WO1989010408A1 - Method of obtaining l-alanine - Google Patents

Method of obtaining l-alanine Download PDF

Info

Publication number
WO1989010408A1
WO1989010408A1 PCT/SU1989/000111 SU8900111W WO8910408A1 WO 1989010408 A1 WO1989010408 A1 WO 1989010408A1 SU 8900111 W SU8900111 W SU 8900111W WO 8910408 A1 WO8910408 A1 WO 8910408A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
alanine
ποd
registered
april
mutants
Prior art date
Application number
PCT/SU1989/000111
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Asmik Gevorkovna Azizian
Artur Albertovich Ambartsumian
Shavarsh Mikaelovich Kocharian
Maritsa Ananikovna Ananikian
Original Assignee
Nauchno-Issledovatelsky Tekhnologichesky Institut
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nauchno-Issledovatelsky Tekhnologichesky Institut filed Critical Nauchno-Issledovatelsky Tekhnologichesky Institut
Publication of WO1989010408A1 publication Critical patent/WO1989010408A1/ru
Priority to DK664089A priority Critical patent/DK664089A/da
Priority to FI896231A priority patent/FI896231A0/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/84—Brevibacterium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/843—Corynebacterium

Definitions

  • the invention is regarded by the microbiological industry, more precisely - by the means of obtaining amino acids, 5 or rather by the use of receiving b-eleniné ⁇ ermentation.
  • This list is multi-stage, connected with the need for radiation of pr ⁇ intermediate sh-elanins, acetyl- ⁇ b-elanin, the enzyme aminoecylase, which is conditional ⁇ zhnya- e ⁇ and ud ⁇ zhaet ⁇ cess.
  • ⁇ ⁇ sn ⁇ bu nast ⁇ yascheg ⁇ inventions ⁇ l ⁇ zhenz task pr ⁇ and use n ⁇ v ⁇ g ⁇ ⁇ ipe yutent ⁇ v mi ⁇ ganizm ⁇ v to create s ⁇ s ⁇ b ⁇ radiation b-alenine, ⁇ allowing to use the process of obtaining the target product with the achievement of 35 pm
  • mutants mi ⁇ ganism ⁇ in the form of ⁇ ge ⁇ réellec-ye-g ⁇ it G ⁇ réelle ⁇ it, depot ⁇ zez ⁇ Zi ⁇ ⁇ ais- ⁇ ais_sh ⁇ -1zz1ei ⁇ a * le1zku : ⁇ z-bghi-b ee ⁇ e-b ⁇ k ⁇ ze ⁇ ekkz ⁇ ⁇ g ⁇ - tuz ⁇ egtu ⁇ t ⁇ kg ⁇ g ⁇ réelle ⁇ t ⁇ ( ⁇ jan ⁇ ⁇ &e ⁇ e * b * ⁇ _ka), ⁇ ,11 ⁇ ⁇ - ⁇ - ⁇ , 25 ⁇ demander ⁇ **** - * , ⁇ êt ⁇ concerned ⁇ êt ⁇ , till ⁇ .1,
  • mutants of microbial species it is expedient to use mutants of microbial species in different ways.
  • mutants mi ⁇ geniz- 10 m ⁇ vide at ⁇ sit, de ni ⁇ znannye in the All-Union Scientific Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microgenisms ( ⁇ SHSHgeneti ⁇ e): shtemm So ⁇ u ⁇ e.bac- 15 registered ⁇ d number ⁇ -332 ⁇ 25 January 1985 strain ⁇ administrat ⁇ e. ⁇ as- Canal ⁇ ⁇ 1u * lat ⁇ sit ⁇ , ze-registered ⁇ d number ⁇ -3323 March 25, 1985 - the tenations are clear from the following ⁇ d ⁇ bn ⁇ g ⁇ ⁇ piseniya 20 ssp ⁇ s ⁇ be ⁇ radiation b-elanin and ⁇ n ⁇ etny ⁇ prime ⁇ v ⁇ existence of this ssp ⁇ s ⁇ be.
  • mi teki ⁇ mi ⁇ genizm ⁇ v are a strain - pr ⁇ ducent
  • mi ⁇ ganism ⁇ in ⁇ da ⁇ ge ⁇ bac-her ⁇ sha, requiring -0-alanine and stable ⁇ B,b- ⁇ -aminobutyric acid.
  • mi ⁇ -ganisms can be strains-producers of ⁇ > -alanine
  • Mutations of stability of ⁇ ⁇ »b- ⁇ * -aminobutyric acid can be either spontaneous or induced as a result of ⁇ brab ⁇ ni mi ⁇ ganism any known way.
  • Cells are lobular, slightly elongated, immobile, non-sp ⁇ bruzzu_ ⁇ schie, grammsh ⁇ l ⁇ zhitelnye. ⁇ l ⁇ ii nz meat - nept ⁇ nn ⁇ m zagare ⁇ after 48 hours in incubation ⁇ v with 5 gl ⁇ y, ⁇ vat ⁇ y ⁇ ve ⁇ n ⁇ stu, ⁇ asheny in yellow ⁇ Woolish color, reach 2 mm in diameter.
  • Strain ⁇ SS 14067 is grown in meat-peptto ⁇ nn ⁇ m bul ⁇ -
  • ⁇ z is the meat-note eege- ⁇ ⁇ ctions ⁇ s the 48th chrozybobes ⁇ ugogous, brilliant, 10, ⁇ iat in the ⁇ dozen bols; the edges are smooth, reach a diameter of 2-3 mm.
  • Optional Anzebs. ⁇ l ⁇ do not shine.
  • the gelatin is not liquefied. They squirt off glucose, se ⁇ er ⁇ zu. Assimilate ammonium az ⁇ Y urea. ⁇ ptimum ⁇ ste 15 ⁇ and 30-32° ⁇ and ⁇ 7.2-7.8.
  • Strains ⁇ 5 and ⁇ b ⁇ with their ⁇ - n ⁇ sti ⁇ B-zl znin and b-eleninpr ⁇ duziruyuschy sp ⁇ s ⁇ bn ⁇ - 20 sti) do not differ ⁇ ⁇ ditelsk ⁇ g ⁇ shtemme ⁇ ge ⁇ ⁇ bac-ye-g ⁇ Pa ⁇ sh ⁇ ⁇ SS 14067.
  • the cells are mobile, slightly elongated, 1.7-2.5 ⁇ m long, restless, immobile, gravel-friendly.
  • Cultural signs 30 Meat-pept ⁇ nn ⁇ m agar ne 2nd day ⁇ ste pr ⁇ i 30° ⁇ ⁇ brezyut ⁇ l ⁇ ni diametr ⁇ m 2 mm, ⁇ réeller ⁇ m ⁇ m ⁇ m, ⁇ , smooth, ⁇ réelleshennye yellow .
  • Gelatin does not liquefy.
  • strain ⁇ re ⁇ bac-Ler ⁇ sh ⁇ Pa ⁇ sh ⁇ ⁇ CC 14067 mutates ⁇ -methyl- ⁇ '-ni ⁇ - ⁇ -nl ⁇ z ⁇ guenidin ⁇ m and selects the mutant that needs ⁇ -alanine.
  • suspensions of these ⁇ strains are applied with a loop on the surface of the medium I. I and ⁇ 3 2 (the composition of these media is indicated above) and incubated for 40 hours at 30°C. 5
  • the appearance of ⁇ sta is indicated by the sign "+", and the absence of the sign "-”.
  • strains ⁇ , ⁇ 2, ⁇ 5, ⁇ b, ⁇ , ⁇ 4 ⁇ in contrast to the parental strains in ⁇ SS 4067 and ⁇ SS 13032, do not grow on the medium ⁇ ° I.
  • 25 liquids determine the content of -E -b -alenine (total content of b and ⁇ m alanine) by the method of paper ⁇ -me ⁇ ggra ⁇ ii and ⁇ eshivenym ningidrin ⁇ m or with the help of amino acid enelizator.
  • the content of ⁇ -alenine ⁇ - is determined with the help of the enzyme ⁇ - ⁇ sideza emin ⁇ isl ⁇ in
  • Vitamins bigin, gizmine
  • other compounds including emin ⁇ -acids, in the case if they are necessary for ⁇ ste ⁇ e ⁇ - nog ⁇ stammz-pr ⁇ ducengz.
  • Sources of carbon can be used both separately, and in combination with each other in various * - ⁇ - weight ⁇ vy ⁇ e ⁇ n ⁇ shennya ⁇ .
  • the total amount of the substance - the source of carbon must be introduced at the beginning of fermentation, or in the process of fermentation.
  • nitrogen As an assimilated source of nitrogen, it can be 5 used as both organic and non-organic salts of ammonium, for example, sulfate am m ⁇ nia, ammonium chloride, ammonium carbonate, ammonium acetate, emm ⁇ nium nitrate, ammonium ⁇ z ⁇ , la ⁇ te ⁇ emm ⁇ nia and zmm ⁇ nium; urea; ⁇ zlichnye pr and r ⁇ dnye nitrogen-containing compounds, for example, pept ⁇ n, 10 hydrolize yeast, meat extract and hydr thoroughlyzzta ⁇ ss- enabling ⁇ ⁇ v.
  • ammonium for example, sulfate am m ⁇ nia, ammonium chloride, ammonium carbonate, ammonium acetate, emm ⁇ nium nitrate, ammonium ⁇ z ⁇ , la ⁇ te ⁇ emm ⁇ nia and zmm ⁇ nium; urea; ⁇ zlichn
  • non-ferrous salts ⁇ s ⁇ e of potassium, sodium, magnesium sulphate, hydrochloric acid, salts of iron, yargentse and zinc can be used, calcium carbonate. 15
  • organic substances that are necessary for the above-mentioned mi ⁇ gizm ⁇ , thiamine, bitine or its substitutes can be used, e ⁇ zhe zmin ⁇ - acids, if ⁇ ni are necessary for ⁇ ste mi ⁇ gznizm ⁇ v.
  • the content of b-alanine in the cultural liquid is determined with the help of the method of paper ⁇ mz ⁇ grz ⁇ ii and 35 rinsing of ninhydrrin ⁇ y or with the help of amin ⁇ is l ⁇ n ⁇ g ⁇ analysis ⁇ réelle. - And -
  • the accumulated l-zlanin can be isolated from the cultural liquid by any known spoofy, as a result of the expansion of mi ⁇ genizm ⁇ s and other unparalleled ⁇ es tits centrifugation or filtirzation, eds ⁇ btsiya b-ale-
  • ⁇ ⁇ lb ⁇ s are brought in ⁇ 0.5 y ⁇ l ⁇ sevn ⁇ g ⁇ yzte ⁇ izla shtayma Bge ⁇ as-leg ⁇ it Pa ⁇ it ⁇ 2 and incubated ⁇ g ⁇ (70 ⁇ b/min) for 72 hours ⁇ at ⁇ and 30° ⁇ .
  • Example 2 10 The seed material of the strain ⁇ ge ⁇ ac-Leg ⁇ it £ ⁇ While ⁇ it ⁇ g ⁇ vyat under the conditions enzl ⁇ gic to those specified in example I.
  • ⁇ fermentation bottles with a volume of 250 ml are eseptically poured into 10 ml of sterilized bath fermentation medium of the following composition (g / l): molasses - 200 ,0 ( ⁇ sa- 15 ⁇ réelle ⁇ réelle - 100); hydrolysis of the biomass of d ⁇ zhzhey - 120.0; CeS ⁇ - 30.0, ⁇ 7.5.
  • ⁇ ⁇ lby contribute ⁇ 0.5 ml ⁇ sevn ⁇ g ⁇ materiele shtem- 30 me ⁇ are the same as those specified in example I.
  • the cells are incubated and pumped (70 rpm) in for 72 hours at 30°C.
  • the content of b-alanine in the cultural fluid obtained after completion of fermentation, 35 is 3.8 g/l.
  • the bulbs are incubated and pumped (70 rpm) for 72 hours during 30°C.
  • the content of ⁇ -alanine in the cultural 10 liquid, obtained after the fermentation is complete, is 6.4 g/l.
  • Example 7 35 Fermentation process - 17 - me-pr ⁇ ducente b-alanine use sh ⁇ zmm C ⁇ gu ⁇ eêac-ye- ⁇ sh ⁇ e ⁇ u-lat ⁇ s ⁇ t ⁇ and use the fermentation medium of the following composition (g / l): sz ⁇ ar ⁇ ze - 100.0, (b ⁇ )B ⁇ -55.0, ⁇ 2 ⁇ 0 - 3.0da ⁇ ⁇ 7 ⁇ 2 0 - 1.0; I-alanine - 0.1, 5 ⁇ eB0 ⁇ 7 ⁇ 2 0 - 0.01; ⁇ B ⁇ .5 ⁇ 2 0 - 0.01, biotin - 0.0002, thiamine b ⁇ mid - 0.00005, CaCO 3 - 50.0, ⁇ 7.5.
  • Example 8 10 The fermentation process takes place under conditions ⁇ similar to those indicated in Example I, however, the strain ⁇ gupeas-leg ⁇ um ⁇ 1u-lat ⁇ ssh ⁇ ⁇ 4 ⁇ and use a fermentation medium of the following composition (g / l) : sa ⁇ ar ⁇ ze - 100.0, 15 (W) 2 ⁇ 0 -55.0; ⁇ 2 ⁇ 0 - 3.0, ⁇ 6 80 .
  • Fermentation medium has the following composition (g/l): sa ⁇ z ⁇ ze - 120.0; ( ⁇ B ⁇ . 55.0, ⁇ 2 ⁇ 0 - 3.0; ⁇ 8 B0 .7 ⁇ 2 0 - 1.0, ⁇ -elanin - 0.1 ⁇ e80 • 7 ⁇ 2 0 - 0.0 ⁇ ; ⁇ ⁇ 8 ⁇ . 5 ⁇ 2 0 - 0.01, biotin - 0.0002, thiamines b ⁇ mid - 0.00005, CeC0 3 - 50.0, ⁇ 7.5.
  • Fermentation medium has the following composition (g/l): - 18 - sa ⁇ z ⁇ za - 120.0; ( ⁇ 4 )
  • the flasks are incubated for 72 hours at 30° ⁇ .
  • the content of ⁇ -alanine in the cultural liquid obtained after completion of fermentation is 31.4 g/l.
  • the fermentation process takes place under conditions similar to those indicated in Example 5, the strain ⁇ ge ⁇ as is introduced into the forehead as a shteyye-pr ⁇ ducente -Er ⁇ um £a ⁇ um ⁇ D ⁇ .
  • ⁇ mentation medium ieet the following ratio (g/l): sz ⁇ ar ⁇ za - 55.0; ⁇ 2 ⁇ 0 ⁇ - 3.0, ⁇ eB0 -7 ⁇ 2 0 - ⁇ .0; ⁇ -alanine - 0.1; ⁇ e80 4 • 7H 2 0 - 0.01; ⁇ _ ⁇ 80 .5 ⁇ 2 0 - 0.01, biotin - 0.0002; thianinz b ⁇ mid - 0.00005, Ce ⁇ - 50.0 ⁇ 7.5.
  • the fermentation process takes place under conditions that are energetically specific in prion 5.
  • Fermentation medium has the following composition (g/l): se ⁇ er ⁇ ze - 150.0; ) 2 B0 - 55.0; ⁇ - - 3.0; N 6 20 4 -7 ⁇ 2 0 - 1.0; ⁇ -alanine - 0. ⁇ * eB -7 ⁇ 2 0-0.0 ⁇ ⁇ - ⁇ g ⁇ B ⁇ .5 ⁇ 2 0 - 0.0; biotin - 0.0002; thiamine b ⁇ -mid - 0.00005; CeC0 3 - 50.0: ⁇ H 7.5.
  • the fermentation process takes place under conditions ⁇ similar to those indicated in Example 5.
  • Example 5 The 25 logical ones are listed in Example 5.
  • the fermentation medium has the following composition (g/l): se ⁇ e ⁇ zz- ⁇ 50.0; B-elznin - 0.1; 0.01; biotin - 0.0002; - 50.0
  • the flasks are incubated for 96 hours at 30°C.
  • the claimed invention will find application in medicine, in the chemical, food and tobacco industries.

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Figure imgf000003_0001
СП0С0Б ПΟЛУЧΕΗИЯ ъ -ΑЛΑΗИΗΑ
Οбласτь τеχниκи
Изοбρеτение οτнοсиτся κ миκροбиοлοгичесκοй προмыш- леннοсτи, κοнκρеτнее - κ сποсοбам ποлучения аминοκислοτ, 5 а τοчнее κ сποсοбу ποлучения ь -элэнинэ φеρменτэцией.
Пρедшесτвующий уροвень τеχниκи
Извесτны сποсοбы ποлучения Ь -аланина τρансφορма- цией из зсπаρагинοвοй κислοτы с ποмοщью иммοбилизοвэнныχ κлеτοκ миκροορганизмοв, οбладающиχ β -деκаρбοκсилазнοй
10 аκτивнοсτью ( Τ Α, 3898128).
Τаκие извесτные сποсοбы мнοгοсτэдийны, чτο связанο с неοбχοдимοсτью ποлучения, наπρимеρ, нз πеρвοй сτадии сποсοбэ ъ -асπэρагинοвοй κислοτы из ' φумаρаτэ аммοния τρансφορмацией с ποмοщью асπаρτазы, а на вτοροй сτадии
15 сποсοба - τρэнсφορмации ποлученнοй ь -асπзρагинοвοй κислοτы в ъ -аланин с ποмοщью ъ -зсπзρτэτ-^-деκзρбο- κсилазы. ,
Τοкуο, I. СΙιιЪаΙза, Τ. Τοва, Τ. Κак_шο1;ο "Α1аш_ηе",ρ.224- 232).
20 Извесτен сποсοб выделения ь -аналина из ρацеми- чесκοй смеси, πρи κοτοροмΕ»ϊ* -алэнин ποдвеρгэюτ ацеτи- лиροванию, а заτем с ποмοщыο φеρменτа аминοацилазы из- биρаτельнο гидροлизуюτ ацеτил- Ъ-элэнин, ποлучэя Ь-элэ- нин. Пοсле чегο οсущесτвляюτ οτделение ь -аланина οτ
25 эцеτил- Б-злзнинэ (ϋЗ, Α, 3386888).
Уκазанный сποсοб являеτся мнοгοсτэдийным, связзн с неοбχοдимοсτью ποлучения προмежуτοчныχ ш--эланинз, ацеτил- ϋь-эланинэ, φеρменτа аминοэцилэзы, чτο услοжня- еτ и удοροжаеτ προцесс.
30 Ρасκρыτие изοбρеτения
Β οснοву насτοящегο изοбρеτения ποлοженз задача πρи исποльзοвании нοвοгο τиπэ ыуτэнτοв миκροορганизмοв сοздаτь сποсοб ποлучения ъ-алэнинэ, ποзвοляющий уπροс- τиτь προцесс ποлучения целевοгο προдуκτа с дοсτижением 35 προмышленнο πρиемлемοгο выχοдэ целевοгο προдуκτэ в
Figure imgf000004_0001
- 2 - κульτуρаяьнοй жидκοсτи.
Эτа задача ρешаеτся τем, чτο в сποсοбе ποлучения Ι# -аланина, οсущесτвляемοм πуτем κульτивиροвания миκρο- ορгаюιзмοв ροдοв ΒгеνιЬасЬегΙит и СοгуηеЪасЪегз-ϊшι на πиτаτельнοй сρеде, сοдеρжащеκ уевοяемые иеτοчниκи уг- леροда, азοτа, неορганичесκие сοли и ορганичесκие сοе- динения, сτимулиρующие ροсτ миκροορганизмοв, дο наκοπ- ления Ь -аланина в κульτуρальнοй жидκοсτи и ποследуιο- 0 щегο выделения целевοгο προдуκτа, сοгласнο заявляемοму изοбρеτению, в κачесτве миκροορганизмοв исποльзуюτ муτан- τы миκροορганизмοв ροдοв ΒгеνΙЪас-Ьегϊит и СοгуηеЪас- •Ьегχши , нуждающиеся для ροсτа в Ι> -аланине. Благοдаρя заявляемοму изοбρеτению сτалο вοзмοжнο
15 πο.ιучаτь οπτичесκи чисτый Ъ -аланин в κульτуρальнοй жидκοсτи, исκлючая ρанее неοбχοдимые сτадии, связанные с выделением ϊ> -аланина из ρацемичесκοй смеси, цρи эτοм сοдеρжание целевοгο προдуκτа в κульτуρашьнοй жидκοсτи дοсτигаеτ 28 г/л.
20 Β сοοτвеτсτвии с заявляемым изοбρеτением целесοοб- ρазнο исποльзοваτь муτанτы миκροορганизмοв вида ΒгеνΙЬас-Ье- гιит Гϊаνит , деποниροванные вο ΥзезοЗиζη ηаисЬ- ηаис_шο-1зз1ейονа*Ье1зку :Ιηз-ЬгЬи-Ь ееηе-Ьιк χ зеΙекЬзϋ ρгο- тузωегтуΜι тιкгοοгβаηϊζтον (νнΤΕ&еηе*Ь*ι_ка) ,ϋΒБΕ,11 ~ ~-\-~, 25 Μοзсο****-*, БοгοζЪιιу ρгοеζсΙ,сΙ.1,
Βсесοюзнοм научнο-исследοваτельсκοм инсτиτуτе генеτиκи и селеκции προмыπιленныχ миκροορганизмοв (ΒШИгенеτиκа) шτаιлм ΒгеνχЪаσЬегχит £1аνит ΑΑΙ, заρегисτρиροваκ- ный ποд нοмеροм Β-306Ι 05 аπρеля 1984 гοда; шτамм 30 ΒгеνχЪасЪегχит _0.ауи ΑΑ2, заρегисτρиροванный ποд нοмеροм Β-3062 05 аπρеля 1984 гοда.
Для ποследующегο увеличения сοдеρжания целевοгο προдуκτа в κульτуρальнοй жидκοсτи (дοсτигающегο 44 г/л) целесοοбρазнο, сοгласнο заявляемοму изοбρеτению, исποль- 35 зοваτь муτанτы миκροορганизмοв ροда ΒгеνχЪаσЬегχит, усτοйчивые κБ,Ь-οС -аϊνшκοмаслянοй κислοτе.
Β сοοτвеτсτвии с насτοящим изοбρеτением целесοοб- ρазнο исποльзοваτь муτанτы миκροορганизмοв вида.
Figure imgf000005_0001
- 3 -
Β-СеνχЪас-Ьегχшα £1аνит } деποниροвзнные вο Βсесοюзнοм нэучнο-исследοвэτельсκοм инсτиτуτе генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκρορρганизмοв (ΒΗΜкгенеτиκэ): шτэмм ΒгеνχЪас-Ьегϊит Гϊаνшп ΑΔ5, зэρеги- 5 сτρиροвэнный ποд нοмеροм Β-399Ι 01 аπρеля 1987 гοда; шτэмм ΒгеνχЪас-Ьегχша £1аνит ΑΑб, зэρеги- сτρиροвэнный ποд нοмеροм Β-3992 01 аπρеля 1987 гοда.
Κροме τοгο, целесοοбρазнο, в сοοτвеτсτвии с заяв- ляемым изοбρеτением, исποльзοваτь муτэнτы миκροορгэниз- 10 мοв видэ СοгуηеЪас-Ьегχит еΙи-Ьатχсит , де ниροвзнные вο Βсесοюзнοм нэучнο-исследοвэτельсκοм инсτи τуτе генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκροορгэнизмοв (ΒШШгенеτиκэ): шτэмм Сοχуηе.Ъас-Ьегχит βΙи-Ьатχсит ΑΑ Ι, зэ- 15 ρегисτρиροвэнный ποд нοмеροы Β-332Ι 25 ыаρτз 1985 гοда шτамм Сόχуηе.Ъас-Ьегχшη §1и*Ьатχсит ΑΑΙΙ, зэ- ρегисτρиροвэнный ποд нοмеροм Β-3323 25 маρτэ 1985 гοда Дальнейшие цели и πρеимущесτва заявляемοгο изοбρе- τения сτэнуτ ясны из ποследушщегο ποдροбнοгο οπисэния 20 сποсοбэ ποлучения ъ -эланина и κοнκρеτныχ πρимеροв οсущесτвления эτοгο сποсοбэ.
Лучший вэρиэнτ οсущесτвления изοбρеτения
Пρедлэгэемый в зэявляемοм изοбρеτении сποсοб ποлу- чения ь-эланинэ οснοвывзеτся нэ исποльзοвэнии миκροορ- 25 гэнизмοв - προдуценτοв ъ -элзнина, κулыивиρуемыχ в πи- τаτельнοй сρеде.
Пρедлэгаеτся исποльзοвание муτанτοв миκροορганиз- мοв ροдοв ΒгеνχЪаσЬегχιдт и СοгуηеЪас*Ьегχша , нуждающиχся для ροсτэ в ])-элэнине. Κοнκρеτными πρимеρэ- 30 ми τэκиχ миκροορгэнизмοв являюτся шτэмм - προдуценτ
Ь-элэнинэ ΒгеνχЪас-Ьегχшα £ϊаνит ΑΑΙ, деποни- ροвэнный вο Βсесοюзнοм нзучнο-исследοваτельсκοм инсτиτу- τе генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκροορганизмοв (ΒΗЙйгенеτиκэ) и ззρегисτρиροвэнный ποд нοмеροм Β-306Ι 35 05 эπρеля 1984 гοдэ, шτэмм - προдуценτ Ъ -аланинэ ΒгеνχЪас-егχшη ϊаνшη - -
ΑΑ2, деποниροванный вο Βсесοюзнοы научнο- иселедοваτельсκοм инсτиτуτе генеτиκи и селеκции προмыш- ленныχ миκροορгзнизмοв (ΒΗйИгенеτиκи) и заρегисτρиροван ный ποд нοмеροм Β-3062 05 аπρеля 1984 гοда; 5 щτэнм-προдуценτ Ь-эланина СοгуиеЪас-Ьегϊит еΙи-Ьатϊсшι ΑΑ4-Ι, деποниροванный вο Βсесοюзнοм научнο- исследοваτельсκοм инсшиτуτе генеτиκи и селеκции προмыш- ленныχ минροορганизмοв (ΒΗИИгенеτиκа) и заρегисτρиροван ный ποд нοмеροм Β-332Ι 25 маρτа 1985 гοдэ,
10 и шτамм-προдуценτ Ь-элэнинэ СοιуηеЪас-ЬегΙшιι 8ϊи*атϊсшιι ΑΑΙΙ, деποниροванный вο Βсесοюзнοм научнο-исследοваτельсκοм инсτиτуτе генеτиκи и αзлеκции προмышленныχ миκροορгэнизнοв (ΒΗИйгенеτиκа) и заρегисτ- ρиροвзнный ποд нοмеροм Β-3323 25 маρτа 1985 гοда.
15 Сοгласнο заявляемοму изοбρеτению, πρедлагаеτся τаκже исποльзοвание муτанτοв миκροορганизмοв ροда ΒгеνϊЪас-ЬегΙша , нуждающиχся в -0 -аланине и усгοйчивыχ κ Б,ь-^-аминοмаслянοй κислοτе. Пρимеρами τаκиχ миκροορ- ганизмοв мοгуτ служиτь шτаммы-προдуценτы ~> -аланина
20 ΒгеνϊЪас егϊит £1аνит ΑΑ5 или ΒгеνϊЪас-ЬегΙιшι £1аνша ΔΑБ, деποниροванные БΟ Βсесοюзнοм научнο- исследοваτельсκοм инсτиτуτе генеτиκи и селеκции προмыш- ленныχ миκροορганизмοв (ΒΗйИгенеτиκа) и заρегисτρиροван ные сοοτвеτсτвеннο ποд нοмеρами Β-399Ι, Β-3992 01 аπ-
25 ρеля 1987 гοда.
Μуτации ауκсοτροφнοсτи πο Β -аланину нοгуτ быτь индуциροιаны в ρезульτаτе οбρабοτκи миκροορганизмοв любым извесτным сποсοбοм (нэπρимеρ, οбρзбοτκοй Ν -ме- τил- Ν' -нигρο-Ν-ниτροзοгуанидинοм или ульτρаφиοлеτοвым
30 οблучением). Μуτации усτοйчивοсτи κ Β»ь-^* -аминοмасля- нοй κислοτе мοгуг быτь либο сποнτзнными, либο индуци- ροванными в ρезульτаге οбρабοτни миκροορганизмοв любым извесτным сποсοбοκ. Сοзмещенκе в генοме миκροορганизмοв муτации усτοйчивοсτи κ в^Ь-^эминοмэслянοй κислοτе и
35 мугации аунсοτροφнοсτи πο ъ -аланину мοжеτ быгь οсу- щесгвленο в любοй ποследοваτельнοсτи.
Figure imgf000007_0001
Β κачесτве ροдиτельсκиχ шτаммοв для селеκции муτан- τοв, нуждающиχся вБ -аланине, ыοгуτ быτь исποльзοваны любые πρиροдные миκροορганизмы или муτанτы миκροορганиз- мοв, προдуциρующие алэнин в виде ρацемэτз. Уκэзанные вы- 5 ше нοвыθ шτаммы ΒгеνιЬас-ЬегΙит 1аνшп ΑΑΙ, ΒгеνχЪас-Ъегχит 1аνит ΑΑ2, ΒгеνχЪасЬегχит
£1аνит ΑΑб и ΒгеνχЪас-Ъегχит £1аνит ΑΑ5 ποлучены генеτиκο-селеκциοнными πρиемами из шτамма ΒгеνχЪас-Ъегχит £1аνит ΑΤСС 14067, χρаня-
10 щегοся вο Βсесοюзнοм научнο-исследοваτельсκοм инсτиτуτе генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκροορганизмοв (ΒΗИИге неτиκа) и заρегисτρиροваннοгο ποд нοмеροм Β-42 16 ян- ввρя 1969 гοда. Уκэзэнные выше нοвые шτэммы θοг-уηеЪаσЪе- гχит βΙи-Ьатϊсит ΔΑ4Ι и Сοι-уηеЪас-Ъегχит
15 еΙи-Ьатϊсшα ΔΔΙΙ ποлучены генеτиκο-селеκциοнными πρиемами из шиροκο извесτнοгο шτэмма θοгуηеЪас егχит §1и-Ъатχсит ΔΙ СС 13032, χρанящегοся вο Βсе- сοгознοм научнο-исследοвэτельсκοм инсτиτуτе генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκροορганизмοв (ΒΗИИгенеτиκэ) и
20 зэρегисτρиροваннοгο ποд нοмеροм Β-4Ι 16 янвэρя 1969 гοда.
Οднэκο, в κэчесτве ροдиτельсκиχ шτаммοв для селеκ- ции названныχ в зэявляемοм изοбρеτении минροορгэнизмοв или πρедлэгаемοгο τиπа муτанτοв, нуждающиχся в -~ -зла-
25 нине и, вοзмοжнο, усτοйчивыχ κ Β,ь-<^.-аминοмэслянοй κис- лοге, мοгуτ быτь исποльзοваны любые шτаммы миκροορганиз- мοв, οτнοсящиеся κ ροду ΒгеνχЪас-Ъегχшη ИЛи κ ροду СοгуηеЪас-Ъегχит.
Шгаммы ΑΔΙ, ΑΔ2, ΔΑ4Ι, ΑΑΙΙ πο свοим χаρаκτеρисτи-
30 κэм (κροме ауκсοτροφнοсτи πο Ι> -элэнину и Ь -эланинπρο- дуциρующей сποсοбнοсτи) не οτличаюτся οτ ροдиτельсκиχ ШΤЭΜΜΟΒ ΒгеνΙЪас-Ьегχшα £1аνιш ΑΤСС 14067 и σοгУ~ ηеЪас-Ьегχит еΙи-Ьатχсит ΑΤСС 13032, сοοгвеτ- сτвеннο.
35 Пρедлагаемые шτаммы-προдуценτы Ь -алэнинэ ΒгеνχЪас- •Ьегχит £1аνшη ΑΑΙ и ΒгеνχЪас-Ьегχит 1аνшη ΑΑ2 имеюτ следующие мορφο'лοгο-κульτуρэльные
Figure imgf000008_0001
- 6 - и φизиοлοгο-биοχимичесκие πρизнаκи.
Κлеτκи οвальные, слегκа выτянуτые, неποдвижные, несποροοбρззу_οщие,гρамшιοлοжиτельные. Κοлοнии нз мясο- πеπτοннοм згаρе ποсле 48 часοв инκубиροвания κρуглыв с 5 глэдκοй, ρеже шеροχοваτοй ποвеρχнοсτью, οκρашены в жел- τοваτый цвеτ, дοсτигаюτ в диамеτρе 2 мм.
Φаκульτаτивные анаэροбы. Ιелэτину не ρазжижаюτ. Сбρаживзюτ глюκοзу, саχэροзу. Αссимилиρуюτ амнοнийный азοτ. Οπτимуы ροсτа πρи 30-32°С и ρΗ 7,2-7,8. Для ροсτэ
10 нэ минимзльныχ сρедзχ нуждзюτся в биοτине и τиамине. Пοлучение шτзнма ΒгеνχЪас-Ъегχит £1аνит ΑΑΙ И шϊаммз ΒгеνχЪаσЬегχπт 1аνшη ΑΑ2 οсу- щесτвляюτ следующим οбρазοм:
Шτамм ΑΤСС 14067 выρащивэюτ в мясο-πеπτοннοм бульο-
15 не πρи 30°С с аэρацией дο дοсτижения τиτρа 10° κлеτοκ/мл Κлеτκи οτмываюτ οτ мясο-πеπτοннοгο бульοна ценτρиφугиρο- вэнием и ρесусπендиρуюτ в циτρзτнοм буφеρе (ρΗ 5,5). Κ ποлученнοй сусπензии дοбэвляюτ Ν -меτил- Ν*-ниτρο--Η -ниг- ροзοгузнидин дο κοнечнοй нοнценτρации 300 мнг/мл, инну-
20 биρуюτ с аэρацией в τечение 20 минуτ πρи 30°С. Заτем κлеτκи οτмываюτ οτ муτагенэ οχлэжденным мясο-πеπτοнным бульοнοм, πеρенοсяτ в προбиρκκ с 10 мл мясο-πеπτοннοгο бульοнз, инκубиρуюτ с аэρэцией 18 чзсοв πρи 30°С и зз- τем высеивзюτ нз ποвеρχнοсτь сρеды мясο-πеπτοннοгο
25 бульοнз, сοдеρжэщей 2 вес. згэρ-згзρз. Κοлοнии, выροс- шие нэ эτοй сρеде чеρез 48 часοв инκубэции πρи 30°С, προвеρяюτ меτοдοм οгπечэτκοв на сποсοбнοсτь κ ροсτу на двуχ сρедзχ следующегο сοсτзва. Сρеда I (мг/мл): глюκο-
чзеτся οτ сρеды I τем, чτο οн сοдеρжиτ 100 мκг/мл Б-аланина. Μуτанτы ΒгеνχЪасЪегχит £1аνша ΑΑΙ
35 и ΒгеνχЪас-Ъегχшη £1аνит ΔΑ2 οτбиρаюτ сρеди κοлοний, не сποсοбныχ κ ροсτу чеρез 48 часοв инκубации - 7 - πρи 30°С нз сρеде I и выρасτающиχ нэ сρеде 2. Пρедлэгаемые шτзммы-προдуценτы 1> -злзнинэ ΟοгуηеЪасЬегΙша еΙиатχсшη ΑΑ4Ι и
СοгуηеЪасЪегχшη дΙи-Ьатχсит ΑΑΙΙ имеюτ следую- 5 щие мορφοлοгο-κульτуρальные и φизиοлοгο-биοχимичесκие πρизнаκи:
Κдешκи οвэльные, κοροτκие, не οбρэзуюτ сπορ. Пο Гρэму οκρашивэюτся ποлοжиτельнο. Ηз мясο-πеπτοннοм эгэ- ρе κοлοнии ποсле 48 чзсοв инκубиροвэния κρуглые, блесτя- 10 щие, οκρашены в κρемοвый цвеτ; κρая гладκие, дοсτигаюτ в диамеτρе 2-3 мм.
Φаκульτэτивные анзэροбы. Μοлοκο не свеρτывэюτ. Желзτину не ρэзжижэюτ. Сбρзживэюτ глюκοзу, сэχэροзу. Αссимилиρуюτ аммοнийный азοτ Й мοчевину. Οπτимум ροсτэ 15 πρи 30-32°С и ρΗ 7,2-7,8.
Для ροсτз на минимэльныχ сρедэχ нуждзюτся в τизмине. Шτаммы ΑΑ5 и ΑΑб πο свοим χзρэκτеρисτиκзм (κροме усτοйчивοсτи κ в^ъ-^-эминοмзслянοй κислοτе, эуκсοτροφ- нοсτи πο Б -злзнину и Ъ -элэнинπροдуциρующем сποсοбнο- 20 сτи) не οτличэюτся οτ ροдиτельсκοгο шτэммэ ΒгеνχЪас-Ье-гχ Паνшη ΔΤСС 14067.
Пρедлэгэемые шτэммы-προдуценτы Ь -элэнина ΒгеνχЪас- •Ьегχша £1аνшη . ΑΑ5 и ΒгеνχЪас-Ьегχиш __.1аνит ΑΑб имеюτ следующую κудьτуρэльнο-мορφοлοгичесκую χаρэκτеρис- 25 τиκу.
Μορφοлοгичесκие πρизнзκи.
Κлеτκи οвзльные, слегκэ выτянуτые, длинοй 1,7-2,5 мκм, бессποροвые, неποдвижные, гρашποлοжиτельные. Κульτуρэльные πρизнаκи. 30 Ηа мясο-πеπτοннοм агаρе нэ 2-е суτκи ροсτэ πρи 30°С οбρэзуюτ κοлοнии диэмеτροм 2 мм, κρуглые, глэдκие, οκρэшенные в желτοвзτый цвеτ.
Шτρиχ нэ мясο-πеπτοннοм эгаρе. Ηа 2-е суτκи ροсτ умеρенный, κρзй гладκий, ποвеρχнοсτь блесτящзя, πлοτ- 35 ная, цвеτ желτοвэτο-κρемοвый.
Ροсτ πο уκοлу в мясο-πеπτοннοы згэρе. Уωеρенный в - 8 - οснοвнοм на ποвеρχнοсτи сρеды.
Μинеρальная сρеда Глοвеρз с глюнοзοй. Для ροсτа неοбχοдии биοτин, τизмин и в -аланин. Ηа 2-е суτκи ροс- τа πρи 30°С οбρэзуюτ κοлοнии диамеτροм I мм, цвеτ свеτ- 5 лο-κρемοвый. Ροсτ шτρиχз на 2-е суτκи умеρенный, πлοτ- ный, цвеτ свеτлο-κρемοвый.
Ηа κаρτοφеле ρэсτуτ и οбρазуюτ πигменτ с желτым οττенκοм.
Желэτину не ρэзжижаеτ.
10 Οτнοшение н исτοчниκам углеροда. Οбρаживаюτ глюнο- зу, сэχаροзу, маннοзу, φρуκτοзу, малыοзу; слабее га- лаκτοзу, ρамнοзу, сορбοзу, сορбиτ, аммοнийную и наτρие- вую сοли уκсуснοй κислοτы, эτилοвый сπиρτ, не сбρажива- юτ лэκτοзу.
15 Οτнοшение κ исτοчниκэм азοτа. Αссимилиρуюτ сеρнο- κислый и χлορисτый зммοний, мοчевину..
Οπτимум ροсτэ πρи 30-32°С и ρΗ 7,2-7,8. Пοлучение шτэммз ΒгеνϊЪас-Ьегϊит £1аνит ΔΑ5 οсущесτвляюτ следующим οбρэзοм.
20 Шτзмм ΒгеνϊЪас-ЬегΙша £1аνит ΑΤСС 14067 вы- ρэщиваюτ в мясο-πеπτοннοм бульοне πρи 30°С с аэρзцией дο дοсτижения τиτρа 10 κлеτοκ/мл. Κлеτκи οτмывэюτ οτ мясο-πеπτοннοгο бульοнэ ценτρиφугиροвэнием и ρесусπен- диρуюτ в ниτρэτнοм буφеρе ρΗ 5,5. Κ ποлученнοй сусπен-
25 зии дοбэвляюτ κ -меτил-н '-ниτρο-Ν-ниτροзοгуэнидин дο κοнечнοй κοнценτρации 300 мκг/мл и инκубиρуюτ с аэρа- цией в τечение 20 минуг πρи 30°С. Заτем κлеτκи οτмы- ваюτ οτ муτагена οχлажденным мясο-πеπτοнным бульοнοм, πеρенοсяτ в προбиρκи с 10 мл мясο-πеπτοннοгο бульοна,
30 инκубиρуюτ 18 часοв πρи 30°С и заτем высеиваюτ на πο- веρχнοсτь сρеды Ш I сοсτэвэ (мг/мл): глюκοзэ - 20, ΝЗΟ^- 2, Κ2ΗΡ0 - I, ΝΗ^СΙ - З^Ϊ ^- Ι^ΒΟ^ΤΗ^Ο - Ο^Ι.ΜηБΟ^ χ5Η20 - ΙχЮ"" ,ΡеΒ0 χ7Η20 - ΙχΙΟ"4, биοτин- - 5-10 , τизминэ χлορид - ΙχΙΟ""^, згэρ-згэρ - 20,
35 Б,ь-^-зминοмаслιянзянислοτэ - 30, ρΗ 7,4. Κοлοнии, вы- ροсшие нз эτοй сρеде Чι I чеρез 4-5 суτοн инκубации πρи - 9 -
30°С , ρасчищаюτ и пροвеρяюτ иχ аланинπροдуциρующую сπο- сοбнοсτь. Οдин из οτοбρзнныχ τаκим οбρазοм муτанτοв, лρο дуциρующий ποвышенные κοличесτвэΕ»ь -аланина , внοвь ποд веρгаюτ муτагенезу н -меτил-Ι -ниτρο-Ν -ниτροзοгуаниди- 5 нοм и οτбиρаюτ муτанτы , нуждающиеся для ροсτа в -ала- нине. Щτамм ΒгеνχЪас-Ьегχшη Гϊаνшι ΑΔ5, προдуциρующий ъ -аланин , являеτся οдним из οτοбρанныχ τаκим οбρэзοм муτанτοв.
Пοлучение шτэммэ ΒгеνχЪаσЬегχит „Сϊаνит ΑΑб 10 οсущесτвляюτ следующим οбρазοм.
Шτамм ΒгеνχЪас-Ьегϊшη Паνшη ΑΤСС 14067 му- τагенизиρуюτ Ν -меτил-Ν'-ниτρο- Ν -нлτροзοгуэнидинοм и οτбиρаюτ муτанτ, нуждающийся в в -аланине . Пοлученный муτанτ, нуждзющийся в Ό -аланине для ροсτз , внοвь ποд- 15 веρгаюг муτагенезу Ν -меτил- Ν^-ниτρο- Ν-ниτροзοгуаниди- нοм и οτбиρаюτ муτэнτы , усτοйчивые κ Б,ъ- ,-аминοмэсля- нοй κислοτе , аналοгичнο уκазаннοму πρи ποлучении шτамма ΒгеνχЪаσЬегχшη χ'ϊаνшη ΑΑ5, οднаκο, в сοсτав сρеды Νз I внοсяτ τаκже Ъ -аланин в κοнценτρации 20 0, 1 мг/мл. Οдин из οτοбρанныχ τаκим οбρазοм муτанτοв, προдуциρующиχ ποвышение κοличесτва ь -аланина , οбοзначен ΒгеνχЪаσЬегχшη Гϊаνша ΑΑб.
Шτаммы СοιуηеЪас-Ьегχиш ёΙиЬатχсит ΑΑΙΙ И
СοгуηеЪаσЬегχит §ζ1и*Ьатχсит ΔΑ4Ι ποлучэюτ из шτамма 25 СοгуηеЪас-Ьегχша ёΙи-Ьε χϊит ΑΤСС 13032 селеκциοнными πρие- мэми, энэлοгичными уκэзанным выше для ποлучения шτаммοв ΒгеνχЪаσЬегχит £1аνит ΑΑΙ И ΒгеνχЪаσЬегχшη
Гϊаνшη ΑΑ2 из шτэммэ ΒгеνχЪас-Ьегχша Гϊаνшη
ΑΤСС 14067. 30 Οτличиτельные πρизнаκи πρедлагэемыχ шτаммοв в сρав- нении с сοοτвеτсτвующими ροдиτельсκими шτзммами ΒгеνχЪас- •Ьегχшη £1аνшη ΑΤСС 14067 и СοгуηеЪаσЬе- гχшη §1и-Ьатχсшιι ΑΤСС 13032 πρивοдяτся в нижеследую- щей τаблице :
Figure imgf000012_0001
ΒгеνϊЪасΙ. егд.ит. ϊϊаνит
ΑΤСС 14067
ΒгеνΙЪас-Ьегιшп Гϊаνшη
ΑΑΙ + ΒгеνιЪас1**ег:шт Гϊаνшп
ΑΑ2 + ΒгеνϊЪас-Ьегιιшι _С1аνшη
ДΑ5 + + ΒгеνιЪас-Ьеηша ϊ-ϊаνит
ΑΑб + + СοгуηеЪас1;егιшα βΙи-Ьатιсит
ΑΤСС 13032 + СοгуηеЪас*Ьегϊшα βΙи-ЬатΙсша
ΑΑΙΙ + СοгуηеЪас-Ьегιит βΙи'Ьатϊсит
ΑΑ4Ι
Figure imgf000013_0001
- II -
Для οπρеделения ποτρебнοсτи в ο -аланине для ροсτэ у шτэммοв, уκазанныχ в τэблице, сусπензии эτиχ шτэммοв нанοсяτ πеτлей на ποвеρχнοсτь сρед И. I и ϋ32 (сοсτав эτиχ сρед уκазан выше) и инκубиρуюτ 40 часοв πρи 30°С. 5 Пοявление ροсτа οбοзначенο знаκοьι "+", э οτсуτсτвие зна- κοм "-".
Шτэммы ΑΔΙ, ΑΑ2, ΑΔ5, ΑΑб, ΔΑΙΙ, ΑΑ4Ι, в οτличие οτ ροдиτельсκиχ шτамыοв ΑΤСС 4067 и ΑΤСС 13032, не ρасτуτ на сρеде Ν° I.
10 Шτаммы ΑΑ5 и ΑΑ6 в οτличие οτ οсτальныχ шτаммοв, -уκэззнныχ в τаблице, сποсοбны κ ροсτу на сρеде, сοсτав κοτοροй аналοгичен сοсτаву сρеды Κ? 2, с τем οτличием, чτο в ней сοдеρжиτся τэκже 30 мг/мл >,ь-^-зминοмаслянοй κислοτы.
15 Для οπρеделения сποсοбнοсτи шτэммοв синτезиροвэτь Б и Ь-сτеρеοизοмеρы алэнина сусπензии эτиχ шτэммοв внοсяτ в προбиρκи, сοдеρжэщие 5 мл προсτеρилизοвэннοй сρеды следующегο сοсτавэ (г/л): глюκοзэ - 50,0, (Ш )2εο - 30,0, Η2Ρ0 - 3,0, Μб20χ7Η20 - 1,0 -ϋ-элз-
20 нин - 0,1, Ρ<εθ47Η20 - 0,ΟΙ,Μη804χ5Η20 - 0,01, биοτин - 0,0002, τиамина бροмид - 0,00005, СаС03 - 30,0 с τаκим ρасчеτοм, чτοбы κοнценτρация миκροορганизмοв была 10 κлеτοκ/мл. Пροбиρκи инκубиρуюτ πρи ποκачивании в τечение 4-0 чэсοв πρи 30°С. Б ποлученнοй κульгуρальнοй
25 жидκοсτи οπρеделяюτ сοдеρжэние -Э -Ъ -алэнина (суммаρнοе сοдеρжэние ъ и ъ φορм аланина) меτοдοм бумажнοй χρο- мэτοгρаφии и οκρэшивэнием нингидρинοм или с ποмοщью аминοκислοτнοгο энэлизаτορа. Сοдеρжание ϋ -алэнинэ οπ- ρеделяюτ с ποмοщью φеρменτз ϋ -οκсидэзы эминοκислοτ в
30 ρеэκциοннοй смеси κοнечнοгο οбъемэ 0,4 ыл, сοдеρжэщей: 8 миллиединиц οκсидззы -~ -эминοκислοτ из свиныχ ποчеκ, 0,2 мл исπыτуемοгο ρэсτвορз с сοдеρжзнием ϋ -эланинэ 0,1-5,0 мΜ, 33 мΜ πиροφοсφаτнοгο буφеρа, ρΗ 8,3. Ρеэκ- цию προвοдяτ πρи 37°С дο дοсτижения ρавнοвесия, πρи κο-
35 τοροм 93-95 Ε -алэнина πρевρащэеτся в πиρувэτ. Οбρэ- зοвэвшийся πиρувэτ οπρеделяюτ сπеκτροφοτοмеτρичесκи πρи - 12 - длине вοлны 440 нм. Заτем нз οснοвании измеρенныχ веди- чин суммзρнοгο сοдеρжэния Б,Ь -алзнинэ и -~ -алэнинэ вы- числяюτ προценτнοе сοοгнοшение ϊ> и - ο м алзнина в κульгуρадьныχ жидκοсгяχ. 5 Пοлученные данные πρиведены в вышеуκазэннοй габлице.
Из τаблицы следуеτ, чτο шгаммы ΑΔГ, ΑΑ2, ΔΑ5, ΔΑ6, ΔΑΙΙ, ΑΑ4Ι в οгличие οг шτамиοз ΑΤСС 14067 и ΑΤСС 13032 не сποсοбны προдуциροваτь в -аланин.
Пοсевнοй маτеρиал шτзммοв-προдуценτοв для ποследую-
10 щей φеρменгации мοжеτ быτь πρигοτοвлен любым извесτным сποсοбοм, τзκим κэκ выρащивание нз ποвеρχнοсτи πигэгель- ныχ сρед или в жидκиχ шгэгельныχ сρедзχ, сοдеρжащиχ усзοяемые исτοчниκи углеροда , азοга, неορгэничесние сοли и ορганичесκие вещесгвз, οбесπечивающие ροсτ миκροορгз-
15 низмοв.
Κ ορганичесκим вещесτвам οгнοсяτся виτамины (биοгин, гизмин), э τаκже дρугие сοединения, з τοм числе эминο- κислοτы, в случэе, если οни неοбχοдимы для ροсτэ κοнκρеτ- нοгο шτаммз-προдуценгз.
20 Β κзчесгзе πигагельнοй φеρменгзциοннοй сρеды для κульτивиροвания муτэнτοв миκροορгэнизмοв, исποльзуемыχ в нэсτοящем изοбρегении, мοгуτ быτь πρименены любые πи- τзτельные сρеды, сοдеρжэщие усвοяемые исτοчниκи углеρο- дз, ззοгз, неορгэничесκие сοли, ορгзничесκие вещесτва,
25 сτимулиρующие ροсτ миκροορганизмοв и наκοπление ь-элэ- нина.
Β κэчесτве усвοяемыχ исτοчниκοв углеροдз мοгуτ быτь исποльзοвэны гаκие исτοчниκи углеροда, κаκ саχзρο- зз, глаκοзэ, φρуκгοза, мальτοза, маннοзз, κρаχмэл, гид-
30 ροлиззг κρаχмэлэ и мелэсса; мнοгοэгοмные сπиρгы, гаκие κэκ глицеρин и сορбиτ; ορганичесκие κислοгы τэκие, κэκ муρэвьинзя κислοга, уκсусная κислοга, мοлοчная κислοга, φумаροвэя κислοτа, малеинοвэя κислοτэ, προπиοнοвая κис- лοτэ; сπиρτы τэκие, κэκ меτэнοл и эτзнοл. Уκззэнные
35 исτοчниκи углеροда мοгуг быτь исποльзοваны κаκ в οτ- дельнοсτи, τэκ и в сοчеτэнии дρуг с дρугοм в ρззличныχ * - ιз - весοвыχ еοοτнοшенняχ. Οбщее κοличесτвο вещесτвэ - исτοч- ниκа углеροда ыοжеτ быτь введенο в начале φеρменτации, либο πορциями в προцессе φеρωенτации.
Β κачесτве усвοяемοгο исτοчниκз азοτэ мοгуτ быτь 5 исποльзοвэны κаκ ορгзничесκие, τаκ и неορганичесκие сο- ли аммοния, нэπρимеρ, сульφаτ аммοния, χлορид аммοния, κаρбοнаτ аωмοния, ацеτаτ аммοния, ниτρаτ эммοния, φοсφзτ аммοния, лаκτэτ эммοния и зммοний; мοчевина; ρззличные πρиροдные азοτсοдеρжащие сοединения, наπρимеρ, πеπτοн, 10 гидροлизэτ дροжжей, мяснοй эκсτρэκτ и гидροлиззτы ρзс- τиτельныχ белκοв.
Β κзчесτве неορгзничесκиχ сοлей мοгуτ быτь исποль- зοваны φοсφορнοκисл е κалий, наτρий, οульφаτ магния, χлсρ нагρия, сοли железа, ыаρгэнцэ и цинκа, κаρбοнаτ κальция. 15 Β κэчесτве ορганичесκиχ вещесτв, неοбχοдимыχ для ροсτа назвэнныχ выше миκροορгзнизмοв мοгуτ быτь исποль- зοваны τиамин, биοτин или егο ззмениτели, э τзκже зминο- κислοτы, если οни неοбχοдимы для ροсτэ миκροορгзнизмοв.
Пρи услοвии нзличия ορгзничесκиχ вещесτв в дοсτаτοчнοм 20 κοличесτве в сοсτаве дρугиχ κοмποненτοв πиτаτельнοй сρе- ды, неοбχοдимοсτь внесения ορганичесκиχ вещесτв в чисτοм виде οτπадаеτ.
Ηаκοπление ъ -эланинэ имееτ месτο πρи κульτивиρο- вании в зэροбныχ услοвияχ в дизπэзοне τемπеρаτуρ 20-37°С 25 и знэчений ρΗ 6,5-9,0.
Пοявление Ь -зланинз нэблюдзюг чеρез б-ΙΟ чзсοв ποсле нзчэла φеρменτэции. Οднаκο маκсиωальный уροвень наκοπления ь -аланинз в κульτуρзльнοй жидκοсτи дοсτигэ- еτся в ρезульτэτе ποлнοгο ποτρебления исτοчниκэ углеρο- 30 дз и энеρгии (чеρез 32 чэсэ и бοлее в зэвисимοсτи οτ исποльзοвзннοй κοнценτρэции исτοчниκэ углеροда и энеρ- гии).
Сοдеρжание ъ -аланинэ в κульτуρальнοй жидκοсτи οπρеделяюτ с ποмοщью меτοда бумэжнοй χροмзτοгρзφии и 35 οяρашивания нингидρинοы или с ποыοщью аминοκислοτнοгο анализаτορа. - и -
Ηаκοπленный ь-зланин ыοжеτ быτь выделен из κуль- τуρзльнοй жидκοсτи любым извесτным сποсοбοы, τзκим κзκ удзление миκροορгэнизмοв и дρугиχ неρзсτвορимыχ чэсτиц ценτρиφугиροвэнием или φильτρзцией, эдсορбцией Ь-алэ-
5 нина на иοннοοбменные смοлы, с ποследующим элюиροвани- ем, κοнценτρиροванием и κρисτаллизэцией ъ -элэнинэ.
Для лучшегο ποнимэния даннοгο изοбρеτения πρивο- дяτся следующие πρимеρы егο κοнκρеτнοгο выποлнения. Пρимеρ I
10 Пοсевнοй мэτеρиэл шτэммз ΒгеνιЪасЪег-Ιшα ϊϊаνшα ΔΑ2 гοτοвяτ выρэщивэнием миκροορганизыοв в προбиρκэχ нэ ποвеρχнοсτи сκοшеннοгο ыясο-πеπτοннοгο бульοнз, сοдеρ- жащегο 15 г/л агаρ-агэρз и 100 мл/л Б -злэнинэ, в τече- ние 22 часοв πρи 30°С и ποследующегο сыыва ыиκροορганиз-
15 мοв сτеρильным φизиοлοгичесκиы ρэсτвοροм (κοнценτρэция миκροορгэнизмοв в ποлученнοй сусπензии 10 κлеτοκ/ыг).
Β φеρменτзциοнные κοлбы οбъемοм 250 ыл асеπτичесκи ρазливаюτ πο 10 мл προсτеρилизοваннοй φеρыенτзциοннοй сρеды следующегο сοсτавэ (г/л): мелэсса - 200,0 (πο
20 саχэρу - 100), гидροлизаτ биοмзссы дροжжей - 120,0; СаС03 - 30,0, ρΗ 7,5.
Β κοлбы внοсяτ πο 0,5 ыκл ποсевнοгο ызτеρизла шτаы- ма БгеνϊЪас-ЬегΙит Паνит ΑΑ2 и инκубиρуюτ πρи ποκачивании (70 οб/мин) в τечение 72 часοв πρи 30°С.
25 Сοдеρжание ъ -алзнинэ в κульτуρэльнοй жидκοсτи, ποлу- ченнοй ποсле зэвеρшения φеρменτэции, сοсτэвляеτ 5,1 г/л.
250 мл ποлученнοй κульτуρэльнοй жидκοсτи шτаммэ ΒгеνΙЪас-Ьегχша £1аνша ΑΑ2, сοдеρжзщей
5,1 ь -алэнина, ценτρиφугиρуюτ (5000 οб/ыин в τечение
30 20 минуτ) для удаления бэκτеρий и дρугиχ неρасιвορимыχ часτиц. Пοлученный надοсадοκ προπусκаюτ чеρез κοлοнκу с иοнοοбменнοй смοлοй в ян - φορме в нзπρэвлении свеρχу вниз πρи сκοροсτи 0,6-0,7 οбъемοв ρасτвορа нэ οбъем смοлы зз I чзс. Κοлοнну προмываюτ вοдοй и элюиρу-
35 юτ эдсορбиροвэнный ь-аланин 3,5%-ныы вοдным ρасτвοροм аммиэκэ. Пοлученный элюэτ κοнценτρиρуюτ ποд ваκуумοы и - 15 - κρисτэллизуюτ ь-эланин πρи τемπеρэτуρе Ι4-Ι6°С в τе- чение 4 часοв. Κρисτэллы οτделяюτ οτ ρасτвορа φильτρο- вэнием чеρез бумэжный φильτρ и сушаτ ποд взκуумοм. Βы- хοд ь-злэнинэ сοсτавляеτ 3,3 г без учеτа егο сοдеρжэ- 5 ния в мзτοчнοм ρасτвορе, чτο даеτ οбщий выχοд οτ сοдеρ- жания в κульτуρальнοй жидκοсτи 65 .
Чисτοτз προдуκции πο данным бумажнοй χροмаτοгρа- φии 77,4 .
Пρимеρ 2 10 Пοсевнοй маτеρиал шτаммэ ΒгеνϊЪас-ЬегΙит £ϊаνит ΑΑΙ гοτοвяτ в услοвияχ,энзлοгичныχ уκззанным в πρимеρе I.
Β φеρменτациοнные κοлбы οбъемοм 250 мл эсеπτичесκи ρазливаюτ πο 10 мл προсτеρилизοваннοй φеρменτациοннοй сρеды следующегο сοсτава (г/л): меласса - 200,0 (πο са- 15 χаρу - 100); гидροлизаτ биοмассы дροжжей - 120,0; СэСΟζ- 30,0, ρΗ 7,5.
Β κοлбы внοсяτ πο 0,5 мл ποсевнοгο мэτеρизла шτэммэ ΒгеνϊЪас-Ьегϊит £1аνит ΑΑΙ, ποлучβннοгο в услοвиях, энэлοгичныχ уκэзэнным в πρимеρе I. Κοлбы инκубиρуюτ πρи 20 ποκэчивэнии (70 οб/мин) в τечение 72 часοв πρи 30°С. Сοдеρжание ь -аланинэ в κульτуρальнοй жидκοсτи, ποлу- ченнοй ποсле завеρшения φеρменτэции, сοсτэвляеτ 6,9 г/л. ιϊρимеρ 3
Β φеρменτэциοнные κοлбы οбъемοм 250 мл эсеπτичесκи 25 ρэзливэюτ πο 10 мл προсτеρилизοвэннοй φеρменτэциοннοй сρеды следующегο сοсτава (г/л): меласса - 200,0 (лο саχэρу - 100); гидροлизэτ биοмэссы дροжжей - 120,0, СаС03 - 30,0, ρΗ 7,5.
Β κοлбы внοсяτ πο 0,5 мл ποсевнοгο маτеρиэлэ шτэм- 30 мэ СοгуπеЪас-Ьегιит §1и1.атд_сию ΑΑΙΙ, ποлучен- нοгο в услοвияχ, энэлοгичныχ уκэзэнным в πρимеρе I. Κοл- бы инκубиρуюτ πρи ποκэчивэнии (70 οб/мин) в τечение 72 чэсοв πρи 30°С. Сοдеρжэние ь -аланинэ в κульτуρаль- нοй κидκοсτи, ποлученнοй ποсле завеρшения φеρменτации, 35 сοсгзвляеτ 3,8 г/л.
Пρимеρ
Β φеρмβнτациοнные κοлбы οбъемοм 250 мл эсеπτичесκи - 16 - ρазливэюτ πο 10 мл προсτеρилизοваннοй φеρменτэциοннοй сρеды следующегο сοсτэва (г/л): меласса - 200,0 πο са- χзρу - 100), гидροлизаτ биοмэссы дροжжей - 120,0, СэСΟ^- 30,0, ρΗ 7,5. 5 Β κοлбы внοсяτ πο 0,5 мл ποсевнοгο мзτеρиэла шτам- ма СοιуηеЪас-ЬегΙит §1и1;ат1сш_ι ΑΑ4Ι, ποлученнοгο в услοвияχ, анэлοгичныχ уκазэнным в πρимеρе I. Κοлбы инκубиρуюг πρи ποκачивании (70 οб/мин) в τечение 72 ча- сοв πρи 30°С. Сοдеρжание ь -аланинз в κульτуρальнοй 10 жидκοсτи, ποлученнοй ποсле ззвеρшения φеρменτзции, сοс- τзвляеτ 6,4 г/л. Пρимеρ 5
Пροцесс φеρменτэции οсущесτвляюτ в услοзияχ, энзлο- гичныχ уκззэнным в πρимеρе I, исποльзуя в κэчесτве шτзм- 15 мэ-προдуценτз Ь -злзнин шτзмм ΒгеνϊЪас-Ьегϊит £1аνит ΑΑΙ, οднэκο исποльзуюτ πиιаτельную φеρменτациοнную сρе- ду следующегο сοсτава (г/л): саχаροза - 100,0, øга^^Бθ^. - 55,0, Η2Ρ0 - 3,0,Μе80 χ7Η20 - 1,0 -алэнин -0,1, ϊе80 χ7Η20 - 0,0Ι;ΜпБΟ χ5Η20 - 0,01, биοτин - 0,0002, 20 τиаминэ бροмид - 0,00005, СэСΟ^ - 50,0, ρΗ 7,5.
Сοдеρжзние ь -элэнинэ в κульτуρэльнοй жидκοсτи ποсле 72 чзсοв инκубэции сοсτэвляеτ 17,6 г/л. Пρимеρ 6
Пροцесс φеρменгэции οсущесτвляюτ в услοвияχ, знэлο- 25 гичныχ уκэзэнным в πρимеρе I, οднэнο в κэчесτве шτзммз- προдуценτэ Ь-злзнинэ исποльзуюτ шτамм ΒгеνϊЪаσЬегϊит Εϊаνит ΑΑ2, и исποльзуюτ φеρменτациοнную сρеду
Figure imgf000018_0001
ποсле чзсοв инκубэции сοсτзвляеτ 20,4 г/л. Пρимеρ 7 35 Пροцесс φеρменτэции οсущесτвляюτ в услοвияχ, знэ- лοгичныχ уκзззнным в πρимеρе I, οднэκο в κэчесτве шτэм- - 17 - мэ-προдуценτэ Ъ -аланина исποльзуюτ шτзмм СοгуηеЪас-Ье- τϊшα еϊи-Ьатιсαт ΑΑΙΙ и исποльзуюг φеρменτациοнную сρеду следующегο сοсτава (г/л): сзχаροзэ - 100,0,(ЬΉ )БΟ -55,0, Η2Ρ0 - 3,0даο χ 7Η20 - 1,0; I -аланин - 0,1, 5 ΡеБ0 χ7Η20 - 0,01; ΜοБΟ^.5Η20 - 0,01, биοτин - 0,0002, τиамина бροмид - 0,00005, СаС03 - 50,0, ρΗ 7,5.
Сοдеρжзние ь-алзнинэ в κульτуρальнοй жидκοсτи ποс- ле 72 часοв инκубации сοсτэвляеτ 2,6 г/л. Пρимеρ 8 10 Пροцесс φеρменτэции οсущесτвляюτ в услοвияχ, аналο- гичныχ уκазанным в πρимеρе I, οднаκο в κачесτве шτамма- προдуценτа ъ -аланина исποльзуюτ шτамм ΟοгупеЪас-Ьегχит §1и-Ьатχсшα ΑΑ4Ι и исποльзуюτ φеρменτациοнную сρеду следующегο сοсτава (г/л): саχаροзэ - 100,0, 15 (Ш )2β0 -55,0; ΚΗ2Ρ0 - 3,0,Μ680 . 7Η20 - 1,0,1) -эла- нин - 0,Ι,»еБ0 ,7Η20 - 0,0Ι,^Ο .5Η20 - 0,01, биοτин - 0,00002, гиамина бροмид - 0,00005, СэС03 - 50,0, ρΗ 7,5. Сοдеρжание ъ -аланина в κульτуρальнοй жидκοсτи ποс- ле 72 часοв инκубэции сοсτавляеτ 5,1 г/л. 20 Пρимеρ 9
Пροцесс φеρменτации οсущесτвляюτ в услοвияχ, аналο- гичных уκэзэнным в πρимеρе 5, в κοлбы внοсяτ в κэчесτве шτэммэ-προдуценτа Ь -элзнинз шτэмм ΒгеνϊЪасЬегϊшη £1аνша ΑΔ5. Φеρменτэциοннэя сρедз имееτ следую- 25 щий сοсτзв (г/л): саχзροзэ - 120,0; ( ^БΟ^. 55,0, ΚΗ2Ρ0 - 3,0;Μ8Б0 .7Η20 - 1,0, ϋ -эланин - 0,1 Εе80 • 7Η20 - 0,0Ι;Μη8Ο .5Η20 - 0,01, биοτин -0,0002, τиаминз бροмид - 0,00005, СэС03 - 50,0, ρΗ 7,5.
Κοлбы инκубиρуюτ πρи ποκзчивании 72 часэ πρи 30°С. 30 Сοдеρжание ь-аланинэ в κульτуρальнοй дидκοсτи, ποлучен- нοй ποсле зэвеρшения φеρменτэции, сοсгэвляеτ 32,9 г/л. Пρимеρ 10
Пροцесс φеρменτэции οсущесτвляюτ в услοвияχ, энэ- лοгичныχ уκэзэнным в πρимеρе 5, в κοлбы внοсяτ в κэче- 35 сгве шτэммэ-προдуценτэ Ъ -элэнинэ шτамм ΒгеνϊЪас-Ьегϊит £1аνшα ΑΑβ.
Φеρменτэциοннэя сρедз имееτ следующий сοсτэв (г/л): - 18 - саχзροза - 120, 0;(ΕΗ4)|Ю- 55,0; Η^ΡΟ^. - 3,0даο 7Η20 - 1,0, Ъ -аланин - 0,1; ^еБΟ^ΤΕ- - 0,01; Μπ8Ο4.5Η20 - 0,01; биοτин - 0,0002; τизмина бροмид - 0,00005, СэСΟ^ - 50,0; рΕ 7,5. Κοлбы инκубиρуюτ πρи ποκэчивэнии 72 часа πρи 30°С. Сοдеρκание ъ -аланина в κульτуρэльнοй жидκοсτи ποлученнοй ποсле завеρшения φеρменτэции, сοсτэвляеτ 31,4 г/л.
Яρимеρ II
Пροцесс φеρменτзции οсущесτвляюτ в услοвияχ, аналο- гичныχ уκззэнным в πρимеρе 5, в κοлбы внοсяτ в κэчесτве шτэыыэ-προдуценτэ Ъ -алзнина шτамм ΒгеνϊЪас-Ьегϊит £1аνит ΑДΙ. Φеρменτациοннзя сρедэ иыееτ сле- дующий сοсτзв (г/л): сзχаροза -
Figure imgf000020_0001
55,0; ΚΗ2Ρ0^ - 3,0,ΜеБ0 -7Η20 - Ι,0; ϋ -аланин - 0,1; Ρе804 • 7Η20 - 0,01; Μ_α80 .5Η20 - 0,01, биοτин - 0,0002; τианинз бροмид - 0,00005, СэСΟ^ - 50,0 ρΗ 7,5.
Κοлбы инκубиρуюτ πρи ποκэчивэнии 72 чзсэ πρи 30°С. Сοдеρжзние ь -элэнина в κульτуρэльнοй жидκοсτи, ποлу- ченнοй ποсле ззвеρшения φеρменτзции, сοсτзвляеτ 20,6 г/ Пρимеρ 12
Пροцесс φеρменτэции οсущесτвляюτ в услοвияχ, энэ- лοгичныχ уκэззнным в πρиыеρе 5. Οднзκο в κοлбы внοсяτ πο 0,5 мл ποсевнοгο мэτеρинлэ шτзммэ ΒгеνϊЪас-Ьегϊиш £1аνшα ΑΑ5, πρедсτзвляющегο сοбοй сусπензию, ποлученную смывοм с οднοсуτοчныχ эгэρизοвэнныχ κοсяκοв мясο-πеπτοннοгο бульοнэ (κοнценτρэция миκροορгэнизмοв 10 κлеτοд/мл). Φеρменτациοннзя сρедз имееτ следующий сοсτэв (г/л): сэχэροзэ - 150,0; )2Б0- 55,0; ΚΗ^ΡΟ^- - 3,0;Ы6204 -7Η20 - 1,0; Β -аланин - 0,Ι *еБ -7Η20- 0,0Ι ϊ-ϋгιБΟ.5Η20 - 0,0 ; биοτин - 0,0002; τиаминэ бρο- мид - 0,00005; СэС03 - 50,0: ρΗ 7,5.
Κοлбы инκубиρуюτ πρи ποκэчивэнии 96 чэсοв πρи 30°С. Сοдеρжэние ь-элэнинэ в κулыуρзльнοй жидκοсτи, ποлучен- нοй ποсле зэвеρшения φеρменτэции, сοсτзвляеτ 43,8 г/л. Οчисτκу ъ-эланина из 250 мл κульτуρальнοй жидκο- сτи шτамыз ΒгеνϊЪас-Ьегϊшα Гϊаνша ΑΑ5 (οбщее - 19- сοдеρжание ъ -злэнина II гρэммοв) οсущесτвляюτ в ус- лοвияχ, анэлοгичныχ уκэззнныы в πρимеρе I. Βыχοд Ь -злэ- нинэ без учеτз егο сοдеρжэния в мэτοчнοм ρэсτвορе 7,3 г, чτοдэеτ οбщий выχοд οτ сοдеρжэния в κульτуρальнοй жид- 5 κοсτи 67 . Чисτοτа προдуκτэ πο дзнным бумэжнοй χροмзτο- гρэφии 91,3 . Пρимеρ 13
Пροцесс φеρменτации οсущесτвляюτ в услοвияχ, ана- лοгичныχ уκазанным в πρимеρе 5.
10 Οднэκο в κοлбы внοсяτ πο 0,5 ыл ποсевнοгο маτеρиэ- лз шτэммз ΒгеνιЪас-Ьегϊшη £1аνιат ΑΑ6, πρедсτзвляющегο сοбοй сусπензию, ποлученную смывοм с οднοсуτοчныχ агаρизοванныχ κοсяκοв мясο-πеπτοниοгο бульο на (κοнценτρация миκροορгэнизмοв 10 κлеτοκ/ыл). Φеρмен-
15 τэциοннэя сρедэ иыееτ следующий сοсτзв (г/л): сзχзροзэ- 150,0; (ΝΗ )^0 55,0; ΚΗ^ΡΟ^ - 3,0; Μβ80 .7Η20 - 1,0;! Ъ -ЭЛЭΗИΗ - 0,Ι;Ρе80 .7Η20 - 0,01; ΜυБΟ^ .5Η20 - 0,01; биοτин - 0,0002; τиамина бροмид - 0,00005; СэС03 - 50,0;! ΡΗ 7,5.
20 Κοлбы инκубиρуюτ πρи ποκачивэнии 96 чэсοв πρи 30°С. Сοдеρжэние ь -эланинз в κульτуρальнοй жидκοсτи, ποлу- ченнοй ποсле завеρшения φеρыенτации, сοсгавляеτ 42,3 г/л. Пρимеρ 1 Пροцесс φеρменτации οсущесτвляюτ в услοвияχ, анз-
25 лοгичныχ уκазанныы в πρиыеρе 5.
Οднэκο в κοлбы внοсяτ πο 0,5 нл ποсевнοгο маτеρиэ- ла шτаммэ ΒгеνϊЪаσЬегϊит £1аνшα ΑΑΙ, πρедсτавляющегο сοбοй сусπензию, ποлученную смывοм с οднοсуτοчныχ агаρизοванныχ κοсяκοв мясο-πеπτοннοгο бульο-
30 на (κοнценτρация ыиκροορганизыοв 10 κлеτοκ/ыл). Φеρыен- τациοнная сρедз имееτ следующий сοсτзв (г/л): сэχэροзз- Ι50,0;(ΝΗ )2δΟ - - 1,0; Б -элзнин - 0,1; 0,01; биοτин - 0,0002;
Figure imgf000021_0001
- 50,0
35 ρΗ 7,5,
Κοлбы инκубиρуюτ πρи ποκэчивании 96 чзсοв πρи 30°С. Сοдеρжэние ъ -эланинэ в κульτуρальнοй жидκοсτ.ι, ποлучен- - 20 - нοй ποсле зэвеρшенκя φеρменτэции, сοсτэвдяег 20,6 г/л.
Дροмышленная πρимениыοсτь
Заявляемοе изοбρеτение найдеτ πρименение в медици- не, в χимичесκοй, πищевοй и τабачнοй προмышленнοсτи.

Claims

ИЗΜΕΗΕΗΗΑЯ ΦΟΡΜУЛΑ ИЗΟБΡΕΤΕΗИЯ(ποлучена Μеждунаροдным бюρο 16 οκτябρя1989 (16.10.89))
1. Сποсοб ποлучения Ъ -аланина πуτеы κульτивиροва- ния миκροορганизмοв ροдοв Βгеν___Ъас*Ьег:__.ит СοгуηеЪас*Ьег1шη
5 на πиτаτельнοй сρеде, сοдеρжащей усвοяемые исτοчниκи углеροда, азοτа, неορганичесκие сοли и сτимуляτορы ροсτа миκροορганизмοв дο наκοπления Ь-аланина в κульτуρаль- нοй жидκοсτи и ποследующегο выделения целевοгο προдуκτа, οτличающийся τем, чτο в κачесτве миκροορганизмοв исποль-
Ю зуюτ муτанτы миκρсορганизмοв ροдοв Βгеν1Ъас*Ьег1иш или СοгуηеЪас-Ьегϊшη , ну;κдающиеся для ροсτа в ϋ-ала- нине.
2. Сποсοб πο π.Ι,οτличающийся τем, чτο исποльзуюτ муτанτы миκρορρганκзмοв вида ΒгеνϊЪас-ЬегΙит χϊаνшη
15 деποниροванные вο Βсесοюзнοм научнο-исследοваτельсκοм инсτиτуτе генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκροορганиз- мοв (ΒΗИИгенеτиκа): шτамм ΒгеνГЬас-Ьегϊшη ιϊаνшη ΑΑΙ, заρегисτρи- ροванный ποд нοмеροм Β-306Ι 05 аπρеля 1984 гοда, 20 ιгτамϊ.. ΒгеνϊЪасЬегΙπι Ιϊаνилι ΑΑ2, заρегκсτρи- ροванный ποд нοмеροм 3-306205 аπρеля 1984 гοда.
3 (измененныГ:). Сποсοб πс π.Ι,οτличающκκся τем, чτο исπсльзуюτ муτанτы мπκροсρганизмοв ρсда Βгеν_χЪас*Ьегϊшη , нуждающκеся для ροсτа в Б-аланине и усτοйчизые κ ϋ, ъ-σС 5 -амκнοмаслянοй κислοτе.
4. Сποсοб πο ππ.Ι,3,οτличающийся τегл, чτο исποль- зуюτ м.уτанτы мκκροсρганизмοв вида ΒгеνΙЪас-Ьегϊит £1а- νшη , деποниροванные вс Βсесοюзнοм научнο-исследοваτель- сκοм инсτπτуτе генеτиκи и селеκцκκ πρсмьпπленныχ миκρсορ- 20 ганизмοв (ΒΗΙΙИгенετκκа): ζιτамм ΒгеνχЪас*Ьег1шη £1аνит ΑΑ5, заρегисτρиροван- ныκ ποд нοмеροм Β-399Ι 01 аπρеля 1987 гοда, ιπτамι.: ΒгеνϊЪасЬегϊшη χϊаνшη ΑΑ6, заρегκсτρ οван- ны": ποд нсмеροм 3-399201 аπρеля 1937 гοда. 35 5. Сποссб πс π.Ι,οτлκчающκκся τем, чτο исποльзуюτ муτанτы миκροορганизмοв вида СοгуηеЪас*Ьег:__.шη §1и*Ьаπιϊсшη, деποнκρсванные ΕС Βс-эссюзнсм научнο-κсследθΕаτельсκс: κнсτκτуτе генеτиκκ ν. селеκцκκ ποсмьπιленыыχ ι,.κκг)сс*οган::з- мсв (ЗΗΙΩгенеτиκа):
Figure imgf000026_0001
зι аΜ-лϊ СοгуηеЪас*Ьег±шιι &1_и*Ьали.сит ΑΑ4Ι, заρэгκсτρκ- ρсванны* ποд нοмеρсм 3-3321 25 маρτа 1985 гсда,
~ν~амι. СοгуηеЪас*Ьегάшη §1и*Ьатχсшπ ΑΑΙΙ , заρегисτρи- ρсванны* πсд нοмеροм 3-3323 25 маρτа 1985 гοда. 5 6 (изменεнный) . Εиοлοгκчесκκ чκсτые κульτуρы мκκρсορ- ганκзιлοв, οбладающие χаρаκτеρисτиκами и κденτиφицκρуемыз с любым κз нижеследующиχ зιτаммοв-προдуценτοв ь -аланина:
ΒгеνιЬас*Ьегϊшη £1аνшιι ΑΑΙ, зз.ρегκсτρκροванныГ: ποд нοмеροм Β-ЗΟβΙ 05 аπρеля 1984 гοда; 0 ΒгеνΙЪас-ЬегΙшη £1аνит ΑΑ2, заρегκсτρκρеванныκ ποд нο- меρο^ Β-3062 05 аηρеля 1984 гοда;
ΒгеνϊЪас*Ьег1шη Лаνшη ΑΑ5 , заρегκсτρиροванныГ: ποд нсмеρсм 3-3991 01 аπρеля 1987 гοда;
ΒгеνϊЪас-Ьегϊит ιϊаνшτι ΑΑβ, заρегисτρиρсванныГ ποд 5 нοмеροм Β-3992 01 аπρεля 1987 гοда;
СοгуηеЪас-Ьегχшη βϊи.'&аπ-±сшι ΑΑ4Ι , заρегκсτρκρсванный πсд κсмеροм 3-3321 25 маρτа 1985 гοда;
СοгуηеЪас-ЬегΙшη §1и*Ьашχсига ΑΑΙΙ, заρегκсτρκρс-ванныκ ποд нсмεροм 3-3323 25 маρτа 1985 гοда.
Figure imgf000027_0001
ΟБЪЯСΗΕΗИΕ Β СΟΟΤΒΕΤСΤΒИИ СΟ СΤΑΤЬЁЙ 19
Ыасτοящее πисьмο κасаеτся изменений, προизведэнныχ ш езульτаτам οτчеτа ο ποисκе, προведеннοм Эτи изменения κасаюτся φορмулы изοбρеτения и заκлοчаюτся в следшцем:
Β π.π. 3 и 6 внесеяы дοποлнения.
PCT/SU1989/000111 1988-04-26 1989-04-25 Method of obtaining l-alanine WO1989010408A1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK664089A DK664089A (da) 1988-04-26 1989-12-22 Fremgangsmaade til fremstilling af l-alanin
FI896231A FI896231A0 (fi) 1988-04-26 1989-12-22 Foerfarande foer framstaellning av l-alanin.

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU884408234A SU1719433A1 (ru) 1988-04-26 1988-04-26 Способ получени L-аланина
SU4408234/28 1988-04-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1989010408A1 true WO1989010408A1 (en) 1989-11-02

Family

ID=21367916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/SU1989/000111 WO1989010408A1 (en) 1988-04-26 1989-04-25 Method of obtaining l-alanine

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5124257A (ru)
EP (1) EP0369029A4 (ru)
JP (1) JPH03500486A (ru)
CN (1) CN1038669A (ru)
FI (1) FI896231A0 (ru)
HU (1) HU205389B (ru)
SU (1) SU1719433A1 (ru)
WO (1) WO1989010408A1 (ru)
YU (1) YU85489A (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10428358B2 (en) 2008-09-30 2019-10-01 Toray Industries, Inc. Method of producing a chemical product

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5478733A (en) * 1993-07-16 1995-12-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing L-alanine by fermentation with arthrobacter
CN1884565B (zh) * 2006-05-29 2011-05-04 安徽华恒生物工程有限公司 D-丙氨酸微生物制造方法
EP2650375B1 (en) 2010-12-09 2020-09-23 Toray Industries, Inc. Method for producing chemical by continuous fermentation
EP2659957A1 (en) 2010-12-27 2013-11-06 Toray Industries, Inc. Hollow fiber membrane module and method for producing chemicals
JP6201753B2 (ja) 2012-03-30 2017-09-27 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法および連続発酵装置
KR101947959B1 (ko) 2018-05-28 2019-02-13 씨제이제일제당 (주) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법
CN108484423B (zh) * 2018-07-05 2021-02-09 秦皇岛华恒生物工程有限公司 一种从l-丙氨酸发酵液中分离纯化l-丙氨酸的方法
KR101996769B1 (ko) 2018-12-21 2019-10-01 씨제이제일제당 (주) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3898128A (en) * 1972-11-20 1975-08-05 Tanabe Seiyaku Co Process for preparing L-alanine
CH651066A5 (de) * 1980-09-17 1985-08-30 Grace W R & Co Verfahren zur herstellung von l-alanin und mittel zu dessen durchfuehrung.

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2511867A (en) * 1949-12-19 1950-06-20 Method fob separating enantiomers
DE3723932A1 (de) * 1987-07-20 1989-02-02 Henkel Kgaa Klebeverfahren fuer wasserdampfdurchlaessige substrate
JPH074265B2 (ja) * 1987-10-07 1995-01-25 東レ株式会社 発酵法によるｄ−アラニンの製造法
US5508939A (en) * 1993-06-10 1996-04-16 At&T Corp. Method of partitioning a circuit

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3898128A (en) * 1972-11-20 1975-08-05 Tanabe Seiyaku Co Process for preparing L-alanine
CH651066A5 (de) * 1980-09-17 1985-08-30 Grace W R & Co Verfahren zur herstellung von l-alanin und mittel zu dessen durchfuehrung.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP0369029A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10428358B2 (en) 2008-09-30 2019-10-01 Toray Industries, Inc. Method of producing a chemical product

Also Published As

Publication number Publication date
YU85489A (en) 1990-08-31
CN1038669A (zh) 1990-01-10
US5124257A (en) 1992-06-23
HUT53940A (en) 1990-12-28
JPH03500486A (ja) 1991-02-07
FI896231A0 (fi) 1989-12-22
EP0369029A4 (en) 1991-09-25
SU1719433A1 (ru) 1992-03-15
HU894784D0 (en) 1990-07-28
EP0369029A1 (de) 1990-05-23
HU205389B (en) 1992-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2208640C2 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА
ES2376218T3 (es) Cepa de rhodococcus rhodochrous ncimb 41164 y su uso como productor de nitrilo hidratasa.
WO1989010408A1 (en) Method of obtaining l-alanine
CN116478878A (zh) 一种高产核黄素的枯草芽孢杆菌及其应用
US20050239165A1 (en) Method for cultivation of the nitrile-hydratase-producing strain Rhodococcus rhodochrous M33
CN116731933B (zh) 一种谷氨酸棒杆菌及其在生产缬氨酸中的应用
US4275164A (en) Process and nutrient medium for growing microorganism
US2776926A (en) Preparation of alpha-ketoglutaric acid by serratia marcescens
SU770200A1 (ru) Штамм @ @ ВСБ-874-продуцент биомассы
JP2710834B2 (ja) Ｆｏ―６０８ａ物質およびその製造法
DK171744B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af pyrodruesyre
CN116590202B (zh) 一株谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产l-亮氨酸中的应用
CN116590203B (zh) 一株谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产l-异亮氨酸中的应用
KR0146493B1 (ko) 발효법에 의한 l-알라닌의 제조 방법
SU644833A1 (ru) Штамм 85-продуцент -аспарагиновой кислоты
JPH03277292A (ja) 光学活性な２―ヒドロキシカルボン酸の製造法
RU2731289C2 (ru) Способ конструирования на основе бактерий рода Rhodococcus штамма-биокатализатора, обладающего нитрилазной активностью и повышенной операционной стабильностью, рекомбинантный штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous, полученный таким способом, способ синтеза акриловой кислоты с использованием этого штамма в качестве биокатализатора
JP3642344B2 (ja) クレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法
SU958498A1 (ru) Способ получени @ -маннаназы
SU1270172A1 (ru) Штамм @ @ @ продуцент уреазы
JPH0591895A (ja) Ｄ−セリンの製造法
JPH08275776A (ja) 新規キチナーゼ及びその製造方法
CN118792280A (zh) 一种脂肪酶突变体及其在单细胞蛋白合成中的应用
RU2053292C1 (ru) Штамм бактерий alcaligenes eutrophus - продуцент белковой биомассы
SU1523569A1 (ru) Штамм бактерий СIтRовастеR FReUNDII дл биотрансформации фумарата в L- блочную кислоту

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BG DK FI HU JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE

CR1 Correction of entry in section i

Free format text: IN PAT.BUL.26/89,UNDER PUBLISHED ADD "WITH AMENDED CLAIMS" AFTER "WITH INTERNATIONAL SEARCH REPORT"

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1989905476

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 896231

Country of ref document: FI

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1989905476

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1989905476

Country of ref document: EP