WO1992018537A1

WO1992018537A1 - Composition a base d'interleukine 6 et procede de production

Info

Publication number: WO1992018537A1
Application number: PCT/JP1992/000487
Authority: WO
Inventors: Shingou Sakurai; Masanobu Naruto; Makoto Kihara; Keizo Hanada; Emiko Sano; Shigeru Ichikura; Jun Utsumi; Kazuo Hosoi
Original assignee: Toray Industries, Inc.
Priority date: 1991-04-18
Filing date: 1992-04-17
Publication date: 1992-10-29
Also published as: DE69232259T2; EP0550756B1; TW221379B; EP0550756A4; DE69232259D1; AU1554592A; FI925745A; ES2164050T3; ATE210150T1; KR930700550A; EP0550756A1; FI925745A0; CA2085744A1

Description

明細書

インターロイキン 6組成物およびその製造法

技術分野

本発明は、インターロイキン 6 (以下 I L一 6と略す）組成物およびその製造法に関する。さらに詳しくは、医薬としての有用な糖鎖を有するヒト I L— 6組成物、およびそれを高品位でかつ大量に生産する製造法に関する。

背景技術

I L— 6は、 B リンパ球分化因子、インタ一フヱロン β ₂ 、 2 6 K d蛋白、ハイプリドーマプラズマサイト一マ増殖因子、あるいは肝細胞刺激因子などとよばれていたサイトカインの統一名である。

I L一 6は、活性化された B細胞に対し、抗体産生細胞への分化を誘導する。 T細胞に対しては、マイトジュン刺激を受けた T細胞に I L一 2産生を誘導したり、ある種の T細胞株や胸腺細胞に I L— 2 レセプターを誘導する。造血細胞に対しては I L— 3存在下で I L一 6力く造血幹細胞の増殖を相乗的に誘導する。また、最近、 I L— 6はトロンボポェチン様の作用を有していること力く報告されている。この様に I L— 6は、多くの生理活性を有しており、臨床への応用が期待されている。

I L— 6は様々な細胞によって産生される。リンパ球のほかにヒト線維芽細胞を Po (I) ' Poly (C) とシクロへキシミドを刺激することで産生される（Eur. J. Bioche m. , 159 , 625, ( 1986 ) ) 。また、マウスの I L— 6は Ρο -- ly (A) · Po 1 y (ϋ) で刺激して産生される（ 1 mmu n o p lu rma cology, 21, p 33, (1991) ) 。誘導物質は多岐にわたり I L - 1 , T N F， I F N— Sなどのサイト力インや P D G F， T G F— などの増殖因子， L P S , P MA, P 5 H A, コレラ毒素などが知られている (Science, 235 , 7

31 (1987)) 。また、ヒト血管内皮細胞、マクロファージ、ヒトグリオブラスト一マなども I L一 6を産生することが報告されている（Immunol. , U 2, 144, (1989) , J. Iimuno 1. , l , 1529, (1988), 特開昭 6 3 — 2 9 6 6 8 8 ) ) 。 ίδ また、誘発剤を用いて細胞を刺激した後、ベラパミル、シクロへキシミド、ァクチノマイシン Dなどの代謝阻害剤で細胞を処理することにより産生を一層増強せしめる方法（J, Immunol. , 144 , 4242 -4248 (1990)) も知られる。しかしながら、 I L— 6についてその産生細胞の種類や 5 誘導物質などの違いによる活性、構造等の違いは未知である。少なくとも I L— 6を医薬として有効活用していく際には、大量生産系の開発と生産された I L 一 6の物質的性状およびその生物的活性の解明が必要とされるが、臨床応用に適用できる高品位の糖鎖付き I L一 6を効率0 的に大量生産する方法は現在のところまだ確立されていない。

また、従来から知られている I L— 6の精製法には、まず初段に C P G (control led pore glass ) にバッチ吸着させ酸で回収した後、ポリクローナル抗体カラム Z5 ゲルろ過クロマトグラフィーノイオン交換クロマトダラフィー Z C 1 カラムを利用した逆相高速液体クロマトグラフィ一と組み合わせて精製する方法（Eur. J. Bioche m. 168, 543 ( 1987)〕、あるいは、膜濃縮 Zゲルろ過クロマトグラフィ一透析イオン交換クロマトグラフィ一 / F P L C Z逆相高速液体クロマトグラフィー（H P L C) の組み合わせ（Proc. Nat 1. Acad. Sc i. USA. , 8 2_, 5490 ( 1985 ) ) による方法がある。大腸菌由来の遺伝子組換え I L一 6は、尿素処理/透析ゾ塩酸グアジ二ン処理/ ゲルろ過クロマトグラフィ一ィォン交換ク口マトグラフィ一の組み合わせで精製されている（東ソ一研究報告第 3 2巻第 2号（ 1 9 8 8 ) ) 。また、大腸菌で生産したヒト B C D Fは、化学結合型（ C ₈ ) シリカゲルを充填剤とする 2段階逆相 H P L Cに供し、タンパク純度を 9 9 %以上、エンドトキシンを 0. 6 Εϋ Zmg蛋白以下に精製する方法がある（特開平 2 — 1 8 6 9 9 6 ) 。しかし、これら従来の精製法では繁雑で工業的生産時の大量処理には適していないほか、逆相 H P L

Cの条件では夕ンパク質に対して温和な条件ではなく、夕ンパク質の変性や会合体の形成などが起こりやすく、高品位の I L — 6標品を得るには必ずしも適当な方法ではない。

以上述べてきたように、医薬として I L — 6を産業上利用するには高品位な大量標品の調製、およびその標の性状解明が課題として残っている。本発明はこれを解決し、高品位な糖鎖を有する I L一 6組成物を工業的に安定に生産し、提供しょうとするものである。

発明の開示

本発明は、糖鎮を有し、一定の規定された性状を有するヒト I L— 6組成物と、それをより効果的に得るベく、ヒト I L一 6の製造法を提供するものであり、具体的には、ヒト I L一 6産生細胞を培養しヒト I L一 6を産生させる際に、培地中にァスコルビン酸またはその誘導体を添加することを特徴とするヒト I L一 6の製造法、および粗 I L— 6原液をへパリンを結合させた担体（以後、へパリン担体とよぶ）を用いたクロマトグラフィーにより精製することを特徴とするヒト I L— 6の製造法を提供する。

発明を実施するための最良の形態

本発明のヒト I L— 6組成物は、糖鎖を有するいわゆる天然型のヒト I L一 6を含み、それは（1) S D S— P A G Eで少なくとも分子量が 22 0 0 0〜 2 5 0 0 0および 2 6 0 0 0〜 3 0 0 0 0の 2成分を含み、その含有量がそれぞれ 6 0〜 9 0 %および 4 0〜 1 0 %であること、（2) 末端アミノ酸配列が少なくとも、 P r o—V a I 一 P r o— P r o— G i y―、 V a l — P r o— P r o - G 1 y - G 1 u—および A l a— P r o—V a 1 — P r o - P r o—から成る 3種類の配列を含み、かつ V a l - P r o - P r o - G l y - G l u一の含有量が 4 0 %以上（好ましくは 5 0 %以上）である、（3) 構成糖として、マンノース、フコース、ガラクト一ス、 N—ァセチルダルコサミン、 N —ァセチルガラクトサミン、および N —ァセチルノイラミン酸を含むこと、で特徴づけられる性状を示す。

これらの性状は I L 一 6の本来の生理活性を十分に発揮するにふさわしい高品位な特性を示し、生体内で安定性が良くかつ抗原性が非常に低いことが期待される。このようなヒト I L— 6組成物は、以下に述べるような大量培養法と大量精製法により、工業的生産が可能である。

I L— 6はさまざまな細胞により恒常的に、あるいは種々の刺激により産生される。また、遺伝子組換え細胞によつても産生される。

糖鎖付 I L 一 6は、 T細胞、 B細胞、単球マクロファージに代表される浮遊細胞と、線維芽細胞、骨肉腫細胞、肺癌細胞、血管内皮細胞に代表される接着依存性細胞株により産生されるが、本発明の I L — 6産生細胞としては接着依存性細胞が好ましく用いられる。特に、線維芽細胞が好ましく用いられる。

また、本発明の I L— 6産生細胞としては、遺伝子組換え C H 0細胞に代表される遺伝子組換え細胞も用いることができる。遺伝子組換え細胞にも、宿主細胞の種類により浮遊細胞と接着依存性細胞があるが、本発明は接着依存性細胞が好ましく用いられる。

本発明によれば、 I L 一 6産生細胞を培養して高品位な糖鎖付 I L 一 6を高収率で生産できる。本発明は、浮遊細胞もしくは接着依存性細胞を培養し、誘発剤を用いないで恒常的に I L一 6を産生させるか、あるいは各種 I L - 6の誘発剤で産生剌激し I L一 6を産生する際、もしくは遺伝子組換え細胞により I L一 6を産生する際、培地中にァスコルビン酸、またはァスコルビン酸誘導体を添加し、その産生を増強することを特徴とする I L一 6の産生方法である。

接着依存性細胞を培養する方法としては、ルー瓶、口一ラー瓶を用いる方法、マイクロキヤリヤーもしくは中空糸に接着培養する方法、あるいはマイクロカプセルに固定化培養する方法などがあるが、マイクロキヤリヤー、中空糸またはマイクロ力プセルを用いる方法が好ましく用いりれる。

マイクロキャリア一としては、マトリックス素材はコラーゲン、ゼラチン、セルロース、架橋デキストラン、ポリスチレンのような合成樹脂からなり、ジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノエチル、トリメチルハイド口キシァミノプロピルなどの荷電基が付加されているものが好ましく用いられる。また、マトリックス素材をコラーゲンやゼラチンでコートしたものも使用される。巿販品として、架橋デキストランにジメチルアミノエチルを付加した " C y t o d e x— 1 " (フアルマシア製）、架橋デキストランに変性コラーゲンをコートした "C y t 0 d e X - 3 " (フアルマシア製）がある。中空糸としては、修飾セルロースを使用した物がある。市販品は、 "V i t a f i b e r " (アミコン製）がある。マイク口カプセルは、水透過性のあゲルを形成するコラーゲンゃアルギン酸ソーダを用いて、内部に細胞を包埋して作成する（ B i o Z t e c h n o し，丄， 7 3 6 ( 1 9 8 3 ) o

I L - 6産生細胞を誘発剤で処理し I L一 6を産生させる方法としては、天然型もしくは合成 R N A等の誘発剤、もしくは I L— 1、 T N F、 I F N— ^などのサイトカイン、もしくは P D G F、 T G F— 等の増殖因子、もしくは P MA、 P H A、リポポリサッカライドゃコレラ毒素などを用いて誘発させる方法がある（ S c i e n c e， 2 3 5 , 7 3 1 ( 1 9 8 7 ) ) 。これらのうち合成 R N Aである Po （1) « Poly (C) を使用するのが好ましい。また、誘発剤を用いて細胞を刺激した後、ベラパミル、シクロへキシミド、ァクチノマイシン Dなどの代謝阻害剤で細胞を処理することにより産生を一層増強せしめる方法（ J . I mm u n o l . , 1 4 4 , 4 2 4 2 - 4 2 4 8 ( 1 9 9 0 ) ) も用いられる。

本発明は I L— 6律生細胞培養中において、培地中にァスコルビン酸もしくはその誘導体を添加することを特徵とする。ァスコルビン酸もしくはその誘導体を添加する時期は特に限定されないが、誘発剤を用いて I L _ 6 を産生させる場台は、 I L— 6産生細胞を増殖させた後、誘発剤で刺激して I L一 6を産生させる時、すなわち I L— 6産生培地中に添加することが好ましい。ァスコルビン酸もしくはその誘導体は、好ましくは 0. 0 5〜丄 O mM、特に好ましくは、 0. 5〜3 mM添加する。培養に用いるァスコルビン酸としては、培養条件下で安定かつァスコルビン酸作用をもつ誘導体であることが好ましい。ァスコルビン酸誘導体としては、 L—ァスコルビン酸リン酸エステル（畑ら、 1 9 8 8 第 3 5回コラーゲン研究会抄録 p 8 5〜8 9) や、 L—ァスコルビン酸ダルコシドが好ましい。

本発明で用いる培地は通常の市販のものが使用できるが、これら市販培地を修飾した培地も含めて細胞に適した培地を適宜選択することが好ましい。例えば、ィーグル MEM、 R PM I 1 6 4 0、 α— MEMやこれらの修飾培地が好ましく用いられる。また、培養液中の溶存酸素濃度及び p Hは、細胞に適した範囲内で制御することが好ましく、溶存酸素濃度は通常、空気に対する飽和溶解度の 2 0〜8 0 %、好ましくは 4 0〜6 5 %の範囲に保つことが好ましい。同様に p Hは 7. 0〜8. 0の範囲に制御することが好ましい。

また、糖鎖を有する I L— 6を産生させるためには、培地中の糖を欠乏させないように糖を追加して添加することが好ましい。糖としては一般的にはグルコース、麦芽糖などが用いられる。特に I L一 6産生培地中の糖が欠乏しないように 1 日 1回〜数回添加するか、もしくは連続添加するなどの操作が好ましい。たとえばダルコ一スでは、培地中の濃度が 0. 1〜2. 5 gZL、好ましくは 0. 2〜1. 5 gZLの濃度に維持することが好ましい。

これら産生した原液中のヒト I L— 6 は、後述する酵素免疫測定法（E L I S A法）および H P G F (hybrid oma/plasmacytome growth f actor) 活性測定などで確認することができる。

このようにして得られる I L一 6原液をへパリン担体に接触させる場合には、あらかじめ公知の方法 U. Exp . Med. , 165, 914 ( 1987 ), The Biology o f the i nt e r f e ron System 1988, p. 395 など）にしたがって、粗 I L 一 6をシリカ系吸着剤（以下シリカ担体と略す）などを用いて前濃縮しておくことが好ましい。シリ力担体としては、好ましくは " C P G" (control led pore glass) やシリカビーズなどが用いられる。具体的には "C P G" (シグマ製）や "マイクロビーズシリカゲル" （富士デビソン製）などが挙げられる。前濃縮した I L一 6液は引き続き陽ィォン交換体に素通りさせることで夾雑物を吸着除去し、さらに精製純度を上げることもできる。ここでいう陽ィォン交換体とは骨格担体としてセルロース、ァガロースなどを材料とする多糖類系および合成高分子系などの不溶性担体にカルボキシル基や、スルホン酸基あるいはリン酸基などを結合した担体である。具体的には " Sセファロース F F " (フアルマシア製）や " C M セファロ—ス C L— 6 B " (フアルマシア製）などが挙げられる。

本発明で用いるへパリン担体とは、骨格担体としてセルロース、ァガロースなどを材料とする多糖類系および合成高分子系などの不溶性担体にへパリンを結合させたものならばいずれでもよい。具体的には "へパリントヨノヽ⁰—ル" （東ソ—製）や "へノ、⁰リンセル口ファイン" (チッソ製）が挙げられる。

粗 I L一 6液をへパリン担体に接触させる場合、 Ρ Η を 5 〜 1 0に調節することが望ましい。特に好ましくは、へパリンに対する親和性を十分に確保できる ρ Η 5 . 5 〜 8 . 0の範囲でイオン強度 0 . 3以下がよい。このようにへパリン担体に吸着させた I L一 6は、イオン強度を高くすることで回収することができる。例えば、リン酸ナトリゥム緩衝液などの緩衝液に塩化ナトリウム、硫酸アンモニゥムなどの無機塩を添加した液により回収することができる。回収方法は、塩濃度をダラジェント式に増加させる方法でも段階的に増加させるステツプワイズ式でもよい。具体的に用いられるイオン強度は 0 . 3 〜 2で好ましくは 0 . 3 〜 1である。

さらに、純度を向上させるには疎水性基を結合した担体（以下、疎水性担体と略す）を用いることが有用である。上記へパリン担体で処理した I L - 6液に塩を添加したり、あるいは酸性条件にすることで疎水性担体に効率よく I L一 6を吸着させることができる。吸着方法はカラム法でもバッチ法でもよい。

ここに用いる疎水性担体は、アルキル基（ C j 〜 c _{1 0} ) 、フニル基、ォクチル基などが担体骨格に化学的に結合されたものならばいずれでもよいが、フユニル基ゃブチル基を有するものが特に望ましい。骨格担体としては、セルロース、ァガロースなどを材料とする多糖類系および合成高分子系などの不溶性担体を用いることができる。具体的に使用可能な疎水性担体としては "プチルトョパ —ル" （東ソ一製）や "フヱニルセル口ファイン" （チッソ製）などが挙げられる。吸着は N a ₂ S 0 4 、 K ₂ S 0 4 、 N H ₄ C 1 、 K C 1 、 N a C 1 などの塩を高濃度に添加して行うが、好ましい吸着条件は、 N a C 1 でいうならば 0 . 2 M〜 5 M、または p Hが 2〜 7 . 5であり、その両方を組み合わせた条件とするのも可能である。吸着させた疎水性担体は、常法にしたがってグラジェント方式またはステツプ的に塩濃度を下げて目的夕ンパク質を溶出させることができる。また、塩濃度をさげるほかに p Hや温度を適宜変えても有効な場合がある。本疎水性ク口マトグラフィーによれば、例えば p H 5〜 9で塩濃度を下げることにより I L— 6 は効率よく溶出され、他の夾雑タンパク質と分離することができる。また、夾雑タンパク質の除去のために I L 一 6の溶出を伴なわない各種溶液を用いてあらかじめ洗浄することも可能である。例えば、吸着イオン強度をやや下げた中性緩衝液ゃ p H 2付近の塩濃度の著しく低い酸性溶液は効率よく夾雑タンパク質を餘去することができる。

疎水性担体を用いる場合は、へパリン担体と疎水性担体の使用する順序はどちらでも構わないが、溶液の組成リン担体を使用した後に、疎水性担体を使用するのが好ましい。

以上のようにへパリン担体を用いる精製法で得られた I L— 6標品は、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いた分析では純度 9 5 %以上であつた。

また、本発明に記載した精製法は動物細胞によって産生される I L— 6のみならず大腸菌、酵母あるいは昆虫細胞等を宿主として組換えられた細胞により得られるヒト I L— 6の精製にも適用されるものである。

また、本発明で得られたヒト I L— 6組成物を製剤化するにあたっては、ヒト血清アルブミンや適当な界面活性剤や糖などを安定化剤として用いることが好ましい。また、適当な糖やアミノ酸などを賦形剤として添加して凍結乾燥製剤とすることができる。あるいは、溶液を無菌濾過後、注射剤とすることができる。さらに医薬用途の基剤と共に、軟膏、ざ剤、錠剤等への処方も可能である o

本発明にかかるヒト I L一 6の定量は、中和活性を有するモノクロ一ナノレ &L体 ( B i 0 c em. B i ophy s. Res. Com mum. , _ 728 - 734 (1989) ) を使った E L I S Aや、ヒト B C D Fに反応して I g Mを産生するヒト B細胞株 C L 4 (Proc. Na 11. Acad. Sci. , 82, 5490 (1985) ) 、あるいは I L一 6依存性に増殖するマウスハイプリドーマ株細胞 7 T D I ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 83 , 9678 - 9683 (1986) ) などを用いることで達成される。 ,

実施例

以下に、実施例にしたがつて本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明が限定されるものではない。実施例 1

2 リットルのガラス製培養槽に 1 リットルの 5 %の新生子牛血清を含むイーグル Μ Ε Μ培地中で、細胞数が 1 0⁰ 個 Zmlになるようにヒト線維芽細胞をマイクロキヤリア上で培養した〔マイクロキャリア： "サイトデックス 1 " (フアルマシア製）、 3 7°C〕。その後、培地を少量のカルボキシメチルセルロースを含む無血清ィ一グル MEM培地 1 リットルに交換し、プライミングとして 1 0万単位/リットルのヒト天然型インタ一フヱロン一 β ( I F N— /3) を添加した。翌日、さらに Poly (I) · Poly (C) 1 0 mg/ リットルを添加して誘発処理を行なつた。その 2時間後、産生培地として少量のメチルセル口ースを含むイーグル MEM培地に置換した。その後 6 曰間そのまま 3 7 °Cで培養を続けた。

撹拌を停止し、マイクロキャリアを沈降させた後、上清および産生培地での洗液ろ過し、 1 リツトルを別の容器に移した。シリカ担体〔 "マイクロビーズシリカゲル" (富士デビソン製）〕は、リン酸ナトリウム緩衝液中で高圧蒸気滅菌（ 1 2 1 °C、 3 0分）した後、 4mlずつ 2 本のカラムに充填して直列に接続させた。これにフィルターでろ過した後の産生液を流速 2 OmlZhrで流した。全量流した後、 2本のカラムを別々にクロマトグラフィ一した。それぞれリン酸ナトリウム緩衝液 2 5mlを流した後、 2 0 mM塩酸を流してヒト I L— 6含有画分 1 0 ml を回収した。この塩酸回収液に、さらに 0. 3 Mリン酸水素 2ナトリゥム水溶液を添加して P Hを 6. 4に調節した。このとき生成する沈殿物を 3 0 0 0 rpm 、 4°C、

3 0分遠心分離し、除去した。

分離した上清をそれぞれそのままへパリンクロマトグラフィ一担体である " A F—へパリントヨパール 6 5 0 M" 1 mi ( 東ソ一製）を充填したカラムに流し、吸着させた。このカラムを 1 0 mMリン酸ナトリウム緩衝液 p H 6. 4で洗浄した後、 0. 3M N a C 1を含む 2 0 mMリン酸ナトリゥム緩衝液（p H 7, 2 ) で回収し、 2nilのヒト I L— 6を含む画分を得た。この時点でそれぞれをプールした。さらに、この画分に 4Μ塩化ナトリウムを添加し、全体の塩濃度が 2. 1 5 Mになるように調整した。つづいて、この画分を 1mlの "ブチルトヨパール 6 5 0 M" (東ソ一製）を充填したカラムに流し、吸着させた。吸着時の温度は 2 3 °Cであった。この後、 2M N a C 1を含む緩衝液（p H 7. 2) 、 2M N a C lを含む 2 0mM H C 1 (p H 1. 8) 、 2 0raM H C 1 (p H I. 8) 、 0. 5M リン酸ナトリゥム緩衝液（ p H 5. 8) 、 0. 0 5M リン酸ナトリゥム緩衝液（p H 5, 8) で順次洗浄し、最後に 5 OmMリン酸ナトリゥム緩衝液 ( H 7. 2 ) で回収した。このようにして得られた精製ヒト I L— 6の蛋白質純度は 9 5 %以上（ C _{ί 8}逆相高速液体クロマトグラフィ一による評価）で、産生原液に対する収率は 3 0 %であった。

なお、ヒト I L— 6の濃度の定量は、 9 6穴プレートを用いた E L I S A法を使った。すなわち、抗 I L— 6 モノクローナル抗体を 1 μ g/mlの濃度でプレートにコートした。ゥシ血清アルブミン（ B S A ) を含むリン酸ナトリウム緩衝液（p H 7. 0、洗浄バッファー）でブロッキングした後、二次抗体としてャギの抗 I L— 6抗体をピオチン標識したものを 1 0 〃 gZmk 5 0〃 1 をまずプレートにのせ、さらに濃度既知の I L一 6標準品と未知濃度の I L— 6液を、それぞれ 1 0 0 1加え、 1時間振盪しながら反応させた。洗浄バッファーで 3回洗浄した後、洗浄バッファーで 2 0 0 0倍希釈した "ストレブトアビジン一 HR Pコンジュゲート " （B R L製）を 1 0 0 1添加し、 3 0分反応させた。洗浄バッファ —で 3回洗浄した後、オルトフエ二レンジアミンと過酸化水素を含むクェン酸緩衝液（p H 5. 0) を 1 0 0 i添加し発色反応させた。 3 0分後、 4. 5 N硫酸で反応停止し、各ゥエルの発色量をマイクロプレート用光度計（ "マルチスキャン CM" ：フローラボラトリー製）を用い、 4 9 2〜 6 9 0 nmで測定した。

実施例 2

実施例 1に述べた条件で 3ロットのヒト I L一 6精製標品を調製した。この精製標品（約 5 g) について還元条件下の S D S— P A G E (5— 2 0 %グラジェントゲル）を行った。泳動後のゲルをク一マシープリリアント · ブルーで染色したところ、分子量 2 2 0 0 0〜 2 5

0 0 0および 2 6 0 0 0〜 3 0 0 0 0の 2つのバンド力主成分として検出された。それぞれのバンドの存在比はクロマト . スキャナーで定量したところ、それぞれ 7 5

± 1 5 %および 2 5 ± 1 5 %であった。

また、各精製標品約 1 0 gをもちいて N末端ァミノ酸配列分析を行ったところ、いずれのロッ卜からも V a

1 一 P r o— P r o— G l y— G l u—が主成分として検出された。さらに少なくとも P r o— V a l — P r o

— P r o— G l y—と A l a - P r o -V a 1 一 P r o 一 P r o—の 2成分が副成分として含まれていた。

さらに各精製標品約 3 0 β gを用いて糖組成分析を行つたところ、いずれのロットからも、構成単糖としてマンノース、フコース、ガラクトース、ダルコサミン、ガラクトサミン、および N—ァセチルノイラミン酸が検出された。存在量はタンパク質 1モルあたり、フコースで 0. 2モル以上、その他の単糖で 0. 5モル以上が含まれていた。

実施例 3

胎児牛血清 5 %およびジェチルァミノェチル基を有する架橋デキストランマイクロキヤリア 3 gZLを含むィ一ダル MEM系培地 2 Lにヒト線維芽細胞を約 2 X 1 0 °個 Zm 1 の割合で接種したスピナ一フラスコでゆるく撹拌しながら 3 7 °C、 p H 7. 2、 2 0 %飽和酸素濃度で 6 日間培養した。途中、 1 日目、 3 日目、 5 日目に培地交換を行った。到達細胞数は、 3. 2 1 0 ⁶個 m l であった。次に、 I F N— /3 1 0 0国際単位 Zm 1、カルボキシルメチルセルロースを含む、イーグル M E M 培地と交換し、 3 7 °C、 p H 7. 2、 2 0 %飽和酸素濃度で 2 4時間インキュベートした。次に、 Po （1) · Po ly (C) を l O /z g Zm l加え 3 7 °Cで 2時間インキュべートした後、イーグル M E M系培地で培地交換し、 L 一ァスコルビン酸リン酸エステルを 1. O mM添加し、さらに 3 7 °C、 p H 7. 2、 2 0 %飽和酸素濃度で 6 日間培養した。最終的に産生されたインターロイキン 6の量は酵素免疫測定法で測定した。結果は、 L 一ァスコルビン酸リン酸エステル無添加としたものの相対力価を 1 0 0 とすると、 1. 0 mM添加した場合の相対力価は、 1 2 0であった。

実施例 4

実施例 3 と同様にヒト線維芽細胞を培養し、 1 6 リツトルタンク中で 1. 7 X 1 0⁶ 個 mlの細胞を得た。次に培地を I F N— 1 0 0 I U Zinlとカルボキシメチルセルロース 0. 2 %を含むイーグル M E M培地に交換し、 3 7 °C、 p H 7. 2、 2 0 %飽和酸素濃度で 2 4時間インキュベートした。次に、 Poly (1) - Poiy (C) を 1 0 β g / 1 加え 3 7 °Cで 2時間インキュべ一トした後、イーグル M E M系培地で培地交換した。その後、ダルコ —ス 1 g Z L とァスコルビン酸リン酸エステル M g塩 0. 4 mMを含む培地に置換し、 6日間通気培養した。この間 1、 2日目に l gZL, 3、 4日目に 0. 5 gZ'Lのダルコースを追加添加した。上記培養タンク 2基分の産生液を実施例 1 と同様にシリ力担体 24 0 m i にカラム吸着させた。吸着済み担体を 1 M N a C l液、リン酸ナトリウム緩衝液でそれぞれ約 1 L洗浄後、 2 0 mM塩酸水溶液 Ί 0 0 m lで I L— 6を回収した。回収後直ちに、 0. 1 Mリン酸 3ナトリウムで P H 7. 0に中和した。この液を "S Pセファロ一ス F F" (フアルマシア製） 6 m 1 に素通りさせた。この後、実施例 1 と同様に

"へパリントヨノ、。—ル 6 5 0 M" 5 0 m l に吸着させ、 1 0 mMリン酸ナトリゥム緩衝液（ p H 6. 4) で洗浄し、 0. 3 MN a C Iを含む 2 0 mMリン酸ナトリウム緩衝液で I L一 6を含む画分 1 0 0 m 1を得た。これに最終濃度が 3 Mになるように N a C 1を添加し、 "フエニルセル口ファイン S" (チッソ製） 7 O m l にカラム吸着させた。吸着時の温度は 3 0 °Cであった。このカラムは順次、 3 MN a C l液、 2 0 mM塩酸溶液、リン酸ナトリゥム緩衝液（P H 5. 8) で洗浄し、最後に 1 0 mMリン酸ナトリウム緩衝液（p H 7. 2) で I L— 6 液 1 2 1 m lを回収した。この液の I L一 6の純度は 9 8 % (逆栢高速液体ク口マトグラフィ —）で産生原液に対する収率は 5 7 %であつた。

実施例 5

実施例 4に述べた条件で 4ロットのヒト I L一 6精製標品'を調製した。これらの精製標品について S D S— P A G Eによる分子量分布測定、 N末端アミノ酸配列分析および糖組成分析を実施例 2に準じて行ったところ、いずれの分析でも実施例 2に示した結果と同じ結果が得られた。また、各ロッ卜の V a 1 — P r o— P r o— G 1 y - G 1 u—の含有量はそれぞれ 5 8 %、 7 9 %. 7 8 %および 7 0 %であった。

実施例 6

胎児牛血清 5 %およびジェチルァミノェチル基を有する架橋デキストランマイクロキヤリア 3 gZLを含むィ一ダル M E M系培地 2 Lにヒト線維芽細胞を約 2 X 1 0 ⁵個 Zm 1 の割合で接種したスピナ一フラスコでゆるく撹拌しながら 3 7°C、 p H 7. 2、 2 0 %飽和酸素濃度で 6日間培養した。途中、 1 日目、 3日目、 5日目に培地交換を行った。到達細胞数は、 3. 2 1 0 ⁶個 m lであった。次に、 I F N— ;S 1 0 0国際単位 Zm 1、カルボキシルメチルセルロースを含む、イーグル M E M 培地と交換し、 3 7で、 p H 7. 2、 2 0 %飽和酸素濃度で 2 4時間インキュベートした。次に、 Poly (1) . Po iy (0 を 1 0 g m l加え 3 7°Cで 2時間インキュべ — トした後、イーグル M E M系培地で培地交換し、 L一ァスコルビン酸リン酸エステルを 1. 0 m M添加し、さらに 3 7 °C、 p H 7. 2、 2 0 %飽和酸素濃度で 6 日間培養した。この間、 1 日後、 2 日後にそれぞれ 2 g、 3 日後、 4日後にそれぞれ 1 gのグルコースを添加した。 6日後に、最終的に産生された I L一 6の量を酵素免疫測定法で測定した。結果は、 L—ァスコルビン酸リン酸エステルのみを添加としたものの相対力価を 1 0 0とすると、 1 2 5であった。

実施例 7

既知文献〔Nature, JH^ Π (1986)〕と同じ遺伝子配列を持つヒト I L一 6 c DN Aを骨格とする I L— 6発現ベクターを、下記の方法で合成した c D N A混合物から下記 2本の D NAオリゴマー

C C GAT C GAT G C C A GTA C C C C C A G GA

およぴ

G C C A C G GAT C C TA C ATTT G C C GAA G

をプライマーとして P C R反応を行なった。得られた增幅 D N Aを制限酵素 C 1 a I と B a mH Iで消化した後、得られた D N A断片を大腸菌発現べクター p KM 6 I L

— 6を得た。この p KM I L— 6を大腸菌 H B 1 0 1に導入し、組換え体を得た。この組換え体を下記のように培養して大腸菌組換え型ヒト I L— 6を調製した。

ヒト I L一 6発現プラスミドを保持する大腸菌 H B 1 O l Zp KM I L— 6を、 3 0 Lの増殖用培地（リン酸

1カリウム 0. 3 %、リン酸 2ナトリウム 0. 6 %、塩化ナトリウム 0. 5 %、塩化アンモニゥム 0. 1 %、グルコース 0. 5 %、カザミノ酸 0. 5 %、硫酸マグネシゥム 1 mM、硫酸第 1鉄 3 M、ビタミン B i S ^ g /ir, アンピシリン 5 0 g Zm 1 ) 3 0 リットル容ジャーに仕込み、上記組換え体を植菌した。ジャーは撹拌数 3 0 0 rpm 、通気量 1 VVM 、 2 5 °Cの条件で運転した。トリプトフアンオペロンの誘導物質であるインドールァクリル酸を加え、グルコースとカザミノ酸を添加しながら 6 0 時間培養した。培養菌体を 1 0， 0 0 0 X g 2 0分間の遠心分離操作により集めた。菌体は約 8 9 5 g得られた。集められた菌体を I mM E D T A、 1 0 0 mM N a C l を含む 5 0 mMトリス塩酸緩衝液（p H 8. 0 ) に O D 5 5 0 nmが 2 0 となるように懸濁した。菌体をマントンゴ ―リンにより破砕し、遠心分離を行ない、破砕抽出物を回収した。抽出液の蛋白質 2 3 5 g、 I L — 6 は 4 9 5 nigであった。ここで I L — 6の量は実施例 1 に示した E L I S A法で測定した。

抽出液を実施例 1で使用したシリ力担体 5. 5 リットルに吸着させ、リン酸ナトリウム緩衝液（ p H 7. 2 ) で洗浄した後、 2 O mM塩酸水溶液で回収した。 I L 一 6 は 4 6 2 mg回収した。溶出液に硫酸アンモニゥムを終濃度 1. 3 3 M になるように添加してから遠心により不溶性不純物を除去した。次に、プチル担体（ "プチルトヨパール 6 5 0 M" 、東ソ一製） 2 0 0 mlに吸着させ、 2 0 mM塩酸洗いをした後、 1 0 DiMリン酸ナトリウム緩衝液で回収した。ここで、 S D S — P A G E純度検定法により純度 8 4 %の I L — 6を 2 3 7 mg得た。溶出した I L 一 6をそのままへパリン担体（ " A F —へパリントヨノ、。 —ル 6 5 0 M" 、東ソ一製） 8 0 mlに吸着させ、 2 0 mM リン酸ナトリウム緩衝液（ P H 7. 2 ) に 0. 3 M N a C 1 を含む液で回収し、純度 9 1 %の I L一 6を 1 1 4 rag得た。溶出液をさらにブチル担体（前述と同じ） 2 0

0 m!で再度精製し、ヒト I L一 6を 6 6 mg得た。得られた I L— 6の精製純度は 9 5 %以上であった（C 逆相高速液体クロマトグラフィーによる分析）。

産業上の利用可能性

本発明により、医薬としての有用な糖鎖を有するヒト

1 L一 6を含む組成物の利用が可能となった。本発明に係る I L一 6組成物は、免疫不全症、骨髄移植後あるいは化学療法剤投与後の骨髄抑制、血小板減少症などに汎く治療薬として有用である。また、血中などの I L一 6 濃度を測定するための標準品としても利用しうる。

また、本発明に記載した方法により、高品位な I L - 6を大量に製造することができ、また高純度に I L一 6 を精製することができる。さらに、スケールアップが容易であり、工業的にも用いることができる。

Claims

請求の範囲

1. 糖鎖を有し、次の特性を有するヒト · インタ一ロイキン 6を含む組成物。

(1) ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルァミドゲル電気泳動で少なくとも分子量が 2 2 0 0 0〜 2

5 0 0 0および 2 6 0 0 0〜 3 0 0 0 0の 2成分を含み、その含有量がそれぞれ 6 0 %〜 9 0 %および 4 0 〜 1 0 %である、

(2) N末端アミノ酸配列が、少なくとも P r o— V a 1 一 P r o— P r o— G l y—、 V a l — P r o— P r o— G l y— G l u—および A l a - P r o -V a 1 一 P r o— P r o—から成る 3種類の配列を含み、かつ V a 1 — P r o— P r o— G l y— G l u—の含有量が 4 0 %以上である、

(3) 構成糖としてマンノ一ス、フコース、ガラクトース、 N—ァセチルダルコサミン、 N—ァセチルガラクトサミンおよび N—ァセチルノイラミン酸を含む。

2. ヒト · インターロイキン 6産生細胞を培養しヒト · インターロイキン 6を産生させる際に、培地中にァスコルビン酸またはその誘導体を添加することを特徴とするヒト · インターロイキン 6の製造法。

3. ヒト · インタ一ロイキン 6産生細胞がヒト線維芽細胞である請求の範囲第 2項記載のヒト · インタ一ロイキン 6の製造法。

4. 培地にさらに糖を添加することを特徵とする請求の範囲第 2項または第 3項記載のヒト · インターロイキン 6の製造法。

5 . へパリンを結合した担体を用いたクロマトグラフィ一により精製することを特徴とするヒト · インター口ィキン 6の製造法。

6 . 担体としてさらに疎水性基を結合した担体および Z またはシリ力系吸着剤を用いることを特徵とする請求の範囲第 5項記載のヒト ' インターロイキン 6の製造法

7 . シリ力系吸着剤を用いたクロマトグラフィー、へパリンを結合した担体を用いたク口マトグラフィー、および疎水性基を結合した担体を用いたクロマトグラフィーをこの順に行なうことを特徵とする請求の範囲第 5項または第 6項記載のヒト ' インタ一ロイキン 6の製造法。

. ヒト · インターロイキン 6が、ヒト線維芽細胞を培養して得られるものである請求の範囲第 5項〜第 7項記載のヒト · ィンターロイキン 6の製造法。

. へパリンを結合した担体を用いたクロマトグラフィ一により精製して得られうるヒト · インターロイキン 6組成物。

0 . 担体としてさらに疎水性基を結合した担体および Zまたはシリ力系吸着剤を用いることを特徴とする請求の範囲第 9項記載のヒト · ィンターロイキン 6組成物。 L 1. シリ力系吸着剤を用いたク口マトグラフィ一、へノ、。リンを結合した担体を用いたクロマトグラフィー、および疎水性基を結合した担体を用いたクロマトダラフィ一をこの順に行なって得られうる請求の範囲第 9 項または第 1 0項記載のヒト · インターロイキン 6組成物。

. 2, ヒト線維芽細胞を培養して得られるヒト · インタ一ロイキン 6を、へパリンを結合した担体を用いたク口マトグラフィ一により精製して得られうる請求の範囲第 9項〜第 1 1項記載のヒト · インタ一ロイキン 6 組成物。

3. ヒト · インターロイキン 6組成物が、糖鎖を有し、次の特性を有するものである請求の範囲第 9項〜第 1 2項記載のヒト · インターロイキン 6組成物。

(1) ドデシル硫酸ナトリゥムを含むポリアクリルァミドゲル電気泳動で少なくとも分子量が 2 2 0 0 0〜 2 5 0 0 0および 2 6 0 0 0〜 3 0 0 0 0の 2成分を含み、その含有量がそれぞれ 6 0 %〜 9 0 %および 4 0 〜 1 0 %である、

(2) N末端アミノ酸配列が、少なくとも P r o— V a 1 — P r o— P r o— G l y—、 V a 1 - P r o - P r o— G l y— G l u—および A l a— P r o— V a 1 — P r o - P r o—から成る 3種類の配列を含み、かつ V a 1 — P r o— P r o— G l y - G 1 u—の含有量が 4 0 %以上である、 (3) 構成糖としてマンノース、フコース、ガラクトース、 N —ァセチルダルコサミン、 N —ァセチルガラクトサミンおよび N —ァセチルノイラミン酸を含む。