CN112203674A - 用于抑制炎性细胞因子的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含特定四肽的药物组合物，所述药物组合物用于减少炎性细胞因子和介导物的释放或抑制它们的活性，并用于治疗与这些细胞因子和介导物相关的疾病和障碍。

Description

用于抑制炎性细胞因子的药物组合物
技术领域
本发明提供了用于在包括但不限于炎性眼部障碍的炎性病症中减轻与炎性细胞因子的释放相关的症状的药物组合物和方法。
背景技术
炎症是身体组织对有害刺激例如病原体、受损细胞或刺激物的复杂生物应答的一部分，并且是涉及免疫细胞、血管和分子介导物的保护性应答。炎症的功能是消除细胞损伤的初始原因，清除坏死细胞和在原始损伤和炎症过程中受损的组织，并启动组织修复。
炎症的经典症状是发热、疼痛、发红、肿胀和功能丧失。炎症是一种通用应答，因此被认为是先天性免疫的一种机制。
炎性疾病包括多种以炎症为特征的障碍和病症。实例包括过敏症、哮喘、移植排斥、自身免疫性疾病和眼部炎症，这仅仅是几个实例。
炎性眼部障碍
葡萄膜炎是一个通用术语，描述一组可轻微降低视力或导致严重视力丧失的炎性眼病。所述疾病通常影响眼的被称为葡萄膜的部分，但不仅限于眼的这一部分。这些疾病还影响晶状体、视网膜、视神经和玻璃体，导致视力下降或失明。葡萄膜炎可能由眼中出现的问题或疾病引起，也可能是影响身体其他部位的炎性疾病的一部分。葡萄膜炎可以是急性或慢性的，并且通常被分类为传染性或非传染性的。
干燥性角膜结膜炎、也被称为干眼病(DED)或干眼综合征(DES)，是一种常见的眼病，促使数以百万计的人寻求眼科护理。不论潜在的病因如何，已显示干眼病与角膜前泪膜异常以及随后包括附件、结膜和角膜在内的整个眼表中的炎性变化有关。炎性细胞因子例如IL-6的激活在DED的病理生理中发挥关键作用。
自从认识到炎症在干眼病中的作用以来，已调查了大量旨在抑制各种不同炎性途径的治疗方法，例如环孢菌素A、皮质类固醇、他克莫司、四环素衍生物和自体血清(Michelle Hessen M.和Karamursel Akpek，E J Ophthalmic Vis Res.2014,9(2),240–250)。
美国专利号4,619,916教导了13种式pGlu-X-Trp的三肽，其中pGlu是环化谷氨酸(焦谷氨酸)，并且X可以是Gly、Val、Glu、Asp、Ser、Ala、Asn、Gln、Ile、Leu、Pro、Lys和Arg。所述参考文献未描述或建议所述肽用于治疗炎症的用途。
美国专利号7,220,725和国际专利公开WO200212269教导了包括pGlu-Asn-Trp-Lys(辛酰基)-OH(ZEP3)和pGlu-Asn-Trp-Thr-OH(ZEP4)在内的新肽及其用于治疗疼痛的用途。所述参考文献未描述或建议所述肽用于治疗炎症的用途。
美国专利号9,012,397和WO2012/131676教导了包括肽ZEP3或ZEP4的局部用药物组合物及其用于改善皮肤障碍的症状的用途。所述参考文献未描述或建议所述肽用于治疗炎症的用途。
Gaynes等人(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.54,E-Abstract 5416,2013)描述了在实验诱导的化学角膜损伤的大鼠模型中，肽ZEP4在减轻眼痛和改变伤害感受途径方面的镇痛作用。所述参考文献未描述或建议所述肽的抗炎活性。
本发明致力于通过炎症级联的干预来改进和开发改善炎性病症的新的安全有效的治疗方法的持续需求。
发明内容
本发明提供了用于改善与炎性细胞因子的释放相关的症状的组合物和方法。已知这些细胞因子是许多炎性障碍的病因和病理的一部分。适于用本发明的组合物治疗的疾病和障碍包括但不限于眼、耳、肺和肠的炎性疾病。适于治疗的疾病和障碍还包括自身免疫性疾病，其中为了防止恶化，药物的给药可能是长期给药。
本发明部分是基于下述在体外和体内模型中的发现，即被称为ZEP3和ZEP4的肽出人意料地在减弱炎性和促炎性介导物的表达和/或释放中显示出强大活性，所述介导物包括特定细胞因子干扰素γ(IFN-γ，IFNγ)、白介素1β(IL-1β，IL-1β)、白介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNFα，TNFα)和白介素6(IL-6)和介导物活性氧物质(ROS)和RANTES(活化后调控正常T细胞表达和可能分泌的趋化因子)。
令人吃惊地发现，所述肽在抑制炎性级联中的活性，即使在所述肽在炎症反应开始之前给药的情况下也能够发挥。因此，所述肽可以改善或抑制在各种不同炎性疾病和障碍中诱导的症状，并且可用于完全消除炎性反应。设想了本发明的组合物可用于预防慢性炎性疾病的恶化。
应当明确地理解，使用本发明的组合物治疗炎性疾病不包括治疗皮肤障碍或疼痛本身。
根据本发明的一个方面，提供了一种药物组合物，其包含可药用载体和根据式I：pGlu-X1-X2-X3-OH所述的肽或其可药用盐或衍生物作为活性成分，其中X1是极性氨基酸残基；X2是芳香族或疏水氨基酸残基；并且X3选自带正电荷的氨基酸残基和极性氨基酸残基；用于减少炎性细胞因子的释放或抑制其活性。
根据某些实施方式，X1选自Asn、Gln、His、Ser、Thr、Tyr和Cys；X2选自Trp、Phe、Tyr、Ala、Ile、Leu、Met、Val和Gly；并且X3选自Lys、Lys衍生物、Arg、His、Asn、Gln、His、Ser、Thr和Tyr。
根据其他实施方式，X1选自Asn和Thr；X2选自Trp、Phe和Tyr；并且X3选自Lys、Lys衍生物和Thr。
根据某些实施方式，所述肽衍生物包含连接到所述肽序列的游离官能团的烷基。
根据其他实施方式，所述烷基通过酰胺键或连键连接到所述肽的侧链或N-端的游离氨基。
根据某些实施方式，所述烷基是C4至C30烷基。
根据某些特定实施方式，C8烷基(本文中的辛酰基)通过酰胺键连接到所述肽序列的Lys残基的侧链或所述肽的末端氨基。根据某些实施方式，所述肽的羧基端被修饰，以形成例如酰胺、醇或酯末端。
根据某些特定实施方式，所述肽选自pGlu-Asn-Trp-Lys(辛酰基)-OH(SEQ ID NO：1)、pGlu-Asn-Trp-Thr-OH(SEQ ID NO：2)及其可药用衍生物和盐。
根据某些实施方式，所述炎性细胞因子选自TNFα、IL-1β、IL-6、IL-10和IFNγ。
根据另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含可药用载体和根据式I：pGlu-X1-X2-X3-OH所述的肽或其可药用盐或衍生物作为活性成分，其中X1是极性氨基酸残基；X2是芳香族或疏水氨基酸残基；并且X3选自带正电荷的氨基酸残基和极性氨基酸残基；用于减少炎性介导物或趋化因子的释放。
根据某些特定实施方式，所述肽选自pGlu-Asn-Trp-Lys(辛酰基)-OH(SEQ ID NO：1)、pGlu-Asn-Trp-Thr-OH(SEQ ID NO：2)及其可药用衍生物和盐。
根据某些实施方式，所述炎性介导物或细胞因子选自活性氧物质(ROS)和RANTES(活化后调控正常T细胞表达和可能分泌的趋化因子)。
根据本发明的另一方面，提供了一种减少至少一种炎性或促炎性炎性细胞因子的释放或抑制其活性的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的根据式I：pGlu-X1-X2-X3-OH所述的肽或其可药用盐或衍生物的步骤，其中X1是极性氨基酸残基；X2是芳香族或疏水氨基酸残基；并且X3选自带正电荷的氨基酸残基和极性氨基酸残基。
根据另一方面，提供了一种减少炎性介导物或趋化因子的释放的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的根据式I：pGlu-X1-X2-X3-OH所述的肽或其可药用盐或衍生物的步骤，其中X1是极性氨基酸残基；X2是芳香族或疏水氨基酸残基；并且X3选自带正电荷的氨基酸残基和极性氨基酸残基。
根据某些实施方式，所述炎性介导物或趋化因子选自ROS和RANTES。
根据另一方面，本发明提供了一种治疗炎性疾病或障碍的方法。根据特定实施方式，所述炎性疾病或障碍选自眼部炎性疾病或障碍、耳部炎性疾病或障碍、肺部炎性疾病或障碍、肠炎性疾病或障碍或炎性自身免疫性疾病或障碍，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的根据式I：pGlu-X1-X2-X3-OH所述的肽或其可药用盐或衍生物的步骤，其中X1是极性氨基酸残基；X2选自芳香族氨基酸残基和疏水氨基酸残基；并且X3选自带正电荷的氨基酸残基和极性氨基酸残基。
根据某些实施方式，本发明提供了治疗慢性炎性疾病的方法。根据特定实施方式，所述向需要的对象给药治疗有效量的根据式I的肽的步骤甚至在所述症状已出现或发生之前进行。这些治疗慢性炎性疾病的方法有效地防止病情恶化。
根据另一方面，本发明提供了一种治疗眼部炎性疾病或障碍的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的根据式I：pGlu-X1-X2-X3-OH所述的肽或其可药用盐或衍生物的步骤，其中X1是极性氨基酸残基；X2是芳香族或疏水氨基酸残基；并且X3选自带正电荷的氨基酸残基和极性氨基酸残基。
根据某些实施方式，X1选自Asn、Gln、His、Ser、Thr、Tyr和Cys；X2选自Trp、Phe、Tyr、Ala、Ile、Leu、Met、Val和Gly；并且X3选自Lys、Lys衍生物、Arg、His、Asn、Gln、His、Ser、Thr和Tyr。
根据其他实施方式，X1选自Asn和Thr；X2选自Trp、Phe和Tyr；并且X3选自Lys、Lys衍生物和Thr。
根据某些特定实施方式，所述Lys衍生物是Lys(辛酰基)。
根据某些实施方式，所述肽衍生物包含连接到所述肽序列的官能团的烷基。
根据其他实施方式，所述烷基通过酰胺键连接到所述肽的侧链或末端的氨基。
根据某些实施方式，所述烷基是C4至C30烷基。
根据某些特定实施方式，C8烷基(本文中的辛酰基)通过酰胺键连接到所述肽序列Lys残基的侧链或末端氨基。
根据某些特定实施方式，所述肽选自pGlu-Asn-Trp-Lys(辛酰基)-OH(SEQ ID NO：1)、pGlu-Asn-Trp-Thr-OH(SEQ ID NO：2)及其可药用盐或衍生物。
根据某些实施方式，所述肽具有SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列。
根据某些实施方式，所述肽具有SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列。
根据某些实施方式，所述药物组合物包含具有在选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列中示出的氨基酸序列的肽的衍生物或盐。
根据某些实施方式，所述方法包括给药具有在选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列中示出的氨基酸序列的肽的衍生物或盐。
根据某些实施方式，所述药物组合物包含在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的任一者中示出的肽的钠盐。
根据某些实施方式，所述药物组合物被配制成用于通过选自以下的途径给药：局部给药、眼部给药、口服给药、鼻部给药和肠胃外给药。
根据各种不同实施方式，用于局部给药的制剂可以选自霜剂、软膏、糊剂、洗剂、凝胶或采取滴眼液的形式。
根据某些特定实施方式，提供了包含选自SEQ ID NO：1和2的肽或其可药用盐的霜剂制剂，用于局部给药。
根据某些实施方式，所述霜剂组合物包含0.1-5％w/w的所述肽。根据其他实施方式，所述组合物包含0.5-2％的所述肽。根据其他实施方式，所述组合物包含约1％的所述肽。
根据某些实施方式，根据本发明所述的组合物具有约4至约8的pH。根据某些实施方式，所述组合物具有约4.5至约6.5的pH。根据其他实施方式，所述组合物具有约7至约9的pH。
根据某些实施方式，所述药物组合物包含选自以下的至少一种赋形剂：聚山梨酸酯80，依地酸二钠(EDTA)，二氧化硅，对羟基苯甲酸甲酯，白凡士林，肉豆蔻酸异丙酯，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯。
根据其他实施方式，所述用于给药到具有眼部疾病或损伤的对象的组合物被配制成选自以下的形式：用作滴眼液的液体溶液或悬液、乳液、霜剂、软膏、喷剂和凝胶。
根据某些实施方式，所述眼部疾病或损伤是选自以下的炎性疾病或障碍：葡萄膜炎、干眼综合征、与感染性眼病相关的炎性症状、过敏性眼病、角膜炎、结膜炎、睑板腺功能障碍和干燥综合征。
根据其他实施方式，所述药物组合物被配制成滴眼液、眼用软膏、眼用喷剂、眼用悬液、眼用乳液、眼用溶液、眼用凝胶或玻璃体内注射剂。
根据其他实施方式，所述炎性疾病或障碍是自身免疫性疾病或障碍。
根据其他实施方式，所述自身免疫性疾病或障碍选自类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、幼年特发性关节炎、狼疮和干燥综合征。
根据其他实施方式，所述炎性疾病或障碍是炎性肠病。
根据其他实施方式，所述炎性肠病选自克罗恩病、溃疡性结肠炎和乳糜泻。
根据其他实施方式，所述炎性疾病或障碍是肺部炎性疾病或障碍。
根据其他实施方式，所述肺部炎性疾病或障碍选自哮喘、支气管炎、胸膜炎、肺泡炎、血管炎、肺炎、慢性支气管炎、支气管扩张、弥漫性泛细支气管炎、超敏性肺炎、特发性肺纤维化和囊性纤维化。
根据其他实施方式，所述炎性疾病或障碍是耳部炎性疾病或障碍。
根据其他实施方式，所述耳部炎性疾病或障碍选自与耳部感染相关的炎性症状、中耳炎、外耳炎、乳突炎和耳乳突炎。
根据其他实施方式，所述给药是眼部给药。
根据其他实施方式，所述给药是口服给药。
根据其他实施方式，所述给药是鼻部给药。
根据其他实施方式，所述给药是肠胃外给药。
本发明通过提供用于减少炎性细胞因子和介导物的释放或抑制其活性以及用于治疗与炎性细胞因子和介导物相关的疾病或病症的药物组合物，成功地解决了目前已知配置的缺点。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在本发明的实施方式的实践和测试中可以使用与本文中描述的相似或等同的方法和材料，但在下面描述了示例性的方法和/或材料。在有冲突的情况下，以本专利说明书、包括定义为准。另外，所述材料、方法和实施例仅仅是说明性的，并不意图必然是限制性的。
附图说明
在本文中以仅为示例的方式，参考附图描述了本发明的一些实施方式。现在将详细地具体参考附图，应该强调的是，所示出的细节仅仅作为示例，并且是出于对本发明的实施方式进行说明性讨论的目的。就此而言，所述结合附图进行的描述可以使本领域技术人员明显看出可以如何实践本发明的实施方式。
在所述附图中：
图1是说明了浓度范围为3.125–100μg/ml的ZEP4(Z)对由炎症诱导的巨噬细胞产生的TNFα的量的影响的条形图。用****标注的线表示在p<0.0001下的统计学显著差异。
图2是说明了ZEP4(Z)(50μg/ml)对由脂多糖(LPS，100ng/ml)和棕榈酸(PA，100、200或400μM)处理过的、炎症诱导的巨噬细胞产生的TNFα的量的影响的条形图。用****标注的线表示在p<0.0001下的统计学显著差异。
图3是说明了ZEP3(Z)(浓度范围：3.125–100μg/ml)对由炎症诱导的巨噬细胞产生的TNFα的量的影响的条形图。用****、***、**、*和n.s.标注的线分别表示在p<0.0001、p<0.001、p<0.01、P<0.1和不显著下的统计学显著差异。
图4是说明了ZEP4(Z)(50μg/ml)对由炎症尼日利亚菌素诱导的巨噬细胞产生的IL-1β的量的影响的条形图。用****标注的线表示在p<0.0001下的统计学显著差异。
图5是说明了ZEP3对炎症诱导的巨噬细胞的生存力的影响的条形图。
图6是说明了不同浓度下的ZEP3对通过LDH测定法确定的暴露于70mM NaCl(黑色条)或NHE20(灰色条)的炎症诱导的角膜上皮细胞的生存力的保护性效果的条形图。用****和*标注的线分别表示在p<0.0001和p<0.05下的统计学显著差异。
图7是说明了不同浓度下的ZEP3对由暴露于4-羟基壬烯醛(4-HNE)24hr的、炎症诱导的角膜上皮细胞产生的IL-6的量的影响的条形图。用*标注的线表示在p<0.05下的统计学显著差异。
图8是说明了在不同浓度下的ZEP3对由暴露于4-HNE 24小时的、炎症诱导的角膜上皮细胞产生的活性氧物质(ROS，通过DCFDA试剂盒测量)的量的保护性效果的条形图。用****、***和**标注的线分别表示在p<0.0001、p<0.001和p<0.01下的统计学显著差异。
图9描述了在来自于4位人类供体的正常PBMC中，对使用不同浓度的ZEP3的刺激，以及培养基、刺激和地塞米松对照做出响应的IFN-γ生产。统计学显著差异被表示为：*p<0.05，**p<0.01，通过单向ANOVA然后是Dunette多重比较与刺激对照进行比较。
图10描述了在来自于4位人类供体的正常PBMC中，对使用不同浓度的ZEP3的刺激，以及培养基、刺激和地塞米松对照做出响应的IL-10生产。统计学显著差异被表示为：*p<0.05，**p<0.01，通过单向ANOVA然后是Dunette多重比较与刺激对照进行比较。
图11描述了在来自于4位人类供体的正常PBMC中，对使用不同浓度的ZEP3的刺激，以及培养基、刺激和地塞米松对照做出响应的IL-1β生产。统计学显著差异被表示为：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，通过单向ANOVA然后是Dunette多重比较与刺激对照进行比较。
图12代表了在来自于4位人类供体的正常PBMC中，对使用不同浓度的ZEP3的刺激，以及培养基、刺激和地塞米松对照做出响应的RANTES生产。统计学显著差异被表示为：*p<0.05，通过单向ANOVA然后是Dunette多重比较与刺激对照进行比较。
图13A和13B是示出了在噁唑酮诱导的小鼠特应性皮炎模型中，在用ZEP3、ZEP3Na(图13A)或ZEP4(图13B)局部治疗的小鼠中，与赋形剂和倍他米松对照相比，背部皮肤厚度随时间演变的图。统计学显著差异被表示为：*p<0.05，**p<0.0，****p<0.001，通过单向ANOVA然后是Dunette多重比较与刺激对照进行比较。
图14A和14B描述了在噁唑酮诱导的小鼠特应性皮炎模型中，在用ZEP3、ZEP3Na(图14A)或ZEP4(图14B)局部治疗的小鼠中，与赋形剂和倍他米松对照相比，基线校正的右耳厚度随时间的演变。
图15A和15B代表的图展示了在噁唑酮诱导的小鼠特应性皮炎模型中，在用ZEP3、ZEP3Na(图15A)或ZEP4(图15B)局部治疗的小鼠中，与赋形剂和倍他米松对照相比，红斑评分随时间的演变。统计学显著差异被表示为：*p<0.05，**p<0.001，****p<0.0001，通过单向ANOVA然后是Dunette多重比较与刺激对照进行比较。
图16A和16B代表了在噁唑酮诱导的小鼠特应性皮炎模型中，在用ZEP3、ZEP3Na(图16A)或ZEP4(图16B)局部治疗的小鼠中，与赋形剂和倍他米松对照相比，鳞屑评分随时间的演变。统计学显著差异被表示为：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，通过单向ANOVA然后是Dunette多重比较与刺激对照进行比较。
图17A和17B说明了在噁唑酮诱导的小鼠特应性皮炎模型中，在用ZEP3、ZEP3Na(图17A)或ZEP4(图17B)局部治疗的小鼠中，与赋形剂和倍他米松对照相比，动物体重从第8天到第28天的相对变化。
具体实施方式
本发明涉及包含特定肽及其盐和衍生物，用于抑制炎性级联的药物组合物。炎性介导物的抑制有益于几种炎性疾病和障碍例如眼部炎性疾病和障碍的预防和治疗。
正如本文中示例的，所述对炎性细胞因子释放的抑制性效应在包括小鼠巨噬细胞系、人类单核细胞系、人类角化细胞系、人类外周血单核细胞(人类PBMC)和人类角膜上皮细胞(HCEC)的几种模型中得到体外证实，并在炎性特应性皮炎(AD)小鼠模型中得到体内证实。
所述肽对实验性角膜炎症的有益效果在人类角膜上皮细胞培养物模型中得到证实。
参考附图和伴随的描述，本发明的原理和操作可以被更好地理解。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应该理解，本发明的应用并不一定限于在下面的描述中阐述或由实施例示例说明的细节。本发明能够具有其他实施方式或以各种不同方式实践或实施。另外，应当理解，本文中使用的短语和术语是出于描述的目的，而不应被视为限制。
在使本发明付诸实践的同时，本发明人令人吃惊地发现，肽ZEP3和ZEP4及其钠盐形式降低了为引起炎症而诱导的巨噬细胞和角膜上皮细胞的炎性细胞因子TNFα、IL-1β和IL-6的表达(下述实施例1-7)，并在炎症刺激的人PBMC中降低了IFNγ、IL-10、IL-1β和RANTES的表达(下述实施例12)。此外，在特应性皮炎的小鼠炎症模型中，ZEP4、ZEP3及其钠盐形式ZEP3Na显著减少了体内临床病灶(下述实施例13)。所述结果表明，本发明的肽能够独特地抑制或阻止炎症。
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种用于减少参与炎性疾病或障碍的病因或病理的至少一种细胞因子或介导物的释放或抑制其活性的药物组合物。所述药物组合物包含作为活性成分的肽和可药用载体。所述肽具有SEQ ID NO：1和2中的任一者中示出的氨基酸序列，或者是其可药用盐。
因此，本发明提供了用于改善和治疗与特定细胞因子和介导物的过量释放或活性相关的炎性疾病的方法。
根据某些实施方式，所述炎性疾病是与至少一种细胞因子或介导物的过量释放或活性相关的疾病或障碍，其中所述至少一种细胞因子或介导物选自IFN-γ、IL-1β、IL-10、TNFα、IL-6、ROS和RANTES。
本文中使用的短语“炎性疾病或障碍”是指与炎症相关的疾病、病症或障碍。当在本文中使用时，术语“炎症”是指对象的免疫系统协调对组织损伤、感染、抗原激惹等的应答的过程。炎症可能与血液向组织的供应增加、组织中的毛细血管通透性增加和/或白细胞向组织的迁移增加有关。
促炎性细胞因子主要由活化的巨噬细胞产生，并参与炎性反应的上调。
炎症可以通过从所述对象获得的生物样品中炎性细胞因子例如但不限于TNFα、IL-1-α、IL-1β、IFN-γ和IL-6的水平升高来诊断。生物样品可以是例如泪液、血液、血清、血浆、尿液、痰液、唾液、粪便、精液、脊髓液、骨髓、淋巴液或CSF、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部分泌物、乳液、任何人体器官或组织、通过灌洗获得的任何样品、胸膜积液、体外或离体细胞培养的样品以及细胞培养成分。
活性氧物质(ROS)是在炎性障碍的发展中发挥重要作用的关键信号传导分子。在炎症部位处多形核中性粒细胞(PMN)产生的ROS增多会引起内皮功能障碍和组织损伤。在炎性条件下，由PMN产生的氧化应激导致内皮间连接的打开，并促进炎性细胞跨内皮屏障迁移。
根据本发明的某些实施方式，所述炎性疾病或障碍是眼部炎性疾病或障碍。所述眼部炎性疾病或障碍可以是但不限于葡萄膜炎、干眼综合征、与病毒、细菌或真菌眼部感染相关的炎性症状、过敏性眼病、角膜炎、结膜炎、睑板腺功能障碍和干燥综合征。
在一个实施方式中，所述眼部炎性疾病或障碍是葡萄膜炎。当在本文中使用时，术语“葡萄膜炎”是指葡萄膜的炎症，所述葡萄膜是巩膜与视网膜之间的层，并包括虹膜、睫状体和脉络膜。葡萄膜炎通常也被称为虹膜炎、睫状体扁平部炎、脉络膜炎、脉络膜视网膜炎、前葡萄膜炎和后葡萄膜炎。葡萄膜炎的最常见形式是前葡萄膜炎，它涉及通常与虹膜隔离的眼前部的炎症。这种病症通常被称为虹膜炎。
在一个实施方式中，所述眼部炎性疾病或病症是干眼综合征。本文中使用的短语“干眼综合征(DES)”是指由患病或功能障碍的泪腺功能单元引起的泪液组合物改变的病症。有证据表明，炎症引起泪液分泌腺的结构改变。由泪腺功能障碍、蒸发增加和/或清理不良引起的泪液组合物变化对眼表有促炎作用。这种炎症部分造成了干眼病中的刺激症状、眼表上皮疾病和角膜上皮屏障功能的改变。用于DES的抗炎疗法针对在干眼病中已鉴定的一种或多种炎性介导物/途径。DES也被本领域技术人员称为干眼病(DED)、干燥性角膜结膜炎和干燥性角膜炎。
在一个实施方式中，所述眼部炎性疾病或病症与干燥综合征相关。当在本文中使用时，短语“干燥综合征”是指以流泪减少、口干和其他粘膜干燥为特征的系统性自身免疫炎性障碍，并通常伴有自身免疫风湿障碍例如类风湿性关节炎。眼和口的干燥是这种综合征的最常见症状。所述症状可以单独出现，或者伴有与类风湿性关节炎或其他结缔组织疾病相关的症状。可能存在相关的唾液腺增大。其他器官可能受到影响。所述综合征可能与类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、多发性肌炎和其他疾病相关。
在某些实施方式中，所述眼部炎性疾病或病症由涉及眼的手术例如角膜移植/角膜移植术、角膜修复手术、层板移植或选择性内皮移植引起。
在某些实施方式中，所述眼部炎性疾病或病症影响眼表，例如但不限于角膜眼表炎性病症、角膜新血管形成、包括周围溃疡性角膜炎和微生物角膜炎在内的角膜炎、结膜炎或类天疱疮综合征。
在某些实施方式中，所述眼部炎性疾病或病症是影响眼部的自身免疫障碍，例如但不限于交感神经性眼病、Vogt-Koyanagi Harada(VKH)综合征、鸟枪弹样脉络膜视网膜病变、眼瘢痕性类天疱疮(OCP)、干燥综合征或Fuchs异时性虹膜睫状体炎。
根据本发明的某些实施方式，所述炎性疾病或障碍是自身免疫性疾病或障碍。所述自身免疫性疾病或障碍可以是但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、寻常型天疱疮、强直性脊柱炎、幼年特发性关节炎、狼疮和干燥综合征。
在一个实施方式中，所述自身免疫性疾病或障碍是类风湿性关节炎。当在本文中使用时，短语“类风湿性关节炎”是指其中多个关节发炎的慢性自身免疫性障碍。滑膜关节内膜的炎症伴有关节疼痛和僵硬，并且通常会导致骨骼和关节破坏、畸形、残疾和甚至死亡。
在一个实施方式中，所述自身免疫性疾病或障碍是狼疮。当在本文中使用时，术语“狼疮”是指被称为红斑狼疮的慢性炎性自身免疫性障碍，其可能影响许多器官系统，包括皮肤、关节和内脏器官。狼疮是一个通用术语，包括许多特定类型的狼疮，包括系统性狼疮、狼疮肾炎和狼疮脑炎。在系统性红斑狼疮(SLE)中，人体的自然防御力转而针对人体，变质的免疫细胞攻击人体组织。可能产生可与人体的血细胞、器官和组织发生反应的抗体。这种反应导致免疫细胞攻击受影响的系统，从而产生慢性疾病。也被称为狼疮肾小球疾病的狼疮肾炎是一种肾脏障碍，其通常是SLE的并发症，并以肾小球的损害和肾功能的进行性丧失为特征。狼疮脑炎是指SLE的另一种并发症，其是脑和/或中枢神经系统的炎症。
在本发明的一个实施方式中，所述炎性疾病或障碍是骨关节炎(OA)。OA也被称为肥大性骨关节炎、骨关节病和变性关节病。OA是骨骼关节的一种慢性变性疾病，它在所有年龄的成年人中影响特定关节，通常是膝、髋、手关节和脊柱。OA的特征在于以下几种表现，包括关节软骨的变性和变薄以及相伴的“溃疡”或凹陷的发生、骨赘形成、边缘部骨肥大、滑膜变化和受影响的关节增大。此外，骨关节炎伴有疼痛和僵硬，尤其是在长时间活动后。本发明的肽、其盐和衍生物以及包含它们的药物组合物可用于治疗骨关节炎。骨关节炎的特征性影像学特点包括关节间隙变窄、软骨下硬化、骨赘、软骨下囊肿形成、骨质体松散(或“关节游离体”)。
根据本发明的某些实施方式，所述炎性疾病或障碍是炎性肠病。所述炎性肠病可以是但不限于克罗恩病、溃疡性结肠炎和乳糜泻。
根据本发明的某些实施方式，所述炎性疾病或障碍是肺部炎性疾病或障碍。所述肺部炎性疾病或障碍可以是但不限于哮喘、支气管炎、胸膜炎、肺泡炎、血管炎、肺炎、慢性支气管炎、支气管扩张、弥漫性泛细支气管炎、超敏性肺炎、特发性肺纤维化和囊性纤维化。
根据本发明的某些实施方式，所述炎性疾病或障碍是耳部炎性疾病或障碍。所述耳部炎性疾病或障碍可以是但不限于与耳部感染相关的炎性症状、中耳炎、外耳炎、乳突炎和耳乳突炎。
本发明还提供了一种用于治疗与炎性介导物和趋化因子包括但不限于ROS、RANTES和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的过量释放相关的疾病或障碍的药物组合物。可以使用本发明的组合物治疗的与ROS的释放相关的炎性疾病包括但不限于肺部疾病、心血管疾病、肾脏疾病相关的血管钙化和炎性代谢疾病。
趋化因子RANTES和MCP-1与肺过敏性炎症、肺白细胞浸润、支气管高反应性和哮喘病理发生中嗜酸性粒细胞的召集相关。
术语“治疗”是指抑制、预防或阻止疾病或障碍的发展和/或引起疾病或障碍的减轻、缓解或消退。
在本发明的组合物和方法中使用的肽、衍生物和盐可以使用本领域中已知的任何方法包括但不限于固相和液相肽合成来合成。在本发明的组合物中使用的某些肽可以使用重组方法或重组与合成方法的组合来生产。
在本发明的一个实施方式中，所述肽是pGlu-Asn-Trp-Lys(辛酰基)-OH(SEQ IDNO：1；在后文中被称为“ZEP3”)，其中pGlu是焦谷氨酸。所述肽ZEP3可以例如通过美国专利号7,220,725中描述的程序来生产。
在本发明的一个实施方式中，所述肽是pGlu-Asn-Trp-Thr-OH(SEQ ID NO：2；在后文中被称为“ZEP4”)。所述肽ZEP4可以例如通过下述程序来生产：
肽ZEP4的合成通过9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸在氯三苯甲基氯树脂(CTC)的固相支持物上的顺序合成来进行。在CTC树脂(125gr)上装载Fmoc-苏氨酸(叔丁基；79gr)和充当氨基酸与固相支持物的偶联剂的二异丙胺(DIPEA；160gr)。通过25％哌啶的混合物除去Fmoc保护基团，将所述树脂-肽过滤并用二甲基甲酰胺(DMF)清洗。将第二个氨基酸Fmoc-Trp(85gr)用3-[双(二甲基氨基)甲基脲基]-3H-苯并三唑-1-氧化物，六氟磷酸酯(HBTU)/羟基苯并噻唑(OHBT)的混合物活化，通过添加DIEA偶联到第一个氨基酸。如上文中所述除去Fmoc基团，将所述树脂-肽过滤并用二甲基甲酰胺(DMF)清洗。将第三个氨基酸Fmoc-Asn(trt)(119gr)用HBTU/HOBT活化并通过添加DIEA进行偶联。如上文中所述除去Fmoc基团，将所述树脂-肽过滤并用二甲基甲酰胺(DMF)清洗。将第四个氨基酸pGlu(26gr)用HBTU/HOBT活化并通过DIEA进行偶联。
将所述肽-树脂用DMF、然后用IPA充分清洗，并在减压下干燥。将所述肽从树脂切下，并通过TFA(95％)和三异丙基甲硅烷(TIS)(5％)在室温下2hr也将Thr和Asn的保护基团切下。通过添加甲基叔丁基醚(MTBE)将所述肽沉淀，过滤并干燥(得到46gr)。
将所述粗产物(46gr)溶解在乙腈(ACN)/水的混合物中，装载在制备型HPLC系统(4"，RP C-18 100-120A孔径)上，并使用下述梯度系统进行纯化：A相–0.1％TFA水溶液；B相–ACN。洗脱通过在45min内逐渐增加B相(3％至33％)来进行。收集纯度高于97％的级分。将合并的级分在相同的HPLC系统上使用下述梯度来洗脱：A相：0.2％乙酸；B相：ACN。洗脱通过在30min内逐渐增加B相(10％至40％)来进行。收集纯度高于97％的级分，合并并冷冻干燥(得到29gr)。所述最终产物具有530.5的M.W(MS)和97.3％的纯度(HPLC)。
在本发明的范围内还包括在所公开的组合物和方法中使用的肽的盐和衍生物。
当在本文中使用时，术语“盐”是指所述肽分子的羧基的盐和其氨基或胍基的酸加成盐两者。羧基的盐可以通过本领域中已知的手段来形成，并且包括无机盐例如钠、钙、铵、铁或锌盐等，以及与有机碱的盐例如与胺类例如三乙醇胺、哌啶、普鲁卡因等形成的盐。酸加成盐包括例如与无机酸例如乙酸或草酸的盐。这里描述的盐还包括添加到所述肽溶液以增强水凝胶形成和/或钙盐矿化的离子性成分。
当在本文中使用时，本发明的肽的“衍生物”涵盖可以从作为侧链出现在所述残基上的官能团或N-或C-端基团通过本领域中已知的方式制备的衍生物，并且只要它们仍然可药用，即它们不破坏所述肽的活性，不对含有它的组合物提供有毒性质，并且对其免疫原性性质没有不利影响，即可包括在本发明中。
这些衍生物可以包括例如羧基的脂族酯、通过与氨或与伯胺或叔胺反应产生的羧基的酰胺、通过与酰基组成部分(例如烷酰基或芳酰基)反应形成的、氨基酸残基游离氨基的N-酰基衍生物或通过与酰基组成部分反应形成的、游离羟基(例如丝氨酰基或苏氨酰基的游离羟基)的O-酰基衍生物。
在本发明的一个实施方式中，所述肽是SEQ ID NO：1中示出的肽的钠盐(pGlu-Asn-Trp-Lys(辛酰基)-OH.nNa，其中n是1或2；在后文中被称为“ZEP3钠盐”或ZEP3Na)。
ZEP3钠盐可以例如通过下述程序来生产：
将ZEP3(3.1g)溶解在NaHCO3(100mM)水溶液中(50g/l)。将所述溶液注入到HPLC离子交换柱(2.5x 22cm Luna C18，100A，15微米)中，并通过下述梯度进行洗脱：流动相A：2mMNaHCO3水溶液；流动相B：CH3CN/H2O(8/2)中的2mM NaHCO3；和流动相：C：100mM NaHCO3水溶液。每次运行载样量：最高5％(W/W％肽/固定相)。流速：4.8cm/min(24ml/min)。梯度程序如下：20min C相；5min A相；18min B相；和7min C相。收集含有产物的级分并在减压下浓缩以除去乙腈(110g/l)，然后冷冻干燥[得到2.2g(71％)]。最终产物具有99.7％的纯度(HPLC)、3.1％的钠含量和50mg/ml水的溶解性。
在本发明的一个实施方式中，所述肽是SEQ ID NO：2中示出的肽的钠盐(pGlu-Asn-Trp–Thr-OH.nNa，其中n是1或2；在后文中被称为“ZEP4钠盐”或ZEP4Na)。ZEP4钠盐可以例如通过下述程序来生产：
将ZEP4(5g)溶解在NaHCO3(100mM)水溶液中(50g/l)。将所述溶液注入到HPLC离子交换柱(2.5x 22cm Luna C18，100A，15微米)中，并通过下述梯度进行洗脱：流动相A：2mMNaHCO3水溶液；流动相B：CH3CN/H2O(8/2)中的2mM NaHCO3；和流动相：C：100mM NaHCO3水溶液。每次运行载样量：最高5％(W/W％肽/固定相)。流速：4.8cm/min(24ml/min)。梯度程序如下：20min C相，然后5min A相，然后20min B相和10min C相。收集含有产物的级分并在减压下浓缩以除去乙腈(110g/l)，然后冷冻干燥[得到4g(80％)]。最终产物具有97.5％的纯度(HPLC)、2.5％的钠含量和50mg/ml水的溶解性。
本发明的肽可以本身或作为药物组合物的一部分(活性成分)用于疗法中。
当在本文中使用时，“药物组合物”是指本文中描述的一种或多种活性成分与其他化学组分例如生理上适合的载体和赋形剂的制备物。药物组合物的目的是便于将化合物给药到生物体。
在后文中，可互换使用的短语“生理上可接受的载体”和“可药用载体”是指对生物体不造成显著刺激并且不废除所给药的化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。佐剂被包括在这些短语下。
在本文中，术语“赋形剂”是指添加到药物组合物以进一步便于活性成分的给药的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种不同的糖类和淀粉类型、多糖、环糊精、悬浮剂如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、离子或非离子表面活性剂、增溶剂、乳化剂如卵磷脂、渗透增强剂、多元羧酸、纤维素衍生物、明胶、植物油、蜡、矿物油、丙二醇和聚乙二醇。
用于药物的配制和给药的技术可以在《Remington制药学》(Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.,Easton,PA)最新版中找到，其通过引用并入本文。
适合的给药途径可以例如包括眼、局部、口、直肠、透粘膜、经鼻、肠或肠胃外递送，包括肌肉内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
本发明的药物组合物可以通过本领域公知的方法来制造，例如利用常规的混合、溶解、悬浮、增溶、制粒、糖衣制造、磨细、乳化、包封、包埋、喷雾干燥或冻干方法。
因此，根据本发明使用的药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体以常规方式来配制，所述载体包括便于将活性成分加工成制剂的可药用的赋形剂和辅助剂。适合的配方依赖于所选的给药途径。
本文中描述的药物组合物可以被配制成用于眼部给药。本文中使用的短语“眼部给药”是指在外眼(例如结膜囊)中或玻璃体内给药本发明的肽或药物组合物。适合于眼部给药的剂型可以是但不限于滴眼液、眼用软膏、眼用喷剂、眼用混悬剂、眼用乳液、眼用溶液、眼用凝胶或玻璃体内注射剂。
本文描述的药物组合物可以被配制成用于局部给药。适合于局部给药的剂型可以是但不限于滴液、洗液、凝胶、软膏、乳液、悬液、洗剂、喷剂、雾化液体、栓剂、霜剂、粉剂、泡沫、晶体和脂质体。
对于注射来说，可以将所述药物组合物的活性成分配制在水性溶液中，优选配制在生理相容的缓冲液例如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液中。适合于本发明的药物组合物的一种给药途径是如Erikkson的美国专利号6,525,030中所描述的骨膜下注射。对于透粘膜给药来说，在制剂中使用适合于待透过的屏障的渗透剂。这些渗透剂在本领域中是公知的。
对于口服给药来说，所述药物组合物可以通过将活性化合物与本领域公知的可药用载体组合而容易地配制。这样的载体能够将所述药物组合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬液、乳液等，以供患者口服摄取。用于口服使用的药物制剂可以如下制造：使用固体赋形剂，并在需要时在加入适合的辅助剂后，任选地研磨得到的混合物并加工颗粒的混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。适合的赋形剂具体来说是填充剂例如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制备物，例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄耆胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐例如藻酸钠。当在本文中使用时，术语“口服给药”包括将药物化合物给药到任何口腔表面，包括舌、牙龈、上颚、舌下或其他颊表面。
为糖衣丸核心提供适合的包衣。为此目的，可以使用浓缩糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、清漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣，用于识别或表征活性化合物药剂的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推合式胶囊以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的密封软胶囊。所述推合式胶囊可以含有所述活性成分与填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉、润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁以及任选的稳定剂的混合物。在软胶囊中，可以将所述活性成分溶解或悬浮在适合的液体例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。另外，可以添加稳定剂。所有用于口服给药的制剂应采用适合于所选给药途径的剂量。
对于颊给药来说，所述组合物可以采取以常规方式配制的片剂或含片的形式。
对于通过鼻吸入的给药来说，将所述根据本发明使用的活性成分以气溶胶喷雾呈递的方式，利用适合的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳，从加压包装或喷雾器方便地递送。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供阀门来确定剂量单位以递送计量的量。可以配制用于在分药器中使用的例如明胶的胶囊和药筒，其含有所述化合物与合适的粉剂基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文中描述的药物组合物可以被配制成用于肠胃外给药，例如通过快速浓注或连续输注。注射用制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂容器中，并任选地添加防腐剂。所述组合物可以是在油性或水性介质中的悬液、溶液或乳液，并且可以含有配制剂例如增溶剂、悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外给药的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水性溶液。另外，可以将所述活性成分的悬液制备成适合的油性或水基注射悬液。适合的亲脂性溶剂或介质包括脂肪油例如芝麻油或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯乳液或脂质体。水性注射悬液可以包含增加所述悬液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖。任选地，所述悬液还可以包含适合的稳定剂或提高所述活性成分的溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。
或者，所述活性成分可以采取粉末形式，用于在使用前用适合的介质例如无菌、无热原的水基溶液重构。
本发明的药物组合物也可以使用例如常规的栓剂基料如可可脂或其他甘油酯配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂。
适合于在本发明的情形中使用的药物组合物包括其中所述活性成分以有效实现所需目的的量被包含的组合物。更具体来说，治疗有效量意味着有效预防、减轻或改善待治疗对象的疾病或障碍的症状的活性成分的量。
治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。
对于在本发明的方法中使用的任何制剂来说，治疗有效量或剂量可以首先从体外和细胞培养物测定来估算。例如，可以在动物模型中配制剂量以达到所需浓度或滴度。此类信息可用于更准确地确定在人类中的有用剂量。
本文描述的活性成分的毒性和治疗功效可以通过体外标准药理学程序，在细胞培养物或实验动物中确定。从这些体外和细胞培养物测定法以及动物研究获得的数据可用于配制在人类使用的剂量范围。所述剂量可以根据可能随着所使用的剂型和所采用的给药途径而变。各个医师可以根据患者的状况选择确切的制剂、给药途径和剂量。(参见例如，Fingl等，1975，在《治疗剂的药理学基础》(The Pharmacological Basis ofTherapeutics)Ch.1p.1中)。
可以将剂量和时间间隔分别调整到足以达到最低有效浓度(MEC)的活性成分水平。每种制剂的MEC有所不同，但可以从体外数据估算。达到MEC所必需的剂量将取决于个体特征和给药途径。检测测定法可用于确定血浆或组织浓度。
取决于待治疗病症的严重性和响应性，给药可以是单次或多次给药，并且治疗过程可持续数天至数周或达到疾病状态的减轻。
待给药的组合物的量当然将依赖于待治疗的对象、病患的严重性、给药方式、处方医师的判断等。
因此，如果需要，本发明的某些实施方案的组合物和/或物品可以存在于包装或分药器装置例如FDA批准的药剂盒中，其可以含有一个或多个含有活性成分的单元剂量形式。所述包装可以例如包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装。所述包装或分药器装置可以随附给药的说明书。所述包装或分药器还可以包含与所述容器相伴的通知，其采取由规范药品生产、使用或销售的政府机构所规定的形式，所述通知反映了所述机构对所述组合物的形式或人类或兽医给药的批准。例如，此类通知可以是由美国食品药品监督管理局批准的处方药标签或批准的产品说明书。正如上文进一步详述的，也可以制备在相容的药物载体中配制的包含本发明制剂的组合物，将其放置在适当的容器(例如冻干小瓶)中，并添加用于治疗指定病症的标签。
通过向需要的对象提供治疗有效量的本发明的肽或药物组合物，所述肽或药物组合物可用于抑制炎性细胞因子和介导物的释放或活性和治疗炎性疾病或障碍。
本文中使用的短语“需要的对象”是指被诊断为患有炎性疾病或障碍的雄性或雌性哺乳动物对象(例如人类)。在特定实施方式中，该术语涵盖了处于发生炎性疾病或障碍的风险下的个体。所述对象可以是任何性别或任何年龄，包括新生儿、婴儿、幼儿、少年、青年、成年和老年人。
当在本文中使用时，术语“约”是指±10％。
术语“包含”、“包括”、“具有”及其变化形式意味着“包括但不限于”。
术语“由……构成”意味着“包括并限于”。
术语“基本上由……构成”意味着组合物、方法或结构可能包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是所述另外的成分、步骤和/或部分不会实质性改变所宣称的组合物、方法或结构的基本和新颖特征。
当在本文中使用时，单数形式包括复数指称物，除非上下文明确陈述不是如此。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
在整个本申请中，本发明的各种不同实施方式可能以范围的格式呈现。应当理解，采取范围格式的描述仅仅是出于方便和简洁的目的，而不应被解释为对本发明范围的刚性限制。因此，范围的描述应该被视为具体公开了该范围内的所有可能的子范围以及各个数值。例如，对从1至6的范围的描述应该被视为具体公开了子范围例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各个数字例如1、2、3、4、5和6。不论所述范围的广度如何，这一点都适用。
每当在本文中指出数值范围时，其意在包括在所指出的范围内的任何引用的数值(分数或整数)。短语“在第一指示数字与第二指示数字之间的范围”和“从第一指示数字至第二指示数字的范围”在本文中可互换使用，并且意在包括所述第一和第二指示数字以及它们之间的所有分数和整数数值。
当在本文中使用时，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知的或容易从已知方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
应当理解，为清楚起见而在分开的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特点，也可以组合提供在在单个实施方式中。相反，为简洁起见而在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特点，也可以分开地或以任何适合的子组合或在适合情况下提供在本发明的任何其他描述的实施实施方式中。在各种不同的实施方式的上下文中描述的某些特点不应被当作那些实施方式的必要特征，除非所述实施方式在没有那些要素的情况下不可操作。
上文描述的以及在权利要求书部分中提出权利要求的本发明的各种不同实施方案和方面，在下述实施例中得到实验支持。
实施例
现在参考下述实施例，所述实施例与上文的描述一起，以非限制性方式说明了本发明。
实施例1-ZEP4对炎症诱导的巨噬细胞的TNFα表达的影响
材料和方法
肽pGlu-Asn-Trp-Thr-OH(在后文中被称为“ZEP4”，SEQ ID NO：2)如上文中所述来合成。
B6巨噬细胞的TNFα表达
将源自于C57BL/6小鼠的巨噬细胞以200,000个细胞/mL的密度培养在24孔板(500μl孔)中，并在37℃和5％CO2下温育过夜。在温育后，将某些实验组中的培养基用含有100ng/mL LPS的新鲜培养基代替，然后温育3小时。然后，将某些实验组中的培养基(含LPS或不含LPS)用含有浓度在3.125至100μg/ml范围内的ZEP4的新鲜培养基代替，然后温育1小时。接下来，向适合的孔添加棕榈酸(PA，200μM)，并将板继续温育24小时，然后测量每个孔中TNFα的量。表1列出了不同的处理和对照组。处理组中TNFα生产的减少相对于用LPS和PA(CLP200)处理的细胞来计算。
结果
图1和下面的表1显示，ZEP4显著减少由用LPS和棕榈酸处理24hr的、炎症诱导的巨噬细胞所产生的TNFα的量。3.125μg/ml的ZEP4浓度导致TNFα表达降低70.6％。最有效的ZEP4浓度是50μg/ml，其导致TNFα表达降低77.0％(p<0.0001)。
表1
ZEP4浓度对用LPS和棕榈酸处理的巨噬细胞的TNFα表达的影响
Figure BDA0002769587570000241
实施例2-ZEP4对炎症诱导的巨噬细胞的TNFα表达的影响
材料和方法
肽ZEP4(SEQ ID NO：2)如上文中所述来合成。
B6巨噬细胞的TNFα表达
将源自于C57BL/6小鼠的巨噬细胞以200,000个细胞/mL的密度培养在24孔板(500μl孔)中，并在37℃和5％CO2下温育过夜。在温育后，将培养基用含有100ng/mL LPS的新鲜培养基代替，然后温育3小时。然后将处理组中的含LPS培养基用含有50μg/ml ZEP4的新鲜培养基代替，然后温育1小时。然后，向适合的孔添加棕榈酸的等分试样(100、200或400μM)。将板继续温育24小时，并测量每个孔中TNFα的量。表2列出了不同的处理和对照组。处理组中TNFα生产的减少相对于用LPS和PA处理的细胞，根据PA浓度来计算。
结果
图2和下面的表2显示，100、200和400μM的棕榈酸浓度分别诱导416、462和593pg/mL的巨噬细胞TNFα表达。在所有棕榈酸浓度下，浓度为50μg/ml的ZEP4显著降低巨噬细胞的TNFα表达(****p<0/0001)。
表2
ZEP4(50μg/ml)对用LPS(100ng/ml)和棕榈酸(100、200和400μM)处理的巨噬细胞的TNFα表达的影响
Figure BDA0002769587570000251
实施例3-ZEP3对炎症诱导的巨噬细胞的TNFα表达的影响
材料和方法
肽pGlu-Asn-Trp-Lys(辛酰基)-OH(在后文中被称为“ZEP3”，SEQ ID NO：1)如美国专利号7,220,725中所述来合成。
B6巨噬细胞的TNFα表达
将源自于C57BL/6小鼠的巨噬细胞以200,000个细胞/mL的密度培养在24孔板(500μl孔)中，并在37℃和5％CO2下温育过夜。在温育后，将某些实验组中的培养基用含有100ng/mL LPS的新鲜培养基代替，然后温育3小时。然后，将某些实验组中的培养基(含LPS或不含LPS)用含有浓度在3.125至100μg/ml范围内的ZEP3的新鲜培养基代替，然后温育1小时。接下来，向适合的孔添加棕榈酸(200μM)等分试样，并将板继续温育24小时，然后测量每个孔中TNFα的量。表3列出了不同的处理和对照组。处理组中TNFα生产的减少相对于用LPS和PA处理的细胞来计算。
结果
图3和下面的表3显示，ZEP3显著降低用LPS和棕榈酸处理的巨噬细胞的TNFα表达。在实验条件下最有效的ZEP3浓度是3.125μg/ml(TNFα表达降低82.9％；p<0.0001)。ZEP3ED50据估算为51.94μg/mL。
表3
ZEP3浓度对用LPS和棕榈酸处理的巨噬细胞的TNFα表达的影响
Figure BDA0002769587570000261
实施例4-ZEP4对尼日利亚菌素活化的巨噬细胞的IL-1β表达的影响
材料和方法
肽ZEP4(SEQ ID NO：2)如上文中所述来合成。
尼日利亚菌素活化的巨噬细胞的IL-1β表达
将源自于C57BL/6小鼠的巨噬细胞以200,000个细胞/mL的密度培养在24孔板(500μl孔)中，并在37℃和5％CO2下温育过夜。在温育过夜后，将培养基用含有100ng/mL LPS的新鲜培养基代替。3小时后，对处理孔来说，将所述含LPS培养基用含有50μg/ml ZEP4的新鲜培养基代替。温育1小时后，向ZEP4处理的孔和LPS对照孔添加尼日利亚菌素(20mM)的等分试样。将板继续温育24小时，并测量每个孔中IL-1β的量。表4列出了不同的对照和处理组。处理组中TNFα生产的减少相对于用LPS和尼日利亚菌素(LPS+N)处理的细胞来计算。
结果
图4和下面的表4显示，浓度为50μg/ml的ZEP4使尼日利亚菌素活化的巨噬细胞的IL-1β释放减少53.8％(****p<0.0001)。
表4
ZEP4对尼日利亚菌素活化的巨噬细胞的IL-1β释放的影响
Figure BDA0002769587570000271
实施例5-ZEP3对炎症诱导的巨噬细胞的生存力的影响
材料和方法
肽ZEP3(SEQ ID NO：1)如美国专利号7,220,725中所述来合成。ZEP3对用LPS和棕榈酸活化的巨噬细胞的生存力的影响
将源自于C57BL/6小鼠的巨噬细胞以200,000个细胞/mL的密度培养在24孔板(500μl孔)中，并在37℃和5％CO2下温育过夜。在温育过夜后，将培养基用含有100ng/mL LPS的新鲜培养基代替，然后温育3小时。然后将处理组中的含LPS培养基用含有浓度为50μg/ml的ZEP3的新鲜培养基代替，然后温育1小时。接下来，向适合的孔添加棕榈酸(100、200或400μM)。将板继续温育24小时，并使用LDH细胞毒性测定试剂盒估算细胞的生存力。表5列出了不同的处理和对照组。
结果
图5和下面的表5显示，在实验条件下，ZEP3对炎症诱导的巨噬细胞的生存力没有显著影响。
表5
ZEP3对用LPS和棕榈酸活化的B6巨噬细胞的生存力的影响
Figure BDA0002769587570000281
实施例6-ZEP3预处理对炎症诱导的巨噬细胞的TNFα表达的影响
材料和方法
肽ZEP3(SEQ ID NO：1)如美国专利号7,220,725中所述来合成。
B6巨噬细胞的TNFα表达
将源自于C57BL/6小鼠的巨噬细胞以200,000个细胞/mL的密度培养在24孔板(500μl孔)中，并在37℃和5％CO2下温育过夜。在温育过夜后，将培养基用含有50μg/ml ZEP3的新鲜培养基代替。在温育1小时后，向适合的孔添加100ng/mL LPS，将板继续温育24小时，然后测量每个孔中TNFα的量。
结果
下面的表6显示，在LPS诱导前用ZEP3预处理巨噬细胞导致由所述细胞生产的TNFα减少46.7％(**p<0.05)。
表6
ZEP3预处理对LPS处理的巨噬细胞的TNFα表达的影响
Figure BDA0002769587570000291
实施例7-ZEP3在角膜上皮细胞培养物干眼病模型中的抗炎效果
使用各种不同的炎性体诱导物例如LPS、4-HNE、尼日利亚菌素等建立干眼病(DED)模型，在细胞培养物模型中测试了所述肽在实验性角膜炎症中的抗炎效果。使用剂量响应模型，将人类原代角膜上皮细胞用所述肽预处理，然后暴露于DED诱导物。测量IL-6的表达以及细胞生存力、ROS生产。
材料和方法
将人类原代角膜上皮细胞(PCS-700-010；HCEC)用浓度在3至12μg/ml范围内的ZEP3处理2小时，然后暴露到LPS、4-HNE或尼日利亚菌素24小时。在温育后，测量细胞培养物中促炎性细胞因子IL-6、细胞生存力和活性氧物质(ROS)生产的水平。
结果
如图7中所示，细胞培养物中的IL-6水平从未处理的细胞培养物中的52.45±0.9121pg/mL降低到ZEP3处理的细胞中的38.08±1.368pg/mL(降低27.4％；P<0.05)。
如图8中所示，细胞培养物中的ROS水平(被报告为相对荧光单位；RFU)从未处理的细胞培养物中的27043±952RFU降低到用ZEP3处理的细胞培养物中的13000±800RFU(降低51.9％；P<0.0001)。
如图6中所示，细胞死亡密度从未处理的细胞培养物中的21.125±.942％降低到用ZEP3处理的细胞培养物中的3.625±1.092％(降低82.8％；P<0.0001)。
总而言之，所述ZEP3肽有效降低角膜炎症、恢复HCEC的生存力并减少ROS生产，这些因素在DEA严重程度中是重要的。所述结果为使用这种肽和类似肽预防和治疗由不同病理引起的DED提供了基础。
上文中的实施例1–7显示，肽ZEP3(SEQ ID NO：1)和ZEP4(SEQ ID NO：2)在炎症诱导的巨噬细胞和角膜上皮细胞中降低炎性细胞因子TNFα、IL-1β和IL-6的表达。此外，所述肽能够恢复暴露于炎性胁迫的细胞的生存力。所述结果表明，本发明的肽能够在巨噬细胞和角膜上皮细胞中有效抑制或阻止炎症。
实施例8-ZEP3、ZEP3钠盐和ZEP4对大鼠中内毒素诱导的葡萄膜炎(EIU)的效果
所述模型按照De Vos等，Exp Eye Res 61:667-675,1995来建立。在体重为180至200g的雄性Lewis大鼠中，通过足垫注射在0.1mL无菌水中稀释的200μg LPS来诱导EIU。然后将动物随机分为(4种肽)x(三种浓度)＝12个组。使用未治疗的诱导组作为诱导的对照。
在对应于EIU的峰值严重性的24小时后，使用裂隙灯活组织显微镜检查动物。使用如下所述的0至7的量表对每只眼中的临床眼部炎症进行评分：前房中的虹膜充血和细胞0-2(0＝无征兆；1＝轻度；2＝重度)，并对红肿、缩瞳和前房积脓进行评分，0为无征兆，1为存在。可能的最高评分为7(5个参数评分之和)。
实施例9-ZEP3、ZEP3钠盐和ZEP4在受控环境室(CEC)干眼病小鼠模型中的效果
所述模型建立程序描述在Barabino等(IOVS 46:2766–2771,2005)中。简单来说，将8至12周龄的BALB/c小鼠用于相对湿度(RH)、温度(T)和空气流(AF)受到调节和监测的受控环境室(CEC)中。将小鼠随机分组并用ZEP3、ZEP钠盐和ZEP4(测试肽)治疗。使用未治疗的诱导组作为对照。然后将小鼠置于CEC中，并暴露于特定的环境受控条件(RH＝18.5％±5.1％，AF＝15L/min，T＝21–23℃)3、7、14和28天。将对照小鼠保持在正常环境(RH＝50％–80％，无AF，T＝21–23℃)中同样的时间长度。利用棉线测试的泪液产生、角膜荧光素染色(分值0–15)以及上和下结膜中的杯状细胞密度，由戴口罩的观察者测量。
实施例10-ZEP3、ZEP3钠盐和ZEP4在东莨菪碱诱导的干眼病大鼠模型中的效果
使用体重在300g至350g之间的雄性Sprague-Dawley大鼠。干眼病使用东莨菪碱(Sigma-Aldrich，St.Louis,Mo.)来诱导，其通过装有东莨菪碱并皮下植入到肩胛骨之间的背部中线区域中的渗透泵(2ML4
Figure BDA0002769587570000311
CedarLane,Burlington,Ontario)连续且系统性地递送。将伤口用2-3个创伤夹封闭。在手术后以及第二天，给动物皮下注射卡洛芬(0.5mg/100g)，这是啮齿动物中的一种非甾类消炎药和强力长效镇痛剂。在泵植入手术之前和所有终点试验之前，将动物在99.9％异氟烷USP(Abraxis Bioscience,Richmond Hill,Ontario)仓室中麻醉。东莨菪碱以12.5mg/天的速率递送，并在第14天评估数据。
在盐水(0.9％)中制备0.175g/mL的东莨菪碱氢溴酸盐(Sigma-Aldrich,St.LouisMo.)的无菌溶液，并通过0.22um注射器末端过滤器(Millex-GC,Millipore Corp.,Bedford,Mass.)过滤。按照制造商的说明书，向2ML4
Figure BDA0002769587570000312
泵装入2mL 0.175g/mL的东莨菪碱溶液。
测试的大鼠眼睛组如下：第1组：对照大鼠(来自于6只大鼠的n＝12只眼)。第2组：大鼠(来自于6只大鼠的n＝12只眼)通过东莨菪碱的连续系统性给药来诱导干眼病，并在第14天获取荧光素染色的测量值。第3组：大鼠(来自于7只大鼠的n＝14只眼)通过东莨菪碱的连续系统性给药来诱导干眼病，并在第8天用盐水局部治疗一次。第4组：大鼠(来自于7只大鼠的n＝14只眼)通过东莨菪碱的连续系统性给药来诱导干眼病，并在第8天用测试肽局部治疗一次。
终点是：(i)与盐水治疗的对照相比在第13天测量到的角膜荧光素染色降低；(ii)与未处理的或东莨菪碱处理的对照相比在第13天测量到的泪液产生和泪液流通量。
实施例11-ZEP3、ZEP3钠盐和ZEP4在干燥性角膜结膜炎的兔模型中的效果
通过手术封闭泪腺排泄管并去除瞬膜、nictitans腺和哈氏腺，在8只新西兰白兔的右眼中产生干燥性角膜结膜炎(KCS)。将所有兔保持不治疗8周，并如J.Gilbard等(Ophthalmol.96:677,1978)所述，通过采集0.1-0.4μL泪液样品测量泪膜渗透压的升高来确认KCS。在防腐的等渗缓冲溶液中制备UTP或类似物的3.0mmol溶液。将兔随机分组并用ZEP3、ZEP钠盐和ZEP4(测试肽)治疗。未治疗的组被用作对照。治疗开始后，在第一次给药前从所有兔获取0.1-0.4μL泪液样品用于摩尔渗透压浓度测量。在第20周将动物处死，并通过用阿尔新蓝和高碘酸-席夫氏试剂染色来测量杯状细胞密度(D.Dartt等，Exp.Eye Res.67:27,1996)。
实施例12-在人类PBMC中的体外炎症模型中ZEP3及其钠盐(ZEP3Na)对细胞因子生产的影响
在炎症的体外人类模型中评估肽ZEP3(SEQ ID NO：1)对细胞因子生产的影响。使用脂多糖(LPS)刺激人类外周血单核细胞(PBMC)以产生细胞因子。
方法：简单来说，将未使用任何皮质类固醇或其他炎症药物的4位健康非吸烟者的低温保存的人类PBMC，在含有10％热失活胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640(完全生产培养基，CGM)中生长。
对于所有组(1-6，表7)来说，将人类PBMC融化并铺板，并在处理之前静置1小时。将细胞组用浓度为40、100和150μg/ml的测试物ZEP3(SEQ ID NO：1)或地塞米松处理1小时，然后用LPS刺激24小时。在收集上清液之前4小时添加阿拉玛蓝。在添加LPS后24小时，测量585nm处的阿拉玛蓝荧光(与细胞生存力相关)，并收集上清液用于细胞因子测定。每个组测试三份平行样。
表7
研究中使用的实验组
组 刺激(100pg/ml) 处理 处理时间安排
1 NA NA(培养基对照) NA
2 LPS NA(刺激对照) NA
3 LPS 1uM地塞米松 处理前1hr
4 LPS ZEP3(40μg/ml) 处理前1hr
5 LPS ZEP3(100μg/ml) 处理前1hr
6 LPS ZEP3(150μg/ml) 处理前1hr
详细方法：按照制造商的说明书将细胞融化，在CGM中清洗并使用锥虫兰染色评估生存力。在CGM中制备2x10^6个细胞/mL的储用溶液。向96孔黑壁板的适合的孔添加100μL所述储用溶液(每位供体一块板)，每个孔接种2x105个细胞。将细胞在37℃和5％CO2下温育1小时。向适合的孔添加100μL 2X测试物、地塞米松或1X CGM，使终体积为200μL/孔。将板在37℃和5％CO2下继续温育1小时。1小时后，向第2-9组添加20μL LPS至终体积为220μL。向第1组添加20μL IM。将细胞在37℃和5％CO2下温育20小时。在所述20小时标记时，向所有孔添加20μL阿拉玛蓝。将板在37℃和5％CO2下继续温育4小时。在LPS刺激后24小时，读板以估算细胞生存力，收获细胞培养上清液并储存在-80℃下用于细胞因子分析。将剩余的细胞用无菌PBS清洗一次。将细胞在胰蛋白酶溶液中温育以从板脱离，离心沉积并除去胰蛋白酶溶液。然后将细胞储存在-80℃，用于任选的进一步分析。使用Luminex测定法来确定在阿拉玛蓝测定后收集的上清液样品中存在的GM-CSF、IFN-g、IL-10、IL-12p40、IL-17a、IL-1β、IL-4、IL-6、RANTES和TNFα的浓度。在使用细胞因子测定法中遵循制造商的流程。针对刺激对照的平均值计算样品刺激的细胞因子生产和百分率。
结果：正如图9-12中指明的，显示出ZEP3引发炎症的主要介导物包括干扰素γ(IFNγ，图9)、IL-10(图10)、IL-1β(图11)和RANTES(图12)的显著减少，支持其抗炎效果的概念。在测量的某些细胞因子中，观察到剂量依赖性响应。在用测试的所有浓度的肽处理后，在所有供体中既没有观察到细胞生存力的显著变化也没有观察到任何趋势，表明所述肽对PBMC无细胞毒性。在所有测试的组中，IL-4和IL-17a水平低于检测极限。
细胞因子生产的减少与ZEP3直接相关，证实了ZEP3在人类血细胞中的抗炎效果。
实施例13-体内特应性皮炎模型
在噁唑酮诱导的特应性皮炎(AD)小鼠模型中评估了ZEP3(SEQ ID NO：1)及其钠盐形式(ZEP3Na)和ZEP4(SEQ ID NO：2)的局部给药的效果。作为用于评估在人类中用于AD疗法的药物的接受的动物模型，这个模型被广泛使用并在文献中充分描述(Avci等，2013Expert Opin Drug Discov.8,331-355；Petersen T.K.2006,BasicClin.Pharmacol.Toxicol.99,104-115)。
方法：在第0天，在将动物剃毛和脱毛后，通过在背部上局部给药2％噁唑酮的乙醇溶液将所述动物敏化(致敏阶段)。然后在一周后，通过每两天在背部和右耳上局部给药1％噁唑酮的乙醇溶液共10次，即总共3周，进行激惹。在所述激惹阶段中，每两天通过局部途径将所述测试化合物作为即用型霜剂制剂施用。施用的表面与用于激惹的表面相同(背部+耳部)。在背部上施加100μL并轻柔按摩背部。然后，将指套上的剩余制剂施加到耳的内侧面。每隔一天使用卡尺测量背部皮肤和耳的厚度，并从背部皮肤记录下述临床评分：红斑和鳞屑。动物也每隔一天进行称重(在开始时小鼠的近似体重为约20g)。在第8、18和28天获取背部皮肤区的校准的数字图片。在第28天实验结束，对动物采血并分离血浆样本。在安乐死的动物上收集右耳和背部皮肤样品，并在-80℃下冷冻(来自于背部皮肤的样本和血浆)或保持在福尔马林中(背部皮肤和右耳样品)，用于进一步分析。表8描述了给药组。
表8
在AD模型中测试的实验组
Figure BDA0002769587570000351
*对于每只动物来说在100μl体积中。
用于测试化合物的局部给药的制剂是：
ZEP3 1％霜剂，具有pH 7.1并包含：丙二醇，聚山梨酸酯80，依地酸二钠，二氧化硅(syloid)，对羟基苯甲酸甲酯，白凡士林，肉豆蔻酸异丙酯，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯。
ZEP3Na 1％霜剂，具有pH 8.0并包含：丙二醇，聚山梨酸酯80，依地酸二钠，二氧化硅(syloid)，对羟基苯甲酸甲酯，白凡士林，肉豆蔻酸异丙酯，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯。
ZEP4 1％霜剂，具有pH 4.5并包含：丙二醇，甘油，聚山梨酸酯80，EDTA二钠，黄原胶，二氧化硅(syloid)，对羟基苯甲酸甲酯，白凡士林，肉豆蔻酸异丙酯，鲸蜡醇，硬脂醇和单硬脂酸甘油酯(kolliwax)。
结果：以50mg/kg给药到特应性皮炎诱导小鼠的测试化合物ZEP3、ZEP3Na和ZEP4均被良好耐受。所有肽都显著减少特应性皮炎的临床病损、背部皮肤厚度(图13A和13B)、耳厚度(图14A和14B)和红斑(图15A和15B)。在用ZEP3治疗的小鼠(图16A)中从第18至24天和用ZEP3Na(图16A)或ZEP4(图16B)治疗的小鼠中从第14至24天鳞屑减少，指示了延迟的效果。与赋形剂相比，用ZEP3、ZEP3Na或ZEP4治疗的小鼠的体重表现正常(图17A和17B)。
详细来说，对ZEP3、ZEP3Na和ZEP4来说体重在研究的前几天中相当稳定，并在第28天显示出约3-4％的增加(图17A和17B)。对于用倍他米松治疗的组来说，正如预期，观察到约8-10％的体重减轻。
除了倍他米松治疗的小鼠之外，在研究的前几天中背部皮肤厚度增加，然后保持相当稳定直至研究结束(图13A和13B)。在第28天，注意到对于给药赋形剂的阴性对照组来说110％左右的增加，对于给药ZEP3 1％的第3组来说90％的增加，对于给药的ZEP3Na 1％的第4组来说105％的增加，以及对于给药ZEP4 1％的第5组来说90％左右的增加，而对给药倍他米松的第2阳性对照组来说注意到40％的减少。所有治疗组(第3、4和5组)图示出一种趋势，显示出背部皮肤厚度小于第1阴性对照组。对于ZEP3来说，在第20(-25.5％)和24(-16.6％)天显现出与对照组1相比背部皮肤厚度的显著差异。对于ZEP4来说，在第14天显现出与对照组1相比背部皮肤厚度的显著差异(-13.5％)。
右耳厚度：正如使用这种模型通常观察到的，所有组从前几天直至研究结束均表现出重要的增厚，只有阳性对照组2例外，其在所有研究过程中仅表现出约15-20％的略微增加(图14A和14B)。对于ZEP3来说在第20、22和28天(与对照相比-10.1至-18.0％)、对于ZEP3 Na来说在第18、20和22天(与对照相比-18.4至-22.7％)和对于ZEP4来说在第20、22和28天(与对照相比-12.3至-16.0％)，显现出显著差异。
对于阴性对照组(第1组)来说，红斑评分在第16天最大，然后轻微降低直至第26-28天为0。为测试组3、4、和5记录的红斑评分与阴性对照组1相近(图15A和15B)。对于ZEP3来说在第22和24天、对于ZEP3Na来说在第24天和对于ZEP4来说在第12、16、22和24天，显示出显著差异。
鳞屑评分在前几天逐渐提高，然后在研究的第二部分略微下降并保持相当稳定(图16A和16B)。所有治疗组3、4和5从第14天至第28天表现出低于阴性对照组1的鳞屑评分。
对于治疗组3、4和5来说，从第14天至第28天总评分(红斑和鳞屑评分之和)也低于阴性对照组1。对于ZEP3来说在第20、24和28天、对于ZEP3Na来说在第14、18、20和22天以及对于ZEP4来说在第12-20、24和28天，显示出总评分的显著差异。
结论：以50mg/kg给药到特应性皮炎诱导小鼠的化合物ZEP3和ZEP4及其钠盐被良好地耐受，并显著减少特应性皮炎的临床病损，正如由背部皮肤厚度、耳厚度、红斑和鳞屑的减少所示。
实施例14.用ZEP3治疗腕掌骨关节炎(CMC关节炎)
一位75岁的男性对象被骨科医生诊断为大脚趾具有CMC类型的关节炎。他的脚趾肿胀、发红并且非常疼痛，以至于阻止他行走。
将0.5％的ZEP3钠盐霜剂每天5次施用在肿胀区上。所述对象在治疗的一天之内报告了缓解，并且在3-4天之内病症消退。
实施例15.在人类角化细胞中ZEP3和ZEP3Na肽对TNFα分泌的影响
TNFα是角化细胞中的主要促炎性介导物。通过测量所述化合物对TNFα水平的影响来测试它们的抗炎效果。
方法：将SCCE020细胞(EpiGROTM人表皮角化细胞)在完全生长培养基(EpiGROTM人角化细胞完全培养基；Millipore目录号SCMK001)中生长共4次传代。在第5次传代时，将细胞一式三份接种(3*105个细胞/孔)在每孔1ml体积的完全生长培养基中。另外的3个对照孔只含有培养基而没有细胞。在贴壁后，将细胞培养基更换为不含增补剂的含有L-谷氨酰胺的基础培养基(饥饿培养基)，并将细胞饥饿过夜。第二天，在接种后24小时，将细胞用ZEP3或ZEP3Na或适合的稀释剂(PBS或DMSO)处理。在温育4小时后，以20或30μg/ml的终浓度向所述孔添加LPS(来自于大肠杆菌055:B5；Sigma目录号L6529-1MG)。实验组(每种处理3个孔)概述在表9中。
将细胞在组织培养箱中温育24小时。在从所有孔收集细胞上清液后，将来自于治疗组1、2、3、8、9、10、13、14(不包括DMSO组)的细胞离心沉积，并储存在-80℃用于进一步分析。细胞如下所述进行收集：在收集上清液后，将孔用胰蛋白酶漂洗，然后与胰蛋白酶温育直至它们从板表面脱离，离心，用PBS清洗，并作为细胞沉积物储存。上清液中的TNF-α浓度通过ELISA(Quantikine HS ELISA；R&D Systems目录号HSTA00D)一式五份进行测量。
结果：ZEP3和ZEP4有效地降低人类角化细胞培养物中的TNFα水平。样品中的TNFα浓度按照标准曲线趋势线方程来计算：OD＝0.063x+0.1718。每个处理组中TNFα生产的抑制百分数与相应的对照组(相同条件，不含肽)相比来计算。结果概述在表9中。
表9
实验条件、结果和分析
Figure BDA0002769587570000381
&无细胞
*每个样品的变化倍数是针对#2样品中的TNF-α浓度。
**对于每个样品(阵列1)来说，针对该样品的对照(阵列2)使用Microsoft EXCEL函数来进行t-检验。用于t-检验的参数：双尾分布，未配对t检验，不等方差。使用相同的对照参比样品来计算TNF-α分泌的抑制百分数。
结论：通过ELISA进行的定量测试证实了与用单独的LPS刺激的细胞所分泌的量相比，在LPS处理的人类角化细胞中ZEP3或ZEP3Na对TNF-α生产的剂量依赖性抑制。
尽管本发明已结合其特定实施方式进行了描述，但是显然，对于本领域技术人员而言许多替代、修改和变化将是显而易见的。因此，打算涵盖落于权利要求书的精神和广泛范围内的所有这样的替代、修改和变化。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本说明书，其程度等同于具体且个别地指示将每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文。另外，本申请中任何参考文献的引用或标识均不应被解释为承认该参考文献可用作本发明的先有技术。在使用小节标题的情况下，不应将它们解释为必然的限制。
序列表
<110> S.I.S舒洛夫创新科学有限公司
<120> 用于抑制炎性细胞因子的药物组合物
<130> SIS001PCT
<150> US 62649940
<151> 2018-03-29
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> pyroglutamic acid (pGlu)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> C8 alkyl attached to the epsilon amine of the Lysine side chain
to form Lys(Octanoyl)
<400> 1
Glu Asn Trp Lys
1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> pyroglutamic acid (pGlu)
<400> 2
Glu Asn Trp Thr
1

Claims (42)

1.一种药物组合物，其包含可药用载体和根据式I：pGlu-X1-X2-X3-OH所述的肽或其可药用盐或衍生物作为活性成分，其中X1选自Asn和Thr；X2选自Trp、Phe和Tyr；并且X3选自Lys、Lys衍生物和Thr，所述药物组合物用于减少至少一种炎性细胞因子的释放或抑制其活性。
2.根据权利要求1所述使用的药物组合物，其中所述至少一种炎性细胞因子选自：干扰素γ(IFNγ)、白介素1β(IL-1β)、白介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、和白介素6(IL-6)。
3.根据权利要求1所述使用的药物组合物，其中所述至少一种炎性细胞因子选自：TNFα、IL-1β和IL-6。
4.一种药物组合物，其包含可药用载体和根据式I：pGlu-X1-X2-X3-OH所述的肽或其可药用盐或衍生物作为活性成分，其中X1选自Asn和Thr；X2选自Trp、Phe和Tyr；并且X3选自Lys、Lys衍生物和Thr，所述药物组合物用于减少至少一种炎性介导物或趋化因子的释放。
5.根据权利要求4所述使用的药物组合物，其中所述至少一种炎性介导物或趋化因子选自活性氧物质(ROS)和RANTES(活化后调控正常T细胞表达和可能分泌的趋化因子)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述肽衍生物包含连接到所述肽的侧链氨基或末端氨基的烷基。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述烷基通过酰胺键连接。
8.根据权利要求6或7所述的药物组合物，其中所述烷基是C4至C30烷基。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述烷基是C8烷基(辛酰基)，并通过酰胺键连接到Lys残基的侧链。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述肽选自pGlu-Asn-Trp-Lys(辛酰基)-OH(SEQ ID NO：1)和pGlu-Asn-Trp-Thr-OH(SEQ ID NO：2)及其可药用盐和衍生物。
11.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述肽具有SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列。
12.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述肽具有SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其具有约4至约8范围内的pH。
14.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其被配制成用于选自以下的给药途径：局部给药、眼部给药、口服给药、鼻部给药和肠胃外给药。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其用于局部给药，其中所述组合物被配制成霜剂、软膏、糊剂、洗剂、凝胶或采取滴眼液的形式。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其被配制成包含0.1-5％w/w的所述肽、衍生物或可药用盐的霜剂。
17.根据权利要求15所述的药物组合物，其用于给药到具有眼部疾病或损伤的对象。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其被配制成选自以下的形式：用作滴眼液的液体溶液或悬液、乳液、霜剂、软膏、喷剂、凝胶和玻璃体内注射剂。
19.根据权利要求17或18所述的药物组合物，其中所述眼部疾病或损伤是选自以下的炎性疾病或障碍：葡萄膜炎、干眼综合征、与感染性眼病相关的炎性症状、过敏性眼病、角膜炎、结膜炎、睑板腺功能障碍和与干燥综合征相关的眼部症状。
20.根据权利要求14所述的药物组合物，其用于给药到具有炎性自身免疫性疾病或障碍的对象。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述自身免疫性疾病或障碍选自类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、幼年特发性关节炎和狼疮。
22.根据权利要求14所述的药物组合物，其用于给药到具有炎性肠病的对象。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述炎性肠病选自克罗恩病和溃疡性结肠炎。
24.根据权利要求14所述的药物组合物，其用于给药到具有肺部炎性疾病或障碍的对象。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述肺部炎性疾病或障碍选自哮喘、支气管炎、胸膜炎、肺泡炎、血管炎、肺炎、慢性支气管炎、支气管扩张、弥漫性泛细支气管炎、超敏性肺炎、特发性肺纤维化和囊性纤维化。
26.根据权利要求14所述的药物组合物，其用于给药到具有耳部炎性疾病或障碍的对象。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述耳部炎性疾病或障碍选自与耳部感染相关的炎性症状、中耳炎、外耳炎、乳突炎和耳乳突炎。
28.一种减少至少一种炎性或促炎性细胞因子的释放或抑制其活性的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的根据式I：pGlu-X1-X2-X3-OH所述的肽或其可药用盐或衍生物，其中X1选自Asn和Thr；X2选自Trp、Phe和Tyr；并且X3选自Lys、Lys衍生物和Thr。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述至少一种炎性细胞因子选自：干扰素γ(IFNγ)，白介素1β(IL-1β)，白介素10(IL-10)，肿瘤坏死因子α(TNFα)和白介素6(IL-6)。
30.一种减少炎性介导物或趋化因子的释放的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的根据式I：pGlu-X1-X2-X3-OH所述的肽或其可药用盐或衍生物，其中X1选自Asn和Thr；X2选自Trp、Phe和Tyr；并且X3选自Lys、Lys衍生物和Thr。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述炎性介导物或趋化因子选自ROS和RANTES。
32.一种治疗选自眼部炎性疾病或障碍、耳部炎性疾病或障碍、肺部炎性疾病或障碍、肠炎性疾病或障碍或炎性自身免疫性疾病或障碍的炎性疾病或障碍的方法，所述方法包括向需要的对象给药治疗有效量的根据式I：pGlu-X1-X2-X3-OH所述的肽或其可药用盐或衍生物的步骤，其中X1选自Asn和Thr；X2选自Trp、Phe和Tyr；并且X3选自Lys、Lys衍生物和Thr，由此治疗所述炎性疾病或障碍。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中给药通过选自局部、眼部、口服、鼻部和肠胃外给药的途径。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述眼部炎性疾病或障碍选自葡萄膜炎、干眼综合征、与感染性眼病相关的炎性症状、过敏性眼病、角膜炎、结膜炎、睑板腺功能障碍和干燥综合征。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述炎性自身免疫性疾病或障碍选自类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、幼年特发性关节炎、干燥综合征和狼疮。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述肠炎性疾病或障碍选自克罗恩病和溃疡性结肠炎。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述肺部炎性疾病或障碍选自哮喘、支气管炎、胸膜炎、肺泡炎、血管炎、肺炎、慢性支气管炎、支气管扩张、弥漫性泛细支气管炎、超敏性肺炎、特发性肺纤维化和囊性纤维化。
38.根据权利要求32所述的方法，其中所述耳部炎性疾病或障碍选自与耳部感染相关的炎性症状、中耳炎、外耳炎、乳突炎和耳乳突炎。
39.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，其中所述肽衍生物包含通过酰胺键连接到所述肽的侧链氨基或末端氨基的烷基。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述烷基是C4至C30烷基。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述烷基是连接到Lys残基的侧链的C8烷基(辛酰基)。
42.根据权利要求28至38中任一项所述的方法，其中所述肽选自SEQ ID NO：1的肽、SEQID NO：2的肽及其盐和衍生物。
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