KR102609115B1 - 펩타이드를 포함하는 안구 질환의 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 펩타이드를 포함하는 안구 질환의 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 눈물량 개선, 눈물 분해시간 연장, 항염 효과 및 항-아폽토시스 효과가 우수한 동시에, 점안액 형태의 제형에서도 안정도가 우수하여, 안구 건조증을 비롯한 다양한 안구 질환의 치료용 조성물로 이용될 수 있다.

Description

펩타이드를 포함하는 안구 질환의 치료용 조성물 {Composition for the treatment of eye diseases containing peptides}
본 발명은 펩타이드를 포함하는 안구 질환의 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 안구 건조증의 치료에 효과적인 펩타이드를 포함하는 안구 질환의 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
안구 건조증은 눈물이 부족해서 눈에 자극을 일으키는 눈물막의 질환이다. 안구 건조증은 눈물의 분비 저하, 눈물의 과도한 증발, 눈물 생성기관의 염증에 의해 발병하거나, 쇼그렌 증후군, 스티븐존슨 증후군, 유천포창 같은 전신질환이 동반된 경우에 발병하게 된다.
안구 건조증이 발병하는 경우, 눈이 시리고 모래알이 들어간 듯한 이물감이 생기고 콕콕 쑤시는 느낌이 생기게 되며, 또한, 평소보다 쉽게 눈이 피로하여 잘 뜰 수가 없다. 특히 겨울철 외출 시 찬 바람을 맞으면 눈물이 줄줄 흐르며, 심한 경우 두통을 호소하기도 하며, 눈이 충혈되게 된다. 안구 건조증은 몸에서 눈물을 적게 생성하는 것으로, 완치는 어려우며, 증상을 호전시키고 염증 반응을 가라앉히기 위한 여러 가지 치료법 중 본인의 눈 상태에 맞는 적절한 치료를 받게 된다. 건성안이 아주 심할 경우 각막이 말라 시력이 심하게 저하되기도 한다.
한편, 안구 건조증은 완치가 어려움에도 불구하고, 다양한 치료법이 시도되었다. 수성층의 부족에 따른 안구 건조증의 경우 인공 눈물 점안하고, 지방층의 부족에 의한 눈물 증발 증가일 경우에는 눈꺼풀 염증 치료를 시행하며, 안구의 염증이 주된 원인일 경우 항염증 치료가 수반된다.
이러한 안구 건조증을 치료하기 위한 약물로는 지난 2003년 FDA에 승인된 사이클로스포린 (cyclosporine, 제품명: 레스타시스)이 있고, 이는 T세포의 인터류킨-2 생성을 억제함에 따라 안구건조증에 따른 염증을 치료하게된다. 다만, 사이클로스포린의 경우 신장기능 저하, 혈압상승, 두통, 고지혈증, 구토, 다모증, 잇몸 증식, 혈당상승 등의 부작용을 동반할 수 있으며, 안구 건조증의 근본적인 치료가 어렵다는 문제가 존재하였다.
최근, 사이클로스포린 이후 안구 건조증의 신약으로 리피테그라스트 (lifitegrast, 제품명: 자이드라)이 출시되었으며, 이는 T 세포의 표면에 위치한 유착분자에 경쟁적으로 결합하여 T 세포의 활성화를 막아줌에 따라 안구건조증의 염증을 억제하는 것으로 알려져 있다. 다만, 리피테그라스트 또한 안구자극, 안구통증 및 점적 부위 반응 등의 안과적 약물 이상 반응을 일으키는 것으로 보고되고 있으며, 근본적인 안구 건조증의 치료는 어려운 것으로 알려져 있다.
이러한 배경에서, 치료 효능이 우수하면서도 안전성이 우수한 안구 건조증 치료제에 대한 관심이 대두되고 있다.
본 발명자들은 펩타이드를 포함하는 안구 질환의 치료용 조성물을 제조하였고, 본 발명에 따른 조성물은 안구 건조증을 포함하는 안구 질환의 치료 효능이 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 펩타이드를 이용한 안구 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 펩타이드의 안구 질환 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 펩타이드를 포함하는 안구 질환의 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 안구 건조증을 포함하는 안구 질환의 치료 효능이 월등히 우수하고, 안전성이 우수하다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는, 서열번호 1 (Xaa1-Tyr-Phe-Ala-Tyr-His-Pro-Asn-Ile-Pro-Gly-Leu-Xaa2-Tyr-Phe)을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 치료, 예방, 완화 또는 억제용 약제학적 조성물이다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1의 Xaa1는 티로신, 트립토판, 페닐알라닌 및 이들과 동일 특성을 가진 비자연적 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1의 Xaa2는 티로신, 트립토판, 페닐알라닌 및 이들과 동일 특성을 가진 비자연적 아미노산으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드는 그의 염 형태를 포함한다. 이와 같은 염의 예는 금속 염, 암모늄 염, 유기 염기와의 염, 무기 산과의 염, 유기 산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염, 및 기타 등등을 포함한다. 금속 염의 바람직한 예는 알칼리 금속 염 예컨대 나트륨 염, 칼륨 염 및 기타 등등; 알칼리성 토류 금속 염 예컨대 칼슘 염, 마그네슘 염, 바륨 염 및 기타 등등; 알루미늄 염 및 기타 등등을 포함한다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 펩타이드 합성 방법에 따라 생산될 수 있다. 일 예로, 생리적 조건하에 본 발명의 펩타이드 분자로 전환되는 것일 수 있다. 일 예로, 고상 합성 과정 및 액상 합성 과정에 따라 본 발명의 펩타이드를 합성할 수 있다. 즉, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 펩타이드 분자를 구성할 수 있는 부분적 펩타이드 또는 아미노산, 합성되어야 하는 펩타이드 그리고 나머지 부분을 원하는 순서에 따라 반복 축합시킴으로써 생산될 수 있다. 바람직한 순서를 갖는 생산물이 보호기를 갖는 경우, 목적 펩타이드는 보호기를 제거함으로써 생산될 수 있다.
본 발명에 있어서, 펩타이드는 캐리어 물질이 연결된 형태일 수 있다.
캐리어 물질은 면역글로불린 Fc 영역, 지방친화 화합물, 아미노산, 알부민, 트랜스페린 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
PEG는 목적 펩타이드의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 펩타이드의 분자량을 증가시켜 신장에 의한 소실을 억제하고 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는다. 이에 더하여 외래 펩타이드에 PEG를 결합시키면 때로는 외래 펩타이드에 존재하는 항원 부위가 면역세포에 의해 인식되는 것을 저해할 수 있다. 구체적으로는 펩타이드의 항원제시세포 (antigen-presenting cell)에 의한 대식작용 및 세포 내 분해작용 (proteolysis)을 저해하여 펩타이드가 항원으로 작용할 가능성을 낮출 수 있다.
본 명세서 상의 용어 “아미노산”이란 염기성 성질을 가진 아민기(-NH2)와 산성 성질을 가진 카르복실기(-COOH)가 공존하는 특정한 구조를 지닌 분자를 말하며 단백질의 구성요소이다. 하나의 아미노산 분자에 결합되어 있는 아미노기와 또 다른 아미노산 분자에 결합되어 있는 카르복실기가 반응을 하면 물과 두 개의 아미노산으로 구성된 한 개의 새로운 분자가 형성된다. 새로운 분자는 다이펩타이드라 하며, 반응 결과 이루어진 결합을 펩타이드 결합이라 한다. 아민기가 있는 부분은 N 말단이라고 부르며, 카르복실기가 있는 부분을 C말단이라고 부른다. 단백질 하나가 형성되기 위해서는 수많은 펩타이드 결합이 형성되어야 한다. 자연에는 20개의 아미노산이 존재하고 있으며 그 중에서 12개인 글리신 (glycine), 알라닌 (alanine), 아지닌 (arginine), 아스파라진 (asparagine), 아스파테이트 (aspartate), 시스틴 (cysteine), 글루타메이트 (glutamate), 글루타민 (glutamine), 히스티딘 (histidine), 프롤린 (proline), 세린 (serine), 티로신 (tyrosine)은 먹는 식품을 원료로 우리 몸에서 합성이 된다. 나머지 8개인 이소루신 (isoleucine), 루신 (leucine), 라이신 (lysine), 트립토판 (tryptophan), 발린 (valine), 메타이오닌 (methionine), 페닐알라닌 (phenylalanie), 트레오닌 (threonine)은 합성이 되지 않는다.
비자연적 아미노산이란, 자연에는 존재하지 않는 아미노산을 말하는 것으로서 사람에 의해 합성되거나 만들어진 아미노산을 말한다. 구체적으로는 요오드화 티로신 (iodinated tyrosine), 메틸화 티로신 (methylated tyrosine), 당화 세린 (glycosylated serine), 당화 트레오닌 (glycosylated threonine), 아제티딘-2-카르복시산 (azetidine-2-carboxylic acid), 3,4-디하이로프롤린 (3,4-dehydroproline), 퍼티아프롤린 (perthiaproline), 카나바닌 (canavanine), 에타이오닌 (ethionine), 노어루신 (norleucine), 셀레노메타이오닌 (selenomethionine), 아니모헥사노산 (animohexanoic acid), 텔루로메타이오인 (telluromethionine), 호모알릴글리신 (homoallylglycine) 및 호모프로파길글리신 (homopropargylglycine)을 포함하며, D-아미노산도 비자연적 아미노산에 포함된다.
동일특성을 가진 비자연적 아미노산이란, 자연적 아미노산과 물리적, 화학적 혹은 기능적으로 유사한 특징을 가지고 있는 비자연적 아미노산을 말하는 것이며 자연적 아미노산을 대체했을 때, 자연적 아미노산이 가지는 효과와 유사하거나 동일한 것을 말한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌과 동일 특성이라는 것은 아로마틱 (방향족) 특성을 가지는 아미노산일 수 있다. 아로마틱 아미노산이란 아미노산 곁사슬에 방향고리 (벤젠고리와 그 유도체)를 갖는 아미노산을 말한다. 따라서, 아로마틱 아미노산과 동일 혹은 유사한 특성을 가지는 비자연적 아미노산일 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드는 캐리어 물질과 링커를 통해 연결될 수 있다.
링커는 펩타이드성 또는 비펩타이드성 중합체일 수 있다.
비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA (폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA (폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 기술 분야에 이미 알려진 비펩타이드 중합체의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 링커로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드는 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 범위에서, 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파네실화 (farnesylation), 아세틸화 (acetylation) 및 아미드화 (amidation) 등으로 수식 (modification)될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 서열번호 1의 아미노산 서열의 N 말단에 X-L1의 연결 화합물이 추가로 결합될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, X는 1내지 10개의 아미노산; 1내지 200kDa의 무게를 가진 선형 형태 또는 가지가 달린 형태의 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol); 지방친화 화합물; 및 펩타이드 트랜스덕션 도메인 (peptide transduction domain)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, L1은 서열번호 1의 N말단과 상기 X를 연결하는 단일 결합 또는 연결고리 역할을 하는 화합물일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 서열번호 1의 아미노산 서열의 C말단에 L2-Z의 연결 화합물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, Z는 1내지 10개의 아미노산; 1내지 200kDa의 무게를 가진 선형 형태 또는 가지가 달린 형태의 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol); 지방친화 화합물; 및 펩타이드 트랜스덕션 도메인 (peptide transduction domain)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol; PEG)이란, 에틸렌 옥사이드 (ethylene oxide)의 중합체를 말한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 폴리에틸렌 글리콜은 메톡실PEG 말레이마이드 (methoxyl PEG maleimide (mPEG(MAL))), 메톡실 PEG 분기된 말레이마이드 (methoxyl PEG forked maleimide (mPEG2(MAL))), 메톡실 PEG 오소-피리딜 이중황화물 (methoxyl PEG ortho-pyridyldisulfide (mPEG-OPSS)), PEG-비닐술폰 (PEG-vinylsulphone), 혹은 메톡실 PEG 알데하이드 (methoxyl PEG aldehyde (mPEG-ALD))와 오소-피리딜 이중황화-PEG-하이드라지드 (ortho-pyridyldisulfide-PEG-hydrazide (OPSS-PEG-hy-drazide))의 조성물일 수 있다. 본발명의 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 폴리 에틸렌 글리콜은 5k-mPEG (MAL), 20k-mPEG (MAL), 40k-mPEG2 (MAL), 5k-mPEG-OPSS, 10k-mPEG-OPSS, 20k-mPEG-OPSS, 또는 mPEG30 kD-ALD 와OPSS-PEG2k-hydrazide의 조성물으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
지방친화 화합물이란 자연에 존재하는 화합물로서 구체적으로는 포화 또는 불포화 지방산, 지방산 디케톤 (fatty acid diketone), 터핀 (terpene), 프로스타글란딘 (prostaglandin), 비타민, 카로티노이드 (carotenoid), 스테로이드 (steroid), 또는 합성 화합물, 구체적으로는 탄산 (carbon acid), 알코올, 아민 (amine), 하나 이상의 알킬 (alkyl), 알릴 (aryl), 알키닐 (alkenyl), 혹은 다른 여러 불포화 화합물을 가진 술폰산일 수 있다.
　펩타이드 트랜스덕션 도메인 (peptide transduction domain)이란 세포막 단백질을 침투해 들어갈 수 있는 단백질을 말하며, 다른 화합물과 결합이 되어 생성된 복합체가 세포막 안으로 들어가게 해줄 수 있는 능력을 부여할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 펩타이드 트랜스덕션 도메인은 이미 알려진 막투과 특성을 지닌 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, L2는 서열번호 1의 C말단과 Z를 연결하는 단일 결합 또는 연결고리 역할을 하는 화합물인 것일 수 있다.
단일결합 또는 연결고리 역할을 하는 화합물, 즉, L1또는 L2는 상기 X 혹은 상기 Z와 상기 작용제 펩타이드의 아미노산 서열의 N 또는 C말단사이에서 위치해서 상기 작용제 펩타이드의 안정성을 부가시켜줄 수 있는 화합물로서, 구체적으로 최소 2개의 작용기일 수 있다. L1또는 L2는 2개 그리고 여러 개의 작용기, 예를 들어 알킬기 (alkyl-), 알릴기 (aryl-), 아랄킬기 (arakyl-) 또는 펩타이드 작용기일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 서열번호1은 Tyr-Tyr-Phe-Ala-Tyr-His-Pro-Asn-Ile-Pro-Gly-Leu-Tyr-Tyr-Phe (서열번호 2); Trp-Tyr-Phe-Ala-Tyr-His-Pro-Asn-Ile-Pro-Gly-Leu-Trp-Tyr-Phe (서열번호3); 및 Phe-Tyr-Phe-Ala-Tyr-His-Pro-Asn-Ile-Pro-Gly-Leu-Phe-Tyr-Phe (서열번호4)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 “안구 질환 (ocular disease)"은 눈에 영향을 미치는 장애 및 병태를 의미한다. 본 발명의 일 구현예에서, 안구 질환은 건성각결막염 (keratoconjunctivis sicca; KCS), 아토피성 각결막염 (atopic keratoconjunctivitis; AKC), 봄철 각결막염 (vernal keratoconjunctivitis; VKC), 녹내장 (glaucoma), 각막염(keratitis), 각막 상피 침식 (corneal epithelium erosion), 포도막염 (uveitis), 안내 염증 (intraocular inflammation), 안구 건조증 (dry eye syndrome), 안구 건조증 안구 감염 (dry-eye syndrome ocular infections), 안구 감염 (ocular infections), 안구 알레르기 (ocular allergy), 각막 또는 결막 병변 (corneal or conjunctival lesions), 당뇨병성 황반 부종 (diabetic macular edema) 및 연령-관련 황반 변성 (age-related macular degeneration)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있고, 예를 들어, 안구 질환은 안구 건조증 또는 안구 건조증 안구 감염일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물 내의 유효성분의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 1일 투여량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절될 수 있으며 유효성분 함량 기준으로 1 내지 1000 μg/ml일 수 있고, 예를 들면 0.001 내지 10000 mg/kg일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하, 안구 등의 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들어 안구내로 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 안구 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 안구 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 단일제로도 사용할 수 있으며, 공인된 안질환 예방 또는 치료 효과를 가진다고 알려진 약학 조성물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가하여 약제학적 단위 투여형으로 제형화할 수 있다.
본 발명에 있어서, "약학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물은 점안액, 인공 눈물, 겔, 연고, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 안내 투여를 위한 안약, 안액 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 에틸렌다이아민테트라아세트산 (ethylene-diamine-tetraacetic acid; EDTA)를 포함하는 것일 수 있다. 에틸렌다이아민테트라아세트산은 항산화제로 약제학적 조성물에 포함될 수 있으며, 산화에 취약한 단백질 의약품의 분해를 방지하는 것이 가능하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 에틸렌다이아민테트라아세트산은 조성물의 안정성을 약화시키는 중황산나트륨 (sodium bisulfate)과 달리 시료의 분해를 일으키지 않으면서도 약제학적 조성물에 포함된 펩타이드의 안정성을 높일 수 있음이 확인되었다 (실시예 9 참조).
본 발명의 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 0.01 내지 1, 0.1 내지 0.9%, 0. 15 내지 0.85%, 0.2 내지 0.8%, 0.25 내지 0.75%, 0.3 내지 0.7%, 0.35 내지 0.65%, 0.4 내지 0.6%, 0.45 내지 0.55% (w/v), 예를 들어, 0.5 % (w/v)의 에틸렌다이아민테트라아세트산을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 정상인과 안구건조증의 중간 정도의 점도를 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 1 내지 20, 2 내지 18, 3 내지 17, 4 내지 16, 5 내지 15, 6 내지 14, 7 내지 13, 8 내지 12, 예를 들어, 10 cP의 점도를 갖는 것일 수 있다. 약제학적 조성물의 점도를 조정하기 위한 성분으로는 히알루론산 (hyaluronic acid) 또는 히알루론산염이 포함될 수 있다. 발명의 구체적인 실시예에서 히알루론산은 조성물의 안정성을 약화시키지 않으면서도 점도를 조성할 수 있는 것으로 확인되었다 (실시예 9 참조). 또한, 일 실시예에 따른 약제학적 조성물은 히알루론산 또는 히알루론산 나트륨을 0.01 내지 1, 0.05 내지 0.95, 0.05 내지 0.90, 0.05 내지 0.8, 0.05 내지 0.7, 0.05 내지 0.6, 0.05 내지 0.5, 0.05 내지 0.4, 0.05 내지 0.3, 0.05 내지 0.2, 0.06 내지 0.15, 0.06 내지 0.15, 0.08 내지 0.15, 0.08 내지 0.12, 또는 0.1 % (w/v) 농도로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 5.0 내지 9.0, 5.2 내지 8.8, 5.4 내지 8.6, 5.6 내지 8.6, 5.8 내지 8.4, 6.0 내지 8.2, 6.0 내지 8.0, 6.2 내지 7.8 또는 6.5 내지 7.6의 pH인 것일 수 있다. pH조정을 위한 성분으로는 물, 염화수소산 (HCl), 수산화나트륨 (NaOH) 인산나트륨 완충액 및/또는 아지드화나트륨이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 280 내지 340, 290 내지 330, 290 내지 320, 280 내지 310, 290 내지 310 mOsm/kg의 삼투압 농도를 갖는 것일 수 있다. 삼투압을 조정하기 위한 시료로는 트레할로오스 및/또는 만니톨이 이용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 트레할로스 또는 만니톨 단독 제형 및 트레할로스/만니톨 복합제형은 염류, PEG등의 다른 시료를 첨가한 제형과 안정성 비교했을 때 안정성이 더 우수한 것으로 확인되었다.
본 발명의 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 트레할로스를 1.0 내지 20.0, 2.0 내지 18.0, 3.0 내지 17.0, 4.0 내지 16.0, 5.0 내지 15.0, 6.0 내지 14.0, 7.0 내지 13.0, 8.0 내지 12.0, 7.0 내지 11.0, 8.0 내지 10.0, 8.2 내지 9.8, 8.4 내지 9.6, 8.6 내지 9.4, 8.8 내지 9.0 또는 9.0 % (w/v) 농도로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 펩타이드를 0.1 내지 5, 0.1 내지 4.5, 0.1 내지 4.0, 0.1 내지 3.5, 0.1 내지 3.0, 0.1 내지 3.0, 0.1 내지 2.5, 0.1 내지 2.0, 0.1 내지 1.0, 0.1 내지 0.9, 0.1 내지 0.8, 0.1 내지 0.7, 0.1 내지 0.6, 0.2 내지 0.8, 0.3 내지 0.7, 0.4 내지 0.6 또는 0.5 % (w/v) 농도로 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물에서 서열번호 1에 따른 펩타이드가 0.5 내지 1.5 % 또는 0.5% 농도로 포함되는 경우 삼투압이 안약 제제의 적정 삼투압 농도인 약 300 mOsm/kg으로 유지될 수 있으면서 점도 또한 정상인과 안구 건조증의 중간 정도인 약 10 cP가 달성되는 것이 확인되었다.
본 발명의 다른 양태는 약제학적 조성물을 안구 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 안구 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, "개체"란 안구 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 안질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 기존의 치료제와 병행하여 투여함으로써 시너지적인 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, "투여"란 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 안내 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 또한, 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이 될 수 있다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르 (예, 올레인산에칠 등), 알코올 류 (예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제 (예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 용도는 약제학적 조성물의 안구 질환 치료 용도이다.
본 발명은 아디포넥틴 수용체에 대한 작용제 펩타이드를 포함하는 안구 질환의 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 눈물량 개선, 눈물 분해시간 연장, 항염 효과 및 항-아폽토시스 효과가 우수한 동시에, 점안액 형태의 제형에서도 안정도가 우수하여, 안구 건조증을 비롯한 다양한 안구 질환의 치료용 조성물로 이용될 수 있다.
도 1은 마우스 모델에서 대조군 (EDE), 비히클 그룹 (PBS) 및 (PEG)-BHD1028 투여군 (0.001%, 0.01% 및 0.1%)의 5일째 및 10일 째의 눈물 생산량을 페놀레드쓰레드 테스트를 통해 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2은 토끼 모델에서 비히클 그룹 (PBS), (PEG)-BHD1028 투여군 (0.1%, 0.2% 및 0.4%) 및 사이클로스포린 (0.05%) 투여군의 5일째 및 10일 째의 Schirmer tear test (STT) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 토끼 모델에서 비히클 그룹 (PBS), (PEG)-BHD1028 투여군 (0.1%, 0.2% 및 0.4%) 및 사이클로스포린 (0.05%) 투여군의 베이스라인, 0일째, 5일째 및 10일 째의 Schirmer tear test (STT) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 마우스 모델에서 대조군 (EDE), 비히클 그룹 (PBS) 및 (PEG)-BHD1028 투여군 (0.001%, 0.01% 및 0.1%)의 5일째 및 10일 째의 눈물막 파괴 시간 (tear filmbreak-up time; TBUT)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 토끼 모델에서 비히클 그룹 (PBS), (PEG)-BHD1028 투여군 (0.1%, 0.2% 및 0.4%) 및 사이클로스포린 (0.05%) 투여군의 5일째 및 10일 째의 TBUT를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 토끼 모델에서 비히클 그룹 (PBS), (PEG)-BHD1028 투여군 (0.1%, 0.2% 및 0.4%) 및 사이클로스포린 (0.05%) 투여군의 베이스라인, 0일째, 5일째 및 10일 째의 TBUT를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 마우스 모델에서 대조군 (EDE), 비히클 그룹 (PBS) 및 (PEG)-BHD1028 투여군 (0.001%, 0.01% 및 0.1%)의 5일째 및 10일 째의 임상적 중증도를 각막 형광염색법 (CFS)을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프 및 사진이다.
도 8은 토끼 모델에서 비히클 그룹 (PBS), (PEG)-BHD1028 투여군 (0.1%, 0.2% 및 0.4%) 및 사이클로스포린 (0.05%) 투여군의 5일째 및 10일 째의 CSS를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 토끼 모델에서 비히클 그룹 (PBS), (PEG)-BHD1028 투여군 (0.1%, 0.2% 및 0.4%) 및 사이클로스포린 (0.05%) 투여군의 베이스라인, 0일째, 5일째 및 10일 째의 CSS를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 토끼 모델에서 비히클 그룹 (PBS), (PEG)-BHD1028 투여군 (0.1%, 0.2% 및 0.4%) 및 사이클로스포린 (0.05%) 투여군의 베이스라인, 0일째, 5일째 및 10일 째의 임상적 중증도를 각막 형광염색법 (CFS)을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 11은 마우스 모델에서 대조군 (EDE), 비히클 그룹 (PBS) 및 (PEG)-BHD1028 투여군 (0.001%, 0.01% 및 0.1%)의 항염증 효과를 측정하기 위해 각막 (cornea), 결막 (conjunctiva) 및 누선 (lacrimal gland)에서 CD4 + IFN-γ + T 세포 밀도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 마우스 모델에서 대조군 (EDE), 비히클 그룹 (PBS) 및 (PEG)-BHD1028 투여군 (0.001%, 0.01% 및 0.1%)의 항염증 효과를 측정하기 위해 각막 (cornea), 결막 (conjunctiva) 및 누선 (lacrimal gland)에서 CD4 + IFN-γ + T 세포 밀도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 마우스 모델에서 대조군 (EDE), 비히클 그룹 (PBS) 및 (PEG)-BHD1028 투여군 (0.001%, 0.01% 및 0.1%)의 항염증 효과를 측정하기 위해 각막 (cornea), 결막 (conjunctiva) 및 누선 (lacrimal gland)에서 CD11b+ T 세포 수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 마우스 모델에서 대조군 (EDE), 비히클 그룹 (PBS) 및 (PEG)-BHD1028 투여군 (0.001%, 0.01% 및 0.1%)의 항염증 효과를 측정하기 위해 각막 (cornea), 결막 (conjunctiva) 및 누선 (lacrimal gland)에서 CD11b+ T 세포 수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 DED 토끼 모델에서 비히클 그룹 (PBS), (PEG)-BHD1028 투여군 (0.1%, 0.2% 및 0.4%) 및 사이클로스포린 (0.05%) 투여군의 각막실질의 면역세포수를 H&E을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 DED 토끼 모델에서 비히클 그룹 (PBS), (PEG)-BHD1028 투여군 (0.1%, 0.2% 및 0.4%) 및 사이클로스포린 (0.05%) 투여군의 결막에서의 면역세포수를 H&E을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 DED 토끼 모델에서 비히클 그룹 (PBS), (PEG)-BHD1028 투여군 (0.1%, 0.2% 및 0.4%) 및 사이클로스포린 (0.05%) 투여군의 누선에서의 면역세포수를 H&E을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은 DED 토끼 모델에서 비히클 그룹 (PBS), (PEG)-BHD1028 투여군 (0.1%, 0.2% 및 0.4%) 및 사이클로스포린 (0.05%) 투여군의 각막 두께를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 마우스 모델에서 대조군 (EDE), 비히클 그룹 (PBS) 및 (PEG)-BHD1028 투여군 (0.001%, 0.01% 및 0.1%)의 항아포톱시스 효과를 측정하기 위해 TUNEL 분석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 20은 DED 토끼 모델에서 비히클 그룹 (PBS), (PEG)-BHD1028 투여군 (0.1%, 0.2% 및 0.4%) 및 사이클로스포린 (0.05%) 투여군의 각막에서 아폽토시스 세포를 검출한 결과를 나타낸 도면이다. [(a) 대조군 (정상); (b) 베히클; (c) 0.05% Cyclosporine; (d) 0.1% (PEG)-BHD1028; (e) 0.2% (PEG)-BHD1028; 및 (f) 0.4% (PEG)-BHD1028]
도 21은 DED 토끼 모델에서 비히클 그룹 (PBS), (PEG)-BHD1028 투여군 (0.1%, 0.2% 및 0.4%) 및 사이클로스포린 (0.05%) 투여군의 결막에서 아폽토시스 세포를 검출한 결과를 나타낸 도면이다. [(a) 대조군 (정상); (b) 베히클; (c) 0.05% Cyclosporine; (d) 0.1% (PEG)-BHD1028; (e) 0.2% (PEG)-BHD1028; 및 (f) 0.4% (PEG)-BHD1028]
도 22는 10일째 토끼 EDE 모델에서 0.4%(PEG)-BHD1028과 0.05% 사이클로스포린의 모든 시험 결과 (STT-2, TBUT, CFS, 면역세포수)를 Student's t-test를 이용하여 비교 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 (PEG)-BHD1028을 이용한 점안액의 항산화제로 황산 수소 나트륨 (sodium bisulfate)를 설정하여 40℃에서 7일간 보관한 뒤 분석을 진행했을 때의 안정성을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 24는 (PEG)-BHD1028을 이용한 점안액의 항산화제로 EDTA 나트륨 (0.5% sodium EDTA)를 설정하여 40℃에서 25일간 보관한 뒤 분석을 진행했을 때의 안정성을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 25는 (PEG)-BHD1028을 이용한 점안액의 항산화제로 EDTA 나트륨을 포함 (0.5% sodium EDTA)시키지 않은 점안액의 안정성을 40℃에서 25일간 보관한 뒤 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 26은 (PEG)-BHD1028을 이용한 점안액에 0.1%의 히알루론산을 포함시켜 0일차의 안정성을 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 27은 (PEG)-BHD1028을 이용한 점안액에 0.1%의 히알루론산을 포함시켜 7일차의 안정성을 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 28은 (PEG)-BHD1028을 이용한 점안액에 0.1%의 히알루론산을 포함시켜 30일차의 안정성을 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 29는 (PEG)-BHD1028을 이용한 점안액에 0.1%의 히알루론산을 포함시켜 37일차의 안정성을 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 30은 (PEG)-BHD1028을 이용한 점안액의 희석제로 물 (위) 및 PBS (아래)를 사용하여 안정성을 테스트한 결과를 나타낸 도면이다.
도 31은 (PEG)-BHD1028을 이용한 점안액의 삼투압 유지제로 KCl (아래) 및 NaCl (위)을 사용하여 안정성을 테스트한 결과를 나타낸 도면이다.
도 32는 (PEG)-BHD1028을 이용한 점안액의 삼투압 유지제로 PEG400 (상단), PEG5000 (중단) 및 PEG3350 (하단)을 사용하여 안정성을 테스트한 결과를 나타낸 도면이다.
도 33은 (PEG)-BHD1028을 이용한 점안액의 삼투압 유지제로 트레할로스를 사용하여 안정성을 테스트한 결과를 나타낸 도면이다.
도 34은 (PEG)-BHD1028을 이용한 점안액의 삼투압 유지제로 만니톨을 사용하여 안정성을 테스트한 결과를 나타낸 도면이다 (40도에서 6일간 보관).
도 35은 (PEG)-BHD1028을 이용한 점안액의 삼투압 유지제로 트레할로스 및 만니톨 복합 사용하여 안정성을 테스트한 결과를 나타낸 도면이다.
도 36은 비히클 그룹 (PBS), 점안액 베히클 (Fomulated Vehicle) 및 (PEG)-BHD1028 점안액 (0.5% (PEG)-BHD1028 투여군)의 각막 손상 개선 정도를 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 37은 비히클 그룹 (PBS), 점안액 베히클 (Fomulated Vehicle) 및 (PEG)-BHD1028 점안액 (0.5% (PEG)-BHD1028 투여군) 투여에 따른 각막 두께를 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 38는 비히클 그룹 (PBS), 점안액 베히클 (Fomulated Vehicle) 및 (PEG)-BHD1028 점안액 (0.5% (PEG)-BHD1028 투여군)의 각막실질의 면역세포수를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 39는 비히클 그룹 (PBS), 점안액 베히클 (Formulated Vehicle) 및 (PEG)-BHD1028 점안액 (0.5% (PEG)-BHD1028 투여군)의 결막에서의 면역세포수를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 40은 비히클 그룹 (PBS), 점안액 베히클 (Formulated Vehicle) 및 (PEG)-BHD1028 점안액 (0.5% (PEG)-BHD1028 투여군)의 누선에서의 면역세포수를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 41은 비히클 그룹 (PBS), 점안액 베히클 (Formulated Vehicle) 및 (PEG)-BHD1028 점안액 (0.5% (PEG)-BHD1028 투여군)의 각막실질에서의 항아포톱시스 효과를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 42는 비히클 그룹 (PBS), 점안액 베히클 (Formulated Vehicle) 및 (PEG)-BHD1028 점안액 (0.5% (PEG)-BHD1028 투여군)의 결막에서의 항아포톱시스 효과를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 43은 비히클 그룹 (PBS), 점안액 베히클 (Formulated Vehicle) 및 (PEG)-BHD1028 점안액 (0.5% (PEG)-BHD1028 투여군)의 누선에서의 항아포톱시스 효과를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
1-1. (PEG)-BHD1028의 합성
(PEG)-BHD1028은 아미노산 서열은 NH2-Tyr-Tyr-Phe-Ala-Tyr-His-Pro-Asn-Ile-Pro-Gly-Leu-Tyr-Tyr-Phe-COOH 이다. (PEG)-BHD1028의 제조 공정은 (1) 펩타이드 합성 및 (2) PEG화 및 염 교환의 두 가지 단계로 구성된다. 펩타이드는 고정 수지 (H-Phe-2Cl-Trt-Resin)의 팽윤 및 커플링으로 시작하여 Fmoc (9-플루오레닐메톡시카보닐) 고상 합성 공정에 의해 합성하였다. 첫 번째 아미노산의 C-말단은 HBTU/N-Methylmorpholine/DMF와 혼합하여 앵커 수지와 연결하였다. 그런 다음, 피페리딘/디메틸포름아미드 (DMF)를 사용하여 Fmoc를 탈보호하였다. 아미노산은 카복실산 말단을 활성화한 후 성장하는 사슬에 연결되었다. 마지막 N-terminal tyrosine amino acid가 붙을 때까지 이 과정이 반복되었다. 합성이 끝나면 수지의 allyloxycarbonyl (alloc) amino acid 보호기를 trifluoroacetic acid (TFA)로 처리하여 펩타이드에서 제거하였다. 생성된 펩타이드는 에테르에 침전되어 조 선형 펩타이드, 중간체를 얻었다. 중간 펩타이드는 역상 HPLC에 의해 정제 및 농축된다. 5 kDa 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)로 페길화한 조 PEG화 펩티드는 RP-HPLC에 의한 1차 정제 및 재순환 정제를 거친 후, RP-HPLC를 사용한 아세테이트 교환이 뒤따랐다. 그런 다음 염 교환 펩타이드를 동결 건조하였다. (PEG)-BHD1028의 화학적 특성을 확인하기 위해 FT-IR 분광법 (FT-IR 4600, JASCO, Japan) 및 MALDI-TOF MS 분석 (ABSCIEX TOF/TOF™5800, USA)을 사용하여 API 배치의 구조 확인 및 온전한 질량을 확인했다.
1-2. 동물 실험
실험 프로토콜 및 동물 관리는 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 지침을 준수했으며, 전남대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다. 동물 연구의 승인 날짜 및 코드는 쥐의 경우 2021년 2월 16일 CNUHIACUC-21009, 토끼의 경우 2021년 9월 28일 CNU IACUC-YB-2021-123이었다. 본 연구에서는 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스와 체중 2~3kg의 뉴질랜드 흰토끼 (다물사이언스, 한국)를 사용하였다.
1-3. 연구 설계 및 DED 모델링
약리학적 효과와 적정 용량을 확인하기 위해 실험을 먼저 마우스를 대상으로 한 파일럿 연구를 진행하였다. 또한, 정안면이 많이 노출된 토끼 DED (Dry Eye Disease) 모델을 마우스 모델과 비교하여 평가하였다. 마우스의 EDE (Experimental dry eye) 모델에서 주변 습도가 40% 미만인 25 ± 2 º의 방에서 통풍에 노출된 상태에서 스코폴라민 하이드로브로마이드 (scopolamine hydrobromide, Sigma-Aldrich. St. Louis, MO, USA)를 하루에 세 번 (오전 9시, 오후 1시 30분, 오후 6시) 피하 주사하여 DED를 유도했다.
마우스를 다음과 같이 무작위로 5개 그룹으로 나누었다: (1) 안약을 투여받지 않은 EDE (Experimental dry eye) 대조군 마우스, (2) 비히클 (인산 완충 식염수)로 처리된 EDE 마우스, (3) 0.001%(PEG)-BHD1028로 처리된 EDE 마우스, (4) 0.01% (PEG)-BHD1028로 처리된 EDE 마우스, 및 (5) 0.1%(PEG)-BHD1028로 처리된 EDE 마우스. 모든 치료 그룹은 하루에 세 번 2μL 안약을 받았다.
DED의 토끼 모델은 0.1% BAC (benzalkoniumchloride) 방울 (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 하루 2회 (오전 8시 및 오후 4시) 국소 투여하여 유도하였다. BAC 치료 전 대조군 (기준선, 나이브)은 Schirmer tear test (STT), TBUT, 각막 염색 점수 (CSS)와 같은 표준 안구건조증 임상 검사를 받았다. BAC 처리 후 안구건조증 유발이 확인되었으며, 안구건조증 유발을 유지하면서 10일간 시험물질을 투여하였다. 토끼를 다음과 같이 무작위로 5개 그룹으로 나누었다: (1) 비히클 (인산염 완충 식염수)로 처리된 EDE 토끼, (2) 0.1% (PEG)-HD1028로 처리된 EDE 토끼, (3) 0.2% (PEG)-BHD1028로 처리된 EDE 토끼, (4) 0.4% (PEG)-BHD1028로 처리된 EDE 토끼, 및 (5) 0.05% 사이클로스포린으로 처리된 EDE 토끼 (국제약품(주), 대한민국 성남). 시험물질은 양쪽 눈에 BID (bis in die) 국소 도포하였다.
1-4 눈물량 측정
눈물 분비량은 페놀 레드가 함유된 면사 (Zone-QuickTM; Oasis Medical, Inc., Glendora, CA, USA)를 마우스 눈의 외안각측 결막낭에 접촉시켜 20초 동안 측정하였다. Nikon SMZ1500 현미경을 사용하여 길이를 측정한 후 길이를 규정된 공식에 대입하여 값을 부피로 환산하였다. 토끼의 눈물 생산량은 0일, 5일 및 10일에 Whatman 41 여과지 스트립 (Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Tianjin, China)을 사용하여 수정된 Schirmer 눈물 테스트로 측정되었다. 토끼의 눈 검사는 마취하에 수행되었다. 마취는 xylazine (3 mg/kg, Rompun®Bayer Korea, Korea)을 근육주사하고 10 mg/kgtiletamine/zolazepam (Zoletil®Virbac Laboratories, Carros, France)을 근육주사하여 진정상태에서 시행하였다. 프로파라카인 HCl 0.5% (Alcaine®Alcon Korea Ltd., Seoul, Korea) 1방울을 적하한 후 Weck-cel®셀룰로오스 안약으로 과도한 눈물과 점안액을 제거했다. 종이 스트립의 젖은 길이(mm)는 5분 후에 판독되었다.
1-5. 눈물 분해 시간 (Tear Break-Up Time; TBUT) 측정
TBUT는 마지막 깜박임과 플루오레세인의 분해가 처음 나타나는 사이의 경과 시간이며 눈물막 안정성의 지표이다. TBUT는 마우스의 하부 결막낭에 1 μL의 1% 플루오레세인 나트륨 염료를 투여하고 세극등 생체현미경의 코발트 청색광을 사용하여 눈물막을 시각화하여 평가했다. 측정을 3회 반복하여 평균값을 얻었다.
1-6. 각막 형광 염색 평가
대상체는 각막 염색으로 평가되었고 눈꺼풀, 각막 및 결막의 비정상적인 소견이 기록되었다. 1 μL의 1% 형광염색액을 적하하고 식염수로 세척한 후 세극등현미경 (slit-lamp microscope)으로 각막을 관찰한 후 채점하여 상피손상 정도 (형광염색 정도)를 평가하였다. 각막 염색은 NEI 염색 그리드를 사용하여 등급을 매겼으며 0에서 3 (0 = 정상, 1 = 약함, 2 = 보통, 3 = 심함)의 척도가 5개 각막 영역 (비강, 중심부, 측두, 아래쪽 및 위쪽) 최대 총점 15점으로 평가되었다.
1-7. 마우스의 안구 표면 염증 평가
각막, 결막, 분석에 필요한 각 조직을 가위로 절제하고 절개한 후 0.5 mg/mL 콜라게나제 D형으로 37 º에서 1시간 동안 진탕하였다. 조직을 분쇄한 후, 혼합물을 셀 스트레이너에 통과시키고, 원심분리하고, 1% 우혈청 알부민이 함유된 인산완충식염수에 재현탁하였다.
1-8. 토끼의 안구표면 염증세포 침윤에 대한 조직병리학적 평가
적출된 눈은 PBS (phosphate-buffered saline)로 세척하고 Modified Davidson's 용액에 고정한 다음 파라핀 (Histocore Arcadia, Leica, Wetzlar, Germany)에 포매했다. 그 후, 파라핀 블록을 ~6 μm 두께의 섹션으로 슬라이스하고 현미경 슬라이드 (HistoCore AUTOCUT, Leica, Germany)에 장착하고 공기 건조하고 헤마톡실린-에오신으로 염색했다. 염색된 조직 슬라이드를 영상화하여 광학 현미경/디지털 슬라이드 스캐너 (Axio Scan.Z1, Zeiss, Oberkochen, Germany)로 데이터를 얻었고, ZEN (Zeiss, Germany) 및 ImageJ (NIH, Bethesda, MA, 미국) 프로그램을 이용하여 영상 측정하였다.
1-9. 아폽토시스 평가
각 그룹에서 눈과 부속기를 절제하고 Modified Davidson 용액에 고정하고 파라핀에 포매한 다음 조직 절편을 TUNEL 염색했다. 각 절에서 ZEN (Zeiss, Oberkochen, Germany)과 Image J v1.51j8 소프트웨어(NIH, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 각막 및 결막의 세포사멸 정도를 측정하였다.
1-10. 통계 분석
결과의 변동성은 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 표현되었으며 p-값이 <0.05일 때 유의한 것으로 간주되었다. GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 사용하여 Dunnett의 다중 비교에 이어 Student's t-test 또는 일원 분산 분석을 사용하여 통계 분석을 수행했다.
실시예 2: 실험적으로 유도된 안구 건조증 (EDE)의 0일째 안과 검사 기준선
치료 시작 전 (0일) 그룹화를 위해 건강한 (기준선) 동물과 EDE 동물의 눈물량, 눈물막 파괴 시간 및 각막 플루오레세인 염색을 포함한 안과 검사를 수행했으며 각 그룹 내에서 유의미한 불일치를 나타내지 않았다.
실시예 3: 각 EDE 동물 모델의 눈물 생산량 평가
치료 후 5일과 10일에 마우스의 눈물량을 PRT (Phenol Red Thread) 테스트를 사용하여 측정했다. 5일과 10일에 EDE 동물에 비해 3개의 (PEG)-BHD1028 처리군 모두에서 눈물량이 유의하게 증가했다. 0.01% 및 0.1% (PEG)-BHD1028 그룹의 눈물량은 5일차부터 비히클 그룹보다 훨씬 더 컸고(0.01% 그룹: p < 0.01 및 0.1% 그룹: p < 0.001 vs. 비히클) 10일차에는 용량 의존적 증가 (0.01% 그룹: p < 0.01 및 0.1% 그룹: p < 0.001 대 0.001% 그룹)를 보여주었다 (도 1 및 표 1 참조).
마우스모델 안구건조 유도 후 기간 EDE Vehucle (PBS) (PEG)-BHD1028
0.001% 0.01% 0.1%
Tear volume
(μL)		 5일째 0.019 ± 0.002 0.020 ± 0.004 0.024 ± 0.003 0.026 ± 0.003 0.028 ± 0.002
10일째 0.016 ± 0.002 0.018 ± 0.002 0.021 ± 0.002 0.027 ± 0.003 0.032 ± 0.004
TBUT
(sec)		 5일째 1.304 ± 0.086 1.324 ± 0.114 1.333 ± 0.081 1.406 ± 0.082 1.408 ± 0.095
10일째 1.193 ± 0.092 1.229 ± 0.060 1.359 ± 0.140 1.530 ± 0.137 1.483 ± 0.113
CFS
(score)		 5일째 10.875 ± 2.357 10.250 ± 2.435 9.875 ± 1.808 8.625 ± 1.598 8.125 ± 1.553
10일째 12.375 ± 1.923 12.625 ± 1.302 11.000 ± 1.927 7.625 ± 1.598 8.375 ± 1.302
토끼 모델 연구에서는 0.1%, 0.2%, 0.4% (PEG)-BHD1028 용액을 시험하였고, 0.05% 사이클로스포린 처리군을 양성 기준 및 비교군으로 포함시켰다. Schirmer's tear test (STT)를 이용하여 측정한 눈물량은 다른 모든 군에서 5일째에 비히클군에 비해 0.1% (p<0.001), 0.2% (p<0.05), 0.4% (PEG)-BHD1028 (p < 0.01) 그룹 및 0.05% 사이클로스포린 처리 그룹 (p < 0.01)에서 유의적으로 증가하였다 (표 2 참조).
토끼 모델 안구건조 유도 후 기간 Vehicle (PEG)-BHD1028 Cyclosporine
0. 1% 0.2% 0.4%
STT-2
(mm)		 베이스라인 9.83 ± 1.74 6.6 7± 0.96 8.50 ± 1.39 9.17±1.23 8.33 ± 0.38
0일째 (EDE) 2.67 ± 1.10 3.00 ± 1.22 3.33 ± 1.28 3.33±1.22 2.50 ± 1.10
5일째 1.17 ± 0.50 4.67 ± 0.65 3.33 ± 0.51 4.33±0.45 4.17 ± 0.37
10일째 2.17 ± 0.64 6.50 ± 0.87 7.50 ± 0.99 6.67±1.02 4.33 ± 0.45
TBUT
(sec)		 베이스라인 48.33 ± 3.88 49.67 ± 3.17 49.83 ± 2.10 53.00 ± 2.29 52.00 ± 2.25
0일째 (EDE) 8.20 ± 0.51 8.50 ± 1.0 8.89 ± 1.34 8.22 ± 1.16 8.92 ± 1.3
5일째 8.81 ± 1.20 10.64 ± 0.99 15.68 ± 1.58 19.88 ± 1.42 11.19 ± 1.17
10일째 10.22 ± 1.97 17.88 ± 1.91 17.72 ± 1.74 22.71 ± 1.87 11.49 ± 2.23
CFS
(score)		 베이스라인 0.33 ± 0.19 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.17 ± 0.15
0일째 (EDE) 8.75 ± 0.46 6.67 ± 0.30 9.17 ± 0.37 8.00 ± 0.62 6.05 ± 1.20
5일째 8.50 ± 0.89 7.17 ± 1.21 6.83 ± 0.64 5.67 ± 0.38 5.67 ± 0.81
10일째 12.50 ± 1.24 6.67 ± 0.56 6.17 ± 0.55 3.83 ± 0.64 6.17 ± 1.04
10일 후, 모든 (PEG)-BHD1028의 눈물 생성은 비히클에 비해 크게 증가했다 (p < 0.01) (표 2 및 도 2 및 3 참조). 그러나, 10일째 0.05% 사이클로스포린 그룹의 측정된 눈물량은 5일차나 비히클 그룹보다 크게 증가하지 않았다.
실시예 4: TBUT 평가
눈물막 불안정성은 DED의 중요한 병리학적 특성이며 눈물의 질을 나타내는 가장 일반적인 지표이다. 플루오레세인 염료를 사용하여 눈물막 파괴까지의 시간을 측정하여 평가하며, 그 기간을 "눈물막 파괴 시간 (tear filmbreak-up time; TBUT)”으로 기록하였다. EDE 마우스 모델에서 TBUT는 처리 10일 후 비히클 그룹과 비교하여 p < 0.05에서 모든 (PEG)-BHD1028 그룹에서 유의하게 연장되었다(표 2 및 도 4 참조). 0.01%(PEG)-BHD1028 그룹의 개선은 10일째에 0.001%(PEG)-BHD1028 그룹보다 컸지만 (p < 0.05), 0.01%와 0.1% 사이에는 차이가 없었다. EDE 토끼 모델에서, 모든 (PEG)-BHD1028 처리 그룹의 TBUT는 5일째에 각각 p < 0.01 및 p < 0.001에서 비히클 그룹의 TBUT보다 상당히 컸다 (표 2 및 도 5 참조). 10일 후, 0.4% (PEG)-BHD1028 그룹의 TBUT는 비히클 그룹에 비해 크게 증가했다 (p < 0.01). 통계적으로 유의하지는 않지만 0.1% 및 0.2%의 TBUT -치료군은 치료 10일 후 비히클군 또는 0.05% 사이클로스포린군에 비해 개선되었다 (각각 p < 0.058 및 p < 0.065). 0.2% 및 0.4%(PEG)-BHD1028 그룹의 TBUT는 시간이 지남에 따라 지속적으로 증가하는 경향을 보인 반면 비히클 또는 0.05% 사이클로스포린 그룹의 TBUT는 정체되는 경향이 있었다 (도 6 참조).
실시예 5. CFS 점수 평가
각막의 임상적 중증도는 이물질 및 각막 표면 손상을 검출하기 위해 널리 사용되는 각막 형광염색법 (CFS)을 이용하여 평가하였다. CFS 점수가 높을수록 더 심각한 각막 상피병증을 나타낸다. 표 1 및 도 7에서 볼 수 있듯이, 0.1% (PEG)-BHD1028 처리 마우스 그룹의 평균 CFS 점수는 5일 후 EDE 그룹보다 현저히 낮았다 (p < 0.05). 처리 10일 후, 0.01% 및 0.1%(PEG)-BHD1028 처리 동물의 점수는 EDE보다 유의하게 낮았다.
EDE 토끼 모델에서는 치료 5일 후 전체 (PEG)-BHD1028 또는 0.05% 사이클로스포린 처리군과 비히클군 사이에 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 그러나 10일 후 CFS 점수는 비히클 그룹에 비해 모든 (PEG)-BHD1028 그룹 및 사이클로스포린 0.05% (p< 0.01) 처리된 동물에서 용량 의존적으로 유의하게 감소했다 (표 2, 도 8 및 도 10 참조). 또한, 0.2% 및 0.4%(PEG)-BHD1028 처리군의 1일부터 10일까지의 CFS 점수 변화의 동적 기울기는 각각 -0.42 및 -0.33인 반면, 0.05% 사이클로스포린 그룹의 기울기는 +0.013이었다. 이러한 결과는 임상적 중증도 개선에 대한 0.2% 및 0.4%(PEG)-BHD1028의 치료 효과가 0.05% 사이클로스포린의 치료 효과보다 우수함을 의미한다(도 9 내지 도 10 참조).
실시예 6: 항염 효과 (Anti-Inflammatory Effect) 확인
DED에서 각막 장벽 파괴 및 상피 세포 손실은 골수 및 T 세포 침윤을 동반한다. 활성화된 T 림프구는 안구 표면에서 세포 사멸을 촉진하는 Th-1 사이토카인 및 인터페론 (IFN)-γ의 주요 생산자이다. EDE 마우스 모델에서 (PEG)-BHD1028의 항염증 효과를 평가하기 위해, 염증 세포 표면 마커를 담당하는 면역 세포는 그룹당 한 마리의 동물로 유세포 분석법으로 정량화되었다.
CD4 + IFN-γ+ -T-세포 밀도는 EDE 및 비히클 그룹의 각막에서 각각 23.15% 및 22.83%인 반면, 0.001%, 0.01% 및 0.1% (PEG)-BHD1028 그룹은 각각 18.62%, 16.78% 및 11.66% 였다. EDE 및 비히클 그룹의 결막에서 CD4 + IFN-γ+ T 세포 밀도는 각각 24.89% 및 22.15%였으며, 0.001%, 0.01% 및 0.1%(PEG)-BHD1028 그룹은 각각 18.96%, 15.31%, 9.91% 였다. EDE군과 비히클군의 눈물샘에서 CD4+IFN-γ세포 밀도는 각각 21.00%, 22.67%였으며, 면역세포는 0.001%, 0.01%, 0.1%(PEG)-BHD1028군에서 각각 18.45%, 14.60%, 10.70% 였다 (도 11 및 도 12 참조).
EDE 및 비히클 그룹의 각막에서 CD11b+ 단핵구의 기하 평균 수는 각각 298.85 및 237.08이었다. 0.001%, 0.01%, 0.1% (PEG)-BHD1028군에서 평균 수는 각각 178.06, 131.59, 126.25였다. 결막에서 CD11b+ 단핵구는 EDE군과 비히클군에서 각각 550.33, 547.60이었고, 0.001%, 0.01%, 0.1% (PEG)-BHD1028 처리군에서는 각각 352.09, 330.48, 36.35였다. 또한 누선에서 CD11b+ 단핵구는 EDE군과 비히클군에서 각각 128.63, 184.62 였고, 0.001%, 0.01%, 0.1%(PEG)-BHD1028군에서 각각 84, 74.60, 60.48 이었다. (도 13 및 도 14 참조). 각막, 결막 및 누선에서 CD4 + IFN-γ+ T 세포 및 CD11b+ 세포 수의 결과는 (PEG)-BHD1028의 효과적인 항염 효과를 나타낸다.
DED 염증 경로는 또한 분화된(항원 특이적) T 세포가 각막, 결막 및 눈물샘으로 침윤하는 것을 포함한다. EDE 토끼 모델에서 (PEG)-BHD1028의 항염증 효과를 평가하기 위해 처리 10일 후 H&E 염색으로 간질층으로 침투한 염증세포의 수를 측정하였다. 정상대조군 6안 각막실질 (기질)의 면역세포수 범위는 정상대조군 273±16.08, 비히클군 424.78±22.64, 0.1%(PEG)-BHD1028군 399.39±22.22, 0.2%(PEG)-BHD1028군 349.89±17.18, 0.4%(PEG)-BHD1028군에서 305.06±13.88, 0.05% 사이클로스포린군에서 363.07±17.75로 나타났다 (도 15 참조). 0.2% 및 0.4% (PEG)-BHD1028 그룹의 각막 기질에서 면역 세포의 수는 각각 p < 0.05 및 p < 0.001로 비히클 그룹보다 유의하게 낮았다. 그러나 0.05% 사이클로스포린과 비히클 또는 0.1% (PEG)-BHD1028 그룹 간에는 유의한 차이가 없었다. 결막에서 침윤된 면역세포 수는 정상대조군에서 415.67±25.01, 비히클 처리군에서 698.78±60.51이었다. 0.1%, 0.2%, 0.4%(PEG)-BHD1028 처리군에서는 각각 624.94 ± 29.29, 472.41 ± 39.06, 427.22 ± 29.29였다. 사이클로스포린 0.05% 군에서 침윤된 면역 세포의 수는 635.39±50.70 (도 16 참조)이었다. 0.2% 및 0.4% 시험군의 결막 상피의 면역 세포는 비히클 처리군보다 유의하게 낮았다 (p<0.001). 그러나 0.05% 사이클로스포린과 비히클 그룹 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 눈물샘에서는 연구 그룹 간에 차이가 없었다 (도 17 참조).
실시예 7: EDE 토끼 모델에서 각막 상피 두께 평가
안구건조증의 병리생리학은 미란, 반흔, 반흔, 각막의 신생혈관 형성 및 심한 상태에서의 각막 천공과 같은 상피의 병리학적 변화를 포함한다. 상피에 대한 (PEG)-BHD1028의 보호 효과는 H&E 조직 염색 후 ZEN (Zeiss, Germany) 현미경 소프트웨어를 사용하여 각막 두께를 측정하여 평가하였다. 6개의 안구에서 모든 (PEG)-BHD1028 처리군과 0.05% 사이클로스포린 처리군의 평균 각막 상피 두께는 p < 0.001에서 비히클 처리 동물보다 더 유의했다 (도 18 참조). 그러나 (PEG)-BHD1028과 0.05% 사이클로스포린 처리군 사이에는 유의한 차이가 없었다 (도 18 참조).
실시예 8: EDE 마우스 및 토끼 모델에서 (PEG)-BHD1028의 항-아폽토시스 효과
DED 진행으로 눈 앞부분의 상피는 비정상적인 눈물 기름 분비 및 병원성 세포 사멸과 같은 기능적 손상 및 구조적 변화를 포함하여 병리학적으로 변형된다. 그룹당 한쪽 눈의 각막 및 결막의 동일한 면적에 있는 아폽토시스 세포를 TUNEL 분석으로 정량화하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, (PEG)-BHD1028은 마우스의 각막 및 결막에서 용량 의존적 항-세포사멸 효과를 나타냈다.
단위 면적당 세포사멸 세포의 백분율 비율은 토끼 모델에서 10일 후에 평가하였다. 각막에서 정상 대조군에서는 35±6%, 비히클군에서는 74±2%의 아폽토시스 세포가 검출되었다. 0.1%, 0.2%, 0.4%(PEG)-BHD1028 처리군에서 비율은 각각 40±12%, 39±3%, 35±4%였다. 사이클로스포린 0.05% 그룹의 백분율은 33 ± 5%였다. 모든 각막(PEG)-BHD1028 및 0.05% 사이클로스포린 그룹의 세포사멸 세포는 p < 0.001에서 비히클 그룹보다 현저히 낮았다 (도 20 참조). 또한, 결막에서의 세포 사멸 비율은 정상 대조군에서 7 ± 5%, 비히클 군에서 56 ± 4%였다. 0.1%, 0.2% 및 0.4%(PEG)-BHD1028 처리군에서 백분율 비율은 10일째에 35 ± 4%, 26 ± 3% 및 19 ± 4%였다. 0.05% 그룹은 32 ± 7%였다 (도 21 참조). 모든 시험된 (PEG)-BHD1028 농도 및 0.05% 사이클로스포린은 처리 10일 후 비히클 그룹에 비해 각막 및 결막 세포자멸사를 상당히 감소시켰다.
실시예 8: 10일째 토끼 EDE 모델에서 0.4%(PEG)-BHD1028과 0.05% 사이클로스포린의 비교 분석
0.4%(PEG)-BHD1028의 일관된 치료 효과를 바탕으로 10일째 0.4%(PEG)-BHD1028과 0.05% 사이클로스포린의 모든 시험 결과를 Student's t-test를 이용하여 비교 분석하였다. 0.4%(PEG)-BHD1028의 눈물 부피와 TBUT는 0.05% 사이클로스포린보다 훨씬 컸다 (도 22 참조). (PEG)-BHD1028과 0.05% 사이클로스포린 그룹의 CFS 점수와 면역 세포 수 사이에는 유의한 차이가 없었다. 그러나 0.4%(PEG)-BHD1028 그룹의 평균 CFS 점수는 0.05% 사이클로스포린 처리 동물보다 약 46% 낮았으며 (p = 0.0558), 시간이 지남에 따라 점진적으로 개선되는 경향이 있었다. 면역 세포 수에서 0.4%(PEG)-BHD1028은 결막 상피에서 더 나은 효과를 나타냈다 (p < 0.001)(도 23 참조).
실시예 9: (PEG)-BHD1028를 이용한 점안액의 제조
눈의 특성과 pH, 삼투압농도, 점도를 중요한 매개변수로 설정하여 (PEG)-BHD1028를 이용한 점안액을 제조하였다. 상기 매개변수를 조정하기 위해 시험 제제에 다양한 시약 및 물질을 첨가하고 제제의 안정성을 확인하기 위해 40℃조건에서 보관하였다. 또한, 표적 제제에 사용되는 시약은 주로 의약품의 안정성과 제조 공정의 적합성을 고려하여 결정하였다. 제형의 안정성은 RP-HPLC 분석 데이터를 기반으로 결정되었다. 저장 수명은 평균 동역학 온도 (mean kinetic temperature; MKT)를 반영하여 단일 불순물이 1.0 면적% (area %)를 갖기 전의 기간으로 설정되었다.
9-1. 항산화제
산화에 특히 취약한 단백질 의약품의 분해를 방지하기 위한 항산화제를 스크리닝 하였다. 항산화제로는 2가지 항산화제, 황산수소나트륨 (sodium bisulfate)과 EDTA가 테스트되었다. 도 23에서 확인할 수 있듯이, 황산수소나트륨 (0.03%)을 포함하는 제제의 경우 40℃에서 7일 차에 불순물이 급격히 증가하여, 항산화제에서 황산수소나트륨을 제외하였다.
EDTA 나트륨 (sodium EDTA)의 항산화 효과를 확인하기 위해 두 가지 제형을 준비하였다. 하나는 EDTA 나트륨을 포함 (0.5% sodium EDTA)하고 다른 하나는 EDTA 나트륨을 포함하지 않도록 하였다. 도 24 및 도 25에서 확인할 수 있듯이, 40℃에서 25일간 보관한 뒤에도 황산수소나트륨을 첨가하고 40℃에서 7일간 보관했을 때보다 안정성이 유지되었음을 확인하였다. 또한, EDTA 첨가에 따른 안정성 테스트 결과, EDTA 나트륨을 포함하는 제제가 그렇지 않은 제제보다 더 안정적임을 확인하였다. 또한, EDTA 나트륨은 특별히 시료 분해를 일으키지 않는 것으로 확인되었다. 이에, EDTA 나트륨을 항산화제로 설정하였다.
9-2. 점도
점도 시약은 용액 형태로 첨가되기 때문에, 점도 시약은 원액으로 보다 쉽게 조제할 수 있는 시약을 선택하였다. 스톡 용액은 물에 분말 형태를 첨가하여 잘 분산될 때까지 교반하였다. 점도 시약으로는 메틸셀룰로오스도 사용할 수 있으나, 히알루론산 나트륨이 제조에 더 용이하다.
히알루론산나트륨을 0.1% 농도로 포함하는 점안액을 제조하고, 안정성 테스트 결과 40℃에서 37일간 보관해도 불순물이 거의 없는 것으로 나타났다 (단일 불순물은 모두 1.0 면적% 이하). 위의 정보를 바탕으로 히알루론산나트륨을 점도 시약으로 설정하였다. 한편, (PEG)-BHD1028의 함량과 점도사이의 관계를 회전형 레오미터를 이용하여 평가한 결과, 표 3과 같이 (PEG)-BHD1028를 0.5% 또는 1.5% 함유한 결과 목표 점도인 정상인과 안구건조증의 중간 정도인 약 10 cP와 유사한 점도를 갖는 것을 확인하였다.
(PEG)-BHD1028 농도 단위 Shear rate 시험결과
0.5% Pa·S 100 (1/s) 0.009
1.5% Pa·S 100 (1/s) 0.010
4.5% Pa·S 100 (1/s) 0.014
플라시보 (Placebo) Pa·S 100 (1/s) 0.008
9-3. pH 및 희석제
희석제
점안액의 목표 pH를 유지하기 위한 희석제로 물과 PBS를 희석제로 테스트했다. 그러나 두 제제 사이의 안정성 데이터와 pH에는 큰 차이가 없었다.
pH
눈물의 정상적인 pH 범위는 6.5~7.6으로, 점안액은 정상 눈물보다 범위가 넓다. 정상적인 눈물의 pH범위 내에서 API에 대한 가장 안정적인 pH는 6.5이므로, 점안액 제제의 목표 pH는 6.5로 설정하였다. pH 6.5에서 API는 눈의 체류성을 증가시킬 수 있는 양이온 성질을 가진다.
점안액의 pH에 따른 안정성을 평가하기 위하여, (PEG)-BHD1028에 pH버퍼 10 mM [10mM 인산나트륨 완충액 + 0.02% 아지드화나트륨 (pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0) 또는 10 mM PBS + WELGENE fresh media 10X PBS (pH 7.4)]를 혼합하고 40±2℃에서 인큐베이팅한 후 HPLC 분석을 통해 안정성을 평가하였다. 평가 결과, 하기 표 4와 같이 점안액의 목표 pH로 설정한 pH 6.5와 안구의 평균 pH 7.0으로 제조한 제형 간 잔류량에서는 큰 차이가 없었다,
잔류량 (%) 0 일차 1 일차 3일 차 7일차
pH 5.5 100.0 98.4 97.2 96.6
pH 6.0 100.0 99.8 99.0 98.1
pH 6.5 100.0 99.7 98.7 97.3
pH 7.0 100.0 99.2 98.7 94.9
PBS (pH 7.4) 100.0 97.1 92.3 89.9
제형의 pH가 API의 pI값 (약 6.6)보다 낮은 경우, API는 양이온 성질을 가지므로 안구에서의 체류 시간을 늘릴 수 있다. 상기 결과를 바탕으로 유효성 및 경제성을 고려하여 pH 6.5를 안약 제제의 매개변수로 설정하였다.
9-4. 삼투압
점안액의 삼투압농도를 눈의 삼투압농도와 유사한 약 300 mOsm/kg 정도로 조절하기 위해 다양한 시약을 시험하였으며, 가장 안정한 시약을 삼투농도 시약으로 정하였다.
KCl, NaCl과 같은 염류를 포함하는 제형은 40℃에서 6일에도 상당히 분해되었다 (도 31 참조). PEG를 포함하는 제형도 단기간에도 상당히 분해되었다 (도 32 참조). 수크로스 유도체인 만니톨과 트레할로스를 삼투압 시약으로 추가한 결과, 만니톨, 트레할로오스 또는 만니톨과 트레할로오스 복합 제제가 안정하였으며, 이에 삼투압 시약으로 만니톨 및/또는 트레할로오스를 설정하였다 (도 33 및 34 참조).
(PEG)-BHD1028 함량에 따른 트레할로스 단독 제형 삼투압 (표 5 참조) 및 (PEG)-BHD1028 함량에 따른 트레할로스 만니톨 복합 제형의 삼투압 (표 6 참조)을 측정하였으며, 이의 실험 결과를 반영하여, (PEG)-BHD1028 농도 0.5%를 포함하여 약 300 mOsm/kg이 되도록 조정하였다.
플라시보 (Placebo) (PEG)-BHD1028 0.5% (PEG)-BHD1028 1.5% (PEG)-BHD1028 4.5%
#1 296 mOsm/kg 299 mOsm/kg 310 mOsm/kg 335 mOsm/kg
#2 293 mOsm/kg 301 mOsm/kg 309 mOsm/kg 335 mOsm/kg
#3 295 mOsm/kg 301 mOsm/kg 307 mOsm/kg 335 mOsm/kg
평균 294.67 mOsm/kg 300.33 mOsm/kg 308.67 mOsm/kg 335.00 mOsm/kg
플라시보 (Placebo) (PEG)-BHD1028 0.5% (PEG)-BHD1028 1.5% (PEG)-BHD1028 4.5%
#1 289 mOsm/kg 301 mOsm/kg 309 mOsm/kg 338 mOsm/kg
#2 290 mOsm/kg 399 mOsm/kg 312 mOsm/kg 339 mOsm/kg
#3 291 mOsm/kg 303 mOsm/kg 307 mOsm/kg 338 mOsm/kg
평균 290.00 mOsm/kg 301.00 mOsm/kg 309.33 mOsm/kg 338.33 mOsm/kg
9-5. 안정성 데이터에 따른 저장 수명
저장 수명은 평균 운동 온도(MKT)를 반영하는 안정성 데이터를 기반으로 계산되었다. 이론적으로 40℃의 물질은 25℃보다 5배 활성화된 상태이다. 이 계산에 기초하여 단일 불순물의 면적%가 1.0%에 도달하기 직전의 일수에 5배를 곱하여 수명을 구하였다. 목표 유통기한은 25℃에서 6개월 이상으로 설정하였으며, 트레할로스 단독 제형의 안정성은 약 7개월의 유통기한을 갖는 것으로 예상된다.
실시예 10: (PEG)-BHD1028의 광독성 평가
(PEG)-BHD1028의 광독성을 평가하기 위하여, BALB/3T3 클론 A31 세포에서 UV 노출 후 (PEG)-BHD1028의 잠재적 광독성을 측정하였다. 시험물질 및 양성대조군 (클로르프로마진 염산염, Chlorpromazine hydrochloride; CPZ)을 Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)에 녹이고 Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)으로 희석하였다. 용량 범위는 하기 표 7과 같이 설정되었다.
UV
(+ Irr)/(- Irr)		 용량 (μg/ml)
(PEG)-BHD1028 + Irr/- Irr 0, 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250, 500, 1000
Chlorpromazine hydrochloride + Irr 0, 0.049, 0.098, 0.195, 0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25
- Irr 0, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100
세포를 트립신화하고 계수하였다. 그런 다음 96-웰 플레이트에 웰당 1 x 104개 세포를 시딩하고 테스트 샘플 처리 전에 약 24시간 동안 배양했다. 시료 처리 1시간 후, 플레이트를 UV 조사 시스템 (UVA, 365nm)으로 조사하였다. 플레이트를 UV 조사 후 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양된 세포의 세포생존율은 뉴트럴 레드 염색법을 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.
실험결과, 표 8 및 표 9에서 확인할 수 있듯이 PIF (photo irradiation factor)와 MPE (mean photo effect) 및 (PEG)-BHD1028의 처리에 따른 세포 생존률을 확인한 결과 (PEG)-BHD1028은 '광독성 없음'으로 분류되었다.
항목 IC50 (μg/mL) PIF MPE
UV (-Irr) UV (+Irr)
(PEG)-BHD1028 > 1000 > 1000 1.000 0.003
CPZ 37.53 1.265 29.668 0.489
UV (-Irr) UV (+Irr)
용량 (μg/mL) 세포생존률 % 용량 (μg/mL) 세포생존률 %
0 100 0 100
7.8 104.70 7.8 108.02
15.6 107.47 15.6 110.97
31.3 110.81 31.3 112.03
62.5 112.51 62.5 111.09
125 112.57 125 111.64
250 112.63 250 110.01
500 112.68 500 111.84
1000 114.20 1000 109.28
또한, 양성 대조군인 Chlorpromazine hydrochloride는 PIF와 MPE에서 양성 결과를 보였다. 따라서, (PEG)-BHD1028은 광독성을 유발하지 않는 것을 확인하였다.
실시예 11: (PEG)-BHD1028 점안액의 안구건조증 치료효과 확인
상기 실시예 9에 따른 점안액 테스트를 통하여 (PEG)-BHD1028 0.5% (w/v), EDTA 나트륨 0.5% (w/v), 히알루론산염 0.1% (w/v), 트레할로스 9.0% (w/v)를 포함하는 점안액 조성물 [0.5% (PEG)-BHD1028 점안액 조성물]을 제조하였으며, 이하의 실험에서 점안액 조성물의 안구건조증 치료효과를 확인하였다.
11-1. 각막 손상 개선 평가
Corneal Staining Score (CCS)란 임상적 수치 평가 방법 중 하나로, 안구표면손상을 염색점수로 나타낸 것이며 심각도 (severity)와 정도 (grading)를 객관화한 지표이다. 실험은 실험적 염증성 안질환 대상체 (토끼)의 안구에 1% 형광염색액 (Fluorescein solution) 1 μL를 적하한 뒤 생리식염수 15 mL로 세척한 후 세극 등을 현미경으로 관찰하여 채점하고 그 상피손상 정도 (형광염색정도)를 평가하는 방법으로 진행했다.
각막 염색은 5개의 각막 영역 (nasal, central, temporal, inferior, and superior)에서NEI staining grade를 사용하여 등급을 매겼으며 각 영역 당 0에서 3까지의 점수 (총 15점)로 (0 = 정상 (normal), 1 = 약함 (mild), 2 = 보통 (moderate), 3 = 심함 (severe)) 평가했다. 통계학적 결과는 표준오차 (± SEM)로 나타냈으며, 실험 그룹간 차이에 대한 통계학적 유의성은 Student's t-test 검정 (GraphPad Prism 9.3.0)를 이용하여 결정하였다. 0.05 이하의 P 값은 통계학적 유의성을 갖는 것으로 판단하였다.
실험결과, 도 36에서 확인할 수 있듯이, PBS 베히클과 개발제형의 베히클을 비교했을 때 유의적인 차이가 없는 것으로 확인됐다. 또한, 개발 제형의 베히클과 개발 점안액인 0.5% (PEG)-BHD1028 점안액 조성물 (0.5% (PEG)-BHD1028 in formulated vehicle)를 비교했을 때 통계적으로 유의한 (*p<0.05) 수치 감소를 확인하였다.
결론적으로, 개발제형의 베히클 경우, 확실한 플라시보 효과 (placebo effect)를 확인할 수 있었고, 활성 약효성분을 포함한 0.5% (PEG)-BHD1028 점안액 조성물에서는 통계적으로 유의하게 각막 손상을 개선시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 개선 효과의 이유는 약물의 항 염증반응, 세포보호 효과 및 술잔세포 수의 증가를 통해 확인할 수 있었다.
11-2. EDE 모델에서 각막 두께 평가
조직병리학적 평가법으로 적출된 안구는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 Modified Davidson's 용액에 고정한 다음 파라핀 (Histocore Arcadia, Leica, Wetzlar, Germany)에 포매했다. 그 후, 파라핀 블록을 6 μm 두께의 섹션으로 슬라이스한 뒤, 현미경 (HistoCore AUTOCUT, Leica, Germany) 슬라이드에 장착하고 공기 건조한 후 헤마톡실린-에오신 (H&E)으로 염색을 진행했다. 염색된 조직 슬라이드를 영상화하여 광학현미경/디지털 슬라이드 스캐너 (Axio Scan.Z1, Zeiss, Oberkochen, Germany)로 조직 염색 데이터를 얻었고, 이미지 측정값은 CaseViewer (3DHISTECH, Hungary) 프로그램을 이용하여 각막 상피 두께를 측정 (X40 배율) 하여 얻었다. 모든 값은 3개 영역에서 얻어진 측정치의 평균값으로 결정하였다. 통계학적 결과는 표준오차 (±SEM)로 나타냈으며, 실험 그룹간 차이에 대한 통계학적 유의성은 Student's t-test 검정 (GraphPad Prism 9.3.0)를 이용하여 결정하였다. p-value가 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.
실험결과, 도 37에서 확인할 수 있듯이, PBS 베히클과 개발 제형의 베히클을 비교했을 때 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되었고, 개발제형의 베히클의 경우, 확실한 플라시보 효과 (placebo effect)를 확인할 수 있었다. 개발제형의 베히클과 개발 점안액인 0.5% (PEG)-BHD1028 점안액 조성물을 비교했을 때 통계적으로 유의한 (***p<0.001) 각막두께 증가를 보여주었다. 만성적으로 스트레스를 받은 각막 상피에서 눈물의 증발이 증가하게 되어 눈물의 오스몰농도가 증가하고, 이로 인해 각막이 얇아질 수 있다. 활성 약효성분을 포함한 개발 점안액에서는 통계적으로 유의한 각막 상피의 재생으로 점안액에 의한 조직세포보호효과를 보여주며 각막 손상의 개선을 확인할 수 있었다.
11-3. 항염 효과 확인
조직병리학적 평가법으로 적출된 안구 및 눈물샘 조직은 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 Modified Davidson's 용액에 고정한 다음 파라핀 (Histocore Arcadia, Leica, Wetzlar, Germany)에 포매했다. 그 후, 파라핀 블록을 6 μm 두께의 섹션으로 슬라이스한 뒤, 현미경 (HistoCore AUTOCUT, Leica, Germany) 슬라이드에 장착하고 공기 건조 후, 헤마톡실린-에오신 (H&E)으로 염색했다. 염색된 조직 슬라이드를 영상화 하여 광학현미경/디지털 슬라이드 스캐너 (Axio Scan.Z1, Zeiss, Oberkochen, Germany)로 조직 염색 데이터를 얻었고, 각막 염증 세포 침윤 정도를 파악하기 위해 CaseViewer (3DHISTECH, Hungary) 프로그램 상에서 각막 기질층, 결막 및 눈물샘 영역을 선택 (400 ㎛ X 300 ㎛) 하고Image J (NIH, Bethesda, MA, USA) 프로그램을 이용하여 세포핵의 수를 측정하였다. 모든 값은 슬라이드 한 개당 3개 영역에서 얻어진 측정치의 평균값으로 결정하였다. 통계학적 결과는 표준오차 (± SEM)로 나타냈으며, 실험 그룹간 차이에 대한 통계학적 유의성은 Student's t-test 검정 (GraphPad Prism 9.3.0)를 이용하여 결정하였다. p-value가 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.
실험결과, 도 38에서 확인할 수 있듯이, 시험 물질이 안구건조에 따른 각막의 염증 반응을 감소시킬 수 있는지 여부를 평가한 것으로, 각막 기질층의 염증세포 침윤 정도를 측정한 결과이다. PBS 베히클과 개발제형의 베히클을 비교했을 때 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되었다. 또한, 개발제형의 베히클과 개발 점안액인 0.5% (PEG)-BHD1028 점안액 조성물을 비교했을 때 통계적으로 유의한 (***p<0.001) 염증세포 침윤 감소를 보여주었다.
또한, 도 39와 같이 시험 물질이 안구건조에 따른 결막의 염증 반응을 감소시킬 수 있는지 여부를 평가하여 결막에서의 염증세포 침윤정도를 측정하였다. PBS 베히클과 개발제형의 베히클을 비교했을 때 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되었다. 또한, 개발제형의 베히클과 개발 점안액인 0.5% (PEG)-BHD1028 점안액 조성물을 비교했을 때 통계적으로 유의한 (*p<0.05) 염증세포 침윤 감소를 보여주었다.
도 40과 같이 시험 물질이 안구건조에 따른 눈물샘의 염증 반응을 감소시킬 수 있는지 여부를 평가하여 눈물샘에서의 염증세포 침윤정도를 측정하였다. PBS 베히클과 개발제형의 베히클을 비교했을 때 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되었다. 또한, 개발제형의 베히클과 개발 점안액인 0.5% (PEG)-BHD1028 점안액 조성물을 비교했을 때 통계적으로 유의한 (****p<0.0001) 염증세포 침윤 감소를 보여주었다.
눈물의 생성이 감소하면 눈물 청소율이 떨어지고 안구표면에 여러 염증성 매개체들이 나타난다. 이로 인해 염증 반응이 시작되어 건성안이 발생되는 염증성 질환으로 기인되는 측면에서 평가할 때, 개발제형의 베히클의 경우, 각막, 결막 및 눈물샘조직 모두에서 확실한 플라시보 효과 (placebo effect)를 확인할 수 있었다. 또한, 활성 약효성분을 포함한 0.5% (PEG)-BHD1028 점안액 조성물에서는 통계적으로 유의미한 항 염증반응으로 안구 손상이 개선됨을 확인할 수 있었다.
11-4. 항아폽토시스 효과 확인
조직병리학적 평가법으로 적출된 안구는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 Modified Davidson's 용액에 고정한 다음 파라핀 (Histocore Arcadia, Leica, Wetzlar, Germany)에 포매했다. 그 후, 파라핀 블록을 6 μm 두께의 섹션으로 슬라이스한 뒤, 현미경 (HistoCore AUTOCUT, Leica, Germany) 슬라이드에 장착하고 공기 건조 후, TUNEL로 염색했다. 염색된 조직 슬라이드를 영상화 하여 광학현미경/디지털 슬라이드 스캐너 (Axio Scan.Z1, Zeiss, Oberkochen, Germany)로 조직 염색 데이터를 얻었고, 세포사멸 정도를 파악하기 위해 CaseViewer (3DHISTECH, Hungary) 프로그램 상에서 각막 및 결막 영역을 선택 (400 ㎛ X 300 ㎛) 하고 Image J (NIH, Bethesda, MA, USA) 프로그램을 이용하여 TUNEL 양성/음성 면적비를 측정했다. 모든 값은 슬라이드 한 개당3개 영역에서 얻어진 측정치의 평균값으로 결정하였다. 통계학적 결과는 표준오차 (± SEM)로 나타냈으며, 실험 그룹간 차이에 대한 통계학적 유의성은 Student's t-test 검정 (GraphPad Prism 9.3.0)를 이용하여 결정하였다. p-value가 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.
도 41과 같이 시험 물질이 안구건조에 따른 각막상피의 세포사멸을 감소시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 각막 상피 전체 세포 중 TUNEL 양성세포가 차지하는 비율을 측정하였다. PBS 베히클과 개발제형의 베히클을 비교했을 때 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되었다. 또한, 개발제형의 베히클과 개발 점안액인 0.5% (PEG)-BHD1028 점안액 조성물을 비교했을 때 통계적으로 유의한 (***p<0.001) 세포사멸 감소를 보여주었다.
또한, 도 42와 같이 시험 물질이 안구건조에 따른 결막상피의 세포사멸을 감소시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위해 결막 상피 전체 세포 중 TUNEL 양성세포가 차지하는 비율을 측정하였다. PBS 베히클과 개발제형의 베히클을 비교했을 때 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되었다. 또한, 개발제형의 베히클과 개발 점안액인 0.5% (PEG)-BHD1028 점안액 조성물을 비교했을 때 통계적으로 유의한 (**p<0.01) 세포사멸 감소를 보여주었다.
각막 및 결막 모두에서, 개발제형의 베히클의 경우, 확실한 플라시보 효과 (placebo effect)를 확인할 수 있었으며, 활성 약효성분을 포함한 개발 점안액 (0.5% (PEG)-BHD1028 점안액 조성물) 에서는 통계적으로 유의미한 세포사멸 억제로 세포 손상 근원적 치료효과를 확인할 수 있었다.
11-5. 결막의 술잔세포 수 측정
조직병리학적 평가법으로 적출된 안구는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 Modified Davidson's 용액에 고정한 다음 파라핀 (Histocore Arcadia, Leica, Wetzlar, Germany)에 포매했다. 그 후, 파라핀 블록을 6 μm 두께의 섹션으로 슬라이스한 뒤, 현미경 (HistoCore AUTOCUT, Leica, Germany) 슬라이드에 장착하고 공기 건조 후, PAS (Periodic acid-Schiff)로 염색했다. 염색된 조직 슬라이드를 영상화 하여 광학현미경/디지털 슬라이드 스캐너 (Axio Scan.Z1, Zeiss, Oberkochen, Germany)로 조직 염색 데이터를 얻었고, 세포사멸 정도를 파악하기 위해 CaseViewer (3DHISTECH, Hungary) 프로그램 상에서 결막 영역을 선택 (400 ㎛ X 300 ㎛) 하고 Image J (NIH, Bethesda, MA, USA) 프로그램을 이용하여 결막 술잔세포 (conjunctival goblet cell) 수를 측정했다. 모든 값은 슬라이드 한 개당3개 영역에서 얻어진 측정치의 평균값으로 결정하였다. 통계학적 결과는 표준오차 (± SEM)로 나타냈으며, 실험 그룹간 차이에 대한 통계학적 유의성은 Student's t-test 검정 (GraphPad Prism 9.3.0)를 이용하여 결정하였다. p-value가 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.
눈의 표면의 눈물막은 크게 바깥층에서부터 지방층, 수성층, 점액층의 3가지 성분을 이루고 있고, 눈의 보호막 역할을 한다. 이 중의 한 가지 성분이라도 부족하게 되면 눈물막이 불안정하여 눈물이 쉽게 증발한다. 점액층은 각막표면을 덮고 있는 점액 성분의 눈물층으로, 결막의 술잔세포에서 만들어지며 수성층의 증발을 막는 역할을 한다.
도 43과 같이 은 시험 물질이 안구건조에 따른 결막 술잔세포 감소의 기능 저하 및 사멸에 있어서 세포 증식의 효과가 있는지 여부를 평가하기 위해, 안구조직 PAS (Periodic acid-Schiff) 염색 후 결막 상피층의 술잔세포 수를 측정하였다. PBS 베히클과 개발제형의 베히클을 비교했을 때 유의적인 차이가 없는 것으로 확인됐으며, 개발제형의 베히클과 0.5% (PEG)-BHD1028 점안액 조성물을 비교했을 때 통계적으로 유의한 (***p<0.001) 술잔세포 수의 증가를 보여주었다. 개발제형의 베히클의 경우, 확실한 플라시보 효과(placebo effect)를 확인할 수 있었다. 활성 약효성분을 포함한 개발 점안액 (0.5% (PEG)-BHD1028 in FV)에서는 통계적으로 유의미한 술잔세포 수의 증가를 확인하였다. 대다수의 환자는 안구표면세포 손실단계에서 자각증상을 보이는데, 이 술잔세포의 손실은 악순환적 건성 안 유발의 핵심 원인 중 하나이다. 따라서 개발 점안액이 손실된 술잔세포의 수적 복구를 위한 치료방안임을 확인할 수 있었다.

Claims (14)

  1. 서열번호 2 (Tyr-Tyr-Phe-Ala-Tyr-His-Pro-Asn-Ile-Pro-Gly-Leu-Tyr-Tyr-Phe)로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 안구 건조증 (dry eye syndrome)의 치료, 예방, 완화 또는 억제용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 2의 아미노산 서열의 N 말단에 5 kDa의 무게를 가진 선형 형태 또는 가지가 달린 형태의 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)이 추가로 결합된 것인, 안구 건조증의 치료, 예방, 완화 또는 억제용 약제학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 점안액, 인공 눈물, 겔 또는 연고의 형태인 것인, 안구 건조증의 치료, 예방, 완화 또는 억제용 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 에틸렌다이아민테트라아세트산 (ethylene-diamine-tetraacetic acid; EDTA)를 포함하는 것인, 안구 건조증의 치료, 예방, 완화 또는 억제용 약제학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 히알루론산 (hyaluronic acid) 또는 히알루론산염을 포함하는 것인, 안구 건조증의 치료, 예방, 완화 또는 억제용 약제학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 6 내지 14 cP의 점도를 갖는 것인, 안구 건조증의 치료, 예방, 완화 또는 억제용 약제학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 pH 6.0 내지 8.0의 pH인 것인, 안구 건조증의 치료, 예방, 완화 또는 억제용 약제학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 트레할로오스 또는 만니톨을 포함하는 것인, 안구 건조증의 치료, 예방, 완화 또는 억제용 약제학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 280 내지 340 mOsm/kg의 삼투압 농도를 갖는 것인, 안구 건조증의 치료, 예방, 완화 또는 억제용 약제학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 0.1 내지 0.9% (w/v)의 에틸렌다이아민테트라아세트산 (ethylene-diamine-tetraacetic acid; EDTA), 0.05 내지 0.2 % (w/v)의 히알루론산 나트륨, 4.0 내지 16.0 % (w/v)의 트레할로스를 포함하는 것인, 안구 건조증의 치료, 예방, 완화 또는 억제용 약제학적 조성물.
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