UA114192C2 - Спосіб одержання фізіологічно активного поліпептидного комплексу - Google Patents

Спосіб одержання фізіологічно активного поліпептидного комплексу Download PDF

Info

Publication number
UA114192C2
UA114192C2 UAA201410250A UAA201410250A UA114192C2 UA 114192 C2 UA114192 C2 UA 114192C2 UA A201410250 A UAA201410250 A UA A201410250A UA A201410250 A UAA201410250 A UA A201410250A UA 114192 C2 UA114192 C2 UA 114192C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
immunoglobulin
constant region
physiologically active
reducing agent
active polypeptide
Prior art date
Application number
UAA201410250A
Other languages
English (en)
Inventor
М'юн Х'юн Чан
Мьюн Хьюн Чан
Мін Юн Кім
Мин Юн КИМ
Чон-Су Лі
Чон-Су Ли
Те Чін Кім
Тэ Чин Ким
Сун Мін Пе
Сун Мин Пэ
Се Чхан Квон
Original Assignee
Ханмі Сайенс Ко., Лтд.
Ханми Сайенс Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ханмі Сайенс Ко., Лтд., Ханми Сайенс Ко., Лтд. filed Critical Ханмі Сайенс Ко., Лтд.
Publication of UA114192C2 publication Critical patent/UA114192C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1075—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of amino acids or peptide residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/10—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using coupling agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Винахід належить до способу одержання комплексу фізіологічно активний поліпептид-непептидильний полімер-константна ділянка імуноглобуліну, за яким фізіологічно активний поліпептид ковалентно зв'язується з константною ділянкою імуноглобуліну через непептидильний лінкер, причому концентрація відновлюючого агента в першій реакції становить від 1 мМ до менш ніж 20 мМ.

Description

Галузь техніки
Представлений винахід стосується способу одержання комплексу, в якому фізіологічно активний поліпептид є ковалентно зв'язаним з константною ділянкою імуноглобуліну через непептидильний полімерний лінкер, що містить два або більше альдегідів, як функціональні групи. Більш конкретно, представлений винахід стосується способу ефективного одержання фізіологічно активного поліпептидного комплексу, що характеризується покращенням стану проблем низького виходу одержання та реагентної поліпептидної деформації шляхом регулювання застосування відновлюючого агента при його одержанні.
Рівень техніки
Загалом, фізіологічно активні поліпептиди є такими, що легко денатурують завдяки їх низької стабільності, та легко піддаються протеолітичній деградації в крові та подальшому нирковому або печінковому кліренсу. Тому, існує необхідність частого введення пацієнту протеїнових лікарських засобів, що містять фізіологічно активні поліпептиді, як фармацевтичні інгредієнти, для того, щоб підтримувати відповідні рівні та титри сироватки. Однак, така частота введення протеїнових лікарських засобів, більшість з яких знаходиться в формі ін'єкцій, викликає біль у пацієнтів та має високу вартість лікування. Для вирішення даних проблем, багато зусиль було вкладено в покращення стабільності в сироватці протеїнових лікарських засобів та підтримання лікарських засобів в крові на високих рівнях протягом тривалого періоду часу, щоб максимізувати фармацевтичну ефективність лікарських засобів. Згідно з вимогами щодо застосування препаратів пролонгованої дії, протеїнові лікарські засоби повинні бути сформульовані таким чином, щоб мати високу стабільність, та їх титр повинен підтримуватися на достатньо високому рівні без спричинення імунних реакцій у пацієнтів.
Традиційний підхід до стабілізації протеїнів, та запобігання ферментативному розщепленню, та нирковому кліренсу є хімічне модифікування поверхні протеїнового лікарського засобу полімером, що має високу розчинність, таким як полієтиленгліколь (далі в даному документі зазначається як "ПЕГ"). За рахунок зв'язування з конкретними або різними ділянками протеїну- мішені, ПЕГ робить розчинність протеїну вищою, тим самим стабілізуючи протеїн та запобігаючи гідролізу, не викликаючи серйозні побічні ефекти (Зада еї аї., 9. Регтепіайоп
Віоепдіпеетіпад 71: 137-139).
Зо Наприклад, УМО 2006/076471 розкриває спосіб виробництва натрійуретичного пептиду В- типу (ВМР) тривалої дії шляхом кон'югування його з ПЕГами, який зв'язується з рецептором А натрійуретичного пептиду (МРЕ-А), щоб ініціювати синтез цЦГМФ, тим самим зменшуючи артеріальний тиск. Таким чином, це застосовують в лікуванні застійної серцевої недостатності.
Патент США Мо 6,924,264 описує спосіб вдосконалення тривалості іп мімо ексендину-4 шляхом
ПЕГилювання його лізиновим залишком. Однак, в такому способі, незважаючи на його здатність збільшувати час циркуляції пептидного лікарського засобу шляхом збільшення молекулярної маси ПЕГ, ПЕГилювання має проблеми, такі як значне зниження титрів пептидного лікарського засобу та зниження виходу завдяки зниженій реактивності пептиду, так як молекулярна маса
ПЕГ збільшується.
УМО 02/46227 розкриває злиті протеїни, в яких ГПП-1 та ексендин-4 або їх аналоги є кон'югованими з сироватковим альбуміном людини або імуноглобуліновим фрагментом (Ес), одержаним шляхом генетичної рекомбінації. Патент США Мо 6,756,480 описує злитий протеїн, в якому паратиреоїдний гормон (ПТГ) або його аналог є зв'язаним з Ес. Хоча дані способи можуть оцінювати як такі, що вирішують проблеми ПЕГилювання, такі як низький вихід та не специфічність, їх дія на підвищення іп мімо періоду напіввиведення, як показано, не є значною, всупереч очікуванню, та надалі в деяких випадках злиті протеїни мають низькі титри. В той час, як застосовують різноманітність пептидильних лінкерів так, щоб максимізувати ефект збільшення серологічного періоду напіввиведення, вони мають здатність викликати імунні відповіді. Крім того, пептид, що має дисульфідний зв'язок, такий як ВМР, має труднощі в практичному застосуванні, тому що є високо прийнятним, щоб викликати неправильне згортання. Більш того, пептидильний лінкер з неприродним амінокислотним залишком є неможливим для одержання за допомогою генетичної рекомбінації.
Інсулін є пептидом, який секретується бета-клітинами підшлункової залози у людей, та займає центральне місце щодо регулювання рівня глюкози в крові в організмі. Коли інсулін не секретується належним чином або секретований інсулін адекватно не функціонує в організмі, рівні глюкози крові не можуть контролюватися та підвищуються, в результаті призводячи до цукрового діабету. Останній випадок називають діабетом типу 2. Випадок, коли інсулін не може секретуватись підшлунковою залозою та спричиняє підвищені рівні глюкози крові, з іншого боку, в результаті призводить до діабету типу 1. Пацієнтів з діабетом типу 2 лікують пероральними гіпогліксемічними агентами, та деяких з них лікують інсуліном. В той же час, ін'єкція інсуліну, переважно, є потрібною для пацієнтів з діабетом типу 1.
Як правило, інсулінову терапію проводять шляхом введення інсуліну за допомогою ін'єкції тричі на день кожен раз після або до споживання їжі. Однак, постійне введення інсуліну тричі на день є болісним та спричиняє незручності для пацієнтів. Багато спроб зроблено, щоб вирішити дані проблеми. Однією стратегією, що призначена для підвищення проникності протеїнових лікарських засобів крізь біомембрани, є доставка їх пероральною або назальною інгаляцією.
Однак, введення пероральною або назальною інгаляцією є суттєво низьким щодо ефективності доставки в порівнянні з ін'єкцією, та має труднощі в утриманні пептидних лікарських засобів на рівні, необхідному для активності іп мімо.
Як альтернативна стратегія, надмірну кількість лікарського засобу можуть ін'єкційно вводити підшкірно та може всмоктуватися в організм уповільненим способом так, щоб підтримувати постійний рівень в крові навіть при ін'єкції один раз на день. Деякі з лікарських засобів (наприклад, Лантус, Запоїї-амепіїї) є схваленими щодо комерційного застосування, та їх на даний момент вводять пацієнтам. Зокрема, дослідження проводять в напрямку модифікації інсуліну з жирними кислотами, щоб зробити зв'язування кон'югатів інсуліну більш сильним та розширити тривалість шляхом комбінування з альбуміном в місці ін'єкції або в крові. Деякі з лікарських засобів (наприклад, Левемір, МомоМогаіїєК) є схваленими щодо комерційного застосування. Однак, дані лікарські засоби викликають біль в місці ін'єкції та повинні ін'єкційно вводитись один раз в день, які є все ще великим тягарем для пацієнтів.
Для подолання проблем, що виникають в попередньому рівні техніки, представлені винахідники одержали комплекс, що містить фізіологічно активний поліпептид та константну ділянку імуноглобуліну, які з'єднані із застосуванням непептидильного полімеру, як лінкера, як стратегію одночасного збільшення плазмового періоду напіввиведення та тривалості дії іп мімо фізіологічно активного поліпептиду, такого як, інсулін. Однак, крім того, існує потреба в способі одержання комплексу з високим виходом та з високим ступенем чистоти, тому що компоненти комплексу є дуже дорогими. Маючи це на увазі, представлені винахідники розробили спосіб одержання комплексів фізіологічно активного поліпептиду зі зниженою вартістю, високим виходом та високим ступенем чистоти за рахунок застосування відповідних видів відновлюючих
Зо агентів з оптимальною концентрацією в розчині під час реакції одержання комплексу, таким чином, завершуючи представлений винахід.
Розкриття
Технічна проблема
Об'єктом за представленим винаходом є здійснення ефективного способу одержання комплексу, в якому фізіологічно активний поліпептид є ковалентно зв'язаним з константною ділянкою імуноглобуліну через непептидильний полімерний лінкер, що містить два або більше альдегіди, як функціональні групи, який характеризується тим, що проблеми щодо низького виходу одержання та реагентної поліпептидидної деформації зменшуються шляхом застосування прийнятних видів відновлюючих агентів з оптимальною концентрацією в реакційному розчині під час реакції.
Технічне рішення
В одному аспекті для здійснення зазначеного вище об'єкту, представлений винахід передбачає спосіб одержання комплексу фізіологічно активний поліпептид-непептидильний полімер-константна ділянка імуноглобуліну, який включає (1) реагування непептидильного полімеру, що має два або більше альдегіди, як функціональні групи, з одним з фізіологічно активних поліпептидів або константною ділянкою імуноглобуліну в присутності відновлюючого агенту в концентрації 1-20 мМ; та (2) реагування реакційної суміші (1) з іншим фізіологічно активним поліпептидом або константною ділянкою імуноглобуліну в присутності відновлюючого агенту в концентрації 1-100 мМ.
Реакційна суміш може містити кон'югат непептидильного полімеру та фізіологічно активного поліпептиду або кон'югат непептидильного полімеру та константної ділянки імуноглобуліну, та/або реагенти, що залишилися незмінними. Таким чином, спосіб за представленим винаходом може додатково включати відокремлення кон'югату фізіологічно активного поліпептиду- непептидильного полімеру або кон'югату імуноглобуліну-непептидильного полімеру від реакційної суміші після стадії (1).
Термін "непептидильний полімер", який застосовується в даному документі, стосується біосумісного полімеру, що складається з, щонайменше, двох повторюваних ланок, які утримуються разом за рахунок довільного ковалентного зв'язку, крім пептидного зв'язку.
Приклади непептидильного полімеру, прийнятного в представленому винаході включають 60 поліетиленгліколі, поліпропіленгліколі, співполімери етиленгліколю та пропіленгліколю,
поліоксіетильовані поліоли, полівінильні спирти, полісахариди, декстрани, полівінилетилові етери, полімери, що біорозкладаються, такі як полімолочна кислота (РІГА) та полімолочна- гліколева кислота (РІ СА), ліпідні полімери, хітини, гілауронова кислота та їх комбінації, де перевага надається поліетиленгліколю (ПЕГ). Його похідні, що є добре відомими в даній галузі з рівня техніки, та похідні, які можуть бути легко одержані, застосовуючи способи, відомі в даній галузі з рівня техніки, також знаходяться в межах обсягу представленого винаходу.
Як описано вище, непептидильний полімер може мати два або більше альдегіди, як функціональні групи. Таким чином, непептидильний полімер, зазначений вище, може бути в бі- або мульти-функціональній альдегідній формі сам по собі або містить замісник, що має альдегідну групу, переважно, при його двох або більше спиртових групах. замісник, що має альдегідну групу може бути алкілальдегідом, таким як пропіональдегід або бутилальдегід. В одному переважному втіленні, непептидильним полімером може бути ПЕГ з пропіональдегідним замісником на кожному з його кінців.
Недоліком загальноприйнятих пептидильних лінкерів, які застосовують в злитих протеїнах, сконструйованих за способом злиття в середині рамки, є те, що вони легко розщеплюються іп мімо протеїназами та, таким чином, не можуть гарантувати тривалість сироваткового періоду напіввиведення носієм, всупереч очікуванню. Однак, в представленому винаході застосовують полімер, який є стійким до протеази, та, таким чином, період напіввиведення пептиду з плазми може підтримуватись на рівні подібному до того, що у носія. Внаслідок цього, оскільки він є стійким до протеїназ іп мімо, будь-який непептидильний полімер можуть застосовувати в представленому винаході, без обмеження. Молекулярна маса непептидильного полімеру знаходиться в діапазоні від 1 до 100 кДа та переважно від 1 до 20 кДа. До того ж, непептидильний полімер, який зв'язують з фізіологічно активним поліпептидом, може бути індивідуальним полімером або комбінацією різних полімерів. Крім того, непептидильний полімер прийнятний в представленому винахід може мати функціональні групи на його двох або трьох кінцях, які можуть бути сполученими з фізіологічно активним поліпептидом та константною ділянкою імуноглобуліну. Переважно, функціональні групи можуть бути альдегідними.
Кон'югація з ПЕГ, яку, як правило, застосовують, щоб отримати пролонгованої дії композиції з протеїновими лікарськими засобами, підвищує стабільність протеїнів, в той же час більші
Зо молекулярні маси ПЕГ демонструють меншу реакційну здатність з протеїнами та, таким чином, знижують вихід одержання. Оскільки вихід одержання повністю корелює з вартістю одержання та можливістю впровадження в промисловості, дуже важливим є підвищення виходу одержання. ПЕГ з альдегідами, як функціональними групами, можуть сполучати з аміногрупою, яка є присутньою на М-кінці або на бічному ланцюгу Гух залишку фізіологічно активного поліпептиду або константної ділянки імуноглобуліну. В зв'язку з цим, вихід ПЕГИиЛЮВання може варіювати в залежності від різних чинників, включаючи молярне співвідношення ПЕГ до протеїнів, концентрацію реакційних розчинів, час реакції, рН, температуру, тощо. Спет. Віої.
Огид Оев5. 2007; 69; 132-138 описує ПЕГилювання інсуліну, яке виконують з 5 К альдегідом тПЕГ з виходом понад 9095 шляхом регулювання різних чинників, включаючи молярні співвідношення, час реакції, рН, тощо. В 05 2009/0252703А1, доповідається, що додавання органічного розчинника до реакційного розчину підвищує вихід ПЕГилювання пептиду. УМО 2010/089756А2 розкриває покращення виходу ПЕГилювання шляхом взаємодії г-теїНис-СЗЕ з
ПЕГ в присутності карбогідрату.
Однак, коли непептидильний полімер, що містить ПЕГ з двома або більше функціональними групами, застосовують як лінкер між двома різними поліпептидами, то необхідним є здійснення двох або більше стадій в реакції, що, таким чином, знижує загальний вихід. Зокрема, спостерігалось, що стадію другої реакції (на якій фізіологічно активний поліпептид або константна ділянка імуноглобуліну є кон'югованими з непептидильним полімером, що має дві або більше функціональні групи, піддають взаємодії з константною ділянкою імуноглобуліну або фізіологічно активним поліпептидом, відповідно, далі в даному документі називають "реакцією сполучення") проводять з суттєво нижчим виходом, в порівнянні зі стадією першої реакції, в якій фізіологічно активний поліпептид або константна ділянка імуноглобуліну піддають взаємодії з непептидильним полімером, що має дві або більше функціональні групи.
В представленому винаході, продемонстровано, що концентрація відновлюючого агента в першій реакції корелює з виходом другої реакції сполучення. Більш високі виходи реакції сполучення спостерігали з більш низькими концентраціями відновлюючого агенту, меншим часом реакції та нижчими температурами реакції в першій реакції.
Як застосовується в даному документі, термін "відновлюючий агент" стосується сполуки, яка функціонує для зниження оборотного подвійно утвореного іміну в реакції між альдегідною бо групою непептидильного полімеру та аміногрупою поліпептидів (фізіологічно активний поліпептид, константна ділянка імуноглобуліну), де внаслідок цього утворюється ковалентний зв'язок, та є призначеним для охоплення всіх відновлюючих агентів, відомих в даній галузі з рівня техніки. В межах представленого винаходу, відновлюючий агент можуть додавати до реакційного розчину, в якому непептидильний полімер утворює ковалентний зв'язок з фізіологічно активним поліпептидом або константною ділянкою імуноглобуліну. За умови, що його, як правило, застосовують в даній галузі, будь-який відновлюючий агент можуть застосовувати в представленому винаході. Приклади відновлюючого агента можуть включати, але не обмежуються цим, натрію ціаноборгідрид, боран-піридиновий комплекс, натрію боргідрид, боран-диметиламіновий комплекс, боран-триметиламіновий комплекс та натрію триацетоксиборгідрид. Відповідний відновлюючий агент може бути вибраний в залежності від видів фізіологічно активного поліпептиду або константної ділянки імуноглобуліну та розчинника реакції.
Відновлюючий агент застосовують для кон'югації фізіологічно активного поліпептиду або константної ділянки імуноглобуліну з непептидильним полімером. Реакційний розчин може містити відновлюючий агент в концентрації 1-20 мМ для реакції між фізіологічно активним поліпептидом або константною ділянкою імуноглобуліну та непептидильним полімером, та в концентрації 1-100 мМ для реакції сполучення. Більш переважно, відновлюючий агент можуть застосовувати в концентрації 1-20 мМ для кон'югації між фізіологічно активним поліпептидом або константною ділянкою імуноглобуліну, та непептидильним полімером, та в концентрації 1- 40 мМ для реакції сполучення.
Реакцію кон'югація між фізіологічно активним поліпептидом або константною ділянкою імуноглобуліну та непептидильним полімером (реакція стадії (1)) можуть проводити протягом від 1 до 16 годин та при температурі від 0 до 25 "С. Разом з тим, реакцію сполучення (реакція стадії (2)) можуть проводити протягом від 1 до 48 годин.
Переважно, реакцію стадії (1) можуть проводити протягом від 1 до 16 годин при 0-25 С в присутності відновлюючого агенту в концентрації від 1 до 20 мМ, тоді як реакцію стадії (2) можуть проводити протягом від 1 до 48 годин в присутності відновлюючого агенту в концентрації від 1 до 40 мМ.
В одному переважному втіленні, натрію ціаноборгідрид застосовували як відновлюючий агент за різних умов, для того, щоб підвищити вихід одержання комплексу, в якому інсулін, ПЕГ- лінкер, що має два або більше альдегіди як функціональні групи, та константну ділянку імуноглобуліну з'єднують разом. Виявлено, що вихід реакції сполучення збільшується, коли перша реакція, яку виконують, щоб з'єднати фізіологічно активний поліпептид або константну ділянку імуноглобуліну та непептидильний полімер, проводять протягом короткого часу при низькій температурі в присутності низької концентрації відновлюючого агента (таблиця 1).
В іншому переважному втіленні, реакцію здійснювали з різними концентраціями відновлюючого агента боран-піридинового комплексу, та більш високі виходи другої реакції, реакції сполучення, виявляли після того, як застосовували більш низькі концентрації відновлюючого агента в першій реакції між фізіологічно активним поліпептидом або константною ділянкою імуноглобуліну та непептидильним полімером. Випадок, коли як відновлюючий агент застосовували натрію ціаноборгідрид, показує більш високі виходи в порівнянні з випадком, коли застосовували боран-піридиновий комплекс (таблиця 2).
Разом з тим, підтверджено, що вихід другої, реакції сполучення, підвищувався, коли концентрація відновлюючого агенту підвищувалась.
В одному переважному втіленні, реакцію сполучення здійснювали при різних концентраціях відновлюючого агента натрію ціаноборгідриду, та одержували покращені виходи реакції сполучення в присутності високої концентрації відновлюючого агента. Однак, дуже висока концентрація відновлюючого агента обумовлювала здійснення аберації константної ділянки імуноглобуліну. Для того, щоб уникнути цього, реакцію сполучення здійснювали протягом 13 годин в присутності 20 мМ натрію ціаноборгідриду, та спостерігали, що її вихід утримували на високому рівні, та аберацію константної ділянки імуноглобуліну відповідно мінімізували (таблиці
З та 4).
Як застосовується в даному документі, термін "фізіологічно активний поліпептид" стосується поліпептиду, що має певну фізіологічну функцію іп ммо як загальну концепцію. Він має загалом поліпептидильну структуру та показує різні біологічні активності. Коли організм стає біологічно ненормальним в результаті нестачі або надлишку матеріалу, що бере участь в певній функції, фізіологічно активний поліпептид може регулювати експресію генів або фізіологічну функцію, тим самим корегуючи відхилення. Типовим прикладом є протеїновий лікарський засіб.
Приклади фізіологічно активних поліпептидів, що застосовують в представленому винаході 60 включають гормон росту людини, гормони, що вивільняють гормон росту, пептиди, що вивільняють гормон росту, інтерферон, рецептори інтерферону, колонієстимулюючі чинники, глюкагон-подібні пептиди (СІ Р-1, тощо), оксинтомодулін, З протеїн-сполучені рецептори, інтерлейкіни, рецептори інтерлейкіну, ферменти, інтерлейкін-зв'язуючі протеїни, цитокін- зв'язуючі протеїни, макрофаг-активуючі фактори, пептиди макрофагу, фактори В-клітин, фактори Т-клітин, протеїн А, інгібітори алергії, глікопротеїни некрозу клітин, імунотоксини, лімфотоксини, фактор некрозу пухлини, супресори пухлини, трансформуючий фактор росту, альфа-1 анти-трипсин, альбумін, а-лактальбумін, аполіпопротеїн-Е, еритропоетин, глікозильований еритропоетин, ангіопоетини, гемоглобін, тромбін, пептиди, що активують рецептор тромбіну, тромбомодулін, фактор крові МІ, МПа, МІЙ, ЇХ та ХІШ, активатори плазміногену, фібрин-зв'язуючі пептиди, урокіназу, стрептокіназу, гірудин, протеїн С, С- реактивний протеїн, інгібітор реніну, інгібітор колагенази, супероксиддисмутазу, лептин, фактор росту тромбоцитів, фактор росту епітелію, фактор росту епідермісу, ангіостатин, ангіотензин, фактор росту кістки, кістково-стимулюючий протеїн, кальцитонін, інсулін, атріопептин, хрящевий індукуючий фактор імпульсної відповіді, елкатонін, актгивуючий фактор сполучної тканини, інгібітор шляху тканинного фактору, фолікулостимулюючий гормон, лютеїнізуючий гормон, гормон, що вивільняє лютеїнізуючий гормон, фактори росту нервів, паратироїдний гормон, релаксин, секретин, соматомедин, інсулінподібний фактор росту, гормон наднирників, глюкагон, холецистокінин, панкреатичний поліпептид, гастрин-вивільняючий пептид, кортикотропін- вивільняючий фактор, тиреостимулюючий гормон, аутотаксин, лактоферин, міостатин, антигени клітинної поверхні, вакцинні антигени вірусного походження, моноклональні антитіла, поліклональні антитіла та антитільні фрагменти.
Інсулін, який застосовують у втіленні за представленим винаходом, є видом фізіологічно активних пептидів, секретованих підшлунковою залозою, коли рівень глюкози крові стає високим, який функціонує, щоб контролювати рівні глюкози в крові, спричиняючи прийняття глюкози печінкою, скелетними м'язами та жировою тканиною з крові та накопичення її як глікогену, та пригнічуючи ліполіз, метаболізм застосування жиру як джерела енергії. Фізіологічно активні пептиди включають агоністи, прекурсори, похідні, фрагменти та варіанти інсулін.
Переважними є нативний інсулін, швидко діючий інсулін та інсулін тривалої дії.
Нативний інсулін є гормоном, секретованим підшлунковою залозою, та відіграє вирішальну
Зо роль в контролі рівнів глюкрзи в крові, шляхом стимулювання клітинного поглинання глюкози та інгібування ліполізу. Інсулін, який має функцію регулювання рівнів глюкози в крові, продукується з проінсулінового прекурсору без функції регулювання рівнів глюкози в крові, через серію процесів. Амінокислотна послідовність є наступною: -Альфа ланцюг:
Спу-Пе-МаІ-Спіи-СтТп-Сув-Сув- Гиг-5ег-Пе-Сув-5ег-І еи- Гут-С1п-Ї ей-С1ПІи-Авп- Туг-Субз-Азп (ЗЕО І
МО: 1) -Бета ланцюг:
Ріпе-МаІ-Азп-С1п-Нів-Ї еи-Сувз-Спу-5ег-Нів-І еи-МаІ-Спи-Аїа-Ї еи- Тук- еи-МаІ-Сув-Спту-сп1и-Ага- сСіу-Рпе-РНе-Туг- Тиг-Рго-І ув-ТАг (ЗЕО ІО МО: 2)
Термін "агоніст інсуліну", як застосовується в даному документі, стосується речовини, яка може зв'язуватись іп мімо з інсуліновим рецептором та демонструє таку саму біологічну активність що й інсулін незалежно від структури інсуліну.
Термін "похідна інсуліну", як застосовується в даному документі, стосується пептиду, який функціонує, щоб контролювати рівні глюкози в крові іп мімо та має амінокислотну послідовність, яка має, щонайменше, 80 95 гомологічності з нативним інсуліном. В деяких амінокислотних залишках може відбуватися хімічне заміщення (наприклад, альфа-метилювання, альфа- гідроксилювання), делеція (наприклад, деамінування) або модифікування (наприклад, М- метилювання, глікозилювання, жирні кислоти).
Як застосовується в даному документі, термін "фрагмент інсуліну" стосується пептиду, що має функцію контролювання рівнів глюкози в крові іп мімо, одержану шляхом додавання щонайменше однієї амінокислоти до або видаленням, щонайменше, однієї амінокислоти з амінного або карбоксильного кінця інсуліну. Додана амінокислота може бути амінокислотою, що не зустрічається в природі (наприклад, О-амінокислотою).
Як застосовується в даному документі, термін "варіант інсуліну" стосується пептиду, що має амінокислотну послідовність, яка відрізняється від тієї що у нативного інсуліну одним або більше амінокислотним залишком, але має функцію контролювання рівнів глюкози в крові іп мімо.
На додаток, способи, які застосовують, відповідно, для одержання агоністів, фрагментів та варіантів, інсулін можуть використовувати незалежно або в комбінації. Наприклад, пептид 60 інсуліну, прийнятний в представленому винаході може включати пептид, який має амінокислотну послідовність, яка відрізняється від тієї що у нативного інсуліну одним або більше амінокислотним залишком, з деамінуванням в М-термінальному залишку, але, який функціонує, щоб контролювати рівні глюкози в крові іп мімо.
Як застосовується в даному документі, термін "константна ділянка імуноглобуліну" стосується фрагменту імуноглобуліну, який є вільним від варіабельних ділянок легкого та важкого ланцюгів, константної ділянки 1 важкого ланцюга (Сні) та константної ділянки легкого ланцюга (Сі), іншими словами, є Ес ділянкою, що складається з константних ділянок 2 та З важкого ланцюга (Снг та Снз) (або який містить константну ділянку важкого ланцюга (Сна)).
Необов'язково, Ес ділянка імуноглобуліну може додатково включати шарнірну ділянку. Крім того, константна ділянка імуноглобуліну за представленим винаходом може бути розширеною
Ес ділянкою імуноглобуліну, яка містить частину або повністю константну ділянку 1 важкого ланцюга (Сні) та/або константну ділянку легкого ланцюга (Сі), за виключенням тільки варіабельних ділянок важких та легких ланцюгів імуноглобуліну за умови, що він демонструє ефекти в значній мірі ідентичні або переважаючі ті, що у нативної константної ділянки імуноглобуліну. Крім того, у константної ділянки імуноглобуліну за представленим винаходом може бути відсутня значна частина амінокислотної послідовності, яка відповідає Снг та/або Снз.
Як наслідок, константна ділянка імуноглобуліну за представленим винаходом може містити (1)
Сні домен, Снг домен, Снз домен та Сна домен, (2) Сні домен та Снг домен, (3) Сні домен та Снз домен, (4) Снг домен та Снз домен, (5) комбінацію одного або більше константних доменів та шарнірної ділянки імуноглобуліну (або частину шарнірної ділянки), або (б) димер кожного константного домену важкого ланцюга та константної ділянки легкого ланцюга.
Константна ділянка імуноглобуліну, яка включає Ес ділянку, є здатною до біорозкладання поліпептидом, який може бути метаболізований іп мімо, таким чином, що його можуть безпечно застосовувати як носій лікарського засобу. До того ж, Ес ділянка імуноглобуліну є більш вигідною з точки зору одержання, очистки та виходу одержання комплексу, ніж всієї молекули імуноглобуліну завдяки її відносно меншої молекулярної маси. Крім того, оскільки вона є вільною від Раб, яка демонструє високу неоднорідність завдяки різниці в амінокислотній послідовності від одного антитіла до іншого, Ес імуноглобулін сам по собі забезпечує комплекс, в значній мірі, з підвищеною гомогенністю, та знижує можливість індукування антигенності крові.
Константна ділянка імуноглобуліну може походити від людей або тварин, таких як корови, кози, свині, миші, кролики, хом'ячки, щури, морські свинки, тощо, і може бути переважно людського походження. До того ж, константну ділянку імуноглобуліну можуть вибирати з Ес фрагментів, похідних Ідс, ІДА, ДО, ІДЕ, ЗМ або їх комбінацій, або гібридів. Переважно, константна ділянка є похідною Ідс або ІДМ, які є найбільш поширеними серед них в крові, та найбільш переважно Ідс, який, як відомо, покращує сироватковий період напіввиведення ліганд-зв'язуючих протеїнів.
Як застосовується в даному документі, термін "комбінація" означає, що поліпептиди, які кодують одноланцюгову константну ділянку імуноглобулінів (переважно Ес ділянки) однакового походження, є зв'язаними з одноланцюговим поліпептидом відмінного походження, утворюючи дімер або мультимер. Іншими словами, дімер або мультимер можуть одержувати комбінацією двох або більше фрагментів, вибраних з групи, яка складається з фрагментів Іде Ес, ІдА Ес, (ІМ
Ес, ІдО Ес та ІЧЕ Ес.
Як застосовується в даному документі, термін "гібрид" означає, що послідовності, які кодують два або більше фрагментів Ес імуноглобуліну різних походжень є присутніми в одинарному ланцюгу константної ділянки імуноглобуліну (переважно, Ес ділянки). В представленому винаході можливими є різні гібридні форми. Наприклад, гібридний домен може містити від одного до чотирьох доменів, вибраних з групи, яка складається з Сні, Снг, Снз та Сна з ЇЯо Ес, І9М Ес, ІдДА Ес, ІДЕ Ес та ІдО Ес, та може містити шарнірну ділянку.
ІцО підрозділяють на Ідс1, Ідс2, ІдсЗ та Ідс4 підкласи, та представлений винахід може включати їх комбінації або гібриди. Переважними є Ід52 та Ідс4 підкласи, та найбільш преважною є Ес ділянка Ідс4, яка рідко має ефекторні функції, такі як комплемент залежна цитотоксичність (СОС).
Константна ділянка імуноглобуліну може мати глікозильовану форму в такій самій мірі як, або в більш високій мірі, або меншій мірі, ніж нативна форма, або може бути в деглікозильованій формі. Підвищене або знижене глікозилювання або деглікозилювання ділянки імуноглобуліну може бути досягнуте, використовуючи типові способи, наприклад, із застосуванням хімічного способу, ферментного способу або генно-інженерного способу, використовуючи мікроорганізми. В даному випадку, при деглікозилюванні, комплемент (С14) зв'язуючись з ділянкою Ес імуноглобуліну стає значно зменшеним, та залежна від антитіла 60 цитотоксичність або залежна від комплементу цитотоксичність знижується або зникає, тим самим не викликаючи непотрібних імунних відповідей іп мімо. В даному контексті, деглікозильовані або аглікозильовані ділянки Ес імуноглобуліну є більш відповідними з метою носіїв лікарського засобу. Відповідно, ділянка Ес імуноглобуліну, яка є найбільш прийнятною як носій лікарського засобу за представленим винаходом, є людською Ідс4і-похідною аглікозильованої ділянки Ес. Ес ділянка людського походження є більш переважною, ніж Ес ділянка нелюдського походження, яка може діяти як антиген в організмі людини та викликати небажані імунні відповіді, такі як продукування нового антитіла проти антигену.
Крім того, не тільки константна ділянка імуноглобуліну з нативною амінокислотною послідовністю, але також її мутантна амінокислотна послідовність можуть бути включеними в межі константної ділянки імуноглобуліну за представленим винаходом. Термін "мутантна амінокислотна послідовність", як застосовується в даному документі, стосується поліпептидів, що мають амінокислотну послідовність, яка є відмінною від не мутантного типу, як результат делеції, вставки, консервативного або неконсервативного заміщення одного або більше амінокислотних залишків, або їх комбінації. Наприклад, відомо, що амінокислотні залишки в положеннях 214-238, 297-299, 318-322 або 327-331 в дО Ес, є важливими для зчеплення, можуть застосовувати як сайти прийнятні для модифікації. Різні похідні, такі як ті, що одержані шляхом видалення сайтів, здатних до утворення дисульфідних зв'язків, видалення декількох М- термінальних амінокислот з нативної Ес, або додавання метіоніну до М-кінця нативної Ес, можуть застосовувати в представленому винаході. До того ж, сайти фіксації комплемента, наприклад, С14 сайти фіксації, або АОСС сайти можуть бути видаленими з нативної Ес ділянки, щоб усунути ефекторну функцію. Способи одержання мутантних амінокислотних послідовностей константної ділянки імуноглобуліну є розкритими в міжнародних публікаціях патенту МоМо УМО 97/34631 та УМО 96/32478.
Амінокислотні заміщення в молекулі протеїну або пептиду, які не змінюють активність молекули, є добре відомими в даній галузі з рівня техніки (Н.Мешгакфй, К.С.НІії, Тпе Протеїнв,
Асадетіс Рге55, Мем/ МогК, 1979). Найбільш поширенні заміщення здійснюють між амінокислотними залишками АПа/Зег, мае, Авр/СІм, Тпг/зег, АІа/сіу, АІа/Тпг, зег/Азп, Айа/маї,
Зег/Сіу, Тиг/РНе, Аїа/Рго, І ув/Агу, Азр/Азп, І ешлЛіє, І еи/л/аї, АІа/СІи та Азр/СІу. Необов'язково, амінокислоти можуть модифікувати шляхом фосфорилювання, сульфатування, акрилювання,
Зо глікозилювання, метилювання, фарнесилювання, ацетилювання та амідування.
Описані вище похідні константної ділянки імуноглобуліну демонструють таку саму біологічну активність, як та, що у константної ділянки імуноглобуліну за представленим винаходом, але мають покращену структурну стабільність щодо нагрівання, рнН і тому подібному. Дані константні ділянки імуноглобулінів можуть одержувати з нативного типу, виділеного з людей або тварин, таких як корова, кози, свині, миші, кролі, хом'ячки, щури, морські свинки, тощо, або можуть бути їх рекомбінантами або похідними, одержаними з трансформованих тваринних клітин або мікроорганізмів. Нативні константні ділянки можуть одержувати шляхом протеазного розщеплення всього діапазону імуноглобулінів, виділених зі зразків людини або тварини.
Імуноглобуліни є розщепленими в Раб та Ес за допомогою папаїну та в рес та К(аб)» за допомогою пепсину, з наступною гель-тгроникаючою хроматографією, щоб відокремити Ес або рес на основі цього.
Переважною є рекомбінантна людська константна ділянка імуноглобуліну, одержана з мікроорганізму.
Корисні ефекти
Як описано вище, комплекс фізіологічно активний поліпептид - непептидильний полімер - константна ділянка імуноглобуліну можуть одержувати з високим ступенем чистоти та високим виходом, а також з низькою вартістю, застосовуючи спосіб за представленим винаходом. Таким чином, спосіб за представленим винаходом є промислово прийнятним. Більш того, його можуть застосовувати для розробки композицій фізіологічно активних поліпептидів з тривалою дією, які мають вдосконалену комплаентність лікарського засобу.
Приклади здійснення винаходу
Краще розуміння представленого винаходу може бути отримане завдяки наступним прикладам, які представлені для ілюстрації, але їх не слід розглядати як обмежуючі для представленого винаходу.
ПРИКЛАД 1: ПЕГилювання інсуліну, застосовуючи натрію ціаноборгідрид як відновлюючий агент та очистка моно-ПЕГильованого інсуліну
Порошкоподібний інсулін розчиняли в 10 мМ НС, та ПЕГилювали в М-кінці бета ланцюга з 3.АК пропіон-АГО2 ПЕГ (ПЕГ з двома пропіональдегідними групами, ІОВ, Когеа). В цьому відношенні, 5 мг/мл інсуліну реагували з ПЕГ в молярному співвідношенні 1:2 при температурі бо від 4 "С до кімнатної температури протягом 2 годин. Реакцію здійснювали в 50 мМ буферному розчині цитрату натрію при рН 6,0 в 4595 ізопропанолі в присутності 2-20 мМ натрію ціаноборгідриду як відновлюючого агенту. Реакційну суміш завантажували в 5Р-НР (СЕ
Неапйсаге) колонку, з наступним елююванням буфером, що містить цитрат натрію (рН 3,0), та 4595 ЕН, та застосовуючи градієнт концентрації КСІ, щоб чистити моно-ПЕГильований інсулін.
Виходи ПЕГилювання інсуліну відповідно до умов відновлюючого агента натрію ціаноборгідриду при одержанні комплексу, що містить інсулін та ділянку Ес імуноглобуліну, є підсумованими в таблиці 1, нижче.
ПРИКЛАД 2: Зміни у виходах одержання комплексу моно-ПЕГильований інсулін - ділянка Ес імуноглобуліну відповідно до умов натрію ціаноборгідриду як відновлюючого агенту, який застосовували в ПЕГилюванні
Для аналізу виходу одержання комплексу інсулін - ПЕГ - ділянка Ес імуноглобуліну, моно-
ПЕГильований інсулін, одержаний в прикладі 1, реагував у молярному співвідношенні 1:1 з Ес імуноглобуліном при 25 "С протягом 13 годин, із загальною концентрацією протеїну, що становить 20 мг/мл. Дану реакцію сполучення здійснювали в 100 мМ НЕРЕЗ буфері, який містить 22 мМ фосфату калію та 1095 етанолу при рН 8,2, в присутності 20 мМ натрію ціаноборгідриду як відновлюючого агенту.
Реакційну суміш завантажували в колонку Зоцгсе 150) (ЗЕ Неайсаге), з наступним елююванням Ттгіз-НСІ (рН 7,5) буфером та застосовуючи градієнт концентрації МасСі щоб відокремити та почистити непрореагувавший інсулін, непрореагувавшу ділянку Ес імуноглобуліну, комплекс інсулін - ПЕГ - ділянка Ес імуноглобуліну, та ділянку Ес імуноглобуліну, сполучену з двома або більше моно-ПЕГильованими фрагментами інсуліну (інсулін-ПЕГ).
Виходи одержання комплексу інсулін - ПЕГ - ділянка Ес імуноглобулін визначали, застосовуючи
УФ поглинання на 280 нм після очистки хроматографією.
В таблиці 1 підсумовано виходи реакції сполучення з ділянкою Ес імуноглобуліну відповідно до умов застосування натрію ціаноборгідриду як відновлюючого агенту в ПЕГилюванні інсуліну.
Таблиця 1 ціаноборгідриду реакції |ПЕГилювання (95)| сполучення (90) до 1 8мМ 17 ггод. | кт | 404 | 271 | 71095 щ 8мМм 17 4год. | 4 1777/7404 | 27 2 щЩ | 7109
ПРИКЛАД 3: ПЕГилювання інсуліну, застосовуючи боран-піридиновий комплекс як
Зо відновлюючий агент та очистка моно-ПЕГильованого інсуліну
Порошкоподібний інсулін розчиняли в 10 мМ НСІ та ПЕГилювали на М-кінці бета ланцюга з 3.АК пропіон-АГО2 ПЕГ (ПЕГ з двома пропіональдегідними групами, ІОВ, Когеа). В цьому відношенні, 5 мг/мл інсулін реагували з ПЕГ в молярному співвідношенні 1:2 при 4 "С протягом 2 годин. Реакцію здійснювали в 50 мМ буферному розчині цитрату натрію при рН 6,0 в 45 95 ізопропанолі в присутності 3-20 мМ боран-піридинового комплексу як відновлюючого агенту.
Реакційну суміш завантажували в ЗР-НР (СЕ Неєайнсагє) колонку, з наступним елююванням буфером, що містить цитрат натрію (рН 3,0) та 4595 ЕН, та застосовуючи градієнт концентрації КСІ, щоб чистити моно-ПЕГильований інсулін.
Виходи ПЕГилювання інсуліну відповідно до умов застосування відновлюючого агента боран-піридинового комплексу під час одержання комплексу, що містить інсулін та ділянку Ес імуноглобуліну, підсумовані в таблиці 2, нижче.
ПРИКЛАД 4: Зміни у виходах одержання комплексу моно-ПЕГильований інсулін - ділянка Ес імуноглобуліну відповідно до умов боран-піридинового комплексу як відновлюючого агенту, який застосовували в ПЕГилюванні
Для аналізу виходу одержання комплексу інсулін - ПЕГ - ділянка Ес імуноглобуліну, моно-
ПЕГильований інсулін, одержаний в прикладі З, реагував у молярному співвідношенні 1:1 з Ес імуноглобуліном при 25 "С протягом 13 годин, із загальною концентрацією протеїну, що становить 20 мг/мл. Дану реакцію сполучення здійснювали в 100 мМ НЕРЕЗ буфері, що містить 22 ММ фосфату калію та 10 95 етанолу при рН 8,2, в присутності 20 мМ натрію ціаноборгідриду як відновлюючого агенту.
Реакційну суміш завантажували в Зоцйгсе 150) (ЗЕ НеайПсаге) колонку, з наступним елююванням буфером Ттгі5-НСІ (рН 7,5) та застосовуючи градієнт концентрації Масі, щоб відокремити та почистити непрореагувавший інсулін, непрореагувавшу ділянку Ес імуноглобуліну, комплекс інсулін - ПЕГ - ділянка Ес імуноглобуліну та ділянку Ес імуноглобуліну, сполучену з двома або більше фрагментами моно-ПЕГильованого інсуліну (інсулін-ПЕГ).
Виходи одержання комплексу інсулін - ПЕГ - ділянка Ес імуноглобуліну визначали, застосовуючи УФ поглинання на 280 нм після очистки хроматографією.
В таблиці 2 підсумовано виходи реакції сполучення з ділянкою Ес імуноглобуліну відповідно до умов застосування боран-піридинового комплексу як відновлюючого агенту в ПЕГилюванні інсуліну.
Таблиця 2 піридинового комплексу
ПРИКЛАД 5: Виходи реакції сполучення та утворення аберанту імуноглобуліну Ес в залежності від концентрації натрію ціаноборгідриду та часу реакції
Для аналізу утворення аберанту імуноглобуліну Ес в залежності від концентрацій відновлюючого агента та часу реакції в реакції сполучення, моно-ПЕГильований інсулін реагував в молярному співвідношенні 1:1 з Ес імуноглобуліном при 25 "С протягом 13-43 годин, із загальною концентрацією протеїну, що становить 20 мг/мл. Дану реакцію сполучення здійснювали в 100 мМ НЕРЕЗ буфері, який містить 22 мМ фосфату калію та 10 95 етанолу, рН 8,2, в присутності 5-40 мМ натрію ціаноборгідриду.
Реакційну суміш завантажували в Зоцйгсе 150) (ЗЕ НеайПсаге) колонку, з наступним елююванням буфером Ттгіб5-НСІ (рН 7,5), та застосовували градієнт концентрації масі, щоб відокремити та почистити непрореагувавший інсулін, непрореагувавшу ділянку Ес імуноглобуліну, комплекс інсулін - ПЕГ - ділянка Ес імуноглобуліну та ділянку Ес імуноглобуліну, сполучену з двома або більше фрагментами моно-ПЕГильованого інсуліну (інсулін-ПЕГ).
Виходи одержання комплексу інсулін - ПЕГ - ділянка Ес імуноглобуліну визначали, застосовуючи УФ поглинання на 280 нм після очистки хроматографією.
В таблиці З підсумовано виходи реакції сполучення, за якою одержували комплекс, що містить інсулін та ділянку Ес імуноглобуліну в залежності від концентрацій натрію
Зо ціаноборгідриду, який застосовували, як відновлюючий агент, та часу реакції в реакції сполучення.
Таблиця З
Утворення аберантів імуноглобуліну Ес в залежності від концентрацій відновлюючого агента в реакції сполучення відслідковували, використовуючи РХ на Ргорас 5АХ-10 (ОІОМЕХ) колонці, елююючи буфером Ттгі5-НСЇІ (рН 8,0) та застосовуючи градієнт концентрації Масі.
В таблиці 4, представлені виходи одержання аберантів Ес імуноглобуліну в залежності від концентрацій натрію ціаноборгідриду та часу реакції в реакції сполучення, за якою одержують комплекс, що містить інсулін та ділянку Ес імуноглобуліну.
Таблиця 4
Таблиця 4
ПРИКЛАД 6: ПЕГилювання Ес імуноглобуліну, застосовуючи натрію ціаноборгідрид як відновлюючий агент, та очистка моно-ПЕГильованого Ес імуноглобуліну.
М-кінець імуноглобуліну Ес ПЕГилювали 5К пропіон-АЇО0О2 ПЕГ (ПЕГ з трьома пропіональдегідними групами, МОБ, Чдарап). В даному сенсі, 10 мг/мл імуноглобуліну Ес реагували з ПЕГ в молярному співвідношенні 1:22 при температурі від 4 "С до кімнатної температури протягом 4,5 годин. Реакцію здійснювали в 100 мМ буферному розчині фосфату калію з рН 6,0 в присутності 20 мМ натрію ціаноборгідриду як відновлюючого агенту. Реакційну суміш завантажували в колонку Зоигсе 150), з наступним елююванням буфером Ттгі5-НСЇ (рн 7,5) та застосуванням градієнту концентрації Масі для очистки моно-ПЕГильованого інсуліну.
ПРИКЛАД 7: Одержання комплексу моно-ПЕГильованої ділянки Ес імуноглобуліну-інсуліну, застосовуючи натрію ціаноборгідрид як відновлюючий агент
Для одержання комплексу інсулін - ПЕГ - ділянка Ес імуноглобуліну, моно-ПЕГильований імуноглобулін Ес, одержаний в прикладі б, взаємодіяв у молярному співвідношенні 1:4 з інсуліном при 4 "С протягом 13 годин, із загальною концентрацією протеїну, що становила 20 мг/мл. Дану реакцію сполучення здійснювали в 100 мМ буферному розчині фосфату калію з рн 6,0 в присутності 20 мМ натрію ціаноборгідриду як відновлюючого агенту.
Реакційна суміш завантажували в бБоцигсе 150) (ЗЕ Неакрсаге) колонку для первинної очистки. Та другу очистку додатково проводили, використовуючи 5ои!игсе 15150 (СЕ НеаїНсаге) колонку, щоб одержати комплекс інсулін - ПЕГ - ділянка Ес імуноглобуліну.
Перелік послідовностей 1105 Ханмі байене БО, ЛТ. 51205 Вдосконалений спосіб одержання фізівлогічно активного поліпептидного комплекса «150» ОРАТІВ «1805 КЕ ТОО1200гАТІВ «15125 9012-03-08 «бо й «1702 Коржейний 1.77 «а 1 «Киї» 21 «Т8з» ВРКТ «йТ32 Людини «А З
Су Пе маї СН са Су Сує ТЕ Заг а Су Заг ей Тук Ма це
З 5 т 15
СИ Авп Тут був Ап -5 «7102 У «11 З «122 РТ «я» Дюдими й г
Рие Уві Авп сх Ні бен був СМу Баг Нівієц ма! СН Аа ед Тут 1 5 10 тб ме ма! Схже СУ ШІ Ат СУ Ре Ре Тут Тег бто ув ТА 28 ко За

Claims (25)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб одержання комплексу фізіологічно активний поліпептид-непептидильний полімер- константна ділянка імуноглобуліну, за яким: (1) непептидильний полімер, що має два або більше альдегідів як функціональні групи, піддають взаємодії з одним фізіологічно активним поліпептидом або константною ділянкою імуноглобуліну в присутності відновлюючого агента в концентрації від 1ММ до менш ніж 20 мМ; та (2) реакційну суміш зі стадії (1) піддають взаємодії з іншим фізіологічно активним поліпептидом або константною ділянкою імуноглобуліну для того, щоб отримати комплекс фізіологічно активний поліпептид-непептидильний полімер-константна ділянка імуноглобуліну, в присутності відновлюючого агента в концентрації 1-100 мм; де непептидильний полімер реагує з обома фізіологічно активними поліпептидами та константними ділянками імуноглобуліну на стадіях (1) і (2).
2. Спосіб за п. 1, який додатково включає відокремлення кон'югату фізіологічно активного поліпептиду-непептидильного полімеру або кон'югату константної ділянки імуноглобуліну- непептидильного полімеру від реакційної суміші після стадії (1).
3. Спосіб за п. 1, де відновлюючий агент функціонує для того, щоб знизити оборотний імінний подвійний зв'язок, що виникає при сполученні між альдегідною групою непептидильного полімеру та аміногрупою фізіологічно активного поліпептиду або константної ділянки імуноглобуліну при утворенні ковалентного зв'язку.
4. Спосіб за п. 1, в якому відновлюючий агент вибирають з групи, яка складається з натрію ціаноборгідриду, боран-піридинового комплексу, натрію боргідриду, боран-диметиламінового комплексу, боран-триметиламінового комплексу та натрію триацетоксиборгідриду.
5. Спосіб за п. 1, в якому відновлюючий агент застосовують в концентраціях від 1 до 40 мМ на стадії (2).
6. Спосіб за п. 1, в якому реакцію на стадії (1) здійснюють протягом від 1 до 16 годин.
7. Спосіб за п. 1, в якому реакцію на стадії (2) здійснюють протягом від 1 до 48 годин. Зо
8. Спосіб за п. 1, в якому реакцію на стадії (1) здійснюють при температурі від 0 до 25 "С.
9. Спосіб за п. 1, в якому реакцію на стадії (1) здійснюють протягом від 1 до 16 годин при 0-257С в присутності відновлюючого агента в концентрації від 1 до менш ніж 20 мМ, та реакцію на стадії (2) здійснюють протягом від 1 до 48 годин в присутності відновлюючого агента в концентрації від 1 до 40 мМ.
10. Спосіб за п. 1, в якому непептидильний полімер ковалентно зв'язується з кожним фізіологічно активним поліпептидом та константною ділянкою імуноглобуліну за рахунок двох або більше їх альдегідних функціональних груп.
11. Спосіб за п. 1, в якому функціональні групи непептидильного полімеру зв'язуються з кожною аміногрупою фізіологічно активного поліпептиду та константної ділянки імуноглобуліну, де аміногрупа є присутньою в М-кінці або в бічному ланцюзі І уз залишку.
12. Спосіб за п. 1, в якому непепгидильний полімер вибирають з групи, яка складається з поліетиленгліколів, поліпропіленгліколів, співполімерів етиленгліколю та пропіленгліколю, поліоксіетильованих поліолів, полівінільних спиртів, полісахаридів, декстранів, полівінілетилових етерів, полімолочної кислоти (РІ А), полімолочної-гліколевої кислоти (РІ БА), ліпідних полімерів, хітинів, гіалуронової кислоти та їх комбінації.
13. Спосіб за п. 1, в якому непептидильний полімер являє поліетиленгліколь.
14. Спосіб за п. 1, в якому молекулярна маса непептидильного полімеру знаходиться в діапазоні від 1 до 100 кДа.
15. Спосіб за п. 1, в якому константна ділянка імуноглобуліну є аглікозильованою.
16. Спосіб за п. 1, в якому константна ділянка імуноглобуліну містить від одного до чотирьох доменів, вибраних з групи, яка складається з Сні, Снг, Снз та Сна доменів.
17. Спосіб за п. 1, в якому константна ділянка імуноглобуліну додатково містить шарнірну ділянку.
18. Спосіб за п. 1, в якому константну ділянку імуноглобуліну вибирають з групи, яка складається з константних ділянок, що походять з дос, ІдА, дО, ІДЕ, ІдМ або їх комбінацій, або гібридів.
19. Спосіб за п. 1, в якому константну ділянку імуноглобуліну вибирають з групи, яка складається з константних ділянок Ідс1, Ідс2, дез, Ід, їх комбінації, та їх гібриду.
20. Спосіб за п. 1, в якому константна ділянка імуноглобуліну є Ідс4 Ес ділянкою.
21. Спосіб за п. 20, в якому константна ділянка імуноглобуліну є аглікозильованою Ідс4 Ес ділянкою людини.
22. Спосіб за п. 1, в якому фізіологічно активний поліпептид вибирають з групи, яка складається з гормону росту людини, гормонів, що вивільняють гормон росту, пептидів, що вивільняють гормон росту, інтерферону, рецепторів інтерферону, колонієстимулюючих факторів, глюкагонподібних пептидів (СІ Р-1, тощо), оксинтомодуліну, зв'язуючих з протеїн рецепторів, інтерлейкінів, рецепторів інтерлейкіну, ферментів, зв'язуючих інтерлейкін протеїнів, зв'язуючих цитокін протеїнів, макрофаг активуючих факторів, пептидів макрофагу, факторів В-клітин, факторів Т-клітин, протеїну А, інгібіторів алергії, глікопротєїнів некрозу клітин, імунотоксинів, лімфотоксинів, фактора некрозу пухлини, супресорів пухлини, трансформуючого фактора росту, альфа-1 антитрипсину, альбуміну, с-лактальбуміну, аполіпопротеїну-Е, еритропоетину, глікозилованого еритропоетину, ангіопоетинів, гемоглобіну, тромбіну, активуючих пептидів рецептора тромбіну, тромбомодуліну, фактора крові МІІ, Ма, МІ, ЇХ та ХІЇЙ, активаторів плазміногену, фібринзв'язуючих пептидів, урокінази, стрептокінази, гірудину, протеїну С, С- реактивного протеїну, інгібітору реніну, інгібітору колагенази, супероксиддисмутази, лептину, фактора росту тромбоцитів, фактора росту епітелію, фактора росту епідермісу, ангіостатину, ангіотензину, фактора росту кістки, кістковостимулюючого протеїну, кальцитоніну, інсуліну, атріопептину, хрящового індукуючого фактора імпульсної відповіді, елкатоніну, активуючого фактора сполучної тканини, інгібітору шляху тканинного фактора, фолікулостимулюючого гормону, лютеїнізуючого гормону, гормону, що вивільняє лютеїнізуючий гормон, факторів росту нервів, паратироїдного гормону, релаксину, секретину, соматомедину, інсулінподібного фактора росту, гормону наднирників, глюкагону, холецистокінину, панкреатичного поліпептиду, гастрин- вивільняючого пептиду, кортикотропінвивільняючого фактора, тиреостимулюючого гормону, аутотаксину, лактоферину, міостатину, антигенів клітинної поверхні, вакцинних антигенів вірусного походження, моноклональних антитіл, поліклональних антитіл та антитільних фрагментів.
23. Спосіб за п. 1, в якому фізіологічно активним поліпептидом є інсулін.
24. Спосіб за п. 1, де стадію (1) проводять в присутності відновлюючого агента в концентрації від 1 мМ до 10 мМ. Зо
25. Спосіб за п. 1, де стадію (1) проводять в присутності відновлюючого агента в концентрації від 1 мМ до 8 мМ.
UAA201410250A 2012-03-08 2013-03-08 Спосіб одержання фізіологічно активного поліпептидного комплексу UA114192C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20120024136 2012-03-08
PCT/KR2013/001885 WO2013133659A1 (en) 2012-03-08 2013-03-08 An improved process for preparation of physiologically active polypeptide complex

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA114192C2 true UA114192C2 (uk) 2017-05-10

Family

ID=49117067

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201410250A UA114192C2 (uk) 2012-03-08 2013-03-08 Спосіб одержання фізіологічно активного поліпептидного комплексу

Country Status (18)

Country Link
US (1) US11168109B2 (uk)
EP (1) EP2822972A4 (uk)
JP (2) JP6383667B2 (uk)
KR (1) KR101679612B1 (uk)
CN (2) CN110339369B (uk)
AR (1) AR090281A1 (uk)
AU (1) AU2013228144B2 (uk)
CA (1) CA2866473A1 (uk)
HK (1) HK1201858A1 (uk)
IN (1) IN2014DN07956A (uk)
MX (1) MX369613B (uk)
MY (1) MY165211A (uk)
PH (1) PH12014502004A1 (uk)
RU (1) RU2639256C2 (uk)
SG (1) SG11201405537UA (uk)
TW (2) TW202033536A (uk)
UA (1) UA114192C2 (uk)
WO (1) WO2013133659A1 (uk)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR081755A1 (es) * 2010-04-02 2012-10-17 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de la hormona estimuladora de los foliculos donde se usa un fragmento de inmunoglobulina, metodo de preparacion y metodo para tratar a un sujeto que sufre un trastorno reproductivo
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
CN117065044A (zh) * 2014-03-31 2023-11-17 韩美药品株式会社 通过使用免疫球蛋白Fc片段连接改善蛋白质和肽的溶解度的方法
RU2730848C2 (ru) * 2015-06-04 2020-08-26 Резолют, Инк. Способы пэгилирования по аминогруппе для получения сайт-специфичных конъюгатов белков
TW201718022A (zh) 2015-07-24 2017-06-01 韓美藥品股份有限公司 製備生理活性多肽接合物的方法
CA2997263C (en) * 2015-09-08 2022-10-04 Theripion, Inc. Apoa-1 fusion polypeptides and related compositions and methods
EP3341025A4 (en) * 2015-09-24 2019-05-01 Hanmi Pharm. Co., Ltd. PROTEIN COMPLEX BY USING A SPECIFIC ROLE OF AN IMMUNOMOBILIN FRAGMENT FOR LINKING
US20200283492A1 (en) * 2017-09-29 2020-09-10 Hanmi Pharm Co., Ltd. Long acting protein complex having an enhanced efficiency
CN111978390B (zh) * 2020-08-31 2022-10-14 上海景泽生物技术有限公司 聚乙二醇修饰的rhBNP及其用途

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5110906A (en) 1986-08-21 1992-05-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Derivatives of soluble T-4
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US6924264B1 (en) 1999-04-30 2005-08-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Modified exendins and exendin agonists
US6756480B2 (en) 2000-04-27 2004-06-29 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
JP2004510751A (ja) 2000-10-05 2004-04-08 アレス　トレーディング　ソシエテ　アノニム 位置選択的液相ペグ化
JP2004528014A (ja) 2000-12-07 2004-09-16 イーライ・リリー・アンド・カンパニー Ｇｌｐ−１融合タンパク質
US7312192B2 (en) 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
SE526711C2 (sv) 2003-01-31 2005-10-25 Probi Ab Nya stammar av Bifidobacterium med förmåga att överleva i magtarmkanalen och producera glutamin in vivo, samt kompositioner och användningar därav
US20050176108A1 (en) 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US20040180054A1 (en) * 2003-03-13 2004-09-16 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
DK2599502T3 (en) 2003-04-11 2017-04-18 Antriabio Inc Process for Preparation of Site-Specific Protein Conjugates
KR101135244B1 (ko) 2007-11-29 2012-04-24 한미사이언스 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
US8263084B2 (en) 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
AU2004282984B2 (en) 2003-11-13 2011-07-14 Hanmi Science Co., Ltd. Protein complex using immunoglobulin fragment andmethod for the preparation thereof
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
WO2006076471A2 (en) 2005-01-12 2006-07-20 Nobex Corporation Bnp conjugates and methods of use
TWI376234B (en) 2005-02-01 2012-11-11 Msd Oss Bv Conjugates of a polypeptide and an oligosaccharide
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
GB2427360A (en) 2005-06-22 2006-12-27 Complex Biosystems Gmbh Aliphatic prodrug linker
KR100824505B1 (ko) 2005-08-16 2008-04-22 한미약품 주식회사 개시 메티오닌 잔기가 제거된 면역글로불린 Ｆｃ 영역의대량 생산방법
UA97628C2 (uk) * 2005-08-16 2012-03-12 Ханми Холдингз Ко., Лтд. Спосіб отримання fc-фрагмента імуноглобуліну, вільного від початкового метіонінового залишку, в масовому масштабі
WO2008051383A2 (en) * 2006-10-19 2008-05-02 Amgen Inc. Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields
JP2008169195A (ja) 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
JP5577243B2 (ja) 2007-05-30 2014-08-20 ポステク アカデミー−インダストリー ファウンデイション 免疫グロブリン融合タンパク質
JP2009019027A (ja) 2007-07-16 2009-01-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体
EP2184355A4 (en) 2007-08-09 2011-04-27 Daiichi Sankyo Co Ltd WITH A HYDROPHOBIC MOLECULE MODIFIED ANTIBODY
MY151184A (en) * 2008-07-23 2014-04-30 Hanmi Science Co Ltd A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends
CN102256992B (zh) 2008-12-19 2015-04-22 印第安纳大学研究及科技有限公司 胰岛素类似物
CA2755395C (en) 2009-03-20 2015-02-24 Hanmi Holdings Co., Ltd. Method for preparing a site-specific physiologically active polypeptide conjugate
WO2011011073A1 (en) 2009-07-22 2011-01-27 Ipsen Pharma S.A.S. Site-specific pegylated or site-specific lipidated igf-1 and analogues of igf-1
CA2769244A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
WO2011064758A2 (en) 2009-11-30 2011-06-03 Pfizer Limited Fusion protein
US8829163B2 (en) 2010-01-19 2014-09-09 Hanmi Science Co., Ltd Liquid formulations for long-acting erythropoietin conjugate
JP5657698B2 (ja) 2010-01-19 2015-01-21 ハンミ サイエンス カンパニー リミテッドＨａｎｍｉ Ｓｃｉｅｎｃｅｃｏ．，Ｌｔｄ． 持続型顆粒球コロニー刺激因子結合体の液剤
AR081755A1 (es) 2010-04-02 2012-10-17 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de la hormona estimuladora de los foliculos donde se usa un fragmento de inmunoglobulina, metodo de preparacion y metodo para tratar a un sujeto que sufre un trastorno reproductivo
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
AR080993A1 (es) 2010-04-02 2012-05-30 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
KR101330868B1 (ko) 2010-06-08 2013-11-18 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 인슐린 유도체 약물 결합체
KR101337797B1 (ko) 2010-07-14 2013-12-06 한미사이언스 주식회사 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제
KR101382593B1 (ko) 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR101830344B1 (ko) 2010-10-26 2018-02-22 한미사이언스 주식회사 피브로넥틴 단편 및 면역글로불린 단편의 융합 단백질 및 이의 용도
KR101303388B1 (ko) 2010-10-26 2013-09-03 한미사이언스 주식회사 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제
CN103502264A (zh) 2011-04-04 2014-01-08 国立大学法人东京医科齿科大学 Hiv立体结构识别抗体诱导肽
UA113626C2 (xx) 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
ES2692187T3 (es) 2011-06-10 2018-11-30 Hanmi Science Co., Ltd. Nuevos derivados de oxintomodulina y composición farmacéutica para el tratamiento de obesidad que lo comprende
EP2721062B1 (en) 2011-06-17 2018-11-14 Hanmi Science Co., Ltd. A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
BR112014005091A2 (pt) 2011-09-05 2017-06-13 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd composição farmacêutica para o tratamento do câncer compreendendo conjugado de interferon alfa
RU2620072C2 (ru) 2011-10-06 2017-05-22 Ханми Сайенс Ко., Лтд. ПРОИЗВОДНЫЕ ФАКТОРОВ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VII И VIIa, КОНЪЮГАТЫ И КОМПЛЕКСЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИХ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
KR20130049671A (ko) * 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
KR101895047B1 (ko) 2011-12-30 2018-09-06 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 위치 특이적 글루카곤 유사 펩타이드-2 약물 결합체
AU2013216943B2 (en) 2012-02-10 2018-04-19 Research Corporation Technologies, Inc. Fusion proteins comprising immunoglobulin constant domain-derived scaffolds
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
US10064951B2 (en) 2012-03-30 2018-09-04 Hanmi Science Co., Ltd. Liquid formulation of highly concentrated long-acting human growth hormone conjugate
CN103509118B (zh) 2012-06-15 2016-03-23 郭怀祖 胰岛素-Fc融合蛋白
EP2875152B1 (en) 2012-07-19 2019-10-09 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme construct
AR091902A1 (es) 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
KR101968344B1 (ko) 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
AR092862A1 (es) 2012-07-25 2015-05-06 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de insulina de accion prolongada y un peptido insulinotropico y metodo de preparacion
AR094821A1 (es) 2012-07-25 2015-09-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada
US10441665B2 (en) 2012-07-25 2019-10-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation of long acting insulinotropic peptide conjugate
KR101993393B1 (ko) 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
ES2748158T3 (es) 2012-11-06 2020-03-13 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulación líquida de conjugado de proteínas que comprende la oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina
CA2899418C (en) 2013-02-26 2022-05-03 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Site-specific insulin conjugate
TWI755579B (zh) * 2013-02-26 2022-02-21 南韓商韓美藥品股份有限公司 新穎胰島素類似物及其用途
KR102136336B1 (ko) * 2013-03-05 2020-07-22 한미약품 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 고수율 생산을 위한 개선된 제조 방법
AR096891A1 (es) 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
AR096890A1 (es) 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
CA2925416A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Sustained type human growth hormone preparation
TWI684458B (zh) 2014-05-30 2020-02-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 包含胰島素及ｇｌｐ-１/昇糖素雙重促效劑之治療糖尿病之組成物
KR20150140177A (ko) 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
EA038544B1 (ru) 2015-12-31 2021-09-13 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Тройной агонист рецепторов глюкагона/glp-1/gip
IL263934B2 (en) 2016-06-29 2023-10-01 Hanmi Pharm Ind Co Ltd A derivative of glucagon, its conjugate, a preparation containing it and its medical use

Also Published As

Publication number Publication date
TW202033536A (zh) 2020-09-16
HK1201858A1 (en) 2015-09-11
KR101679612B1 (ko) 2016-11-25
TW201341395A (zh) 2013-10-16
EP2822972A4 (en) 2015-12-16
MX369613B (es) 2019-11-14
MY165211A (en) 2018-03-05
JP2015514690A (ja) 2015-05-21
SG11201405537UA (en) 2014-11-27
AU2013228144A1 (en) 2014-09-25
RU2014138621A (ru) 2016-04-27
WO2013133659A1 (en) 2013-09-12
AU2013228144B2 (en) 2017-08-17
US20150299247A1 (en) 2015-10-22
JP6383667B2 (ja) 2018-08-29
CN104271604A (zh) 2015-01-07
RU2639256C2 (ru) 2017-12-20
US11168109B2 (en) 2021-11-09
KR20130103447A (ko) 2013-09-23
CN110339369A (zh) 2019-10-18
EP2822972A1 (en) 2015-01-14
CN110339369B (zh) 2024-01-23
MX2014010734A (es) 2014-12-05
IN2014DN07956A (uk) 2015-05-01
JP2018104465A (ja) 2018-07-05
AR090281A1 (es) 2014-10-29
PH12014502004A1 (en) 2014-11-24
CA2866473A1 (en) 2013-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA114192C2 (uk) Спосіб одержання фізіологічно активного поліпептидного комплексу
RU2483081C2 (ru) Полипептидный комплекс, содержащий непептидильный полимер, обладающий тремя функциональными концами
CA2795291C (en) An insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
EP3406627B1 (en) Igg4 fc fragment comprising modified hinge region
HU231423B1 (hu) Biológiailag aktív polipeptid monomer és immunglobulin Fc fragmentum konjugátuma csökkentett receptor-közvetített kiürüléssel, és az eljárás ennek előállítására
JP2018150332A (ja) 生理活性ポリペプチド複合体の製造方法
JP2020506932A (ja) 持続性が増加した生理活性物質の結合体及びその用途
US10660940B2 (en) Preparation method for high-yield production of physiologically active polypeptide conjugate