JP2868835B2

JP2868835B2 - イソマルトオリゴ糖含有シラップおよびイソマルトオリゴ糖の製造方法

Info

Publication number: JP2868835B2
Application number: JP2093717A
Authority: JP
Inventors: 嚴太郎岡田; 剛裕海野; 喜輝夫中久
Original assignee: Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Current assignee: Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Priority date: 1990-04-09
Filing date: 1990-04-09
Publication date: 1999-03-10
Anticipated expiration: 2014-03-10
Also published as: JPH03292895A

Description

【発明の詳細な説明】「産業上の利用分野」本発明は、甘味料並びに健康食品として用いられるイ
ソマルトオリゴ糖含有シラップおよびイソマルトオリゴ
糖の製造方法に関する。

「従来の技術」近年、イソマルトースやパノースなどの分岐オリゴ糖
が難消化性で、しかも抗う蝕性を有する非発酵性糖質と
して、また、ヒト腸内有用細菌であるビフィズス菌の増
殖因子として注目を集めている。また、α−1.6−グル
コシド結合のみから構成されるグルコ３糖であるイソマ
ルトトリオースも、抗う蝕性甘味料、ヒト腸内のビフィ
ズス菌増殖因子、あるいは研究用試薬、また、保湿性が
極めて高いので有効な保湿剤などとしての用途が期待で
き、その効率的な製造方法の開発が望まれている。

従来、分岐オリゴ糖の製造方法としては、例えばイソ
マルトースの場合、マルトースまたはマルトースシラッ
プなどを原料として、アスペルギルス・ニガー（Asperg
illus niger）などのカビ起源のトランスグルコシラー
ゼ（α−グルコシダーゼ）を作用させる方法［J.H.Pazu
r and T.Ando,Methods in Carbohydrate Chemistry,Vo
l.I,319（1962），特開昭61−219345号参照］、あるい
は、50％以上の高濃度グルコース溶液にグルコアミラー
ゼを作用させて調製する方法（特開昭61−124389号，特
開昭61−219392号参照）などが採用されている。

「発明が解決しようとする課題」しかしながら、これらの方法で生成される分岐オリゴ
糖は、α−1,6−グルコシド結合からなるイソマルトー
スおよびα−1,4−グルコシド結合とα−1,6−グルコシ
ド結合からなるパノースなどが主成分であり、α−1,6
−グルコシド結合のみから構成されるイソマルトオリゴ
糖だけを生成させることは、不可能であった。

また、α−1,6−グルコシド結合を多く含むグルコー
スポリマーであるアミロペクチン、グリコーゲン、プル
ランまたはデキストランなどを原料として、酵素または
酸を用いる加水分解後、各種の分画技術、例えばゲル濾
過クロマトグラフィー、カチオン交換樹脂クロマトグラ
フィーおよびカーボンカラムクロマトグラフィーなどを
適用して調製する方法も知られている。

しかしながら、上記の方法で得られるα−1,6−グル
コシド結合のみからなるイソマルトオリゴ糖の収率は非
常に低く、かつ生産コストも高いという問題点があっ
た。

したがって、本発明の目的は、イソマルトオリゴ糖を
高純度かつ高収率で製造できるようにしたイソマルトオ
リゴ糖含有シラップおよびイソマルトオリゴ糖の製造方
法を提供することにある。

「課題を解決する手段」上記目的を達成するため、本発明のイソマルトオリゴ
糖含有シラップの製造方法は、デキストランを酸処理し
てデキストラン分子中のα−1,6−グルコシド以外の結
合を選択的に分解する工程と、この酸処理したデキスト
ラン溶液に、エンドデキストラナーゼまたは担体に固定
化したエンドデキストラナーゼを作用させて酵素反応を
行う工程とを含むことを特徴とする。

この場合、上記生成糖は、グルコース、イソマルトー
ス、イソマルトトリオースおよび高級イソマルトデキト
リンからなり、糖組成中におけるイソマルトオリゴ糖の
含有量が70％（w/w）以上であることが好ましい。

また、本発明のイソマルトオリゴ糖の製造方法は、デ
キストランを酸処理してデキストラン分子中のα−1,6
−グルコシド以外の結合を選択的に分解する工程と、こ
の酸処理したデキストラン溶液に、エンドデキストラナ
ーゼまたは担体に固定化したエンドデキストラナーゼを
作用させて酵素反応を行う工程と、この酵素糖化液を分
画用カラムまたは分画用膜に通過させる工程とを含むこ
とを特徴とする。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明において、原料として用いられるデキストラン
は、グルコースが主にα−1,6−グルコシド結合で連結
した多糖であるが、その分子中にはα−1,2−，α−1,3
−およびα−1,4−グルコシド結合も一部存在すること
が明らかにされている［R.L.Sidebotham,Adv.Carbohyd
r.Chem.Biochem.,30,371（1974）参照］。したがって、
デキストラン分子にデキストラナーゼを直接作用させた
場合には、α−1,6−グルコシド結合以外の結合箇所で
反応が停止し、せいぜい30％程度の分解率しか得られな
い。

すなわち、第１図には、0.25％濃度および2.0％濃度
の各デキストラン溶液に、糸状菌フザリウム（Fusariu
m）属起源の新規エンドデキストラナーゼ（特願平１−2
24262号参照）を直接作用させた場合における、反応時
間と分解率との関係が示されている。図中、Ａは0.25％
濃度のデキストラン溶液を用いた場合の結果であり、Ｂ
は2.0％濃度のデキストラン溶液を用いた場合の結果で
ある。このように、デキストランにエンドデキストラナ
ーゼを直接作用させた場合には、その分解率がほぼ30％
付近で停止することがわかる。

そこで、本発明者らは、鋭意検討した結果、先ず、デ
キストラン分子中のα−1,6−グルコシド以外の結合、
すなわちα−1,2−、α−1,3−およびα−1,4−グルコ
シド結合を酸処理により選択的に分解した後に、例えば
上記の糸状菌フザリウム（Fusarium）属起源の新規エン
ドデキストラナーゼを作用させることにより、グルコー
ス、イソマルトース、イソマルトトリオースおよび高級
イソマルトデキトリンからなり、糖組成中におけるイソ
マルトオリゴ糖の含有量が70％（w/w）以上である酸素
糖化液が得られることを見いだした。また、この酸素糖
化液を分画用カラムまたは分画用膜を通過させ、それぞ
れのイソマルトオリゴ糖画分を集めることにより、イソ
マルトオリゴ糖を高収率で生産できることを見いだし
た。本発明は、これらの事実に基づいてなされたもので
ある。

本発明の原料であるデキストランは、例えば「デキス
トランT2000」（商品名、ファルマシア/LKB社製）など
の市販品を使用することができる。また、デキストラン
生合成菌であるロイコノストック・メッセンテロイデス
（Leuconostoc mesenteroides）などを用いて、下記文
献記載の方法により、スクロースを炭素源として、培養
することにより調製することも可能である［E.J.Hehre.
Science,93,237（1941）,E.J.Hehre and J.Y.Sugg,J.Ex
ptl.med.,75,339（1942）,A.Jeanes et al.,J.Biol.Ch
em.,176,603（1948）参照］。

本発明においては、デキストランを酸処理してデキス
トラン分子中のα−1,6−グルコシド以外の結合を選択
的に分解する。この場合、酸としては塩酸、硫酸など各
種のものが使用できる。また、酸の濃度は0.04〜0.5Ｎ
が好ましく、さらには0.05〜0.3Ｎが好ましい。処理温
度は、90〜100℃が好ましく、95〜100℃がより好まし
い。さらに処理時間は、１〜10時間程度が好ましく、２
〜７時間がより好ましい。したがって、酸処理は、所定
の規定濃度の酸に一定濃度にデキストランを溶解し、上
記のような条件下で処理することにより行なうことがで
きる。なお、各種のα−グルコビオースを0.1Ｎ塩酸を
用いて、99.5±0.1℃で処理した場合、それぞれの結合
様式の酸分解における速度を、擬一次反応の速度定数Ｋ
で比較すると、α−1,2−，α−1,3−およびα−1,4−
グルコシド結合が、α−1,6−グルコシド結合に先立っ
て選択的に分解される［M.L.Wolfrom et al.,Cereal C
hem.,40,82（1963），千葉ら，澱粉化学，25,105（197
8）参照］。

次に、上記のようにして酸処理したデキストラン溶液
をアルカリで中和した後、エンドデキストラナーゼ（1,
6−α−Ｄ−Glucan 6−glucanohydrolase,EC 3.2.1.1
1）による酵素反応を行う。

本発明で使用するエンドデキストラナーゼは、デキス
トランを加水分解し、主としてイソマルトトリオースを
生成する酵素で、例えば糸状菌フザリウム（Fusarium）
属に属するエンドデキストラナーゼ生産菌またはその突
然変異株を培養培地に接種し、所定の培養条件下で培養
後、当該培養物から採取することができる。かかるエン
ドデキストラナーゼ生産菌としては、例えばFusarium s
p.株（特願平１−224262号参照）が好ましく採用され
る。この菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に、
微工研菌寄第10976号（FERM P−10976）として寄託され
ている。

本菌株を用いたエンドデキストラナーゼの製造は、例
えば次のようにして行うことができる。まず、1.0％デ
キストラン（各糖70）,0.3％ポリペプトン,0.3％イース
トエクストラクト、0.2％NH₄NO₃,0.05％MgSO₄・7H₂O,0.
04％CaCl₂・2H₂O,0.1％KH₂PO₄からなる培養培地（pH5.
5）３を、５のジャーファメンターに仕込み、糸状
菌Fusarium sp.の前培養液（25℃、３日間培養）100ml
を添加して、1.1vvm,110rpmにて25℃、５日間培養す
る。培養後、培養液を高速冷却連続遠心分離にかけて菌
体を除去し、無細胞上清液を得る。本上清液を限外濾過
膜で約20倍に濃縮して、粗酵素液として用いることがで
きる。

なお、デキストランを加水分解して、主としてイソマ
ルトトリオースを生成するデキストラナーゼ生産菌とし
ては、前記したフザリウム（Fusarium）属以外に、アス
ペルギルス・カルネウス（Aspergillus carneus）［D.T
suru et al.,J.Biochem.,71,653（1972）］、ブレビバ
クテリウム・フスクム（Brevibacterium fuscum var.de
xtranlyticum）［M.Sugiura et al.,Biochem.Biophys.
Acta,350,61（1974）］、フラボバクテリウム属（Flavo
bacterium sp.）［M.Kobayasi et al.,Agric.Biol.Che
m.,47,2585（1983）］などが知られており、本発明の場
合、いずれの起源の酵素でも有効に使用することができ
る。

フザリウム（Fusarium）属起源の新規エンドデキスト
ラナーゼ（特願平１−224161号）の反応条件について述
べると、反応液のpHは、好ましくは5.0〜8.0、より好ま
しくは6.0〜7.0がよい。また、反応温度は、好ましくは
25〜45℃、より好ましくは30〜40℃がよい。また、基質
であるデキストランに対するエンドデキストラナーゼの
添加量は、基質1mg当り、好ましくは0.04単位以上、よ
り好ましくは0.4単位以上とする。なお、本発明におい
て、酵素力価を示す１単位とは、最終濃度0.25％の「デ
キストランT2000」を基質とし、30℃、pH6.4で酵素反応
を行い、１分間に１μmolのグルコースに相当する還元
力を生成する酵素量を示すものとする。

また、基質として用いるデキストラン溶液の濃度は一
般に、0.1〜4.0％が好ましく、より好ましくは0.25〜2.
5％が有効である。反応時間は、上記の条件下で通常３
〜24時間である。

また、酵素反応は、デキストラン溶液に酵素液を添加
して回分式で行ってもよいが、特定の担体に固定したエ
ンドデキストラナーゼにデキストラン溶液を通液して連
続式で行うこともできる。エンドデキストラナーゼを固
定化する担体としては、例えば「ダイヤイオンHP−50」
（商品名、三菱化成工業）や、「デュオライトＳ−76
1」（商品名、ダイヤモンドシャムロック社製）や、キ
トサンビーズ（商品名「キトパール BCW 3005,3006,30
07,3505,3507」、富士紡績製）などの市販の吸着樹脂を
用いることができる。

このようにして得られた反応液中には、通常、イソマ
ルトトリオースを主体とし、その他イソマルトースなど
のα−1,6−グルコシド結合のみからなるイソマルトオ
リゴ糖が70％（w/w）以上含まれており、それ以外はグ
ルコースと高級イソマルトデキストリンとからなってい
る。また、イソマルトトリオースは、通常、50％（w/
w）以上含有されている。なお、ここで高級イソマルト
デキストリンとは、グルコースの重合度４以上のイソマ
ルトデキストリンを意味する。

この糖液は、例えば活性炭による脱色およびイオン交
換樹脂による脱イオンを行って、そのままシラップとし
て、また、還元処理して糖アルコールとして使用するこ
とができる。

さらに、必要により、ゲル濾過クロマトグラフィー、
カーボンカラムクロマトグラフィー、カチオン交換樹脂
カラムクロマトグラフィーを用いたり、または、膜分画
法や晶析法などを用いることにより、高純度のイソマル
トオリゴ糖を容易に調製することができる。

「実施例」実施例１市販デキストラン「デキストランT2000」（商品名、
ファルマシア/LKB社製）20gを0.2Ｎ塩酸320mlに溶解し
た後、沸騰水浴中（100℃）で４時間処理し、デキスト
ランを加水分解を行った。次いで、２Ｎ水酸化ナトリウ
ムを用いて中和後、蒸留水を加えて全量を400mlとし、
５％（w/v）溶液を調製して基質溶液とした。

次いで、上記基質溶液150mlに、等量の25mＭ Mcllvai
ne緩衝液（pH6.4）に溶解した前記糸状菌Fusarium sp.
起源の新規エンドデキストラナーゼ溶液（特願平１−22
4161号記載の酵素）300単位を添加し、35℃で20,40分
間、1,3,6,20時間、それぞれ反応を行った。反応液中の
生成糖組成の経時的な変化を、高速液体クロマトグラフ
ィーにより分析した結果を第２図に示す。図中、−●−
はイソマルトトリオース、−■−はイソマルトース、−
□−はグルコース、−○−は高級イソマルトデキストリ
ンのそれぞれの生成率を表わす。

第２図から明らかなように、本実験条件下では、所要
のイソマルトオリゴ糖生成に要する反応時間は３時間で
十分であり、反応３時間内に生成された糖組成を第１表
に示す。

なお、高速液体クロマトグラフィーの条件は、以下の
如くである。

カラム:Aminex HPX−42A（7.8mm×300mm）移動相：脱イオン水流速:0.6ml/min カラム圧:30kg/cm² カラム温度:70℃ 検出器：示差屈折計（（株）島津製作所製，商品名「RI
D−6A」）分岐生成糖は、デキストランの酸による部分加水分解
物を標準物質として、ペーパークロマトグラフィーおよ
び高速液体クロマトグラフィーにより構造確認を行った
ところ、すべてα−1,6−グルコシド結合からなるイソ
マルトオリゴ糖であった。

実施例２実施例１で用いた基質溶液150mlに、等量の25mＭ Mcl
lvaine緩衝液（pH6.4）に溶解した、前記糸状菌Fusariu
m sp.起源の新規エンドデキストラナーゼ溶液30単位を
添加し、35℃で24時間反応を行った。反応終了後の反応
液中の生成糖組成を実施例１と同様の方法で分析した。
得られた結果を第１表に示す。

実施例３実施例１で得られた反応液（250ml）を活性炭で脱色
後、イオン交換樹脂で脱イオンした。さらに、ロータリ
ーエバポレーターにより濃度60％（w/v）にまで濃縮し
た。次いで、ジャケット付きカラム（2.0×120cm）にカ
チオン交換樹脂「Dowex 99」（Na⁺型、ダウケミカル社
製）を充填した後、樹脂量当り5.9％（w/v）の固形分量
を負荷し、温度75℃、空間速度（SV,Space Velocity）
0.34hr^-1の条件下で分画し、それぞれのイソマルトオリ
ゴ糖画分を集めた。その際の生成糖組成を第１表に示
す。

実施例４固定化用担体として「キトパールBCW3505」（商品
名、富士紡績（株）製）を用い、25mＭ Mcllvaine緩衝
液（pH6.4）で充分に平衡化した後、担体1g（湿重量）
当り、前記糸状菌Fusarium sp.起源の新規エンドデキス
トラナーゼ（特願平１−224161号）を同上緩衝液に溶解
して1000単位添加し、室温で１時間往復振盪（120スト
ローク／分、3cm幅）して、担体に酵素を吸着させた。
その後、濾紙で濾過し、得られた固定化酵素を上記緩衝
液でタンパク質が溶出しなくなるまで洗浄した。

こうして得られた固定化酵素10mlをガラスカラム（1.
5×10cm）に充填した、次に、実施例１の場合と全く同
一条件下で調製した基質溶液に、防腐剤としてアジ化ソ
ーダを、0.02％濃度になるよう添加した。この基質溶液
を上記カラムに温度45℃、空間速度0.2〜0.3hr^-1の条件
下で連続通液した。７日間にわたる連続通液後の反応液
の糖組成を第１表に示す。また、40日間連続通液し、固
定化酵素の半減期を計算した結果、約40日であった。

上記第１表の結果から、イソマルトースおよびイソマ
ルトトリオースを合わせた量が糖組成中の70％（w/w）
以上であり、イソマルトトリオースの量は50％（w/w）
以上であることがわかる。

実施例５実施例１で調製した基質溶液70mlに等量の25mＭ Mcll
vaine緩衝液（pH6.4）に溶解した前記Fusarium sp.起源
の新規エンドデキストラナーゼ溶液140単位を添加し、3
5℃で24時間反応を行った。反応終了後、反応液を100
℃、10分間加熱処理して、酵素反応を停止した。

上記処理液を氷冷後、高速冷却遠心分離（1500×ｇ,2
0分間）にかけて不溶性物質を除去し、さらにグラスフ
ィルター（G3）を通過させることにより、透明な生成糖
溶液を調製した。次いで、全試料溶液（約140ml）をカ
ーボン−セライトカラム（5.0×50cm）にのせ、エチル
アルコールの濃度を段階的に上昇させ、１溶出分画を50
mlとして、各イソマルトオリゴ糖を分画精製した。それ
ぞれの分画中に含まれる全糖をフェノール硫酸法［M.Du
bois et．al.,Anal.Chem.,28,350（1956）参照］を用い
て、グルコース換算として定量した結果を第３図に示
す。

また、この実験の結果、イソマルトース（５％ EtOH
で溶出される画分）およびイソマルトトリオース（10％
EtOHで溶出される画分）を、それぞれ380mgおよび160
0mgの収量で得た。そして、両イソマルトオリゴ糖のカ
ーボン−セライトカラム法による回収率は、いずれも95
％以上であった。

「発明の効果」以上説明したように、本発明によれば、デキストラン
を酸処理してデキストラン分子中のα−1,6−グルコシ
ド以外の結合を選択的に分解し、この酸処理したデキス
トラン溶液に、エンドデキストラナーゼまたは担体に固
定化したエンドデキストラナーゼを作用させて酸素反応
を行うことにより、イソマルトトリオースを主体とし、
その他イソマルトースなどのα−1,6−グルコシド結合
のみからなるイソマルトオリゴ糖が70％（w/w）以上含
まれており、それ以外はグルコースと高級イソマルトデ
キストリンとからなるイソマルトオリゴ糖含有シラップ
を高収率で生産することができる。また、上記の酵素糖
化液を分画用カラムまたは分画用膜に通過させて、それ
ぞれのイソマルトオリゴ糖画分を集めることにより、精
製イソマルトオリゴ糖を高収率で得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、0.25％および2.0％デキストラン溶液を基質
としてFusarium sp.起源のエンドデキストラナーゼを作
用させた場合の分解率の経時変化を示す図である。第２図は、酸処理後の2.5％デキストラン溶液を基質と
してFusarium sp.起源のエンドデキストラナーゼを作用
させた際に得られる生成糖組成の経時変化を示す図であ
る。第３図は、本発明の実施例５で得られた酵素糖化液のカ
ーボンカラムクロマトグラフィーにおける溶出パターン
を示す図である。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】デキストランを酸処理してデキストラン分
子中のα−1,6−グルコシド以外の結合を選択的に分解
する工程と、この酸処理したデキストラン溶液に、エン
ドデキストラナーゼまたは担体に固定化したエンドデキ
ストラナーゼを作用させて酵素反応を行う工程とを含む
ことを特徴とするイソマルトオリゴ糖含有シラップの製
造方法。
【請求項２】特許請求の範囲第１項において、生成糖
が、グルコース、イソマルトース、イソマルトトリオー
スおよび高級イソマルトデキトリンからなり、糖組成中
におけるイソマルトオリゴ糖の含有量が70％（w/w）以
上であるイソマルトオリゴ糖含有シラップの製造方法。
【請求項３】デキストランを酸処理してデキストラン分
子中のα−1,6−グルコシド以外の結合を選択的に分解
する工程と、この酸処理したデキストラン溶液に、エン
ドデキストラナーゼまたは担体に固定化したエンドデキ
ストラナーゼを作用させて酵素反応を行う工程と、この
酵素糖化液を分画用カラムまたは分画用膜に通過させる
工程とを含むことを特徴とするイソマルトオリゴ糖の製
造方法。