WO1984004930A1

WO1984004930A1 - Process for decomposing ascorbic acid

Info

Publication number: WO1984004930A1
Application number: PCT/JP1984/000306
Authority: WO
Inventors: Kazuhiko Yamanishi; Toshiro Hanada
Original assignee: Wako Pure Chem Ind Ltd
Priority date: 1983-06-13
Filing date: 1984-06-12
Publication date: 1984-12-20
Also published as: US4910134A; JPS59230161A; EP0148275A1; EP0148275A4; EP0148275B1

Description

明細書

ァスコルビン酸の分解方法

技術分野

本発明は、試料中のァスコルビン酸の新規分解方法に関するものである。

背景技術

ァスコルビン酸は、ビタミン Cとして周知の還元性物質であるが、これ.が:.被.検試.料例えば体液成分中に共存する場合には、被検試料中の目的成分を酸化還元反応 ¾利用して定量する際、ァスコルビン酸の還元性に起因して、正又は負の測定誤差 ¾与えることは良ぐ知られてる。

一方、ァスコルビン酸の分解方法としては、（1) ァスコルビン酸ォキシダーゼ ¾用る方法（特公昭 5 6 - 3 9 1 9 8 ) » (2)ヨウ素酸若しくはその塩 ¾用る方法、及び (³)過ョゥ素酸類若しくはこれらの塩 ¾用る方法（特開昭 5 6 - 1 0 9 5 9 5、特開昭 5 6 — 1 5 1 3 5 8、特開昭 5 6 - 1 0 7 1 6 1 )などが、報告されてる„

しかしながら、ァスコルビン酸ォキシダーゼ ¾用る上記（1)の方法は、ァスコルビン酸才キシダ―ゼが酵素であるため、酵素固有の問題点即ち熱安定性及び貯蔵安— 性が悪欠点があつた。しかも酸化還元反応 ¾利用する被検試料中の目的成分の定量に際しては、所要の試薬が全て 1液中に存在する一液型の試薬若しくは測定系に於て 1液となる試薬 ¾用て 1 ステップで反応させ発させることが強く求められてるが、上述の（1)の方 ¾ ¾この 1 ステツプでの反応に適用しょうとする場合^は、ァスコルビン酸才キシダーゼを多量に用なければ、測定の目的成分である基質に酸化酵素が先に作用し、まだ分解すべきァスコルビン酸が存在するうちに、酸化酵素による過酸化水素の生成反応が優先して進行する不都合が生じる。またこれを避けるためァスコルビン酸才キシダーゼを多量に用ることは、このものが高価であるため、経済性の点で問題があつた。

又、ヨウ素欒若しくはその塩 ¾用る方法及び過ヨウ素酸類若しくはこれらの塩 ¾用る方法は、これら酸化剤の酸化作用によつて酸化酵素などの酵素活性が阻害される場合が生じる問題があつた。また、酸化酵素がその酵素活性を阻害されることなく基質に作用して定量的に過酸化水素 ¾生成したとしても、生成した過酸化水素 ¾発色系に導くための被酸化性呈色試薬の発色至適 P H と、ヨウ素酸若しくはその塩、又は過ヨウ素酸類若しくはそれらの塩がァスコルビン酸 ¾分解する至適 p Hとが一致するような被酸化性呈色試薬が、現在のところ開発されてなため、前記 (2) 及び (3)の方法を 1 ステツプでの反応に適用することはできなかつた。又、過ヨウ素酸類若しくはこれらの塩 ¾用る場合は、過剰の過ヨウ素酸類若しはこれらの塩 ¾分解するアルコール類とかアルデヒド類とったような分解剤 ¾必要とするため、この点からも前記 (3)の方法 ¾ 1 ステップでの反応に、適用することはできな。

一方ァスコルビン酸が、二価の銅ィオン（ Cu ^2÷イオン)の存在下に酸化されてデヒドロアスコルビン酸及び H ₂0 ₂を生成する反^は古くから知られてる〔 E . S . GUZMAN BARRON , R . H . De ME I O , AN D FE I EDR I C H K LEMP ERER . J . Bi o l . Chem . 1 1 2 , 6 2 5〜 6 4 0 ( 1 9 3 6 )参照〕。しかしながら、これは、デヒドロアスコルビン酸と共に H₂0₂ が生成する反応であ ]?、そのためこの分解反応を、基質に酸化酵素を作用させることによ ])生成する H₂0₂ ¾測定して被検試料中の目的成分を定量する反応に適用することは、これら両方の反応で生成した

H₂0₂ ¾、各々、別々に、認識し又は検出できなければならなわけであるが、このことが実質的に不可能であることはうまでもな α

従って、このような、 Cu²⁺ イオンの存在下にァスコルビン酸が酸化されて分解するような反応を、基質に酸化酵素を作用させることによ ]?生成する H₂0₂ を測定して被検試料中の目的成分 ¾ 定量する反応に適用してみようとすることは、到底考え及ばなことであった。

本発明は、過酸化水素を生成させずにァスコルビン酸を分解する方法 ¾提供することを目的としている。

また本発明は、基質に酸化酵素 ¾ ί乍/ fiさせて H ₂0₂ を生成させ、この H₂0₂ を定量する体液成分の定量法に於て、該反応系に含有されるァスコルビン酸 ¾効果的に除去することができる分解方法を提供すること ¾目的としている。

更に本発明は、ァスコルビン酸の分解と、被検試料を酵素反応させ、発色系に導く工程とを、 1 ステノブで行うことができるァスコルビン酸の分解方法を提供すること目的としてる。

発明の

本発明者らは、このような現状に； ¾み、： Wイオンの存在下のァスコルビン酸の分解反応に付き鋭意研究の途上、ァスコルビン酸

O PI が銅ィォンの存在下に酸化されてデヒドロアスコルビン酸及び H ₂ 0 ¾生成する反応が存在すること、及びそのような分解反応には銅ィオンの他にペルォキシダ—ゼ及び、 ① 4—アミノアンチピリン、 ② 3 —メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン、 ③ 2, 2'— アジノビスぐ 3 一ェチルベンゾチアゾリンー 6 —スルホン酸）、 ④ トリフヱ -ルメタン系ロイコ色素、 ⑤フヱノ一ル系化合物、 ⑥ ァニリン系化合物及び⑦ナフトール系化合物から成る群よ 1)選ばれた一種又は二種以上の化合物の存在が必要であること、更に、この方法が基質に酸化酵素 ¾作用させて H ₂0 ₂ ¾生成させ、これを測定することに i?被検試料中の目的成分 ¾定量する、体液成分の定量方法に適用し得ること ¾見出し、本発明を完成するに到つた

即ち、本発明は一価又は二価の銅イオン、ベルォキシダ一ゼ、及び下記①〜⑦から成る群よ選ばれた一種又は二種以上の化合物を共存させること ¾特徵とする、ァスコルビン酸の分解方法で ¾ る。

① 4 — ァミノアンチピリン（ 4 一 )

② 3 — メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ M B T H )

③ 2 , 2,—アジノビス（ 3 一ェチルベンゾチアゾリンー 6 —スルホン酸 ) C A B T S )

④トリフヱニルメタン系ロイコ色素

⑤フヱノール系化合物

⑥ァニリン系化合物

⑦ナフトール系化合物

本発明の反応は、次式に従って進行する。ァスコルビン酸 C U ^{2 +} ，ペルォキシダ一ゼ

^{+ 02} 上記①〜⑦の化合物の一種又は二種以上デヒド α ァスコルビン酸 + Η ₂0

従来、ァスコルビン酸の酸化分解反応の反応系に Cu ^{2 +} イオンが存在すれば、デヒドロアスコルビン酸と共に生成する物質は

H ₂0 ₂ であると固定的に考えられてたこと ¾考慮に入れると、そのような C.u²⁺ ィォンが存在するァスコルビン酸の酸化分解反応に於てデヒドロアスコルビン酸が生成すると共に H ₂ 0 が生成する反応が存在することは、全く思も寄らず、極めて意想外のことであるとわざるを得ない。

また、 -従来、ァスコルビン酸を分解する銅イオンは 2価の銅ィオンであるとされてたが、本発明者らは、 4一ァミノアンチピリンゃ 3 — メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン等の還元性 #J質の共存下に於ては、 Cu ²⁺は還元されて Cu + として存在し、尚且つ、ァスコルビン酸を分解して、これ ¾ デヒドロアスコルビン酸と H ₂0に変え得ることをも見出した。ち. ァスコルビン酸を分解する銅ィ才ンは二価の銅ィオンに限定されるものではなく、一価の銅ィオンも同様の作用効果 ¾奏することを本発明者らは初めて見出したのである。

また、本発明の方法を実施するに用いる 1 価叉は 2価の銅ィ才ン、ペルォキシダーゼ、及び① 4 ーァ； ' ノアンチピリン、 ② 3 — メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン、： 2 , 2 '—アジノビス（ 3 ーェチノレべン：チアン' リンー 6 — スノレ - T- ン / ¾ ) 、 ④ トリフエニルメタン系ロイコ色素、 ⑤フ Xノール系化' ¾J、 ⑥ァ - リン系化合物及び⑦ナフトール系化合物から成る詳ょ選ばれた一種又は二 o而種以上から成る新規な試薬組成物は、ァスコルビン酸と同じ還元性物質であるビリルビンにも作用して、その還元性を失わせる効杲¾も併せて有する。従-つて、本発明の方法 ¾ H ₂0 ₂のような酸化性物質 ¾測定することによ U 目的成分を定量するような反応即ち、酸化還元反応レドックス反応：）によ ]) 目的成分 ¾定量する反応に、これ ¾適用すると、そのような反応系に存在するァスコルビン酸やピルビンのような還元性物質の妨害を効果的に回避することができるので、目的成分を、そのような妨害による悪影響なしに、正確に定量することができる。

本発明に於て、 H₂0 ₂ の生成なしにァスコルビン酸 ¾分解させるに必要な銅イオンは、 1価の銅ィオンであっても、 2価の銅ィオンであってもよが、 2価の銅イオンが好まし。また 2価の銅イオン ¾使用しても、反応系に於ては、併用する上記①〜⑦ の試薬の還元力の強さによ ]?、 1価のィオンの状態で存在することも、 2価のイオンの状態で存在する-こともあ！）得る。

本発明に於て、 H ₂0 ₂ の生成なしにァスコルビン酸 ¾分解させる目的で、 1価又は 2 "(ffiの銅イオン及びペルォキシダ一ゼと共に用られる、 4ーァミノアンチピリン、 3 — メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン、 2 , 2 '— アジノビスぐ 3 —ェチルベンゾチアゾリン一 6 — スルホン酸）、トリフエニルメタン系ロイコ色素、フエノ一ル系化合物、ァニリン系化合物及びナフトール系化合物に於て、トリフヱ - ルメタン系ロイコ色素の具体例としては、従来ら公知のロイコマラカイトグリーン、ロイコクリスタルヴアイォレット等の他、最近開発された、ビス（ p—ジェチルアミノフェ -ル） 2一スルホフエ二ノレメタン、ビス（ p—ジェチノレアミノ

( O PI フエ -ル） 4 ースルホフ。ロホ。キシフエ -ルメタンナトリゥ厶塩、ビス p—ジェチルァミノフエ -ル） 3,4 — ジスルホプロポキシフエ -ルメタンジナトリウム塩（以下、 B S dipro P M と略称する。）等が挙げられる。

また、フヱノール誘導体の具体例としては、フエノール、 P — クロ口フエノール、 2,4— ジクロロフエノ一ル、 /^一プロモフエノール、ひ一クロ口. フエノール、 m—ク'ロロフェノールなと力挙げられ、ァ - リン誘導体としては、ァ - リン、 Ν,Ν—ジメチルァ二リン、 Ν，Ν一ジェチル丁二リン、 Ν,Ν—ジェチルー m— トルイジン、 3— メチル一 N—ェチルー N— —ヒドロキシェチル）一ァ - リ -ン、 N一ェチル N— ( 2 ーヒドロキシー 3—スノレホフ。 π ピル ) 一 m— .トルイジン、 3,5 — ジメチル一 N—ェチルー N— ( 2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル）ァニリン、 3， 5—ジメトキシ一 ; N— ェチノレー ( 2—ヒドロキシ一 3—スルホフ。口ピル ) ァ - リンなどが挙げられる。

更に、ナフトール誘導体としては 1 —ナフトール、 1 —ナフト — ル一 2— スノレホン酸、 1一ナフトール一 2— カノレポ'ン酸、 1 — ナフト一ソレー 8— スルホン酸、 1 — ナフトール一 3— スルホン酸、 1— ナフトール一 5—スルホン酸などが ^げられる。

本発明の、還元性物'質の分解反応は、通常は、溶液中で実施される。

そのような溶液中の Cu⁺又は Cu^ イオン邊^としては、通常、 0.0 0 1〜 1 m mo 1 であ ]?、 p Hは、 ^えば、 6.0〜 8.5力選ばれ、そのような ρ Ηに溶液を維待すめの緩 ¾液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン塩緩衝液、グッド緩衝液など、汎用されているものが使用されるが、その好まし一例として、 0.0 0 1〜 2 Mリン酸緩衝液が挙げられる。

そのような溶液中に於て、 Cu⁺又は Cu²⁺ イオンを与える化合物としては、例えば、硫酸銅、塩化第二銅、塩化第一銅、硝酸銅，臭化第二銅、臭化篛一銅、リン酸第二銅などの水溶性無機銅塩、酒石酸銅、クェン酸銅、酢酸銅などの水溶'性有機銅塩、などの水溶性銅化合物、が拳げられる。一

本発明に用られるペルォキシダ—ゼの濃度は、通常 2 0〜

5 0 0 0 UZif であ]?、好ましくは、 5 0〜 2 0 0 0 ϋΖ ^であ。

また、 4一アミノア.ンチピリン（ 4一 A A Ρ ) の濃度は、通常, 0.0 0 1〜 0.0 5 %であ ]?、好ましくは、 0.0 0 3〜0.0 3 で

3— メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ M B T H ) の濃度は、通常、 0.0 0 0 5〜 0.2 %であ ]?、好ましくは、 0.0 0 1〜

0.0 5 ^である。

2，2'—アジノビス（ 3—ェチルンゾチアゾリン一 6—スルホン鍥） C A B T S ) の濃度は、通常、 0.0 0 2〜0.45¾であ、好ましくは、 0.0 2〜 0.2 %である。

トリフニルメタン系ロイコ色素の濃度は、通常、 0.0 0 5〜 0.5 1111101ダ^でぁ ]?、好ましくは、 0.0 3〜0.3 mmol Z

て ¾>る o

また、フヱノ一ル系化合物、ァニリン系化合物又はナフト一ル系化合物の濃度は、通常、 0.0 1〜 0.5 %であ ]?、好ましくは、

Ο ΡΙ 0 . 0 3〜0 . 3 である。

本発明の還元性物質の分解方法は、またすベての試薬が吸収性担体中に又はフィルム中に乾燥した形で存在する試験紙にも同様にして用ることができる。

生体液中の成分の測定に先立って前処理として本発明方法を行なうと、ァスコルビン酸及びビリルビンは速やかに酸化されて、その妨害作用は消失する。

本発明の還元性物質の分解方法 ¾適用して特に効果的な測定方法は、被検試料が体液であ、定量の目的成分が体液成分であるような測定方法であるが、そのような、目的成分 ¾定量する反応として代表的なものに、定量の目的成分が基質又は酵素であつて且つその酵素が基質に作用して H ₂0 ₂ を生成するような酸化酵素である酵素反応があ ]?、このような反応の例としては、基質がグルコース、コレステロール、グリセ口一ル、グリセローノレ 'リン酸エステル、コリン、ァシル C 0 A、ピルビン酸、尿酸、キサンチン又は乳酸であ？、それらの基質に作用する ¾化酵素が、各々グルコ一ス才キシタ'— }f、コレステロ一ノレ才キシタ-— fef、グリセ口一ノレォキシタ *— ゼ、グリセロ一ルリン酸エステノレォキシタ *— *ゼ、コリン才キシタ'ーゼ、ァシル C 0 A ォキシダ一ゼ、ピルビン酸ォキシダ一ゼ、ゥリカ一ゼ、キサンチン才キシダーゼ又は乳酸才キシダ― ゼである系等が挙げられる。

このような反応で生成した H ₂ 0 ₂ を^ 'ύ·することによ ]? 目的成分 ¾定量する場合は Η ₂0 ₂ とペル才キ ζ ：—ゼの存在下に酸化されて呈色する被酸化性呈色試薬を用、 'ii成した Η ₂0 ₂ によるこの試薬の呈色を測定することによって目的成分を定量するのが、

0丽 γ i —殺的である。

かかる目的に用られる被酸化性呈色試薬としては、 4 -アミノアンチピリン（： - A A P ) とフヱノール系化合物との組合せ試薬、 4 -ァミノアンチピリンぐ - A A P ) とァ- リン系化合

5 物との組合せ試薬、 4一ァミノアンチピリン（ 4— A A P ：)とナ

フトール系化合物との組合せ試薬、 3 — メチルベンゾチアゾリゾンヒドラゾン（ M B T H ) とァ-リン系化合物との組合せ試薬、 2 , 2'一アジノビス ( 3 — ェチルベンゾ.チアゾリン一 6—スルホン酸）（ A B T S ) > トリフヱニルメタン系ロイコ色素等、先に述

0 ベた、本発明に於て、 H ₂0 ₂ の生成なしにァスコルビン酸を分解

させるに-必要な試薬と同じものが、単独で、若しくは組合せ試薬として挙げられる。また、ここで使用するトリフエニルメタン系ロイコ色素、フヱノール系化合物、ァ- リン系化合物、ナフトール系化合物等の具-体例も、先に述べた本発明で用られるトリフ5 ニルメタン系ロイコ色素、フノール系化合物、ァ- リン系化合物、ナフト —ル系化合物の具^例と同じものが挙げられる。

本発明の方法 ¾適用した基質に酸化酵素 ¾作¾させて H₂0 ₂ ¾ 生成させ、これ ¾測定することによ 1?被検試料中の目的成分 ¾定量する^液成分の定量方法に於ける定量試薬の例を挙げると、次

Q のとお ]3である。

(1)基質測定用の系がダルコ — ス ¾測定するために用られ、ベルォキシダ一ゼ、グルコースォキシタ *— ゼ、 4 ーァミノアンチピリン、フヱノ一ル又は Ν,Ν—ジェチルキシリジンおよび緩衝剤を含有する試薬。

5 (2)基質測定用の系が尿酸 ¾測定するために用られ、ペルォキ

ΟΜΡΙ シタ，—ゼ、ゥリカ— ¾f 、 N—ェチルー N—ヒドロキシェチルー m ートルイジン、 4一ァミノアンチピリンおよび緩衝剤 ¾含有する

(3)基質測定用の系がコレステロールを測定するために用られ、ペル才'キシタ，一ゼ、コレステロ一ノレエステル- ヒドロラ— if _¾ コレステロール才キシタ *—ゼ、 4一ァミノアンチピリン、フエノール又は N—ェチル— N—ヒドロキシェチソレ一 m— トルィジンおよび緩衝剤を含有する試薬。

(4)基質測定用の系がトリグリセライドを測定するために用られ_¥ ペル才キシタ *— ゼ、リホ。フ。口ティンリハ'一ゼ、グリセロキナ —ゼ、グ- .リセ口一ルー 3 — リン酸ォキシダ一ゼ、 4一アミノアンチピリン、 Ό一クロルフエノール又は N—ェチル— Nーヒドロキシェチル一 m— トルイジンおよび锾衝剤を含有する試薬。

(5)基質測定用の系がリン脂質 ¾測定するために用いられ、ペルォキシダーゼ、ホスホリパ一ゼ D、コリンォキシダ一ゼ、 4 ーァミノアンチピリン、フヱノール又は N—ェチル一 N—ヒドロキシェチルー m— トルイジンおよび緩衝剤 2"有する試薬。

(6)基質測定用の系がァシル Co A を測定するために用いられ、ペル才キシタ'一ゼ、ァシル C 0 A 才キシダ一ゼ、 4 ーァミノアンチピリン _¼ p — クロノレフエノール又は N—ェチル— Nーヒドロキシェチルー m— トルイジンおよび緩衝 'n t 有する試薬。

(ァ)基質測定用の系がピルビン酸 ¾測' するために用られ、ぺルォキシタ *—ゼ、ピルビン酸ォキシタ'— ゼ、フラビンアデニンジヌクレオチド、チアミンピロホスフェート、 4 — ァミノアンチピリン、 p—クロノレフエノ一ル又は N—ェチルー Nーヒドロキシェ

¾£4 O PI

V,'I?0 •^ ΛΤΙΟ^ i チル——m— トルイジンおよび緩衝剤 ¾含有する試薬。

(8)基質測定用の系がグリセロール ¾測定するために用られ、ペルォキシダーゼ、グリセ口一ルォキシダーゼ、 4一アミノアンチピリン、 p—クロルフェノール又は N—ェチル一 N— ヒドロキ

⁵ シェチル一 m— トルイジンおよび緩衝剤を含有する試薬。

(9)基質測定用の系がコリン ¾測定するために用られ、ペルォキシダーゼ、コリンォキシダ一ゼ、 4一ァミノアンチビリン、フエノ一ル又は Nーェチルー Nーヒドロキシェチル一 m—トルイジンおよび緩衝剤 ¾含有する試薬。

0 な0基質測定用の系がグリセロ—ルー 3—リン酸を測定するために用いられ、ペルォキシダ一ゼ、グリセ α — ル一 3 — リン酸ォキシダーゼ、 4 — ァミノアンチピリン、 ρ—クロルフヱノール又は 1ST—ェチル一 Ν—ヒドロキシェチル一 m— トルイジンおよび緩衝剤 ¾含有する試薬。

s W基質測定用の系が尿酸 ¾測定するために用いられ、ペル才キシダ一ゼ、ゥリカーゼ、 2， 2 ,一アジノ — ビス一（ 3—ェチルベンゾチアゾリソー 6 — スルホン漦 )及び緩衝剤 ¾含有する試薬。

上のような定量用試薬 ¾用いて被検試料中の ^液成分 ¾定量する方法に、本発明に係るァスコルビン酸の分解方法及び分解用0 試薬を適用する場合は、酸化還元反応（：レドックス反応） ¾利用する被検試料中の目的成分の定量の際、最も要求される、所要の試薬が全て一液中^存在する一液型の試薬若しくは測定系に於て

1 液となる試薬を用て 1 ステツプで反応させた場合に於ても、それら酸化性物質や還元性物質 ¾測定することによ ]3 目的成分 ¾S 定量する反応系に共存するァスコルビン酸ゃビリルビンの還元性物質の妨害を効果的に回遂することができるので、目的成分を、そのような妨害による悪影響なしに、正確に定量することができる。

例えば、血清中の遊離コレステロールを定量するには、 CuS0₄' 5 H₂0 0.0 0 1〜： L m mo 1ノ ^、 4 - A A P 0.0 0 3〜

0.0 3 、フヱノール系化合物、ァ - リン系化合物又はナフト一ル系化合物 0.0 3〜 0.3 %、ペル才キシダ一ゼ 5 0〜 2000 / di. コレステロール才キシダーゼ 5 〜； L O O UZ 及び界面活性剤 0.0 5〜 0.2 %の濃度になる量加え、これら ¾溶解した緩衝液 ¾測定試案として用ると、血清中に存在するァスコルビン酸ゃ 'ビリルビンのような還元性物質の妨害 ¾効果的に回避し、よ ]?正確な遊離コレステロール値 ¾測定することができる。

図面の簡単な：说明

第 1図は、実施例 7 . に於て得られた検量線を表わし、横軸の各総コレステロール濃度 ; / ) につて得られた吸光度（ 0 D ) を縦軸にヽつてプロットした点を結んものである。

第 211は、実施例 8 . に於て得られた ^ a線を表わし、横軸の各グルコース嬝度（： ^ ）につてィ善られた吸光度（ 0 D ) ¾ 縦軸に、つてプロットした点を結んだものである。

発明を実施するための^ ¾の形態

ァスコルビン酸の分解

実施例 1 .

〔測定試薬〕

①第 1試液： C.u S 0₄ · 5 H ₂0、ペルォ -f ンダ一ゼ（ P 0 D ：) 、フエノール、 1—ナフトール一 2—スルホン酸、 4— AA Pを夫

OMPI 夫単独で、又は二種以上組み合わせた次表 1に記載の組成のものを、 0.0 5 Mリン酸緩衝液（： p H= 7.0 ) に溶解させる。伹し、 Cu S 0₄ · 5 H₂0は 0.0 0 3 %、 P 0 Dは 3 0 0 ϋノ、フエノールは 0.1 ^、 1一ナフトール一 2— スルホン酸は 0.1 ^、 4 - Α ΑΡは 0.0 1 の濃度になるように調製する。

②第 2試液（発色試液）： Ρ 0 D¾ 3 0 0 ϋ 、フヱノール ¾ 0.1 %、 4一 A A Ρを 0.0 1 %の濃度になるように、 0.0 5 Mリン酸緩衝液（ p H = 7.0 )に溶解させたものを、発色試液とする < 伹し、第 1試液で 1—ナフトール一 2— スルホン酸 ¾含む試液 ¾用た場合には、第 2試液（発色試液）として、 P O D¾ 300 ϋ ί¾、 -1—ナフトール一 2— スルホン酸 ¾ 0.1 、 - A A Ρ ¾ 0.0 1 9δの濃度になるように、 0.0 5 Μリン酸緩衝液（ ρ Η = 7.0 ) に溶解させたものを用る。

〔測定方法〕

ァスコルビン酸溶液〔 1 0 0 s ^ノ c¾ ) ¾ 5 0 と！)、これに第 1試液 2； ^を加え、 3 7 °Cで 3分間加温した後、箅 2試液 (発色試液） 2 /^を加え、 3 7 ¾で 5分間加温する。試薬肓撿 ¾対照として波長 5 0 5 n mに於ける吸光度 ¾測定する。測定結杲¾表 1に示す。

OMPI 第 1 試液中の組成吸光度（OD〕

C S 0₄ 0.205

Cu S 0₄ . P O D 0.164

Cu S 0₄ , P O D ， 4一 A A P 0.000

Cu S0₄ , P O D ，フエノール 0.001

CuS0₄， POD , 1一ナフトール一 2—スルホン酸 0.001

CuS0₄ , POD，フエノール， 4— AAP 0.001

CuS0₄. POD , 1一ナフト一ルー 2—スルホン酸， -ΑΑΡ 0.001

Cu S 0₄ , 4 - A A P 0.206

Cu S0₄ ，フエノール 0.203

Cu S 0₄ , 1一ナフトール一 2—スルホン酸 0.202 注）ァスコルビン酸が分解して H₂0₂ ¾生成してる場合には、系内の 4— A A Pとフエノール、あるは 4一 AA Pと 1 一ナフト—ルー ₂—スルホン酸が、その H₂0₂ によ ]?酸化 ¾受けて波長

5 0 5 n m近辺に吸収が現われる。

本実験よ iP、銅イオンと P O Dの他に、 4一 A A P、フヱノ一ル、 1—ナフトール一 2—スルホン酸、フエノールと 4 — A A P 及び 4— AA Pと 1—ナフトール一 2—スルホン酸が共存してる場合には、 H₂0₂ の生成が認められなことがわかる。但し、第 1試液中に、銅イオンと P O Dの他に、 4一 AA P、フヱノ一ル、 1一ナフトール一 2— スルホン酸のずれか 1つ力共存してる場合には、仮に H₂0₂ が生成したとしても、卩 00と 4 ー A P、フエノール又は 1—ナフト一ルー 2— スルホン酸に

i- H₂0₂ が消去されてしまうため、見かけ上検出されなことも考えられる .（ 4一 A A P単独、フエノール単独、又は 1一ナフトールー 2 —スルホン酸単独の場合には、酸化されても外観上さほど変化がな為、本実験からでは確認できな）。そこで、次に、

5 これらの場合にも、ァスコルビン酸が Η₂0₂ の生成を伴わずに分

解されてること ¾確認する実験 ¾行なった _c

実施例 2 .

〔測定試薬〕

①第 1試液： Cu S 0₄ * 5 H₂0 ¾ 0.0 0 3 ^ » P O D ¾ 3 0 0 Uo / άί、及び 4一 Α Α Ρを 0.0 1 7 ？ S C又はフエノール ¾ 0.0 1 °h、又は 1一ナフトール一 2 — スルホン酸を 0.0 1 °h ) の濃度になるように、_ 0.0 5 Mリン酸緩衝液 C p H= 7.5 ) に溶解させる。

②第 2試液（発色試液：）： Na I 0₄ ¾ 2 0 τψ/ di、フノ一ル ¾ 0.1 ^ ( 又は 4一を 0.0 1 °h ：)の ¾¾になるように、 0.05s Mリン酸缓衝液（ p H= 7.5 ) に溶解させる。

伹し、第 1試液で 4一 A A P ¾含む試液を用' た場合には、第 2試液でフエノール ¾含む試液を ί更用し、第 1 試液でフヱノール又は 1 —ナフト一ルー 2— スルホン酸 ¾含む試液 ¾用た場合には、第 2試液で 4一 A A Ρ ¾含む試液を使用する。

» 〔測定方法〕

試料として、ァスコルビン酸 ¾各々、 Q Z d£ , 1 Q Q Z ， 2 0 Q τψ / di 1 I mmo l ）の -濃度になるように、 0.0 5 Mリン酸緩衝液（ p H= 7.5 ) に溶解させたもの、あるは、

H₂0₂ を各々、 O m mo l Z ， 5 m mo 1 / ^ , 1 0 mmo I / ^55 の濃度になるように 0.0 5 M リン酸缓衢液に溶解させたもの ¾用

f OMPI る。

試料を 1 0 0 と ]?、これに第 1試液を加え、 3 7 °C で 1 0分間加温する。この混合液 ¾ 1 0 0 と！）、これに第 2 試液（発色試液） 3 を加え、 3 7 °Cで 5分間加温後、試薬盲検 ¾対照として波長 5 0 5 n mに於ける吸光度 ¾測定する。測定結果を表 2に示す。 . -

OMPI ん 2

0

* ：第 1 試液中のィ才ン及び P 0 DJ!il外の成分,

i 以上 _¼ 銅イオンによるァスコルビン酸の分解に於て、共存して

る 4一 A A P、フエノール、 1一ナフト一ルー 2ースルホン酸

' が何ら変化を受けてなので、本反応系では H₂0₂ の生成はな

' とえる。一方、ァスコルビン酸とほぼ等モル量の H₂0₂ を試

5 料とした場合には、明らかに H₂0₂ による 4一 A A P、フエノー

ル、 1—ナフトール一 2—スルホン酸への酸化が起こ ]3、 4 - A A P共存系では赤色に、フヱノール系、ナフトール系では黄褐色に着色した。反応系の H₂0₂ の残存濃度 ¾測定すると H₂0₂ は明らかに消費されてることがわかる。

10 実施例 3 .

〔測定試薬〕

①第 1試液： Cu S 0₄ · 5 H₂0、 P O D, 3 —メチル一N—ェチルー N— ( ?—ヒドロキシェチル）一ァ - リン（ ME H A ) 、 3 ― メチル一 2—べンゾチアゾリノンヒドラゾン（ M B T H ) ¾夫

15 夫単独で、又は二種以上組み合わせた次表 3に記載の組成のもの

を、 0.0 5 Mリン酸緩衝液（ p H = 7.0 ) に溶解させる。但し、 Cu S 0₄ · 5 H₂0は 0.0 0 3 %、 P 0 Dは 3 0 0 Z d£、 M EHA は 0.0 5 % . MB T Hは 0.0 3 %の饞度になるように調製する。

②第 2試液〔発色試液）：第 1試液で M E H Aを含む試液を用

, ₂₀ 一— _ _¾-.^g. _t¾¾ 第 2試液〔発色試液）として、 P O D ¾ 3 0 0 UZ

c 、 4一 A A Pを 0,0 1 %の濃度になるように、 0.0 5 Mリン ί 緩衝液（： ρ Η= 7.0 ：) 溶解させたもの ¾用、第 1 試液で M B T H¾含む試液 ¾用た場合には、第 2試液（発色試液）として、 P O Dを 3 0 0 UZc¾、 Μ Ε ΗΑ¾ 0·0 2 %の濃度になるように、

25 0.0 5 Μリン酸緩衝液（： ρ Η = 7.0 ：) に溶解させたもの ¾用いる。

OMPI 、ーまた、第 1試液中に M E H Aも M B T Hも含まな場合には、第

2試液（発色試液）として、 : P O Dを 3 0 0 TJ / 、 M E H A ¾

0.0 5 、 4 - AA Pを 0.0 1 の濃度になるように、 0.0 5 M

リン酸緩衝液（ p H = 7.0 )に溶解させたものを用る。

〔測定方法〕

ァスコルビン酸溶液（ 1 0 0 ί Ζ c¾ ) ¾ 5 0 と ]?、これに

第 1試液 2 ^¾加え、 3 7 °Cで 5分間加温した後、第 2試液

(発色試液：） 2 ^¾加え、 3 7 °Cで 5分間加溫する。試薬盲検

¾対照として波長 5 5 0 n mに於ける吸光度 ¾測定する。測定

結杲¾表 3に示す。

- 表 3

本実験よ ]?、第 1試液中に、銅イオン ¾ P 0 D 他に、 ME H

A又は M B T珏が共存してる場合には、外観上、 Η₂0₂ の生成

はないようである。しかしながら、本実験からでは、ァスコルビ

ン酸の分解が確かに Η₂0₂ の生成なしに起こってるかどうかは

わからなので、これ ¾確認するため、次のような実験 ¾行なつ

OM?I

, "丄 ¾ 実施例 4 .

〔測定試薬〕

①第 1試液： Cu S 0₄ ' 5 H₂0 ¾ 0.0 0 3 ^ _¾ P O D ¾ 3 0 0 U / di, 及び ME H A ¾ 0.0 1 9 °h ( 又は M B T H¾ 0.0 2 5 ° ) の濃度になるように、 0.0 5 M リン酸緩衝液（ P H = 7.5 )に溶解させる。

②第 2試液（発色試液）： Na 10₄ ¾ 2 0 W/ di、 4 - A A P ¾ 0.0 1 ¾δ C又は M E H Aを 0.0 1 °h ) の濃度になるように、 0.05 M リン酸緩衝液（ p H = 7.5 ) に溶解させる。

但し、第 1 試液で M E H A ¾含む試液 ¾用た場合には、笋 2 試液で 4-一 A A P ¾含む試液 ¾使用し、第 1 試液で M B T H ¾含む試液 ¾用いた場合に.は、第 2 試液で M E H A ¾含む試液 ¾使用する。

〔測定方法〕

試料として、ァスコルビン酸 ¾各々、 Q Wノ d£ , 1 0 0 Z d ，

2 0 0 / dt C 1 1 m m 01 ノ）の濃度になるように 0.0 5 M リン酸緩衝液（： p H = 7.5 ：) に溶解させたもの、あるは、 Η₂0₂ ¾各々、 O m mo l , 5 m mo l ^ ， 1 O mo l Z の濃度になるように 0.0 5 M リン酸緩衝液を溶解させたもの ¾用る ₀

試料 ¾ 1 0 0 と ])、これに第 1試液 2 ^¾加え、 3 7 ^UC で 1 0分間加温する。この混合液 ¾ 1 0 0 /^ と！？、これに第 2 試液（発色試液） 3 . を加え、 3 7 °Cで 5分間加温後、試^ 検¾対照として波長 5 5 0 n mに於ける吸光度 ¾測定する。測定結果 ¾表 4に示す。 4

^ 第 1試液中の銅イオン及び P 0 D以外の成分。

以上、銅イオンによるァスコルビン鍥の分解に於て、共存してる ME-HA、 M B T Hが何ら変化を受けてなので、本反応系では H₂0₂ の生成はなとえる。一方、ァスコルビン酸とほぼ等モル量の li₂0₂ を試料とした場合には、明らかに H₂0₂ による ME HA、 M B T Hへの酸化が起こ、残存 ¾度¾測定すると明らかに H₂0₂は消肇されてることがわかる。

実施例 5 .

〔測定試薬〕

(a) Cu S 0₄ - 5 H₂0 0.0 0 3 %、 P O D 3 0 0 U/ A B T S 0.1 %を、 0.0 5 Mリン酸锾 ίϋπ夜 C p H= 7.0 ) に溶解させたもの。

(b) Cu S 04 · 5 H₂0 0.0 0 3 %、 P O D 3 0 0 \J / di. ビス ( p— ジェチノレアミノフエ二ノレ ) 3,4 — ジスルホプロボキシフェニルメタンジナトリウム塩（以下、 B S dipro P M と略称する。） 0.0 5 mM¾、 0.0 5 ^1リン漦¾ 『_:' ( 9 11 = 7.0 ) に溶解させたもの。 C測定方法〕

ァスコルビン酸溶液（ 1 0 0 ^ ） ¾ 5 0 ^^ と ]?、これに測定試薬 (a)又は (b)を加え、 3 7 Cで 3分間加温した後、試薬盲検を対照として、夫々波長 6 6 0 n m、又は 6 2 0 n mに於ける吸光度 ¾測定する。測定結果を表 5 · に示す。

表 5.

本実験-よ ]?、銅イオンと P O D及び A B T Sが共存する場合、並びに銅ィオノと P O.D及びトリフヱニルメタン系ロイコ色素が共存する場合にも、ァスコルビン酸が H₂0₂ の生成 ¾伴わずに分解されてることがわかる。

次に、本発明の反応系に於て、銅イオンが 2価で存在して'いるか、 1価で存在してるかを確認する実験を、 Cu+の発色剤であるバソクブロインスルホン酸ナトリゥ厶 ¾用て行なった。

実施例 6 .

測定試料〕

Cu S 0₄ - 5H₂0、 P O D. フエノール、 1一ナフトール一 2 ースルホン酸、 4— A A P、 A B T S、 B S dipro PM、 M B T H¾夫々各種組み合わせたものを、 0.0 5 Mリン酸緩衝液（ p H = 7.0 ) に溶解させる。但し、 Cu S0₄ · 5H₂0は 0.0 0 3 ^、 P O Dは 3 0 0 U 、フエノールは 0.1 、 1 —ナフトール一 2—スルホン酸は 0.1 %、 4一 AA Pは 0.0 1 %、 A B T Sは 0.1 %、 B S dipro P Mは 0.1 m mo 1 ^、 MB T Hは 0.1 ^ の濃度になるように調製する。

〔発色試液〕

ノくソクブロインスルホン酸ナトリゥム 1 0 Μ /ί¾¾ 0·5Μリン酸 ¾衛 C Ρ Η= 4.4 ) に溶解させる。

〔測定方法〕

各種組成の測定試料 0.5 に、発色試液 2 ^¾加え、波長 4 8 0 n mに於ける吸光度を測定し、これよ ]?測定試料中の Cu^÷ の濃度を算出する。更に、この反応液中に、ァスコルビン酸 20 ¾加え、再び、波長 4 8 0 n mに於ける吸光度 ¾測定し、これよ ] 測定試料中の Cu⁺の濃度 ¾算出する ₃ 測定結杲 ¾表 δ . に示す。

= 6

* 反応液が黄緣色とな判別がつかな。しかし、この系に 4一 A A Pを添加したところ、黄褐色とな、明らかに Cu +は Cu+ となって、バソクプロインスルホン酸ナトリゥ厶と反応が起こってることが確認できた。従って、 A B T Sと Cu² とでは、 Cu+にはなってなことがわか。

上記実験よ ])、 2価の鈉イオンは、フエノール、 1 —ナフト一ル一 ₂ ースルホン酸、 3で 3又は 8 3 <11 ₁"0 ?丄¼ と共存の-湯小 ·Λ'.{ S 合には、 2価の銅イオンのまま存在してるが、 4一 AA P、又は M B T Hと共存の場合には、 1価の銅イオンとして存在してることがわかる。

体液成分測定系に於けるァスコルビン酸 ¾しくはビリルビンの；分解

実施例 7 . 血清総コレステロールの測定

〔測定試薬〕

各々、硫酸銅 0.1 2 mmo l /^、フエノール 0.1 %、 4—ァミノアンチピリン 0.0 1 、ペルォキシダ一ゼ C P O D ) 6 0 0i JJノ d£、コレステロールエステルヒドロラ一ゼ 3 0 XJZi¾、コレステロー-ルォキシタ -ーゼ 1 5 ϋ Z 、ロッシヱル塩 0.5 %、トリトン； L 0 0 0.1 %の濃度になるように、これら ¾ 0.0 5 M U ン酸緩衝液 p H 7.5 ) に溶解させる。

〔測定方法〕

試料溶液として、血清 100 に、ァスコルビン ¾各々 0、 5、

10、 20、 30、 60、 80、 100 /ど：:^' したもの ¾用る。試料:容液を 2 0 ^ と、これに測 3 加えて、 37 °Cの恒温 «中で 1 0分間加温した後、試^^ ¾¾对照として波長 5 0 5 n mに於ける吸光度を酒 i定する。

- 別に作成した検量線（ 1 ίヌ ί ) から試屮の^コレステ口ール濃度 ¾算出する。測定結表 7にす ₃

比較例 1

〔測定試^〕

実施例 7 . の測定試^から Cu S 0₄ . 5 H ₂0 ¾除たもの。

. 〔測定方法〕

：； ¾ WiFO 実施例 7 . と同じ試料溶液を用、実施例 7 . の測定方法に従、総コレステロールの測定を行なう。測定結果を表 7に示す。

参考例 1 .

〔測定試薬〕

実施例 7 . の測定試薬に於て、 Cu S 0₄ · 5H₂0の代わ ]?に、 A 0 D ¾ 1 0 になるように加えたもの。

〔測定方法〕

実施例 7 . と同じ試料溶液を用い、実施例 7 . の測定方法に従、総コレステロールの測定を行なう。測定結杲を表 7に示す。

表 7 .

c ：) 内の数値はコレステロール回収率（） ¾示す。表 7に示さ.れるように、銅イオン、 P O D、フ X ノール及び 4 — A A Pを共存させた実施例 7に於ては、ァスコルビン酸が 2 0

/ di~iで共存させても、総コレステロ—ル値には影響は認めら

/

O PI れないが、比較例 1 ' に於ては、ァスコルビン酸が 5 ^ 共存しても負の影響がでてる。

また、表 7 ¾示されるように本凳明の方法によるァスコルビン酸の妨害除去効杲は、 A O Dによるものとほぼ同等であること実施例 8 . 血清グルコースの測定

〔測定試薬〕

各々、硫酸銅 0.2 mmo l 、フエノール 0.1 %、 4 ーァミノアンチピリン 0.0 1 °h、ペルォキシダ一ゼ（ P O D ) 2 0 0 U/ di、グルコースォキシダ一ゼ 4 0 0 0 UZc¾、ムタロタ一ゼ 1 0 ϋノ、 -ロッシヱル塩 0.5 の濃度になるよう、これら ¾ · 0.0 5 Μリン酸緩衝液（ Ρ Η 7.0 ) に溶解させる。

〔測定方法〕

試料溶液として血清 1 0 0 に、ァスコルビン酸を各々 0、 5、 1 0、 2 0、 3 0、 6 0 、 8 0、 1 0 0 Zc¾添加したもの ¾用る。

試科溶液 ¾ 2 0 と！）、これに測走^：^ 3 を加えて、

3 7 での恒温槽中で 5分間加温した後、匿筷を対照として波長 5 0 5 II mに於ける吸光度を測定する。

別に作成した換量線（第 2図）から ¾ 中のグルコース嬝度を求める。測定結杲を表 8 に示す。

比較例 2 .

〔測定試薬〕

実施例 8 . の測定試薬から Cu S 04 . 5 H ₂0 ¾除たもの。

〔測定方法〕

ハ

OMPI 実施例 8 . と同じ試料溶液 ¾用、実施例 8 . の測定方法に従、グルコースの測定を行なう。測定結果を表 8に示す。

参考例 2 .

〔測定試薬〕

実施例 8 . の測定試薬に於て、 Cu S 0₄ ' 5H₂0の代わ ]?に、

A 0 D ¾ 1 0 0 になるよう ^加えたもの。

〔測定方法〕

実施例 8 . と同じ試料溶液 ¾用、実施例 8 .の測定方法に従、グルコースの測定を行なう。測定結果を表 8に示す。

表 8

c ：) 内の数値はグルコース回収率（） ¾示す。

表 8に示されるように、銅イオン、 P 0 D、フエノール及び 4

一 A A P ¾共存させた実施例 8 . に於ては、ァスコルビン酸が

2 0 ^ノまで共存しても、グルコース値には影響は認められな

O PI が、比較例 2 . に於ては、ァスコルビン漦が 5 ^/ 共存しても負の影響がでてる。

また、表 8に示されるように、本発明の方法によるァスコルビン酸の妨害除去効果は、 A 0 Dによるものとほぽ同等であることカわ：^る ₀

実施例 9 . 遊離コレステロ — ルの測定〔 2液法〕

〔測定試薬〕

①第 1試液

各々、 Cu S 0₄ * 5 H₂0 0.0 I % . B S dipro P M 0.1 m mo 1 / _% P O D 5 0 0 ϋ Zi¾、ゥリカーゼ 3 0 U ^. トリトン：一 1 0 0 0.1 ^の濃度になるように、これらを 0.05 Mリン酸緩衝液（ p H = 7.0 ) に溶解させる。

②第 2試液

各々、コレステロールォキシダーゼ 2 0 UZc¾、トリトン： X - 1 0 0 0.1 %の籩度になるように、これら ¾ 0.0 5 Mリン酸緩衝液（： p H= 7.0 ) に溶解させる。

〔測定方法〕

試料溶液として、血清 1 0 0 π に、ァスコルビン酸 ¾各々 0、ェ 0、 2 0、 3 0、 4 0、 5 0、 1 0 0. Z W忝加したものを用る ο

試料溶液 ¾ 1 0 と U、募 1試; ¾ 1 ' ' ¾加えて、 3 7 Cの恒温槽中で 5分間加 ¾した後、 2 _: 2 ¾加え、更に 3 7 ³Cの恒温檀中で 5分間加温する。その' Λ·. を対照として波長 6 2 0 n mに於ける吸光度 ¾測 ^す ₃ 測定^杲を表 9に示す。比敦例 3 .

〔測定試薬〕

①第 1試液

実施例 9 . の箅 1試液から Cu S 0₄ · 511₂0¾除たもの。

②第 ·_2_::試.液

実施例 9. . に同じ。

〔測定方法〕

実施例 9 . と同じ試料溶液 ¾用、実施例 9 ，の測定方法に従、遊離コレステロールの測定 ¾行なう。測定結果を表 9に示す。

参考例 3 .

〔測定試-薬〕

①第 1試液

各々、 A O D 3 0 / di, B S dipro P M O.l m mo l ノ^、 P O D 、ゥリカ—ゼ 3 0 11ノ、トリトン X—

1 0 0 0.1 %の濃度になるように、これらを 0.0 5 M リン酸緩衝液（ p H= 7.0 ) に溶解させる。

②第 2試液

実施例 9 . に同じ。

〔測定方法〕

実^例 9 . と同じ試料溶液を用、実施例 9 . の測定方法に従、遊離コレステロールの測定を行なう。測定結果 ¾表 9に示す。

実施例 1 0 . 遊離コレステロールの測定 [； 1液& 〕

〔測定試薬〕

実施例 9 ，の第 1 試液と ^: 2試液 ¾ 1 ： 2の割合で混合したもの ¾用^る。

_ CMPI , 〔測定方法〕 .

実施例 9 . と同じ試料溶液 ¾用る。

試料溶液 ¾ 1 0 ^ と、測定試薬 3 ;^ ¾加えて、 3 7での恒濫槽中で 1 0分間加温した後、試薬盲検¾対照として波長

6 2 0 n mに於ける吸光度 ¾測定する。測定結杲¾表 9に示す。比較例 4 .

〔測定試薬〕

比較例 3 . の第 1試液と第 2試液 ¾ 1 ： 2の割合で混合したもの ¾用る。

〔測定方法〕

実施伊 } 9 . と同じ試料溶液 ¾用 . 実施例 1 0 . の測定方法に従、遊離コレステロールの測定を行なう。測定結杲¾表 9に示す。

参考例 4 .

C測定試薬〕

参考例 3 . の第 1 試液と第 2試液 ¾ 1 ： 2の别合で混合したもの ¾用る。

〔測定方法〕

実例 9 . と同じ試科溶液 ¾用、 '列 1 0 . の測定方法に ¾ 、遊離-コレステ σ—ルの測定を行う ₀ 測定： ½果¾表 9に示す。 9

表 9 に示されるように、本発明の方法によるァスコルビン酸の妨害除去効杲は、 1液法、 2液法共 A 0 Dと同等若しくはそれ以上で、 2液法の場合には、ァスコルビン酸 1 0 0 ^ まで完全に影響 ¾回避し得る。

実施例 1 1 . 遊離コレステロールの測定〔 2液法〕

〔測定試薬〕

実施例 9 . に同じ。

測定方法〕

試料 ¾液として、血清 1 0 0 ^に、ピリルビン ¾各々 0、 5、 1 0、 1 5、 2 0 ^ノ添加したもの ¾用る。

試料溶液 ¾ 1 0 と！）、第 1試液加えて、 3 7 ° (：恒温嘈中 5分間加温した後、第 2試液 2. ¾加え、更に、 3 7 °C の恒温禧中で 5分間加温する。その後、試薬盲検¾対照として波長 6 2 0 n mに於ける吸光度 ¾測定する。測定結杲¾表 1 0に示す o

比較例 5 .

〔測定試薬〕

比較例 3 . に同じ。

〔測定方法〕

実施例 1 1 . と同じ試料溶液を用、 ¾例 1 1 . の測定方法に従、遊離コレステ口一ルの^定を r r ' うつ Π定結果 ¾表 1 0 に示す。 - 参考例 5 .

〔測定試薬〕

参考例 3 . に同じ。

Ο ΡΙ

d WIPO 〔測定方法〕

実施例 1 1 . と同じ試料溶液 ¾用、実施例 1 1 . の測定方法に従い、遊離コレステロールの測定 ¾行なう。測定結果 ¾表 1 0 に示す。

実施例 1 2 . 遊離コレステ π — ルの測定〔 1 液法〕

〔測定試薬〕

実施例 1 0 に同じ <

〔測定方法〕

実施例 1 11 . と同じ試料溶液を用いる。

試料溶液を 1 0 と ]?、測定試薬 3； ^を加えて、 3 7 ²Cの恒温槽中で 1 0分間加温した後、試薬盲検¾対照として波長 620 n mに於ける吸光度 ¾測定する。測定結果を表 1 0に示す。

比較例 6 .

〔測定試薬〕

比較例 4 . に同じ。

〔測定方法〕

実施例 1 1 . と同じ試科溶液 ¾用、実施例 1 2 . の測定方法に従，遊離コレステ ^σ — ルの測定を行なう。測定結果を表 1 0 に示す。

参考例 6 .

〔測定試薬〕

参考例 4 · に同じ。

測定方法〕

実施例 1 1 . と同じ試科溶液 ¾用、実施例 1 2 . の測定方法に従、遊離コレステロールの測定を行なう。測定結果 ¾表 1 0 sz

QZ

SX

01

'^

98

0S6 8 OA 0

表 1 0に示されるように、本発明の方'法によるビリルビンの妨害除去効果は 1液法、 2液法共 A 0 Dと同等もしくはそれ以上であ ^ 3 o

実施例 1 3 .

〔測定試薬〕

各々、 CuS0₄ ' 5H;0 0.0 0 3 、 A B T S 0.1 %、 P 0 D 3 0 0 UZ<¾、コレステロール才キシダーゼ 1 5— LT . トリトン： X— 1 0 0 0.1 %の濃度になるように、これら ¾ 0.05 Mリン酸緩衝液（： p H= 7.0 ) に溶解せる。.

〔測定方法〕

試料溶液として、 1 0 0 ί ^中コレステ α — ル 1 0 0 W Z びァスコ /レビン酸 ¾夫々 0、 1 0、 2 0、 3 0 4 0、 5 0 ^/ c¾含む水溶液 ¾用る。

試料溶液 ¾ 2 0 z^ と！）、測定試薬 3 ¾ ¾加えて、 3 7 °Gの恒温槽中で 1 0分間加温した後、試薬盲検¾対照として波長 660 Π. mに於ける吸光度 ¾測定する。測定結果を表 1 1に示す。

比較例 7 .

〔測定試薬〕

実施例 1 3 の測定試案から Cu S 0₄ * 5H₂0¾除たもの _c

〔測定方法〕

実施伊 1-3 と同じ試料溶液 ¾甩、実施例 1 3 . の測定方 ¾ 従 - コレス,テ口ールの測定 ¾行なう。測定結杲 ¾表 1 1に示す。溶液 OD 実施例 13 . 比較倒 7 .

ァスコルビン

濃度 \

0 0.216 ( 100 ) 0.21 0 C 10 0 )

1 0 0.1 74 C 81 ) 0.1 65 ( 79 )

20 0.135 C 62 ) 0.108 C 51 )

30 0.1 16 C 54 ) 0.056 ( 27 )

40 0.1 07 ( 50 ) . 0 C 0 )

50 0.087 ( 40 ) 0 C 0 ) c ：) 内の数値はコレステロール回収率（：示す。. 表 1 1 よ ]?、銅イオン、 P O D及び A B T Sを共存させた場合にもァスコルビン酸の妨害除去効果があることがわかる。産業上の利用可能性

本発明の方法は、酸化還元反を利月する被渙試料中の目的成分の定量の際、試料中に混人するァスコルビン酸の悪影響 ¾効果的に除去するのに使用され得る。

ゝ ' Ίν. no

Claims

請求の範囲

(1) 銅イオン、ペルォキシダーゼ、及ひ '下記①〜⑦から成る群よ選ばれた一種又は二種以上の化合物 ¾共存させることを特徵とする、ァスコルビン酸の分解方法。

① 4 — ァミノアンチピリン

② 3 — メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン

③ 2 , 2,—アジノビス（ 3—ェチルベンゾチアゾリン— 6 — スル . ホン酸）

④ トリフエ - ルメタン系ロイコ色素

⑤フヱノール系化合物

⑤ァリン系化合物

⑦ナフト —ル系化合物

(2) 銅イオンが 2価の銅ィオンである請求の範囲第 1項記載のァスコルビン酸の分解方法。

(3) 被検試料中のァスコルビン酸 ¾分解する請求の範囲笋 1項記载の、ァスコルビン酸の分解方法。

(4) 被 ΐ食試科が体液であ ])、酸化還元反 ( レドックス反応）によ！）体液成分 ¾定量する反応に於てァスコルビン酸の妨害による悪影響 ¾回避するため、ァスコルビン漦が銅ィオンの存在下に酸化されてデヒドロアスコルビン酸及び Η ₂0 ¾生成する反応によってァスコルビン酸を分解する、請求の範囲第 3項に記載の，ァスコルビン酸の分解方法。

(5) g安化還元反応（レドックス反応）が、基質に酸化酵素が作甩して H₂0 ₂ ¾生成する酵素反応である、請求の範囲第 4項記載の、ァスコルビンの分解方法。

CMPI

(6) 基質がグルコース、コレステロール、グリセロール、グリセロールリン酸エステル、コリン、ァシル C o A、ピルビン酸、尿酸、キサンチン及び乳酸からなる群から選ばれ、それらの基質に作用する黢化酵素が各々グルコースォキシダーゼ、コレステロール才キシタ *ーゼ、グリセローノレ才キシタ，一ゼ、グリセローソレリン酸エステル才キシダーゼ、コリン才キシタ *ーゼ、ァシル Co A 才キシダーゼ、ピルビン酸才キシタ'ーゼ、ゥリカ一ゼ、キサンチンォキシダーゼ及び乳酸才キシダーゼからなる群から選ばれる、請求の範囲第 5項記載の、ァスコルビン酸の分解方法。

(7) ペル才キシダーゼ及び H ₂0 ₂ の存在下に被酸化性呈色試薬が酸化さ.れて生ずる呈色を測定することによ ]?体液成分 ¾定量する、請求の範囲第 5項又は第 6項記載の、ァスコルビン酸の分解方法。

(8) ァスコルビン酸の分'解と、被^試料 ¾酵素反応させ、発色系に導く工程と ¾ 1 ステップで行う請求の範囲篛 5項記載のァスコノレビン酸の分解方法。

(9) トリフエニルメタン系ロイコ色素が、 σ イコマラカイトグリーン、ロイコクリスタル 'プアィ才レット、ビス ( ρ —ジェチノレァミノフエ二ノレ ) 2 — スルホフヱ - ノレメタン、ビス ( ρ —ジェチルァミノフヱニル） 4 — スルホフ-口ホ。キシフエニルメタンナトリゥム塩及びビスぐ ρ—ジェチルアミノフ .ェニル） 3， 4一ジスルホプロポキシフヱニルメタンジナトリクム塩か.らなる群から選ばれる請求の範囲第 1項記載のァスコルヒン酸の分解方法。

(10) フエノール化合物、フエノーノレ、 ρ — クロ口フエノール ' 2 , 4 — ジクロ口フエノール、一ブ、ロモフエノール、ひーク σ— σ 一

ΟΜΡΙ

^ ΥΉ ： -一 tO^ i フエノール及び m—クロロフヱノールからなる群から選^ ίれる請求の範囲第 1項記載のァスコルビン酸の分解方法。

(11) ァ - リン菜.イど物が、ァニリン、 Ν，Ν— ジメチルァ - リン、 Ν,Ν— ジェチノレア - リン、 ΙΝΓ,Ν— ジェチルー m— トルイジン、 3 5 メチルー ]T—ェチル一 N— ( ヒドロキシェチル）一ァ - リン、 N—ェチルー N一 C 2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル） - m— トルイジン、 3.5—ジメチル— N—ェチル一 N— （ 2—ヒドロキ 'ン一 3一スルホプロピル）ァ - リン及び 3 , 5— ジメトキシ

— 1ST— ェチル一 ( 2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル）ァニリンからなる群から選ばれる請求の範囲 1項記載のァズコ— ン酸の分解方法.。

ナフト一ル^ :^が 1一ナフトール、 1 —ナフトール一 2 . — スルホン酸、 1 —ナフトール一 2一力ルポ'ン酸、 1一ナフトール一 8—スルホン酸、 1 —ナフトール一 3 — スルホン酸及び 1一s ナフトール — 5— スルホン酸からなる群から還ばれる請求の範囲 M 1項記載の了スコ /レビ.ン酸の分解方法。

基質に酸化酵素 ¾作, させて fi₂o ₂ を生成させ、この H₂O₂

¾定量する体液成分の定量法に於て、銅イオン、ペルォキシダ一ゼ及び下記①〜⑦から成る群よ D選ばれた一 ¾又は二種以上の0 化合物 ¾、体液中の還元姓物質を含有する被検試料中に共存させること ¾特徵とする還元性物質の悪影響 ¾防止した体液中の目的成分の定量方法。

① 4— ァミノアンチピリン

② 3— メチルベンゾチアゾリノンヒドラゾン

5 ③ 2， 2'—アジノビス（ 3—ェチルベンゾチアゾリンー 6— スルホン酸）

④ トリフエニルメタン系ロイコ色素

⑤フヱノール系化合物

⑥ァ - リン系化合物

⑦ナフトール化合物

( 還元性物質がァスコルビン酸である請求の範囲第 1 3項記載の定量方法。

$ 還元性物質がビリルビンである請求の範囲第 1 s項記載の定量珐 .

C FI

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