
〜６のアルカノイル、例えばホルミル、アセチル、プロ
ピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバ
レリル、ピバロイル等が又はアロイル、例えばベンゾイ
ル、ナフトイル等があげられる。

【００２４】アルケニルとしては、直鎖又は分岐状の炭
素数２〜６の、例えばビニル、アリル、２−ブテニル、
２−ペンテニル、２−ヘキセニル等があげられる。

【００２５】アリールとしては、フェニル、ナフチル等
が、芳香族複素環基としては、ピリジル、ピリミジニ
ル、キノリル、イミダゾリル、トリアゾリル、フリル、
チエニル、ピラゾリニル、チアゾリル、オキサゾリル、
オキサジアゾリル等があげられる。

【００２６】置換アルキルの置換基は、同一又は異なっ
て置換数１〜３の、例えばアルコキシ、アシル、アリー
ル、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ホスホ、ハロゲ
ン等があげられる。アルコキシ、アシル、アリールは前
記と同意義を表し、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、
ヨウ素の各原子を表す。

【００２７】置換アリール及び置換芳香族複素環基の置
換基としては、同一又は異なって置換数１〜３の、例え
ばアルキル、アルコキシ、アシル、ハロゲン、カルボキ
シ、アルコシキカルボニル、シアノ、アミノ等があげら
れる。アルキル、アルコキシ、アシル、ハロゲンはそれ
ぞれ前記と同意義を表し、アルコキシカルボニルのアル
キル部分は、前記のアルキルと同意義である。

【００２８】なお、置換芳香族炭化水素及び置換芳香族
複素環の置換基としては、前記の少なくとも２個の同一
又は異なって置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシ
以外の置換基で置換されてもよく該置換基としては、例
えば同一又は異なって置換数１〜４のハロゲン又は置換
もしくは非置換アルキルを表し、ハロゲン、置換もしく
は非置換アルキルはそれぞれ前記と同意義である。

【００２９】有機鉄化合物としては、ヘキサシアノ鉄酸
塩、フェロセン類、鉄キレート等があげられる。ヘキサ
シアノ鉄酸としては、ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸及びヘ
キサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸が含まれ、塩を形成する塩基
としてはアンモニウムイオン、金属イオン等があげられ
金属イオンとしては例えばリチウム、ナトリウム、カリ
ウム等のアルカリ金属イオン、マグネシウム、カルシウ
ム等のアルカリ土類金属イオン、アルミニウム又は亜鉛
イオン等があげられる。

【００３０】フェロセン類とは、フェロセン及び置換基
を有するフェロセンをいう。置換基としてはアシル、置
換もしくは非置換アルキルがあげられ、アシル、置換も
しくは非置換のアルキルはそれぞれ前記と同意義であ
る。鉄キレートとはキレート化合物と鉄の結合したもの
をいう。キレート化合物としては、鉄を配位するもので
あれば公知のものを用いうるが、ポルフィリン環、ポリ
アミノカルボン酸、オキシカルボン酸等をあげることが
できる。

【００３１】本発明における反応促進化合物のうち特に
好ましい反応促進化合物としては、一般式（Ｉ）

【００３２】

【化５】

【００３３】（式中、Ｒ¹ はヒドロキシ又は置換もしく
は非置換アミノを表し、Ｒ² 及びＲ³は同一もしくは異
なって水素、ハロゲン又は置換もしくは非置換アルキル
を示し、Ｒ⁴ 及びＲ⁵ は同一もしくは異なって、水素又
は置換もしくは非置換アルキルを表す）で表される化合
物、一般式（ＩＩ）

【００３４】

【化６】

【００３５】（式中、置換基Ｒ⁶ 、Ｒ⁷ 、Ｒ⁸ 及びＲ⁹
は同一もしくは異なって、少なくとも２個の置換基は同
一又は異なって置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキ
シを表し、残り置換基は同一又は異なって水素、ハロゲ
ン、ヒドロキシ、置換もしくは非置換アミノ又は置換も
しくは非置換アルキルを表し、ＪはＣＨ又はＮを表す）
で表される化合物をあげることができる。

【００３６】ハロゲン、置換もしくは非置換アミノ、置
換もしくは非置換アルキルは、前記と同意義である。

【００３７】反応促進化合物の具体例としては例えば、
芳香族炭化水素がベンゼン環である化合物として、４−
アミノ−２，６−ジブロモフェノール、２，６−ジブロ
モ−４−メチルアミノフェノール、２，６−ジブロモ−
４−ジメチルアミノフェノール、２，６−ジブロモ−４
−スルホプロピルアミノフェノール、４−アミノ−２，
６−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロ−４−メチ
ルアミノフェノール、２，６−ジクロロ−４−ジメチル
アミノフェノール、２，６−ジクロロ−４−スルホプロ
ピルアミノフェノール、４−アミノ−２，６−ジヨード
フェノール、２，６−ジヨード−４−メチルアミノフェ
ノール、２，６−ジヨード−４−ジメチルアミノフェノ
ール、２，６−ジヨード−４−スルホプロピルアミノフ
ェノール、４，５−ジメチル−１，２−フェニレンジア
ミン、２，５−ジメチル−１，４−フェニレンジアミ
ン、４，５−ジエチル−１，２−フェニレンジアミン、
２，５−ジエチル−１，４−フェニレンジアミン、Ｎ，
Ｎ−ジメチル−１，４−フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−
ジエチル−１，４−フェニレンジアミン等があげられ
る。

【００３８】芳香族炭化水素がナフタレン環である化合
物として、例えば１，４−ナフトール、１，６−ナフト
ール、４−アミノ−１−ナフトール、５−アミノ−１−
ナフトール、１−アミノ−２−ナフトール等があげられ
る。芳香族複素環がキノリン環である化合物として、例
えば５−アミノ−８−ヒドロキシキノリン、５，８−ジ
アミノキノリン、５，８−ジヒドロキシキノリン等があ
げられる。

【００３９】有機鉄化合物は、ヘキサシアノ鉄酸塩とし
て、例えばフェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナ
トリウム、フェロシアン化マグネシウム、フェロシアン
化アンモニウム、フェリシアン化カリウム、フェリシア
ン化ナトリウム、フェリシアン化マグネシウム、フェリ
シアン化アンモニウム等を、フェロセン類としては例え
ばフェロセン、フェロセンジカルボン酸、フェロセニル
メタノール等が、鉄キレートのうちポリアミノカルボン
酸鉄キレートとして、例えばエチレンジアミン四酢酸
鉄、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテ
ル）四酢酸二鉄等があげられ、オキシカルボン酸鉄キレ
ートとしては、例えばグリコール酸鉄、グリセリン酸
鉄、乳酸鉄、リンゴ酸鉄、クエン酸鉄、酒石酸鉄等があ
げられる。

【００４０】反応液中の反応促進化合物の濃度として
は、好ましくは１〜１０００μＭ、さらに好ましくは１
０〜２００μＭである。

【００４１】本発明で用いる反応促進化合物の前駆体と
は、少なくとも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒ
ドロキシ及び酵素的に切断される保護基で保護されてい
る少なくとも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒド
ロキシで置換されている置換芳香族炭化水素並びに少な
くとも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシ
及び酵素的に切断される保護基で保護されている少なく
とも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシで
置換されている置換芳香族複素環をあげることができ
る。

【００４２】置換芳香族炭化水素、置換芳香族複素環及
び置換アミノの置換基は前述の置換芳香族炭化水素、置
換芳香族複素環及び置換アミノの置換基と同意義を示
す。

【００４３】上記酵素的に切断される保護基としては、
置換もしくは非置換アミノに対してはアミノ酸残基が、
ヒドロキシに対しては糖残基、ホスホ、スルホ等があげ
られる。アミノ酸残基を構成するアミノ酸としては、何
れのアミノ酸でもよいが、好ましくはα−アミノ酸があ
げられ，例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシ
ン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、リジン、ヒドロキシリジン、アルギ
ニン、システイン、メチオニン等があげられる。

【００４４】糖残基を構成する糖類としては、単糖類が
好ましく、酵素により加水分解されるものであれば何れ
の炭素数のものでもよいが、好ましくはペントース、ヘ
キソース、より好ましくはヘキソース、例えばガラクト
ース、グルコース、タロース、マンノース、ソルボー
ス、タガトース、フルクトース、プシコース等があげら
れる。

【００４５】なお、本発明で反応促進化合物の前駆体と
して用いられる置換芳香族炭化水素及び置換芳香族複素
環は、必要に応じて上述した、少なくとも一つの置換も
しくは非置換アミノ又はヒドロキシ及び酵素的に切断さ
れる保護基で保護されている少なくとも一つの置換もし
くは非置換アミノ又はヒドロキシの置換基に加え、更に
別の置換基で置換されていてもよい。別の置換基として
は、例えば同一又は異なって置換数１〜４のハロゲン又
は置換もしくは非置換アルキルがあげられる。ハロゲ
ン、置換もしくは非置換アルキルはそれぞれ前記と同意
義である。

【００４６】特に好ましい応促進化合物の前駆体として
は、一般式（ＩＩＩ）

【００４７】

【化７】

【００４８】（式中、Ｒ¹⁰は糖残基もしくはホスホを表
し、Ｒ² 、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 及びＲ⁵ は前記と同意義である）
で表される化合物及び、一般式（ＩＶ）

【００４９】

【化８】

【００５０】（式中、Ｒ¹¹はアミノ酸残基を表し、
Ｒ² 、Ｒ³ 及びＲ⁴ は前記と同意義である）で表される
化合物があげられる。糖残基及びアミノ酸残基の定義は
前記と同意義である。

【００５１】具体的な反応促進化合物の前駆体として
は、糖残基で保護された化合物として、例えば４−アミ
ノ−２，６−ジクロロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド、４−アミノ−２，６−ジクロロフェノール−
β−Ｄ−グルコピラノシド、４−アミノ−２，６−ジク
ロロフェノール−β−Ｄ−マンノピラノシド、２，６−
ジクロロ−４−メチルアミノフェノール−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド、２，６−ジクロロ−４−ジメチルアミ
ノフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、２，６−
ジクロロ−４−スルホプロピルアミノフェノール−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド等が、アミノ酸残基で保護され
た化合物として、例えば２，６−ジブロモ−４−（Ｎ−
ロイシル）アミノフェノール、２，６−ジブロモ−４−
（Ｎ−γ−グルタミル）アミノフェノール等があげられ
る。

【００５２】反応液中の反応促進化合物の前駆体濃度と
しては、好ましくは１〜１０００μＭ、さらに好ましく
は１０〜２００μＭである。

【００５３】反応促進化合物の前駆体から保護基を切断
する活性を有する酵素としては、保護基の種類に応じて
公知の加水分解酵素、転移酵素を用いることができる。
例えば、反応促進化合物の前駆体が４−アミノ−２，６
−ジクロロフェノールのヒドロキシがβ−Ｄ−ガラクト
シルで保護されている場合は、β−ガラクトシダーゼ
を、４−アミノ−２，６−ジブロモフェノールのアミノ
がロイシンで保護されている場合は、ロイシンアミノペ
プチダーゼを、また４−アミノ−２，６−ジクロロフェ
ノールのアミノがγ−グルタミン酸で保護されている場
合は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼをあげるこ
とができ、本酵素を用いる場合は、受容体としてグリシ
ルグリシン等を添加するのが好ましい。

【００５４】反応促進化合物の前駆体から保護基を切断
する活性を有する酵素の濃度は、好ましくは０．１〜５
００Ｕ／ｍｌ、より好ましくは１〜１００Ｕ／ｍｌであ
る。これら反応促進化合物の前駆体から保護基を切断す
る活性を有する酵素を作用させる時期はアスコルビン酸
オキシダーゼを作用させる直前又は同時がよい。

【００５５】反応促進化合物の前駆体は、酵素により保
護基が切断される結果、前記で定義した反応促進化合物
が生成する。生成した反応促進化合物の存在下に前記の
ビリルビンの定量を行うことができる。酵素的に切断さ
れる保護基で反応促進化合物を保護することにより溶液
中で自然酸化分解等の変化を受けにくくなり、試薬とし
ての安定性を高めることができる。反応促進化合物の前
駆体それ自体はアスコルビン酸オキシダーゼによるビリ
ルビンの酸化を促進させないが、反応促進化合物の前駆
体から保護基を切断する活性を有する酵素で保護基が切
断されることにより反応促進化合物となる。

【００５６】本発明のビリルビン定量方法は、水性媒体
中、試料中のビリルビンをアスコルビン酸オキシダーゼ
及び反応促進化合物と共存させ、それによりビリルビン
を酸化すること、水性媒体の吸光度の変化を測定するこ
と及び吸光度の変化を検量線と比較することにより行わ
れる。ビリルビンの酸化反応は、反応促進化合物、ビリ
ルビンを含む試料、及び必要に応じて試料の濁りを防ぐ
界面活性剤を水性媒体に添加し、水溶性媒体を２０〜５
０℃で、０〜１５分間、通常３７℃で５分間予備加温し
た後、アスコルビン酸オキシダーゼを加えて、２０〜５
０℃で、３〜１５分間、通常３７℃で５分間、反応させ
ることにより達成される。

【００５７】さらに、本発明のビリルビン定量方法は、
水性媒体中、試料中のビリルビンをアスコルビン酸オキ
シダーゼ及び反応促進化合物の前駆体化合物及び反応促
進化合物の前駆体から保護基を切断する活性を有する酵
素と共存させ、それによりビリルビンを酸化すること、
水性媒体の吸光度の変化を測定すること及び吸光度の変
化を検量線と比較することにより行われる。

【００５８】ビリルビンの酸化反応は、反応促進化合物
の前駆体、ビリルビンを含む試料、及び必要に応じて試
料の濁りを防ぐ界面活性剤を水性媒体に添加し、水溶性
媒体を２０〜５０℃で、０〜１５分間、通常３７℃で５
分間予備加温した後、アスコルビン酸オキシダーゼ及び
反応促進化合物の前駆体から保護基を切断する活性を有
する酵素を加えて、２０〜５０℃で、３〜１５分間、通
常３７℃で５分間、反応させることにより達成される。
なお、反応促進化合物の前駆体から保護基を切断する活
性を有する酵素は、反応促進化合物の前駆体の添加時に
同時に添加してもよい。

【００５９】界面活性剤としてはトリトン Ｘ−１０
０、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等を例示するこ
とができる。

【００６０】水性媒体の吸光度の変化はビリルビンがビ
リベルジン（Ｃ₃₃Ｈ₃₄Ｎ₄ Ｏ₆ ）に酸化されることによ
り起こる。ビリルビンの量的変化を光学的に測定する場
合、ビリルビンの減少は４４０〜４７０ｎｍの吸光度の
減少で、ビリベルジンの増加は３３０ｎｍ又は３８０ｎ
ｍの吸収の増大で測定することが好ましい。

【００６１】測定される吸光度の変化量は、対応するビ
リルビン濃度にプロットし、ビリルビン濃度と吸光度の
変化の関係を示す検量線を作成する。サンプル中のビリ
ルビン濃度は測定される吸光度の変化を検量線と比較し
て求められる。

【００６２】また、総ビリルビン測定の場合、界面活性
剤、芳香族カルボン酸、サルファ剤、アルコール等ジア
ゾ反応における間接型ビリルビンの反応活性化剤を添加
することもできる。界面活性剤としては、陰イオン系界
面活性剤が好ましく、例えばコール酸、ドデシル硫酸等
があげられる。芳香族カルボン酸としては、例えば安息
香酸、フタル酸、サリチル酸があげられる。サルファ剤
として、例えばスルファニルアミド、スルファメラジ
ン、スルフイソキサゾール、スルファチアゾール、スル
ファグアニジン等があげられる。アルコールとしては、
炭素数１〜６の例えばメタノール、エタノール、プロパ
ノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノー
ル、ヘキサノール等があげられる。

【００６３】上記の界面活性剤、芳香族カルボン酸、サ
ルファ剤は、塩として用いてもよくこの場合の塩基とし
ては、金属イオンがあげられ、例えばリチウム、ナトリ
ウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、マグネシウ
ム、カルシウム等のアルカリ土類金属イオン、アルミニ
ウム、亜鉛イオン等があげられる。間接型ビリルビンの
反応活性化剤の濃度は、好ましくは０〜５％、さらに好
ましくは０．１〜１％である。

【００６４】本発明の、ビリルビン定量試薬は、アスコ
ルビン酸オキシダーゼ及び反応促進化合物からなる。該
定量試薬は、アスコルビン酸オキシダーゼを含む試薬及
び反応促進化合物を含む試薬からなるキットであっても
よい。

【００６５】更に本発明の、ビリルビン定量試薬は、ア
スコルビン酸オキシダーゼ、反応促進化合物の前駆体及
び反応促進化合物の前駆体から保護基を切断する活性を
有する酵素からなる。該定量用試薬は、アスコルビン酸
オキシダーゼを含む試薬、反応促進化合物の前駆体を含
む試薬及び反応促進化合物の前駆体から保護基を切断す
る活性を有する酵素を含む試薬からなるキットであって
もよい。

【００６６】更に、該キットは、反応促進化合物の前駆
体を含む試薬及び反応促進化合物の前駆体から保護基を
切断する活性を有する酵素を含む試薬からなるキットで
あって、アスコルビン酸オキシダーゼがいずれか一方の
試薬に含まれているものでもよい。更に、該キットの各
試薬は水溶性媒体、好ましくは緩衝液を含むものが好ま
しい。

【００６７】ビリルビンの分別定量の観点から、直接型
ビリルビンの定量試薬は、 １）反応促進化合物の前駆体を含むｐＨ２．０から４．
５の緩衝液（以下、反応促進化合物の前駆体試薬とい
う）及び ２）反応促進化合物の前駆体から保護基を切断する活性
を有する酵素及びアスコルビン酸オキシダーゼを含む緩
衝液（以下、酵素試薬という）、からなるキットとし
て、総ビリルビンの定量試薬は、 １）反応促進化合物の前駆体を含むｐＨ５．０から１
２．０の緩衝液（以下、反応促進化合物の前駆体試薬と
いう）及び ２）反応促進化合物の前駆体から保護基を切断する活性
を有する酵素及びアスコルビン酸オキシダーゼを含む緩
衝液（以下、酵素試薬という）、からなるキットとして
構成するのが好ましい。

【００６８】酵素試薬のｐＨは、各酵素の溶液安定性を
考慮して決定するのが好ましく、反応促進化合物の前駆
体試薬のｐＨは、酵素試薬が添加されたのち所望の反応
ｐＨと一致するように調整されるのが好ましい。

【００６９】なお、上記に示した化合物又は酵素は、市
販品から容易に入手でき、例えば、東京化成（株）、
（株）同仁化学研究所、大東化学（株）、和光純薬工業
（株）、盛進（株）、ナカライ（株）又はアルドリッチ
（Aldrich ）社等の試薬カタログに掲載されている。

【００７０】試験例１ ビリルビン検体として、国際試薬（株）の干渉チェック
・Ａ ビリルビン・Ｃ（以下、単に直接型ビリルビン試
薬という）を１５ｍｇ／ｄｌに調整したものを０．１ｍ
ｌ、０．１Ｍ乳酸緩衝液（ｐＨ３．５）２．２ｍｌ及び
第１表に示す反応促進化合物を３．１ｍＭに調整した溶
液０．０５ｍｌを混合して、３７℃５分間予備加温し
た。このときの波長４５０ｎｍでの吸光度を日立Ｕ−３
２１０形自記分光光度計を用いて測定した（反応前の吸
光度：Ａ₀ ）。

【００７１】次に、４００Ｕ／ｍｌアスコルビン酸オキ
シダーゼ［旭化成工業（株）製、Acremonium sp.由来］
を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
０．７５ｍｌを加え、３７℃５分間反応させた後の吸光
度を測定した（反応後の吸光度：Ａ₂ ）。なお以後の説
明で反応前後の吸光度の変化量あるいは単に吸光度の変
化量というときは、上記Ａ₀ を反応前の液量から反応後
の液量に補正した値をＡ ₁ とし、Ａ₁ とＡ₂ の差を示
す。結果を第１表に示す。既知の反応促進化合物を用い
ても、反応促進化合物を用いないとき同様アスコルビン
酸オキシダーゼによるビリルビンの酸化は殆ど起こって
いないことがわかる。

【００７２】

【表１】

【００７３】試験例２ 反応促進化合物を第２表に示す反応促進化合物の前駆体
にかえる以外は試験例１と同様に予備加温したのち反応
前の吸光度を測定した。次いで、４００Ｕ／ｍｌアスコ
ルビン酸オキシダーゼと１０Ｕ／ｍｌ β−ガラクトシ
ダーゼ［東洋紡績（株）製、Aspergillus sp. 由来］を
含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．
７５ｍｌを加え、試験例１と同様に反応させ吸光度を測
定し、反応前後の吸光度の変化量を求めた。結果を第２
表に示す。１０Ｕ／ｍｌ β−ガラクトシダーゼを加え
ない場合（酵素なし）は、吸光度の変化は殆ど認められ
なかったので反応促進化合物の前駆体は、それ自体、酸
化反応を促進させないが、β−ガラクトシダーゼで加水
分解されて反応促進化合物となることがわかる。

【００７４】

【表２】

【００７５】試験例３ 反応促進化合物の前駆体として第３表に示す化合物を、
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液のかわりに、ピペラジン
−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパン）スル
ホン酸（以下、ＰＯＰＳＯと略す）緩衝液（ｐＨ８．
０）を、β−ガラクトシダーゼのかわりに、１０Ｕ／ｍ
ｌ γ−グルタミルトランスフェラーゼ［協和醗酵工業
（株）製、Bacillus subtilis由来］及び２０ｍＭグリ
シルグリシンを用いる以外は、試験例２と同様に試験し
た。結果を第３表に示す。１０Ｕ／ｍｌγ−グルタミル
トランスフェラーゼを加えない場合（酵素なし）は、吸
光度の変化は殆ど認められなかったので２，６−ジブロ
モ−４−（Ｎ−γ−グルタミル）アミノフェノールは、
それ自体、酸化反応を促進させないが、γ−グルタミル
トランスフェラーゼで分解されて反応促進化合物となる
ことがわかる。

【００７６】

【表３】

【００７７】試験例４ 第４表に示す化合物を、０．１Ｍ乳酸緩衝液（ｐＨ３．
５）及び０．１Ｍ ＰＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ８．０）に
５ｍＭとなるように溶解させ褐色の試薬瓶に移した。こ
の試薬瓶を３０℃の恒温槽中で保存し溶液の色を肉眼で
観察した。４−アミノ−２，６−ジブロモフェノールの
場合、溶解直後では無色透明であったが、保存期間が長
くなるに従い赤褐色を帯びてくることを認めた。一方、
４−アミノ−２，６−ジクロロフェノール−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドや２，６−ジブロモ−４−（Ｎ−γ−
グルタミル）アミノフェノールは１４日間無色透明であ
った。結果を第４表に示す。

【００７８】

【表４】

【００７９】試験例５ ０．１Ｍ乳酸緩衝液（ｐＨ３．５）のかわりに各種ｐＨ
の緩衝液２．２ｍｌ、反応促進化合物として、３．１ｍ
Ｍの４−アミノ−２，６−ジブロモフェノール０．０５
ｍｌ及びビリルビン検体として１５ｍｇ／ｄｌに調製し
た直接型ビリルビンであるジタウロビリルビン（Porphy
rin Products Inc. ）水溶液を用いる以外は試験例１と
同様に試験した。各種ｐＨの緩衝液としては、ｐＨ２．
５〜５．０はクエン酸緩衝液を、ｐＨ５．５〜７．０は
リン酸緩衝液を、ｐＨ７．５〜９．０はトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液を用いた。アス
コルビン酸オキシダーゼを含む１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ６．０）を上記の各ｐＨに添加した場合、
反応液のｐＨは殆ど変化しなかった。結果を第５表に示
す。直接型ビリルビンは測定した何れのｐＨでも同程度
の吸光度の変化を示した。

【００８０】

【表５】

【００８１】試験例６ ビリルビン検体として、国際試薬（株）の干渉チェック
・Ａ ビリルビン・Ｆ（以下、単に間接型ビリルビン試
薬という）を３０ｍｇ／ｄｌに調整したもの０．１ｍｌ
を用いる以外は、試験例５と同様に試験した［ＳＤＳ無
添加（−で示す）］。また、これとは別に０．１Ｍの各
種ｐＨの緩衝液にＳＤＳを０．１％となるように添加し
たものを用いた場合も試験した［ＳＤＳ添加（＋で示
す）］。結果を第６表に示す。ｐＨ４．０以下で、ＳＤ
Ｓ（−）の条件下では、間接型ビリルビンの吸光度の変
化は殆ど認められなかったが、ｐＨ４．５以上で吸光度
の変化が認められ間接型ビリルビンが酸化されたことが
わかる。ＳＤＳ（＋）の条件下では、ｐＨ７．０以上で
間接型ビリルビンが完全に酸化されたことを示した。

【００８２】

【表６】

【００８３】

【実施例】

【００８４】実施例１ 直接型ビリルビンとしてジタウロビリルビンを蒸留水で
希釈し、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１
８、２０ｍｇ／ｄｌのビリルビン検量線用標準液を調製
した。４−アミノ−２，６−ジブロモフェノール５４．
２μＭを含む０．１Ｍ乳酸緩衝液（ｐＨ３．７）２．８
ｍｌにビリルビン検量線用標準液を０．１ｍｌ加え、３
７℃で５分間予備加温した。次に、アスコルビン酸オキ
シダーゼ１５５０Ｕ／ｍｌを含む１０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ６．０）０．１ｍｌを加え、３７℃で５
分間反応させた。各濃度のビリルビンに対する反応前後
の吸光度の変化量を求めた。その結果、図１に示す検量
線が得られた。ビリルビン濃度と吸光度の変化量は原点
を通る直線上にプロットされ、直接型ビリルビンを定量
することができる。

【００８５】実施例２ 直接型ビリルビン試薬、間接型ビリルビン試薬及び直接
型ビリルビン試薬と間接型ビリルビン試薬を１：１に混
合して、それぞれ総ビリルビン濃度として、４、８、１
２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０ｍｇ／
ｄｌの検量線用標準液を調製した。

【００８６】５４．２μＭ ４−アミノ−２，６−ジブ
ロモフェノール及び０．１％ ＳＤＳを含む０．１Ｍ
ＰＯＰＳＯ緩衝液（ｐＨ８．０）２．８ｍｌに上記ビリ
ルビン検量線用標準液を０．１ｍｌ加え３７℃で５分間
予備加温した。次いで、アスコルビン酸オキシダーゼ１
５５０Ｕ／ｍｌを含む１０ｍＭ ＰＯＰＳＯ緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）０．１ｍｌを加え、３７℃で５分間反応させ
た。各濃度のビリルビンに対する反応前後の吸光度の変
化量を求めた。その結果、図２に示す検量線が得られ
た。直接型、間接型及び混合のいずれのビリルビンの場
合も、総ビリルビン濃度と吸光度の変化量は原点を通る
同一直線上にそれぞれプロットされ、しかも同一の傾き
を示した。従って、本方法ではビリルビンの型にかかわ
らずビリルビンを総ビリルビン濃度として定量すること
ができる。

【００８７】実施例３ 和光純薬工業（株）製直接型ビリルビン測定キット（直
接ビリルビンII−ＨＡテストワコー）により直接型ビリ
ルビン値２．９５ｍｇ／ｄｌ、和光純薬工業（株）製総
ビリルビン測定キット（総ビリルビンII−ＨＡテストワ
コー）により総ビリルビン値４．８５ｍｇ／ｄｌの血清
検体をサンプルに用いた。

【００８８】実施例１の方法で直接型ビリルビンの吸光
度の変化量を測定し、実施例２の方法で総ビリルビンの
吸光度の変化量を測定した。同様に、血清検体のかわり
に既知濃度のビリルビンを用いた場合の吸光度の変化量
を測定し、ビリルビンの濃度を式１より求めた。尚、実
施例１の方法で既知濃度のビリルビンとして直接型ビリ
ルビン試薬、実施例２の方法で既知濃度のビリルビンと
して直接型ビリルビン試薬と間接型ビリルビン試薬を
１：１に混合したものを用いた。結果を第７表に示す。

【００８９】

【数１】

【００９０】

【表７】

【００９１】実施例４ 実施例３で用いた血清サンプルを試験例２の方法で直接
型ビリルビンの吸光度の変化量を測定した。血清検体の
かわりに既知濃度のビリルビンを用い同様に吸光度の変
化量を測定し、ビリルビンの濃度を式１より求めた。な
お、既知濃度のビリルビンとして直接型ビリルビン試薬
を用いた。結果を第８表に示す。

【００９２】

【表８】

【００９３】実施例５ 実施例３で用いた血清サンプルを試験例３の方法で総ビ
リルビンの吸光度の変化量を測定した。血清検体のかわ
りに既知濃度のビリルビンを用いた場合の吸光度の変化
量を測定し、ビリルビンの濃度を式１より求めた。な
お、既知濃度のビリルビンとして直接型ビリルビン試薬
と間接型ビリルビン試薬を１：１に混合したものを用い
た。結果を第９表に示す。

【００９４】

【表９】

【００９５】実施例６ 直接型ビリルビン測定用として以下の試薬キットを調製
した。 第１試薬：０．３％ トリトン Ｘ−１００及び６９．
８７μＭ ４−アミノ−２，６−ジクロロフェノール−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む０．１Ｍ乳酸−クエ
ン酸三ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．７）。

【００９６】第２試薬：０．３％ トリトン Ｘ−１０
０、４００Ｕ／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ及び
１０Ｕ／ｍｌ β−ガラクトシダーゼを含む１０ｍＭの
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）。

【００９７】実施例７ 総ビリルビン測定用として以下の試薬キットを調製し
た。 第３試薬：０．５％ 硫酸ナトリウム、０．２５％ Ｓ
ＤＳ、０．２％ コール酸ナトリウム、２０ｍＭ グリ
シルグリシン及び７５．７５μＭ ２，６−ジブロモ−
４−（Ｎ−γ−グルタミル）アミノフェノールを含む２
０ｍＭ ＰＯＰＳＯ（ｐＨ８．０）緩衝液。

【００９８】第４試薬：２０ｍＭ グリシルグリシン、
１６０Ｕ／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ及び１Ｕ
／ｍｌ γ−グルタミルトランスフェラーゼを含む２０
ｍＭ ＰＯＰＳＯ（ｐＨ８．０）緩衝液。

【００９９】実施例８ 実施例６及び実施例７で作成した試薬を１０℃の冷暗所
中で第１０表に示す期間それぞれ保存した後、試験に供
した。

【０１００】第１試薬２．２ｍｌに正常ヒト血清サンプ
ル０．１ｍｌを加え５分間予備加温したのち、第２試薬
０．７５ｍｌを加えて更に５分間反応させ直接型ビリル
ビン濃度を測定した。同様に第３試薬２．２ｍｌに該正
常ヒト血清サンプル０．１ｍｌを加え５分間予備加温し
たのち、第４試薬０．７５ｍｌを加えて更に５分間反応
させ総ビリルビン濃度を測定した。血清サンプルのかわ
りに既知濃度の標準ビリルビンを用いた場合の吸光度の
変化を測定した。ビリルビン濃度は、式１により算出し
た。得られた結果を第１０表に示す。なお、用いた正常
ヒト血清は、和光純薬工業（株）製直接型ビリルビン測
定キット（直接ビリルビンII−ＨＡテストワコー）によ
り直接型ビリルビン値０．２４ｍｇ／ｄｌ、和光純薬工
業（株）製総ビリルビン測定キット（総ビリルビンII−
ＨＡテストワコー）により総ビリルビン値０．７４ｍｇ
／ｄｌであった。少なくとも、２８日間試薬を水溶液状
態で保存しても安定してビリルビンを測定することが可
能であった。

【０１０１】

【表１０】

【０１０２】

【発明の効果】本発明によれば、ビリルビンオキシダー
ゼよりも安定性の高い酵素アスコルビン酸オキシダーゼ
を用いてビリルビンを迅速にかつ正確に測定することが
できる。また、反応促進化合物の前駆体を用いることに
より、凍結乾燥品として供給されている酵素を用いたビ
リルビン定量試薬にかわり、使用直前に試薬調製の必要
のない液状化試薬として提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 直接型ビリルビンの検量線

【図２】 総ビリルビンの検量線

【符号の説明】

● 直接型ビリルビン ■ 間接型ビリルビン ○ 直接型及び間接型ビリルビン混合物（１：１）

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （Ａ）少なくとも２個の同一又は異なっ
   て、置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシで置換さ
   れている置換芳香族炭化水素、少なくとも２個の同一又
   は異なって、置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシ
   で置換されている置換芳香族複素環及び有機鉄化合物か
   らなる群より選ばれる反応促進化合物を選択すること、
   （Ｂ）水性媒体中、試料中のビリルビンをアスコルビン
   酸オキシダーゼ及び反応促進化合物と共存させ、それに
   よりビリルビンを酸化すること、（Ｃ）水性媒体の吸光
   度の変化を測定すること、及び（Ｄ）吸光度の変化を検
   量線と比較することからなる試料中のビリルビンの定量
   方法。
2. 【請求項２】 芳香族炭化水素が、ベンゼン、ナフタレ
   ン又はアントラセンである請求項１記載の定量方法。
3. 【請求項３】 芳香族複素環が、ピリジン、ピラジン、
   ピリダシン、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、
   キナゾリン、シンノリン、フタラジン又はナフチリジン
   である請求項１記載の定量方法。
4. 【請求項４】 置換アミノが、置換もしくは非置換アル
   キル置換アミノである請求項１記載の定量方法。
5. 【請求項５】 少なくとも２個の同一又は異なって、置
   換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシで置換されてい
   る置換芳香族炭化水素及び少なくとも２個の同一又は異
   なって、置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシで置
   換されている置換芳香族複素環が、さらに同一又は異な
   って置換数１〜４のハロゲン又は置換もしくは非置換ア
   ルキルで置換されている請求項１記載の定量方法。
6. 【請求項６】 有機鉄化合物が、ヘキサシアノ鉄、置換
   もしくは非置換のフェロセン又は鉄キレートである請求
   項１記載の定量方法。
7. 【請求項７】 反応促進化合物が、一般式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ¹ はヒドロキシ又は置換もしくは非置換アミ
   ノを表し、Ｒ² 及びＲ³は同一又は異なって水素、ハロ
   ゲン又は置換もしくは非置換のアルキルを表し、Ｒ⁴ 及
   びＲ⁵ は同一又は異なってハロゲン又は置換もしくは非
   置換のアルキルを表す）又は一般式（ＩＩ） 【化２】 （式中、置換基Ｒ⁶ 、Ｒ⁷ 、Ｒ⁸ 及びＲ⁹ は同一又は異
   なって、少なくとも２個の置換基は同一又は異なって置
   換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシを表し、残りの
   置換基は同一又は異なって水素、ハロゲン、ヒドロキ
   シ、置換もしくは非置換アミノ又は置換もしくは非置換
   アルキルを表し、ＪはＣＨ又はＮを表す）である請求項
   １記載の定量方法。
8. 【請求項８】 水性媒体が緩衝液である請求項１記載の
   定量方法。
9. 【請求項９】 ビリルビンが直接型ビリルビンであり、
   水性媒体がｐＨ２．０〜４．５の緩衝液である請求項１
   記載の定量方法。
10. 【請求項１０】 ビリルビンが総ビリルビンであり、水
    性媒体がｐＨ５．０〜１２．０の緩衝液である請求項１
    記載の定量方法。
11. 【請求項１１】 （Ａ）少なくとも一つの置換もしくは
    非置換アミノ又はヒドロキシ及び酵素的に切断される保
    護基で保護されている少なくとも一つの置換もしくは非
    置換アミノ又はヒドロキシで置換されている置換芳香族
    炭化水素並びに少なくとも一つの置換もしくは非置換ア
    ミノ又はヒドロキシ及び酵素的に切断される保護基で保
    護されている少なくとも一つの置換もしくは非置換アミ
    ノ又はヒドロキシで置換されている置換芳香族複素環か
    らなる群より選ばれる反応促進化合物の前駆体を選択す
    ること、（Ｂ）水性媒体中、試料中のビリルビンをアス
    コルビン酸オキシダーゼ、反応促進化合物の前駆体及び
    反応促進化合物の前駆体から保護基を切断する活性を有
    する酵素と共存させ、それによりビリルビンを酸化する
    こと、（Ｃ）水性媒体の吸光度の変化を測定すること、
    及び（Ｄ）吸光度の変化を検量線と比較することからな
    る試料中のビリルビンの定量方法。
12. 【請求項１２】 芳香族炭化水素が、ベンゼン、ナフタ
    レン又はアントラセンである請求項１１記載の定量方
    法。
13. 【請求項１３】 芳香族複素環が、ピリジン、ピラジ
    ン、ピリダシン、キノリン、イソキノリン、キノキサリ
    ン、キナゾリン、シンノリン、フタラジン又はナフチリ
    ジンである請求項１１記載の定量方法。
14. 【請求項１４】 置換アミノが、置換もしくは非置換ア
    ルキル置換アミノである請求項１１記載の定量方法。
15. 【請求項１５】 少なくとも一つの置換もしくは非置換
    アミノ又はヒドロキシ及び酵素的に切断される保護基で
    保護されている少なくとも一つの置換もしくは非置換ア
    ミノ又はヒドロキシで置換されている置換芳香族炭化水
    素並びに少なくとも一つの置換もしくは非置換アミノ又
    はヒドロキシ及び酵素的に切断される保護基で保護され
    ている少なくとも一つの置換もしくは非置換アミノ又は
    ヒドロキシで置換されている置換芳香族複素環が、さら
    に同一又は異なって置換数１〜４のハロゲン又は置換も
    しくは非置換アルキルで置換されている請求項１１記載
    の定量方法。
16. 【請求項１６】 反応促進化合物の前駆体が、一般式
    （ＩＩＩ） 【化３】 （式中、Ｒ² 及びＲ³ は同一又は異なって水素、ハロゲ
    ン又は置換もしくは非置換のアルキルを表し、Ｒ⁴ 及び
    Ｒ⁵ は同一又は異なってハロゲン又は置換もしくは非置
    換のアルキルを表し、Ｒ¹⁰は糖残基もしくはホスホを表
    す）又は一般式（ＩＶ） 【化４】 （式中、Ｒ² 及びＲ³ は同一又は異なって水素、ハロゲ
    ン、又は置換もしくは非置換のアルキルを表し、Ｒ⁴ は
    ハロゲン又は置換もしくは非置換のアルキルを表し、Ｒ
    ¹¹はアミノ酸残基を表す）である請求項１１記載の定量
    方法。
17. 【請求項１７】 酵素的に切断される保護基が、置換も
    しくは非置換アミノに対してアミノ酸残基であり、ヒド
    ロキシに対して糖残基、ホスホ又はスルホである請求項
    １１記載の定量方法。
18. 【請求項１８】 水性媒体が緩衝液である請求項１１記
    載の定量方法。
19. 【請求項１９】 ビリルビンが直接型ビリルビンであ
    り、水性媒体がｐＨ２．０〜４．５の緩衝液である請求
    項１１記載の定量方法。
20. 【請求項２０】 ビリルビンが総ビリルビンであり、水
    性媒体がｐＨ５．０〜１２．０の緩衝液である請求項１
    １記載の定量方法。
21. 【請求項２１】 アスコルビン酸オキシダーゼ及び少な
    くとも２個の同一又は異なって、置換もしくは非置換ア
    ミノ又はヒドロキシで置換されている置換芳香族炭化水
    素、少なくとも２個の同一又は異なって、置換もしくは
    非置換アミノ又はヒドロキシで置換されている置換芳香
    族複素環及び有機鉄化合物からなる群より選ばれる反応
    促進化合物からなるビリルビン定量用試薬。
22. 【請求項２２】 アスコルビン酸オキシダーゼを含む試
    薬及び少なくとも２個の同一又は異なって、置換もしく
    は非置換アミノ又はヒドロキシで置換されている置換芳
    香族炭化水素、少なくとも２個の同一又は異なって、置
    換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシで置換されてい
    る置換芳香族複素環及び有機鉄化合物からなる群より選
    ばれる反応促進化合物を含む試薬からなるビリルビン定
    量用キット。
23. 【請求項２３】 アスコルビン酸オキシダーゼ、少なく
    とも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシ及
    び酵素的に切断される保護基で保護されている少なくと
    も一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシで置
    換されている置換芳香族炭化水素並びに少なくとも一つ
    の置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシ及び酵素的
    に切断される保護基で保護されている少なくとも一つの
    置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシで置換されて
    いる置換芳香族複素環からなる群より選ばれる反応促進
    化合物の前駆体及び反応促進化合物の前駆体から保護基
    を切断する活性を有する酵素からなるビリルビン定量用
    試薬。
24. 【請求項２４】 アスコルビン酸オキシダーゼを含む試
    薬、少なくとも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒ
    ドロキシ及び酵素的に切断される保護基で保護されてい
    る少なくとも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒド
    ロキシで置換されている置換芳香族炭化水素並びに少な
    くとも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシ
    及び酵素的に切断される保護基で保護されている少なく
    とも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシで
    置換されている置換芳香族複素環からなる群より選ばれ
    る反応促進化合物の前駆体を含む試薬及び反応促進化合
    物の前駆体から保護基を切断する活性を有する酵素を含
    む試薬からなるビリルビン定量用キット。
25. 【請求項２５】 アスコルビン酸オキシダーゼ及び少な
    くとも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシ
    及び酵素的に切断される保護基で保護されている少なく
    とも一つの置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシで
    置換されている置換芳香族炭化水素並びに少なくとも一
    つの置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシ及び酵素
    的に切断される保護基で保護されている少なくとも一つ
    の置換もしくは非置換アミノ又はヒドロキシで置換され
    ている置換芳香族複素環からなる群より選ばれる反応促
    進化合物の前駆体を含む試薬及び反応促進化合物の前駆
    体から保護基を切断する活性を有する酵素を含む試薬か
    らなるビリルビン定量用キット。
26. 【請求項２６】 少なくとも一つの置換もしくは非置換
    アミノ又はヒドロキシ及び酵素的に切断される保護基で
    保護されている少なくとも一つの置換もしくは非置換ア
    ミノ又はヒドロキシで置換されている置換芳香族炭化水
    素並びに少なくとも一つの置換もしくは非置換アミノ又
    はヒドロキシ及び酵素的に切断される保護基で保護され
    ている少なくとも一つの置換もしくは非置換アミノ又は
    ヒドロキシで置換されている置換芳香族複素環からなる
    群より選ばれる反応促進化合物の前駆体を含む試薬及び
    アスコルビン酸オキシダーゼ及び反応促進化合物の前駆
    体から保護基を切断する活性を有する酵素を含む試薬か
    らなるビリルビン定量用キット。