WO1992001805A1

WO1992001805A1 - Procede de production de sucre et transfusion

Info

Publication number: WO1992001805A1
Application number: PCT/JP1991/000984
Authority: WO
Inventors: Yohji Ezure; Shigeaki Maruo; Katsunori Miyazaki; Naoyoshi Yamada
Original assignee: Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Priority date: 1990-07-26
Filing date: 1991-07-24
Publication date: 1992-02-06
Also published as: US5364794A; EP0560982A1; EP0560982A4; AU8226791A; CA2088048A1

Description

明細誊

糖鎖の《造法及び翰液技術分野

本発明は、グルコース、マルトース、マルトオリゴ糖等の定まつた糖鎖長の糖類を単品で髙純度に得る製造法に闋する。

"rf¹ 景： ά 術

特定糖鎖長の糖類を単品で高純度に得る方法としては、これまで、澱粉等のグルカンを単独又は 2種以上の適当なァミラーゼ類で分解し、これを公知の様々な力ラムクロマトグラフィ一等によって他の目的としないオリゴ糖ゃ単糖から分離するか（例えば、澱粉科学ハンドブック， Ρ452, 1987、特開昭 57-209000 号公報、特開昭 62-19210 号公報、特公平 2 - 17158号公報）、又はそれを更に結晶化に導いて、他の微量に混在している目的としないォリゴ糖ゃ単糖から分雜する方法（例えば、澱粉科学ハンドブック， Ρ456， 1987) 等が知られている。

しかしながら、上記いずれの方法もダルコ一スゃ未切断のデキストリン、その他目的としないォリゴ糖の副生を本質的に伴い、これら目的としない糖類を、反応系から除くことは実質的にできなかつまた、微量の目的としない糖類の共存は、目的とする特定糖鎖長の糖類の結晶化を著しく妨げることが判っていた。

更に、上記公知の方法によって、できる限り髙純度のォリゴ糖を得ようとすると、製造工程が複雑になり、収率面ゃコスト面で問題があつた。

発明の開示

従って、本発明者らは、糖類の公知製造法には改善の余地が多分にあると考え、特に医薬用に適した目的としない糖類を実質的に含まないダルコース、マルトース、マルトォリゴ糖等の特定糖鎖長の糖類のみを単品で製造する方法の構築を試みた。

本発明の要旨は、以下の一連の操作を連繞して行うことにある。即ち、目的とする特定糖鎖長の糖類に対し実質的に分雜可能な物質（以下「分雜可能物質」という）に、糖鎖転移酵素により直接又は中間体を介して他の糖鎖供給源から糖鎖を耘移させ、得られたォリゴ糖に、オリゴ糖に対して特定の長さの糖鎖をェキソ型に切り出す酵素（以下「ェキソ型切断酵素」という）を作用させて目的とする特定の糖鎖長の糖類を単雔するという方法である。

本発明を以下に詳述する。

本発明で用いる分雜可能物質は、ヰトサンビーズ、イオン交换樹脂、合成髙分子樹脂、若しくはその他固定化担体として用いられている担体又は次の一般式〔 I 〕

(以下次貢）

(式中 Rは、水素、低級アルキル、ヒド πキシ了ルキル、フヱニルアルキル、フエニルァルケニル、フヱニル了ルキニル、フエノキシ了ルキル、フユノキシアルケニル又はフ Xノヰシアルヰニルを示す _t ここにおけるフヱニルには、 g换されているものも含む。）で表される化合物（以下「モラノリン類」という）、ノジリマイシン、了ミノシクリトール、了ミノシクリトール誘導体若しくはダルク口ン酸又はこれらのダルコシル若しくはォリゴダルコシル体等のィォン交換樹脂に吸着可能な極性を有する糖類（以下「極性糖」という）等である。担体は、ビーズ状、胰状、繊維状等を間わない。モラノリン類は、桑白皮や放線菌等より得ることができる（例えば、特願昭 54- 159417 号、特願昭 55-76838号、特公昭 56- 9919 号公報、特願昭 57-93997号、特公昭 59-27337号公報）。モラノリン類のダルコシル及びォリゴダルコシル体は、既に開示されている方法によって製造することができる（例えば、了グリカルチュラルアンドバイォロジカルケミストリー、 2159 (1985) ) 。アミノシクリトールは、バリダマイシン類等から得る方法が開示されており（例えば、特願昭 55- 128157号）、また、市販のバリダマイシン製剤から調製できる。

末端にダルコシル又は極性糖等、糖鎖転移酵素により糖鎖を転移されうる残基を有しない担体に糖鎖を転移させるためには、前もつて担体に、糖鎖転移酵素により糖鎖を転移され όる残基を有する中間体を、直接又はスぺーサーを介して結合させておく必要がある。ここに、中間体としては、極性糖、グルコース等の単糖、マルトース、マルトトリオース等のォ I)ゴ糖等を挙げることができる。担体に中間体を結合させるためには、例えば、アミノ基を末端に持つスぺーサ一を結合させたキトサンビーズの担体に、中間体としてのマルトースを水素化シァノホウ素ナトリウム（NaBH₃CN)のような還元剤で結合させる方法等を挙げることができる。ここに、スぺーサーとしては、ォキシラン、グルタルアルデヒド（GLA)等、固定化技術に用いられるモノファンクショナル及びバイフアンクショナルな物質を挙げることができる。

他の糖鎖供給源から糖鎖を転移させるために用いる糖鎖転移酵素としては、例えば、サイク T3デキストリング！）コシルトランスフユラーゼ（CGTase) 、 —了ミラーゼ等を挙げることができる。

CGTaseは、これまでいくつかの種類の菌秣からの生産が報告されており、例えば、バチルス · マセランス、バチルス ' メガテリゥム、バチルス ' サーキュランス、好アル力リバチルス、 i 熱性バチルス等からの生産が報告されている。それぞれ生産されるサイクロデキストりン類は各々特徴を持っているが、本発明に用いる CGTaseは、これらどの型の CGTaseであっても充分にその目的を果たすことができる。また、酵素以^にもある種の菌株は、直接糖転移生成物を形成することが知られているが（例えば、日本廣芸化学会大会講演要旨集， 4N-2, 昭和 56年 3月 10曰発行）、そのようなものでも本発明に係る糖鎖転移酵素としての目的を果たすことができる。糖鎖転移反応における PH、反応温度は、用いる糖鎖転移酵素によつてそれぞれ若干異なるが、例えば、 CGTaseを用いる場合、 pHは 4. 0 〜： 11. 5の範囲、好ましくは pH 5. 5〜10. 5の範囲が適当であり、反応温度は、 20〜85 tの範囲、好ましくは 45〜65 tの範囲が適当である。糖鎖転移反応に要する時間は、 CGTaseを耘移酵素として用いた場合、 PH、反応温度、酵素濃度、糖鎖供給源の濃度によってもかなり異なるが、通常、数時間〜 4 日間である。 CGTaseの使用量は、糖鎖転移酵素により糖鎖を転移されうる残基にできる限り多くの糖鎖を転移させることが好ましいので、糖鎖供拾源の澱粉系多糖に対して酵素の割合は多い程良好な結果が得られる。具体的には、用いる糖鎖供— 給源の澱粉系多糖、 P H、反応時間により異なるが、およそ繳粉系多糖 l g当たり 500〜5000単位（B . V法）、好ましくは 1000〜2000 単位が適当である。

ここに、糖鎖供給源としては、澱粉、澱粉系糖質又はサイクロデキストリン等を挙げることができる。濺粉は、市場に流通している商業用澱粉のいずれでも用いることができる。また、澱粉系糖質としては、各種デキストリン、アミロース、アミロぺクチンのような中間加水分解物又は高重合度、中程度若しくは低重合度のものいずれでも用いることができる。澱粉系多糖の濃度は、製造上の要請に応じた作用時間、転移酵素量によって異なるが、 5〜60 %、好ましくは 10〜20%が適当である。デヰストリンであれば 30〜50 %までが実用的である。ただし、澱粉を糖鎖供給源として髙«度で用いる場合、その粘度は著しく高くなるので、糖鎖転移反応を行う前に、澱粉を CGTaseや α—ァミラーゼ等で液化しておくのが一般的である。また、添加する澱粉系多糖の利用率を髙めるためには、耘移酵素量に対して澱粉系多糖の相封的添加量を少し低い濃度にすることが好ましく、例えば、澱粉系多糖 1 g当たり糖鎖転移酵素量 2000〜3000 単位が好ましい。

分雜可能物質として極性糖を用いる場合、その濃度は、例えば、モラノリンの場合、 15%程度まで上げることができる。しかし、糖鎖供給源のモラノリンに対する重量比は、 2〜20倍程度が効果的でめる G

分錐可能物質として担体を用いた場合は、糖鎖転移反応終了後、 ¾贛「糖鎖が延長された祖体を充^に洗浄する。また、洗狰後、例えば、 100で、 5分間加熱して残存の糖鎖転移酵素を失活させ、更に充分に洗浄することもできる。用いた糖鎖転移酵素は、限外攄過 (以下「UF」という）法等で容易に回収することができる。

分雜可能物質として極性糖を用いた場合は、糖鎖転移反応終了後、極性糖及びその糖にダルコースオリゴマーが転移したものをィォン交換樹脂に吸着させる。この場合も用いた糖鑌転移酵素は、 UF法等によって容易に回収することができるので、糖鎖転移酵素を回収しない場合は反応液をそのまま、回収する場合は ϋΡ胰処理後、濾過液を適当なイオン交換樹脂にかける。ここに、イオン交換榭脂としては、ダウエックス 50W-X2 (登録商標）、ダイヤイオン SA-11A (登録商標）、アンバーライト I R-120 (登録商標）等を挙げることができ、極性糖の極性によって適宜選択する。イオン交換樹脂の量は、反応に用いる極性糖の量により増減しなければならないことは言うまでもない。また、極性糖及びその糖にダルコースオリゴマーが転移したものをイオン交換樹脂に吸着後、通常、充分に洗浄する。そして、洗浄後、これらをィォン交換樹脂から溶出させるのが一般的であり、例えば、 1 Nのアンモニア永等で溶出させる。

続いて、ェキソ型切断酵素に適した pHにおいて、ェキソ型切断酵素を、通常、反応温度 30〜55 tで数時間〜 2 日間作用させるが、ェキソ型切断酵素としては、ダルコアミラーゼ、）9一アミラーゼ、マルトオリゴ糖生成酵素等を挙げることができる。例えば、マルトースを製造する場合、一アミラーゼを用いることができるが、用いる 9一アミラーゼに適した pH 4. 5〜 6. 0、例えば、 pH 4. 8に反応液を調整し、 β—了ラーゼを反応液に入れ、反応温度 30〜601：の間で 1〜 2 日間反応させるのが適当である。ェキソ型切断酵素の添加量は、用いるヱキソ型切断酵素ゃ分雜可能物質の種類にもよるが、分雜可能物質が担体の場合、担体 l m£当たり 2(！〜 100単位を加えれば、工業上 1 曰の作業時間内に切断を終えることができる。

分離可能物質として極性糖を用い、先の操作でィォン交換榭脂から溶出させた場合、ェキソ型切断酵素を作用後、そのまま、又は適当な UP膜法等の分雜方法によりェキソ型切断狳素を分雜し、再度、用いた極性糖を吸着するィォン交換樹脂にかけることによって、実質的に目的とする特定糖鎖長の糖類のみを単雔することができる。樹脂量は、主として仕込んだ極性糖の量により増減する必要がある。分雜可能物賈として極性糖を用い、先の搔作でィォン交换樹脂から溶出させないままェキソ型切断酵素を作用させた場合、又は分雜可能物質として担体を用いた場合は、ェヰソ型切断酵素を作用後、攩過ゃ ϋΡ膜法等の適当な分離方法により、ェキソ型切断酵素を分雜することによって、実質的に目的とする特定糖鎖長の糖類のみを単雜することができる。

上記のようにして分雜されたェキソ型切断酵素は、再利用することもできる。

最終的に得られた液を濃綰するには、ロータリーエバポレーターによる減圧濃縮法、 ^浸透圧（R0) 胰法等、汎用されている濃縮手段により行うことができる。

分離可能物質として極性糖を用いた場合、糖鎖転移酵素及びェキソ型切断酵素は、溶液状で用いることもできるが、汎用されている公知の面定化酵素を製造する方法で調製した固定化酵素の型で反応させることもできる。特に、粗酵素を用いる場合には、面定化酵素を用いることは夾雑物を少なくでき、精製工程上有利である。

本発明に係る製造法によって製造されるマルトースの反応を図式化すると次のようにな.る。

(以下次頁）

Ψ ▼ τ ▼ ▼ τ

A -G- G-G- G-G- G-G- G - G— G-G- G-G

T ▼ ▼ ▼ T

A -G-G- G-G— G-G— G-G- G-G— G-G

▼ ▼ T ▼ T

A -G - G-G— G-G— G-G- G-G - G-G

▼ ▼ ▼ ▼

A -G-G- G-G- G-G— G-G— G-G

T T T T

A - G— G - G— G- G— G-G― G - G

▼ ▼ T

G-G

T

A -G-G- G-G

T

A -G- G-G

A -G-G

A -G

A

(式中、 Aは分鎗可能物質を、 Gはグルコースを、 Bは J9一丁ミラーゼを、それぞれ表す。ただし、すべての Aは、同一とは限らない Vは、 /3—アミラーゼの切断箇所を示す。）

上式のように、 /9一アミラーゼは、その性質上、二糖叉は三糖を切断せずに残す（上式の場合、 G- G、 A -G及び。従って、溶液状であり中性糖であるマルトース（G-G)のみを、固形状又は極性糖であるその他（A、 A -G及び A - G-G〉のものから、據過又はィオン交換榭脂等により、容易に単雜することができる。

そして、マルトースを分雜後、糖鎖転移酵素は、再びその他の残澄の上に糖鏔を延長でき、結局、糖鎖転移反応、切断反応、分雜を繰り返すことにより、連続的なマルトースの生産が可能となる。以上より、本発明に係る製造法は、連耩性を兼ね備えた、実質的に目的とする特定糖鎮長の糖類のみを单品で得ることができる新規且つ面期的な製造法であるということができる。また、本発明によれば、特定糖鎖長の糖類のみが得られるという利点だけでなく、従来法と比較して製造工程が非常に簡易的であり、柽費、労力等を大幅に節減することができ、収率も充分に高め得る。

本発明の製造法で得られる糖類、例えば、マルトースは、特に髙純度が要求される医薬用に有用であり、その使用形態としては、点滴剤等を挙げることができる。また、当然に食品用としても用いることができる。マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトぺンタオース、マルトへキサオース等は、診断薬等として用いることができる。更に、マルト一スを還元して.製造される甘味剤のマルチトールの結晶化は、原料のマルトースが純粋なもの程良好であるので、本発明の製造法で製造されるマルトースは、この点に対しても非常に有効である。

本発明に係る糖類を医薬用として適用する例としては、例えば、輸液等を挙げることができる。輸液に適用する場合に、例えばマルトースはその 10 %溶液が等張であり、等量のダルコースの 2倍のェネルギー価を有すること等から、グルコース等よりも有益であることが知られており（「麻酔と蘇生」 20巻 3号 163頁。 1984年）、同様に等張のマルトトリオース 15 %溶液はグルコースの 3倍のエネルギー価を有して有効性が更に髙ぃ。本発明に係る糖類を医薬用に適用する場合には、例えば、以下の組成のものを適用することができるが、一般的には、糖（マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトへヰサオース等）を単独で、又はグルコース若しくはマルトースと同時に含有させ、適宜塩化ナトリウム、塩化力リゥム、齚酸ナトリゥ厶等の無機塩を含有させることができ 0

(輪液組成例）

マルトトリオース 15 g、塩化力リウム 0. 03 g、塩化力ルシゥム 0. 02 g、塩化ナトリウム 0, 6 g、乳酸ナトリウム 0. 31 gを混合し、輸液 100m£の組成とする。

発明を実施するための最良の形旗

次に、本発明を参考例及び実施例により、更に詳細且つ具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。

参考例 1 固定化 CGTaseビーズの調製

まず、バチルス · マセランス CGTase (コンチザィム、天野製薬社製） 200m£を 0. 01M酢酸缓衝液（PH6. 0)に対して透析した。別に、ヰトパール BCW- 3010 (登録商標、富士枋綾社製、以下同じ。） 50 m£を 2. 5 グルタルアルデヒドを含む 0. 1M齚酸緩衝液（pH5. 0)で 24時間室温で穩やかに振鑀した後、充分に水洗した。そして、この活性化されたキトパールに上記の透析内液を遣心分離した上清を加えて 4 :で 16時間穗やかに振盪しながら酵素の結合をさせた後、充分に氷洗した。これによつて、 23. 8rag蛋白質ビーズの本固定化酵素を得。

参考例 2 面定化ー了ミラーゼの調製

まず、さつまいも由来の J9ーァミラーゼ（シグマ社製、硫安懸漪液） 4. 8m£を 0. 01M 酢酸緩街液（ΡΗ5. 0)に対して透析した。別に、キトパール BCW-3010 10m£を 2. 5%グルタルアルデヒドを舍む 0. IMS 酸緩衝液（PH5. 0)で 24時間室温で穏やかに振盪した後、充分に永洗した。そして、この活性化されたキトパールに上記の透析内波を遠心分雜した上清を加えて 4 :で 16時間穏やかに振盪しながら酵素の結合をさせた後、充分に水洗した。これによつて、 6. 44ng蛋白質 m£ビーズの本固定化酵素を得た。

参考例 3 キトサンビーズにマルトースを結合させた担体の調製

キトサンビーズとしてキトパール BCW-3010 5 m£とマルトース 1. 8g をメタノ一ル永 = 1 / 1の混合溶媒 20m£に加え、マルトースを溶— _ 解した後、永素化シァノホウ素ナトリゥムを加えて酌酸にて PHを 3 〜4に会わせ、 3 日間反応させた。そして、ビーズを ¾過した後、充分永洗して本担体を得た。

参考例 4 固定化ダルコ了ミラ一ゼの鏞製

ダルコアミラーゼ「ダルクザィム NL-3」（天野製薬社製） 35 ·2にィォン交換水 35 を加え希釈し、 UP法で精製して得られた酵素濃縮液をカラムに充填したキトパール BCW-3010 33 に導入し、吸着させた。即ち、この酵素液が、最終的に 0. 05M 酢酸緩衝液（PH 5. 0) 56 £に含まれるようにした液を 8 tで 24時簡循環させることにより吸着させ、その後、 0. 05M 齚酸緩衝液（PH 5. 0) 150 £で洗浄し、 2. 5%グルタルァルデヒドを舍む0. 0511 齚酸緩衝液（PH5. 0) 120Jを力ラムに循環させて面定化を完了した。余分のグルタル了ルデヒドは、 550 ·βの氷を通すことにより除去した。これによつて、 24. 4nig 蛋白質 Ζπώビーズの本固定化酵素を得た。実施例 1

50m 三角フラスコにモラノリン、 N—メチルモラノリン、 N—ぺンジルモラノリン、 N—ヒドロキシェチルモラノリン、 N—ブチルモラノリン及びダルコシルモラノリンをそれぞれ 300mgとり、これらに各々可溶性澱粉 1200ragを加え、水 10m£に加温溶解させ、参考例 1の方法で調製した固定化 CGTaseビーズ 5 m£を加え、 40 :で 3 日閱振盪し転移反応を行わせた。そして、これら各々の反応液から 3 m£ とり、 10m£の強酸性イオン交換樹脂ダウエックス 50W-X2にかけ、充分水洗して 1 Nアンモニア水 60w£で溶出し、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。この糖鎖転移物の重量を表 1 に示し、それぞれの TLC (キーゼルゲル 60F₂ "、メルク社製；展開溶媒： n-プロパノールアンモニア水 Z永- 6 Z 2 Z 1.、発色剤： 10%硫酸のェタノール溶液を聩霧後、火炎上で加熱、以下同じ。）を図 1 に示した。次に、糖鎖転移物を 50ing/m になるように水に溶解させ、 2H塩酸で PHを 5〜 6に合わせ、これに参考例 2の方法で調製した固定化 ]9 一アミラーゼを 200粒加え、 37でで 5時間反応させた。この J9ーァミラーゼ反応液の TLC を図 2に示した。

図 2からそれぞれマルトースを生成していることは明らかである。銃いて、それぞれの β—了ミラーゼ反応液を 10 の強酸性ィォン交換樹脂ダウエツクス 50W-X2にかけ、通過液を 2Νカセィソーダで中和後、ロータリ一エバポレーターで濃縮乾固した。得られたそれぞれのマルトース重量は、表 1 に示した。

(£1下次頁) 表 1

また、これらのマルトース画の TLC は、図 3に示した。

図 3からマルトースのみ生産されていることが明らかである。実施例 2

50m2三角フラスコにバリダミン 60rogと可溶性澱粉 1200ragを入れ、 10m£の水を加え加温溶解させ、これに参考例 1の方法で調製した固定化 CGTaseビーズ 5 m£を加え、 40 tで 3 日間振盪し転移反応を行わせた。そして、この反応液から 3 m とり、 ΙΟπώの強酸性イオン交換樹脂ダウェックス 50W-X2にかけ、充分永洗して 1 Νアンモニア永 60 JH£で溶出し、ロータリーエバポレーターで濃縮乾面した。この糖鎖耘移物の重量は 274mgであり、糖鎖転移物の TLC は図 4に示した。

次に、この糖鎖耘移物に氷 5. 5ι ^を加え、 2N塩酸で P Hを 5〜 6に合わせ、これに参考例 2の方法で調製した固定化 )9一アミラーゼを 200粒加え、 37でで 5時間反応させた。この j9一アミラーゼ反応液の TLC を図 5に示した。

図 5からマルトースを生成していることは明らかである。

銃いて、このーアミラーゼ反応液を 10m£の強酸性イオン交換樹脂ダウェクス 50W-X2にかけ、通通波を 2Nカセイソーダで中和後、 ϋータリーエバポレーターで濃縮乾固した。得られたマルトース重量は、 113ragであった。また、このマルトース画分の TLC は、図 6 に示した。

図 6からマルトースのみ生産されていることが明らかである。実施例 3

ねじ口試験官に N- (1, 3—ジヒドロヰシー 2—プ π ビル）パリォールァミン 60rogと酵素デヰストリン「了ミコール」（登錄商標、日本澱粉社製） 240 rag、更に、 CGTase 「コンチザィム」（天野製薬社製 ) l «gを加え、計 2 «gになるように永を加えて 50 tで 48時龃振盪しながら転移反応させた。反応液全体を約 10«£の強酸性ィォン交换榭脂ダウェックス 50W-X2に通して充分水洗し、 1 N了ンモニァ氷 60m で溶出し、面分をロータリ一エバポレーターで濃榕乾固した。得られた糖鎖転移物の重量は 118. 6ragであった。

この糖鎖転移物に 0. 1M齚酸緩街液（pH 4. 8) 10m£を加えて溶解させ、耪いて ]9一アミラーゼ（サツマィモ由来、硫安懸濁液、生化学工業社製） IOO J ίを加えて 37tで 16時閽反応した。そして、この β—了ミラーゼ反応液を 10m£の強酸性ィォン交換樹脂ダウェックス 50W-X2にかけ、素通り区分を洗液と共に 2N水酸化ナトリゥムで中和し、ータリ一エバポレータ一で濃縮乾面して 129. 8ng のマルトースを得た。実施例 4

ォリゴダルコシルモラノリン 4. 7gを水 170m£に溶解し、 pH 4. 9に 1N塩酸で調整した後、）5—アミラーゼ（セルパ（SBRVA)社製、甘藷由来、 848 U/ng蛋白、 3回再結晶品、 5 mg/lffli) l m£を加え、 37 t で 20時間反応した。反応液を強塩基性ィォン交換樹脂ダイヤィォン SA-11A 30J ^を通過させ、充分イオン交換水で洗浄した。そして、通過液と洗液を合わせて強酸性ィォン交換樹脂ダウェッタス 50W-X2

50m£を通過させ、充分イオン交換水で洗浄した。続いて、通過液と洗液を合わせ濃綰乾固し粉末 1. 4gを得た。

これのマルト一ス舍量は、髙.速液体ク口マトグラフィー（カラム： Nucleosi l 5fiH₂、 5 ju m、 4 mra i. d. x 25；移動層：ァセトニトリル Z氷 = 70/30；検出：示差屈折計）で分析した結果、 98. 3%であつプ o

実施例 5

可溶倥澱粉 15 gを水 100m£に加温溶解した後、モラノリン 5 gを溶解した。そして、氷を加えて全容穰を 170m£として後、参考例 1 の方法で調製した固定化 CGTaseビーズ 2Gm£を加えて 55 tで 42時間反応した。次いで、濾過して固定化 CGTaseビーズを除去し、氷洗後、據液と洗液を合わせ、強酸性ィォン交换榭脂ダウェックス 50W-X2の 50m£を通適させた。これを充分氷洗後、 1 N了ンモニ了永で溶出し、溶出液を凍結乾燥して粉末 11. 3 gを得た。

この粉末を水 250 に溶解し、 2N塩酸で PHを 5. 0に調整した後、参考例 2の方法で調製した固定化 i3—了ミラーゼ 10JH£を加えて 37 t で 3時 K反応した。そして、この反応液を據過して固定化ーアミラーゼを除去し、氷洗後、 «波と浼液を合わせて強塩基性イオン交換樹脂ダイヤイオン SA-11Aの 30m£を通通させ、充分水洗した。銃いて、通過液と洗液を合わせ約 20m£まで滅圧下で濃綰し、強酸性ィォン交換樹脂ダウエックス 50W -) (2の lOOmgを通通させた。 gく永洗後、通通液と洗液を合わせて凍結乾燥し、マルトース粉末 800rogを得た。本品のマルトース 85mgZm£濃度のもの £を実施例 4と同様の髙速狭体クロマトグラフィ一条件で分析した結果、本品は、図 7に示すように 100 のマルトースであった。

実施例 6

参考例 3で調製したマルトース結合キトバール 5 m に醉素デキストリン「アミコール」（登録商標、日澱化学社製） 3 g、氷 10m を加え、 2N塩酸で pH 6. 0に調整した後、 CGTase (コンチザィム、天野製薬社製） 5 m£を加え、 50 tで 24時簡種やかに振镫した。そして、担体ビーズを據通した後、充分氷洗し、 100 ¾で 5分間沸騰永中で加温し、更に充分氷洗した。

別に、コントロールとして、マルトース結合キトパールの代わりに無処理のキトパールを同様に反応させた。

このようにして得られた担体ビーズ 5 mgに 0. 2M齚酸緩衝液 10«£を加え、これに、一アミラーゼ（セルバ（SBRVA)社製）を加えて 37 tで穏やかに振盪した。

柽時的に反応波を 500 M £サンプリングし、 3, 5-ジニトロサリチル酸試薬 l m£を加え、 100 tで 10分間沸騰水中で加熱した後、水冷し、 5 m£の氷を加えて 535nmの吸光度で遊雛したマルトースを測定した。その結果を図 8— Aに示した。無処理のキトパールと比較して、マルトース結合処理したキトパールの方が明らかにマルトースの遊雜を示した。この 15—アミラーゼ処理後の上清を濃縮し、 TLC で確認したところ、マルトースのみ検出され、他の小糖類の混在は認めなかった。

実施例 7

50«£の三角フラスコに実施例 6で用いた J9一アミラーゼ切断後のマルトース結合キトパールとコント口一ルのキトパールを lOO :で 5分 K加熱処理して充分に水洗したもの 5 ^と酵素デキストリン「アミコール」（登録商標、日本澱粉社製） 3 g、永 10m、 CGTase 「コンチザィ厶 j (天野製薬社製） 5 ^を加えて、；50 tで 24時間振盪しながら再度反応させた。そして、ビーズを ¾過洗浄した後、 100 tで 5分簡加熱処理して更に充分永洗した。

このビーズ 5 m«を 0. 2M酢酸緩衝液（PH 4. 8) 10 ^に加え、更に、一アミラーゼ（サツマィモ由来、硫安懸濁液、生化学工業社製） 50 JU を加えて 371でィンキュペートし、柽時的に 0. 5m£をサンブ U ングして 3, 5-ジニトロサリチル酸試薬 1 ^を加え、 100でで 5分藺沸騰水中で加熱した後、永冷し、 5 m の永を加えて 535nroの吸光度で遊雜したマルトースを測定し、吸光度の変化を図 8— Bに示し 0

図 8— Bから明らかなように、実施例 6の第 1回目の反^と同様、コントロールと比較してマルトースの生成が充分に認められた。

これにより、マルトース結合ビーズを用いても、マルトースの製造が鹱り返し行なえる、即ち、連続生産の可能性が示唆された。

実施例 8 実施例 1 と同様にして得られたモラノリンの糖鎖転移物 U9mgを 3 m£の氷に溶解し、 2N塩酸で pH 5. 0に合わせ、参考例 4により調製した固定化ダルコァミラーゼビーズを 200粒加え、 40tで 4時間振盪してグルコースを遊雔させた。この反応液をダウエックス 50W-X2 10m£にかけ、吸着されずに出てくる画分を 2. 5Nのカセィソーダで中和した後、ロータリ一エバポレーターで濃緒乾固することによつて、純粋なグルコース 58. 3mgを得た。

図 9にその TLC を示した。

実施例 9

実施例 1 と同様にして得られた N—プロビルモラノリンと N—ぺ— ンジルモラノリンの糖鎖転移物のそれぞれ 12. 5ngを 250 M ίの水に溶解させ、 2Ν塩酸で ρΗ 6. 0に調製し、これにストレブトミセスグリセウス NA-468 ( PERM P-2227 ) より驪製したマルトトリオース生成アミラーゼ溶液 250 μ & ( 95ュニット Ζ0. 25rogブロティン； 1ュニットは 1時間に 1 rogのマルトトリオースに相当する還元糖を生成する酵素量）を加えて、 40 tで 2時間緩く振通してマルトトリオ一スを生成した。図 10にこの反応液の TLC を示した。

更に、この反応液をダウエックス 50W-X2にかけ、吸着されずに出てくる面分を 2. 5Nのカセィソーダで中和した。図 11にこのマルトトリオース面分の TLC を示した。

図 11からマルトトリオースのみ生産されていることが明らかである 0

なお、 3， 5-ジニトロサリチル酸法でマルトトリオ一スの標品を基準に定量したところ、それぞれ 5. 2mg 、 5. 7mg のマルトトリオースを確認した。

実施例 10

実施例 1 と同様にして得られた N—プロビルモラノリンと N—べンジルモラノリンの糖鎖耘移物のそれぞれ 12. 5ragをシユードモナススタツッヱリイ（Pseudoraonas stutzer i ) IF0-3773株より調製したマルトテトラオース生成アミラーゼ溶液 250 β ϋ ( 26. 25 ュニット / 0. 24ragプロティン ·； 1ユニットは 1時間に 1 ragのマルトテトラオースに相当する還元糖を生成する酵素量）を加えて、 40 tで 2時閒緩く振盪してマルトテトラオースを生成した。

更に、この反応液をダウエックス.50W-X2にかけ、吸着されずに出てくる画分を得、このマルトテトラオース面分の反応 20分目の TLC を図 12に示した。

図 12からマルトテトラオースのみ生産されていることが明らかでめ ₀

なお、 3, 5-ジニトサリチル酸法でマルトテトラオースの標品を基準に定量したところ、それぞれ 2. Omg 、 1. 6mg のマルトテトラオースを確認した。

実施例 11

実施例 1 と同様にして得られた N—プロビルモラノリンと N—べンジルモラノリンの糖鎖転移物のそれぞれ 12. 5nigをシユードモナスエスピー（Pseudoraonas sp. ) 0-8940 (PBRM P-7456)より調製したマルトペンタオース生成ァミラーゼ溶液 250 M i ( 10. 13 ュニット 85mgプロティン； 1ュニッドは 1時間に l ingのマルトペンタオースに相当する還元糖を生成する酵素量）を加えて、 40でで 2時間緩く振逢してマルトペンタォースを生成した。

更に、この反応液をダウエックス 50¾H(2にかけ、吸着されずに出てくる画分を得、 N—ペンジルモラノリンからのマルトペンタォース画分の反応 90分目の TLC を図 13に示した。 '

図 13からマルトペンタオースのみ生産されていることが明らかである。

なお、 3， 5 -ジニトロサリチル酸法でマルトペンタオースの標品を基準に定量したところ、それぞれ 6 oig 、 0. 8rog のマルトペンタォースを確認した。

面面の簡単な銳明

図 1は、実施例 1 における糖鎖転移物の TLCである。図中 1 はモラノリンの、 2 は N-メチルモラノリンの、 3 は N-ペンジルモラノリンの、 4は N-ヒドロキシェチルモラノリンの、 5 は N-ブチルモラノリンの、 6 はダルコシルモラノリンの各糖鎖転移物を示し、 a、 b、 c、 d、 e、 ίはスタンダードとしての上記各モラノリン類を示す。図 2は、実施例 1 における 9ーァミラーゼ反応液の TLCである。図中 1、 2、 3、 4、 5、 6は図 1で説明しているものと同じである。 Μはマルトースを示す。

図 3は、実施例 1 におけるマルトース画分の TLCである。図中 1、

2、 3、 4、 5、 6は図 1で銳明しているものと同じである。 Μはマルトースを示す。

図 4は、実施例 2における糖鎖転移物の TLCである。 7はバリダミンの糖鎖転移物を、 B aはバリダミンを、それぞれ示す。

5は、実施例 2における j9一了ミラーゼ反応液の TLCである。 7はバ I)ダミンの糖鎖転移物を、 Mはマルトースを、それぞれ示す。図 6は、実施例 2におけるマルトース面分の LCである。 7はパリダミンの糖鎖転移物を、 Mはマルトースを、それぞれ示す。

図 7は、実施例 5において得られたマルトース粉末の髙速液体ク πマトグラムである。図中 Aは溶媒の 1 ·一クを、 Bはマルトースのピーク、それぞれ示す。

図 8— Aは、実施例 6における結果である。書は、マルトース結合キトパールを用いた場合、〇は、無処理のキトパールを用いた場合を、それぞれ表す。縦軸は溶液の吸光度を、横軸は時間（時間）を、それぞれ表す。

図 8— Bは、実施例 7における結果である。磨は、マルトース結合キトパ ^ルを用いた場合、〇は、無処理のヰトパールを用いた場合を、それぞれ表す。縦軸は溶液の吸光度を、横軸は時藺（時間）を、それぞれ表す。

9 は、実施例 8におけるグルコース画分の TLCである。図中 8 は、グルコース画分を、 . Gはグルコースを、それぞれ示す。

図 10は、実施例 9におけるマルトトリオース生成アミラーゼ反応液の TLC である。図中 9は N—プロビルモラノリンの、 10は N—べンジルモラノリンの各糖鎖転移物を、 Tはマルトトリオースを、それぞれ示す。

図 11は、実施例 9 におけるマルトトリォ ^ス画分の TLC である。図中 9は N—プロビルモラノリンからのマルトトリオース画分を、図中 10は N—ペンジルモラノリンからのマルトトひオース画分を、 Tはマルトトリオースを、それぞれ示す。図 12は、実施例 10におけるマルトテトラオース面分の Tし C である。図中 11は N—プロビルモラノリンからのマルトテトラオース画分を、中 12は N—べンジルモラノリンからのマルトテトラオース面分を、 T eはマルトテトラオースを、それぞれ示す。

図 13は、実施例 11におけるマルトペンタオース面分の TLC である。図中 13は N—ペンジルモラノリンからのマルトペンタオース画分を、 P eはマルトペンタオースを、それぞれ示す _n

Claims

請求の範囲

1 . 目的とする特定糖鎖長の糖類に対し実質的に分雜可能な物質に、糖鎖転移酵素により直接又は中間体を介して他の糖鎖供給源から糖鎖を転移させ、'得られたォりゴ糖に、ォリゴ糖に対して特定の長さの糖鎖をェキソ型に切り出す酵素を作用させて目的とする特定の糖鎖長の糖類を単雜することを特徵とする糖類の製造法。

2 . 目的とする特定糖鎖長の糖類に対し実質的に分雜可能な物質が、担体又は次の一般式〔 I〕

C I〕

(式中 Rは、永素、低級アルキル、ヒドロヰシアルキル、フヱニル了ルキル、フエニルァルケニル、フエニルアルキニル、フヱノキシアルキル、フヱノキシアルケニル又はフヱノキシアルキニルを示す < ここにおけるフヱニルには、置換ざれているものも舍む。）

で表される化合物、ノジリマイシン、ァミノシグリトール、ァミノシクリトール誘導体若しくはダルク。ン繫又はこれらのダルコシル若しくはォリゴダルコシル体である請求項 1記載の糖類の製造法。

3 . 次の一般式〔 Π〕

(式中、 nは、 2から 5の整数を示す。）

で表されるマルトオリゴ糖を主成分として舍有する輪液,