TW202235430A

TW202235430A - 短合成胜肽及其用於治療乾眼症之用途

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Publication number: TW202235430A
Application number: TW110107250A
Authority: TW
Inventors: 曹友平; 何宗權
Original assignee: 台灣基督長老教會馬偕醫療財團法人馬偕紀念醫院
Priority date: 2021-03-02
Filing date: 2021-03-02
Publication date: 2022-09-16
Also published as: TWI776410B

Abstract

本發明揭示一種合成胜肽，以及包含所述合成胜肽用以治療乾眼症(dry eye disease, DED)的藥學組合物。本發明亦揭示一種藉由對一亟需治療之個體投予一有效量含有本發明合成胜肽之藥學組合物以治療乾眼症的方法。

Description

短合成胜肽及其用於治療乾眼症之用途

本揭示內容關於發現一種短合成胜肽對αv整聯蛋白(αv integrins)具有拮抗活性，因此有助於治療或預防乾眼症(dry eye disease, DED)。

乾眼症(DED)是一種眼睛表面的多因子障礙(multifactorial disorder)，其特徵為不適、視覺障礙(visual disturbance)、淚液減少及慢性發炎症狀。淚液分泌的減少及/或淚液蒸發的增加導致淚膜(tear film)不穩定及高滲透壓淚液(tear hyperosmolarity)，都和乾眼症的眼部表面發炎及角膜上皮損傷相關。就目前而言，類固醇抗發炎藥劑為大部分眼科醫生常開的處方。儘管類固醇抗發炎藥劑能有效治療乾眼症，但是導致青光眼(glaucoma)及白內障(cataract)的風險亦不容忽視。外用環孢素(cyclosporine)需要花費數個月才會開始發揮功效，且僅對15 %的病患有效。據此，在治療乾眼症的相關領域中仍存在著未滿足的醫療需求。

整聯蛋白為一種αβ異二聚體的跨膜受體，藉由和各種胞外配體(如，玻連蛋白(vitronectin, VTN))交互作用執行廣泛的功能。1984年，Pierschbacher及Ruoslahti指出Arg-Gly-Asp(RGD)為纖網蛋白(fibronectin)之細胞附著域(cell attachment domain)之關鍵序列。隨後，發現到所述RGD序列在其他細胞外間質(extracellular matrix, ECM)蛋白中促進細胞附著及遷移，所述ECM蛋白包括VTN、溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)、骨橋蛋白(osteopontin)及層連結蛋白(laminin)。另外，八種整聯蛋白(包含αv-RGD整聯蛋白(αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8)、α5β1、α8β1及血小板受體αIIbβ3)被認為是辨認小RGD三肽(tripeptide)之細胞表面受體。也發現整聯蛋白涉及各種不同的致病機制。舉例來說，在新生的血管中上調節整聯蛋白αvβ3以調節內皮細胞存活、增生及血管通透性。此外，αv整聯蛋白也在不同的疾病模式中被研究。舉例來說，αvβ3整聯蛋白在動脈粥漾硬化斑(atherosclerotic plaque)中活化的巨噬細胞內被高度表現；然而，正常主動脈中靜止的巨噬細胞內αvβ3整聯蛋白的表現量極少。此外，在肝臟星狀細胞(hepatic stellate cell, HSCs)中耗盡αv整聯蛋白可保護小鼠免於肝纖維化，然而單獨耗盡β次單元(subunit)則不具有此功效。

發明人意外發現αv整聯蛋白涉及巨噬細胞相關的發炎反應及乾眼症的致病機制，因此設計及合成以RGD為基礎的胜肽作為αv整聯蛋白的拮抗劑。據此，本揭示內容以RGD為基礎的新穎合成胜肽是有潛力發展為治療DED的候選藥物。

本揭示內容整體關於一種新穎的合成胜肽、包含所述新穎合成胜肽的藥學組合物、以及/或是藉由使用所述新穎合成胜肽用於治療乾眼症(dry eyes disease, DED)的方法。

據此，本揭示內容第一態樣旨在提供一種能夠拮抗αv整聯蛋白(αv integrins)的短合成胜肽。所述合成胜肽具有通式(I)之胺基酸序列： RGDX _aaD (I) 其中，R為精胺酸；G為甘胺酸；D為天門冬胺酸；且X _aa為一D式胺基酸，係選自由異白胺酸(I)及苯丙胺酸(F)所組成之群組。

依據本揭示內容的實施方式，通式(I)之合成胜肽可為線性或環狀形式。

在某些實施方式中，通式(I)之合成胜肽為線性形式，且該通式(I)之合成胜肽胺基酸序列之N端經乙醯化(acetylated)而其C端經醯胺化(amidated)。在優選的實施例中，該通式(I)之合成胜肽具有與序列編號：10至少80%相同的一胺基酸序列。

在某些實施方式中，通式(I)之合成胜肽為頭接尾(head-to-tail)環狀形式，且具有與序列編號：16或18至少85%相同的一胺基酸序列。

本揭示內容第二態樣旨在提供一種適用於治療乾眼症的藥物及/或藥學組合物。所述藥物或藥學組合物包含前述合成胜肽及一藥學上可接受的載體。

在某些實施方式中，所述合成胜肽為線性形式，並且具有與序列編號：10至少85%相同的一胺基酸序列。

在某些實施方式中，所述合成胜肽為環狀形式，並且具有與序列編號：16或18至少80 %相同的一胺基酸序列。

替選地或非必要地，該合成胜肽在製備成一藥物及/或一藥學組合物前，可被封裝或包埋在一遞送賦形劑中。在不同態樣中，該遞送賦形劑可為微脂體、溶酶體、微膠囊或奈米粒子。

依據本揭示內容的實施方式，所述藥物及/或藥學組合物為液體、凝膠、乳膏或軟膏形式。

本揭示內容的第三態樣係關於一種治療患有乾眼症之個體的方法。所述方法包含對該個體投予一有效量之本揭示內容所述藥物或藥學組合物的步驟，以改善或減輕乾眼症相關症狀。

依據本揭示內容的實施方式，本揭示內容的藥物或藥學組合物可經由口服、腸內、直腸、肺部(例如：吸入)、鼻用、外用(包括經皮、經頰及舌下)、膀胱內、水晶體內、結膜下、腹腔內、陰道、腦遞送(例如：腦室及大腦內)、中樞神經系統遞送(例如：鞘內、脊柱旁及脊椎內)或非經腸胃道(例如：皮下、肌內、靜脈內及皮內)、透黏膜(transmucosal)給藥，或是經由移植或本發明技術領域習知的其他遞送途徑投予至該個體。

依據本揭示內容的實施方式，是對該個體投予每公斤0.001-1500毫克之量的本揭示內容藥物或藥學組合物；較優選地，是以每公斤0.1-1200毫克之量；更優選地，是以每公斤15-500毫克之量投予至該個體。

在所有實施方式中，該個體為人類。

以下的說明闡述本發明詳細的實施方式。從以下的實施方式及申請專利範圍，本發明的其他特徵及優點將更清楚。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

1. 定義

為方便起見，在此列出本揭示內容中某些用於內文的詞彙。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

本文所使用之詞彙「胜肽」表示一胺基酸殘基的聚合物。本文所使用之「合成胜肽」一詞，是指一胜肽，其不包含一完整的天然蛋白質分子。胜肽是「合成的」，因為它可藉由利用諸如化學合成、重組基因學技術或全抗原斷裂法等相似技術經人為干預而製成。在整個本揭示內容中，一胜肽中任一種特定胺基酸殘基的位置皆從該胜肽的N端開始編號。當胺基酸不以D式或L式胺基酸命名時，該胺基酸為一L式胺基酸或可為一D式或L式胺基酸，除非內文限定一特定異構物。且，本文中所使用於多肽胺基酸殘基之記號是本發明所屬領域中慣用的縮寫。

如本揭示內容所討論，胜肽胺基酸序列中的些微變化是被預期涵蓋於本揭示內容及要求保護的發明概念中，所在胺基酸序列中提供的變異維持至少70 %的相似度，像是維持至少70 %、71 %、72 %、73 %、75 %、75 %、76 %、77 %、78 %、79 %、80 %、81 %、82 %、83 %、84 %、85 %、86 %、87 %、88 %、89 %、90 %、91 %、92 %、93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %及100 %之相似度。本文所界定的相對於合成胜肽的序列的胺基酸序列相似度百分比(%)(或同一性百分比)是定義為，一候選序列的胺基酸殘基相同於一特定胜肽序列之胺基酸殘基的百分比，若有需要，是先將序列對齊(aligning)並導入間隙(gap)，以達到最大百分比的序列相似度，且不考慮任一種保守性置換作為序列同一性的一部分。可藉由相關領域已知的多種方法來達致決定序列相似度百分比之旨的比對(alignment)，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等。本領域技術人員可以決定適合比對時所使用的參數，包含在比對全長序列時，欲實現最大比對結果所需的任一種演算法。為了本文的目的，在兩個胺基酸序列之間的序列比較是藉由國家生物技術資訊中心(NCBI)提供之電腦程式Blastp (protein-protein BLAST)進行。藉由以下通式：

% 計算一給定的胺基酸序列A和另一給定的胺基酸序列B的胺基酸序列相似度百分比(也可被表述為一給定的胺基酸序列A具有一相對於一給定胺基酸序列B特定百分比的胺基酸序列相似度)。其中X係序列比對程式BLAST在該程序對A和B的比對中評分為相同匹配的胺基酸殘基數目，而Y係A或B的胺基酸殘基總數，以較短者為準。

可專一性地修飾本揭示內容合成胜肽以改變無關乎其生理活性之胜肽特徵。舉例來說，在本發明中，可改變及/或剔除該胜肽的某些胺基酸而不影響其生理活性(亦即，其拮抗αv整聯蛋白的能力)。具體而言，可預期保守性胺基酸的置換。可藉由測定該胜肽衍生物的比活性(specific activity)輕易確定胺基酸變化是否會導致功能性胜肽。本發明所屬技術領域具有通常知識者能夠輕易製備胜肽的片段或類似物。優選的片段或類似物的胺基及羧基端發生在接近功能域的邊界。在某些實施例中，本揭示內容合成胜肽的胺基酸殘基保守地置換成其D式胺基酸殘基，例如，L式苯丙胺酸(F)及L式異白胺酸(I)分別置換成對應的D式殘基。

本文所述「治療」(treatment)一詞係指得到所欲的藥學及/或生理學效果；例如，針對αv整聯蛋白的拮抗作用。上述的效果是指能夠部分或完全地治癒或預防個體出現所述疾病的症狀。所述「治療」包含預防、治療或減緩一哺乳類的疾病，尤其是人類。所述治療包含：(1)預防(如，預防用藥)、治療或減緩一個體的疾病或症狀(例如，視網膜變性或組織損傷)，其中所述個體可能患有疾病但尚未被診斷；(2)抑制一疾病(例如，阻止疾病發展)；或(3)治癒一疾病(例如，減少與所述疾病相關的症狀)。

本文所述「施用」、「投予」或「給藥」(administered/administering/administration)一詞係指一種投藥方式，其包含，但不限於，靜脈內(intraveneously)、肌內(intramuscularly)、腹膜內(intraperitoneally)、動脈內(intraarterially)、顱內(intracranially)或皮下(subcutaneously)給予本揭示內容的製劑(例如：化合物或組合物)。在某些實施方式中，本揭示內容的合成胜肽及/或其類似物可配製成點眼劑以直接施用於角膜表面。在其他實施方式中，本揭示內容的合成胜肽可配製成皮膚軟膏或乳液以直接施用在皮膚上。在進一步的實施方式中，本揭示內容的合成胜肽配製成粉末用以於使用前(像是靜脈注射之前)與適當的載體(例如：緩衝溶液)混合。

本文所述「一有效量」(an effective amount)係指一成分的用量、劑量和投予的期間，足以達成有關疾病治療的期望結果。舉例來說，在乾眼症的治療中，可減少、預防、延緩、抑制或遏制任一種乾眼症的症狀的一製劑(亦即，一化合物、一合成胜肽、或可編碼本揭示內容治療性胜肽的一核酸)則為有效的。一製劑的有效量不必然能夠治癒一疾病或症狀，但能提供一疾病或病症的治療，使得該疾病或病症的發生被延緩、阻斷或預防，或是該疾病或症狀相關的病徵可被延緩。所述有效量可以合適的形式分成一、二或更多劑量，以在一指定期間內投予一次、二次或更多次。

本文所述「個體」(subject)或「患者」(patient)一詞可交互使用，係旨在指可藉由本揭示內容的合成胜肽及/或方法進行治療的一哺乳動物(包括人類)。所述「哺乳類」涵蓋哺乳綱的所有成員，包括人類、靈長類動物、家畜及農畜，像是兔子、豬、綿羊及牛；以及動物園圈養動物、競賽用動物或寵物；以及囓齒類，像是小鼠及大鼠。再者，除非具體指出性別，所述「個體」或「病患」在此係指雄性及雌性。據此，所述「個體」或「病患」包含任一種可自本揭示內容的治療方法獲益的哺乳類。一「個體」或「病患」的實施例包含，但不限於：人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、豬、羊、牛、馬、狗、貓、鳥及禽類。在一例示性實施方式中，該病患為人類。

雖然闡述本發明較廣範圍的數值範圍及參數皆為近似值，但在具體實施例中設定的該數值已盡可能精準地呈現。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10 %、5 %、1 %或0.5 %之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

除非內文有明確說明，在本文使用的單數形式「一」、「以及」及「該」皆包含複數形式。

2. 具體實施方式

本揭示內容至少部分是基於短合成胜肽能夠拮抗αv整聯蛋白之發現。據此，本發明提供一種用於治療及/或預防乾眼症之方法以及包含該新鑑定合成胜肽的組合物。

2.1 本揭示內容合成胜肽

本揭示內容的短合成胜肽由通式(I)闡述的胺基酸序列組成： RGDX _aaD (I) 其中，R為精胺酸；G為甘胺酸；D為天冬胺酸；且X _aa為一D式胺基酸，係選自由異白胺酸(I)及苯丙胺酸(F)所組成之群組。

依據本揭示內容的實施方式，通式(I)之合成胜肽可為線性或頭接尾環狀形式。

在某些實施方式中，通式(I)之合成胜肽為線性形式，且通式(I)之合成胜肽胺基酸序列之N端及C端分別被乙醯化及醯胺化。在較優選的實施例中，通式(I)之合成胜肽具有序列編號：10的胺基酸序列。

在其他實施方式中，通式(I)之合成胜肽為頭接尾環狀形式，且具有序列編號：16或18的胺基酸序列。

本揭示內容的合成胜肽詳細列於表1。

表1：合成胜肽

胜肽名稱	胺基酸序列	序列編號
	線性
RGDfD	NH ₂-Arg-Gly-Asp-d(Phe)-Asp-COOH	10
	環狀
C(RGDiD)	環狀(Arg-Gly-Asp-d(Ile)-Asp)	16
C(RGDfD)	環狀(Arg-Gly-Asp-d(Phe)-Asp)	18

任一序列中小寫字母表示該特定胺基酸為D式胺基酸。

依據較優選的實施方式，通式(I)之合成胜肽的第四個胺基酸殘基必為D式胺基酸，否則該合成胜肽會失去對αv整聯蛋白的拮抗活性。

無論呈線性或環狀形式，都可依據本領域中任一種標準胜肽合成程序合成本揭示內容的合成胜肽。舉例來說，可藉由在胺基酸間形成胜肽鍵結的常規程序來輕易合成線性胜肽。舉例來說，前述常規程序包含任一種可容許具有被保護的羧基及其他反應基的一胺基酸殘基的游離阿伐(alpha)胺基與具有被保護的胺基或其他反應基之另一個胺基酸殘基的游離初級羧基之間有一縮合反應的溶液相方法。在一較優選的常規程序中，可依據本發明領域具有通常知識者熟知的方法藉由固相合成(solid-phase synthesis)及純化來合成本揭示內容的胜肽。任何一種採用各種不同的樹脂及試劑的數種本領域熟知的方法都可被用於製備本揭示內容的胜肽。可藉由將所需序列的每個胺基酸殘基一次一個加至另一個胺基酸殘基的方式，或是藉由先將所需胺基酸序列的胜肽片段以常規程序合成，再利用縮合反應合成所需胜肽的方式，來進行胜肽的合成。優選地，可根據製造商的標準流程，使用固相胜肽合成儀(ABI433A胜肽合成儀；Applied Biosystems Inc.；Life Technologies Corp.；Foster City, CA, USA)進行合成。在此方法中，依據固相合成法的一般性原則，可藉由一次一個依序將目標胺基酸殘基合併至延長中的胜肽鏈上，以進行胜肽的合成。

至於合成環狀胜肽，則是先藉由上述方式合成一胜肽，接著將該胜肽進行環化以產生本揭示內容的環狀胜肽。可採用任何環化的方法。在某些實施方式中，該胜肽可在自胜肽樹脂(peptide resin)截切之前先進行環化。對於在反應側鏈基團(moietiy)部分存在下的環化，該側鏈是被保護住的，而該胜肽懸浮在添加有一環化耦合試劑的合適溶劑中。合適溶劑的實例包含二甲基甲醛(dimethyl formaldehyde, DMF)、二氯甲烷(dichloromethane, DCM)或1-甲基-2-吡咯酮(1-methyl-2-pyrrolidone, NMP)。合適的環化耦合試劑之實例包含2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate, TBTU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HBTU)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲胺基)磷六氟磷酸鹽(benzotriazole-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafiuorophosphate, BOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三(咯啶)磷六氟磷酸鹽(benzotriazole-1-yl-oxy-tris(pyrrolidino)phosphoniumhexafluorophosphate, PyBOP)、2-(7-氮-1H-苯并三唑-1-基)-1(2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-yl)-1)、四甲基脲四氟硼酸(1,3,3-tetramethyturonium tetratluoroborate, TATU)、2-(2-側氧基-1(2H)-吡啶基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(2-(2-oxo-1(2H)-pyridyl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate, TPTU)或N,N'-二環己基碳二亞胺/羥基苯并三唑(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide /i-hydroxybenzotriazole, DCCl/HOBt)。藉由合適的鹼常規地開始進行耦合，例如，N,N-二異丙基乙胺(N,N-diisopropylethylatnine, DIPEA)、2,4,6-三甲基吡啶(2,4,6-trimethyl pyridine)或N-甲基嗎啉(N-methylmorpholine, NMM)。所述環化胜肽可接著利用任何合適的試劑自固相截切，合適的試劑像是在DCM中的乙胺或不同藥劑的組合，例如，三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)、三異丙基矽烷(tri-isopropylsilane, TIS)、二甲氧基苯(dimethoxybenezene, DMB)、水及其類似物。乾燥該所得粗合成胜肽，若有殘留胺基酸側鏈保護基，則可利用任一種適當的試劑(例如，存在水中的TFA、TIS、2-巰基乙醇(2-mercaptopethane, ME)及/或1,2-乙二硫醇(1,2-ethanedithiol, EDT))進行截切。可藉由加入冰乙醚沉澱並過濾收集終產物。使用一適當的管柱(例如：C18管柱)，藉由逆相高效液相色層層析法(reverse phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)進行最終純化，或是也可採用其他分離或純化的方法，像是基於胜肽的大小或電荷進行分離或純化的方法。一旦純化後，該胜肽可藉由任一種方法定性，例如，高效液相色層層析法(high performance liquid chromatography, HPLC)、胺基酸分析、質譜法及其他類似方法。依上述方法製備的胜肽可依據以下操作實例所述之方法測試其活性。

雖然已經先描述利用固相芴甲氧羰基(Fmoc)化學合成的方法進行合成，可理解的是其它化學物及合成方法都可用以製造本發明環狀胜肽，像是藉由實施例之方法但不限於，叔丁氧羰基(Boc)化學合成法、溶液化學合成法及其它化學物及合成方法。

本發明的線性合成胜肽之N端或C端可進行修飾。N端修飾的實施例包含，但不限於，N-醣基化(N-glycated)、N-烷基化(N-alkylated)及N-乙醯化(N-acetylated)胺基酸。一終端修飾包含聚乙二醇化(pegylation)。C端修飾的實施例為一C端醯胺化胺基酸。在可任選的實施方式中，一或多個胜肽鍵結可置換成一非胜肽鏈，且可透過能夠與選定側鏈或終端殘基反應的試劑處理以修飾個別的胺基酸基團。

不同官能基也可加到所述合成胜肽中容易受化學修飾影響的不同位置。官能基可以被添加到所述胜肽的終端。在某些實施方式中，所述官能基改善該胜肽一或多個特性的活性，例如，改善合成胜肽穩定性、效能或選擇性；改善所述合成胜肽通過細胞膜及/或組織屏障的穿透效率；改善組織定位能力；降低毒性或清除率；以及改善細胞幫浦的排除，及其他類似的活性。在非限制的實施例中，合適的官能基是那些能夠促進貼附在一細胞上的胜肽向細胞內運輸的官能基，舉例來說，藉由降低胜肽的親水性及增進胜肽的親脂性來促進前述作用，這些官能基可非必要地並優選地在活體細胞內裂解，無論是以水解或酵素分解的方式裂解。水解保護基包含酯、碳酸酯及氨基甲酸酯保護基。胺保護基包含烷氧基及芳氧羰基。羧酸保護基包含脂族(aliphatic)、苯基(benzylic)及芳酯(aryl esters)。

可以保守性或非保守性置換方式，以「擬胜肽有機基團(peptidomimetic organic moiety)」取代本發明合成胜肽的任一胺基酸殘基。在可任選的較佳實例中，所述擬胜肽有機基團非必要或較佳地具有與取代的胺基酸相似的立體空間、電子或構形特性，且這樣的擬胜肽被用來取代必要位置上的胺基酸，並具有類似的被視為保守性置換。非必要地，可以擬胜肽來抑制酵素造成的胜肽降解或其他降解過程。在可任選和優選的實施利中，所述擬胜肽可藉由有機合成技術產生。在非限制的實施例中，合適的擬胜肽包含醯胺鍵之同電子排列體(isosteres)、3-氨-2-丙二酮-6-羧酸(3-amino-2-propenidone-6-carboxylic acid)、羥基-1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸酯(hydroxyl-1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline-3-carboxylate)、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸酯(1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline-3-carboxylate)及組胺酸異喹啉羧酸(histidine isoquinolone carboxylic acid)。

合成胜肽的任一部份可非必要地經化學修飾，例如，添加官能基。所述修飾可非必要性地於合成本發明胜肽的期間完成。非限制的例示性修飾種類包含羧甲基化(carboxymethylation)、乙醯化(acylation)、磷酸化(phosphorylation)、醣基化(glycosylation)或脂醯化(fatty acylation)。醚鍵可非必要性地用來將絲胺酸(serine)或蘇胺酸羥基(threonine hydroxy)結合至糖類的羥基上。醯胺鍵可非必要性地用來將麩胺酸(glutamate)或天冬胺酸羧基(aspartate carboxy groups)結合至糖類的胺基上。縮醛及縮酮鍵也可非必要性地在胺基酸及碳水化合物之間形成。

2.2 用於治療乾眼症之藥物及/或藥學組合物

本發明合成胜肽適用於治療一患有乾眼症的個體。據此，本發明的另一態樣是提供一包含本發明合成胜肽之藥物及/或藥學組合物，其用於治療乾眼症。

可藉由混合適當量的本揭示內容合成胜肽及一藥學上可接受的載體、賦形劑或安定劑進組合物中，以製備該藥物及/或藥學組合物。在具體的實施方式中，本發明合成胜肽是選自由上述胜肽所組成的群組，其包含但不限於，RGDfD(序列編號：10)、c(RGDiD)(序列編號：16)、c(RGDfD)(序列編號：18)及其組合。

所述藥物或藥學組合物中，本發明胜肽的含量會隨著使用的胜肽而有所不同。存在於所述藥學組合物中的胜肽含量重量百分比約為0.001 %至10 %；例如：重量百分比0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2.、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.9、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9及10.0 %之含量；具體是約0.01 %至5 %(重量百分比)之含量，例如：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.9、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9及5.0 %(重量百分比)。

替選地或非必要地，可在製備成一藥品及/或一藥學組合物前，將合成胜肽被封裝或包埋至一遞送載體中。在不同態樣中，該遞送載體可為微脂體、溶酶體、微膠囊或奈米粒子。

可和合成胜肽一起使用的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑是本發明領域具有通常知識者所熟知的，包含但不限於，非毒性惰性固體、半固體、液體填充劑、稀釋劑、包封劑或配方助劑。一般的藥學上可接受載體是水或生理食鹽水。藥學上可接受的載體實例包含，但不限於，糖類(例如：乳糖、葡萄糖以及蔗糖)；澱粉類(例如：玉米澱粉)；纖維素及其衍生物(例如：羧甲基纖維、乙基纖維素及醋酸纖維素(cellulose acetate))；黃蓍膠粉末(powdered tragacanth)；麥芽；明膠；滑石；賦形劑(例如：可可脂及栓劑蠟(suppository waxes))；油類(例如：花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油)；二醇類(glycols)(例如：丙二醇)；酯類(例如：油酸乙酯(ethyl oleate)及月桂酸乙酯(ethyl laurate))；瓊脂(agar)；緩衝劑(例如：氫氧化鎂及氫氧化鋁)；藻酸；以及其他試劑，例如：非毒性潤滑劑(non-toxic lubricants)(例如：月桂硫酸(lauryl sulfate)及硬脂酸鎂(magnesium stearate))、著色劑、釋放劑、調味劑、防腐劑及抗氧化劑。所述藥學組合物可更包含抗生素或抗黴菌劑。

本發明藥物或藥學組合物的合適投予途徑為經由血管遞送(例如：注射或灌注)、口服、腸內、直腸、肺(例如：吸入)、經鼻、局部施用(包括經皮、經頰及舌下)、膀胱內、水晶體內、腹膜內、陰道、經腦遞送(例如：腦室注射及顱內注射)、經CNS遞送(例如：髓內、椎旁以及椎內)或腸外(例如：皮下、肌肉內、靜脈內及皮內)、黏膜給藥或藉由移植或其他習知的給藥途徑。

適用於口服的藥學組合物，可為離散劑量單位，像是丸劑、片劑、錠劑、硬式或軟式膠囊；或製成一分散粉末或顆粒；或製成一溶液或懸浮液，舉例來說：水溶性或油性懸浮液、乳劑、糖漿、酏劑或腸內配方。在優選的實施例中，所述藥學組合物為點眼劑。所述組合物可製成單一劑量或多劑量劑型，例如密封瓶或安瓿(ampoules)，並可在使用之前添加無菌液體載體(例如：水或食鹽水)儲存於凍乾條件下。

適用於腸胃外給藥的藥學組合物，可為水溶液或藉由混合或分散本發明合成胜肽與無菌溶劑(例如：水、林格氏液、食鹽水、1,3-丁二醇(1,3-butanediol)及酒精等)進行非水無菌注射。抑或是，固定油、脂肪酸或合成的單或雙甘油酯皆可做為溶劑使用。可藉由通過一過濾器過濾，以對所述組合物進行滅菌。

所述用於局部施用或經皮施用的藥學組合物一般是製成軟膏、糊劑、乳膏、洗劑、凝膠、貼片或噴霧劑。眼用製劑、滴耳劑及點眼劑都包含在本發明範圍中。依據某些實施方式，本發明的組合物為局部施用於眼睛。依據其他實施方式，所述藥學組合物為用於皮膚的軟膏。

隨著疾病的類型及嚴重程度不同，施用至病患的本發明合成胜肽之劑量為約每公斤1微克至每公斤1,500毫克(例如：0.01-1,200毫克/公斤)，例如：1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1,000微克/公斤；或是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400或1,500毫克/公斤。每日或每周的施用劑量為約0.1毫克/公斤至1,200毫克/公斤或更高，例如：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1,000、1,100或1,200毫克/公斤。優選地，所述每日劑量之範圍係從約15毫克/公斤至500毫克/公斤，例如：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500毫克/公斤。用於前述任一種目的之劑量可每日投予一次或多次，例如：每日四次、六次、八次或更多次。

藥學組合物可製成適用於肺部施用的劑型，例如：粉塵(dusts)或氣霧(mists)，其可藉由計量(metered dose)劑量加壓氣溶膠、霧化器(nebuliser)或吹粉器(insufflator)來產生。

本發明提供的藥學組合物優選為一套組。可以理解的是本發明所述套組係為一產品，其包含本發明合成胜肽的產品及/或其他治療性化合物，經包裝而形成所述組合物，以利運送、儲存和同時或連續施用。因此，本發明所述套組可包含分別含有本發明合成胜肽之一或多個密封安瓿，並且可將本發明合成胜肽製成單一劑型或多劑量形式。所述套組可額外包含一載體，適用於溶解所述合成胜肽，例如：水溶液介質，如：生理食鹽水、林格氏液(Ringer's solution)、右旋糖及氯化鈉；水溶性介質，如：乙醇、聚乙二醇(polyethylene glycol)、丙基乙二醇(propylethylene glycol，PEG)；若有必要，非水溶性載體亦可適用本發明。所述套組的其它成分也可以為一外包裝，用以將本發明的組合物保持在一確定的範圍內。適用於本發明之外包裝的材料包含玻璃、塑膠(聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯及其類似物)、瓶子、小罐子、紙、束袋及其類似物。

本揭示內容套組可更包含說明書，其中記載本發明各種配方的施用方式(如：同時施用、連續施用、個別施用)。因此，本揭示內容套組可更包含如何施用(如：同時施用、連續施用、個別施用)本揭示內容中不同成分的說明書。所述說明書可為紙本或可備讀取的電子媒介物，例如：電子儲存媒體(磁碟、磁帶及其類似物)、光學媒體(CD-ROM、DVD)及其類似物。所述媒體可額外或替選地包含網路頁面，以提供上述說明資訊。

2.3 治療乾眼症的方法

如上所述，本揭示內容提供的發現可用來治療及/或預防個體患有乾眼症。

因此，本揭示內容是關於一種預防及/或治療乾眼症的方法，其包含對一亟需之個體投予前述藥物或藥學組合物，該藥物或藥學組合物包含一通式(I)之合成胜肽， RGDX _aaD(I) 其中， R為精胺酸；G為甘胺酸；D為天冬胺酸；以及X _aa為一D式胺基酸，係選自由異白胺酸(I)及苯丙胺酸(F)所組成的群組；以及一藥學上可接受的載體。

依據本揭示內容的實施方式，該通式(I)之合成胜肽可為線性或頭接尾環狀形式。

替選地或非必要地，當通式(I)之合成胜肽為線性形式，則該合成胜肽的胺基酸序列N-端被乙醯化，而其C-端則被醯胺化。在一較優選的實施例中，該通式(I)之合成胜肽具有序列編號：10的該胺基酸序列。

在其他實施方式中，該通式(I)之合成胜肽為頭接尾環狀形式，且具有序列編號：16或18的胺基酸序列。

當投予該個體之後，所述藥物及/或藥學組合物能改善及緩和乾眼症相關症狀。

在具體實施方式中，所述合成胜肽是選自由前述胜肽所組成之群組，其包含但不限於：RGDfD(序列編號：10)、c(RGDiD)(序列編號：16)、c(RGDfD)(序列編號：18)及其組合。

根據本揭示內容的一實施方式，本發明是關於一種治療乾眼症的方法，其包含對一亟需之個體投予一有效量之本發明藥物或藥學組合物。

所述方法包含以下步驟，對一亟需之個體投予本揭示內容藥物或藥學組合物之劑量為約每公斤1微克至每公斤1,500毫克(例如：0.01-1,200毫克/公斤)，例如：1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1,000微克/公斤；或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400或1,500毫克/公斤。典型的每日或每周劑量為約0.1毫克/公斤至1,200毫克/公斤或更高，例如：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1,000、1,100或1,200毫克/公斤。優選地，所述每日劑量為約15毫克/公斤至500毫克/公斤，例如：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500毫克/公斤。為用於前述任一種目的，所述劑量通常可投予一次或多次，例如：每日四次、六次、八次或更多次。

在所有實施方式中，適合接受治療的個體為人類。

以下的實施例是來說明本發明中的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實施本發明。不應將這些實施例視為對本發明範圍的限制。

實施例

材料與方法

材料

取得市售RPMI 1640培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、抗生素-抗黴菌溶液以及胰蛋白酶(購自Invitrogen，Carlsbad, CA)。重組人類玻連蛋白(Vitronectin)(140-09)購自PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)。取得市售赫斯特染劑(Hoechst 33258)及所有化學品(供應商：Sigma-Aldrich，St. Louis, MO, USA)。取得市售整聯蛋白αV抗體(ab179475)及F4/80抗體(ab6640)，供應商為Abcam (Cambridge, MA, USA)。玻連蛋白抗體(GTX61399)之供應商為GeneTex。自供應商(Selleckchem，Houston, TX, USA)取得c(RGDfK)、ATN-161、SB273005、西崙吉肽及替羅非班(Tirofiban))。

所述線性RGDVF基胜肽的NH ₂端經乙醯化修飾，且COOH端經胺基化修飾，以改善穩定性。合成所述RGDVF基線性及頭接尾環狀胜肽，並以質譜儀定性(＞90 %純度)(供應商：GenScript (Piscataway, NJ, USA))。

細胞培養

將人類THP-1單核球血癌細胞株培養在含有25 mM HEPES緩衝液的RPMI 1640中(額外補充10 % FBS、2 mM 麩醯胺酸、100單位/毫升的盤尼西林及100微克/毫升的鏈黴素)，培養於37°C，含5 % CO ₂的大氣環境下。藉由重新懸浮THP-1細胞於含有10奈克/毫升PMA之新鮮10 % FBS培養基中48小時誘導THP-1細胞分化，並誘導THP-1細胞轉換為功能上類似於巨噬細胞的成熟細胞。以VTN(10微克/毫升)及整聯蛋白抑制劑(20微莫耳濃度，除非另有說明)處理種在不含血清之RPMI 1640培養基的細胞(6孔盤，每孔種5×10 ⁵顆細胞)。抑制劑溶於DMSO(溶劑)並加至細胞培養液中(DMSO的最終濃度少於0.05 %)。

誘導乾眼症及點眼劑治療

將C57Bl/6小鼠(8周大母鼠)餵養在控溫(24-25 ˚C)且光照週期為12小時日與12小時夜的動物房中。採自由進食及自由飲水。實驗過程皆由馬偕紀念醫院審查委員會(計劃編號：MMH-A-S-107-41，日期：2019年1月1日-2021年12月31日)許可且符合國家動物福利法規。小鼠於可控制環境室(controlled environment chamber，CEC)中飼養並投予東莨菪鹼(scopolamine)以產生最大眼表乾燥，以誘導乾眼症。控制可控制環境室條件以提供整日24小時一小於25 %之相對溼度，10公升/分鐘之氣流，且24-25 ˚C之溫度。小鼠餵養於可控制環境室12日，並且各於第3日及第5日時，對小鼠每日兩次進行皮下注射氫溴酸東莨菪鹼(copolamine hydrobromide)(注射量：每隻小鼠0.375毫克溶於0.15毫升PBS)。將未處理且年齡及性別皆相同的小鼠作為控制組。用於點眼劑治療時，將平衡鹽溶液(balanced salt solution)(BSS, Alcon)做為載體以產生所有結果。局部投予30微升之100 微莫耳濃度的胜肽或載體至眼睛，每日三次。

即時定量聚合酶連鎖反應 (Quantitative Real-time PCR)

以TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, CA)萃取細胞總RNA，並以DNA水解酶(RNase-free DNase I)(Qiagen, Santa Clarita, CA)處理，以移除基因體DNA，接著以RNA純化套組(Dynabeads, Invitrogen)純化RNA。藉由cDNA合成套組(Superscript III，Invitrogen)合成cDNA。利用序列偵測系統(GeneAmp 7700，Applied Biosys-tems, Foster City, CA)進行即時定量聚合酶連鎖反應。總體積為40微升，含有3皮摩爾(pmol)之引子、連續稀釋的反轉錄產物及染劑核心試劑(SYBR Green PCR core reagent，購自Applied Biosystems)來進行擴增反應。實驗中使用的引子對列於表2。步驟循環程式設定於95 °C變性15秒，接著在62 ˚C黏合及延展1分鐘，共計40個循環。所有的測量皆為三重覆。利用序列偵測系統軟體(GeneAmp 7700 SDS)分析對應於PCR循環數的循環閥值(cycle threshold, Ct)，在該PCR循環數下，即時螢光發光達到該基線發光以上的一閥值。所欲PCR產物及控制組mRNA(GAPDH)的循環閥值用以計算mRNA樣本間的相對表現量。

表2：使用於即時聚合酶連鎖反應的引子

標的基因	引子(5’→3’)	序列編號
hTNF‐α	正股	AGGACACCATGAGCACTGAA	22
反股	CGATCACTCCAAAGTGCAG	23
hGAPDH	正股	ACCCAGAAGACTGTGGATGG	24
反股	TCAGCTCAGGGATGACCTTG	25
moVTN	正股	CATACTAGCCCTGGTGGCAT	26
反股	CCATGAAACCCTGAGTGCAG	27
moNOS2	正股	CCTTGTTCAGCTACGCCTTC	28
反股	CTTCAGAGTCTGCCCATTGC	29
moTNF‐α	正股	CCAAATGGCCTCCCTCTCAT	30
反股	CACTTGGTGGTTTGCTACGA	31
moIL‐1β	正股	GGCTCATCTGGGATCCTCTC	32
反股	GTTTGGAAGCAGCCCTTCAT	33
moIL‐6	正股	GGAGCCCACCAAGAACGATA	34
反股	ACCAGCATCAGTCCCAAGAA	35
moMMP9	正股	GCAGAGGCATACTTGTACCG	36
反股	ATGGCCTTTAGTGTCTGGCT	37
mGAPDH	正股	AACGGATTTGGCCGTATTGG	38
反股	CATTCTCGGCCTTGACTGTG	39

乾眼的角膜螢光染色 (Corneal fluorescein staining)

用以評估乾燥壓力對眼睛表面破壞的影響，將螢光素(100毫克/毫升；Alcon Laboratories, Inc., Texas, USA)經由微量吸管滴入下外側結膜囊(每隻小鼠0.6微升的0.5 %鈉螢光素溶於4.4微升的PBS中)。螢光染色15秒後，以PBS清洗小鼠眼睛一次，接著利用裂隙燈顯微鏡(slit lamp microscope)在鈷藍光下觀察。

杯狀細胞 (goblet cells) 的過碘酸希夫 (Periodic Acid-Schiff, PAS) 染色

動物犧牲後，利用手術摘除眼睛，固定於4 %聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)中，接著以石蠟包埋，且切成5微莫耳濃度厚的切片。所述切片以PAS(Sigma-Aldrich)試劑進行染色，測量上結膜及下結膜內的杯狀細胞。利用配置有照相機(型號：Leica DC 500，供應商：Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)的顯微鏡(型號：Nikon Eclipse 80i；供應商：Nikon Corporation, Tokyo, Japan)拍攝照片。測量每顆眼睛的6個切片中結膜內PAS染色呈陽性的杯狀細胞數。

西方墨點法

刮取細胞至含有20 mM HEPES(pH 7.4)、1 % SDS、150 mM NaCl、1 mM EGTA及蛋白酶抑制劑(Cocktail I，購自Merck)的裂解緩衝液(150微升/35毫米孔洞(well))中。藉由SDS-PAGE分析含有20微克蛋白的樣本，接著電轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)膜(Immobilon-P；Millipore, Bedford, MA)進行免疫墨點分析。此實驗中使用的抗體為VTN(GeneTex)及β-肌動蛋白(Sigma)。利用適當免疫球蛋白G-山葵過氧化酶(IgG-horseradish peroxidase)二級抗體(Santa Cruz Biotechnology)及ECL試劑(Amersham Biosciences)偵測所欲之蛋白。在圖像密度計(GS-700 ，Bio-Rad)上掃描X光片且利用分析軟體(Labworks 4.0)進行分析。為了定量，至少進行三次獨立的轉漬實驗。

免疫組織化學法

以多聚甲醛(Paraformaldehyde, PFA)固定及石蠟包埋的乾燥眼睛檢體在二甲苯中進行脫蠟後，以系列濃度的酒精進行復水。以含有10 %山羊血清及5 %牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)的PBST(PBS中含有0.5 % Triton X-100)進行阻斷60分鐘，接著在37 ˚C下與抗VTN(1：100稀釋)的一級抗體共培養3小時。接著，將所述載玻片與標記有過氧化氫酶的山羊免疫球蛋)(1：500稀釋)共培養20分鐘，最後以蘇木精復染前，先與顯色劑基質(二胺基聯苯胺(3,3'-diaminobenzidine))共培養2分鐘。

免疫螢光法

進行組織切片脫蠟或在4 % PFA固定的骨髓衍生巨噬細胞(Bone Marrow Derived Macrophages, BMDMs)中以含有10 %山羊血清及5 % BSA的PBST進行阻斷20分鐘。使用抗F4/80的一級抗體(1：100稀釋)在37 °C下染色3小時。用於αv整聯蛋白染色(1：100稀釋)的切片在4 ˚C染色隔夜。負載有該切片之載玻片接著與具有螢光標記，合適的二級抗體(1：500 稀釋)在37 °C下培養1小時，再以赫斯特染劑對比染色6分鐘，並以配置有一電荷耦合攝影機(Zeiss AxioCam HRm, Zeiss)的落射螢光顯微鏡(epifluorescence microscope)(Zeiss Axioplan 2 imaging；Zeiss, Oberkochen, Germany)進行觀察，再利用分析軟體(Axiovert；Zeiss AxioVision Releasr 4.8.2, Zeiss)進行定量。

小鼠 VTN 酵素結合免疫吸附分析法 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 檢測

藉由ELISA測定淚液中VTN的濃度。將平衡鹽溶液(balanced salt solution, BSS；Alcone) 每周一次滴至小鼠的下穹窿(inferior fornix)。同一隻小鼠的雙眼洗眼液(各5微升；在此稱為眼淚檢體)匯集在一起，並保存於-80 ˚C以供ELISA使用。匯集的眼淚檢體依據使用操作說明，利用小鼠VTN(玻連蛋白)的ELISA套組(Fine Test；EM0500)進行檢測。新鮮血清樣本藉由在2,000 g下離心15分鐘，並以1：100的比例稀釋於磷酸鹽緩衝溶液(phosphatebuffered saline, PBS)中。血清樣本保存在-20 ˚C下，以供ELISA使用。

統計

數據分別由三個獨立實驗產生。利用曼惠特尼U檢定(Mann-Whitney U test)比較兩實驗組。P＜0.05視為顯著。

實施例1：乾眼症動物的巨噬細胞中αv整聯蛋白的表現量增加

1.1 乾眼症小鼠的淚液及結膜基質中玻連蛋白(VTN)含量上昇。

發現到血清中含有高濃度可溶性VTN，主要由肝細胞在肝臟中製造。VTN也作為胞外基質成分表現於各種組織中。另外觀察到在微血管中誘導VTN表現，會加速在缺血性後肢中巨噬細胞浸潤。在人類眼睛中，VTN是原位合成於網膜色素上皮-脈絡膜複合體，其涉及老化相關的黃斑點退化(age-related macular degeneration, AMD)之致病機制。然而，對於VTN在乾眼症的疾病發展中的作用所知有限。

為了研究VTN在乾眼中的表現及分布，依據「材料與方法」所述之程序誘導及處理乾眼症小鼠，其中年齡及性別相同之未處理的小鼠作為非壓力(non-stressed, NS)控制組。藉由VTN ELISA測定淚液中的VTN蛋白濃度，顯示出相比於NS小鼠，誘導乾眼症1週後，乾眼症小鼠的VTN濃度微幅地上升，而經誘導2週及3週更增加近2倍(230±22及229±18相對於114±7奈克/毫升，第1圖小圖(A))。在血清中發現到高濃度的VTN，但是在乾眼症小鼠的血清中VTN濃度並沒有提升。VTN的免疫組織化學染色揭示在乾眼症的結膜基質中有強烈的免疫反應。相比之下，NS控制組沒有顯著免疫反應(第1圖小圖(B))。此外，以即時定量PCR及西方墨點分析自乾眼症小鼠中分離出來的結膜內 VTN基因及蛋白表現，結果顯示乾眼症小鼠基因表現量及蛋白質表現量分別高於NS小鼠2.3倍及2.9倍(第1圖小圖(C)及第1圖小圖(D))。

前述結果顯示，試驗性乾眼症動物展現出在結膜中有VTN局部生合成的增加。

1.2 乾眼症小鼠引發巨噬細胞中αv整聯蛋白的表現。

αv整聯蛋白包含αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6及αvβ8，皆為細胞表面的VTN受器。本實施例探討乾眼症動物的巨噬細胞中αv整聯蛋白的表現。巨噬細胞代表異質的(heterogeneous)細胞族群(M1及M2或更多)。在誘導乾眼症10天後，發現到乾眼症小鼠的眼睛表面中促發炎M1巨噬細胞主要是留滯在結膜而非角膜(You et al.， Arch Immunol Ther Exp.2015，63：299-304)。值得注意的是，於結膜下注射氯膦酸使結膜巨噬細胞部位性地耗盡，使乾眼症中眼睛表面的損傷及促發炎因子的表現顯著地降低(Schaumburg et al., J. Immunol. 2011, 187：3653-3662； Zhou et al., Am J Pathol. 2012, 181：753-760)。因此，巨噬細胞可代表一種用於乾眼症患者的新穎藥物標的。

相比於NS小鼠，在誘導乾眼症12天後，αv整聯蛋白及F4/80(巨噬細胞標記)的雙重免疫螢光染色(dual-immunofluorescence staining)顯示出，在乾眼的結膜巨噬細胞內αv整聯蛋白的染色強度有顯著地增加。此外，乾眼症小鼠中αv整聯蛋白呈陽性的巨噬細胞數量約為NS小鼠的2.3倍(第2圖小圖(B))。同時，以及即時定量PCR分析iNOS(M1促發炎巨噬細胞的標記)及乾眼症中分離出的結膜中αv整聯蛋白的mRNA表現，結果顯示，mRNA表現量分別高出NS群組2.7±0.6倍及3.4±0.5倍(第2圖小圖(C))。

實驗結果表示，在乾眼症動物中，結膜巨噬細胞展現出具體增加αv整聯蛋白表現量的結果。

實施例2：本揭示內容合成胜肽的鑑定及定性

2.1 鑑定胜肽具有針對αv整聯蛋白的拮抗活性

在本實施例中，合成一系列含有如表3所列示的RGD序列的短合成胜肽，且藉由「材料及方法」的章節中所述之程序，測定促發炎因子TNF-α基因在THP-1巨噬細胞中的表現，評估該些合成胜肽針對αv整聯蛋白之功效。簡言之，THP-1巨噬細胞以可溶性VTN及特定胜肽(序列編號：1至18的任一種)處理3小時，並藉由即時定量PCR監測基因表現。實驗結果繪示於第3圖。

表3 短合成胜肽

胜肽名稱	胺基酸序列	序列編號
RGD胜肽
RGDVF	NH ₂-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-COOH	1
RGDID	NH ₂-Arg-Gly-Asp-Ile-Asp-COOH	2
RGDFD	NH ₂-Arg-Gly-Asp-Phe-Asp-COOH	3
RGDND	NH ₂-Arg-Gly-Asp-Asn-Asp-COOH	4
RGDPD	NH ₂-Arg-Gly-Asp-Pro-Asp-COOH	5
RGDTD	NH ₂-Arg-Gly-Asp-Thr-Asp-COOH	6
RGDVD	NH ₂-Arg-Gly-Asp-Val-Asp-COOH	7
線性D式RGD胜肽
RGDvF	NH ₂-Arg-Gly-Asp-d(Val)-Phe-COOH	8
RGDiD	NH ₂-Arg-Gly-Asp-d(Ile)-Asp-COOH	9
RGDfD	NH ₂-Arg-Gly-Asp-d(Phe)-Asp-COOH	10
RGDnD	NH ₂-Arg-Gly-Asp-d(Asn)-Asp-COOH	11
RGDpD	NH ₂-Arg-Gly-Asp-d(Pro)-Asp-COOH	12
RGDtD	NH ₂-Arg-Gly-Asp-d(Thr)-Asp-COOH	13
RGDvD	NH ₂-Arg-Gly-Asp-d(Val)-Asp-COOH	14
頭接尾環狀RGD胜肽
c(RGDID)	環狀(Arg-Gly-Asp-Ile-Asp)	15
c(RGDiD)	環狀(Arg-Gly-Asp-d(Ile)-Asp)	16
c(RGDFD)	環狀(Arg-Gly-Asp-Phe-Asp)	17
c(RGDfD)	環狀(Arg-Gly-Asp-d(Phe)-Asp)	18

任一序列中小寫字母表示該特定胺基酸為D式胺基酸。

如第3圖所述，相比於溶劑處理控制組的細胞，可溶性VTN誘導的 TNF-αmRNA表現約高出14.3倍。更加令人訝異的是，L-組態的胺基酸組成的RGDVF線性及環狀胜肽都沒有展現出抑制 TNF-αmRNA表現的效應(第3A圖)。實驗結果說明，所述RGD胜肽對αvβ3整聯蛋白不具有拮抗效應，卻體現某些類似於VTN的拮抗效應。

相反地，相較於以VTN/溶劑處理的細胞，以含有RGDfD、c(RGDfD)或c(RGDiD)胜肽的VTN處理之細胞，獨立地展現出降低 TNF-αmRNA之表現(10.5±0.9、8.3±0.8或10.7±0.8相較於14.3±0.8，第3圖小圖(B))。實驗結果說明某些包含D式胺基酸的RGD胜肽可作為αvβ3整聯蛋白的拮抗劑。

綜上所述，RGDfD、c(RGDfD)及c(RGDiD)可藉由修復THP-1巨噬細胞中VTN誘導的TNF-α之基因表現，作為αv整聯蛋白的拮抗物。

2.2 活化的RGD類胜肽以劑量依賴性方式抑制VTN誘導的 TNF-α基因表現

發明人進一步研究五個已知的αvβ3整聯蛋白拮抗劑，包括西崙吉肽、c(RGDfK)(序列編號：19)、c(RGDyK)(序列編號：20)、SB273005((S)-2-(8-(2-(6-(甲胺基)吡啶基-2-基)乙氧基)-3-側氧基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,5-四氫-1H-苯並[c]氮卓-4-基)醋酸)((S)-2-(8-(2-(6-(methylamino)pyridin-2-yl)ethoxy)-3-oxo-2-(2,2,2-trifluoroethyl)-2,3,4,5-tetrahydro-1H-benzo[c]azepin-4-yl)acetic acid)、ATN-161(Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH ₂，序列編號：21)以及替羅非班(Tirofiban)(血小板受體αIIbβ3之拮抗劑)，是否在THP-1巨噬細胞中對VTN誘導的TNF-α基因表現具有任何抑制效應。發明人發現到相較於經VTN/溶劑處理之細胞，經含有西崙吉肽、c(RGDfK)、SB273005及ATN-161的VTN處理之細胞可獨立地導致 TNF-α之mRNA表現量降低(9.7±1.0、9.6±1.6、11.4±0.9及10.0±1.1相比於14.3±0.8(控制組))；而c(RGDyK)及替羅非班則不具有這類效應(第4A圖)。

接著，以不同劑量(5、10或20微莫耳濃度)的西崙吉肽、c(RGDfK)、RGDfD、c(RGDiD)及c(RGDfD)處理THP-1巨噬細胞，用以評估針對VTN誘導的 TNF-αmRNA表現的抑制效應。實驗結果以VTN/溶劑控制組(設定為100%)的抑制百分比之方式呈現。整體而言，五個αvβ3整聯蛋白拮抗劑針對VTN誘導的TNF-α基因表現顯示出劑量依賴性反應，儘管RGDfD及c(RGDiD)的劑量依賴性反應程度較小。當THP-1巨噬細胞經10或20微莫耳濃度的西崙吉肽、c(RGDfK)及c(RGDfD)處理後，抑制百分比分別為65.9/49.4 %、68.8/54.2 %及67.8/51.2 %(第4圖小圖(B))。

前述實驗數據表示所述三個RGD胜肽分別具備相似的抗VTN之αvβ3整聯蛋白拮抗活性。

實施例3：在試驗性乾眼中c(RGDfD)及c(RGDiD)個別地展現出有利於恢復角膜上皮損傷的效應

在本實施例中，探討c(RGDfD)及c(RGDiD)對乾眼症的效應。實驗結果繪示於第5圖。

如第5圖小圖(A)、(B)所述，誘導乾眼症8天後，在角膜上皮屏障(corneal epithelial barrier)中的損傷導致螢光染料的吸收。小鼠螢光染色分數高於2就歸類為中等/嚴重的乾眼症，接著隨機指定接受c(RGDfD)、c(RGDiD)或載體點眼劑的治療。發現到相較於以載體處理的組別，小鼠經c(RGDfD)或c(RGDiD)處理5天後(第12日)呈現螢光染色分數顯著的減少(第5圖小圖(C)；2.1±0.2及2.4±0.3比起3.0±0.0；P值分別為0.0003及0.04)。

進一步將用點眼劑治療的乾眼症小鼠餵養於低濕度環境，在第19日時，與以載體處理的組別相比，螢光染色顯示以c(RGDfD)或c(RGDiD)治療的小鼠減少角膜上皮損傷(2.1±0.2及2.0±0.2相比於2.9±0.1；P值分別為0.004及0.003)。

總共，在本實施例的結果中指出DED小鼠展現出明顯角膜上皮損害，然而，藉由含有c(RGDfD)或c(RGDiD)胜肽的點眼劑治療，可緩解在乾眼症中既有的眼睛表面損害。

實施例4：所述合成胜肽對乾眼症的治療效應

為了進一步確認αv整聯蛋白拮抗劑對DED的治療效應，將含有所述合成胜肽(RGDfD或c(RGDfD))或四個本領域所熟知的αvβ3整聯蛋白拮抗劑(包括c(RGDfK)、ATN-161、SB273005及西崙吉肽)任一種的點眼劑分別用於治療乾眼症小鼠。以含替羅非班(一αIIbβ3抑制劑)的點眼劑治療作為負控制組。

誘導乾眼症8天後，藉由螢光染色檢測(分數高於2)發現，所有組別中的老鼠在角膜上皮展現出明顯的損傷。點眼劑治療4天(第12日)後，c(RGDfK)、ATN-161、SB273005、西崙吉肽、RGDfD及c(RGDfD)展現出治療乾眼症的能力，而賦形劑及替羅非班則不具有這類治療效應(表4及第6圖)。此外，發明人注意到和其他組別相比，c(RGDfD)展現更明顯的治療乾眼症的能力，即使c(RGDfD)、c(RGDfK)及西崙吉肽獨立地表現出類似抑制THP-1巨噬細胞中由VTN誘導的 TNF-αmRNA表現的活性。

表 4 乾眼症組別內角膜螢光染色分數的平均

化合物	平均分數	P值
第8日	第12日
載體	2.9±0.10	3.0±0.0	0.15
c(RGDfK)	3.0±0.0	1.8±0.24	7.75E-05
ATN-161	2.8±0.11	2.1±0.19	0.0028
SB273005	3.0±0.0	2.7±0.14	0.028
西崙吉肽	2.9±0.08	2.4±0.19	0.027
RGDfD	2.8±0.11	2.1±0.19	0.0028
c(RGDfD)	3.0±0.0	1.4±0.14	1.18E-11
替羅非班	2.8±0.11	2.6±0.19	0.48

實施例5：所述合成胜肽可防止實驗性乾眼症發展過程中損失結膜中的杯狀細胞

杯狀細胞主要是常駐在結膜穹窿的表面上皮且負責產生黏液性淚液(mucous tear)。在NS小鼠中杯狀細胞的PAS染色於結膜穹窿上顯示一連續性勻相模式(第7A圖)。然而，和NS、c(RGDfD)或c(RGDiD)組別相比，以載體處理的乾眼症小鼠中杯狀細胞明顯減少(個數/0.1 mm ²：5相比於9、8及7；第7B圖)。

實驗結果說明含有c(RGDfD)或c(RGDiD)的眼部滴劑能夠預防乾眼症發展過程中杯狀細胞的損失。

實施例6：所述合成胜肽抑制試驗性乾眼中的發炎反應

報導顯示促發炎因子，例如，TNF-α、IL-1β、IL-6及基質金屬蛋白酶(MMP)-9參與在乾眼症的致病機制中。舉例來說，已經證明TNF-α及IL-1β阻斷劑可改善實驗性乾眼症。因此，在乾眼症中 TNF-α 、 IL-1β 、 IL-6及 MMP-9的基因表現減少對乾眼症治療是有益處的。

在本實施例中，藉由即時定量PCR分別監測乾眼症中 TNF-α 、 IL-1β 、 IL-6及 MMP-9的mRNA表現量。發現到和NS組別相比，TNF-α、IL-1β、IL-6及MMP-9個別的mRNA表現量顯著地上調節1.6、1.7、2.3及29.6倍(第8圖)。進一步，以c(RGDfD)及c(RGDiD)處理顯著地減少 TNF-α、 IL-1β及 IL-6的基因表現，使得表現量接近於個別的基準線。此外，與賦形劑處理的群組相比，c(RGDfD)及c(RGDiD)也顯著地抑制MMP-9的基因表現約1.33及1.65倍。

綜上所述，實驗結果說明c(RGDfD)及c(RGDiD)能夠抑制乾眼症中促發炎因子(即， MMP-9)的基因表現。實驗結果說明αv整聯蛋白參與巨噬細胞相關的發炎及乾眼症的發病機制。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

無

配合附隨圖式，本揭示內容以下的實施方式則將更明顯易懂，其中：

第1圖呈現在乾眼症小鼠中，玻連蛋白(vitronectin, VTN)於淚液及結膜基質(conjunctival stroma)中過表現。(A)利用酵素結合免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)分析乾眼症小鼠的淚液及血清中的VTN濃度。自第0天至第3週，從10隻小鼠獲得實驗數據(平均值±SE)是。*表示相比於第0天且P＜0.001。飼養在一般環境條件的非壓力對照(non-stressed, NS)小鼠作為控制組。(B)結膜組織中VTN(咖啡色)的免疫組織化學染色(Immunohistochemical staining)，其顯示分別來自兩個獨立實驗(n=6)的代表顯微照片。利用即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，real-time qPCR)(C)及西方墨點法(D)分析乾眼症小鼠及NS小鼠(n=6)的結膜中VTN的表現。來自6個樣本的代表轉漬(blot)結果及密度分析如圖所示。a：相比於NS小鼠P＜0.0001；b：相比於NS小鼠P＜0.0002。

第2圖呈現在乾眼中，巨噬細胞內αv整聯蛋白會被誘導表現。(A)誘導乾眼症後第12天的結膜組織中αv整聯蛋白(紅色)及F4/80(綠色；一巨噬細胞生物標記)的免疫螢光染色(Immunofluorescence staining)結果。局部小圖為影像圖疊加前的影像。以染劑(Hoechst 33258)對細胞核(藍色)進行對比染色。星號表示結膜上皮細胞。從每組六隻小鼠的每一隻小鼠眼睛取得六個切片作為各組的代表圖。NS組：小鼠飼養在無壓力環境下。(B)利用蔡司(Zeiss)落射螢光顯微鏡(epifluorescence microscope)及蔡司軟體進行數位影像分析，從每個切片中隨機選擇的六個1000放大倍率視野的平均值(n=6)，進行盲分析每個總巨噬細胞中αv整聯蛋白 ⁺巨噬細胞的百分比。*：相比於NS組P＜0.0001。(C)誘導乾眼症12天後，即時定量PCR測量結膜中iNOS及αv整聯蛋白的mRNA含量。以Gapdh作為控制組。數值以平均值±標準差表示。a：相比於NS小鼠P＜0.03；b：相比於NS小鼠P＜0.002。

第3圖呈現在THP-1巨噬細胞中，RGDVF基胜肽對VTN誘導的TNF-α mRNA表現之影響。藉由添加10奈克/毫升之PMA於完全培養基中培養2天，接著進行額外16小時的血清飢餓，將5×10 ⁵顆THP-1單核細胞分化成巨噬細胞。接著，在新鮮無血清培養基中，以(A)20 微莫耳濃度的RGDVF基胜肽(以L-組態之胺基酸構成)及(B)有一D式胺基酸(小寫字母)的RGDVF基胜肽處理THP-1巨噬細胞10分鐘，接著加入VTN(10微克/毫升)再培養3小時。利用即時定量PCR分析並測定 TNF-αmRNA含量。 Gapdh作為裝填控制組。實驗數據代表三個獨立實驗。*表示相比於僅用溶劑處理的細胞p＜0.00007。a：相比於僅用溶劑處理的細胞P＜0.03；b：P＜0.03；c：P＜0.005。

第4圖呈現在THP-1巨噬細胞中，本揭示內容合成胜肽及習知的αvβ3整聯蛋白拮抗劑，分別對於VTN誘導的TNF-α mRNA表現之影響。對5×10 ⁵顆THP-1巨噬細胞進行16小時血清飢餓，接著以VTN(10微克/毫升)以及作為指標的(A)20微莫耳濃度或(B)5~20微莫耳濃度的整聯蛋白抑制劑處理該巨噬細胞，並在新鮮無血清的培養基中培養3小時。利用即時定量PCR分析測定 TNF-αmRNA含量。 Gapdh作為裝填控制組。實驗結果以VTN/溶劑抑制組(100%)的抑制百分比呈現。各長條(bar)代表三個獨立實驗的平均值±標準誤差(Standard Error, SE)。*：表示相比於僅用溶劑處理的細胞p＜0.05。

第5圖呈現本揭示內容合成胜肽可改善乾眼的角膜上皮損害。(A)乾眼症小鼠模型誘導時程：為了誘發乾眼症，將C57BL/6小鼠餵養於低濕度的可控制環境室(controlled environment chamber, CEC)，並且於第3天及第5天進行皮下注射莨菪鹼(scopolamine)。接著，在第8-12天及第15-19天以載體(BSS)、c(RGDfD)及c(RGDiD)點眼劑局部性處理小鼠。於處理前(第8天)及處理後(第12-19天)藉由角膜螢光染色檢測角膜上皮損傷的嚴重程度。(B)角膜螢光染色分數的代表影像圖。

第6圖呈現在試驗性乾眼中，αvβ3整聯蛋白拮抗劑對角膜上皮損傷的治療效應。在第8天時，與未處理的乾眼症小鼠相比，經100微莫耳濃度的c(RGDfK)、ATN-161、SB273005、RGDfD、c(RGDfD)或西崙吉肽(cilengitide)點眼劑局部性處理4天之乾眼症小鼠之角膜上皮損傷呈現顯著的降低(P＜0.05)。誤差槓(Error bars)代表標準誤差(Standard Error, SE)。

第7圖呈現第19日的乾眼症小鼠之結膜前叉(conjunctival fornices)內杯狀細胞之PAS染色結果。(A)杯狀細胞(粉紅色)的代表照片顯示以載體、c(RGDfD)及c(RGDiD)點眼劑處理的乾眼。(B)利用裝設有相機(Leica DC 500)之顯微鏡(Nikon Eclipse 80i)，在200倍的放大倍率下，從每一切片隨機挑選6個視野之平均細胞數，以盲計算每一組杯狀細胞的平均數值。實驗數據顯示出個別小鼠(每一組n=8)的中位數/四分位數。

第8圖呈現以即時定量PCR分析，評估乾眼的結膜內 TNF-α、 IL-1β、 IL-6及 MMP-9的轉錄程度。乾眼小鼠的誘導時程及治療如第5圖所示。實驗數據以平均數±SE呈現。相比僅以載體處理的組別之P值做為指標。

               序列表
          <![CDATA[<110> 台灣基督長老教會馬偕醫療財團法人馬偕紀念醫院]]>
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          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 21]]>
          Pro His Ser Cys Asn 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 22]]>
          aggacaccat gagcactgaa                                                20
          <![CDATA[<210> 23]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> ]]>DNA
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 23]]>
          cgatcactcc aaagtgcag                                                 19
          <![CDATA[<210> 24]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 24]]>
          acccagaaga ctgtggatgg                                                20
          <![CDATA[<210> 25]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 25]]>
          tcagctcagg gatgaccttg                                                20
          <![CDATA[<210> 26]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 26]]>
          catactagcc ctggtggcat                                                20
          <![CDATA[<210> 27]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 27]]>
          ccatgaaacc ctgagtgcag                                                20
          <![CDATA[<210> 28]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 28]]>
          ccttgttcag ctacgccttc                                                20
          <![CDATA[<210> 29]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 29]]>
          cttcagagtc tgcccattgc                                                20
          <![CDATA[<210> 30]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 30]]>
          ccaaatggcc tccctctcat                                                20
          <![CDATA[<210> 31]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 31]]>
          cacttggtgg tttgctacga                                                20
          <![CDATA[<210> 32]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 32]]>
          ggctcatctg ggatcctctc                                                20
          <![CDATA[<210> 33]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 33]]>
          gtttggaagc agcccttcat                                                20
          <![CDATA[<210> 34]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 34]]>
          ggagcccacc aagaacgata                                                20
          <![CDATA[<210> 35]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<4]]>00> 35]]&gt;
          <br/><![CDATA[accagcatca gtcccaagaa                                                20
          <![CDATA[<210> 36]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 36]]>
          gcagaggcat acttgtaccg                                                20
          <![CDATA[<210> 37]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 37]]>
          atggccttta gtgtctggct                                                20
          <![CDATA[<210> 38]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 38]]>
          aacggatttg gccgtattgg                                                20
          <![CDATA[<210> 39]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 39]]>
          cattctcggc cttgactgtg                                                20

Claims

一種通式(I)之合成胜肽： RGDX _aaD (I) 其中，該合成胜肽為線性或環狀形式； X _aa為一D式胺基酸，係選自由異白胺酸(I)及苯丙胺酸(F)所組成之群組。
如請求項1所述之合成胜肽，其中該合成胜肽為線性形式，且具有序列編號：10的胺基酸序列。
如請求項1所述之合成胜肽，其中該合成胜肽為環狀形式，且具有序列編號：16或18的胺基酸序列。
一種藥學組合物，包含如請求項1所述之合成胜肽以及一藥學上可接受之載體。
如請求項4所述之藥學組合物，其中該合成胜肽為線性形式，且具有序列編號：10的胺基酸序列。
如請求項4所述之藥學組合物，其中該合成胜肽為環狀形式，且具有序列編號：16或18的胺基酸序列。
如請求項4所述之藥學組合物，其中該藥學組合物為一液體、凝膠、乳膏或軟膏形式。
一種如請求項1所述之合成胜肽用以製備一治療乾眼症藥劑之用途。
如請求項8所述之用途，其中該合成胜肽為線性形式，且具有序列編號：10的胺基酸序列。
如請求項8所述之用途，其中該合成胜肽為環狀形式，且具有序列編號：16或18的胺基酸序列。