TWI819013B - 氟化物離子摻雜之穩定的非晶形磷酸鈣及其製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係與一種製備檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子的方法有關，其包含以下的步驟：1）提供鈣鹽以及檸檬酸鹽的第一溶液，其中檸檬酸根離子對鈣離子的莫耳比率係在1到2的範圍內，因此獲得澄清的第一溶液；2）提供能夠產生磷酸根陰離子的鹽以及碳酸鹽的第二溶液；3）在8到11的pH範圍內將該澄清的第一溶液以及該第二溶液混合在一起；4）使該奈米粒子沉澱；以及5）使從步驟4）所獲得的該奈米粒子乾燥。較佳且有利地，本發明提供了在步驟2）中添加氟化物化合物，用於獲得氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子或者奈米粒子團聚物。本發明的奈米粒子/奈米粒子團聚物具有特別的表面積以及直徑，使得允許其作為用於牙科應用的生物材料。

Description

氟化物離子摻雜之穩定的非晶形磷酸鈣及其製造方法
本發明係關於用於醫學，較佳用於牙科醫學的生物材料。具體來說，本發明係關於檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣粒子，較佳為摻雜氟化物離子的粒子，以及關於其的製造方法。本發明也有關於本發明的粒子作為醫學的生物材料的用途，較佳作為用於牙齒再礦化以及牙本質減敏劑的牙科醫學的生物材料的用途。
非晶形磷酸鈣（amorphous calcium phosphate；ACP）係生物礦化科學以及生物醫學材料領域中最重要的磷酸鈣（calcium phosphate；CaP）相之一。非晶形磷酸鈣存在於許多生物系統中，特別是存在於原始生物體中，其主要係Ca2+ 離子以及PO4 3- 離子的蓄存庫。由於非晶形磷酸鈣的表面能係低於氫氧基磷灰石（hydroxyapatite；HA）以及磷酸八鈣（octacalcium phosphate；OCP）的表面能，因此非晶形磷酸鈣係來自含Ca2+ 離子以及PO4 3- 離子的過飽和水溶液沉澱的第一相。非晶形磷酸鈣係一種短程有序，而不是結晶的長程有序的礦物質相。由Betts以及Posner所提出的非晶形磷酸鈣的基本結構單元大致上為球形的離子簇（cluster of ion），其平均直徑為9.5奈米，並且與化學組成物Ca9 (PO4 )6 一致。
眾所周知的是，非晶形磷酸鈣為不穩定的材料，且其在溶液中以及乾燥狀態時會轉變成更具熱力學穩定的磷酸鈣相（亦即，氫氧基磷灰石以及磷酸八鈣），並與大氣中的水反應，因此當非晶形磷酸鈣用作最終生物材料時，會明顯加劇非晶形磷酸鈣穩定性的問題。
由於非晶形磷酸鈣優異的生物活性、高的細胞黏附性、可調整的生物降解性以及良好的骨傳導性（osteoconductivity），因此目前正研究將非晶形磷酸鈣用來製造若干種生物材料。舉例來說，非晶形磷酸鈣係用以製備金屬假體上的塗層、自固化的可注射水泥以及具有聚合物的混合複合材料。
與其他的結晶磷酸鈣相相比，由於非晶形磷酸鈣能夠釋放大量的Ca2+ 離子以及PO4 3- 離子，因此非晶形磷酸鈣作為牙科醫學中的牙釉質再礦化劑（remineralization agent）係特別吸引人的材料。這些再礦化劑可以添加到修復材料中，或者直接塗覆到牙齒表面以滲透到牙釉質表面下的病變中。非晶形磷酸鈣已經被提議作為在礦化組織形成期間的必要的前軀體。因此，使用非晶形磷酸鈣可以藉由模擬形成新礦物相的生物礦化過程來提供仿生的再礦化策略。
牙齒硬組織（牙釉質以及牙本質）的脫礦質係導致齲齒以及牙本質敏感症的主要原因。其係由低的pH環境所引起的，其係有三個主要原因：酸性食物或飲料的攝食、胃食道逆流病（gastroesophageal reflux disease）的存在或者病原性口腔生物膜的產酸活性。當口水的pH值降至低於5.5時，氫氧基磷灰石（HA）（代表牙齒組織的主要礦物成分的牙釉質和牙本質分別為95重量%和75重量%）開始溶解。
如果受損組織暴露至有利於再礦化的口腔環境中，則脫礦質為可逆過程。舉例來說，由脫礦質過程引起的牙釉質腔，藉由作為成核位點的殘餘晶體的外延生長而自然地再礦化，其中唾液提供相對於氫氧基磷灰石的過飽和Ca2+ 離子以及PO4 3- 離子環境。然而，很少達成口水對牙釉質的再礦化，特別是當脫礦質相以及再礦化相兩者中存在存續時間以及程度不平衡的時候。為了有效地逆轉脫礦質以及促進再礦化，使用可能在晶體損傷以及空隙中供應Ca2+ 離子以及PO4 3- 離子的外部源來增加氫氧基磷灰石得過飽和度以及產生淨礦物增益可為有助益的。因此，已經報導了若干包含不同形式的磷酸鈣（亦即，氫氧基磷灰石、氟羥基磷灰石（fluoro-hydroxyapatite；FHA）、四鈣磷酸鹽（tetracalcium phosphate；TTCP）、β-第三磷酸鈣（beta Tricalcium Phosphate；β-TCP）、非晶形磷酸鈣，等等）來作為牙釉質脫礦質的癒合劑。然而，在口腔中塗覆晶體磷酸鈣相以促進再礦化的主要問題為晶體磷酸鈣相的溶解度差，特別是在氟離子存在的時候，使得不能夠使用Ca2+ 離子以及PO4 3- 離子。
最近報導了檸檬酸鹽在氫氧基磷灰石的結晶中扮演了重要的雙重角色：通過非晶型前驅物來驅動生長途徑，並且藉由非典型取向的聚集晶體成長機制來控制奈米粒子的尺寸。
此外，氟化物為最廣泛使用的預防劑（prophylacetic agent），用於減少以及防止牙釉質脫礦質，並且至今仍是最有效的齲齒預防劑。氟化物被認為藉由兩種不同的機制起作用：i）取代新形成的氫氧基磷灰石的羥基，產生氟磷灰石（fluorapatite）[FHA、Ca5 (PO4 )3 F]，其溶解度較低，並且因此較氫氧基磷灰石具有更強的抗酸侵蝕性；ii）抑制致齟性生物膜中的微生物代謝以及生理途徑，其產生有機酸以使牙齒組織脫礦質。
因此，本發明的第一個目的在於在牙釉質損傷中遞送Ca2+ 、PO4 3- 以及F- ，導致再礦化作用改善，並且同時導致牙本質小管閉塞。
在WO2016/012452A1中，描述了一種獲得氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子的方法，其可以應用在醫藥以及牙科醫學產品中（諸如作為牙釉質以及牙本質的再礦化劑的漱口水、牙膏、口香糖等）。
具體地，本文中描述的方法包含以下的步驟： -製備濃度介於0.08 M到0.12 M之間的CaCl2 溶液，以及濃度介於0.35 M到0.50 M之間的檸檬酸鈉溶液； -製備藉由Na2 HPO4 形成的濃度介於0.10 M到0.15 M之間的第二溶液，當中包含0.2 M的Na2 CO3 以及氟化物化合物； -攪拌前一階段製備的兩種溶液，以1:1 v/v的比例混合，並且在室溫中攪拌少於2分鐘的時間，混合物的pH值介於8.3到8.7之間（例如以HCl來調節）； -藉由離心達成三次連續沉降循環，移除上澄液，並且以超純水來洗滌沉澱物；以及 -對濕的沉澱物進行冷凍乾燥。
此方法允許獲得在成骨細胞中具有生物反應的奈米粒子，特別是在不同奈米粒子濃度中觀察到細胞增殖，同時與成骨細胞接觸時完全地生物相容。
即使WO2016/012452的奈米粒子為適用於牙釉質再礦化的良好生物材料，然而仍然存在需要具有有效並且能夠在短時間作為再礦化劑的生物材料。
本發明的發明人驚訝地發現一種製備檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子的方法，其包含以下的步驟： 1）提供鈣鹽以及檸檬酸鹽的第一溶液，其中檸檬酸根離子對鈣離子的莫耳比率係在1到2的範圍內，因此獲得澄清的第一溶液； 2）提供能夠產生磷酸根陰離子的鹽以及碳酸鹽的第二溶液； 3）在8到11的pH範圍內將該澄清的第一溶液以及該第二溶液混合在一起； 4）使該奈米粒子沉澱；以及 5）使從步驟4）所獲得的該奈米粒子乾燥。
在本發明的方法中，該第一溶液在該混合步驟進行之前係澄清的。表述「澄清的第一溶液（clear first solution）」指的是該第一溶液實質上沒有任何種類的顆粒。
有利的是，步驟5）為冷凍乾燥步驟。
在另一態樣中，本發明涉及藉由如本發明所述之方法可獲得之檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子，其中該乾燥步驟5）為冷凍乾燥步驟，以布厄特（Brunauer-Emmett-Teller；BET）氣體吸附法並且利用穿透式電子顯微鏡（transmission electron microscopy；TEM）圖像測量，該奈米粒子的特徵在於表面積在250 m2 g-1 到360 m2 g-1 的範圍內，並且具有直徑在30奈米到80奈米範圍內的圓形形態。
因此，在第一個具體實例中，以布厄特（BET）氣體吸附法藉由利用粉末樣品以及藉由Sorpty 1750（Carlo Erba，義大利米蘭）測量，奈米粒子具有介於250 m2 g-1 到360 m2 g-1 的表面積範圍，並且該奈米粒子較佳具有直徑在30奈米到80奈米範圍內的球形形態。所有用來確定直徑的儀器為能夠擁有穿透式電子顯微鏡（TEM）圖像的儀器。
有利的是，步驟5）為噴霧乾燥步驟。
在另一態樣中，本發明涉及藉由如本發明所述之方法可獲得之檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子團聚物，其中該乾燥步驟5）為噴霧乾燥步驟，以布厄特（BET）氣體吸附法測量，並利用掃描電子顯微術（scanning electron microscopy；SEM）測量，該檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子團聚物的特徵在於表面積為3 m2 g-1 到10 m2 g-1 ，並且具有直徑在2微米到25微米範圍內的圓形形態。
下方的實驗部分也將證明，當步驟5）包含噴霧乾燥步驟時，最終產物為對應於介於2微米到25微米的直徑範圍內的微粒的奈米粒子的團聚物。
因此，在第二個具體實例中，以布厄特（BET）氣體吸附法藉由利用粉末樣品以及藉由Sorpty 1750（Carlo Erba，義大利米蘭）測量，奈米粒子團聚物具有介於3 m2 g-1 到10 m2 g-1 的表面積範圍，並且該奈米粒子團聚物較佳具有直徑在2微米到25微米範圍內的球形形態。所有用來確定直徑的儀器為用於掃描電子顯微術（SEM）的儀器。
在本發明的另一個較佳的態樣中，藉由在步驟2）的第二溶液中添加氟化物化合物，可以獲得氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子。
因此，在另一個較佳的態樣中，本發明涉及藉由如本發明所述之方法可獲得之氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子，並且包含在步驟2）中添加氟化物化合物，其中該乾燥步驟5）為冷凍乾燥步驟，以布厄特（BET）氣體吸附法並且利用穿透式電子顯微鏡（TEM）圖像測量，該奈米粒子的特徵在於表面積為250 m2 g-1 到370 m2 g-1 ，並且具有直徑在30奈米到80奈米範圍內的圓形形態。
因此，在第一個具體實例中，以布厄特（BET）氣體吸附法藉由利用粉末樣品以及藉由Sorpty 1750（Carlo Erba，義大利米蘭）測量，氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的奈米粒子具有介於250 m2 g-1 到370 m2 g-1 的表面積範圍，並且該氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的奈米粒子較佳具有直徑在30奈米到80奈米範圍內的圓形形態。所有用來確定直徑的儀器為能夠擁有穿透式電子顯微鏡（TEM）圖像的儀器。
在另一個較佳的態樣中，本發明涉及藉由如本發明所述之方法可獲得之氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子團聚物，並且包含在步驟2）中添加氟化物，其中該乾燥步驟5）為噴霧乾燥步驟，以布厄特（BET）氣體吸附法並且利用掃描電子顯微術（SEM）測量，該氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子團聚物的特徵在於表面積為3 m2 g-1 到10 m2 g-1 ，並且具有介於2微米到25微米內的直徑範圍。
表面積範圍係以布厄特（BET）氣體吸附法，藉由利用粉末樣品以及Sorpty 1750（Carlo Erba，義大利米蘭）測量。
在另一個態樣中，本發明涉及使用奈米粒子或者奈米粒子團聚物作為在口腔治療中（通常在牙科醫學中）的生物材料的用途。較佳地，該生物材料係作為再礦化劑，較佳用於牙齒硬組織的再礦化，或者作為牙本質減敏劑（dentin desensitizer），其中在後者的情況中，該生物材料的作用較佳係填充以及使牙本質小管閉塞。
具體地，該生物材料為再礦化劑，較佳係用於剝離（abraction）、侵蝕、空洞、磨損、白斑以及低礦化的情況中。
在又一個態樣中，本發明涉及本發明的粒子作為整形外科應用中的生物材料的用途。
令人驚訝的是，本發明的檸檬酸鹽穩定的奈米粒子以及氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的奈米粒子具有高的表面積，導致能夠以很快的方式來傳遞Ca2+ 離子以及F1- 離子，這毫無疑問地較先前技術，如同在WO2016/012452中描述的那些奈米粒子的傳遞來得快。
不希望受到任何特定的理論約束，並且如同將在實驗部分中加以解釋的是，本案發明人將以很快的方式傳遞Ca2+ 離子以及F1- 離子的令人驚訝的特性，視為是由於方法所致，亦即檸檬酸根離子對鈣離子的莫耳比率介於1到2之間的範圍。
因此，本發明係與一種製備檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子的方法有關，其包含以下的步驟： 1）提供鈣鹽以及檸檬酸鹽的第一溶液，其中檸檬酸根離子對鈣離子的莫耳比率係在1到2的範圍內，因此獲得澄清的第一溶液； 2）提供能夠產生磷酸根陰離子的鹽以及碳酸鹽的第二溶液； 3）在8到11的pH範圍內將該澄清的第一溶液以及該第二溶液混合在一起； 4）使該奈米粒子沉澱；以及 5）使從步驟4）所獲得的該奈米粒子乾燥。
方法的步驟1）包含提供鈣鹽以及檸檬酸鹽的第一溶液，其中檸檬酸根離子對鈣離子的莫耳比率係在1到2的範圍內。所獲得的第一溶液係澄清的。
鈣鹽較佳係由陰離子所構成，該陰離子係選自由以下所組成的群組：氯離子、硝酸根離子、氫氧根離子、乙酸根離子、草酸根離子、乳酸根離子，更佳該陰離子為氯離子。
檸檬酸鹽較佳係由陽離子所構成，該陽離子係選自由鈉離子以及鈣離子所組成的群組，更佳該陽離子為鈉離子。
更佳地，檸檬酸根離子對鈣離子的莫耳比率大約為1。
又更佳地，檸檬酸根離子對鈣離子的莫耳比率大約為2。在一個較佳的具體實例中，根據本發明的方法的步驟1）的第一溶液包含至少一種額外的鹽，該至少一種額外的鹽係選自由鍶鹽以及鎂鹽所組成的群組。
鍶鹽較佳係由陰離子所構成，該陰離子係選自由以下所組成的群組：氯離子、硝酸根離子、氫氧根離子、乙酸根離子、草酸根離子、乳酸根離子，更佳該陰離子為氯離子。
鎂鹽較佳係由陰離子所構成，該陰離子係選自由以下所組成的群組：氯離子、硝酸根離子、氫氧根離子、乙酸根離子、草酸根離子、乳酸根離子，更佳該陰離子為氯離子。
步驟2）包含提供能夠產生磷酸根陰離子的鹽以及碳酸鹽的第二溶液；
較佳地，碳酸根陰離子以及磷酸根陰離子之間的比例係介於1到1.66的範圍內。
較佳地，能夠產生磷酸根陰離子的鹽是磷酸鹽、磷酸氫鹽或者磷酸氫鹽。能夠產生磷酸根陰離子的鹽較佳係由陽離子所構成，該陽離子係選自由鈉離子、鈣離子以及銨離子所組成的群組，更佳地該陽離子為鈉離子。
步驟3）包含在8到11的pH範圍內，較佳在8.5到10.7的pH範圍內，將第一溶液以及第二溶液混合在一起。
在一個有利的態樣中，第一溶液以及第二溶液的比率在1：1到1：1.5的範圍內。
根據本發明，在第一步驟澄清後進行混合步驟3）。較佳地，將第二溶液加入到澄清的第一溶液中進行混合步驟。
步驟4）包含使奈米粒子沉澱。
沉澱步驟可以有利地藉由離心提供沉降循環來進行，之後可以根據眾所周知的方法移除上澄液。一旦收集了沉澱物，較佳就可以以超純水沖洗該沉澱物。接著，根據本領域已知的乾燥方法來使濕的沉澱物乾燥。
步驟5）包含本發明的使沉澱奈米粒子乾燥的步驟。
可以以本領域中的任何合適的方法進行乾燥步驟。較佳地，乾燥步驟可以選自冷凍乾燥、噴霧乾燥以及通風烘箱乾燥。較佳地，後者係在以乙醇沖洗之後並且在大約40 °C的溫度中進行。
在一個較佳的態樣中，乾燥步驟5）為冷凍乾燥步驟。
在另一態樣中，本發明涉及藉由如本發明所述之方法可獲得之檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子，其中該乾燥步驟5）為冷凍乾燥步驟，以布厄特（BET）氣體吸附法並且利用穿透式電子顯微鏡（TEM）圖像測量，該奈米粒子的特徵在於表面積在250 m2 g-1 到360 m2 g-1 ，較佳在270 m2 g-1 到360 m2 g-1 ，並且具有直徑在30奈米到80奈米範圍內的圓形形態。
因此，在第一個具體實例中，以布厄特（BET）氣體吸附法藉由利用粉末樣品以及藉由Sorpty 1750（Carlo Erba，義大利米蘭）測量，奈米粒子具有介於250 m2 g-1 到360 m2 g-1 的表面積範圍，較佳具有介於270 m2 g-1 到360 m2 g-1 的表面積範圍，並且該奈米粒子較佳具有直徑在30奈米到80奈米範圍內的球形形態。所有用來確定直徑的儀器為能夠擁有穿透式電子顯微鏡（TEM）圖像的儀器。
在另一個有利的態樣中，乾燥步驟5）為噴霧乾燥步驟。
在另一態樣中，本發明涉及藉由如本發明所述之方法可獲得之檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子團聚物，其中該乾燥步驟5）為噴霧乾燥步驟，以布厄特（BET）氣體吸附法測量，並利用掃描電子顯微術（SEM）測量，該檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子團聚物的特徵在於表面積為3 m2 g-1 到10 m2 g-1 ，並且具有直徑在2微米到25微米範圍內的圓形形態。
因此，在第一個具體實例中，以布厄特（BET）氣體吸附法藉由利用粉末樣品以及藉由Sorpty 1750（Carlo Erba，義大利米蘭）測量，奈米粒子團聚物具有介於3 m2 g-1 到10 m2 g-1 的表面積範圍，並且該奈米粒子團聚物較佳具有直徑在2微米到25微米範圍內的球形形態。所有用來確定直徑的儀器為用於掃描電子顯微術（SEM）儀器。
在本發明的另一個較佳的態樣中，藉由在步驟2）的第二溶液中添加氟化物化合物，可以獲得氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子。
較佳地，氟化物化合物為陽離子的氟化物，該陽離子係選自由鈉離子以及鉀離子所組成的群組。
因此，在另一個較佳的態樣中，本發明涉及藉由如本發明所述之方法可獲得之氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子，並且包含在步驟2）中添加氟化物化合物，其中該乾燥步驟5）為冷凍乾燥步驟，以布厄特（BET）氣體吸附法並且利用穿透式電子顯微鏡（TEM）圖像測量，該奈米粒子的特徵在於表面積為250 m2 g-1 到370 m2 g-1 ，較佳為270 m2 g-1 到370 m2 g-1 ，並且具有直徑在30奈米到80奈米範圍內的圓形形態。
因此，在第一個具體實例中，以布厄特（BET）氣體吸附法藉由利用粉末樣品以及藉由Sorpty 1750（Carlo Erba，義大利米蘭）測量，氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子具有介於250 m2 g-1 到370 m2 g-1 的表面積範圍，較佳具有介於270 m2 g-1 到370 m2 g-1 的表面積範圍，並且該奈米粒子較佳具有直徑在30奈米到80奈米範圍內的球形形態。所有用來確定直徑的儀器為能夠擁有穿透式電子顯微鏡（TEM）圖像的儀器。
在另一個較佳的態樣中，本發明涉及藉由如本發明所述之方法可獲得之氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子團聚物，並且包含在步驟2）中添加氟化物化合物，其中該乾燥步驟5）為噴霧乾燥步驟，以布厄特（BET）氣體吸附法並且利用掃描電子顯微術（SEM）測量，該氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子團聚物的特徵在於表面積為3 m2 g-1 到10 m2 g-1 ，並且為具有介於2微米到25微米內的直徑範圍的圓形。
表面積範圍係以布厄特（BET）氣體吸附法，藉由利用粉末樣品以及Sorpty 1750（Carlo Erba，義大利米蘭）測量。
在另一個態樣中，本發明涉及本發明的粒子作為牙科醫學應用的生物材料的用途。較佳地，該生物材料係用於牙齒硬組織的再礦化，或者作為牙本質減敏劑，其中在後者的情況中，該生物材料的作用較佳係填充以及使牙本質小管閉塞。
在又一個態樣中，本發明涉及本發明的粒子作為整形外科應用中的生物材料的用途。
實驗部分
材料
從Sigma Aldrich（聖路易斯市；密蘇里州；美國）購買二水氯化鈣（CaCl2 ∙2H2 O；純度≥ 99.0%）、檬酸三鈉二水合物（Na3 (C6 H5 O7 )∙2H2 O；純度≥ 99.0%；以下簡稱Na3 (Cit)）、磷酸氫二鈉二水合物（Na2 HPO4 ∙2H2 O；純度≥ 99.0%）、氯化鍶六水合物（SrCl2 ·6H2 O；純度≥ 99.0%）、氯化鎂六水合物（MgCl2 ·6H2 O；純度≥ 99.0%）、一水碳酸鈉（Na2 CO3 ∙2H2 O；純度≥ 99.0%）、氟化鈉（NaF；純度≥ 99.0%）、氯化鉀（KCl；純度≥ 99.5%）、硫氰酸鉀（KSCN；純度≥ 98.0%）、碳酸二氫鈉（NaHCO3 ；純度≥ 99.7%）以及乳酸（C3 H6 O3 ；純度≥ 90.0%）。所有溶液皆以超純水製備（0.22 µS；25 °C；MilliQ© ；Millipore）。
儀器以及評估方法
表1中報導的樣品的X光繞射圖式紀錄於D8 Advance繞射儀中（Bruker；卡爾斯魯爾市；德國），其裝配有Lynx-eye位置敏感偵檢器，並使用以40 千伏以及40毫安培產生的銅的Kα射線（λ = 1.54178 Å）。在10°到60°之間的2θ範圍紀錄光譜，步長（step size；2θ）為0.021，並且計數時間為0.5秒。
傅立葉轉換紅外線（Fourier transform infrared；FT-IR）光譜分析係在Nicolet 5700光譜儀（賽默飛世爾科技公司；沃爾瑟姆市；麻薩諸塞州；美國）中進行，解析度為2 cm− 1 ，累積64次掃描，覆蓋4000 cm− 1 至400 cm− 1 的範圍，並使用溴化鉀鹽片方法。
穿透式電子顯微鏡（TEM）以及選定區域電子繞射（selected area electron diffraction；SAED）評估係以Tecnai F20顯微鏡（Fei Corp.；希爾斯伯勒市；俄勒岡州；美國），以120千伏來實施。將粉末樣品進行超聲波分散在超純水中，接著使數滴的漿液沉積在200目的銅穿透式電子顯微鏡網格，其係以薄、非結晶的碳膜覆蓋，並且保溫（incubate)若干分鐘。
藉由感應耦合電漿原子發射（inductively coupled plasma atomic emission；ICP-OES）光譜儀（安捷倫科技5100 ICP-OES；聖塔克拉拉市；加利福尼亞州；美國）來定量鈣、磷、鎂以及鍶，同時以氟離子電極（Intellical™ ISEF121；Hach Lange；拉夫蘭市；科羅拉多州；美國）來定量氟。將等份的粉末溶解於1重量%的硝酸溶液中來製備樣品。
熱重分析（thermogravimetry analyses；TGA）係利用STA 449 Jupiter（Netzsch GmbH；塞爾布鎮；德國）儀器來實施。在鉑坩堝中稱重大約10毫克的樣品，並以空氣流對其加熱，以10 °C每分鐘的加熱速率從室溫加熱到1200 °C 的溫度。
布厄特（BET）氣體吸附法係利用Sorpty 1750（Carlo Erba，義大利米蘭）來測量粉末樣品的比表面積（specific surface area；SSA）。
掃描電子顯微術（SEM）評估係利用Sigma NTS Gmbh（卡爾蔡司；上科亨鎮；德國）來實施。利用碳膠帶將粉末樣品安置在鋁樣品台（stub）上，並且在分析之前在Sputter Coater E5100（Polaron Equipment；沃特福德市；赫特福德郡；英國）且在10-3 毫巴的氬氣氛圍中，以30毫安培的濺鍍電流、4分鐘的濺鍍時間對粉末樣品濺鍍金。
實施例1
先前技術WO2016/016012452的奈米粒子的製備
藉由在室溫中混合以下兩種溶液（1：1 v/v，總共200毫升）來合成乾燥的ACP（非晶形磷酸鈣）粉末：（i）100 mM的CaCl2 + 400 mM的Na3 (Cit)，以及（ii）120 mM的Na2 HPO4 + 200 mM的Na2 CO3 。以氯化氫溶液將pH調節到8.5。當混合物變成乳狀時，以超純水沖洗粒子三次，藉由恆溫在4 °C中以轉速5,000 rpm離心15分鐘，接著在-50 °C、3毫巴的真空中冷凍乾燥過夜。
以類似於製備ACP來製備F-ACP樣品，同時向溶液（ii）中加入50 mM的NaF2 。
實施例2
本發明的奈米粒子的製備
按照與實施例1相同的製備，同樣製備ACP以及F-ACP的樣品（以50 mM的NaF2 摻雜），將初始Cit/Ca的莫耳比率降至2以及1（以下分別編碼為ACP2 、F-ACP2 以及ACP1 、F-ACP1 ）。
實施例2bis
以鎂和鍶製備本發明的奈米粒子
按照與實施例2相同的製備，也以類似於製備F-ACP來製備SrF-ACP、MgF-ACP以及SrMgF-ACP，同時向溶液（i）中加入5 mM的SrCl2 或40 mM的MgCl2 或兩者。使用2以及1的初始Cit/Ca的莫耳比率（以下分別編碼為SrF-ACP2 、MgF-ACP2 、SrMgF-ACP2 以及SrF-ACP1 、MgF-ACP1 、SrMgF-ACP1 ）。
用於置備實施例1以及實施例2的樣品編碼以及化學反應物的濃度報導在下方的表1中。表 1
先前技術的樣品中，檸檬酸鹽對鈣的莫耳比率為4，而本發明係以介於1到2的莫耳比率範圍來製備樣品。
實施例3：在實施例1中製備的ACP4 粒子的物理特徵以及組成的評估
以上文中報導的儀器來評估實施例1中製備的乾燥ACP4 粉末的物理性質。
在圖1A中，報導了ACP4 的穿透式電子顯微鏡顯微圖，揭露了圓形形狀的奈米粒子而非典型結晶磷酸鈣的刻面以及角形，其尺寸在20奈米以及50奈米的範圍之間。由於存在漫射翼（diffuse wing）而非繞射點，因此針對這種奈米粒子收集的選定區域電子繞射圖形（圖1A中的右上插圖）證明了其非晶形的性質。
ACP4 的X光繞射圖式（圖1B）揭露相的典型的大約30°（2θ）的寬帶，其並無長程規律性，證實了ACP4 的非結晶結構以及排除了存在氫氧基磷灰石和其它磷酸鈣結晶相。傅立葉轉換紅外線光譜（圖1C）顯示非結晶結構的磷酸鈣的寬且未分辨的帶。特別的是，在大約560 cm-1 以及1050 cm-1 的吸收帶係分別與磷酸基團的彎曲模式及伸展模式有關；在大約870 cm-1 以及在1400 cm-1 到1500 cm-1 的範圍內的那些吸收帶屬於碳酸根離子，而在大約1605 cm-1 的帶屬於吸附的水以及檸檬酸鹽的COO- 的伸展。
因此，圖1A、圖1B、圖1C證實了由非結晶磷酸鈣構成的奈米粒子的球形形狀。
實施例4：在實施例1中製備的F-ACP粒子的物理特徵以及組成的評估
參考實施例1，在第一步驟中，試劑濃度以及Cit/Ca比率相對於用於製備ACP4 的方案保持恆定，然而加入NaF以摻雜ACP4 （下文稱為F-ACP4 ）。
F-ACP4 的穿透式電子顯微鏡圖像（圖2A）顯示了具有與ACP4 相似的尺寸以及形態的圓形粒子。由於存在漫射翼（diffuse wing）而非繞射點，因此針對這種奈米粒子收集的選定區域電子繞射圖形（圖2A中的右上插圖）證明了其非結晶的性質。F-ACP4 的X光繞射圖式（圖2B）顯示在ACP4 記錄的大約30°（2θ）處的相同的寬繞射峰，表明F- 離子的存在不會導致氟化物鹽或者其它結晶磷酸鈣相的沉澱。F-ACP4 的傅立葉轉換紅外線光譜也顯示了與ACP4 的傅立葉轉換紅外線光譜中類似的那些寬且未分辨的帶（圖2C）。
實施例5：在實施例2中製備的ACP以及F-ACP粒子的物理特徵以及組成的評估
如同上面所報導的，製備了兩個非晶形磷酸鈣樣品，改變了根據本發明試劑的標稱Cit/Ca比率，其根據先前技術設定為4，根據本發明設定為2或者1（以下非別稱為ACP2 以及ACP1 ），藉以評估Cit/Ca莫耳比率對這些非結晶材料的化學-物理特徵的影響。此外，使用用來合成F-ACP4 的相同的NaF的量來摻雜ACP2 以及ACP1 ，並且這些樣品分別稱作F-ACP2 以及F-ACP1 。
ACP2 的穿透式電子顯微鏡圖像（未顯示）以及ACP1 的穿透式電子顯微鏡圖像（圖3A）顯示具有與ACP4 相當的尺寸和形狀的圓形顆粒。由於存在漫射翼（diffuse wing）而非繞射點，因此針對ACP1 收集的選定區域電子繞射圖形（圖3A中的右上插圖）證明了其非結晶的性質。同樣這種情況中，與未摻雜的對應體相比，添加F- 離子不會誘發尺寸以及形態的變化。ACP2 、ACP1 、F-ACP2 以及F-ACP1 的X光繞射圖式（圖3B）顯示與純的非結晶相相同的寬繞射峰特徵。ACP2 、ACP1 、F-ACP2 以及F-ACP1 的傅立葉轉換紅外線光譜（圖3C）同樣顯示與在其它傅立葉轉換紅外線光譜中報導的那些類似的寬且未分辨的帶。
因此，根據本發明的ACP或者F-ACP為圓形形狀以及具有與先前技術的那些相似的尺寸。
實施例5bis
SrF-ACP2 、MgF-ACP2 、SrMgF-ACP2 、SrF-ACP1 、MgF-ACP1 、SrMgF-ACP1 的X光繞射圖式（圖8）顯示了與純的非結晶相相同的寬繞射峰特徵。SrF-ACP2 、MgF-ACP2 、SrMgF-ACP2 、SrF-ACP1 、MgF-ACP1 、SrMgF-ACP1 的傅立葉轉換紅外線光譜（圖9C）同樣顯示與在其它傅立葉轉換紅外線光譜中報導的那些類似的寬且未分辨的帶。
實施例6：在實施例1以及實施例2以及實施例2bis中製備的樣品的化學組成
表2概述了在實施例2中製備的樣品的化學組成。表 2 （a）藉由感應耦合電漿原子發射來量化； （b）藉由氟離子電極來量化； （c）藉由熱重分析來量化； （d）從布厄特吸附來計算。
同樣確定了SSABET 用於實施例1中製備的先前技術的樣品。
獲得以下的值：
ACP4 200±20 m2 g-1
F-ACP4 213±21 m2 g-1
SSABET 的值為一特徵，其區分以先前技術的方法以及本發明的方法所獲得的ACP及F-ACP。
根據本發明的樣品的熱重分析曲線主要表現出4種重量損失，其可以歸因於吸附的水（從室溫到150 °C）、結構水（structural water；從150 °C到350 °C）、檸檬酸鹽（從350 °C到700 °C）以及碳酸鹽（從700 °C到1,000 °C）。根據這些損失，估算檸檬酸鹽以及碳酸鹽的含量並且報導在表2中。
ACP2 與ACP1 的鈣/磷酸鹽比率相似，然而F-ACP2 以及F-ACP1 顯示較其未摻雜的對應體更高的鈣含量以及更高的Ca/P比率。F-ACP2 與F-ACP1 的鈣/磷酸鹽比率類似。
SrF-ACP2 、MgF-ACP2 、SrMgF-ACP2 、SrF-ACP1 、MgF-ACP1 、SrMgF-ACP1 的鈣+鍶+鎂/磷酸鹽比率與樣品F-ACP2 以及F-ACP1 的計算值類似。在摻雜鍶以及鎂的樣品中，檸檬酸鹽以及碳酸鹽的含量沒有變化，並且該含量與F-ACP2 以及F-ACP1 的計算值類似。有趣的是，吾人發現到當配製中包含單獨或者與鍶組合的鎂時，氟化物的量會增加。
不希望受到任何理論的約束，本案發明人認為更高的表面積是由於本發明的方法所致，其提供了介於1到2的範圍之間的檸檬酸根離子對鈣離子的莫耳比率。
上述數據表明了，藉由本發明的方法所獲得的檸檬酸鹽塗覆的粒子以及氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的粒子，不同於WO2016/012452的氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的粒子，並且是如此新穎。
實施例7：在實施例1以及實施例2中製備的樣品的人造唾液中的離子釋放
非晶形磷酸鈣在牙齒處理產品中的應用，係基於釋放鈣離子以及磷酸根離子的原理，藉以產生局部過飽和來觸發牙釉質再礦化。因此，已經在體外 測試此效果。已經測試了在人造唾液（一種模仿人類進食後的唾液的溶液，沒有其巨分子組分）中的體外 離子釋放。
將實施例1以及實施例2中製備的200毫克的ACP或者F-ACP粉末分散到10毫升的人造唾液中，該人造唾液製備為改良的Tani-Zucchi溶液，其含有20 mM的KCl、5.3 mM的KSCN、1.4 mM的Na2 HPO4 、15 mM的NaHCO3 以及10 mM的乳酸。搖晃懸浮液並保持在37 ℃。在預定的時間，分別藉由感應耦合電漿原子發射以及氟離子電極來移除8毫升的上澄液（藉由轉速5,000 rpm離心15分鐘來與固相充分分離），以用於Ca2+ 以及F- 的定量。其後，以8毫升的新鮮人造唾液來潤濕樣品，並且搖晃懸浮液並保持在37 ℃，並且如下所述的在下一個時間點處理該懸浮液。
實施例1以及實施例2的所有樣品顯示在最初的兩個小時後持續釋放Ca2+ 離子以及F- 離子（圖4）。根據本發明的具有Cit/Ca比率的樣品，顯示了令人驚訝地更高的離子釋放速率，因此相對於先前技術來說，其揭露了自身為一個改良並且有利的產品。
不希望受到任何理論的約束，本案發明人認為此令人驚訝的效果可能是由於具有較高表面積的本發明的粒子的獨特特徵，這是由於在製備奈米粒子的方法中使用的特定莫耳比率。
實施例7bis
已經在與實施例7相同的條件中測試了根據實施例2bis中製備的SrF-ACP2 、MgF-ACP2 、SrMgF-ACP2 、SrF-ACP1 、MgF-ACP1 、SrMgF-ACP1 在酸性人體唾液中的體外 離子釋放。
實施例2bis的所有樣品，類似於實施例1以及實施例2的樣品，顯示在最初的兩個小時後持續釋放Ca2+ 離子以及F- 離子（圖10A以及圖10B）。根據本發明的實施例2bis的樣品，顯示了與實施例2的樣品相當的離子釋放速率，因此相對於先前技術來說，其揭露了自身為一個改良並且有利的產品。
實施例8：製備在微粒中聚集的本發明的奈米粒子（本發明的奈米粒子團聚物）
為了評估藉由噴霧乾燥使實施例2的樣品乾燥而不影響其非結晶特徵的可能性，沖洗後以及如實施例2中所獲得的ACP2 、ACP1 、F-ACP2 以及F-ACP1 已經重新懸浮在3.5 %w/v的水中，並且藉由以下條件進行噴霧乾燥（Mini Spray Dryer B-290；Büchi Labortechnik Ag；瑞士）來乾燥：0.7毫米的噴嘴直徑、3毫升每分鐘的饋料速率、450公升每小時的氬氣流速、120 °C的入口溫度以及70 %的吸氣率。噴霧乾燥的F-ACP1 粉末的X光繞射圖式（圖5）在大約30°（2θ）處僅顯示了寬帶，證實了保留非結晶相的事實。噴霧乾燥的F-ACP1 粉末的掃描電子顯微術顯微圖（圖6）揭露了樣品係由直徑大約為2微米到25微米的球形粒子所組成，而球形粒子又由團聚的奈米粒子所構成，其與Cit/Ca比率無關，並且存在有氟化物。乾燥粉末的SSABET 的值係介於3 m2 g-1 到10 m2 g-1 之間的範圍，其與Cit/Ca比率無關，並且存在有氟化物。
實施例9：在實施例2中製備的樣品的乾燥粉末穩定性
非晶形磷酸鈣較磷酸鈣的結晶多晶形物來的不穩定，所以即使其在乾燥狀態中與大氣水反應也會在結晶相中轉化。因此，除非開發出穩定的材料，否則其使用以及處理係困難的。藉由收集X光繞射多達1年並分析ACP2 、ACP1 、F-ACP2 以及F-ACP1 粉末的結構（圖7），已經評估了該些粉末在室溫中的穩定性。有趣的是，X光繞射圖式保持不變，確定在這段時間內保留了所有樣品的非結晶的性質。
無
圖1A顯示在實施例1中製備的ACP4 的穿透式電子顯微鏡顯微圖；（插圖：相應的選定區域電子繞射圖式）
圖1B顯示在實施例1中製備的ACP4 的X光繞射圖式；
圖1C顯示在實施例1中製備的ACP4 的傅立葉轉換紅外線光譜；
圖2A顯示在實施例1中製備的F-ACP4 的穿透式電子顯微鏡顯微圖；（插圖：相應的選定區域電子繞射圖式）
圖2B顯示在實施例1中製備的F-ACP4 的X光繞射圖式；
圖2C顯示在實施例1中製備的F-ACP4 的傅立葉轉換紅外線光譜；
圖3A顯示在實施例2中製備的ACP1 的穿透式電子顯微鏡顯微圖；（插圖：相應的選定區域電子繞射圖式）
圖3B顯示在實施例2中製備的ACP2 、ACP1 、F-ACP1 、F-ACP2 的X光繞射圖式；
圖3C顯示在實施例2中製備的ACP2 、ACP1 、F-ACP1 、F-ACP2 的傅立葉轉換紅外線光譜；
圖4A報導了在實施例1以及實施例2中製備的從ACP樣品中的累積Ca2+ 釋放；數據以平均值±標準差表示（n = 5）；
圖4B報導了在實施例1以及實施例2中製備的從F-ACP樣品中的累積Ca2+ 釋放；數據以平均值±標準差表示（n = 5）；
圖4C報導了在實施例1以及實施例2中製備的從F-ACP樣品中的累積F- 釋放；數據以平均值±標準差表示（n = 5）；
圖5顯示實施例8的噴霧乾燥的F-ACP1 的X光繞射圖式；
圖6顯示實施例8的噴霧乾燥的F-ACP1 在不同放大倍率時的掃描電子顯微術顯微圖；
圖7顯示在實施例2中製備的ACP2 、ACP1 、F-ACP2 ,、F-ACP1 的合成後一年的X光繞射圖式，其儲存在實施例9的室溫中；
圖8顯示在實施例2bis中製備的SrF-ACP2 、MgF-ACP2 、SrMgF-ACP2 、SrF-ACP1 、MgF-ACP1 、SrMgF-ACP1 的X光繞射圖式；
圖9顯示在實施例2bis中製備的SrF-ACP2 、MgF-ACP2 、SrMgF-ACP2 、SrF-ACP1 、MgF-ACP1 、SrMgF-ACP1 的傅立葉轉換紅外線光譜；
圖10A報導了在實施例2bis中製備的從SrF-ACP2 、MgF-ACP2 、SrMgF-ACP2 、SrF-ACP1 、MgF-ACP1 、SrMgF-ACP1 樣品中的累積Ca2+ 釋放；數據以平均值±標準差表示（n = 5）；以及
圖10B報導了在實施例2bis中製備的從SrF-ACP2 、MgF-ACP2 、SrMgF-ACP2 、SrF-ACP1 、MgF-ACP1 、SrMgF-ACP1 樣品中的累積F- 釋放；數據以平均值±標準差表示（n = 5）。

Claims (27)

  1. 一種製備檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子之方法，其包含以下的步驟：1)提供鈣鹽以及檸檬酸鹽的第一溶液，其中檸檬酸根離子對鈣離子的莫耳比率係在1到2的範圍內，因此獲得澄清的第一溶液；2)提供能夠產生磷酸根陰離子的鹽以及碳酸鹽的第二溶液；3)在8到11的pH範圍內將該澄清的第一溶液以及該第二溶液混合在一起；4)使該奈米粒子沉澱；以及5)使從步驟4)所獲得的該奈米粒子乾燥。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該鈣鹽係由陰離子所構成，該陰離子係選自由以下所組成的群組：氯離子、硝酸根離子、氫氧根離子、乙酸根離子、草酸根離子、乳酸根離子。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該陰離子為氯離子。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該檸檬酸鹽係由陽離子所構成，其選自由鈉離子以及鈣離子所組成的群組。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該陽離子為鈉離子。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中檸檬酸根離子對鈣離子的該莫耳比率為2。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟1)的該第一溶液包含至少一種額外的鹽，其選自由鍶鹽以及鎂鹽所組成的群組。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該能夠產生磷酸根陰離子的鹽為磷酸鹽或磷酸氫鹽。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該能夠產生磷酸根陰離子的鹽為磷酸鹽或磷酸氫鹽，該鹽係由陽離子所構成，其選自由鈉離子、鈣離 子以及銨離子所組成的群組。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該步驟3)的pH係介於8.5到10.7的範圍內。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中在該混合步驟3)中，將該第二溶液加入到該澄清的第一溶液中。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中在步驟4)中，藉由離心除去上澄液、收集並且洗滌沉澱物來提供沉降循環以進行該沉澱。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該乾燥步驟5)係選自冷凍乾燥、噴霧乾燥以及通風烘箱乾燥。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中在步驟1)中加入氟化物化合物。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該氟化物化合物為陽離子的氟化物，該陽離子係選自由鈉離子以及鉀離子所組成的群組。
  16. 一種藉由如申請專利範圍第1項所述之方法可獲得之檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子團聚物，其中該乾燥步驟5)為冷凍乾燥步驟，該奈米粒子的特徵在於，以布厄特(Brunauer-Emmett-Teller；BET)氣體吸附法測量之表面積為250m2g-1到360m2g-1，並且利用穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscopy；TEM)圖像測量具有直徑在30奈米到80奈米範圍內的圓形形態。
  17. 一種藉由如申請專利範圍第1項所述之方法可獲得之檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子團聚物，其中該乾燥步驟5)為噴霧乾燥步驟，該奈米粒子團聚物的特徵在於，以布厄特(BET)氣體吸附法測量之表面積為2m2g-1到10m2g-1，並且利用掃描電子顯微術(scanning electron microscopy；SEM)測量具有直徑在2微米到25微米範圍內的圓形形態。
  18. 一種藉由如申請專利範圍第1項所述之方法可獲得之氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子，其中該乾燥步驟5)為冷凍乾燥步驟，該奈米粒子的特徵在於，以布厄特(BET)氣體吸附法測量之表面積為250m2g-1到370m2g-1，並且利用穿透式電子顯微鏡(TEM)圖像測量具有直徑在30奈米到80奈米範圍內的圓形形態。
  19. 一種藉由如申請專利範圍第1項所述之方法可獲得之氟摻雜檸檬酸鹽塗覆的非晶形磷酸鈣奈米粒子團聚物，其中該乾燥步驟5)為噴霧乾燥步驟，該奈米粒子團聚物的特徵在於，以布厄特(BET)氣體吸附法測量之表面積為3m2g-1到10m2g-1，並且利用掃描電子顯微術(SEM)測量具有直徑在2微米到25微米範圍內的圓形形態。
  20. 一種如申請專利範圍第16項所述之奈米粒子或者奈米粒子團聚物之用途，其係用於製造用於牙科應用的生物材料。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之用途，其中該生物材料係用作再礦化劑(remineralization agent)，或者用作牙本質減敏劑(dentin desensitizer)。
  22. 一種如申請專利範圍第17項所述之奈米粒子或者奈米粒子團聚物之用途，其係用於製造用於牙科應用的生物材料。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之用途，其中該生物材料係用作再礦化劑，或者用作牙本質減敏劑。
  24. 一種如申請專利範圍第18項所述之奈米粒子或者奈米粒子團聚物之用途，其係用於製造用於牙科應用的生物材料。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之用途，其中該生物材料係用作再礦化劑，或者用作牙本質減敏劑。
  26. 一種如申請專利範圍第19項所述之奈米粒子或者奈米粒子團聚物之用途，其係用於製造用於牙科應用的生物材料。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之用途，其中該生物材料係用作再礦化劑，或者用作牙本質減敏劑。
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