UA126941C2

UA126941C2 - Фармацевтичні композиції для інгібування запальних цитокінів

Info

Publication number: UA126941C2
Application number: UAA202006701A
Authority: UA
Inventors: Нафталі Прімор; Нафтали ПРИМОР
Original assignee: С.І.С. Шулов Інновейтів Сайєнс Лтд.; С.И.С. Шулов Инновейтив Сайенс Лтд.
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2023-02-22
Also published as: IL277436A; US20220387547A1; ZA202006412B; JP2021519773A; BR112020019347A2; SG11202009257TA; KR20200138326A; MX2020009999A; CA3094295A1; RU2020134114A; US11419913B2; US20210138023A1; PH12020551573A1; AU2019245521A1; EP3773661A1; EP3773661A4; JP2024015099A; JP7421219B2; CN112203674A; WO2019186561A1

Abstract

Винахід стосується застосування фармацевтичної композиції, яка містить як активний інгредієнт пептид, вибраний з групи, що складається з pGlu-Asn-Trp-Lys(октаноїл)-OH (SEQ ID NO: 1), pGlu-Asn-Trp-Thr-OH (SEQ ID NO: 2), а також їх фармацевтично прийнятних солей, для лікування запального захворювання або розладу, вибраного з групи, що складається з запального захворювання або розладу очей, запального захворювання або розладу вуха, запального захворювання або розладу легені, запального захворювання або розладу кишечнику та запального аутоімунного захворювання або розладу.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ

Даний винахід відноситься до фармацевтичних композицій та способів полегшення симптомів, пов'язаних з вивільненням запальних цитокінів при запальних станах, включаючи, без обмеження, запальні захворювання очей.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Запалення є частиною складної біологічної реакції тканин організму на шкідливі стимули, такі як патогени, ушкоджені клітини або подразники, й являє собою захисну реакцію за участю імунних клітин, кровоносних судин і молекулярних медіаторів. Функція запалення полягає в тому, щоб усунути первісну причину ушкодження клітин, очистити некротичні клітини та тканини, ушкоджені в результаті первісного ушкодження та запального процесу, й ініціювати відновлення тканин.

Класичними ознаками запалення є жар, біль, почервоніння, набряк і втрата функції.

Запалення - це загальна відповідь, тому його вважають механізмом вродженого імунітету.

Запальні захворювання включають широкий спектр порушень та станів, які характеризуються запаленням. Приклади включають алергію, астму, відторгнення трансплантата, аутоїмунні захворювання та запалення очей, і це лише деякі з них.

Запальні захворювання очей

Увеїт - це загальний термін, що описує групу запальних захворювань очей, які можуть незначно погіршити зір або призвести до серйозної втрати зору. Захворювання часто вражають частину ока, називану судинною оболонкою ока, але не обмежуються цією частиною ока. Ці захворювання також впливають на кришталик, сітківку, зоровий нерв і склоподібне тіло, викликаючи погіршення зору або сліпоту. Увеїт може бути викликаний проблемами або захворюваннями, що виникають в очах, або може бути частиною запального захворювання, що вражає інші частини тіла. Увеїт може бути гострим або хронічним і зазвичай підрозділяється на інфекційний або неінфекційний.

Сухий кератокон'юнктивіт, також відомий як хвороба сухого ока (ХСО) або синдром сухого ока (ССО), є розповсюдженим захворюванням очей, що спонукують мільйони людей звертатися за офтальмологічною допомогою. Незалежно від лежачої в основі етіології було показано, що сухе око пов'язане з аномаліями у передкорнеальній сльозній плівці та наступними запальними

Зо змінами на всій поверхні ока, включаючи придатки, кон'юнктиву та роговицю. Активація запальних цитокінів, наприклад, ІЛ-6, відіграє вирішальну роль у патофізіології ХСО.

З моменту визнання ролі запалення в розвитку синдрому сухого ока був досліджений ряд засобів лікування, призначених для придушення різних запальних шляхів, наприклад, циклоспорин А, кортикостероїди, такролімус, похідні тетрацикліну й аутологічна сироватка (Міспеїе Неззеп М. і Кагатигзеї! Акрек Е)). Орпіпаїтіс Мі5 Кевз. 2014, 9 (2), 240-250).

Патент США Мо 4619916 описує 13 трипептидів формули роіш-Х-Тгр, де роЇш являє собою циклізовану глутамінову кислоту (піроглутамінову кислоту), а Х може являти собою су, Маї, СІМ,

Азр, зег, Аа, Азп, Сп, Пе, Геи, Рго, Гу5 й Агуд. У посиланні не описується та не пропонується застосування пептидів для лікування запалення.

Патент США Мо 7220725 і міжнародна патентна публікація УМО200212269 розкривають нові пептиди, включаючи роїіш-Авп-Ттр-Гуз(октаноїл)-ОН (2ЕРЗ) ї рОІш-Авп-Ттр-ТИІ-ОН (2ЕРА), й їх застосування для лікування болю. У даному документі не описується та не пропонується застосування пептидів для лікування запалення.

У патенті США Мо 9012397 їі М/02012/131676 описані фармацевтичні композиції для місцевого застосування, що включають пептиди 2ЕРЗ або 7ЕР4, й їх застосування для полегшення симптомів шкірних захворювань. У посиланні не описується та не пропонується застосування пептидів для лікування запалення.

Саупез еї аї. (Іпме5і. ОрпіпаїЇтої. Мі. Зсі. 54, Е-АБрзігасі 5416, 2013) описують знеболюючу дію пептиду 2ЕРА4 відносно зменшення болю в очах і модифікації шляхів ноцицепції в моделі на пацюках експериментально індукованого хімічного ушкодження роговиці. У посиланні не описують та не припускають протизапальної активності пептиду.

Даний винахід спрямований на задоволення постійної потреби у поліпшенні та розробці нових безпечних й ефективних методів лікування, які поліпшують запальні стани шляхом втручання в запальний каскад.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Згідно з даним винаходом запропоновані композиції та способи полегшення симптомів, пов'язаних з вивільненням запальних цитокінів. Ці цитокіни, як відомо, є частиною етіології та патології багатьох запальних захворювань. Захворювання та порушення, що піддаються лікуванню композиціями згідно з даним винаходом, включають, без обмеження, запальні бо захворювання ока, вуха, легенів і кишечнику. Захворювання та порушення, що піддаються лікуванню, також включають аутоімунні захворювання, при яких введення лікарських засобів може бути хронічним введенням для запобігання загострень.

Даний винахід частково заснований на виявленні на моделях іп міїго й іп мімо того факту, що пептиди, позначені 2ЕРЗ і 2ЕР4, проявляють несподівано сильну активність в ослабленні експресії та/або вивільненні запальних і прозапальних медіаторів, включаючи конкретні цитокіни інтерферон гамма (ІФН-гамма, ІФНУ), інтерлейкін 1 бета (ІЛ-1 бета, ІЛ-1рД), інтерлейкін 10 (ІЛ- 10), фактор некрозу пухлини альфа (ФНП альфа, ФНПа) й інтерлейкін 6 (ІЛ-б6), і медіатори активних форм кисню (АФК) і КАМТЕ5 (експресованого та приблизно секретованого нормальними Т-клітинами при активації).

Несподівано було виявлено, що активність пептидів в інгібуванні запальних каскадів проявляється навіть у тому випадку, коли пептиди вводять до початку запальної реакції.

Таким чином, пептиди можуть полегшувати або пригнічувати симптоми, викликані різними запальними захворюваннями та порушеннями, і можуть бути корисні для повного усунення запальної реакції. Передбачається, що композиції згідно з даним винаходом можуть бути корисні для запобігання загострень хронічних запальних захворювань.

Слід чітко розуміти, що застосування композицій згідно з даним винаходом для лікування запальних захворювань не включає лікування шкірних захворювань або болю як такого.

Згідно з одним аспектом даного винаходу запропонована фармацевтична композиція, яка містить в якості активного інгредієнта пептид формули !: реЇШ-Хі-Х2-Хз-ОН, де Хі являє собою полярний амінокислотний залишок; Хг2 являє собою залишок ароматичної або гідрофобної амінокислоти; і Хз вибраний з позитивно зарядженого амінокислотного залишку та полярного амінокислотного залишку, або його фармацевтично прийнятну сіль або похідну; та фармацевтично прийнятний носій, для застосування для зменшення вивільнення або інгібування активності запального цитокіну.

Згідно з деякими варіантами реалізації Хі вибраний з групи, що складається з: Авп, Сіп, Нів, зЗег, ТАг, Туг і Суб, Х» вибраний з Тгр, Ре, Туг, Аа, Пе, ем, Меї, маї і Су, і Хз вибраний з І ух, похідної І уб, Ага, Ні, Авп, іп, Ні, зег, ТАг і Туг.

Згідно з іншими варіантами реалізації Х: вибраний з Авп і ТНг; Х2 вибраний з Тгр, Ре і Туг; і

Хз вибраний з І уз, похідної І уз і ТНг.

Зо Згідно з деякими варіантами реалізації пептидна похідна містить алкільну групу, приєднану до вільної функціональної групи пептидної послідовності.

Згідно з іншими варіантами реалізації алкільна група приєднана амідним зв'язком або сполукою до вільної аміногрупи бічного ланцюга або М-кінця пептиду.

Згідно з деякими варіантами реалізації, алкіл являє собою С4-С30 алкіл.

Згідно з деякими конкретними варіантами реалізації Св-алкільна група (тут октаноїл) приєднана амідним зв'язком до бічного ланцюга залишку ух пептидної послідовності або кінцевої аміногрупи пептиду. Згідно з деякими варіантами реалізації карбокси-кінець пептиду модифікований з утворенням, наприклад, амідного, спиртового або складноефірного кінця.

Згідно з деякими конкретними варіантами реалізації пептид вибраний з групи, що складається з: роІш-Авп-Ттр-Гуз(октаноїл)-ОН (ЗЕО ІО МО: 1), роОІш-Авп- Ттр-ТИІ-ОН (ЗЕО ІЮ МО: 2) й їх фармацевтично прийнятних похідних і солей.

Згідно з деякими варіантами реалізації запальний цитокін вибраний з групи, що складається 3: ФНП альфа, ІЛ-1 бета, ІЛ-б6, ІЛ-10 і ІФН гамма.

Згідно з ще одним аспектом даного винаходу запропонована фармацевтична композиція, яка містить в якості активного інгредієнта пептид формули І: роЇш-Хі-Х2-Хз--ОН, де Хі являє собою полярний амінокислотний залишок; Х2 являє собою залишок ароматичної або гідрофобної амінокислоти; і Хз вибраний з позитивно зарядженого амінокислотного залишку та полярного амінокислотного залишку, або його фармацевтично прийнятну сіль або похідну; та фармацевтично прийнятний носій, для застосування для зменшення вивільнення медіатора запалення або хемокіну, при цьому медіатор або хемокін.

Згідно з деякими варіантами реалізації медіатор запалення або цитокін вибраний з групи, що складається з активних форм кисню ( АФК) і К АМТЕЗ (експресованого та приблизно секретованого нормальними Т-клітинами при активації).

Згідно з іншим аспектом даного винаходу запропонований спосіб зменшення вивільнення або інгібування активності щонайменше одного запального або прозапального цитокіну, причому спосіб включає стадію введення суб'єкту, що має в цьому потребу, терапевтично 60 ефективної кількості пептиду формули !: роЇш-Хі-Х2-Х--ОН, де Х! являє собою полярний амінокислотний залишок; Хг2 являє собою залишок ароматичної або гідрофобної амінокислоти; і

Хз вибраний з позитивно зарядженого амінокислотного залишку та полярного амінокислотного залишку, або його фармацевтично прийнятної солі або похідної.

Згідно з іншим аспектом запропонований спосіб зменшення вивільнення медіатора запалення або хемокіну, причому спосіб включає стадію введення суб'єкту, що має в цьому потребу, терапевтично ефективної кількості пептиду формули І!: рош-Хі-Х2-Х3-ОН, де Хі являє собою полярний амінокислотний залишок; Х»2 являє собою ароматичний або гідрофобний амінокислотний залишок, і Хз вибраний з позитивно зарядженого амінокислотного залишку та полярного амінокислотного залишку, або його фармацевтично прийнятної солі або похідної.

Згідно з деякими варіантами реалізації медіатор запалення або хемокін вибраний з групи, що складається з АФК і КАМТЕ5.

Згідно з ще одним аспектом даного винаходу запропонований спосіб лікування запального захворювання або порушення. Згідно з конкретними варіантами реалізації запальне захворювання або порушення вибране з групи, що складається зі: запального захворювання або порушення очей, запального захворювання або порушення вуха, запального захворювання або порушення легень, запального захворювання або порушення кишечнику або запального аутоїмунного захворювання або порушення, і спосіб включає стадію введення суб'єкту, що має в цьому потребу, терапевтично ефективної кількості пептиду згідно з формулою І: реЇш-Х1і-Х2-Хз-

ОН, або його фармацевтично прийнятної солі або похідної, де ХІ! являє собою полярний амінокислотний залишок; Х2 вибраний із залишку ароматичної амінокислоти та залишку гідрофобної амінокислоти; і Хз вибраний з позитивно зарядженого амінокислотного залишку та полярного амінокислотного залишку.

Згідно з деякими варіантами реалізації даного винаходу запропоновані способи лікування хронічних запальних захворювань. Згідно з конкретними варіантами реалізації стадію введення суб'єкту, що має в цьому потребу, терапевтично ефективної кількості пептиду формули здійснюють ще до появи або розвитку симптомів. Зазначені способи лікування хронічних запальних захворювань ефективні для запобігання загострень.

Згідно з ще одним аспектом даного винаходу запропонований спосіб лікування запального захворювання або порушення очей, який включає стадію введення суб'єкту, що має в цьому

Зо потребу, терапевтично ефективної кількості пептиду формули !: роїш-Хі-Х2-Хз-ОН, або його фармацевтично прийнятної солі або похідної, де Хі! являє собою полярний амінокислотний залишок; Хг2 являє собою ароматичний або гідрофобний амінокислотний залишок, і Хз вибраний з позитивно зарядженого амінокислотного залишку та полярного амінокислотного залишку.

Згідно з деякими варіантами реалізації Хі вибраний з групи, що складається з: Авп, Сіп, Нів, зег, ТАг, Туг ії Суб; Х2 вибраний з Тгр, Ріє, Туг, Аа, Пе, ем, Меї, мМаї і Су; і Хз вибраний з І уз, похідної І уб, Ага, Ні, Авп, іп, Ні, зег, ТАг і Туг.

Хз вибраний з І уз, похідної І уз і ТНг.

Згідно з деякими конкретними варіантами реалізації похідна І ух являє собою І ух(октаноїл).

Згідно з деякими варіантами реалізації пептидна похідна містить алкільну групу, приєднану до функціональної групи пептидної послідовності.

Згідно з іншими варіантами реалізації алкільна група приєднана амідним зв'язком до аміногрупи бічного ланцюга або до кінця пептиду.

Згідно з деякими варіантами реалізації алкіл являє собою С4 - СЗ30 алкіл.

Згідно з деякими конкретними варіантами реалізації Св-алкільна група (тут октаноїл) приєднана амідним зв'язком до бічного ланцюга залишку ГГ ух або кінцевої аміногрупи пептидної послідовності.

Згідно з деякими конкретними варіантами реалізації пептид вибраний з групи, що складається з: роІш-Авп-Ттр-Гуз(октаноїл)-ОН (ЗЕО ІО МО: 1), роОІш-Авп- Ттр-ТИІ-ОН (ЗЕО ІЮ МО: 2) й їх фармацевтично прийнятних солей або похідних.

Згідно з деякими варіантами реалізації пептид має амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 1.

Згідно з деякими варіантами реалізації пептид має амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 2.

Згідно з деякими варіантами реалізації фармацевтична композиція містить похідну або сіль пептиду, що має амінокислотну послідовність, встановлену у послідовності, вибраної з 5ЕО ІЮ

МО: 1 і 5ЕО ІЮО МО: 2.

Згідно з деякими варіантами реалізації спосіб включає введення похідної або солі пептиду, що має амінокислотну послідовність, представлену у послідовності, вибраної з ЗЕО ІЮ МО: 1 і 60 ЗЕО ІЮ МО: 2.

Згідно з деякими варіантами реалізації фармацевтична композиція містить натрієву сіль пептиду, зазначеного у будь-якій з БЕО ІЮ МО: 1 ії 5ЕО ІЮО МО: 2.

Згідно з деякими варіантами реалізації рФрармацевтична композиція складена для (виконана з можливістю) введення шляхом, вибраним із групи, що складається з місцевого застосування, офтальмологічного введення, перорального введення, назального введення ("та парентерального введення.

Згідно з різними варіантами реалізації склади для місцевого застосування можуть бути вибрані з крему, мазі, пасти, лосьйону, гелю або очних крапель.

Згідно з деякими конкретними варіантами реалізації запропонований склад крему, що містить пептид, вибраний з ЗЕО ІЮ МО: 1 їі 2, або його фармацевтично прийнятну сіль, для місцевого застосування.

Згідно з деякими варіантами реалізації композиція крему містить 0,1-5 9Уо мас./мас. пептиду.

Згідно з іншими варіантами реалізації композиція містить 0,5-2 9о пептиду. Згідно з іншими варіантами реалізації композиція містить приблизно 1 95 пептиду.

Згідно з деякими варіантами реалізації композиція згідно з даним винаходом має рнН від приблизно 4 до приблизно 8. Згідно з деякими варіантами реалізації композиція має рН від приблизно 4,5 до приблизно 6,5. Згідно з іншими варіантами реалізації композиція має рнН від приблизно 7 до приблизно 9.

Згідно з деякими варіантами реалізації фармацевтична композиція містить щонайменше один наповнювач, вибраний з групи, що складається з: полісорбату 80, динатрію едетату (ЕДТА), діоксиду кремнію, метилпарабену, білого вазеліну, ізопропілміристату, цетилового спирту та моностеарату гліцерину.

Згідно з іншими варіантами реалізації композицію для введення суб'єкту із захворюванням або ушкодженням очей, складають у формі, вибраній з групи, що складається з рідкого розчину або суспензії для застосування у формі очних крапель, емульсії, крему, мазі, спрею та гелю.

Згідно з деякими варіантами реалізації захворювання або ушкодження ока являє собою запальне захворювання або порушення, вибране з групи, що складається з: увеїту, синдрому сухого ока, запальних симптомів, пов'язаних з інфекційним захворюванням очей, алергійного захворювання очей, кератиту, кон'юнктивіту, дисфункції мейбомієвих залоз і синдрому Шегрена.

Зо Згідно з іншими варіантами реалізації фармацевтична композиція складена у вигляді очних крапель, очної мазі, спрею для очей, офтальмологічної суспензії, офтальмологічної емульсії, офтальмологічного розчину, офтальмологічного гелю або інтравітреальної ін'єкції.

Згідно з іншими варіантами реалізації запальне захворювання або порушення являє собою аутоїмунне захворювання або порушення.

Згідно з іншими варіантами реалізації аутоїмунне захворювання або порушення вибране з групи, що складається з ревматоїдного артриту, остеоартриту, псоріатичного артриту, анкілозуючого спондиліту, ювенільного ідіопатичного артриту, вовчака та синдрому Шегрена.

Згідно з іншими варіантами реалізації запальне захворювання або порушення являє собою запальне захворювання кишечнику.

Згідно з іншими варіантами реалізації запальне захворювання кишечнику вибране з групи, що складається з хвороби Крона, виразкового коліту та целіакії.

Згідно з іншими варіантами реалізації запальне захворювання або порушення являє собою запальне захворювання або порушення легенів.

Згідно з іншими варіантами реалізації запальне захворювання або порушення легенів вибране з групи, що складається з астми, бронхіту, плевриту, альвеоліту, васкуліту, пневмонії, хронічного бронхіту, бронхоектазії, дифузійного панбронхіоліту, пневмоніту гіперчутливості, ідіопатичного легеневого фіброзу та муковісцидозу.

Згідно з іншими варіантами реалізації запальне захворювання або розлад являє собою запальне захворювання або порушення вуха.

Згідно з іншими варіантами здійснення запальне захворювання або порушення вуха вибране з групи, що складається із запальних симптомів, пов'язаних із інфекцією вуха, середнього отиту, зовнішнього отиту, мастоїдиту й отомастоїдиту.

Згідно з іншими варіантами реалізації введення являє собою офтальмологічне введення.

Згідно з іншими варіантами реалізації введення являє собою пероральне введення.

Згідно з іншими варіантами реалізації введення являє собою назальне введення.

Згідно з іншими варіантами реалізації введення являє собою парентеральне введення.

Даний винахід успішно усуває недоліки відомих у даний час конфігурацій, завдяки забезпеченню фармацевтичних композицій для використання для зниження вивільнення або інгібування активності запальних цитокінів і медіаторів і для лікування захворювань або бо порушень, пов'язаних із запальними цитокінами та медіаторами.

Якщо не зазначено інше, всі технічні та/або наукові терміни, що використовуються у даному документі, мають те саме значення, яке зазвичай розуміється фахівцем в тій області техніки, до якої відноситься винахід. Хоча способи та матеріали, подібні або еквівалентні описаним у даному документі, можуть використовуватися при практичній реалізації або при тестуванні варіантів реалізації даного винаходу, нижче описані зразкові способи та/або матеріали. У випадку конфлікту опис патенту, включаючи визначення, буде мати переважну силу. Крім того, матеріали, способи та приклади є тільки ілюстративними та не призначені для обмеження.

КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ

Деякі варіанти реалізації винаходу описані тут тільки в якості прикладу з посиланням на прикладені креслення. Звертаючись тепер до конкретних докладних креслень, слід підкреслити, що деталі показані в якості прикладу та з метою ілюстративного обговорення варіантів реалізації винаходу. Щодо цього опис креслень робить очевидним для фахівців у даній області техніки, як варіанти реалізації винаходу можуть бути реалізовані на практиці.

На кресленнях:

Фіг. 1 являє собою гістограму, яка ілюструє дію 7ЕРА (7), діапазон концентрацій: 3,125 - 100 мкг/мл, на кількість ФНІПа, що продукується індукованими запаленням клітинами макрофагів.

Лінії, відзначені знаком 7, являють статистично значиму різницю при р «0,0001.

Фіг. 2 являє собою гістограму, яка ілюструє вплив 2ЕРА (72) (50 мкг/мл) на кількість ФНПа, що продукується індукованими запаленням клітинами макрофагів, обробленими ліпополісахаридом (ЛПС, 100 нг/мл) і пальмітиновою кислотою (ПК, 100, 200 або 400 мкМ). Лінії, відзначені знаком ях, являють статистично значиму різницю при р «0,0001.

Фіг. З являє собою гістограму, яка ілюструє дію 2ЕРЗ (7) (діапазон концентрацій: 3,125 - 100 мкг/мл) на кількість ФНІПс, що продукується індукованими запаленням клітинами макрофагів.

Лінії, відзначені знаком хх, хх, х | н.3.,, являють статистично значиму різницю при р «0,0001, р.0,001, р «0,01, Р «0,1 і не значиму, відповідно.

Фіг. 4 являє собою гістограму, яка ілюструє вплив 2ЕРА (2) (50 мкг/мл) на кількість ІЛ-1бета, що продукується збудженими клітинами макрофагів, індукованими нігерицином. Лінія, відзначена знаком 77, являє статистично значиму різницю при р «0,0001.

Фіг. 5 являє собою гістограму, яка ілюструє вплив 2ЕРЗ на життєздатність індукованих

Зо запаленням клітин макрофагів.

Фіг. 6 являє собою гістограму, яка ілюструє захисну дію 2ЕРЗ при різних концентраціях на життєздатність індукованих запаленням епітеліальних клітин роговиці, підданих впливу 70 мМ масі (чорні стовпці) або МНЕ20О (сірі стовпці), визначену за допомогою аналізу з ЛДГ. Лінії, відзначені знаком 75 їх, являють статистично значиму різницю при р «0,0001 і р «0,05 відповідно.

Фіг. 7 являє собою гістограму, яка ілюструє вплив 2ЕРЗ у різних концентраціях на кількість

ІЛ-6, що продукується викликаними запаленням епітеліальними клітинами роговиці, підданими впливу 4-гідроксиноненалю (4-НМЕ) протягом 24 годин. Лінія, відзначена ", являє статистично значиму різницю при р «0,05.

Фіг. 8 являє собою гістограму, яка ілюструє захисний ефект 7ЕРЗ при різних концентраціях на кількість активних форм кисню (АФК, виміряних за допомогою набору ЮОСЕБА), що продукуються індукованими запаленням епітеліальними клітинами роговиці, підданими впливу 4-НМЕ протягом 24 годин. Лінії, відзначені хх, хх | хх, являють статистично значиму різницю при р.0,0001, р «0,001 ії р «0,01 відповідно.

Фіг. 9 описує продукування ІФН-у нормальними МКПК від 4 донорів-людей у відповідь на стимуляцію 2ЕРЗ у різних концентраціях і середовищах, стимуляцію та контроль за дексаметазоном. Статистично значимі відмінності представлені як: " р «0,05, р «0,01, у порівнянні з контролем стимуляції, за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу з наступними множинними порівняннями Данетт.

На Фіг. 10 показана продукція ІЛ-10 у нормальних МКПК від чотирьох донорів-людей у відповідь на стимуляцію 2ЕРЗ у різних концентраціях і середовищах, стимуляцію та контроль за дексаметазоном. Статистично значимі відмінності представлені як: " р «0,05, р «001, у порівнянні з контролем стимуляції, за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу з наступними множинними порівняннями Данетт.

На Фіг. 11 зображена продукція ІЛ-18 у нормальних МКПК від 4 донорів-людей у відповідь на стимуляцію 2ЕРЗ у різних концентраціях і середовищах, стимуляцію та контроль за дексаметазоном. Статистично значимі відмінності представлені як: 7" р «0,05, р «0 р -0,001, и р «0,0001 у порівнянні з контролем стимуляції за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу з наступними множинними порівняннями Данетт.

На Фіг. 12 представлена продукція КАМТЕЗ у нормальних МКПК від 4 донорів-людей у відповідь на стимуляцію 2ЕРЗ у різних концентраціях і середовищах, стимуляцію та контроль за дексаметазоном. Статистично значимі відмінності представлені як: " р «0,05, у порівнянні з контролем стимуляції за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу з наступними множинними порівняннями Данетт.

Фігури 13А і 13В являють собою графіки, які показують зміну товщини шкіри спини з плином часу у мишей, що одержували місцево 2ЕРЗ, 2ЕРЗМа (фіг. 13А) або 2ЕР4 (фіг. 138В), у порівнянні з контролем за наповнювачем і бетаметазоном в моделі атопічного дерматиту, індукованого оксазолоном. Статистично значимі відмінності представлені як: " р «0,05, р «0,01, 5 р «0,001, у порівнянні з контролем стимуляції за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу з наступними множинними порівняннями Данетт.

На фігурах 14А і 14В показана зміна товщини правого вуха з поправкою на вихідний рівень з плином часу у мишей, що одержували місцево 2ЕРЗ, 2ЕРЗМАа (фіг. 14А) або 7ЕРА (фіг. 14В), у порівнянні з контролем за наповнювачем і бетаметазоном в моделі атопічного дерматиту, індукованого оксазолоном у мишей.

Фігури 15А їі 15В8 являють собою графіки, які відображають еволюцію показника еритеми з плином часу у мишей, що одержували місцево 2ЕРЗ, 7ЕРЗМа (фіг. 15А) або 7ЕРА (фіг. 158), у порівнянні з контролем за наповнювачем і бетаметазоном в моделі атопічного дерматиту, індукованого оксазолоном, у мишей. Статистично значимі відмінності представлені як: " р «0,05, р '«0,001, и р «0,0001, у порівнянні з контролем стимуляції за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу з наступними множинними порівняннями Данетт.

Фігури 16А і 168 представляють еволюцію шкали оцінки в часі у мишей, що одержували місцево 2ЕРЗ, 2ЕРЗМа (фіг. 16А) або 2ЕР4 (фіг.168), у порівнянні з контролем за наповнювачами і бетаметазоном в моделі атопічного дерматиту, індукованого оксазолоном.

Статистично значимі відмінності представлені як: " р.к0,05, и рк0 1, ра0001, и р 00001, у порівнянні з контролем стимуляції за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу з наступними множинними порівняннями Данетт.

Фігури 17А ії 17В ілюструють відносну зміну маси тіла тварин з 8 по 28 день у мишей, що одержували місцево 2ЕРЗ, 2ЕРЗМа (фіг. 17А) або 2ЕРА (фіг. 17В), у порівнянні з контролем за

Зо наповнювачем і бетаметазоном в моделі індукованого оксазолоном атопічного дерматиту у мишей.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДОМ

Даний винахід відноситься до фармацевтичних композицій, що містять певні пептиди, їх солі та похідні, для застосування в інгібуванні запальних каскадів. Інгібування медіаторів запалення корисне для профілактики та лікування деяких запальних захворювань та порушень, наприклад, запальних захворювань та порушень очей.

Як проілюстровано у даному документі, інгібуюча дія на вивільнення запальних цитокінів була продемонстрована іп міго на декількох моделях, включаючи клітинну лінію макрофагів миші, клітинну лінію моноцитів людини, клітинну лінію кератиноцитів людини, моноцити периферичної крові людини (МКПК людини) й епітеліальні клітини роговиці людини (ЕКРЛ) й іп мімо на мишачій моделі запального атопічного дерматиту (АД).

Сприятлива дія пептидів на експериментальне запалення роговиці була продемонстрована на моделі культури епітеліальних клітин роговиці людини.

Ідеї та принцип дії даного винаходу можна краще зрозуміти з посиланням на креслення та супровідні описи.

Перш ніж докладно пояснювати щонайменше один варіант реалізації винаходу, слід розуміти, що винахід не обов'язково обмежений у своєму застосуванні деталями, викладеними в нижченаведеному описі або проілюстрованими прикладами. Винахід може бути реалізований в інших варіантах реалізації або реалізований на практиці різними способами. Також слід розуміти, що фразеологія та термінологія, що використані у даному документі, призначені для цілей опису та не повинні розглядатися як обмежуючі.

Застосовуючи даний винахід на практиці, автори несподівано виявили, що пептиди 2ЕРЗ і 2ЕРА й їх форми натрієвої солі знижують експресію запальних цитокінів ФНП-альфа, ІЛ-1-бета й

ІЛ-6 макрофагами й епітелі«альними клітинами роговиці, які були індуковані для запалення (приклади 1-7 нижче), і знижують експресію ІФН гамма, ІЛ-10, ІЛ-їЇ бета і КАМТЕ5З у стимульованих запаленням МКПК людини (приклад 12 нижче). Крім того, у запальній моделі атопічного дерматиту у мишей 2ЕР4, 2ЕРЗ і форма його натрієвої солі 2ЕРЗМа значно зменшували клінічні ураження іп-мімо (Приклад 13 нижче). Результати показують, що пептиди згідно з даним винаходом мають унікальну здатність пригнічувати або запобігати запаленню.

Таким чином, згідно з одним аспектом даного винаходу, запропонована фармацевтична композиція для зменшення вивільнення або інгібування активності щонайменше одного цитокіну або медіатора, залученого в етіологію або патологію запального захворювання або порушення. Фармацевтична композиція включає пептид в якості активного інгредієнта та фармацевтично прийнятний носій. Пептид має амінокислотну послідовність, представлену у будь-якій з ФЕО ІЮО МО: 1 і 2, а бо його фармацевтично прийнятну сіль.

Відповідно, даний винахід забезпечує спосіб полегшення та лікування запальних патологій, пов'язаних з надлишковим вивільненням або активністю певних цитокінів і медіаторів.

Згідно з деякими варіантами реалізації запальна патологія являє собою захворювання або порушення, пов'язане з надлишковим вивільненням або активністю щонайменше одного цитокіну або медіатора, при цьому щонайменше один цитокін або медіатор вибраний з групи, що складається з: ІФН-гамма, ІЛ-1 бета, ІЛ-10, ФНП альфа, ІЛ-б, АФК і КАМТЕ5.

Використовувана тут фраза "запальне захворювання або порушення" відноситься до захворювання, стану або порушення, пов'язаних із запаленням. Використовуваний тут термін "запалення" відноситься до процесу, за допомогою якого імунна система суб'єкта координує відповідь на ушкодження тканини, інфекцію, антигенне навантаження та т.д.

Запалення може бути пов'язане з підвищеним кровопостачанням тканини, підвищеною проникністю капілярів у тканині та/або підвищеною міграцією лейкоцитів у тканину.

Прозапальні цитокіни виробляються переважно активованими макрофагами та беруть участь у регуляції запальних реакцій.

Запалення можна діагностувати за підвищеними рівнями запальних цитокінів, таких як, крім іншого, ФНП альфа, ІЛ-1-альфа, ІЛ-1-бета, ІФН-гамма й ІЛ-6, у біологічному зразку, отриманому від суб'єкта. Біологічний зразок може являти собою, наприклад, сльози, кров, сироватку, плазму, сечу, мокротиння, слину, фекалії, сперму, спинномозкову рідину, кістковий мозок, лімфатичну рідину або цереброспинальну рідину, зовнішні виділення шкіри, дихальних, кишкових і сечостатевих шляхів, молоко, будь-який орган або тканину людини, будь-який зразок, отриманий за допомогою лаважа, множинний випіт, зразок культури клітин іп міго або ех мімо та складові клітинної культури.

Активні форми кисню (АФК) є ключовими сигнальними молекулами, які відіграють важливу

Зо роль у прогресуванні запальних захворювань. Підвищена генерація АФК поліморфноядерними нейтрофілами (ПМН) в місці запалення викликає ендотеліальну дисфункцію й ушкодження тканин. В умовах запалення окисний стрес, викликуваний ПМН, призводить до відкриття міжендотеліальних контактів і сприяє міграції запальних клітин через ендотеліальний бар'єр.

Згідно з деякими варіантами реалізації даного винаходом запальне захворювання або порушення являє собою запальне захворювання або порушення очей. Запальне захворювання або порушення очей може являти собою, крім іншого, увеїт, синдром сухого ока, запальні симптоми, пов'язані з вірусною, бактеріальною або грибковою інфекцією очей, алергійне захворювання очей, кератит, кон'юнктивіт, дисфункцію мейбомієвих залоз і синдром Шегрена.

В одному з варіантів реалізації запальне захворювання або порушення очей являє собою увеїт. Використовуваний тут термін "увеїт" відноситься до запалення судинної оболонки ока, що являє собою шар між склерою та сітківкою, який включає райдужну оболонку, циліарне тіло та судинну оболонку. Увеїт також часто називають іритом, парспланітом, хороїдитом, хоріоретинітом, переднім увеїтом і заднім увеїтом. Найпоширенішою формою увеїту є передній увеїт, який включає запалення у передній частині ока, що зазвичай обмежується райдужною оболонкою. Цей стан часто називають іритом.

В одному варіанті реалізації запальне захворювання або стан ока являє собою синдром сухого ока. Вираз "синдром сухого ока (ССО)3", що використовується у даному документі, відноситься до стану зміненого складу сльози, який є результатом захворювання або дисфункції функціональної одиниці слізної залози. Дані свідчать про те, що запалення викликає структурні зміни слізних залоз. Зміни в складі сльози в результаті дисфункції слізної залози, підвищеного випаровування та/або поганого кліренсу виявляють прозапальну дію на поверхню ока. Це запалення частково відповідає за симптоми роздратування, захворювання поверхневого епітелію ока та зміну бар'єрної функції епітелію роговиці при сухому оці.

Протизапальна терапія для ССО націлена на один або декілька медіаторів/шляхів запалення, які були ідентифіковані при синдромі сухого ока. ССО також відомий фахівцям як хвороба сухого ока (ХСО), сухий кератокон'юнктивіт і сухий кератит.

В одному варіанті реалізації запальне захворювання або стан ока пов'язаний із синдромом

Шегрена. Вираз "синдром Шегрена" в контексті даного опису відноситься до системного аутоїмунного запального захворювання, яке характеризується зменшенням сльозотечі, сухістю бо в роті й іншими сухими слизуватими оболонками, і часто асоціюється з аутоїмунними ревматичними розладами, такими як ревматоїдний артрит. Сухість очей та рота - найчастіші симптоми цього синдрому. Симптоми можуть виникати самі по собі або разом із симптомами, пов'язаними з ревматоїдним артритом або іншими захворюваннями сполучної тканини.

Можливе супутнє збільшення слинних залоз. Можуть бути порушені інші органи. Синдром може бути пов'язаний з ревматоїдним артритом, системним червоним вовчаком (СЧВ), склеродермією, поліміозитом й іншими захворюваннями.

У деяких варіантах реалізації запальне захворювання або стан ока виникає в результаті процедури, що залучає око, наприклад, трансплантації/ кератопластики роговиці, операції кератопротезування, ламелярної трансплантації або селективної трансплантації ендотелію.

У деяких варіантах реалізації запальне захворювання або стан ока впливає на поверхню ока, наприклад, але не обмежуючись ними, запальні стани роговиці й очної поверхні, неоваскуляризація роговиці, кератит, включаючи периферичний виразковий кератит і мікробний кератит, кон'юнктивіт або пемфігоїдний синдром.

У деяких варіантах реалізації запальне захворювання або стан ока являє собою аутоіїмунне захворювання, що вражає око, таке як, крім іншого, симпатична офтальмія, синдром Фогта-

Коянагі Харада (МКН), дробовидна ретинохоріодопатія, очний рубцевий пемфігоїд (ОРП), синдром Шегрена. або гетерохронний іридоцикліт Фукса.

Згідно з деякими варіантами реалізації даного винаходом запальне захворювання або порушення являє собою аутоїмунне захворювання або порушення. Аутоїмунне захворювання або порушення може являти собою, без обмеження, ревматоїдний артрит, остеоартрит, псоріатичний артрит, вульгарну пузирчатку, анкілозуючий спондиліт, ювенільний ідіопатичний артрит, вовчак і синдром Шегрена.

В одному варіанті реалізації аутоїмунне захворювання або порушення являє собою ревматоїдний артрит. Вираз "ревматоїдний артрит" в контексті даного опису відноситься до хронічного аутоїмунного захворювання, при якому запалені декілька суглобів. Запалення слизуватої оболонки синовіального суглоба супроводжується болем у суглобах й їх скутістю та зазвичай призводить до руйнування кісток і суглобів, деформації, інвалідності та навіть смерті.

В одному варіанті реалізації аутоїмунне захворювання або порушення являє собою вовчак.

Використовуваний тут термін "вовчак" відноситься до хронічного запального аутоіїмунного

Зо захворювання, що називається червоним вовчаком, яке може вражати багато систем органів, включаючи шкіру, суглоби та внутрішні органі. Вовчак - це загальний термін, який включає ряд конкретних типів вовчаку, включаючи системний вовчак, вовчанковий нефрит і вовчанковий церебрит. При системному вовчаку (СЧВ) природній захист організму спрямований проти нього самого, й імунні клітини атакують власні тканини. Можуть вироблятися антитіла, які можуть реагувати проти клітин крові, органів і тканин організму. Ця реакція призводить до того, що імунні клітини атакують уражені системи, викликаючи хронічне захворювання. Вовчанковий нефрит, що також називається гломерулярним вовчаком, являє собою захворювання нирок, яке зазвичай є ускладненням СЧВ і характеризується ушкодженням клубочків і прогресуючою втратою функції нирок. Вовчанковий церебрит відноситься до ще одного ускладнення СЧВ, яке являє собою запалення головного мозку та/або центральної нервової системи.

В одному з варіантів реалізації даного винаходу запальне захворювання або порушення являє собою остеоартрит (ОА). ОА також називають гіпертрофічним остеоартрозом, остеоартрозом і дегенеративним захворюванням суглобів. ОА - це хронічне дегенеративне захворювання кістякових суглобів, яке вражає певні суглоби, зазвичай коліна, стегна, суглоби рук і хребет, у дорослих усіх віків. ОА характеризується рядом наступних проявів, включаючи дегенерацію та потоншення суглобного хряща із супутнім розвитком "виразок" або кратерів, утворення остеофітів, гіпертрофію кісток за краями, а також зміни синовіальної оболонки та збільшення вражених суглобів. Крім того, остеоартрит супроводжується болем і скутістю, особливо після тривалої активності. Пептиди, їх солі та похідні, а також фармацевтичні композиції, що їх містять, згідно з даним винаходом можна використовувати для лікування остеоартриту. Характерні рентгенологічні ознаки остеоартриту включають звуження суглобної щілини, субхондральний склероз, остеофітоз, утворення субхондральних кист, пухке кісткове тіло (або "суглобну мишу").

Згідно з деякими варіантами реалізації даного винаходу запальне захворювання або порушення являє собою запальне захворювання кишечнику. Запальне захворювання кишечнику може являти собою, крім іншого, хворобу Крона, виразковий коліт і целіакію.

Згідно з деякими варіантами реалізації даного винаходу запальне захворювання або порушення являє собою запальне захворювання або порушення легенів. Запальне захворювання або порушення легенів може являти собою, крім іншого, астму, бронхіт, плеврит,

альвеоліт, васкуліт, пневмонію, хронічний бронхіт, бронхоектазію, дифузійний панбронхіоліт, гіперчутливий пневмоніт, ідіопатичний легеневий фіброз і муковісцидоз.

Згідно з деякими варіантами реалізації даного винаходу запальне захворювання або порушення являє собою запальне захворювання або порушення вуха. Запальне захворювання або порушення вуха може являти собою, без обмеження, запальні симптоми, пов'язані з інфекцією вуха, середній отит, зовнішній отит, мастоїдит й отомастоїдит.

Згідно з даним винаходом також запропонована фармацевтична композиція для застосування при лікуванні захворювання або розладу, пов'язаного з надлишковим вивільненням медіаторів запалення та хемокінів, включаючи, але не обмежуючись ними, АФК,

КАМТЕЗ і хемотаксичний білок-ї моноцитів (ХБМ-1). Запальні захворювання, пов'язані з вивільненням АФК, які піддаються лікуванню за допомогою композицій згідно з даним винаходом, включають, без обмеження, захворювання легенів, серцево-судинні захворювання, кальцифікацію судин, пов'язану із захворюванням нирок, і запальні метаболічні захворювання.

Хемокіни КАМТЕ5 і ХБМ-1 беруть участь в алергійному запаленні легенів, інфільтрації лейкоцитів у легенях, гіперреактивності бронхів і залученні еозинофілів у патогенез астми.

Терміни "лікування" або "лікувати" можуть використовуватися у даному документі взаємозамінно та відносяться до інгібування, запобігання або зупинці розвитку захворювання або порушення та/або до зменшення, ремісії або регресу захворювання або порушення.

Пептиди, похідні та солі, що застосовуються в композиціях і способах згідно з даним винаходом, можуть бути синтезовані з використанням будь-якого способу, відомого в даній області техніки, включаючи, крім іншого, твердофазний та рідкофазний пептидний синтез.

Деякі з пептидів, що використовуються в композиціях згідно з даним винаходом, можуть бути отримані з використанням рекомбінантних методів або комбінації рекомбінантних і синтетичних методів.

В одному варіанті здійснення даного винаходу пептид являє собою роїіш-Авп-Ттр-

Гуз(октаноїл)у-ОН (ЗЕО ІО МО: 1 ; далі позначається як " 2ЕРЗ") де ро являє собою піроглутамінову кислоту. Пептид 2ЕРЗ може бути отриманий, наприклад, згідно з методикою, описаною у патенті США Мо 7220725.

В одному варіанті реалізації даного винаходу пептид являє собою роіш-Авп-Ттр-Г-ОоНн (ЗЕБЕО ІЮО МО: 2; далі згадується як "ЕР4"М. Пептид 2ЕР4 можна одержати, наприклад, за допомогою наступної процедури:

Синтез пептиду 2ЕР4 здійснюють послідовним синтезом 9-фторметоксикарбоніл. (Етос) амінокислот на твердому носії з хлортритилхлоридної смоли (ХТХ). В смолу ХТХ (125 г) завантажують Етос-треонін (трет-бутил; 79 г) і дізопропіламін (ОІРЕА; 160 г), що служить сполучним агентом амінокислоти з твердим носієм. Захисну групу Етос видаляють сумішшю 2590 піперидину, та смолу-пептид фільтрують та промивають диметилформамідом (ДМФ).

Другу амінокислоту, Ептос-Ттр (85 г), активують сумішшю гексафторфосфату 2-(1Н- бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію (НВТШ) / гідроксибензотіазолу (ОНВТ) і приєднують до першої амінокислоти додаванням ОІРЕА. Групу ЕГтос видаляють, як описано вище, і смолу-пептид фільтрують та промивають диметилформамідом (ДМФ). Третю амінокислоту, Етос-Азп (трифенілметил) ( 119 г), активують Н ВТО/НОВТ і зв'язують шляхом додавання ОСІРЕА. Групу Етос видаляють, як описано вище, і смолу-пептид фільтрують та промивають диметилформамідом (ДМФ). Четверту амінокислоту роОїш (26 г) активують

НВТИО/НОВТ і зв'язують за допомогою ОІРЕА.

Пептид-смолу ретельно промивають ДМФ, потім ІПС, ії сушать при зниженому тиску. Пептид відщеплюють від смоли та захисних груп ТПАг й Авп, під дією ТФОК (95 95) і триїзопропілсилану (ТІС) (5 95) при кімнатній температурі протягом 2 годин. Пептид осаджують додаванням метил- трет-бутилового ефіру (МТЕЕ), фільтрують та сушать (вихід 46 г).

Неочищений продукт (46 г) розчиняють в суміші ацетонітрил (АСМ)/вода, завантажують в систему препаративної ВЕРХ (4 дюйма, КР С-18, розмір пор 100-120 А) й очищають з використанням градієнтної системи, що складається з: фази А - 0,1 95 ТФОК у воді та фази В -

АСМ. Елюювання здійснюють шляхом поступового збільшення фази В (від З 95 до 33 95) протягом 45 хвилин. Збирають фракції, що мають чистоту більше 97 95. Об'єднані фракції елююють у тій самій системі ВЕРХ, використовуючи градієнт, що складається з: фази А: 0,2 95 оцтової кислоти; і фази В: АСМ. Елюювання здійснюють шляхом поступового збільшення фази

В (від 10 95 до 40 95) протягом 30 хвилин. Фракції, що мають чистоту більше 97 95, збирають, поєднують та ліофілізують (вихід 29 г). Кінцевий продукт має молекулярну масу (МС) 530,5; і чистоту 97,3 95 (ВЕРХ).

В обсяг винаходу також входять солі та похідні пептидів, які використовуються у композиціях 60 і способах згідно з даним винаходом.

Використовуваний тут термін "солі" відноситься як до солей карбоксильних груп, так і до утворених приєднанням кислоти солей аміно- або гуанідиногруп молекули пептиду. Солі карбоксильних груп можуть бути утворені способами, відомими в даній області, та включають неорганічні солі, наприклад, солі натрію, кальцію, амонію, заліза або цинку та т.п., і солі з органічними основами, такі як солі, утворені, наприклад, з амінами, такими як триетаноламін, піперидин, новокаїн і тому подібне. Утворені приєднанням кислоти солі включають, наприклад, солі з мінеральними кислотами, такими як, наприклад, оцтова кислота або щавлева кислота. Солі описують також іонні компоненти, додані до розчину пептиду для посилення утворення гідрогелю та/або мінералізації мінералів кальцію.

Використовуваний тут термін "похідні" пептидів згідно з даним винаходом охоплює похідні, які можуть бути отримані з функціональних груп, які зустрічаються у вигляді бічних ланцюгів на залишках або М- або С-кінцевих групах, способами, відомими в даній області техніки, й які включені у винахід, поки вони залишаються фармацевтично прийнятними, тобто не порушують активність пептиду, не надають токсичних властивостей композиціям, що містять його, та не виявляють негативного впливу на його імуногенні властивості.

Ці похідні можуть включати, наприклад, аліфатичні складні ефіри карбоксильних груп, аміди карбоксильних груп, отримані реакцією з аміаком або з первинними або вторинними амінами, М- ацильні похідні вільних аміногруп амінокислотних залишків, утворених реакцією з адильними фрагментами (наприклад, алканоїльні або ароїльні групи) або О-ацильні похідні вільної гідроксильної групи (наприклад, серильних або треонільних залишків), утворені реакцією з ацильними фрагментами.

В одному варіанті реалізації даного винаходу пептид являє собою натрієву сіль пептиду, представленого у ЗЕО ІЮ МО: 1 (роіІш-Авп-Ттгр-І уз(октаноїл)-ОН. пМа, де п дорівнює 1 або 2; далі іменовану "натрієва сіль 2ЕРЗ" або 7ЕРЗМАа).

Натрієва сіль 2ЕРЗ може бути отримана, наприклад, за допомогою наступної процедури: 2ЕРЗ (311 г) солюбілізують в розчині МанСОз (100 мМ) уУ воді (50 г/л). Розчин вводять в іонообмінну колонку для ВЕРХ (2,5 х 22 см І ипа С18, 100А, 15 мікрон) й елююють градієнтом, що складається з: рухомої фази А: 2 мМ МансоОз в Н?О; рухомої фази В: 2 мМ Мансоз в

СНіІСМ/НгО (8/2); і рухомої фази С: Мансоз 100 мм у воді. Завантаження за цикл: максимум

Зо 595 (мас./масє. 90 ПЕПТИД/ НЕРУХОМА ФАЗА). Витрата: 4,8 см/хв (24 мл/хв). Процедура градієнта наступна: 20 хв фазаС 5 хв фаза А; 1 8 х в. фаза В ; і 7 х в. фаза С. Фракцію, що містить продукт, збирають та концентрують при зниженому тиску для видалення ацетонітрилу (110 г/л), потім сушать виморожуванням |вихід 2,2 г (71 95)|. Кінцевий продукт має чистоту 99,7 до (ВЕРХ), вміст натрію 3,1 95 і розчинність 50 мг/мл води.

В одному варіанті реалізації даного винаходу пептид являє собою натрієву сіль пептиду, зазначеного у ЗЕО ІЮ МО: 2 (робіІй-Авп-Ттр-ТАИ!-ОН.пМа, де п дорівнює 1 або 2; надалі іменовану "натрієва сіль 2ЕР4" або 7ЕР4АМа). Натрієва сіль 7ЕР4 може бути отримана, наприклад, за допомогою наступної процедури: 2ЕРА (5 г) солюбілізують в МансоЗз (100 мМ) у воді (50 г/л). Розчин вводять в іонообмінну колонку для ВЕРХ (2,5 х 22 см Гипа С18, 100А, 15 мікрон) й елююють градієнтом, що складається з: рухомої фази А: 2 мМ МанНсСОз в Н2гО; рухомої фази В: 2 мМ Мансоз в

СНіІСМ/НгО (8/2); і рухомої фази С: Мансоз 100 мм у воді. Завантаження за цикл: максимум 595 (мас./масє. 90 ПЕПТИД/ НЕРУХОМА ФАЗА). Витрата: 4,8 см/хв (24 мл/хв). Процедура градієнта наступна: 20-хвилин фаза С, потім 5-хвилин фаза А, потім 20-хвилин фаза В і 1 0- хвилин фаза С. Фракцію, що містить продукт, збирають та концентрують при зниженому тиску для видалення ацетонітрилу (110 г/л), потім сушать виморожуванням |вихід 4 г (80 2 95).

Кінцевий продукт має чистоту 97,5 95 (ВЕРХ), вміст натрію 2,5 95 і розчинність 50 мг/мл води.

Пептиди згідно з даним винаходом можуть використовуватися в терапії самі по собі або як частина (активний інгредієнт) фармацевтичної композиції.

Використовуваний тут термін "фармацевтична композиція" відноситься до препарату одного або декількох активних інгредієнтів, описаних у даному документі, з іншими хімічними компонентами, такими як фізіологічно підходящі носії та наповнювачі.

Призначення фармацевтичної композиції - полегшити введення сполуки в організм.

Тут і далі фрази "фізіологічно прийнятний носій" та "фармацевтично прийнятний носій", які можуть використовуватися взаємозамінно, відносяться до носія або розріджувача, що не викликає значного роздратування організму та не скасовує біологічну активність і властивості сполуки, що вводиться. Зазначені вирази включають ад'ювант.

Тут термін "наповнювач" відноситься до інертної речовини, що додається у фармацевтичну композицію для подальшого полегшення введення активного інгредієнта.

Приклади наповнювачів, без обмеження, включають карбонат кальцію, фосфат кальцію, різні цукри та типи крохмалю, полісахариди, циклодекстрини, суспендуючі агенти, такі як полівінілпіролідон, полівініловий спирт, іонні або неїонні поверхнево-активні речовини, солюбілізатори, емульгатори, такі як лецитин, підсилювачі проникнення, полікарбонові кислоти, похідні целюлози, желатин, рослинні олії, воски, мінеральні олії, пропіленгліколь та полієтиленгліколі.

Методи складання та введення лікарських засобів можна знайти в останньому виданні "Кетіпдіоп'є Рпагтасешііса! Зсіепсе5", Маск Рибіїєпіпуд Со., Еазіоп, РА, включеному в даний опис за допомогою посилання.

Підходящі шляхи введення можуть, наприклад, включати: офтальмологічні, місцеві, пероральні, ректальні, черезшкірні, трансназальні, кишкові або парентеральні шляхи доставки, включаючи внутрішньом'язові, підшкірні й інтрамедулярні ін'єкції, а також інтратекальні, прямі внутрішньошлуночкові, внутрішньовенні, внутрішньоперитонеальні, інтраназальні або внутрішньоочні ін'єкції.

Фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом можуть бути отримані способами, добре відомими в даній області техніки, наприклад, за допомогою традиційних способів змішування, розчинення, суспендування, солюбілізації, гранулювання, виготовлення драже, відмулювання, емульгування, інкапсулювання, уловлювання, розпилювального сушіння або ліофілізації.

Таким чином, фармацевтичні композиції для застосування відповідно до даного винаходу можуть бути складені звичайним способом з використанням одного або декількох фізіологічно прийнятних носіїв, включаючи наповнювачі та допоміжні речовини, які полегшують переробку активних інгредієнтів у препарати, які можна використовувати у фармацевтиці. Правильний склад залежить від вибраного шляху введення.

Описана тут фармацевтична композиція може бути приготовлена для офтальмологічного введення. Використовувана тут фраза "офтальмологічне введення" відноситься до введення пептиду або фармацевтичної композиції згідно з винаходом в зовнішнє око (наприклад, кон'юнктивальний мішок) або інтравітреально. Лікарські форми, які підходять для офтальмологічного введення, можуть являти собою, крім іншого, очні краплі, очну мазь, спрей

Зо для очей, очну суспензію, очну емульсію, очний розчин, очний гель або інтравітреальну ін'єкцію.

Описана тут фармацевтична композиція може бути приготовлена для місцевого застосування. Лікарські форми, які підходять для місцевого застосування, можуть являти собою, без обмеження, рідкі краплі, рідке промивання, гель, мазь, емульсію, суспензію, лосьйон, спрей, рідину, що розпилюється, супозиторій, крем, порошок, піну, кристали та ліпосоми.

Для ін'єкції активні інгредієнти фармацевтичної композиції можуть бути приготовлені у водних розчинах, переважно у фізіологічно сумісних буферах, таких як розчин Хенка, розчин

Рінгера або фізіологічний сольовий буфер. Одним із шляхів уведення, який підходить для фармацевтичних композицій згідно з даним винаходом, є субперіостальна ін'єкція, як описано у патенті США Мо 6 525 030 на ім'я Егіккбоп. Для черезшкірного введення в композиції використовують пенетранти, які підходять для проникного бар'єра. Такі пенетранти зазвичай відомі в даній області техніки.

Для перорального введення фармацевтична композиція може бути легко приготовлена шляхом об'єднання активних сполук із фармацевтично прийнятними носіями, добре відомими в даній області техніки. Такі носії дозволяють складати фармацевтичну композицію у вигляді таблеток, пігулок, драже, капсул, рідин, гелів, сиропів, суспензій, емульсій та т.п. для перорального приймання пацієнтом. Фармакологічні препарати для перорального застосування можуть бути приготовлені з використанням твердого наповнювача, необов'язково, з подрібнюванням отриманої суміші й обробкою суміші гранул після додавання підходящих допоміжних засобів, якщо бажано, для одержання таблеток або ядер драже. Підходящими наповнювачами є, зокрема, наповнювачі, такі як цукри, включаючи лактозу, сахарозу, маніт або сорбіт; препарати целюлози, такі як, наприклад, кукурудзяний крохмаль, пшеничний крохмаль, рисовий крохмаль, картопляний крохмаль, желатин, трагакантова камедь, метилцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза, карбометилцелюлоза натрію; та/або фізіологічно прийнятні полімери, такі як полівінілпліролідон (ПВП). Якщо бажано, можуть бути додані дезінтегруючі агенти, такі як зшитий полівінілпіролідон, агар або альгінова кислота або її сіль, така як альгінат натрію. Використовуваний тут термін "пероральне введення" включає введення фармацевтичної сполуки на будь-яку поверхню порожнини рота, включаючи язик, ясна, небо, під'язичну або іншу щічну поверхню.

Ядра драже мають підходящі покриття. Для цієї мети можна використовувати концентровані бо розчини цукрів, які можуть, необов'язково, містити гуміарабік, тальк, полівінілпіролідон, гель карбопол, полієтиленгліколь, діоксид титану, розчини лаків і підходящі органічні розчинники або суміші розчинників. До покриттів таблеток або драже можуть бути додані барвники або пігменти для ідентифікації або для характеристики різних комбінацій доз активної сполуки.

Фармацевтичні композиції, які можна застосовувати перорально, містять в собі тверді капсули, виготовлені з желатину, а також м'які герметичні капсули з желатину та пластифікатора, такого як гліцерин або сорбіт. Тверді капсули можуть містити активні інгредієнти в суміші з наповнювачем, таким як лактоза, зв'язувальними речовинами, такими як крохмалі, змазуючими речовинами, такими як тальк або стеарат магнію, та, необов'язково, стабілізаторами. В м'яких капсулах активні інгредієнти можуть бути розчинені або суспендовані у підходящих рідинах, таких як жирні олії, рідкий парафін або рідкі поліетиленгліколі. Крім того, можуть бути додані стабілізатори. Всі склади для перорального введення повинні бути в дозах, які підходять для вибраного шляху введення.

Для буккального введення композиції можуть мати форму таблеток або льодяників, приготовлених звичайним способом.

Для введення шляхом назальної інгаляції активні інгредієнти для використання відповідно до даного винаходу зручно доставляти у формі аерозольного спрею з герметичної упаковки або небулайзера з використанням підходящого пропелента, наприклад, дихлордифторметану, трихлорфторметану, дихлорфторметану, тетрафторетану або діоксиду вуглецю. У випадку аерозолю під тиском одиницю дозування можна визначити шляхом забезпечення клапана для доставки відміряної кількості. Капсули та картриджі, наприклад, з желатину для використання в дозаторі, можуть бути складені з вмістом суміші порошку сполуки та підходящої порошкової основи, такої як лактоза або крохмаль.

Описана тут фармацевтична композиція може бути складена для парентерального введення, наприклад, шляхом болюсної ін'єкції або безперервної інфузії. Склади для ін'єкцій можуть бути представлені у вигляді стандартної лікарської форми, наприклад, в ампулах або в контейнерах для декількох доз із необов'язково доданим консервантом. Композиції можуть являти собою суспензії, розчини або емульсії в масляних або водних носіях і можуть містити агенти для складання рецептур, такі як солюбілізуючі, суспендуючі, стабілізуючі та/або диспергуючі агенти.

Зо Фармацевтичні композиції для парентерального введення включають водні розчини активного препарату у водорозчинній формі. Крім того, суспензії активних інгредієнтів можуть бути приготовлені у вигляді відповідних суспензій для ін'єкцій на масляній або водній основі.

Підходящі ліпофільні розчинники або носії включають жирні олії, такі як кунжутна олія, або складні ефіри синтетичних жирних кислот, такі як етилолеат, емульсії тригліцеридів а бо ліпосоми. Водні суспензії для ін'єкцій можуть містити речовини, що збільшують в'язкість суспензії, такі як натрійкарбоксиметилцелюлоза, сорбіт або декстран. Необов'язково, суспензія може також містити підходящі стабілізатори або агенти, які збільшують розчинність активних інгредієнтів, що дозволяє приготувати висококонцентровані розчини.

Альтернативно, активний інгредієнт може бути у формі порошку для змішування з підходящим носієм, наприклад, зі стерильним апірогенним розчином на водній основі, перед застосуванням.

Фармацевтична композиція згідно з даним винаходом також може бути приготовлена у вигляді ректальних композицій, таких як супозиторії або утримувані клізми, з використанням, наприклад, звичайних основ для супозиторі .в, таких як масло какаос або інші гліцериди.

Фармацевтичні композиції, які підходять для використання в контексті даного винаходу, включають композиції, в яких активні інгредієнти містяться в кількості, ефективній для досягнення наміченої мети. Більше конкретно, терапевтично ефективна кількість означає кількість активних інгредієнтів, ефективну для запобігання, полегшення або ослаблення симптомів захворювання або розладу в суб'єкта, якого лікують.

Визначення терапевтично ефективної кількості перебуває в компетенції фахівців у даній області техніки, особливо у світлі докладного опису, представленого у даному документі.

Для будь-якого препарату, використовуваного в способах згідно з даним винаходом, терапевтично ефективна кількість або доза може бути спочатку оцінена за допомогою аналізів іп міго та клітинних культур. Наприклад, доза може бути сформульована в моделі на тваринах для досягнення бажаної концентрації або титру. Таку інформацію можна використовувати для більше точного визначення корисних доз для людини.

Токсичність та терапевтичну ефективність активних інгредієнтів, описаних у даному документі, можна визначити стандартними фармацевтичними процедурами іп мійго, на культурах клітин або експериментальних тваринах. Дані, отримані в результаті цих аналізів іп 60 мійго та клітинних культурах, а також досліджень на тваринах, можна використовувати для визначення діапазону доз для застосування на людях. Дозування може варіюватися залежно від застосовуваної лікарської форми та використовуваного шляху введення. Точний склад, спосіб введення та дозування можуть бути вибрані індивідуальним лікарем з урахуванням стану пацієнта (див., наприклад, Ріподі, еї аіІ., 1975, у "пе Рпагтасоїодіса! Вавзі5 ої Тпегарешісв" (Фармакологічні основи терапії), СП. 1 р.1).

Кількість й інтервал дозування можна індивідуально відрегулювати до рівнів активного інгредієнта, які достатні для досягнення мінімальної ефективної концентрації (МЕК). МЕК буде відрізнятися для кожного препарату, але його можна оцінити на основі даних іп міго. Дозування, необхідні для досягнення МЕК, будуть залежати від індивідуальних характеристик і шляху введення. Аналізи виявлення можна використовувати для визначення концентрацій у плазмі або тканині.

Залежно від тяжкості та сприйнятливості стану, який необхідно лікувати, дозування може бути однократним або множинним, з курсом лікування, що триває від декількох днів до декількох тижнів, або до досягнення зменшення хворобливого стану.

Кількість композиції, що вводиться, звичайно ж, буде залежати від суб'єкта, якого лікують, тяжкості захворювання, способу введення, висновку лікаря та т.д.

Таким чином, композиції талабо вироби згідно з деякими варіантами реалізації даного винаходу можуть, при бажанні, бути представлені в упаковці або дозуючому пристрої, такому як схвалений ЕБА набір, який може містити одну або декілька стандартних дозованих форм, що містять активний інгредієнт. Упаковка може, наприклад, містити металеву або пластикову фольгу, таку як блістерна упаковка. До упаковки або дозуючого пристрою можуть додаватися інструкції із застосування. На упаковці або дозаторі також може бути розміщене повідомлення, пов'язане з контейнером, у формі, запропонованій урядовим агентством, що регулює виробництво, використання або продаж фармацевтичних препаратів, причому це повідомлення відображає схвалення агентством форми композицій або для введення людині або тварині.

Таке повідомлення, наприклад, може відноситися до маркування, схваленого Керуванням з контролю за продуктами та ліками США для рецептурних ліків, або до затвердженого вкладиша продукту. Композиції, які містять препарат згідно з даним винаходом, складений у сумісному фармацевтичному носії, також можуть бути приготовлені, поміщені у відповідний контейнер

Зо (наприклад, ліофілізований флакон) і позначені для лікування зазначеного стану, як додатково докладно описано вище.

Пептид або фармацевтичну композицію згідно з даним винаходом можна використовувати для інгібування вивільнення або активності запальних цитокінів і медіаторів і для лікування запального захворювання або порушення шляхом забезпечення суб'єкту, що має в цьому потребу, терапевтично ефективної кількості пептиду або фармацевтичної композиції.

Використовувана тут фраза "суб'єкР, що має в цьому потребу" відноситься до ссавця чоловічої або жіночої статі (наприклад, людини), в якої діагностоване запальне захворювання або порушення. У конкретному варіанті реалізації цей термін охоплює людей, які піддані ризику розвитку запального захворювання або порушення. Суб'єкт може бути будь-якої статі або будь- якого віку, включаючи немовлят, дітей, підлітків, дорослих і людей похилого віку.

Використовуваний тут термін "приблизно" відноситься до «10 95.

Терміни "містить", "що містить", "включає", "що включає", "що має" й їх кон'югати означають "включаючи, але не обмежуючись зазначеним".

Термін "що складається з" означає "включаючи й обмежуючись зазначеним".

Термін "що складається по суті з" означає, що композиція, спосіб або структура можуть включати додаткові інгредієнти, етапи та/або частини, але тільки якщо додаткові інгредієнти, етапи та/або частини не змінюють суттєво основні та нові характеристики заявленого складу, способу або структури.

Використовувані тут форми однини включають вказівку на множину, якщо контекст явно не диктує інше. Наприклад, термін "сполука" або "щонайменше одна сполука" може включати множину сполук, включаючи їх суміші.

У даній заявці різні варіанти реалізації даного винаходу можуть бути представлені у форматі діапазону. Слід розуміти, що опис у форматі діапазону наведений просто для зручності та стислості, і не повинен розглядатися як тверде обмеження обсягу винаходу.

Відповідно, слід вважати, що опис діапазону конкретно розкриває всі можливі піддіапазони, а також окремі числові значення в цьому діапазоні. Наприклад, опис діапазону, такого як від 1 до 6, слід розглядати, як такий, що конкретно розкриває піддіапазони, такі як від 1 до З,відїдо 4, від'до5, від2до4 ,від2 доб , від З до 6 і т.д., а також окремі числа в цьому діапазоні, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5 і 6. Це застосовно незалежно від ширини діапазону.

Кожного разу, коли тут зазначений числовий діапазон, мається на увазі, що він включає будь-яке зазначене число (дробове або ціле) в межах зазначеного діапазону. Фрази "діапазон/діапазони між" першим зазначеним числом і другим зазначеним числом і "діапазон/діапазони від" першого зазначеного числа "до" другого зазначеного числа використовуються тут взаємозамінно та призначені для включення першого та другого зазначених чисел і всіх дробових і цілих чисел між ними.

Використовуваний тут термін "спосіб" відноситься до способів, засобів, методик і процедур для виконання даного завдання, включаючи, але не обмежуючись ними, ті способи, засоби, методики та процедури, які або відомі, або легко можуть бути розроблені виходячи з відомих способів, засобів, методик і процедур практикуючими хіміками, фармакологами, біологічними, біохімічними та медичними фахівцями.

Зрозуміло, що певні ознаки винаходу, які для ясності описані в контексті окремих варіантів реалізації, також можуть бути надані в комбінації в одному варіанті реалізації. І навпаки, різні ознаки винаходу, які для стислості описані в контексті одного варіанта реалізації, також можуть бути надані окремо або у будь-якій підходящій підкомбінації або як підходящі у будь-якому іншому описаному варіанті реалізації даного винаходу. Певні ознаки, описані в контексті різних варіантів реалізації, не слід розглядати як істотні особливості цих варіантів реалізації, якщо тільки варіант реалізації не працює без цих елементів.

Різні варіанти реалізації й аспекти даного винаходу, описані вище та заявлені у наведеному нижче розділі формули винаходу, знаходять експериментальну підтримку у наступних прикладах.

ПРИКЛАДИ

Нижче наведені посилання на наступні приклади, які разом із наведеними вище описами ілюструють винахід, але не обмежують його.

ПРИКЛАД 1 - Вплив 2ЕР4 на експресію ФНП-альфа індукованими запаленням клітинами макрофагів

Матеріали та методи

Пептид роїіш-Авп-Ттр-Ти-ОН (далі іменований "ЛЕР4", 5ЗЕО ІЮ МО: 2) синтезували, як описано вище.

Зо Експресія ФНП альфа клітинами макрофагів Вб

Макрофаги, що походять від мишей С57ВІ /б, культивували при щільності 200000 клітин/мл в 24-ямковому планшеті (ямки 500 мкл) й інкубували при 37"С і 595 СО» протягом ночі. Після інкубації культуральні середовища в деяких експериментальних групах заміняли свіжими середовищами, що містять 100 нг/мл ЛПС, з наступною тригодинною інкубацією.

Потім середовища (що містять ЛОС або не містять ЛПС) у певних експериментальних групах заміняли свіжими середовищами, що містять 2ЕР4 в концентраціях від 3,125 до 100 мкг/мл, з наступною годинною інкубацією. Потім у відповідні ямки додавали пальмітинову кислоту (ПК, 200 мкМ) і планшети інкубували протягом додаткових 24 годин, потім вимірювали кількість ФНП альфа в кожній ямці. В таблиці 1 перераховані різні групи впливу та контрольні групи. Зниження продукції ФНІП-альфа у групах впливу розраховували відносно клітин, оброблених ЛПС і ПК (СІ Р200).

Результати

Малюнок 1 і таблиця 1 нижче показують, що 2ЕРА4 суттєво знижує кількість ФНІП-альфа, що продукується індукованими запаленням макрофагальними клітинами, обробленими ЛПС і пальмітиновою кислотою протягом 24 годин. Концентрація 2ЕР4 3,125 мкг/мл викликала зниження експресії ФНП-альфа на 70,6 95. Найбільш ефективна концентрація 7ЕР4 становила мкг/мл, що викликало зниження експресії ФНП-альфа на 77,0 Фо (р «0,0001).

Таблиця 1

Вплив концентрації ЕРА на експресію ФНП-альфа макрофагами, обробленими ЛПС і пальмітиновою кислотою . Чо

ТЕРА4А лпПпо пальмітинова |(ФНП альфа

ФНП альфа зонтрольлниню | Хто | 2116 . Контроль контроль (клітини) пишно 1 але | 191 ово пальмітинова

Таблиця 1

Вплив концентрації 7ЕР4А на експресію ФНП-альфа макрофагами, обробленими ЛПС і пальмітиновою кислотою

ТЕРА ЛПС | пальмітинова ФНальфа 02

ФНП альфа жислотаїдГ 11111111

КонтрольЛПСГ////777/7С2е1111111-1 100 | 7777717 - 111111 6біЗЯ

Контроль пальмітинова СР2О0О 200 кислота

Контроль2ЕР. | С2100 1100 | - | - (0 ЇЇ -

Контроль за середовищем Сіво ізопропанол

ПРИКЛАД 2 - Вплив 2ЕР4 на експресію ФНП-альфа індукованими запаленням клітинами макрофагів

Матеріали та методи

Пептид 2ЕРА (5ЕО ІО МО: 2) був синтезований, як описано вище.

Експресія ФНП альфа клітинами макрофагів Вб

Макрофаги, що походять від мишей С57ВІ /б, культивували при щільності 200000 клітин/мл в 24-ямковому планшеті (ямки 500 мкл) й інкубували при 37"С і 5 95 СО» протягом ночі. Після інкубації середовище заміняли свіжим середовищем, що містить 100 нг/мл ЛПС, з наступною тригодинною інкубацією. Потім середовище, що містить ЛПС, у групах впливу заміняли свіжим середовищем, що містить 7ЕР4 в концентрації 50 мкг/мл, з наступною годинною інкубацією.

Потім аліквоти пальмітинової кислоти (100, 200 або 400 мкМ) додавали у відповідні ямки.

Планшети інкубували протягом додаткових 24 годин і вимірювали кількість ФНП-альфа в кожній ямці. В таблиці 2 перераховані різні групи впливу та контрольні групи. Зниження продукції ФНП- альфа в групах лікування розраховували відносно клітин, оброблених ЛПС і ПК, відповідно до концентрації ПК.

Результати

На малюнку 2 і в таблиці 2 нижче показано, що концентрації пальмітинової кислоти 100, 200 і 400 мкМ індукували експресію ФНП-альфа макрофагами на рівні 416, 462 і 593 пг/мл відповідно. 2ЕР4 в концентрації 50 мкг/мл суттєво знижував експресію ФНП-альфа макрофагами при всіх концентраціях пальмітинової кислоти (77 р «0/0001).

Таблиця 2

Вплив 2ЕРА (50 мкг/мл) на експресію ФНП альфа макрофагами, обробленими ЛПС (100 нг/мл) і пальмітиновою кислотою (100, 200 і 400 мкМ) лпе пальмітинова кислота |ФНП альфа) 95 зниження ФНП - | 1 2 ню 2 02

Контроль контроль с -111171л00 17111111 -111111111 423,67 | 7-7

СРО 1777777 - 777111 лою | 77771400 | 59282 | о - 7

СіР2О 1777777 - 771171 лою | 77772001 | 46206 | ..::/-.-3./СС

Таблиця 2

Вплив 2ЕРА (50 мкг/мл) на експресію ФНП альфа макрофагами, обробленими ЛПС (100 нг/мл) і пальмітиновою кислотою (100, 200 і 400 мкМ) лпе пальмітинова кислота |ФНП альфа) 95 зниження ФНП сСіРТОЮ 17777717 - 71171 лою | 777710 | 41648 | -Х -

ПРИКЛАД З - Вплив 2ЕРЗ на експресію ФНП-альфа індукованими запаленням клітинами макрофагів

Матеріали та методи

Пептид роіш-Авп-Тгр-І уз(октаноїл)/у-ОН (надалі іменований "2ЕРЗ" 5ЕО ІЮ МО: 1) синтезували, як описано у патенті США Мо 7220725.

Клітини макрофагів, що походять від мишей С57ВІ /б, культивували при щільності 200000 клітин/мл в 24-ямковому планшеті (ямки 500 мкл) й інкубували при 37"С і 5 95 СО» протягом ночі.

Після інкубації середовища в деяких експериментальних групах заміняли свіжими середовищами, що містять 100 нг/мл ЛПС, з наступною тригодинною інкубацією. Потім середовища (що містять або що не містять ЛПС) у певних експериментальних групах заміняли свіжими середовищами, що містять 2ЕРЗ в концентрації від 3,125 до 100 мкг/мл, з наступною інкубацією протягом однієї години. Потім аліквоти пальмітинової кислоти (200 мкМ) додавали у відповідні ямки та планшети інкубували протягом додаткових 24 годин, потім вимірювали кількість ФНП-альфа в кожній ямці. В таблиці З перераховані різні групи впливу та контрольні групи. Зниження продукції ФНІП-альфа в групах впливу розраховували відносно клітин, оброблених ЛПС і ПК.

Результати

Фігура 3 і таблиця З нижче показують, що 2ЕРЗ суттєво знижує експресію ФНП-альфа клітинами макрофагів, обробленими ЛПС і пальмітиновою кислотою. Найбільш ефективна концентрація 2ЕРЗ в експериментальних умовах становила 3,125 мкг/мл (82,9 95 зниження експресії ФНП-альфа; р «0,0001). 2ЕРЗ ЕО5БО становить 51,94 мкг/мл.

Таблиця З

Вплив концентрацій 2ЕРЗ на експресію ФНП-альфа макрофагами, обробленими ЛПС і пальмітиновою кислотою 7ЕРЗ | лпс і ФНП

Вплив Маркування пальмітинова альфа о зниження (мкг/мл) | (нг/мл) кислота (мкМ) (пг/мл) ФНП альфа (Контрольклітин |Контрольу//-// | - | - | - /711022| -

Контроль ЛПС і Контроль - пальмітинова ЛПС я ПК 100 200 24511 кислота

Контроль ях зоттольлло ро | 16)

Контроль пальмітинова Контроль ї- ПК 200 11,21 кислота 2ЕРЗ Контроль |С2100. | 100 | - | - (1044 | :

Контроль за середовищем С-нзо 10,46 (ізопропанол)

ПРИКЛАД 4 - Вплив 2ЕР4 на експресію ІЛ-Ібета клітинами макрофагів, активованих нігерицином

Матеріали та методи

Експресія ІЛ-1бета макрофагами, активованими нігерицином.

Клітини макрофагів, що походять від мишей С57ВІ /б, культивували при щільності 200000 клітин/мл в 24-ямковому планшеті (ямки 500 мкл) й інкубували при 37"С і 5 У5 СО» протягом ночі.

Після інкубації протягом ночі середовище заміняли свіжим середовищем, що містить 100 нг/мл

ЛПС. Три години потому середовище, що містить ЛІС, заміняли в ямках для впливу свіжим середовищем, що містить 50 мкг/мл 2ЕР4. Після 1-годинної інкубації аліквоти нігерицину (20

ММ) додавали в ямки, оброблені 2ЕРА, і контрольні ямки ЛПС.

Планшети інкубували протягом додаткових 24 годин і вимірювали кількість ІЛ-1бета в кожній ямці. В таблиці 4 перераховані різні контрольні групи та групи впливу. Зниження продукції ФНП- альфа у групі впливу розраховували відносно клітин, оброблених ЛПС і нігерицином (ЛПС - Н).

Результати

На малюнку 4 і в таблиці 4 нижче показано, що 2ЕР4 в концентрації 50 мкг/мл знижує вивільнення ІЛ-Ібета макрофагами, активованими нігерицином, на 53,8 95 (777 р «0,0001).

Таблиця 4

Вплив 2ЕРА на вивільнення ІЛ-1бета макрофагами, активованими нігерицином (мкг/мл) (нг/мл) (ММ) (мкг/мл) ІЛ-1бета

Контроль 0 Контролб/-/| /- ЇЇ 7 - 7-1 7-1 птетєт є ||| 520 нігерицин

ПРИКЛАД 5 - Вплив 2ЕРЗ на життєздатність клітин макрофагів, індукованих запаленням

Матеріали та методи

Пептид 2ЕРЗ (5ЕО ІО МО: 1) був синтезований, як описано у патенті США Мо 7220725.

Вплив 2ЕРЗ на життєздатність макрофагів, активованих ЛПС і пальмітиновою кислотою

Макрофаги, що походять від мишей С57ВІ /6, культивували при щільності 200000 клітин/мл в 24-ямковому планшеті (ямка 500 мкл) й інкубували при 37"С і 5 95 СО» протягом ночі. Після інкубації протягом ночі середовище заміняли свіжим середовищем, що містить 100 нг/мл ЛПС, з наступною тригодинною інкубацією. Потім середовище, що містить ЛПС, у групах впливу заміняли свіжим середовищем, що містить 2ЕРЗ в концентрації 50 мкг/мл, з наступною годинною інкубацією. Потім у відповідні ямки додавали пальмітинову кислоту (100, 200 або 400

МКМ). Планшети інкубували протягом додаткових 24 годин, і життєздатність клітин оцінювали з використанням набору для аналізу цитотоксичності з ЛДГ. В таблиці 5 перераховані різні групи впливу та контрольні групи.

Результати

Малюнок 5 і таблиця 5 нижче показують, що 2ЕРЗ не виявляв значного впливу на життєздатність індукованих запаленням клітин макрофагів в експериментальних умовах.

Таблиця 5

Вплив 2ЕРЗ на життєздатність клітин макрофагів Вб, активованих ЛПС і пальмітиновою кислотою вне зжтеюю тем | си УКХ

Вплив «ЕРЗ (мкг/мл) | ЛПС (нг/мл) кислота ОоЩ : значимість (МКМ) о сбіРАОЮЄ | 7-77 17777700 | 400 | 661 | 777- о біР2О0 | 7-77 177777100 | 200 | 7601 1777-22

І сСіРЛООЇ | 7-7 700 | лою | 195895 | -

Таблиця 5

Вплив 2ЕРЗ на життєздатність клітин макрофагів Вб, активованих ЛПС і пальмітиновою кислотою вин джено тем | си ЗОМ

Вплив «ЕРЗ (мкг/мл) | ЛПС (нг/мл) кислота ОоЩ : значимість (МКМ)

ПРИКЛАД 6 - Вплив попередньої обробки 2ЕРЗ на експресію ФНП-альфа індукованими запаленням клітинами макрофагів

Матеріали та методи

Макрофаги, що походять від мишей С57ВІ /б, культивували при щільності 200000 клітин/мл в 24-ямковому планшеті (ямки 500 мкл) та поміщали при 37"С, 5 95 СО» в інкубатор на ніч.

Після інкубації протягом ночі середовище заміняли свіжим середовищем, що містить 50 мкг/мл 2ЕРЗ. Після 1-годинної інкубації у відповідні ямки додавали 100 нг/мл ЛПС, планшети інкубували протягом додаткових 24 годин, потім вимірювали кількість ФНП-альфа в кожній ямці.

Результати

В таблиці 6 нижче показано, що попередня обробка клітин макрофагів ЕРЗ перед індукцією

ЛПС призводила до 46,7 95 зниження ФНП-альфа, продукованого клітинами ("7 р«0,05).

Таблиця 6

Вплив попередньої обробки 2ЕРЗ на експресію ФНІП-альфа макрофагами, обробленими ЛІС

Контроль ЇЇ 11111111 11111101

КонтрольЛПСГ | 77717 -77171717117171711111100 | 71896884 | Жщ

ПРИКЛАД 7 - Протизапальна дія 2ЕРЗ на моделі хвороби сухого ока на культурі клітин епітелію роговиці

Протизапальний ефект пептидів при експериментальному запаленні роговиці був протестований на моделі клітинної культури з використанням різних індукторів інфламасом, таких як ЛПС, 4-НМЕ, нігерицин й інші, для моделювання хвороби сухого ока (ХСО).

Використовуючи модель "доза-відгук", первинні епітеліальні клітини роговиці людини попередньо обробляли пептидами з наступним впливом індукторів ССО. Вимірювали експресію

ІЛ-6, а також життєздатність клітин і продукцію АФК.

Матеріали та методи

Первинні епітеліальні клітини роговиці людини (РС5-700-010; ЕКРЛ) обробляли 7ЕРЗ в концентраціях від З до 12 мкг/мл протягом 2 годин, потім піддавали впливу ЛІС, 4-НМЕ або нігерицину протягом 24 годин. Після інкубації вимірювали рівні прозапального цитокіну ІЛ-б6, життєздатність клітин і продукцію активних форм кисню (АФК) у культурах клітин.

Зо Результати

Як показано на Малюнку 7, рівень ІЛ-6 у клітинній культурі знизився з 52,45 ж 0,9121 пг/мл у необробленій культурі клітин до 38,08 хз 1,368 пг/мл у клітинах, оброблених 7ЕРЗ (зниження на 27,4 90; Р «0,05).

Як показано на фіг. 8, рівень АФК у культурі клітин (виражений у відносних одиницях флуоресценції; ВОФ) знизився з 27043 ж 952 ВОФ у необробленій культурі клітин до 13000 ж 800 ВОФ у культурі клітин, оброблених 2ЕРЗ (зниження на 51,9 95; Р «0,0001).

Як показано на Фігурі б, щільність загибелі клітин знизилася з 21,125 - 0,942 95 у необробленій культурі клітин до 3,625 ж 1,092 95 у культурі, обробленій 2ЕРЗ (зниження 82,8

Чо; Р «0,0001).

Зроблений висновок про те, що пептид 2ЕРЗ ефективний у зменшенні запалення роговиці, відновленні життєздатності ЕКРЛ ії зниженні продукції АФК, факторів, що мають значення для тяжкості ХСО. Результати забезпечують основу для використання цього та подібних пептидів для профілактики та лікування ХСО, викликаної різними патологіями.

Приклади 1-7, наведені вище, показують, що пептиди 2ЕРЗ (ЗЕО ІО МО: 1 ) і 7 ЕРА (ЗЕО ІЮ

МО: 2) знижують експресію запальних цитокінів ФНІП-альфа, Іл-1-бета й ІЛ-6 у макрофагах, індукованих запаленням, й епітеліальних клітинах роговиці. Крім того, пептиди були здатні відновлювати життєздатність клітин, які були піддані запальному стресу.

Результати показують, що пептиди згідно з даним винаходом здатні ефективно інгібувати або запобігати запаленню в макрофагах й епітеліальних клітинах роговиці.

ПРИКЛАД 8 - Ефект 2ЕРЗ, натрієвої солі 2ЕРЗ і 2ЕРА на індукований ендотоксином увеїт (ІЕУ) у пацюків

Модель виконана відповідно до Юе Моз еї аІ., Ехр Еуе Кез 61: 667-675, 1995. ІЕУ індукували у самців пацюків І ем/і5 масою від 180 до 200 г шляхом ін'єкції у подушечки лабет 200 мкг ЛПС, розведеного в 0,1 мл стерильної води. Потім тварин випадковим чином розподіляли в (4 пептиди) х (три концентрації) - дванадцять груп. Необроблену індуковану групу використовували в якості контролю індукції.

Через 24 години, що відповідає піку тяжкості ІЕУ, тварин досліджували за допомогою біомікроскопу з щілинною лампою. Клінічне запалення ока оцінювали в кожному оці за шкалою від 0 до 7 у такий спосіб: гіперемія райдужки та клітини у передній камері 0-2, (0 - немає ознак; 1 - легкі; 2 «5 важкі) і запалення, міоз і гіпопіон одержували 0 балів за відсутність ознаки або 1 за присутність. Максимально можливий бал - 7 (сума балів за 5 параметрами).

ПРИКЛАД 9 - Вплив 2ЕРЗ, натрієвої солі 2ЕРЗ і 2ЕРА в моделі на мишах сухого ока в камері з контрольованим середовищем (ККС)

Модельна процедура описана у Вагарбіпо еї аї. 1ОМ5 46: 2766 - 2771, 2005). Коротко, мишей

ВАГ В/с у віці 8-12 тижнів використовували в камері з контрольованим середовищем (ККС), у якому регулювали та контролювали відносну вологість (КН), температуру (Т) та повітряний потік (АР). Мишей випадковим чином розподіляли на групи та впливали 2ЕРЗ, натрієвою сіллю 2 ЕР і 7 ЕРА ( тестовані пептиди). Необроблену індуковану групу використовували в якості контролю.

Потім мишей поміщали в ККС і піддавали впливу певних контрольованих умов навколишнього середовища (НН - 18,5 905 ж 5,195, АЕ - 15 л/хв, Т - 2 1-237"С) протягом 3, 7, 14 і 28 днів.

Зо Контрольних мишей утримували в нормальних умовах (відносна вологість - 50-80 95, без А Е, Т - 2.1-237С) протягом того самого часу.

Спостерігач у масці вимірював утворення водянистої сльози за допомогою тесту бавовняної нитки, фарбування роговиці флуоресцеїном (оцінка від 0 до 15), і щільність бокалоподібних клітин у верхній та нижній кон'юнктиві.

ПРИКЛАД 10 - Вплив 2ЕРЗ, натрієвої солі 2ЕРЗ їі 2ЕРА в індукованій скополаміном моделі сухого ока у пацюків

Використовували самців пацюків Зргадое-Оамеу масою від З00 г до 350 г. Сухість очей індукували за допомогою скополаміну (Зідта-Аїагіси, 52. Гоці5, МО), який безупинно та системно вводили тваринам за допомогою осмотичного насоса (2МІ4 АїЇ?7еї б; Седагі апе,

Берлінгтон, Онтаріо), заповненого скополаміном й імплантованого підшкірно в середню дорсальну область між лопатками. Рану закривали 2-3 затисками. Після операції та знову наступного дня тваринам підшкірно вводили карпрофен (0,5 мг/100 г), нестероїдний протизапальний засіб і сильнодіючий анальгетик тривалої дії для гризунів. Тварин анестезували перед імплантацією хірургічного насоса та перед усіма кінцевими випробуваннями в камері з ізофлураном 99,9 95 ОБР (Абгахів Віозсіепсе, Річмонд-Хілл, Онтаріо). Скополамін вводили в дозі 12,5 мг/день, і дані оцінювали на 14-й день.

Стерильний розчин 0,175 г/мл гідроброміду скополаміну (Зідта-Аїагіспй, Сент-Луїс, Міссурі) готували у фізіологічному розчині (0,9 95) і фільтрували через фільтр на кінці шприця 0,22 мкм (МіШех-осС, МійПроге Согр., Вега, Мас.). Насоси 2МІ 4 АІге(КтТМ. заповнювали 2 мл розчину скополаміну 0,175 г/мл відповідно до інструкцій виробника.

Випробовували наступні групи очей пацюків: Група 1: контрольні пацюки (п - 12 очей від 6 пацюків). Група 2: у пацюків (п - 12 очей від 6 пацюків) індукували синдром сухого ока постійним системним введенням скополаміну, та вимірювання фарбування флуоресцеїном проводили на чотирнадцятий день. Група 3: у пацюків (п - 14 очей від 7 пацюків) індукували синдром сухого ока постійним системним введенням скополаміну та впливали один раз місцево на восьмий день фізіологічним розчином. Група 4: у пацюків (п - 14 очей від 7 пацюків) індукували синдром сухого ока постійним системним введенням скополаміну та впливали один раз місцево на восьмий день тестованим пептидом.

Результатами є: (ї зниження фарбування роговиці флуоресцеїном, виміряне на бо тринадцятий день, у порівнянні з контролем, обробленим фізіологічним розчином; (ії) утворення водянистої сльози й оборот водянистої сльози, виміряні на тринадцятий день у порівнянні з необробленими або обробленими скополаміном контролями.

ПРИКЛАД 11 - Ефект 2ЕРЗ, натрієвої солі 2ЕРЗ і 2ЕРА4 на моделі сухого кератокон'юнктивіту на кроликах

Сухий кератокон'юнктивіт (СКК) індукували у правих очах 8 новозеландських білих кроликів шляхом хірургічного закриття вивідної протоки сльозної залози та видалення мигальної перетинки, ніктитальної залози та залози Хардера. Всіх кроликів залишали без лікування протягом 8 тижнів, і СКК підтверджували шляхом вимірювання підвищеної осмолярності слізної плівки шляхом взяття 0,1-0,4 мкл зразків сльози, як описано .). сіїБрага, еї аїІ. (ОрпїпаїЇтої. 96: 677, 1978). 3,0 ммоль розчин ШШТР або аналога готовили в консервованому ізотонічному буферному розчині. Кроликів випадковим чином розподіляли за групами й обробляли 2ЕРЗ, натрієвою сіллю 7 ЕР і 2 ЕРА ( тестовані пептиди).

Необроблену групу використовували в якості контролю. Після початку лікування у всіх кроликів брали зразки сльози 0,1-0,4 мкл для вимірювання осмолярності перед першою дозою.

Через 20 тижнів тварин умертвляли та вимірювали щільність бокалоподібних клітин шляхом фарбування альціановим синім і реагентом Шиффа-періодною кислотою (0. Баг, еї аї., Ехр.

Еує Нез. 67: 27, 1996).

ПРИКЛАД 12 - Вплив 2ЕРЗ і його натрієвої солі (ЕРЗМа) на продукцію цитокінів у моделі запалення іп міго в лодських МКПК

Ефект пептиду 24 ЕРЗ ( 5ЕБЕО ІЮО МО: 1 ) на продукцію цитокінів оцінювали на моделі запалення людини іп мійго. Мононуклеарні клітини периферичної крові людину (МКПК) стимулювали з використанням ліпополісахариду (ЛПС) для продукування цитокінів.

Метод: Коротко, кріоконсервовані МКОПК людини від чотирьох здорових донорів, що не курять, які не приймали які-небудь кортикостероїди або інші протизапальні препарати, вирощували в ЕРМІ 1640 з 10 95 інактивованою нагріванням фетальною бичачою сироваткою (ФБС), 100 од/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину (повне живильне середовище СОМ).

Людські МКК розморожували та висіювали на чашки для всіх груп (1-6, таблиця 7) і залишали у спокої протягом 1 години перед обробкою. Групи клітин обробляли досліджуваним пептидом, 2 ЕРЗ ( 5ЕО ІЮО МО: 1 ), в концентрації 40, 100 ї 150 мкг/мл, або дексаметазоном

Зо протягом 1 години, з наступною стимуляцією ЛПС протягом 24 годин. За чотири години до збору супернатанта додавали АїЇтаг Вісе. Через 24 години після додавання ЛПС вимірювали флуоресценцію АїЇтаг Війе при 585 нм (що корелює з життєздатністю клітин), і збирали супернатант для визначення цитокінів. Кожну групу тестували у трьох повтореннях.

Таблиця 7

Експериментальні групи, використані в дослідженні 6 | лпс | 2 ЕРЗ(5Омкумлу | 0 ТІчаспопередньоїобробки./

Докладний метод: клітини розморожували відповідно до інструкцій виробника, промивали в

СОМ й оцінювали на життєздатність за допомогою фарбування трипановим синім. Матковий розчин 2х105 клітин/мл готували в СОМ. 100 мкл вихідного розчину додавали у відповідні ямки 9б-ямкового планшета з чорними стінками (один планшет на донора), висів 2х105 клітин на ямку. Клітини інкубували при 37"С із 595 СО» протягом однієї години. У відповідні ямки додавали 100 с 2Х досліджуваного зразка, дексаметазону або 1Х СОМ у відповідні гнізда до кінцевого обсягу 200 мкл/гніздо. Планшети інкубували ще 1 годину при 37"С із 5 95 СО». Через 1 годину 20 мкл ЛПС додавали в групи 2-9 до кінцевого об'єму 220 мкл. 20 мкл середовища додавали в групу 1. Клітини інкубували при 37"С із 5 95 СО» протягом 20 годин. На 20-годинній позначці в усі гнізда додавали 20 мкл АІатаг Вісе. Планшети інкубували при 37"С із 5 965 СбО» ще 4 години. Через 24 години після стимуляції ЛПС планшети зчитували для оцінки життєздатності клітин, збирали супернатанти клітинних культур і зберігали при -807С для аналізу цитокінів.

Клітини, що залишилися, промивали 1 раз стерильним ФБР. Клітини інкубували в розчині трипсину для відділення від планшета, центрифугували, одержуючи осад, і розчин трипсину видаляли. Потім клітини зберігали при -807"С для необов'язкового подальшого аналізу. Аналіз

Гитіпех використовували для визначення концентрацій 5МО5Е, ІФН-9, ІЛ-10, ІЛ-12р40, ІЛ-17а,

ІЛ-18, ІЛ-4, ІЛ-6, К АМТЕ5 їі ФНП-альфа, присутніх у зразках супернатанта, зібраних після аналізу АіІатаг Вісе. При проведенні аналізу цитокінів дотримувалися протоколів виробника.

Розраховували продукцію цитокінів і відсоток стимуляції зразка у порівнянні із середнім значенням контролю стимуляції.

Результати: Як показано на малюнках 9-12, 2ЕРЗ, як було показано, викликає значне зниження основних медіаторів запалення, включаючи інтерферон гамма (ІФНУ, ФІГУРА 9), ІЛ-10 (Фігура 10), ІЛ-18 (Фіг. 11) ії КАМТЕ5З (Фіг. 12), що підтверджує його протизапальну дію. У відношенні деяких виміряних цитокінів спостерігали дозозалежний відгук. Ніяких значних змін у життєздатності клітин або яких-небудь тенденцій в яких-небудь донорів не спостерігалося після обробки пептидами у всіх випробуваних концентраціях, що вказує на те, що пептиди не цитотоксичні для МКПК. Рівні ІЛ-4 й ІЛ-17а були нижче межі виявлення у всіх тестованих групах.

Зниження вироблення цитокінів було прямо пов'язане з 7ЕРЗ, підтверджуючи протизапальний ефект 2ЕРЗ у клітинах крові людини.

ПРИКЛАД 13 - Модель атопічного дерматиту іп мімо

Ефект місцевого застосування 2ЕРЗ (ЗЕО ІО МО: 1) і його натрієвої солі (ЛЕРЗМа) та ЕРА (

ЗЕО ІО МО: 2) оцінювали на мишах з індукованим оксазолоном атопічним дерматитом (АД). Ця модель широко використовується та добре описана в літературі (Амсі еї аіІ., 2013 Ехрегі Оріп

Огид Різсом. 8, 331-355; Реїегзеп Т. К. 2006, Вабвіс Сііп. Рпаптасої. Тохісої. 99, 104-115) в якості прийнятої моделі на тваринах для оцінки ліків для терапії АД у людей.

Метод. Сенсибілізацію тварин проводили шляхом місцевого нанесення 2 95 оксазолону в етанолі на спину в день 0 після гоління та депіляції тварин (фаза сенсибілізації).

Потім через тиждень виконували контрольну пробу шляхом місцевого нанесення 1 95 оксазолону в етанолі на спину та праве вухо кожні 2 дня в 10 приймань, а саме протягом усього

З тижнів. Тестовані сполуки застосовували під час фази контрольного впливу кожні 2 дня місцевим шляхом як готові до використання склади кремів. Поверхня нанесення така сама, як і для контрольного впливу (спина т вухо). На спину наносили 100 мкл й обережно масажували

Зо спину. Потім склад, що залишився на рукавичці для пальця наносили на внутрішню поверхню вуха. Через день вимірювали товщину шкіри спини та вух штангенциркулем; і реєстрували для шкіри спини наступні клінічні оцінки: еритема та лущення. Тварин також зважували через день (приблизна вага миші на початку випробування становить близько 20 г). Калібровані цифрові знімки шкірних зон спини були зроблені на 8, 18 і 28 дні. На 28 день експеримент був припинений, у тварин брали проби крові та відокремлювали зразки плазми. В умертвлених тварин зразки шкіри правого вуха та спини збирали та заморожували при -807С (зразки шкіри спини та плазми) або зберігали у формаліні (зразки шкіри спини та правого вуха) для подальшого аналізу. В таблиці 8 описані групи впливу.

Таблиця 8

Експериментальні групи, протестовані в моделі АД (мг/кг) о ЛКонтрольнагрупа | 8 / Наповнювач.ї |: 0777/7011

Бетаметазон 2/Референтна група (ДипрозонФ 0,5 2,5 0,05 95 о З/естовагрула!ї | 8 | БЕРУ 96 1777710 | 50с1С о 4Лестовагрула2 | 8 | ЕРЗМАТ 96 77710 77711501 5/естовагрулаЗ | 8 | ЕРА 96 | 10 | 7775071 " В об'ємі 100 мкл на кожну тварину.

Склади, використовувані для місцевого застосування тестованої сполуки, являли собою: 7ЕРЗ 1 95 крем, що має рН 7,1 й який включає: пропіленгліколь, полісорбат 80, динатрію едетат, діоксид кремнію (5уїЇоід), метилпарабен, білий вазелін, ізопропілміристат, цетиловий спирт і моностеарат гліцерину.

7ЕРЗМа 1 95 крем, що має рН 8,0 й який містить: пропіленгліколь, полісорбат 80, динатрію едетат, діоксид кремнію (5уїЇоід), метилпарабен, білий вазелін, ізопропілміристат, цетиловий спирт і моностеарат гліцерину.

ЕРА 1 95 крем, що має рН 4,5 й який містить: пропіленгліколь, гліцерин, полісорбат 80, динатрію ЕДТА, ксантанову камедь, діоксид кремнію (5уїЇоід), метилпарабен, білий вазелін, ізопропілміристат, цетиловий спирт, стеариловий спирт і гліцерилмоностеарат (КоїїЇїм'ах).

Результати. Тестовані сполуки 2ЕРЗ, 2ЕРЗМАа і 2ЕР4, що вводяться в дозі 50 мг/кг мишам з індукованим атопічним дерматитом, добре переносилися. Всі пептиди значно зменшували клінічні ураження атопічного дерматиту, товщину шкіри спини (Фігури 13А ї 13В), товщину вух (Фігури 14А і 148) й еритему (Фігури 15А ії 158). Оцінки зменшувалися з 18 до 24 днів у мишей, що одержували 2ЕРЗ (фігура 16А), і з 14 до 24 днів у мишей, що одержували 7ЕРЗМа (фігура 16А) або 2ЕРА (фігура 168), що вказує на відстрочений ефект.

Маса тіла мишей, що одержували 7ЕРЗ, 2ЕРЗМа або 2ЕРА4, була нормальною у порівнянні з наповнювачем (Фігури 17А і 178).

Докладніше, маса тіла для 2ЕРЗ, 2ЕРЗМАа і 7ЕРА4 була досить стабільною протягом перших днів дослідження та показала збільшення приблизно на 3-4 95 на 28 день (малюнки 17А і 178).

В групі, що одержувала бетаметазон, спостерігалася втрата ваги приблизно на 8-10 95, як і передбачалося.

Товщина шкіри спини збільшувалася протягом перших днів дослідження, за винятком мишей, що одержували бетаметазон, а потім залишалася досить стабільною до кінця дослідження (Фігури 13А їі 138). На 28 день було відзначене збільшення приблизно на 110 95 для групи негативного контролю, що одержувала наповнювач, 9095 для групи 3, що одержувала 1 95 7ЕРЗ, 105 95 для групи 4, що одержувала 1 95 2ЕРЗМа та близько 90 95 для групи 5, що одержувала 2ЕРА4 1 95, тоді як зниження на 40 95 було відзначено для групи 2 позитивного контролю, яким вводили бетаметазон. Всі оброблені групи (групи 3, 4 їі 5) графічно показали тенденцію до того, що товщина шкіри спини нижче, ніж в групи 1 негативного контролю. Значна різниця в товщині спини у порівнянні з контрольною групою 1 була відзначена для 2ЕРЗ на 20-й (-25,5 Фо) та 24-й дні (-16,6 95). Для 2ЕР4 значна різниця в товщині спини у порівнянні з контрольною групою 1 була відзначена на 14 день (-13,5 У).

Зо Товщина правого вуха: як зазвичай спостерігається з цією моделлю, всі групи показали значне стовщення з перших днів до кінця дослідження, за винятком групи позитивного контролю 2, яка показала лише невелике збільшення приблизно на 15-20 95 протягом усього курсу дослідження (Фігури 14А і 14В). Значна різниця була відзначена на 20, 22 і 28 дні для 7ЕРЗ (від - 10,1 до -18,0 95 у порівнянні з контролем), на 18, 20 і 22 дні для 2ЕРЗМАа (від -18,4 до -22,7 95 у порівнянні з контролем) і на 20, 22, 28 дні для 2ЕРА4 (від -12,3 до -16,0 95 у порівнянні з контролем).

Оцінка еритеми була максимальною на 16 день для групи негативного контролю (група 1), а потім трохи знизилася до 0 н а 2 6-28 дні. Показники еритеми, записані для дослідницьких груп 3, 4 і 5, були аналогічні групі негативного контролю 1 (Фігури 15А і 158). Значна різниця була показана на 22 і 24 дні для 2ЕРЗ, на 24 день для 7ЕРЗМЕа та на 12, 16, 22 і 24 дні для 7ЕРА4.

Оцінка за шкалою прогресивно збільшувалася протягом перших днів, потім трохи знижувалася та залишалася досить стабільною в другій частині дослідження (Малюнки 16А і 168). Всі оброблені групи 3, 4 і 5 показали більше низький бал за шкалою, ніж група негативного контролю 1, з 14 по 28 день.

Загальний бал (сума балів еритеми та шкали) також був нижче для оброблених груп 3, 4 і 5, ніж в групи негативного контролю 1 з 1 4 по 2 8 день. Значна різниця в загальній кількості балів була показана на 20, 24 і 28 дні для 2ЕРЗ, на 14, 18, 20 і 22 дні для 2ЕРЗМАа та на 12-20, 24 і 28 дні для ЕРА.

Висновок: Сполуки 2ЕРЗ і 2ЕРА й їх натрієві солі, що вводяться мишам з індукованим атопічним дерматитом, в дозі 50 мг/кг, добре переносилися та значно зменшували клінічні ураження при атопічному дерматиті, про що свідчить зменшення товщини шкіри спини, товщини вух, еритеми та лущення.

ПРИКЛАД 14. Лікування зап'ястно-п'ясткового остеоартриту (артриту СМС) за допомогою «ЕРЗ

Пацієнту-чоловіку у віці 75 років хірург-ортопед діагностував артрит великого пальця стопи типу СМС. Палець на нозі був опухлим, червоним і настільки хворобливим, що пацієнт не міг ходити.

Натрієву сіль 7ЕРЗ у вигляді крему 0,5 95 наносили на опухлі ділянки 5 разів на день.

Суб'єкт повідомив про полегшення протягом одного дня після лікування та зникнення стану 60 протягом 3-4 днів.

ПРИКЛАД 15. Вплив пептидів 2ЕРЗ і 2ЕРЗМа на секрецію ФНІП-альфа в кератиноцитах людини

ФНІП-альфа є основним прозапальним медіатором у кератиноцитах. Сполуки були протестовані на протизапальну дію шляхом вимірювання їх впливу на рівні ФНП-альфа.

Методи: клітини 5ССЕ020 (Епідермальні кератиноцити людини ЕріскО М) вирощували у повному ростовому середовищі (повне середовище для кератиноцитів людини ЕріскоО м:

МіПіроге Саї. Ж 5СМКОО1) протягом 4 пересіювань. При 5 пересіюванні клітини висіювали (3х105 клітин/'ямку) у трьох повтореннях в обсязі 1 мл повного ростового середовища на ямку.

Додаткові З контрольні ямки містили тільки середовище без клітин.

Після прикріплення клітинне середовище заміняли базовим середовищем, що містить І - глутамін без добавок (середовище голодування), і клітини голодували протягом ночі.

Наступного дня, через 24 години після посіву, клітини обробляли 2ЕРЗ або 2ЕРЗМа або підходящим розріджувачем (ФБР або ДМСО). Після 4 годин інкубації додавали в ямки ЛПС (з Е.

Соїї 055: В5; бідта Саї. Ж І 6529-1М) у кінцевій концентрації 20 або 30 мкг/мл.

Експериментальні групи (по три ямки для кожного впливу) наведені в таблиці 9.

Клітини інкубували протягом 24 годин в інкубаторі для тканинних культур. Після збору супернатантів із усіх ямок, клітини з груп впливу: 1, 2, 3, 8, 9, 10, 13, 14 (без ДМСО груп), осаджували та зберігали при -80"С для подальших аналізів. Клітини збирали у такий спосіб: після збору супернатантів ямки промивали трипсином, потім інкубували з трипсином до тих пір, поки вони не відділялися від поверхні планшета, центрифугували, промивали ФБР і зберігали у вигляді осаду клітин. Концентрацію ФНІП-альфа у супернатантах вимірювали за допомогою

ЕСІЗА (ОмчапікКіпе НЗ ЕГІБА; КО Зузіетв5 Саї. Ж Н5ТАОО00) у 5-ти повтореннях.

Результати: 2ЕРЗ і 2ЕР4 ефективно знижували рівні ФНІП альфа у культурі клітин кератиноцитів людини. Концентрацію ФНІП-альфа в зразках розраховували відповідно до рівняння лінії тренда стандартної кривої ОО - 0,063х ж 0,1718. Відсоток інгібування продукції

ФНІ-альфа розраховували в кожній експериментальній групі у порівнянні з відповідною контрольною групою (ті самі умови, без пептиду). Результати представлені в таблиці 9.

Таблиця 9

Умови експерименту, результати й аналіз онпП . Чо група ї- я | ДМСО Пептид ЛПС (мкг альфа Станд. Кратність Інгібуван (-крите рій""| критерію (мг/мл) мл) (пг/мл) відх. Зміна ня 2 18Ї - 1-1 - 10101 1-1 2 - 1 - 1 - | 28 | 03 10 | - ! 1 3 - 1 - 1 20 | 124 | 06 | 44 | - |7ахлюв 2 4 Ц|олоді - | 20 | 88 | 07 | зи | - |ї7хто з 6100595 2ЕРЗО2 | 20 | 60 | 04 | 21 | З2 |7иіхо 4 7 (0025956 2ЕРЗООг 20 | 96 | 05 | 34 | - | - | - 8 | - йЕРЗ3МАа0Я 20 | 59 | 05 | 21 | 52 |8вбхтов з 9 | - йЕРЗ3Мабга 20 | 67 | 0 | 24 | 46 |ї5х105| з ро ли 2 | | волає з

М іолоді /- 1 30 | 215 | 22 | 76 | - | 075 | з 13! - 1 - 1 30 | 210 | 78 | 75 | - |лї4хто 2 (14| - фЕРЗ3Мабге 30 | їз | 08 | 47 | з8 |ї5хто| 1з 8. Немає клітин х Кратна зміна кожного зразка відноситься до концентрації ФНП-альфа у зразку Мо 2. хх І-критерій розраховували з використанням функції Місгозоїй ЕХСЕЇГ!. для кожного зразка (група 1) у порівнянні з контролем цього зразка (група 2). Параметри, використовувані для 1- критерію: двосторонній розподіл, непарний г-критерій, нерівномірна дисперсія. Той самий контрольний еталонний зразок використовували для розрахунків відсотка інгібування секреції

ФНП-альфа.

Висновки: Кількісний тест за допомогою ЕГІЗА продемонстрував дозозалежне інгібування продукування ФНІП-альфа у кератиноцитах людини, оброблених ЛПС, під дією 2ЕРЗ або 2ЕРЗМа, у порівнянні з кількістю, що секретується клітинами, стимульованими тільки за допомогою ЛПС.

Хоча винахід був описаний у зв'язку з його конкретними варіантами реалізації, очевидно, що багато альтернатив, модифікації та варіації будуть очевидні для фахівців у даній області техніки. Відповідно, передбачається, що винахід охоплює всі такі альтернативи, модифікації та варіації, які перебувають в межах сутності та широкого обсягу прикладеної формули винаходу.

Всі публікації, патенти та заявки на патенти, згадані в даному описі, повністю включені в даний опис за допомогою посилання тією самою мірою, як якби кожна окрема публікація, патент або заявка на патент були спеціально й індивідуально зазначені для включення в даний опис за допомогою посилання. Крім того, цитування або ідентифікація будь-якого посилання в цій заявці не повинно тлумачитися як визнання того, що таке посилання доступне як відомий рівень техніки для даного винаходу. В тому ступені, в якому використовуються заголовки розділів, їх не слід розглядати як обов'язкові обмеження «ЗРО: 52.5 Бірайех Завстанісо бсмивле 12. «аж БІЖООВВСУ «ЗКе БЮ МКУ «ВР 3518-33-35 кове: З «ММК Бадзжеття, версія 5.5 а ії «31 Ж «ТІЇ» БІЧОХ «-ЖЗЯх НІвучнЕ послдуметьств «КУ Зживозиликй плести «Ех «а: МОЄ КНУ «3: (В «Ще» МОБ КЕ «МЕЖ» (В «ЖЕЯх Сб жкіт, прЕедидний до опожеслн-яметх бічиого дзяшжкех лаешяк х кож Її бік Тер їде «РІД З «в Я «КУ «ее Сп рчнй пет вид, код «Ж3іх ВИМ) ЖЕК «ЖЕ» 23.4 «ЕЕ: порагтувзаносва кислу та ре «сн: З

Сів аль Тер т

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Застосування фармацевтичної композиції, яка містить як активний інгредієнт пептид, вибраний з групи, що складається з роіш-Авп-Ттр-І ух(октаноїл)-ОН (ЗЕО ІЮ МО: 1), раіш-Авп- Ттр-Тпі-ОН (5ЕБО ІЮО МО: 2), а також їх фармацевтично прийнятних солей, для лікування запального захворювання або розладу, вибраного з групи, що складається з запального захворювання або розладу очей, запального захворювання або розладу вуха, запального захворювання або розладу легені, запального захворювання або розладу кишечника та запального аутоїмунного захворювання або розладу.

2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що пептид має амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 1.

3. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що пептид являє собою натрієву сіль пептиду, що має послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 1.

4. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що пептид має амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 2.

5. Застосування за п.1, яке відрізняється тим, що пептид є натрієвою сіллю пептиду, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 2.

6. Застосування за будь-яким із пп. 1-5, яке відрізняється тим, що фармацевтична композиція має рН в діапазоні приблизно від 4 до приблизно 8.

7. Застосування за будь-яким із пп. 1-5, яке відрізняється тим, що фармацевтична композиція розроблена для способу введення, вибраного з групи, що складається з місцевого введення, офтальмологічного введення, перорального введення, назального введення "та парентерального введення.

8. Застосування за будь-яким із пп. 1-5, яке відрізняється тим, що фармацевтична композиція розроблена для місцевого застосування у вигляді крему, мазі, пасти, лосьйону, гелю або у формі очних крапель.

9. Застосування за будь-яким із пп. 1-5, яке відрізняється тим, що фармацевтична композиція розроблена для введення суб'єкту, який має захворювання або травму ока, у вигляді рідкого розчину або суспензії для використання у вигляді очних крапель, емульсії, крему, мазі, спрею, Зо гелю або інтравітреальної ін'єкції.

10. Застосування за п. 9, яке відрізняється тим, що фармацевтична композиція виготовлена у вигляді крему, що містить 0,1-5 95 мас./масє. зазначеного пептиду або фармацевтично прийнятної солі.

11. Застосування за будь-яким із пп. 1-10 для введення суб'єкту, який має запальне захворювання або розлад легень, причому зазначене запальне захворювання або розлад легень вибирають з групи, що складається з астми, бронхіту, плевриту, альвеоліту, васкуліту, пневмонії, хронічного бронхіту, бронхоектатичної хвороби, дифузного панбронхіоліту, гіперчутливого пневмоніту, ідіопатичного легеневого фіброзу та муковісцидозу.

12. Застосування за будь-яким із пп. 1-10 для введення суб'єкту, який має захворювання або пошкодження ока, яке є запальним захворюванням або розладом, вибраним з групи, що складається з увеїту, синдрому сухого ока, запальних симптомів, пов'язаних з інфекційним захворюванням очей, алергічного захворювання очей, кератиту, кон'юнктивіту, дисфункції мейбомієвої залози й очних симптомів, пов'язаних з синдромом Шегрена.

13. Застосування за будь-яким із пп. 1-10 для введення суб'єкту, який має запальне аутоїмунне захворювання або розлад, де зазначене аутоїмунне захворювання або розлад вибирають з групи, що складається з ревматоїдного артриту, остеоартриту, псоріатичного артриту, анкілозуючого спондиліту, ювенільного ідіопатичного артриту та вовчака.

14. Застосування за будь-яким із пп. 1-10 для введення суб'єкту, який має запальне захворювання кишечника, де зазначене запальне захворювання кишечника вибирають з групи, що складається з хвороби Крона та виразкового коліту.

15. Застосування за будь-яким із пп. 1-10 для введення суб'єкту, який має запальне захворювання або розлад вуха, де зазначене запальне захворювання або розлад вуха вибирають з групи, що складається із запальних симптомів, пов'язаних з інфекцією вуха, середнім отитом, зовнішнім отитом, мастоїдитом й отомастоїдитом.

16. Застосування за будь-яким із попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що лікування запального захворювання або розладу включає зменшення вивільнення або інгібування активності щонайменше одного запального цитокіну, вибраного з групи, що складається з: ТМЕ- альфа, 1 -1-бета й ІІ -6.

17. Виділена натрієва сіль пептиду, що має послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 1.

ЕЕ Й яке Ка яке жжжж ек шу ех Ж жи, «х ПО - Од дронесесотесесоттсесовесесеоесесоотегсотегесо вес весееово дети ре нн о слон, Тит й я В Я оооснстнсюютетттесттесесстеютто ТВ ретосстеотсесосттооссосгетосесестососюсесогосессест сет сооететосегогеассесосостогосесеогссесесосестсест сет стогосесотсвовестесссостестх З ЛЕ що а її Пп - ней ва жа сь ва; я К подолу... ВИК... Я. Сл, зді; дпплачаладилалатачалачаллацлилачатлавчиличилляатвлівавлюлялилпадилатацили оллланллидолалицллидаатиталицаантитатя Ж 290 ва ще т Зо х ве 5 ща я ш ке жо ри о ве х Я я З х 100 ще ст З З -- - ше а апплгаплппллюталать пе (КК палала А Щ я "І - а т су сі Геї їз г що і т в Г йо кі й. їй КІ й еї ті о Є й 4 р з й й, її мі С КУ Са 7 т т Щ Ж - с ГО я у 4 Умови

Фіг. 1 ТОД нт кам ох ОКУ хихе -к с поламав Е тенет Вт жо ЕЕ тт ВВ щоОО900 ІВУШБИТЕОЯ пишИАня Ф «38:30. ке ік ад Ж ас що вав т Ех оуванвя Я КК лює Го о о КО 1 є кі М КА Н ї п о с. ЇЗДІ яння ння нд рентний 00 рення шо 5 лаз аЗіяа І - о МА ї с С м в ЕХ і Ге ДОК Я БО КК з -- о ЗАД М Ве С Б ! і шо 0ОЖМК ня н иннн р КВЕ КТ рин га я З Я ГУ ХМ сову К ї ГУВ ща КО що Кока мех і 133 вЗБОВАВ У З м Зх що у 1 мам МО я ПК ОКХ КОХ нх КМ 1 1 Кк хх хе КЕ ож ї Каоктрапе СЕ сьРЯАФЮ СЕРаЮЄ СьЬРеОй СЕР ЮХ Сей СЕРНЮХ Умови кю пен Ед й о і па, з о о о р іо вро рр вив в нн ОВО сення ПЕ ТТ т тт я - ще х й й г 5 пт НН уд Ин ХЕ Ї о Бо с г ДН у С вищо що х щі . ОХ ще ще КО зву вогво В 5 зе 8 5 ах щи ЗЕ я тн Се щ- БО я БО я Ме а ол ВВВВВЕ ла ВО пла ВВ альо ВВ о ОВ ла ОВ оо ВВ ол ВО свв ЇЇ во о Ж У ж їв - Фе є В Ка - її че 4 мк Й у 8 Ж, концентрація «БР (мк млі ;

Фіг. З пон о нн нн нн у ОО ак о ЩО 200 сення тет ДТ

А п. Я 157. З 1498 шо 00 с с де п о С М ОБ Од | п Король ІРБжМ урн

Фіг. 4

ЯР 00 аллмналаалаа мальні ях Р св 1-55 н.з. Я КК плнллнняяя ДЕ и о ДА по и п али я ОК Ко ооо ооо хх хклллюьх РАДИКАЛ Я КАТА КАТА ТЯ АТ КАК АТАКА КАТЯ ТАТ в. 18095 1.01

1.85 -А---- 5 ВОЮ два нні з Кк о о о. я КОКО Х 405 8, су 1,5 КЕ МО не р укнючючккнкюнннкчкчнччнчння УВК що ях ек Я СЯ х - ТО 445 ШО нянні ння . сп пунктами й Ж Ваня шо Ехо В КО КО рт ОНА КО М З я хо з й С КА х З УКХ 1 Зв : Е ЗО ня КУ З КО : Е сяк 1 о | шк ще БЖ сення рн рин я о ВЕ хх . 5 і Ї і : 4 7 ОНКО Сх З ХХХ ' ї КУ пкт ВВ от ВВ от . нн т нання фея ЕВ Б: Б Б ; ; 408 В МОМ х ші М СОР Се СЬО Скай СЕРІЮ СК Умови

Фіг. 5 Мт ав ід ї жк фро--е ще сних вв жижа я МНЕ 20 мкм ке Е «алкнкканянмикаанимикиккижия зкжж Ж Ї звіня т ї Б й : щу Е ЩІ з 2-8 те о ща 7 ж ВВ рвана КО з ї ОН НІ ВО с . щЗ і с. Гоа ї БЕ ВУ ОХ її т Я ВН З їх З СПЕ СІ ХЕ ші ща . та ї Ба КК ОХ ( ц т ше З ОО Її Я сін 5 с «нка не. . 6 б 6 й й Я й КЗ У : В 5 к Е щ «о: к а З Во З х х х ях Х щ -ї ОО - ш й ЗШ Б Го ш р ш р я х Ех х Ех їх ее ро ву КУ ку ге В - У

Фіг. 6

ОП мепімИ З мкимп Ж Оз пи НК : - " . С б мкм се о щ С ТО мкм т ут зок ве ивненх ем ше и шщ ще Е нн хо

2. чини щ й п ! Ж "ШЕ і

5 в. і й Ех п ВАННЯ ско сн Марно повстань оо Допллтляи

Фіг. 7 че» жк жах зе В Пак ми б'єкомл ше с Що Бе | ща В. шсбоеє Ще зх сага о о І що ВКЛ ж 200004. а ва о з. с Ми ОО ща ще ке М 1 о ШЕ Ї ох я ЛЕ пе о. ЕВ інші 1 ше ; т І: ВВ ве 1 5 а ВХ . Ї ОО ЖОВ Р. з М ЕК У М. ІЗ 5 т щі. ш

1 . ш- З с. о : вв не У 3 1 о ЕНН Се ща | їі 5 1 5 . 1. А Б Ї о. ; : Мах о : КА КЗ і ЗО 5 Е

Кі. ш- шо | і Б І Еш і и її І ши. що ни й чи ше ша ши. хд т ж Ж Ку -- ї-ї - в- ш

Фіг. 8

«КЕ т - вжи Кі т га Кая

150. Донор ІФН-д 150. Донор 2 ФН-д я ще г а ж Ж як ш ле В БО по ї - БМ га МУ : 2 ТОМУ 7 с- ; Зк і ї ж Ж х ї щ : я КОХ і Фони х ! : і з ка КУМ зе не се о ко - 55 АК М тк МО ем да ях зе КО п Ж нов го З льна КОХ ВИН й ТО і М хх и КО во ох 5 а ВО ЕІ КО МОХ їж КО а Мн їх о КК Кк ВХ с і Ах КО с Кл і КК МОНЕ я; М у 5 М 3 В і І Ви - не І їх ви В Сх її З в МОХ ВН шк : Кан У МАК ШО р й Б вві ВО ВИН М о КОХ зовн и ОО х " т Є з моя і т 5 " І ен «хх Гея ш р - п - « щ т В З 5 х х к З В Ку 5 Е ВУ Ж 5 хх Ж Ж Ж Я се 7 Ж Ж КУ щ й й х ХЕ х Ж ж а Е х х Ку ра В су - се щ х р се ко - щ Е гв Ж КУ ще ОБОВ я ОВ З З хо с я-- - - е те й ж - г їх Ж Е х до т с т КУ г о я В щ Т ЖЕ ЗВУ ї ї я Б М й й я в я В В Ж роя ї 5 це ре - т ї - т Ге 5 ве х я Ееу ше я т Е СУ ноу ЗА т ЖЕ, кий «щі Гек зи : з Ї 59 Донор З РН а 50) Донор ВН хх Є - М Б Ж - лад кх -ш- Е ще З орга У жен й Б З Ку х у Е ом Ж Ж. ; - пе В : « вафва ж зх З в З - ВВ я З орав инннх СА в ваше ж те Ве з ОХ | о ше Ви но Сх А нн з : ра АОЕ о к КУ ау ВО 3 Е и ОО Я ем ща з ОА БО ра Рош і Не КОН М КЕ КЕ: ШЕ ж М її Е х У В З о Ь як ко уих РМЗ і АК ВООЯ Ж А Е у НЕ я Ка 5 ж У як - | ІЗ 5 я МЕ Оу Кк 1 о в А ВО КАК ау Сом Ох 7 Ом ДН щ Е ан КО МЕ сум ТМ чув В КА КК ДИКЕ пі дл Кр вовку гу м З В АХ Е Х Х вх о - ХЕ х х кО х т щи «3 с м Е ру р «З дх БОБ ОО 5 50 ЕВ 5 я їси ез вт -т ЩЕ х - я щ- - МОЖ р ХЕ її т ге ом В Е що т т х - : їй се ї ї З за 7 Ж Я щі о що З ЗІ щ - - х т 3 х Кк ж НУ х Ще

Фіг. 9 як Поне Тіп Я кт ; ; 1505 Донов' Ло НУ Донор 2 Л.О з БА : В тк ! Ф К Я БО -х Зап і - ж ал ш 1005 щх и в дО ре он що жа - ОК в З ТК Х Я ТЯ С - - З (Як как р Е ех Ж МК сере Ко кох Ме й і У Еш ОМ ї ; же -- З Їх Кк я Ек щ Ж БК ; о ве ї БОМ т я нн НО Е Ж ї ща Я а ке | Ї се у я ще щу | МО НК ха те З в: ї Яких оо КМ Р екз БОЖЕ -к поконк б З ек ОХ - а ОО МО ча і КЕ вк - МК Її ж М 5 ще КЕ м ОО : УМ ні ж Б З | Ї ке щі я В м МЕ я в ОХ Коен р ї х КЕ ик и БО т-т- ММ их А Я 5 ШК че ни МО М КОМ ака у о МОН Кі и у в Мч ВН ке шк т ок За щі а МНИХ З Ї ія і В а Кк я м «о, в и М МОХ щ ЕЙ , Ве Е і Ї і і КО й ОМ і НО о З и кі А КО ЄЕ С Кс А В я З ШОВ ща : Кия в МОЖ да сі М вою пі ОВ - з ЧЕ. -Ї м - - | 5 - г ж - е ВХ де Е я Ж вх в я х х е Б Е й Х Ех КЗ ке х 5 а - - хх м т і-й - - --оОщУ їх В Б - ш МОУ ре - - ОХ що Ж уж. дет. я-- мо ш щш мі як че СО й с т хв - різ У А Іои ї м - Ж Ж КЗ й 2 т їх а р й. іх БКЯ Кя а - г ні їх т ре щ ці 5 МЕ. щ- щ- В - 5 т Ук Гу Ах щ - і Кк ше ни в Е м Е к Б щ й ТЕ Порно З НИ ге тод ї ей ! ден З З В Ї З 7 же Донор й ІП. п ге З т З та В Ко ше БО ще ; В м хх К що пі до. мем З ялн | : Б КО Ех ТК «и т | іон хе та Е В п КЕ -Ж КОМ . пе З Гея Б Ох З сок Ж пох ся БУК дон АВ В і ОА шу у вежа КО їй | КЕ я я ІЗ З КК в і А Я ж ож Іі і а т- ; СХ я яд Ми и - 50. ПО ші и Я БЖ кя си КН Вс НИ поши НЕ Вік тв Ви Б Я Ву ва МСА ВОНО ча ж Кн р Щі НК М чи М в ОМ що КМ и М в ' ех КМ М. Ю Ге и А. хх и М КВ Є МО - А ох се ик Ь, СХ Я я КЕ М З Ж е я А Мох я ; і із | со ин і А У ре | СК и и я її ж пи с т ММ у М дк ЕЕ КО Я їв і Мн ща с Ну з З ПК Вк, Я М Коннов УОХММЗ і и -ї Я з КОнея М се Й МК коків ВА ВОК НН, Тк 5 сам ПАСМ АНЯ. - В п Не щ ш Б Ж зд Я « ш ж що М х Х к Кх 5 к ЩЕ КУ ш ХЕ по Е Кк 5 Б я тк д Ж й КЗ М ш ш ж Я Ж Ж х БУ ВЕ Х хх х ш хх що х я 5 в В Ек х З У ш ш Ж В о я - до 5 В в - - ще а щ - «У а жКЯ й с у сх т я В М Щ 5 Гй М З а в г. я. х ве Я - г -

Фіг. 10

50 Донор 1 ІЛ-1В 1505 Донор 2 П-ЛВ 9004 сін 9100 щі ОК в | с їз . . но 1 Ко 5000 5ККВщн В 5 й. шиш 52 ШИ М З 5 180 Донор З ІЛ. 1504 Донор 4 Ш-ТВ І дв ів. І кв. Ав ! . хх я же в . ХХ В і ва 0 1 й бі МОРЯКИ з 01 БИЙ

Фіг. 11

1504 ДПонов'ї ВАМТЕ5 450. Донор 2 НАМТЕ5 ВО ро к | в а | Е ца. т Е М т 190. З я сіє В ню КК в | ЕХ, тів ОО Б : З сла - - ВЕУ Ж кп б ХХ не т Ме Ма ден є БО Ки - БО КОХ см ко м З ША Мн Не: | Бк, но КК В Гж ль в Я : п я - ше ин йо но Кия а ОХ М | я Ми Б пев зе ій: Її а а 5 в в ЕНН т Ї Кк Я а ках ДЯН 5 їх о. би хх С да; с сен іти і п Си пах ОКХ МОМ. пі с. ШК що КЗ ге 5 - Еш щ- як я в щ щ КЕ т Я їх ш ХЕ ВЕ 5 Ж х ш Ж а їв в х вх Ше х ї ОЗ х Т с Б її - що З М У - як те я-т ХО т ХА З - - М Кк ш о та т КУ 5 - ЖЕ те -к ОО Во 5 хх й ш 5 Е ою х кт 150) Донор З ВАМТЕ5 200! Донор 3 КАМТЕ5 ж І: г х - КО | ї 150 З яз . | В я 0 : т їх їж | Ї У вовни її | пий МОм. Ж Ї о В Бо се : С. а М НЯ я ! А они м Я В Чет а Ба Ка : З ; шо БОНН Шк зх бе К З и ж ОН Бу ! ; а ЖЕ а Тех іх 5 с-- о А 0 ММ ХХ 1 ди ЗХ Ем о ЗХ В Й КЕ К ги у АВ МОНУ пі ем ще екю ВЕН ННЯ пік хх 1 я хх ща В п З п й ге Е ги хк Це з кг щ ї ве їх 6 ж в 5 вк ОВ 6 ою вк й ж / се я з КЕ а т М я і ОВО в М оф '

Фіг. 12

Я -йк- Го. Наповнювач о-и-- ГО. 2/Бетаметазон 0059 -- Ге. АІЛЕР-ЗМа 16 | м - ду хи тют «ше Е К жк с з а - Е Ме м й ; і яка ЯК ж Е 7 жи и НЕ няно мен хв Я Е жюжа 0 ух У тки у ЖЖ длжежж ЖЖ пк з ее п т: 2 з я я їх я В - о -Е в - 2 -ї в еЕ 2

Фіг. 13А З мне В. МА аповнювач Ї о-к--Гр. 2 Бетаметазон 00575 каф ДОМА -Я о ення до їЗ і о рн г Фо ІЗ ж | і; -и Е БА У ; он ве Е ж КУ ання зе ? ж ж орненя сеск У и М, дан ста зам атья Е ЖЕ - Кт гкиииха Вс убнк» сих з й: г С СР зеню важ яЖжВ яке В - - - -Е 8 ка я їх й В " й й Щ й йо й А с

Фіг. 1386

250 У Гр. з/Наповнювач зе Гго. ДБетаметазон 0,5 жнфеГо, ЗІЛЕР-З 1 2004 он-гр. 4ІЛЕР-ЗМа 155 2 д твої ' ее В и де ; лек в. і й Бо ми В Др ка : дк ой шк жу с шк з «Я нн ення су ет йя киева ік кам У у Б в. ка Ком ерієтікж кн жен чі Я сенкан кктч есе няниннкх Міка інв тжряни кА»не кеи Миті ча жар ка нки дркрі як вагіт 0 - в с 24 че «З «Фа «З З че Ф З Ж че же я чт я З я Я с гу ч чш ш щчо оч ОО ЕЖ ст о0ї День

Фіг. 14А о - й го. Наповнювач яд ГО. Бетаметазон ОО Р соненф яр. ЗЕ АТ ОЙ й, т 150 ях Ж Ж В 100 / В я Ген Б о. , , і й я Ян В НК дж о дих "50 і с сі че Ге. їз г ч я Я в В я я Б А А й Я й День

Фіг. 1465

43 «й Гро Наповнювач -кЕ-- Гр. 2/Бетаметазон 0 пБ5ЗЬ чен Гр. ЖЕ г сну В. МЕР -аМа 1 а ж а е Я нн д Донині, ! Кт ою Я Є пен у як І дк зняку, -щж.. зккк ув я А В я я я й я НА й День

Фіг. 15А Я ей Го. М Ааповнювач

-Ж-. Гр. 2/Бетаметазон 0 059е -щ 2 р. ЕРА Тв З - ; ЕЕ 2 д я іо ; г б , У де У ї й / У зкже х яжи у ; а Ж яжжж У ак, ; ке ее --6 мезнпнодрпапннннннн, Кн у Дн ф вн ; х - с їх ш е - - - 9 Б А в в Б В В В й а й А День

Фіг. 158

4 -й-- Гр. Наповнювач мн Гр. 2Бетаметазон 0 Оь зефуня Гр. ть з Гр. аЯєвР-ЗМма 1 а В , чо. х А

5. Ж нок В ТК я ух Ж я одзані ж а ДІ жежж і як жк 1- о с К я Ж зна ж ве В їх в а їла 8 її й я в й 5 п В В й я День

Фіг. 16А й менти Гр. ТИНаповнювач

-ж. Го. 2ьетаметадзон о пеЗ - ня ГО. ЯТЬ Оле -щ-- Гр. Рая То З З Ж уд оожжяжжожжа й : їй "я ! 14 и - У З жк сс, і і ; г - ХЕ Ст го кі -е «г «о чт я в вд й Я 8 А В А 5 День

Фіг. 16855