WO1989001485A1 - Purification of raw peptides by preparative medium-pressure liquid chromatography - Google Patents
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- WO1989001485A1 WO1989001485A1 PCT/AT1988/000063 AT8800063W WO8901485A1 WO 1989001485 A1 WO1989001485 A1 WO 1989001485A1 AT 8800063 W AT8800063 W AT 8800063W WO 8901485 A1 WO8901485 A1 WO 8901485A1
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Definitions
- the present invention relates to a method for purifying a crude peptide by means of preparative medium pressure liquid chromatography.
- the invention further relates to a peptide compound produced using such a method.
- EP-A 37 516 describes a solid phase synthesis of a vasopressin derivative according to Merrifield, and the first section on page 8 describes purification on molecular sieves (separation by molecular weight). A similar cleaning is also described in US Pat. No. 4,143,787 and in "Collection Czechoslov.Chem.Comm.”, Vol.31, (1966), pages 4581 to 4591. In US Pat. No. 4,093,610, cleaning on ion exchangers or on molecular sieves is described in connection with liquid phase synthesis.
- the object of the invention is to create an economical purification process for peptide compounds with which purities of over 99% can be achieved.
- the object of the invention was to create an economical purification process for peptide compounds with which purities of over 99% can be achieved.
- the process according to the invention for the purification of a crude peptide, preferably an aqueous crude peptide solution, by means of preparative medium-pressure liquid chromatography is characterized in that the peptide to be purified is applied in the most concentrated form possible to a chromatography column, the “reversed-phase-silica” material, ie contains alkylated, highly condensed polysilicic acid, with a particle size of 20 to 90 micrometers and with a pore size of 60 to 300 angstroms as the stationary phase, that then at a pressure of 0 to 40 bar with a mobile phase consisting of
- the process according to the invention has the advantage that it is extremely economical. It is also very advantageous that the process according to the invention can be carried out in a low pressure range.
- the column filling material is also relatively inexpensive because irregular instead of spherical particles can be used in the process according to the invention. Compared to the corresponding HPLC material, the column filling material used according to the invention is currently about 20 times cheaper.
- the peptide compounds are neither denatured nor do they show a loss of activity; the method according to the invention is therefore extremely gentle on the peptide compounds.
- the peptide compounds can be separated quickly and selectively by a suitable choice of the flow agent.
- the purified peptide compounds separated according to the invention surprisingly have a purity of over 99%, which is very likely due to the addition of the chelating agents mentioned and the strongly polar, organic compounds mentioned. Furthermore, large amounts of solvents can be saved with the method according to the invention.
- the detection of the peptide compounds in the fractions takes place e.g. in UV light at a wavelength of 232 nm or 275 nm.
- the known methods can be used: for example HPLC, DC, amino acid analysis, sequence analysis.
- the corresponding fractions are advantageously added before.
- Desalted lyophilization e.g. on ion exchangers or using holecular sieves.
- the corresponding fraction is, for example, lyophilized.
- peptide compounds can be used which can be used both by means of solid phase synthesis according to Merrifield ("Angewandte Chemie", Volume 97, (1985), Pages 810 to 812) as well as in liquid phase synthesis ("Int. J. Peptide
- the following peptides can in particular be purified using the process according to the invention: disulfide compounds which have been prepared in accordance with a new process (described in Austrian patent application A 1379/88) which is essentially characterized in that at least one oxidizing agent which is covalent or is electrostatically bound to a solid phase and which - is capable of oxidizing SH groups to disulfide bridges, placed in water with stirring, then slowly adding an aqueous solution of the peptide compound to be oxidized in such a way that the concentration of the peptide to be oxidized is so low that the probability of an intermolecular reaction of the peptide molecules is negligibly small, and allows the reactants to react with one another with vigorous stirring, and then the crude peptide compound which has a disulfide bridge is worked up.
- peptides such as terlipressin of the formula Gly-Gly-Gly- can also be purified using the method according to the invention.
- Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH 2 CIS-Press in the formula Gly-Gly-Gly-C ys-Tyr-Phe-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-HN 2 , Hamburger peptide of the formula Asp-Ser-Asp-Pro-Arg, vasopressin and its derivatives, calcitonin, somatostatin and insulin.
- the terlipressin purified with the method of the present invention is extremely clean and has characteristics other than a commercially available conventional terlipressin due to the lack of impurities.
- the analytical HPLC was carried out as follows:
- the corresponding chromatogram is shown in FIG.
- the ordinate corresponds to the optical density at 210 nm
- the abscissa corresponds to the retention time in minutes.
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Description
Reinigung von Rohpeptiden mittels präparativer Mitteldruck- Flüssigkeitschromatographie.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines Rohpeptids mittels präparativer Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie. Weiters bezieht sich die Erfindung auf eine mit einem solchen Verfahren hergestellte Peptidverbindung.
Das Prinzip der Festphasensynthese von Peptiden ist von R.B.Merrifield zum Beispiel in "Angewandte Chemie", Band 97, (1985),
Seiten 801 bis 812, beschrieben. Im "International Journal of Peptide and
Protein Research", Band 25, (1985), Seiten 449 bis 474 beschreibt
M.Bodanszky das Prinzip der Peptidsynthese in Flüssigphase.
Die EP-A 37 516 beschreibt eine Festphasensynthese eines Vasopressinderivates nach Merrifield, und im ersten Abschnitt auf Seite 8 wird eine Reinigung auf Molekularsieben (Trennung nach Molekulargewicht) beschrieben. Eine ähnliche Reinigung wird auch in der US-PS 4143787 und in "Collection Czechoslov.Chem.Comm.", Vol.31, (1966), Seiten 4581 bis 4591, beschrieben. In der US-PS 4 093 610 wird im Zusammenhang mit einer Flüssigphasensynthese eine Reinigung auf Ionenaustauschern oder auf Molekularsieben beschrieben.
Weitere Reinigungsmethoden werden in der DE-OS 27 23 453 (Beispiel 19) und der DE-PS 1 643 273 beschrieben, wobei die letztere Methode nur für Mengen im mg-Bereich durchführbar ist.
Auf die Problematik der Peptid-Reinigung ist auch von G.Flouret et al. in "Int.J.Peptide Protein Res.",13, (1979), Seiten 137 bis 141, hingewiesen worden.
Im übrigen sei auch auf folgende, zum Stand der Technik gehörende Literaturstellen verwiesen:
K.Noda in "Int.J.Peptide Protein Res.",19, (1982), Seiten 413-419; "Collection of Czechoslov.Chem.Comm.", Vol.32, (1957), Seiten 1250 - 1257; EP-A 112809, insbesondere Beispiel 1, worin die nicht ökonomische HPLC zur Anwendung kommt; US-PS 4495097; V.du Vigneaud et al.,(1960),J.Biol.Chem. Vol.235,Nr.12,Seiten 64-66.
Ausführlicher werden bestimmte Reinigungsmethoden beschrieben in J.Chromatog.,38, (1968), Seiten 396-398, und
M.Zaoral et al., Collection Czechoslov.Chem.Comm.,Vol.43, (1978),Seiten 511-522.
Mit allen diesen bekannten Reinigungsverfahren können im allgemeinen ökonomisch vertretbare Reinheitsgrade von 92 bis 94 % erreicht werden. Das hat zur Folge, daß bei einer medizinischen Verwendung einer Peptidverbindung stets nachgewiesen werden mußte, daß die sie begleitenden Nebenprodukte keine nachteiligen Folgen, Auswirkungen, Nachteile haben, was nicht leicht war, da man oft nicht wußte, aus was für Verbindungen die Nebenprodukte bestanden. Dieser Zustand ist unbefriedigend, zumal in der Medizin immer mehr Peptidverbindungen eingesetzt werden.
Die Erfindung setzt sich zur Aufgabe, ein ökonomisches Reinigungsverfahren für Peptidverbindungen zu schaffen, mit welchem Reinheiten von über 99 % erreicht werden können. An Hand der bekannten Literatur mußte man annehmen, daß es überhaupt nicht möglich ist, eine solche Reinheit auf ökonomische Art zu erreichen. Ebenso nahm man an, daß es absolut unmöglich ist, ein solches Peptid-Reinigungsverfahren mit hohen Ausbeuten und Reinheitsgraden im industriellen Maßstab durchzuführen.
Völlig überraschend wurde nun doch ein solches Verfahren gefunden. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung eines Rohpeptids, vorzugsweise einer wässerigen Rohpeptidlösung, mittels präparativer Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie ist dadurch gekennzeichnet, daß man das zu reinigende Peptid in möglichst konzentrierter Form auf eine Chromatographie-Säule aufträgt , die "reversed-phase-Silice"-Material , d.h. alkylierte hochkondensierte Polykieselsaure, mit einer Korngröße von 20 bis 90 Mikrometer und mit einer Porengröße von 60 bis 300 Angström als stationäre Phase enthält, daß man dann bei einem Druck von 0 bis 40 bar mit einer mobilen Phase, bestehend aus
(a) einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel und Wasser, oder
(b) einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel und einer Pufferlösung mit einem pH-Bereich von 2 bis 10, oder
(c) einer rein wässerigen Pufferlösung mit einem pH-Bereich von 2 bis 10, wobei in allen drei obigen Fällen (a) bis (c) zusätzlich noch wenigstens ein Chelierungsmittel in geringer Konzentration und wenigstens eine stark polare organische Verbindung in geringer Konzentration vorhanden sein müssen, entweder isokratisch oder mit einem Gradienten eluiert, und so
das Gemisch auftrennt, und schließlich das auf diese Weise erhaltene Eluat fraktioniert.
Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den abhängigen Verfahrensansprüchen definiert. Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß es äußerst ökonomisch ist. Es ist weiter sehr vorteilhaft, daß das erfindungsgemäße Verfahren in einem niedrigen Druckbereich durchgeführt werden kann. Ebenso ist das Säulenfüllmaterial relativ billig, weil im erfindungsgemäßen Verfahren irreguläre statt sphärische Partikel verwendbar sind. Im Vergleich zu entsprechendem HPLC-Material ist das erfindungsgemäß eingesetzte Säulenfüllmaterial gegenwärtig etwa 20 mal billiger. Während der Reinigung werden die Peptidverbindungen weder denaturiert noch weisen sie einen Aktivitätsverlust auf; das erfindungsgemäße Verfahren ist also für die Peptidverbindungen äußerst schonend. Durch geeignete Wahl des Fließmittels können die Peptidverbindungen rasch und selektiv getrennt werden. Die erfindungsgemäß aufgetrennten, gereinigten Peptidverbindungen weisen erstaunlicherweise eine Reinheit von über 99% auf, was mit großer Wahrscheinlichkeit auf den Zusatz der erwähnten Chelierungsmittel und der erwähnten, stark polaren, organischen Verbindungen zurückzuführen ist. Weiters können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren große Mengen an Lösungsmitteln eingespart werden.
Der Nachweis der Peptidverbindungen in den Fraktionen erfolgt z.B. im UV-Licht bei einer Wellenlänge von 232 nm oder 275 nm. Zur Kontrolle der Reinheit und der Struktur des Peptides in den Fraktionen können die bekannten Methoden angewendet werden: beispielsweise HPLC, DC, Aminosäurenanalyse, Sequenzanalyse.
Falls ein Puffer im Fließmittel verwendet wird, so werden die entsprechenden Fraktionen vorteilhaft noch vor der. Lyophilisation entsalzt, z.B. an Ionenaustauschern oder mittels Holekularsieben.
Um das fraktionierte, erfindungsgemäß gereinigte Peptid als Festkörper zu erhalten, wird die entsprechende Fraktion beispielsweise lyophilisiert.
Mit dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren ist es möglich, beispielsweise 20-50 g Rohpeptid innerhalb von 3 Stunden zu reinigen.
Für das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren können Peptidverbindungen verwendet werden, die sowohl mittels Festphasensynthsse nach Merrifield ("Angewandte Chemie", Band 97, (1985),
Seiten 810 bis 812) als auch in der Flüssigphasensynthese ("Int. J.Peptide
Protein Res.",25, (1985), Seiten 449 bis 474) synthetisiert werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können insbesondere folgende Peptide gereinigt werden: Disulfid-Verbindungen, welche gemäß einem neuen Verfahren (beschrieben in der österreichischen Patentanmeldung A 1379/88) hergestellt worden sind, das im wesentlichen dadurch gekennzeichnet ist, daß man wenigstens ein Oxydationsmittel, welches kovalent oder elektrostatisch an eine feste Phase gebunden ist und welches - SH-Gruppen zu Disulfidbrücken oxydieren vermag, in Wasser unter Rühren vorlegt, dann eine wässerige Lösung der zu oxydierenden Peptidverbindung langsam dosiert derart zugibt, daß die Konzentration des zu oxydierenden Peptids so gering ist, daß die Wahrscheinlichkeit einer intermolekularen Reaktion der Peptidmoleküle vernachlässigbar klein ist, und die Reaktionsteilnehmer miteinander unter intensivem Rühren reagieren läßt, und anschließend die rohe, eine Disulfidbrücke aufweisende Peptidverbindung aufarbeitet. Es können aber auch mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Peptide gereinigt werden wie Terlipressin der Formel Gly-Gly-Gly-
Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2, CIS-Pressin der Formel Gly-Gly-Gly-C
ys-Tyr-Phe-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-HN2, Hamburger- Peptid der Formel Asp-Ser-Asp-Pro-Arg, Vasopressin und deren Derivate, Calcitonin, Somatostatin und Insulin. Es ist bevorzugt, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Terlipressin zu reinigen, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigte Terlipressin ist extrem sauber und hat andere Charakteristiken als ein im Handel erhältliches, herkömmliches Terlipressin, was auf das Fehlen von Verunreinigungen zurückzuführen ist.
Entsprechende Strukturformeln sind beschrieben in:
"Handbook of Biochemistry" C-164 bis C-188 - Amino Acid Sequences of Proteins, C-265 (Handbook of Biochemistry selected date for Molecular
Biology, 2nd ed tion (1970), Editor: Herbert A.SOBER, PhD, Published by: The Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, 44 128), und
" Int . J . Peptide Protein Res.", 15, (1980), Seiten 342 bis 354.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern.
Beispiel 1: Terlipressin
10 g Terlipressin (Rohpeptid) der Formel Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2, gelöst in 750 ml
destilliertem Wasser, wurde mittels einer MPLC-Anlage der Firma Labomatic
AG auf eine 45 x 880 mm Säule unter einem Druck von 15 bar aufgetragen.
Packung: Reversephasematerial C18-60. Das Peptid wurde dann mit einem
Fließmittelgemisch von 26 % Methanol und 74% 0,1 M Triethylammoniumphosphat (TEAP) pH 2,45, 0,4% DMSO und 0,05% EDTA mit einem Durchfluß von 60 ml/Min. eluiert und fraktioniert. Die Detektion des Peptides erfolgte bei
210 nm im Durchfluß. Das Peptid wurde dann mittels HPLC-Analyse in den
Fraktionen nachgewiesen und die entsprechenden Fraktionen nach
Zusammenschütten nach bekannten Methoden auf einem Ionenaustauscher entsalzt und lyophilisiert. Die Reinheit des somit erhaltenen Peptides wurde mittels HPLC-,
Aminosäuren- und Sequenzanalyse bestimmt. Ausbeute: 83%, Reinheit 99,8%.
Die analytische HPLC wurde wie folgt durchgeführt:
Säulengröße: 4,6 mm x 250 mm
Stationäre Phase: Spherisorb ODS II, 5μ
Mobile Phase: 74% 0,1 molares Triethynolammoniumphosphat, pH 2,25, 26% Methanol
Temperatur: 20°C
Druck: 148 bar
Fluß: 1,5 ml/Minute
Detektion: 210 nm
In Fig.1 ist das entsprechende Chromatogramm abgebildet. Die Ordinate entspricht der optischen Dichte bei 210 nm, und die Abszisse entspricht der Retentionszeit in Minuten.
Beispiel 2: CIS-Pressin
Es wird im wesentlichen wie in Beispiel 1 vorgegangen, jedoch mit folgenden Abweichungen: Säule: 52 x 480 mm
Packung: Reversephasematerial C18-20-100
Fließmittel: 18% Acetonitril / 82% 0,12 M TEAP pH 2,9 0,52% DMF, 0,05% NTA
Durchfluß: 18 ml/min.
Druck: 20 bar
Detektion: 232 nm Probemenge: 5 g gelöst in 200 ml dest.Wasser
Ausbeute: 78%
Reinheit: 99,5%
Beispiel 3: Asp-Ser-Asp-Pro-Arg Hamburger Peptid
Es wird im wesentlichen wie in Beispiel 1 vorgegangen, jedoch ist keine Entsalzung nötig, sondern eine direkte Lyophilisation der gesammelten Fraktionen. Weitere Abweichunαen waren:
Säule: 37 x 1083 mm
Packung: Reversephasematerial C18-30-60
Fließmittel: 10% Methanol / 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in dest.Wasser, 0,3% NMP, 0,045% EDTA
Druck: 17 bar
Durchfluß: 25 ml/Min.
Detektion: 210 nm,
Probemenge: 3 g gelöst in 70 ml dest.Wasser
Ausbeute: 85%
Reinheit: 99,7%
Claims
1. Verfahren zur Reinigung eines Rohpeptids mittels präparativer Mitteldruckflüssigkeitschromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß man - das zu reinigende Peptid in möglichst konzentrierter Form auf eine Chromatographie-Säule aufträgt, die "reversed-phase-silica"-Material, d.h. alkylierte hochkondensierte Polykieselsäure mit einer Korngröße von 20 bis 90 Mikrometer und mit einer Porengröße von 60 bis 300 Angström als stationäre Phase enthält, - dann bei einem Druck von 0 bis 40 bar mit einer mobilen Phase, bestehend aus
(a) einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel und Wasser, oder
(b) einem Gemisch aus wenigstens einem organischen Lösungsmittel und einer Pufferlösung mit einem pH-Bereich von 2 bis 10, oder
(c) einer rein wässerigen Pufferlösung mit einem pH-Bereich von 2 bis 10, wobei in allen drei obigen Fällen (a) bis (c) zusätzlich noch wenigstens ein Chelierungsmittel in geringer Konzentration und wenigstens eine stark polare organische Verbindung in geringer Konzentration vorhanden sein müssen, entweder isokratisch oder mit einem Gradienten eluiert, und so
- das Gemisch auftrennt, und
- das auf diese Weise erhaltene Eluat fraktioniert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die stationäre Phase eine Korngröße von 20 bis 60 Mikrometer hat.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die stationäre Phase eine Porengröße von 100 Angström hat.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das "reversed-phase-silica"-Material hauptsächlich irreguläre Silikat-Partikel mit einer Kettenlänge von C3 bis C18, insbesondere C8 oder C18, enthält.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Chelierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe der Aminocarbonsäuren, vorzugsweise Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), und der Nitrilocarbonsäuren, vorzugsweise Nitrilotriessigsäure (NTA).
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die stark polare organische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Hexamethylenphosphortriamid, Dimethylsulfoxid (DMSO) ,
Dimethylformamid (DMF) und N-Methylpyrrolidon (NMP) .
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das
Chelierungsmittel in einer Menge von 0,01 bis 0,1 Vol.-%, insbesondere 0,05 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der mobilen Phase, vorhanden ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die stark polare organische Verbindung in einer Menge von 0,05 bis 1 Vol.-%, insbesondere 0,5 Vol.-%, bezogen auf das Gesantvolumen der mobilen Phase, vorhanden ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das zu reinigende Peptid eine Konzentration von 1 bis 100 mg, insbesondere von 1 bis 10 mg, Peptid pro ml Lösung aufweist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel ausgewällt ist aus der Gruppe, bestehend aus Acetonitril, Ethanol, Methanol, Trifluoressigsäure und Methylenchlorid.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 , dadurch gekennzeichnet , daß man das zu reinigende Rohpeptid, welches vorzugsweise als wässerige Lösung oder als wässerig/alkoholische Lösung vorliegt , mit einer Pumpe auf die Chromatographiesäule aufträgt .
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Druck von 12 bis 15 bar eluiert.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 , dadurch gekennzeichnet , daß man bei einer Temperatur von 4 bis 80°C , insbesondere bei Raumtemperatur, vorzugsweise von 20 bis 25°C , arbeitet .
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 , dadurch gekennzeichnet , daß man ein Peptid, ausgewählt aus der Gruppe , bestehend aus Terlipressin der Formel Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-N H2, 
CIS-Pressin der Formel Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2, Hamburger 
Peptid der Formel Asp-Ser-Pro-Arg , Vasopressin und deren Derivate , Calcitonin, Somatostatin, und Insulin reinigt .
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - bis 14 , dadurch gekennzeichnet, daß der Gradient konkav , konvex oder linear ist, und eine Veränderung der Fließmittelzusammensetzung und/ oder eine Veränderung der Ionenstärke und/oder eine Veränderung des pH-Wertes umfaßt .
16. Peptidverbindung , insbesondere Terlipressin, vorzugsweise Terlipressin der Formal Gly-Gly-GLy-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2, gereinigt gemäß dem 
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
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