TWI781935B - 經取代之吲唑於治療及預防動物之疾病之用途 - Google Patents

Abstract

本申請案係關於經取代之吲唑在動物中用於治療及/或預防過敏及/或發炎性疾病的用途，特別是在動物中用於治療及/或預防異位性皮膚炎、跳蚤過敏性皮膚炎、發炎性腸病、骨關節炎和發炎症性疼痛、非傳染性復發性氣道疾病、昆蟲超敏性、氣喘、呼吸道疾病、乳腺炎及子宮內膜炎。

Description

經取代之吲唑於治療及預防動物之疾病之用途

本申請案係關於新穎經取代之吲唑在動物中用於治療及/或預防過敏及/或發炎性疾病的用途及其用於生產用於治療及/或預防動物過敏及/或發炎性疾病的藥物的用途，特別是異位性皮膚炎及/或跳蚤過敏性皮膚炎，特別是家畜，特別是狗。

本發明係關於抑制白細胞介素-1受體相關的激酶4(IRAK4)的通式(I)的新穎經取代之吲唑的用途。

人類IRAK4(白細胞介素-1受體相關的激酶4)在免疫系統的激活中扮演關鍵的角色。因此，這種激酶是發展抑制發炎物質的重要醫療標靶分子。IRAK4是由多種細胞表現，並介導TLR3以外的Toll樣受體(TLR)及包括IL-1R(受體)、IL-18R、IL-33R及IL-36R的白介素(IL)-1 β家族的受體之信號轉導(Janeway and Medzhitov,Annu.Rev.Immunol.,2002；Dinarello,Annu.Rev.Immunol.,2009；Flannery and Bowie,Biochemical Pharmacology,2010)。

不論是IRAK4剔除的小鼠或從缺乏IRAK4之病人的人類細胞都不會對TLRs(TLR3除外)及IL-1 β家族的刺激有反應(Suzuki,Suzuki,et al.,Nature,2002；Davidson,Currie,et al.,The Journal of Immunology,2006；Ku,von Bernuth,et al.,JEM,2007；Kim,Staschke,et al.,JEM,2007)。

TLR配體或IL-1 β家族的配體與相應受體的結合導致MyD88[骨髓分化初級應答基因(88)]募集及結合至受體。因此，MyD88與IRAK4相互作用，導致形成活性複合物，其與激酶IRAK1或IRAK2相互作用並活化(Kollewe, Mackensen,et al.,Journal of Biological Chemistry,2004；Precious et al.,J.Biol.Chem.,2009)。因此，NF(核因子)-κB信號通路及MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)信號通路被活化(Wang,Deng,et al.,Nature,2001)。NF-κ B信號通路及MAPK信號通路兩者的活化導致與不同免疫過程相關的過程。例如，各種發炎性信號分子及酶例如細胞因子、趨化因子及COX-2(環氧酶-2)的表現增加，並且增加與發炎相關的基因例如COX-2、IL-6(白介素-6)、IL-8之mRNA安定性(Holtmann,Enninga,et al.,Journal of Biological Chemistry,2001；Datta,Novotny,et al.,The Journal of Immunology,2004)。此外，這些過程可能與特定細胞類型的增殖及分化相關，例如單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、T細胞及B細胞(Wan,Chi,et al.,Nat Immunol,2006；McGettrick and J.O'Neill,British Journal of Haematology,2007)。

經由直接比較野生型(WT)小鼠與具有IRAK4(IRAK4KDKI)的激酶失活形式的遺傳修飾的動物，已經顯示IRAK4在多種發炎性疾病的病理學中的核心作用。IRAK4 KDKI動物在多發性硬化、動脈粥樣硬化、心肌梗塞及阿茲海默氏症的動物模式中具有改善的臨床表現(Rekhter,Staschke,et al.,Biochemical and Biophysical Research Communication,2008；Maekawa,Mizue,et al.,Circulation,2009；Staschke,Dong,et al.,The Journal of Immunology,2009；Kim,Febbraio,et al.,The Journal of Immunology,2011；Cameron,Tse,et al.,The Journal of Neuroscience,2012)。此外，發現在動物模式中去除IRAK4可以經由改進抗病毒反應同時減少全身性發炎而保護免於病毒誘發的心肌炎(Valaperti,Nishii,et al.,Circulation,2013)。還顯示IRAK4的表現與Vogt-Koyanagi-Harada徵候群的疾病活性相關(Sun,Yang,et al.,PLoS ONE,2014)。此外顯示IRAK4對於經由漿細胞樣樹突狀細胞的免疫複合物介導的IFN α(干擾素-α)生產有高度相關性，其係系統性紅斑狼瘡(SLE)發病機理的關鍵過程(Chiang et al.,The Journal of Immunology,2010)。此外，信號通路是與肥胖有關(Ahmad,R.,P.Shihab,et al.,Diabetology & Metabolic Syndrome,2015)。除了IRAK4在先天免疫中的重要作用，也顯示IRAK4影響適應性免疫成分的Th17 T細胞的分化。在沒有IRAK4激酶活性的情況下，與WT小鼠相比，產生較少IL-17產生的T細胞(Th17 T細胞)。抑制 IRAK4使得能夠預防及/或治療動脈粥樣硬化、第1型糖尿病、類風濕性關節炎、脊椎關節炎(尤其是銀屑病性脊柱關節炎及和貝克赫特病)、紅斑狼瘡、牛皮癬、白癲風、巨細胞性動脈炎、慢性發炎性腸病及病毒性疾病，例如HIV(人類免疫缺陷病毒)、肝炎病毒(Staschke,et al.,The Journal of Immunology,2009；Marquez,et al.,Ann Rheum Dis,2014；Zambrano-Zaragoza,et al.,International Journal of Inflammation,2014；Wang,et al.,Experimental and Therapeutic Medicine,2015；Ciccia,et al.,Rheumatology,2015)。

由於IRAK4在TLRs(TLR3除外)及IL-1受體家族中MyD88介導的信號級聯的核心作用，抑制IRAK4可用於預防及/或治療經由所述受體介導的病症。

現有技術揭示大量的IRAK4抑制劑(參見例如Annual Reports in Medicinal Chemistry(2014),49,117-133)。

US8293923及US20130274241揭示具有3-經取代的吲唑結構的IRAK4抑制劑。沒有描述2-經取代的吲唑。

WO2013106254及WO2011153588揭示2,3-經二取代的吲唑衍生物。

WO2007091107描述用於治療杜氏肌營養不良症的2-經取代的吲唑衍生物。所揭示的化合物不具有6-羥烷基取代。

WO2015091426描述吲唑，例如實例64，在2位置被甲醯胺側鏈取代。

WO2015104662揭示以下通式的2-經取代的吲唑：

其中R₂是烷基或環烷基。有明確描述2-經取代的吲唑在2位置具有甲基、2- 甲氧基乙基及環戊基(實例1、4及76)。實例117也描述在1位置具有羥乙基取代的吲唑衍生物。但是，沒有描述在1位置或2位置具有3-羥基-3-甲基丁基取代基的吲唑衍生物。

在2位置具有羥基取代的烷基的吲唑一般包括在通式中，但在WO2015104662中沒有明確揭示。

在2位置上具有烷基其中該烷基另外經甲基磺醯基取代的吲唑，不包括在WO2015104662中的通式及R₂取代基的定義中。

除了在吲唑的1及2位置的上述取代模式之外，WO2015104662描述在6位置具有取代的吲唑，其中R₁定義如下：烷基、氰基、-NR_aR_b或選自環烷基、芳基或雜環基的視情況經取代的基團，其中該取代基是獨立地為烷基、烷氧基、鹵素、羥基、羥基烷基、胺基、胺基烷基、硝基、氰基、鹵烷基、鹵烷氧基、-OCOCH₂-O-烷基、-OP(O)(O-烷基)CH₂-OP(O)(O-烷基)₂。對於其中R₁為烷基的吲唑化合物，有效申請日為2015年1月7日(WO2015104662的國際申請日)。印度申請案146/CHE/2014及3018/CHE/2014，其優先權要求不公開任何R₁為烷基的吲唑化合物。

因此，以下通式的吲唑化合物：

其中R₁是視情況經取代的烷基，是在2015年1月7日首次被陳述，因此在本申請案的優先權日之後。

在WO2015104662中描述在6位置的取代基實例對於R₁是環丙基、環己基、氰基、3-氟苯基及飽和的雜環取代基。在WO2015104662中沒有明確描述在6位置具有羥基取代的烷基的吲唑。

在本發明中使用的化合物也描述於2016年6月2日公佈的WO2016083433的共同未決專利申請案PCT/EP2015/077596中。

目前針對動物的過敏及/或發炎性疾病的治療方案，例如過敏性皮膚疾病，通常包括使用類固醇及環孢菌素-兩者都與副作用相關。最近，janus-激酶(JAK)抑制劑已經被核准用於犬異位性皮膚炎(CAD)，其對症地提供瘙癢的緩解，但是，給藥方案可能再次受到副作用的限制。使用疾病改善劑治療CAD並且沒有治療相關的副作用仍然是一尚未滿足的醫療需求。

本發明解決的問題是對於動物的發炎性及/或過敏性疾病提供更好的治療選擇。

本發明的IRAK4抑制劑特別適合用於治療及預防過度反應性免疫系統特徵的動物的發炎性疾病。在此應特別提及的是犬異位性皮膚炎、狗和貓中的跳蚤過敏性皮膚炎、狗和貓中的發炎性腸病、狗、貓、馬及牛中的骨關節炎及發炎性疼痛、馬非感染性復發性的氣道疾病(也稱為慢性阻塞性肺疾病、馬慢性肺氣腫)、馬昆蟲超敏反應(也稱為庫蚊叮癢綜合症、夏季濕疹)、貓氣喘、牛呼吸系統疾病、牛乳腺炎及子宮內膜炎以及豬呼吸道疾病。

例如，異位性皮膚炎是伴侶動物中的常見疾病，特別是貓和狗。

在一個具體的實例中，犬異位性皮膚炎(CAD)是狗常見的疾病之一。CAD可以早期影響患者，在整個生命週期中都會復發。在Lund等人1999年的研究中，在美國的52個私人執業中調查了31484隻狗，CAD的普及率為8.7%。CAD是犬瘙癢症中次於蚤過敏性皮膚炎(FAD)的第二大常見原因。

犬異位性皮膚炎可被定義為「具有與IgE相關的特徵性臨床特性的遺傳易感性發炎症及瘙癢性過敏性皮膚病，最常針對環境過敏原」(Halliwell,Veterinary Immunology and Immunopathology,2006)，如塵蟎及花粉，其為寵物難以避免，因為塵蟎幾乎無處不在且花粉會滲透到戶外空氣中。

犬異位性皮膚炎是一種複雜且多因素的疾病，涉及免疫失調、過敏性致敏、皮膚屏障缺陷、微生物定居及環境因素。

IgE不是所有情況下臨床症狀發展的先決條件，而稱為異位性皮膚炎的一單獨臨床實體被定義為「具有與犬異位性皮膚炎相似的臨床特徵的發炎性及瘙癢性皮膚病，其中對環境或其他過敏原的IgE反應無法記錄」(Nuttall et al.,Vet.Record,2013)。

犬異位性皮膚炎最常見的症狀包括瘙癢、過度搔癢、在地毯上摩擦、脫毛、具有惡臭的油膩或片狀皮膚、在爪子及腹部與腋窩等區域的過度咀嚼。隨著時間的推移，被劃傷的皮膚可能會發展出熱點-原始、發炎的區域-其可能被感染。

目前，治療異位性皮膚炎(AD)的急性發作應涉及尋找，且隨後消除耀斑的原因，用溫和的洗髮劑洗澡，並預控制瘙癢及皮膚病變，包括局部及/或口服糖皮質激素或奥拉替尼(oclacitinib)。對於慢性CAD，管理的第一步是識別及避免耀斑因素，並確保有足夠的皮膚與毛皮衛生及護理，這可能包括更頻繁的洗澡及可能增加必需的脂肪酸攝取量。目前在減少慢性瘙癢及皮膚病變中最有效的藥物是局部及口服糖皮質激素、口服環孢菌素、口服奥拉替尼，以及可用的注射重組干擾素。特定過敏原免疫治療及主動間歇性局部糖皮質激素應用是可能預防或延遲AD耀斑復發的唯一干預措施。(Olivry et al.,BMC Veterinary Research,2015)。

另一個具體實例，跳蚤過敏性皮膚炎(FAD)或跳蚤叮咬超敏反應是家犬最常見的皮膚病(Scott et al.,In：Muller and Kirk’s Small Animal Dermatology,2001)，其是由目前最盛行的跳蚤在狗及貓上造成：櫛頭蚤(Ctenocephalides felis)(Beresford-Jones,J Small Animal Practice,1981；Chesney,Veterinary Record,1995)。貓也會發展FAD，這是貓睫狀肌炎的主要原因之一。

FAD在夏季最盛行，儘管在溫暖的氣候中，全年都可能持續存在跳蚤感染。在北溫帶地區，寵物及其跳蚤與人類住宅的密切聯繫創造了一個允許全年問題的條件。極端溫度及低濕度傾向於抑制跳蚤發育。

當餵養時，跳蚤注射含有各種組織胺樣的化合物、酶、多肽及胺基酸的唾液，其種類繁多(40-60kD)並誘發I型、IV型及嗜鹼性粒細胞超敏反應。間歇性暴露於跳蚤咬傷的跳蚤幼犬立即(15分鐘)或延遲(24-48小時)產生反應或兩者，以及可檢測程度的循環性IgE和IgG抗蚤抗體。連續暴露於跳蚤叮咬的狗具有低程度的這些循環抗體，並且不會發展皮膚反應或稍後發展且至顯著降低的程度。這可能表明免疫耐受可能在持續暴露於蚤叮咬的狗中自然發展。雖然貓的FAD病理生理學知之甚少，但也可能存在類似的機制。

貓跳蚤(Ctencephalides felis)對動物及人造成嚴重的刺激，並且與跳蚤過敏性皮膚炎相關。典型的症狀是：瘙癢、皮膚及皮膚病變的發炎(紅斑、鱗屑、丘疹、結皮及苔癬樣變)。這些病變最常見於背部及尾巴底部。

隨著病情的進展，可能會有脫毛、斷髮、出汗或皮膚潰瘍、皮膚腫脹、 皮膚發紅及皮膚發炎。潰瘍可以很疼痛。在嚴重的情況下，皮膚變厚且變暗，主要是在狗的背部及尾巴底部的區域。由於嚴重的瘙癢，狗本身會造成自殘的傷害。

通常，跳蚤感染的預防及治療是治療方案的選擇。最普遍是使用的新菸鹼類，例如吡蟲啉(imidacloprid)、或γ-胺基丁酸(GABA)-門控的氯化物通道阻斷劑，例如氟蟲腈(fipronil)。在皮膚過敏性皮膚炎症狀不能解決的情況下，目前在CAD下提到的治療，是使用局部及口服糖皮質激素、口服環孢菌素、口服奥拉替尼。

本發明提供通式(I)化合物

其中：R¹ 是C₁-C₆-烷基，在此該C₁-C₆-烷基是未經取代或經相同或不同的鹵基、羥基、未經取代或經鹵基單或多取代的環烷基、或R⁶、R⁷SO₂、R⁷SO或R⁸O基單或多取代，或選自下列的基：

在此*表示該基團與該分子的其餘部分的鍵結位置；R²及R³總是有同樣的定義且都是氫或C₁-C₆-烷基；R⁴ 是鹵基、氰基、未經取代或經相同或不同的基單或多取代的C₁-C₆-烷基未經取代或經相同或不同的基單或多取代的C₃-C₆-環烷基，且該取代基是選自包括鹵基及羥基；R⁵ 是氫、鹵基或未經取代或單-或多-鹵基-取代的C₁-C₆-烷基； R⁶ 是含有4至6個環原子的未經取代或單-或二-甲基-取代的單環飽和雜環，其含有一個從O、S、SO及SO₂的雜原子或雜基；R⁷ 是C₁-C₆-烷基，在此該C₁-C₆-烷基是未經取代或經相同或不同的鹵基、羥基、或C₃-C₆-環烷基單或多取代，或R⁷是C₃-C₆-環烷基；R⁸ 是C₁-C₆-烷基，在此該C₁-C₆-烷基是未經取代或經相同或不同的鹵基單或多取代；及其非對掌異構體、對掌異構體、代謝物、鹽、溶劑合物或其鹽的溶劑合物，用於治療及/或預防動物中的過敏及/或發炎性疾病。

在下文所述的本發明合成中間體及實例的上述用途的情況下，任何化合物指定的相應鹼或酸的鹽形式，通常是經由各製備及/或純化方法所得到的未知精確化學計量組成的鹽。除非另有詳細說明，附加至名稱及結構式，例如「鹽酸鹽」、「三氟乙酸鹽」、「鈉鹽」或「x HCl」、「x CF₃COOH」、「x Na⁺」，在這種鹽的情況下，不應理解為化學計量學上的含義，而僅為其中存在成鹽組分之描述文字。

此相應地適用如果合成中間體或其實施例或其鹽是經由所述的製備及/或純化方法所獲得的具有未知化學計量組成(如果它們是定義的類型)的溶劑合物的形式，例如水合物。

本發明化合物是式(I)化合物及鹽、溶劑合物及其鹽的溶劑合物，式(I)及下述通式所包含的化合物及鹽、溶劑合物及其鹽的溶劑合物，以及式(I)所包含並在下文提到作為具體實施例的化合物及鹽、溶劑合物及其鹽的溶劑合物，如果該式(I)所包含並在下文提到作為具體實施例的化合物不已經是鹽、溶劑合物及其鹽的溶劑合物。

本發明上下文中優選的鹽是本發明化合物的生理上可接受的鹽。然而，本發明還包括其本身不適合於藥物應用但可用於例如本發明化合物的分離或純化的鹽。

本發明化合物的生理上可接受的鹽包括無機酸、羧酸及磺酸的酸加成鹽，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸、馬來酸及苯甲酸。

本發明化合物的生理學上可接受的鹽還包括傳統鹼的鹽，作為實例且優選的是鹼金屬鹽(例如鈉及鉀鹽)、鹼土金屬鹽(例如鈣及鎂鹽)及衍生自氨或具有1至16個碳原子的有機胺的銨鹽，作為實例且優選的是乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二異丙基胺、單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二環己基胺、二甲基胺基乙醇、普魯卡因、二芐基胺、N-甲基嗎福啉、精氨酸、賴氨酸、乙二胺及N-甲基六氫吡啶。

在本發明上下文中的溶劑合物是描述為本發明化合物經由與溶劑分子配位形成的固體或液體狀態的複合物的形式。水合物是溶劑合物的具體形式，其中是與水配位。

取決於其結構，本發明化合物可以以不同的立體異構形式存在，也就是以構型異構體的形式存在，或者如果合適時，存在構象異構體(對掌異構體及/或非對掌異構體，包括在阻轉異構體情況下者)。因此，本發明包括對掌異構體及非對掌異構體及其各混合物的用途。可以以已知的方式從這些對掌異構體及/或非對掌異構體的混合物中分離出立體異構性均勻的成分；層析法優選用於此目的，特別是在非對掌或對掌性相上的HPLC層析法。

如果本發明化合物可以以互變異構形式出現，則本發明包括使用全部的互變異構體形式。

本發明還包括本發明化合物所有合適的同位素變體的用途。本發明化合物的同位素變體在此是理解為化合物其中本發明化合物的至少一個原子被交換為具有相同原子數但具有與通常或主要出現在自然界中的原子質量不同的原子質量的另一個原子。

可以併入本發明化合物的同位素的實例是氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯，溴及碘，例如²H(氘)、³H(氚)、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³²P、³³P、³³S、³⁴S、³⁵S、³⁶S、¹⁸F、³⁶C、⁸²Br、¹²3I、¹²⁴I、¹²⁹I及¹³¹I。本發明化合物的特定同位素變體，特別是其中一種或多種放射性同位素的其他同位素變體，可以是有益的，例如用於檢查作用機理或活性成分在體內的分佈；由於比較容易製備及可檢測性，特別是用³H或¹⁴C同位素標記的化合物適用 於此目的。此外，由於化合物的代謝穩定性較高，例如體內半衰期延長或所需活性劑量的降低，同位素(例如氘)的摻入可導致特殊的治療益處；因此，本發明化合物的這些改性在某些情況下也構成本發明使用的優選實施方案。本化合物的同位素變體可以通過本領域技術人員已知的方法製備，例如經由下文進一步描述的方法及實例中描述的方法，經由使用相應試劑及/或起始化合物的相應同位素修飾。

本發明還提供本發明化合物的所有可能的結晶及多晶形式的用途，其中多晶型物可以存在為單個多晶型物或在所有濃度範圍的多個多晶型物的混合物。

本發明還包括本發明化合物的前藥的用途。在本文中術語「前藥」是指本身可具有生物活性或無活性但其在體內的停留期間可轉化(例如代謝或水解)至本發明化合物的化合物。

在本發明的上下文中，除非另有說明，取代基具有以下的含義：烷基在本發明的上下文中，表示具有特定數目的碳原子的直鏈或支鏈的烷基。實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、第三丁基、正戊基、1-乙基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-二甲基丙基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基及2-乙基丁基。優選是甲基、乙基、正丙基、正丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基及2,2-二甲基丙基。

環烷基在本發明的上下文中，是在各情形中具有特定數目的碳原子的單環飽和烷基。優選的實例包括環丙基、環丁基、環戊基及環己基。

烷氧基在本發明上下文中表示具有特定碳原子數的直鏈或支鏈的烷氧基。優選是1至6個碳原子。實例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、1-甲基丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第三丁氧基、正戊氧基、異戊氧基、1-乙基丙氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲基丁氧基及正己氧基。特別優選是具有1至4個碳原子的直鏈或支鏈的烷氧基。可以提及的優選實例是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基丙氧基、正丁氧基及異丁氧基。

鹵基在本發明的上下文中是氟、氯及溴。優選是氟。

羥基在本發明的上下文中是OH。

單環飽和雜環是具有4至6個環原子並含有從O、S、SO及SO₂的雜原子或雜基的單環飽和雜環。優選是具有O、SO及SO₂的雜原子或雜基的雜環。實例包括：氧雜環丁烷、四氫呋喃、四氫-2H-吡喃-4-基、1,1-二氧雜四氫-2H-噻喃-3-基、1,1-二氧雜四氫-2H-噻喃-2-基、1,1-二氧雜四氫-2H-噻喃-4-基、1,1-二氧雜四氫噻吩-3-基、1,1-二氧雜四氫噻吩-2-基、1,1-二氧雜硫雜環丁烷-2-基或1,1-二氧雜硫雜環丁烷-3-基。在此特別優選是氧雜環丁烷及四氫呋喃。非常特別優選是氧雜環丁烷-3-基。

在鍵上的符號*表示分子中的鍵結位置。

當本發明化合物中的基團被取代時，基團可以是經單取代或多取代，除非另有說明。在本發明的上下文中，出現多於一次的所有基團彼此是獨立地定義。優選是經由一個、兩個或三個相同或不同的取代基取代。

R¹的優選具體實施例是被1、2或3個氟原子取代的C₂-C₆-烷基。特別優選是2,2,2-三氟乙基、3,3,3-三氟丙基及4,4,4-三氟丁基。非常特別優選是4,4,4-三氟丁基。

R¹的另一優選具體實施例是被一個或兩個羥基或一個C₁-C₃-烷氧基或三氟取代的C₁-C₃-烷氧基取代的C₂-C₆-烷基。特別優選是被羥基或C₁-C₃-烷氧基或三氟甲氧基或2,2,2-三氟乙氧基取代的C₂-C₅-烷基。非常特別優選是3-羥基-3-甲基丁基、3-甲氧基丙基、3-羥基丙基、3-三氟甲氧基丙基、2-甲氧基乙基或2-羥基乙基。尤其優選是3-羥基-3-甲基丁基。

R¹進一步優選是經C₁-C₆-烷基-SO₂取代的C₂-C₆-烷基。經甲基-SO₂取代之C₂-C₄-烷基特佳。R¹尤其優選是2-(甲基磺醯基)乙基或3-(甲基磺醯基)丙基。從後一組中，2-(甲基磺醯基)乙基是特別優選。

另外優選地，R¹是被氧雜環丁烷基、四氫呋喃基、四氫-2H-吡喃-4-基、1,1-二氧雜四氫-2H-噻喃-3-基、1,1-二氧雜四氫-2H-噻喃-2-基、1,1-二氧雜四氫-2H-噻喃-4-基、1,1-二氧雜四氫噻吩-3-基、1,1-二氧雜四氫噻吩-2-基、1,1-二氧雜硫雜環丁烷-2-基或1,1-二氧雜硫雜環丁烷-3-基取代之C₁-C₃-烷基。特別優選是經氧雜環丁烷取代的C₁-C₃-烷基。R¹尤其優選是氧雜環丁烷-3-基甲基。

對於總是具有相同定義的R²及R³，優選是氫或甲基。特別優選是甲基。

在R⁴的情況下，優選是未經取代或單或多鹵基取代的C₁-C₃-烷基或經一個羥基取代的C₁-C₃-烷基或經一個羥基及三個氟原子取代的C₁-C₃-烷基。

對於R⁴，特別優選是以下基團：甲基、乙基、三氟-C₁-C₃-烷基、二氟-C₁-C₃-烷基、羥基甲基、1-羥基乙基、2-羥基丙-2-基及2,2,2-三氟-1-羥基乙基。對於R⁴，特別優選是甲基、三氟甲基及二氟甲基。特別優選是三氟甲基。

R⁵的一個優選具體實施例是氫、氟、氯或C₁-C₃-烷基。R⁵更優選是氫、氟或甲基。R⁵最優選是氫或氟。

還特別優選的化合物是其中R⁴是甲基或三氟甲基且R⁵是氟。非常特別優選的化合物是其中R⁴是甲基且R⁵是氟，其中R⁵是在R⁴的相鄰位置。

對於R⁶，優選的具體實施例包括氧雜環丁烷基、四氫呋喃基、四氫-2H-吡喃-4-基、1,1-二氧雜四氫-2H-噻喃-3-基、1,1-二氧雜四氫-2H-噻喃-2-基、1-二氧雜四氫-2H-噻喃-4-基、1,1-二氧雜四氫噻吩-3-基、1,1-二氧雜四氫噻吩-2-基、1,1-二氧雜硫雜環丁烷-2-基或1,1-二氧雜硫雜環丁烷-3-基。特別優選是氧雜環丁烷基。非常特別優選是氧雜環丁烷-3-基。

R7是專屬連接至官能團-SO₂-及-SO-，也就是R7-取代的-SO₂-或SO-基團。在這方面，R⁷優選是C₁-C₄-烷基，其中C₁-C₄-烷基是未經取代或經羥基或環丙基單取代或經3個氟原子取代。另外優選的R⁷是環丙基。特別優選的R⁷是甲基、乙基或羥基乙基。非常特別優選的R⁷是甲基。

這意味著，在C₁-C₆-烷基是經R⁷SO₂-或R⁷SO-取代的情形下，在R¹的上下文中，優選是經C₁-C₆-烷基-SO₂或C₁-C₆-烷基-SO取代的C₁-C₆-烷基。對於R¹，特別優選是甲基磺醯基乙基及甲基磺醯基丙基。非常特別優選是甲基磺醯基乙基。

對於R⁸，優選是未經取代的C₁-C₄-烷基或三氟取代的C₁-C₄-烷基。特別優選是甲基、乙基、三氟甲基或2,2,2-三氟乙基。非常特別優選是甲基、三氟甲基或2,2,2-三氟乙基。

如前所述，細胞內酶白細胞介素-1受體相關的激酶4(IRAK4)在與發炎性過程有關的經由細胞因子及TLR配體活化的受體的信號通路扮演整合的角色。除發炎外，IRAK4也參與過敏過程的信號傳導。這種過敏過程在過敏性皮膚病如異位性皮膚炎的發病機理中扮演重要的角色。

例如，IL-33最近加入IL-1族的細胞因子，其也包括IL-18及IL-1，結合並激活IL-33受體(IL-33R)，然後與MyD88、IRAK4及TRF6結合(Schmitz et al,Immunity,2005)。RAK4是該信號通路的重要組成成份。IL-33R在T輔助細胞2型(Th2)細胞、肥大細胞及嗜酸性粒細胞上強烈表現。IL-33激活這些細胞並促進Th2免疫反應(Schmitz et al,Immunity,2005)。這些細胞類型各自參與異位性皮膚炎的發病機制。血清中IL-33量與男性異位性皮膚炎的嚴重程度相關，並隨著使用局部類固醇及鈣調神經磷酸酶抑制劑治療而降低(Tamagawa-Mineoka et al,J American Academy Dermatology,2014)。在急性犬異位性皮膚炎模式中，已經顯示IL-33基因在皮膚病變中顯著調升(Schamber et al.,G3(Bethesda),2014；Olivry et al,Journal of Investigative Dermatology,2016)。

此外，細胞因子IL-1家族的第二個成員，IL-18涉及異位性皮膚炎。血清中的IL-18量隨著兒童異位性皮膚炎的嚴重程度而增加(Sohn et al,Allergy and Asthma Proceedings,2004)。在急性犬異位性皮膚炎模式中，IL-18基因在皮膚病變中顯著調升(Schamber et al.,G3(Bethesda),2014；Olivry et al,Journal of Investigative Dermatology,2016)。此外，在小鼠中的異位性皮膚炎樣發炎及瘙癢是由IL-18的過量釋放所引起，並且經由IL-1加速(Konishi et al,Proceedings of the National Academy of Sciences,2002)。IRAK4再次被證明是IL-18信號級聯的重要組成成份(Suzuki et al,J Immunology,2003)。類似地，IRAK4對IL-1及TLR配體的信號傳導非常重要(Suzuki et al,Nature,2002)。已知TLR激動劑誘導瘙癢(Liu et al,Neuroscience bulletin,2012)，其為異位性皮膚炎的重要症狀，且抗IL-1療法是用於標籤外治療異位性皮膚炎。此外，IRAK4中的多態性是與過敏性疾病例如氣喘及慢性鼻竇炎的總IgE升高相關(Tewfik et al,Allergy,2009)。IgE水平在異位性皮膚炎中也升高。

因此，由於IRAK4是由許多細胞因子激活的信號通路的關鍵部分，TLR配體及IRAK4具有與增加的IgE水平相關的多形性，IRAK4的抑制是治 療過敏性皮膚疾病的重要治療策略，例如異位性皮膚炎。此外，在陪侶動物(特別是狗及貓)中，異位性皮膚炎及跳蚤過敏性皮膚炎是適當的適應症，因為這兩種疾病都包括涉及IgE抗體、Th2細胞、肥大細胞及嗜酸性粒細胞的I型超敏反應。此外，FAD可以包括IV型超敏反應，其中涉及IL-1及IL-18。

本發明化合物作為IRAK4激酶的抑制劑，且因此在治療及/或預防動物的過敏及/或發炎性疾病方面具有不可預見的有用藥理活性範圍。

優選的式(I)化合物是其中R¹ 是C₁-C₆-烷基，在此該C₁-C₆-烷基是未經取代或經相同或不同的氟、羥基、或R⁶、R⁷SO₂、R⁷SO或R⁸O基單或多取代；R²及R³ 總是有同樣的定義且都是氫或C₁-C₃-烷基；R⁴ 是鹵基、氰基或C₁-C₃-烷基，在此該C₁-C₃-烷基是未經取代或經相同或不同的鹵基或羥基單或多取代；R⁵ 是氫，氟，氯或C₁-C₃-烷基；R⁶ 是氧雜環丁烷基或四氫呋喃基；R⁷ 是C₁-C₄-烷基，在此該C₁-C₄-烷基是未經取代或經羥基或環丙基單取代或經三個氟原子取代；R⁸ 是未經取代的C₁-C₄-烷基或三氟取代的C₁-C₄-烷基；及其非對掌異構體、對掌異構體、代謝物、鹽、溶劑合物或其鹽的溶劑合物，用於治療及/或預防動物中的過敏及/或發炎性疾病。

另外優選的式(I)化合物是其中R¹ 是C₂-C₆-烷基，在此C₂-C₆-烷基是未經取代，或C₂-C₆-烷基是單-、二-或三-氟取代，或C₂-C₆-烷基是經羥基、R⁶、R⁷SO₂或R⁸O基單取代，或其中R¹是氧雜環丁烷基取代的C₁-C₃-烷基；R²及R³ 總是有同樣的定義且都是氫或甲基；R⁴ 是未經取代或單-或多-鹵基-取代的C₁-C₃-烷基或經一個羥基取代的C₁-C₃-烷基或經一個羥基及三個氟原子取代的C₁-C₃-烷基；R⁵ 是氫、氟或C₁-C₃-烷基；R⁷ 是C₁-C₃-烷基；R⁸ 是C₁-C₄-烷基，在此該C₁-C₄-烷基是未經取代或單-、二-或三-氟取代；及其非對掌異構體、對掌異構體、代謝物、鹽、溶劑合物或其鹽的溶劑合物，用於治療及/或預防動物中的過敏及/或發炎性疾病。

特別優選的通式(I)化合物是其中R¹ 是經羥基或C₁-C₃-烷氧基或三氟甲氧基或2,2,2-三氟乙氧基或三氟甲基取代之C₂-C₅-烷基，或是甲基-SO₂-取代之C₂-C₄-烷基，或是氧雜環丁烷-3-基-取代之C₁-C₂-烷基；R²及R³ 總是有同樣的定義且都是氫或甲基；R⁴ 是甲基、乙基、三氟-C₁-C₃-烷基、二氟-C₁-C₃-烷基、羥基甲基、1-羥基乙基、2-羥基丙-2-基及2,2,2-三氟-1-羥基乙基，且R⁵ 是氫、氟或甲基；及其非對掌異構體、對掌異構體、代謝物、鹽、溶劑合物或其鹽的溶劑合物，用於治療及/或預防動物中的過敏及/或發炎性疾病。

非常特別優選的化合物是其中R¹ 是4,4,4-三氟丁基、3-羥基-3-甲基丁基、3-羥基丁基、3-甲氧基丙基、3-羥基丙基、3-羥基-2-甲基丙基、3-羥基-2,2-二甲基丙基、3-三氟甲氧基丙基、2-甲氧基乙基、2-羥基乙基、2-(甲基磺醯基)乙基或3-(甲基磺醯基)丙基；R²及R³ 都是甲基或氫，且R⁴ 是二氟甲基、三氟甲基或甲基，且R⁵ 是氫或氟；及其非對掌異構體、對掌異構體、代謝物、鹽、溶劑合物或其鹽的溶劑合物，用於治療及/或預防動物中的過敏及/或發炎性疾病。

也是非常特別優選的化合物是其中R¹ 是3-羥基-3-甲基丁基、3-羥基丁基、3-羥基-2-甲基丙基、3-羥基-2,2-二甲基丙基、3-(甲基磺醯基)丙基或2-(甲基磺醯基)乙基；R²及R³都是甲基；R⁴ 是二氟甲基或三氟甲基；且R⁵ 是氫；及其非對掌異構體、對掌異構體、代謝物、鹽、溶劑合物或其鹽的溶劑合物，用於治療及/或預防動物中的過敏及/或發炎性疾病。

其他也特別優選的化合物是其中R¹ 是3-羥基-3-甲基丁基、3-羥基丁基、3-羥基-2-甲基丙基、3-羥基-2,2-二甲基丙基、3-(甲基磺醯基)丙基或2-(甲基磺醯基)乙基；R²及R³都是甲基；R⁴ 是甲基；且R⁵ 是氟，在此R⁵是在R⁴的相鄰位置；及其非對掌異構體、對掌異構體、代謝物、鹽、溶劑合物或其鹽的溶劑合物，用於治療及/或預防動物中的過敏及/或發炎性疾病。

本發明特別提供下列化合物：

1)N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(2-甲氧基乙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

2)N-[6-(羥基甲基)-2-(2-甲氧基乙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

3)N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(3-甲氧基丙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

4)N-[6-(羥基甲基)-2-(3-甲氧基丙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

5)N-[2-(2-羥基乙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

6)N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(3-羥基丙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

7)N-[2-(2-羥基乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

8)N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(氧雜環丁烷-3-基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

9)N-[6-(羥基甲基)-2-(氧雜環丁烷-3-基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

10)N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[3-(甲基磺醯基)丙基]-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

11)N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

12)N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[2-(甲基磺醯基)乙基]-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

13)6-(二氟甲基)-N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺

14)6-(二氟甲基)-N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[2-(甲基磺醯基)乙基]-2H-吲唑-5-基}吡啶-2-甲醯胺

15)6-(二氟甲基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(3-羥基丙基)-2H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺

16)N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(4,4,4-三氟丁基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

17)N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[3-(三氟甲氧基)丙基]-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

18)N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[3-(2,2,2-三氟乙氧基)丙基]-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

19)5-氟-N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-甲基吡啶-2-甲醯胺

20)N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-甲基吡啶 -2-甲醯胺

21)6-(2-羥基丙-2-基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(4,4,4-三氟丁基)-2H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺

22)N-{2-[2-(1-羥基環丙基)乙基]-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺，用於治療及/或預防動物中的過敏及/或發炎性疾病。

本發明還提供通式(III)化合物

其中R¹ 是4,4,4-三氟丁基、3-羥基-3-甲基丁基、3-甲氧基丙基、3-羥基丙基、3-羥基丁基、3-羥基-2-甲基丙基、3-羥基-2,2-二甲基丙基、3-三氟甲氧基丙基、2-甲氧基乙基、2-羥基乙基，2-(甲基磺醯基)乙基、3-(甲基磺醯基)丙基或2-(1-羥基環丙基)乙基；R⁴ 是二氟甲基、三氟甲基或甲基；且R⁵ 是氫或氟；及其非對掌異構體、對掌異構體、代謝物、鹽、溶劑合物或其鹽的溶劑合物，用於治療及/或預防動物中的過敏及/或發炎性疾病。

優選尤其是下列通式(III)化合物：5-{[(5-氟-6-甲基吡啶-2-基)羰基]胺基}-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯，及2-(3-羥基-3-甲基丁基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯，用於治療及/或預防動物中的過敏及/或發炎性疾病。

通式(III)化合物適於製備一部分的通式(I)化合物。

此外，通式(III)化合物是白細胞介素-1受體相關激酶-4(IRAK4)的抑制劑。

通式(III)化合物可以從通式(II)化合物製備，

其中R¹ 是4,4,4-三氟丁基、3-羥基-3-甲基丁基、3-甲氧基丙基、3-羥基丙基、3-羥基-2-甲基丙基、3-羥基-2,2-二甲基丙基、3-三氟甲氧基丙基、2-甲氧基乙基、2-羥基乙基、2-(甲基磺醯基)乙基、3-(甲基磺醯基)丙基或2-(1-羥基環丙基)乙基；R⁴ 是二氟甲基、三氟甲基或甲基；且R⁵ 是氫或氟；經由(II)與適當經取代之烷基鹵化物或4-甲基苯磺酸烷酯在碳酸鉀存在下反應。

此外，通式(I)化合物可以從式(III)化合物製備，

其中R¹ 是4,4,4-三氟丁基、3-羥基-3-甲基丁基、3-羥基丁基、3-甲氧基丙基、3-羥基丙基、3-羥基-2-甲基丙基、3-羥基-2,2-二甲基丙基、3-三氟甲氧基丙基、2-甲氧基乙基、2-羥基乙基、3-(甲基磺醯基)丙基2-(1-羥基環丙基)乙基；R²及R³ 是甲基；R⁴ 是二氟甲基、三氟甲基或甲基；且R⁵ 是氫或氟；經由與甲基溴化鎂的格任亞(Grignard)反應。

本發明化合物作為IRAK4激酶的抑制劑且具有不可預見的有利藥理活性範圍。

進一步優選是式(I)化合物或上述特別提及的化合物，用於治療及/或預防家養動物中的過敏及/或發炎性疾病，特別是貓和狗，且更特別是在狗。

在這種情況下，「家養動物」一詞包括例如哺乳動物如倉鼠、豚鼠、大鼠、小鼠、花栗鼠、雪貂或特別是狗、貓；籠鳥；爬蟲動物；兩棲動物或水族魚。

進一步優選是式(I)化合物或上述特別提及的化合物用於在家養動物中治療及/或預防過敏性皮膚炎，特別是狗和貓的過敏性皮膚炎，且更特別是狗的過敏性皮膚炎。進一步優選是式(I)化合物或上述特別提及的化合物，用於治療及/或預防農場動物的過敏性及/或發炎性疾病，特別是綿羊、山羊、馬、牛及豬，且更特別是牛及豬。

在這種情況下，「農場動物」一詞包括例如哺乳動物，例如馬、羊、山羊、水牛、馴鹿、黇鹿，或特別是牛或豬。

進一步優選是式(I)化合物或上述特別提及的化合物，在用於治療及/或預防動物中的異位性皮膚炎、跳蚤過敏性皮膚炎，發炎性腸病、骨關節炎及發炎性疼痛、非感染性復發性氣道疾病、昆蟲超敏反應、氣喘、呼吸系統疾病、乳腺炎及子宮內膜炎的方法中使用，特別是異位性皮膚炎及跳蚤過敏性皮膚炎。

特別優選是式(I)化合物或上述特別提及的化合物，在用於治療及/或預防狗的異位性皮膚炎、狗或貓的過敏性皮膚炎、狗或貓的發炎性腸病、狗、貓、馬或牛的骨關節炎及發炎性疼痛、馬的非感染性復發性氣道疾病、馬的昆蟲超敏反應、貓的氣喘、牛的呼吸道疾病、牛的乳腺炎、牛的子宮內膜炎、及豬的呼吸道疾病的方法中使用。

非常特別優選是式(I)化合物或上述特別提及的化合物，在用於治療及/或預防狗的異位性皮膚炎及狗或貓的跳蚤過敏性皮膚炎更特別是狗的方法使用。

還非常特別優選是式(I)化合物或上述特別提及的化合物，在用於治療及/或預防牛的骨關節炎及發炎性疼痛、牛的呼吸道疾病、牛的乳腺炎、牛的子宮內膜炎、及豬的呼吸道疾病的方法中使用。

關於式(III)化合物，進一步優選是用於治療及/或預防家養動物的過敏性及/或發炎性疾病，特別是在貓及狗，且更特別是在狗。

式(III)化合物進一步優選是用於治療及/或預防家養動物的過敏性皮膚炎，特別是狗和貓的過敏性皮膚炎，且更特別是狗的過敏性皮膚炎。

式(III)化合物還優選是用於治療及/或預防農場動物的過敏性及/或發炎性疾病，特別是在綿羊、山羊、馬、牛及豬，且更特別是在牛及豬。

式(III)化合物進一步優選是在用於治療及/或預防動物中的異位性皮膚炎、跳蚤過敏性皮膚炎、發炎性腸病、骨關節炎及發炎性疼痛、非感染性復發性氣道疾病、昆蟲超敏反應、氣喘、呼吸系統疾病、乳腺炎及子宮內膜炎的方法中使用，特別是異位性皮膚炎及跳蚤過敏性皮膚炎。

特別優選是式(III)化合物在用於治療及/或預防狗的異位性皮膚炎、狗或貓的過敏性皮膚炎、狗或貓的發炎性腸病、狗、貓、馬或牛的骨關節炎及發炎性疼痛、馬的非感染性復發性氣道疾病、馬的昆蟲超敏反應、貓的氣喘、牛的呼吸道疾病、牛的乳腺炎、牛的子宮內膜炎、及豬的呼吸道疾病的方法中使用。

非常特別優選是式(III)化合物在用於治療及/或預防狗的異位性皮膚炎及狗或貓的跳蚤過敏性皮膚炎更特別是狗的方法使用。

還非常特別優選是式(III)化合物在用於治療及/或預防牛的骨關節炎及發炎性疼痛、牛的呼吸道疾病、牛的乳腺炎、牛的子宮內膜炎、及豬的呼吸道疾病的方法中使用。

舉例來說，化合物實例11、12、13、19(如下所示)在下文詳述的體外IRAK4 TR-FRET測定中已經評估使用重組的犬IRAK4酶。已經計算出各化合物用於抑制犬IRAK4的IC 50值。已經鑑定實例化合物(11、12、13、19)可用於治療動物中的異位性皮膚炎及跳蚤過敏性皮膚炎，特別是狗和貓。實例化合物11、12、13、19各是犬IRAK4的強力抑制劑，IC₅₀值分別為1.7、9.2、2.2、7.6毫微莫耳濃度。這些化合物實例的各IC₅₀值也類似於計算用於抑制人類IRAK4的IC₅₀值。

作為另一個實例，也在體外測定中評估實施例化合物12，以建立化合物對經由犬末梢血液單核細胞(PBMC)在脂多醣(LPS)誘導的細胞因子製造的作用。實例化合物12在濃度相關的方式抑制由LPS誘導的犬PBMCs的促發炎細胞因子腫瘤壞死因子α(TNF α)的產生。PBMCs包括細胞類型如樹突狀細胞、T及B淋巴細胞、以及單核細胞，其各自與異位性皮膚炎相關，且TNF α在異位性皮膚炎患者中升高(Sumimoto et al,Archives of Disease in Childhood,1992)。此實例也由圖7說明。

因此，本發明化合物顯示經由犬PBMCs抑制重組犬IRAK4酶及細胞因子產生，表明這種化合物實例在犬異位性皮膚炎及跳蚤過敏性皮膚炎中的潛在治療益處。

此外，在另一個研究中，還評估化合物12的體內實驗，以建立化合物在房屋塵蟎(House Dust Mite)模式中治療與犬過敏性皮膚炎相關的臨床症狀的作用，特別是犬異位性皮膚炎(CAD)。實例化合物12顯著降低CAD的臨床症狀，如皮膚水腫及紅斑。此實例也由圖11及12說明。

因此，本發明化合物顯示減少犬過敏性皮膚炎的特徵性臨床症狀，因此證明此化合物實例在犬過敏性皮膚炎中的治療益處，特別是在異位性皮膚炎(CAD)。此外，在犬跳蚤過敏性皮膚炎(FAD)的體內模式中評估實例化合物12，以建立化合物的抗瘙癢作用。用實例化合物12治療可實質上減少與過敏性疾病如跳蚤過敏性皮膚炎相關的瘙癢。此實例也由圖13說明。

因此，本發明化合物顯示可減少過敏性皮膚炎相關病理臨床症狀的皮膚發炎及瘙癢，因此證明此化合物實例在犬過敏性皮膚炎的治療益處，特別是在跳蚤過敏性皮膚炎(FAD)及犬異位性皮膚炎(CAD)。

在本文中，術語「犬過敏性皮膚炎」特別包括犬異位性皮膚炎(CAD)及跳蚤過敏性皮膚炎(FAD)。

作為另一個實例，也在活體外測定中評估化合物12，以建立化合物對 經由牛末梢血液單核細胞(PBMC)在脂多醣(LPS)誘導的細胞因子製造的影響。實例化合物12在濃度相關的方式抑制由LPS誘導的牛PBMCs的促發炎細胞因子腫瘤壞死因子α(TNF α)的產生。PBMCs包括細胞類型如樹突狀細胞、T及B淋巴細胞、以及單核細胞，其各都涉及具有過度促發炎免疫反應的發炎性及感染性疾病例如呼吸道疾病(Sterner-Kock,Haider,et al.,Tropical Animal Health and Production,2016)、腸道疾病(Pan,Rostagnio,et al.,Veterinary Immunology and Immunopathology,2015)及乳腺炎(Zheng,Xu,et al.,Free Radical Biology and Medicine,2016)其中TNF α在這些患者中升高。此實例也由圖8及9說明。

因此，本發明化合物證明經由牛PBMC抑制細胞因子的產生，表明此化合物實例在發炎及/或感染性疾病例如呼吸道疾病、腸道疾病及乳腺炎的潛在治療益處。

作為另一個實例，也在活體外測定法中評估化合物12，以建立化合物對豬末梢血液單核細胞(PBMC)在脂多醣(LPS)誘導的細胞因子產生的影響。實例化合物12抑制由LPS誘導的豬PBMCs的促發炎細胞因子腫瘤壞死因子α(TNF α)的產生。PBMCs包括細胞類型如樹突狀細胞、T及B淋巴細胞、以及單核細胞，其各都涉及具有過度促發炎免疫反應的發炎性及感染性疾病例如呼吸道疾病及腸道疾病其中TNF α在這些患者中升高。此實例也由圖10說明。

因此，本發明化合物證明豬PBMC抑制細胞因子的產生，表明此化合物實例在發炎及/或感染性疾病如呼吸道疾病及腸道疾病的潛在治療益處。

本發明化合物還提供預防及/或治療動物中的瘙癢及疼痛，特別是急性、慢性、發炎性及神經性疼痛。

此外，本發明化合物適用於治療及/或預防動物的疼痛病症，特別是急性、慢性、發炎性及神經性疼痛。這優選包括痛覺過敏、異常性疼痛、關節炎疼痛(例如骨關節炎、類風濕性關節炎及脊椎關節炎)、經前痛、子宮內膜異位症相關的疼痛、手術後疼痛、間質性膀胱炎疼痛、CRPS(複雜性局部疼痛徵候群)、三叉神經痛、前列腺炎疼痛、脊髓損傷引起的疼痛、發炎性疼痛、腰痛、癌症疼痛、化學療法相關的疼痛、HIV治療誘發的神經病 變、燒傷性疼痛及慢性疼痛。

本發明還提供使用有效量的至少一種所述化合物來治療及/或預防動物疾病的方法，特別是上述疾病。

優選是經由將有效量的至少一種上定義的式(I)化合物施用於有需要的動物來治療及/或預防動物的過敏及/或發炎性疾病的方法。

在本發明的上下文中，術語「治療(treatment)」或「治療(treating)」包括抑制、延遲、檢查、減輕、減弱、限制、減少、壓制、排斥或癒合疾病、病症、障礙、損傷或健康問題，或這些狀態及/或這些狀態的症狀的發展、過程或進展。術語「治療(therapy)」在這裡是理解為與術語「治療(treatment)」同義。

術語「預防(prevention)」、「預防(prophylaxis)」及「預防(preclusion)」在本發明的上下文中是同義地使用，並且是指避免或減少感染、經歷、受苦或患有疾病、病症、障礙、傷害或健康問題的風險，或這種狀態及/或這些狀態的症狀的發展或進展。

治療或預防疾病、病症、障礙、損傷或健康問題可能是部分或完全的。

本發明化合物可以單獨使用，或者如果需要時，可與其它活性成分組合使用。本發明進一步提供含有至少一種本發明化合物及一或多種其它活性成分的用於治療及/或預防動物過敏及/或發炎性疾病的藥物。適用於組合的活性成分的優選實例包括：一般可以提及的活性成分例如抗菌劑(例如青黴素(penicillins)、萬古黴素(vancomycin)、環丙沙星(ciprofloxacin))、抗病毒劑(例如阿昔洛韋(acyclovir)、奧司他韋(oseltamivir))及抗真菌劑(例如萘替芬(naftifin)、寧司泰定(nystatin)物質及γ球蛋白(gamma globulins)、免疫調節及免疫抑制的化合物例如環孢素(cyclosporine)、Methotrexat®、TNF拮抗劑(例如Humira®、依那西普(Etanercept)、英夫利昔單抗(Infliximab))、IL-1抑制劑(例如Anakinra,Canakinumab,Rilonacept),phosphodiesterase抑制劑(例如Apremilast),Jak/STAT抑制劑(例如捷抑炎(Tofacitinib)、巴瑞西尼(Baricitinib)、GLPG0634、艾炎寧(leflunomid)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、利妥昔單抗(rituximab)、貝利木單抗(belimumab)、他克莫司(tacrolimus)、雷 帕黴素(rapamycin)、黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)、干擾素(interferons)、皮質類固醇(corticosteroids)(例如強的松(prednisone)、培尼皮質醇(prednisolone)、甲基潑尼松龍(methyl prednisolone)、氫皮質酮(hydrocortisone)、貝他每松(betamethasone))、環磷醯胺(cyclophosphamide)、硫唑嘌呤(azathioprine)及撒樂(sulfasalazine)、乙醯胺酚(paracetamol)、非類固醇抗炎物質(NSAIDS)(阿司匹靈(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、依托度酸(etodolac)、塞來昔布(celecoxib)、秋水仙鹼(colchicines))。

除了上述之外，本發明的IRAK4抑制劑還可以與下列活性成分組合：用於治療肺部疾病的物質，例如β-2-擬交感神經劑(beta-2-sympathomimetics)(例如沙丁胺醇(salbutamol))、抗膽鹼能藥物(例如格隆銨(glycopyrronium))、甲基黃嘌呤(例如茶鹼(theophylline))、白細胞三烯受體拮抗劑(例如孟魯司特(montelukast))、PDE-4(磷酸二酯酶第4型)抑制劑(例如羅氟司特(roflumilast))、氨甲喋呤(methotrexate)、IgE抗體、硫唑嘌呤(azathioprine)及環磷醯胺(cyclophosphamide)、含皮質醇的製劑；用於治療骨關節炎的物質例如非類固醇抗炎物質(NSAIDs)。除了提到的兩種療法之外，用於B-細胞及T-細胞療法的氨甲喋呤(methotrexate)及生物製劑(例如利妥昔單抗(rituximab)、阿巴西普(abatacept))可提及用於類風濕病，例如類風濕性關節炎、脊柱關節炎及幼年特發性關節炎。神經營養物質例如乙醯膽鹼酯酶抑制劑(例如多奈哌齊(donepezil))、MAO(單胺基氧化酶)抑制劑(例如司來吉蘭(selegiline))、干擾素及抗驚厥藥(例如加巴噴丁(gabapentin))；用於治療心血管疾病的活性成分例如β受體阻滯劑(例如美托洛爾(metoprolol))、ACE抑制劑(例如貝那普利(benazepril))、血管緊張素受體阻斷劑(例如氯沙坦(losartan)、纈沙坦(valsartan))、利尿劑(例如氫氯噻嗪(hydrochlorothiazide))、鈣通道阻滯劑(例如硝苯地平(nifedipine))、他汀類藥物(例如辛伐他汀(simvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin))；抗糖尿病藥，例如二甲雙胍(metformin)、格列奈類(glinides)(例如那格列奈(nateglinide))、DPP-4(二肽基肽酶-4)抑制劑(例如利格列汀(linagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、西他列汀(sitagliptin)、維格列汀(vildagliptin))、SGLT2(鈉/葡萄糖轉運蛋白2)抑制 劑/格列淨(gliflozin)(例如達格列淨(dapagliflozin)、恩格列淨(empagliflozin))、腸降血糖素模擬物(激素葡萄糖依賴性促胰島素肽(GIP)及胰高血糖素樣肽1(GLP-1)類似物/激動劑)(例如艾塞那肽(exenatide)、利拉魯肽(liraglutide)、利西拉肽(lixisenatide))、α-葡糖苷酶抑制劑(例如阿卡波糖(acarbose)、米格列醇(miglitol)、伏格列波糖(voglibiose))及磺醯基脲類(例如格列本脲(glibenclamide)、甲苯磺丁脲(olbutamide))、胰島素敏化劑(例如吡格列酮(pioglitazone))及胰島素治療(例如NPH胰島素、賴脯胰島素(insulin lispro))活性成分例如美沙拉嗪(mesalazine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)或氨甲喋呤(methotrexate)、益生菌(probiotic bacteria)(Mutaflor,VSL#3®,Lactobacillus GG,Lactobacillus plantarum,L.acidophilus,L.casei,Bifidobacterium infantis 35624,Enterococcus fecium SF68,Bifidobacterium longum,Escherichia coli Nissle 1917)、抗生素，例如環丙沙星(ciprofloxacin)及甲硝唑(metronidazole)、用於治療慢性炎性腸病的抗腹瀉藥物例如洛哌丁胺(loperamide)、或瀉藥(比沙可啶(bisacodyl))。用於治療紅斑狼瘡的免疫抑制劑例如糖皮質激素及非類固醇抗發炎物質(NSAIDs)、可的松(cortisone)、氯喹(chloroquine)、環孢素(cyclosporine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、貝利木單抗(belimumab)、利妥昔單抗(rituximab)、環磷醯胺(cyclophosphamide)。用於皮膚病的Vitamin D3類似物例如卡泊三醇(calcipotriol)、他卡西醇(tacalcitol)或骨化三醇(calcitriol)、水楊酸、尿素、環孢素(cyclosporine)、氨甲喋呤(methotrexate)、依法利珠(efalizumab)。

還應提及的藥物是包含至少一種本發明化合物及用於本發明用途的一或多種其它活性成分，尤其是EP4抑制劑(前列腺素E2受體4抑製劑)、P2X3抑制劑(P2X嘌呤受體3)、PTGES抑制劑(前列腺素E合成酶抑制劑)或AKR1C3抑制劑(醛酮還原酶家族1成員C3抑制劑)用於治療及/或預防上述疾病。

本發明化合物可以全身及/或局部地作用。為此目的，其可以在適當的方式投藥，例如經由口服、腸胃外、肺、鼻、舌下、舌、口腔、直腸、皮膚、透皮或結膜途徑、經由穗或作為植入物或支架。

本發明化合物可以在適於這些給藥途徑的給藥形式施用。

用於口服給藥的合適給藥形式是根據現有技術製造且快速及/或以改良的方式釋放本發明化合物者，其含有結晶及/或無定形及/或溶解形式的本發明化合物，例如片劑(未包衣或包衣的片劑，例如具有控制本發明化合物釋放的耐胃酸或延遲溶解或不溶性包衣)、在口腔中快速崩解的片劑或薄膜/扁圓體、膜/凍乾劑、膠囊(例如硬或軟明膠膠囊)、糖衣片、咀嚼物(例如軟咀嚼物)、粒劑、丸劑、粉劑、乳劑、懸浮劑，氣溶膠或溶液。

腸胃外給藥可以在避免吸收步驟(例如經由靜脈內、動脈內、心內、脊柱內或腹膜內途徑)或包含吸收(例如經由肌肉內、皮下、皮內，經皮或腹膜內途徑)來完成。適用於腸胃外給藥的給藥形式包括以溶液、懸浮液、乳劑、凍乾劑或無菌粉末形式的注射及輸注製劑。

對於其他給藥途徑，合適的實例是可吸入的藥物形式(包括粉末吸入器，噴霧器)、滴鼻劑、溶液或噴霧劑、片劑、薄膜/扁囊劑或膠囊劑、栓劑、耳朵或眼睛製劑、陰道膠囊、水性懸浮液(洗劑、搖動混合物)、親脂性懸浮液、軟膏、霜劑、傾倒劑、透皮治療系統(例如貼劑)、牛奶劑、糊劑、泡沫劑、噴粉、植入物或支架。

優選是口服或腸胃外給藥，特別是口服給藥。

本發明化合物可以轉化成所述的給藥形式。這可以在本身已知的方式經由與惰性無毒的藥學上合適的賦形劑混合來實現。這些賦形劑包括載體(例如微晶纖維素、乳糖、甘露糖醇)、溶劑(例如液體聚乙二醇類)、乳化劑及分散劑或潤濕劑(例如十二烷基硫酸鈉、聚氧脫水山梨醇油酸酯)、粘合劑(例如聚乙烯吡咯酮)、合成及天然的聚合物(例如白蛋白)、穩定劑(例如抗氧化劑，例如抗壞血酸)、著色劑(例如無機顏料，例如氧化鐵)及調味劑及/或氣味校正劑。

本發明還提供藥物，其包含至少一種本發明化合物，通常與一或多種惰性無毒的藥學上合適的賦形劑一起在用於治療及/或預防動物中的過敏及/或發炎性疾病的方法中使用。

通常，在腸胃外給藥的情況下，有利的施用量是約0.001至1毫克/公斤，優選約0.01至0.5毫克/公斤體重以獲得有效的結果。在口服給藥的情 況下，劑量是約0.01至100毫克/公斤，優選約0.01至20毫克/公斤，最優選是0.1至10毫克/公斤體重。

在某些情況下，有必要偏離所述的量，特別是作為體重、給藥途徑、對活性成分的個體反應、製劑的性質及施用發生的時間或間隔的函數。

因此，在某些情況下，以小於上述最小量的方式管理可能是足夠的，而在其他情況下，必須超過上述的上限。在投藥更大量的情況下，可能會建議在一天中將其分成幾個單獨的劑量。

下面的實例說明本發明。本發明不受限於這些實例。

除非另有說明，以下試驗和實例中的百分比是重量百分比；組份是重量組份。液體/液體溶液的溶劑比率、稀釋比率及濃度數據都是以體積為基準。

化合物之製備

本發明化合物的製備是經由以下的合成圖示說明。

用於合成本發明化合物的原料是羧酸(中間體V3)，其可商購或可以經由文獻已知的途徑或類似於文獻已知的途徑製備(參見例如European Journal of Organic Chemistry 2003,8,1559-1568,Chemical and Pharmaceutical Bulletin,1990,38,9,2446-2458,Synthetic Communications 2012,42,658-666,Tetrahedron,2004,60,51,11869-11874)(參見例如合成圖示1)。部份羧酸V3可以經由水解從羧酸酯(中間體V2)進行製備(參見例如6-(羥基甲基)吡啶-2-羧酸乙酯與氫氧化鈉水溶液在甲醇中的反應，WO2004113281)，或-在第三丁酯的情況下-經由與酸反應，例如氫氯酸或三氟乙酸(參見例如，Dalton Transactions，2014,43,19,7176-7190)。羧酸V3也可以在其鹼金屬鹽的形式使用。中間體V2可以視情況地也可以從含有氯、溴或碘作為取代基X¹之中間體V1製備，經由在一氧化碳氣壓下，視情況地在升高的壓力下，在膦配體例如1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、鈀化合物例如乙酸鈀(II)及鹼例如三乙胺存在下，在溶劑例如二甲亞碸中加入乙醇或甲醇進行反應(製備方法參見例如WO2012112743,WO 2005082866,Chemical Communications(Cambridge,England),2003,15,1948-1949,WO200661715)。中間體V1可以商購或可以經由文獻已知的途徑製備。說 明性的製備方法詳見WO 2012061926,European Journal of Organic Chemistry,2002,2,327-330,Synthesis,2004,10,1619-1624,Journal of the American Chemical Society,2013,135,32,12122-12134,Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,2014,24,16,4039-4043,US2007185058,WO2009117421。

X¹ 是氯、溴或碘。R^d 是甲基、乙基、苄基或第三丁基。R⁴、R⁵ 各自如通式(I)所定義。

5-胺基-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體2)可以根據合成圖示2從1H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體0)得到，經由中間體1的硝基在碳上的鈀存在下用氫氣硝化及還原，類似於WO 2008/001883。對於從中間體2製備中間體3，可以使用文獻中已知的各種偶聯劑(Amino Acids,Peptides and Proteins in Organic Chemistry,Vol.3-Building Blocks,Catalysis and Coupling Chemistry,Andrew B.Hughes,Wiley,Chapter 12-Peptide-Coupling Reagents,407-442；Chem.Soc.Rev.,2009,38,606)。例如可以使用1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽結合1-羥基-1H-苯并三唑水合物(HOBt,WO2012107475；Bioorg.Med.Chem.Lett.,2008,18,2093)、(1H-苯并三唑-1-基氧基)(二甲基胺基)-N,N-二甲基甲脒四氟硼酸鹽(TBTU,CAS 125700-67-6)、(二甲基胺基)-N,N-二甲基(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)甲脒六氟磷酸鹽(HATU,CAS 148893-10-1)、丙烷膦酸酐(在乙酸乙酯或DMF中的溶液，CAS68957-94-8)或二-1H-咪唑-1-基甲酮(CDI)作為偶聯劑，在每種情況下在反應混合物中加入鹼例如三乙胺或N-乙基-N-異丙基丙-2-胺。優選是使用在THF中的TBTU及N-乙基-N-異丙基丙-2-胺。

取代基R⁴、R⁵各自如通式(I)所定義。

從中間體3開始，可以製備2-經取代之吲唑衍生物(中間體4)(參見合成圖示3)。對於此目的之有用的反應包括與視情況經取代之烷基氯化物、烷基溴化物、烷基碘化物或4-甲基苯磺酸烷酯的反應。使用的烷基鹵化物或4-甲基苯磺酸烷酯是可商購或可以類似於文獻中已知的途徑製備(對於製備4-甲基苯磺酸烷酯，一個實例是在三乙胺或吡啶存在下，合適的醇與4-甲基苯磺醯氯的反應；參見例如Bioorganic and Medicinal Chemistry,2006,14,12 4277-4294)。視情況地，在使用烷基氯或烷基溴的情況下，也可以加入鹼金屬碘化物例如碘化鉀或碘化鈉。使用的鹼可以是例如碳酸鉀、碳酸銫或氫化鈉。在反應性烷基鹵化物的情況下，在一些情況下也可以使用N-環己基-N-甲基環己胺。有用的溶劑包括例如1-甲基吡咯啶-2-酮、DMF、DMSO或THF。視情況地，所用的烷基鹵化物或4-甲基苯磺酸烷酯可以具有預先用保護基視情況地保護的官能基(也參見P.G.M.Wuts,T.W.Greene,Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis,Fourth Edition,ISBN：9780471697541)。例如，如果使用具有一個或多個羥基的烷基鹵化物或4-甲基苯磺酸烷酯，這些羥基可以視情況地經第三丁基(二甲基)矽烷基或本領域技術人員熟知的類似含矽保護基保護。或者，羥基也可以經四氫-2H-吡喃(THP)或乙醯基或苯甲醯基保護。然後可以在中間體4合成後或(I)合成後將所使用的保護基分離。例如，如果使用第三丁基(二甲基矽烷基)作為保護基，則可以使用四丁基氟化銨在溶劑如THF中分離。可以例如使用4-甲基 苯磺酸(視情況在單水合物形式)分離THP保護基。可以經由使用氫氧化鈉水溶液處理而分離乙醯基或苯甲醯基。

視情況地，所用的烷基鹵化物或4-甲基苯磺酸烷酯可以含有可經由本領域技術人員已知的氧化或還原反應轉化的官能團(參見例如Science of Synthesis,Georg Thieme Verlag)。如果例如官能基是硫化物基，則可以經由文獻中已知的方法將其氧化成亞碸或碸基。在亞碸基的情況下，同樣可以將其氧化成碸基。對於這些氧化步驟，可以使用例如3-氯過苯甲酸(CAS 937-14-4)(在這方面，另參見例如US201094000用於氧化2-(甲基硫烷基)乙基-1H-吡唑衍生物成為2-(甲基亞磺醯基)乙基-1H-吡唑衍生物及氧化其他2-(甲基硫烷基)乙基-1H-吡唑衍生物成為2-(甲基磺醯基)乙基-1H-吡唑衍生物)。如果使用的烷基鹵化物或甲苯磺酸鹽含有酮基，則可以經由本領域技術人員已知的還原方法將其還原為醇基(參見例如Chemische Berichte,1980,113,1907-1920用於硼氫化鈉)。這些氧化或還原步驟可以在中間體4合成後或本發明通式(I)化合物合成後進行。或者是，中間體4可以經由中間體3與視情況經取代的烷基醇之Mitsunobu反應製備(參見例如K.C.K.Swamy et.al.Chem.Rev.2009,109,2551-2651)。可以使用多種膦例如三苯基膦、三丁基膦或1,2-二苯基膦基乙烷結合二異丙基偶氮二羧酸酯(CAS 2446-83-5)或文獻中提及的其它二嗪衍生物(K.C.K.Swamy et.al.Chem.Rev.2009,109,2551-2651)。優選是使用三苯基膦及二異丙基偶氮二羧酸酯。如果烷基醇具有官能團，則可能-如在上述與烷基鹵化物反應的情況下-已知的保護基策略(另外的指針可見於.G.M.Wuts,T.W.Greene,Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis,Fourth Edition,ISBN：9780471697541)及-如上述與烷基鹵化物反應的情況-使用相應於中間體4合成後或本發明通式(I)化合物合成後進行的氧化或還原步驟。從中間體4開始，經由Grignard反應可獲得其中R²和R³定義為C₁-C₆-烷基(其中R²和R³具有相同定義)的通式(I)化合物(參見例如1H-吲唑-6-羧酸甲酯衍生物與甲基溴化鎂在EP 2489663中的反應)。對於Grignard反應，可以使用烷基鹵化鎂。特別優選是在THF或乙醚、或THF和乙醚的混合物中的甲基氯化鎂或甲基溴化鎂。或者是，從中間體4開始，經由與烷基鋰試劑的反應可以獲得本發 明的通式(I)化合物，其中R²和R³定義為C₁-C₆-烷基(其中R²和R³具有相同的定義)(例如參見WO2006116412，2-胺基-4-氯-1-甲基-1H-苯並咪唑-7-羧酸甲酯衍生物與異丙基鋰或第三丁基鋰的反應)。從中間體4開始，經由在THF中的氫化鋰鋁、在THF中的硼氫化鋰或THF中的硼氫化鈉還原，視情況地加入甲醇或硼氫化鋰和硼氫化鈉的混合物，可以製備通式(I)的本發明化合物，其中R²和R³定義為H。

取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵各自如通式(I)所定義。

從中間體3開始，可以經由Grignard反應(參見例如合成圖示4)得到中間體5其中R²和R³定義為C₁-C₆-烷基(其中R²和R³具有相同定義)。為此目的，可以使用合適的烷基鹵化鎂，例如在THF或乙醚、或THF和乙醚的混合物中的甲基氯化鎂或甲基溴化鎂。

從中間體5開始，可以製備本發明化合物(I)的一部分(I-a)其中R²和R³定義為C₁-C₆-烷基(其中R²和R³具有相同定義)。為此目的，類似於合成圖示3(中間體3的製備)，有用的反應是中間體5與視情況經取代的烷基氯化物、烷基溴化物、烷基碘化物或4-甲基苯磺酸烷酯的反應。可以使用類似於合成圖示3中描述的保護基策略。

或者是，對於製備本發明化合物(I)的一部分(I-a)，其中R²和R³定義為C₁-C₆-烷基(其中R²和R³具有相同定義)，可以使用中間體5與視情況經取代的烷基醇之Mitsunobu反應(類似於合成圖示3)。

如果式(I-a)化合物中的R¹包括合適的官能基，則隨後可以類似於合成圖示3使用氧化或還原反應來製備其它本發明化合物。

取代基R¹、R⁴、R⁵各自如通式(I)所定義。R²及R³總是有同樣的定義且都是C₁-C₆-烷基。

從中間體1開始，可以在替代方式製備中間體4(參見合成圖示5)。首先，中間體1經由合成圖示3中的方法轉化為中間體6(從中間體3製備中間體4)。

然後可以經由硝基的還原將中間體6轉化成中間體7。例如，可以在氫氣壓下使用在碳上的鈀還原硝基(參見例如WO2013174744，用於將6-異丙氧基-5-硝基-1H-吲唑還原成6-異丙氧基-1H-吲唑-5-胺)或經由在水和乙醇中使用氯化鐵和氯化銨(參見例如Journal of the Chemical Society,1955,2412-2419)或使用氯化錫(II)(CAS 7772-99-8)。優選是在水和乙醇中使用鐵和氯化銨。中間體7的製備可以類似於合成圖示2(從中間體2製備中間體3)進行。

如合成圖示3所述，在合成圖示5的情況下，視情況地也可以使用保護基策略。視情況地，如合成圖示3所述，也可能從中間體6或中間體7開始，進行本領域技術人員已知的氧化或還原反應(參見例如Science of Synthesis,Georg Thieme Verlag)。

取代基R¹、R⁴、R⁵各自如通式(I)所定義。

圖1：實例化合物12抑制在人單核細胞產生的DCs中的IL-23。數據是以具有標準偏差的平均值顯示。

圖2：實例化合物12抑制在(A)咪喹莫特(R837)-或(B)CpG-A刺激的人漿細胞樣DCs中的INF-α。數據是以具有標準偏差的平均值顯示。

圖3：用實例化合物11處理LPS誘導的發炎導致分泌的TNF-α量減少。 數據是以具有標準偏差的平均值顯示。

圖4：用實例化合物11(左)及12(右)處理IL-1 β誘導的發炎導致分泌的TNF-α量的劑量依賴性降低。數據是以具有標準偏差的平均值顯示。

圖5：實例化合物11在類風濕性關節炎動物模式(佐劑誘導的大鼠模式)中的抗發炎作用。根據疾病活性評分，測量到顯著且劑量依賴性抑制風濕關節炎。數據對應於平均值+標準偏差。單因素ANOVA變異分析，隨後經由Dunnett氏檢驗與CFA對照組進行多重比較分析；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0,0001。

圖6：實例化合物12在類風濕性關節炎的動物模式(膠原抗體誘導的小鼠模式)中的抗發炎作用。根據疾病活性評分，測量到顯著且劑量依賴性抑制風濕關節炎。數據對應於平均值+標準偏差。經由單因素變異分析且隨後進行 多重比較分析(Dunnett氏檢驗)計算膠原抗體(AK)對照組及治療組之間的統計學意義(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001)。

圖7：實例化合物12抑制LPS誘導的經由犬PBMCs產生TNF α。數據是以具有標準偏差的平均值顯示。

圖8：實例化合物12劑量依賴性抑制1微克/毫升LPS誘導的經由牛PBMCs產生TNF α(動力學測量)。數據是以平均值及生物學三重複的標準偏差顯示，各重複測量。從此曲線測定的IC50值是120毫微莫耳濃度。

圖9：實例化合物12劑量依賴性抑制0.1微克/毫升LPS誘導的經由牛PBMCs產生TNF α(動力學測量)。數據是以平均值及生物學三重複的標準偏差顯示，各重複測量。從此曲線測定的IC50值是70.5毫微莫耳濃度。

圖10：10微莫耳濃度實例化合物12抑制0.1毫微克/毫升LPS誘導的經由豬PBMCs產生TNF α(動力學測量)。數據是以平均值及生物學三重複的標準偏差顯示，各重複測量。

圖11：用實例化合物12處理房屋塵蟎誘導的犬過敏性皮膚炎模式導致紅斑減輕(a)。數據是以具有標準偏差的平均值顯示。

圖12：用實例化合物12處理房屋塵蟎誘導的犬過敏性皮膚炎模式導致水腫減少(b)。數據是以具有標準偏差的平均值顯示。

圖13：實例化合物12在跳蚤過敏性皮膚炎動物模式中的抗瘙癢作用。數據是對應於平均值基線的百分比變化表示。

實例化合物之合成 縮寫及闡釋

術語氯化鈉溶液總是指飽和的氯化鈉水溶液。中間體及實例的化學命名是使用ACD/LABS(Batch Version 12.01.)軟體產生。

方法

在部份情況下，本發明化合物及其前體及/或其中間體是經由LC-MS分析。

方法A1：UPLC(MeCN-HCOOH)：

儀器：Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001；管柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7 50 x 2.1毫米；流洗液A：水+0.1體積%的甲酸(99%)，流洗液B：乙腈；梯度：0-1.6分鐘1-99% B，1.6-2.0分鐘99% B；流速0.8毫升/分鐘；溫度：60℃；注射：2微升；DAD掃描：210-400毫微米；MS ESI+,ESI-，掃描範圍160-1000m/z；ELSD。

方法A2：UPLC(MeCN-NH₃)：

儀器：Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001；管柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7 50 x 2.1毫米；流洗液A：水+0.2體積%的氨(32%)，流洗液B：乙腈；梯度：0-1.6分鐘1-99% B，1.6-2.0分鐘99% B；流速0.8毫升/分鐘；溫度：60℃；注射：2微升；DAD掃描：210-400毫微米；MS ESI+,ESI-，掃描範圍160-1000m/z；ELSD。

方法A3：(LC-MS)

儀器：Agilent 1290 Infinity LC；管柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7 50 x 2.1毫米；流洗液A：水+0.05體積%的甲酸，流洗液B：乙腈+0.05體積%的甲酸；梯度：0-1.7分鐘2-90% B，1.7-2.0分鐘90% B；流速1.2毫升/分鐘；溫度：60℃；注射：2微升；DAD掃描：190-390毫微米；MS：Agilent TOF 6230。

方法A4：(LC-MS)

儀器：Waters Acquity；管柱：Kinetex(Phenomenex),50 x 2毫米；流洗液A：水+0.05%體積的甲酸，流洗液B：乙腈+0.05體積%的甲酸；梯度：0-1.9分鐘1-99% B，1.9-2.1分鐘99% B；流速1.5毫升/分鐘；溫度：60℃；注射：0.5微升；DAD掃描：200-400nm。

在部份情況下，本發明化合物及其前體及/或中間體是經由以下說明的製備級HPLC純化：

方法P1：系統：Waters Autopurification系統：Pump 2545,Sample Manager 2767,CFO,DAD 2996,ELSD 2424,SQD；管柱：XBridge C18 5微米100 x 30毫米；流洗液A：水+0.1體積%的甲酸，流洗液B：乙腈；梯度：0-8分鐘10-100% B，8-10分鐘100% B；流速：50毫升/分鐘；溫度：室溫；溶液：最多250毫克/最多2.5毫升DMSO或DMF；注射：1 x 2.5毫升；偵測：DAD掃描範圍210-400毫微米；MS ESI+,ESI-，掃描範圍160-1000m/z。

方法P2：系統：Waters Autopurification系統：Pump 254,Sample Manager 2767,CFO,DAD 2996,ELSD 2424,SQD 3100；管柱：XBridge C18 5微米10 x 30毫米；流洗液A：水+0.2體積%的氨(32%)，流洗液B：甲醇；梯度：0-8分鐘30-70% B；流速：50毫升/分鐘；溫度：室溫；偵測：DAD掃描範圍210-400毫微米；MS ESI+,ESI-，掃描範圍160-1000m/z；ELSD。

方法P3：系統：Labomatic,pump：HD-5000，餾分收集器：LABOCOL Vario-4000，UV偵測器：Knauer UVD 2.1S；管柱：XBridge C18 5微米100x30毫米；流洗液A：水+0.2體積%的氨(25%)，流洗液B：乙腈；梯度：0-1分鐘15% B，1-6.3分鐘15-55% B，6.3-6.4分鐘55-100% B，6.4-7.4分鐘100% B；流速：60毫升/分鐘；溫度：室溫；溶液：最多250毫克/2毫升 DMSO；注射：2 x 2毫升；偵測：UV 218毫微米；軟體：SCPA PrepCon5。

方法P4：系統：Labomatic,pump：HD-5000，餾分收集器：LABOCOL Vario-4000，UV偵測器：Knauer UVD 2.1S；管柱：Chromatorex RP C18 10微米125 x 30毫米；流洗液A：水+0.1體積%的甲酸，流洗液B：乙腈；梯度：0-15分鐘65-100% B；流速：60毫升/分鐘；溫度：室溫；溶液：最多250毫克/2毫升DMSO；注射：2 x 2毫升；偵測：UV 254毫微米；軟體：SCPA PrepCon5。

方法P5：系統：Sepiatec：Prep SFC100，管柱：Chiralpak IA 5微米250x20毫米；流洗液A：二氧化碳，流洗液B：乙醇；梯度：等梯度20% B；流速：80毫升/分鐘；溫度：40℃；溶液：最多x.250毫克/2毫升DMSO；注射：5 x 0.4毫升；偵測：UV 254毫微米。

方法P6：系統：Agilent：Prep 1200,2 x prep pump,DLA,MWD,Gilson：Liquid Handler 215；管柱：Chiralcel OJ-H 5微米250 x 20毫米；流洗液A：己烷，流洗液B：乙醇；梯度：等梯度30% B；流速：25毫升/分鐘；溫度：25℃；溶液：187毫克/8毫升乙醇/甲醇；注射：8 x 1.0毫升；偵測：UV 280毫微米。

方法P7：系統：Labomatic,pump：HD-5000，餾分收集器：LABOCOL Vario-4000,UV偵測器：Knauer UVD 2.1S；管柱：XBridge C18 5微米100 x 30毫米；流洗液A：水+0.1體積%的甲酸，流洗液B：乙腈；梯度：0-3分鐘：65% B等梯度，3-13分鐘：65-100% B；流速：60毫升/分鐘；溫度：室溫；溶液：最多250毫克/2毫升DMSO；注射：2 x 2毫升；偵測：UV 254毫微米。

方法P8：系統：Agilent：Prep 1200,2 x prep pump,DLA,MWD,Gilson：Liquid Handler 215；管柱：Chiralpak IF 5微米250 x 20毫米；流洗液A：乙醇，流洗液B：甲醇；梯度：等梯度50% B；流速：25毫升/分鐘；溫度：25℃；溶液：600毫克/7毫升N,N-二甲基甲醯胺；注射：10 x 0.7毫升；偵測：UV 254毫微米。

在部份情況下，物質混合物是在矽膠上經由管柱層析法純化。

對於製備部份本發明化合物及其前體級/或中間體，是使用從Biotage 的Isolera^®裝置在矽膠上進行管柱層析純化(「快速層析法」)。這是使用從Biotage的筒完成，例如不同尺寸的"SNAP Cattridge,KP_SIL"筒及不同尺寸從Interchim的"Interchim Puriflash Silica HP 15UM flash column"筒。

起始材料 中間體V2-1 6-(2-羥基丙-2-基)吡啶-2-羧酸甲酯

將2.00克(9.26毫莫耳)的2-(6-溴吡啶-2-基)丙-2-醇(CAS 638218-78-7)溶於20毫升甲醇及20毫升DMSO中。隨後，加入250毫克1,3-二(二苯基膦基)丙烷、130毫克乙酸鈀(II)及3毫升三乙基胺。將反應混合物在室溫下用一氧化碳沖提三次，並在13巴一氧化碳氣壓下攪拌30分鐘。經由施加真空除去一氧化碳，並將混合物在14巴一氧化碳氣壓下在100℃下攪拌24小時。將高壓釜減壓，在反應混合物中加入水，將反應混合物用乙酸乙酯萃取三次，用飽和的碳酸氫鈉水溶液及氯化鈉溶液清洗，經由疏水性過濾器過濾並濃縮。得到1.60克粗產物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=0.76分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量195.00。

中間體V3-1 6-(2-羥基丙-2-基)吡啶-2-羧酸鉀

將1.60克中間體0-1的粗產物先添加至15毫升甲醇中，加入0.74克氫氧化鉀並將混合物在50℃下攪拌16.5小時。濃縮後，得到2.1克殘留物，其不經進一步純化而使用。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=0.47分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量181.00。

中間體1-1 5-硝基-1H-吲唑-6-羧酸甲酯

在配備CPG攪拌器、滴液漏斗及內部溫度計的三頸燒瓶中，將4.60克(26.1毫莫耳)的1H-吲唑-6-羧酸甲酯(CAS編號：170487-40-8)溶解在120毫升硫酸(96%)中並冷卻至-15℃。在15分鐘的時間內，將已經預先製備並冷卻的硝酸(10毫升96%硫酸在5毫升65%硝酸中)滴加到該溶液中。滴加結束後，將混合物再攪拌1小時(內部溫度是-13℃)。將反應混合物加入冰中，抽吸濾出沉澱物，用水清洗並在乾燥箱中在50℃下減壓乾燥。得到5.49克標題化合物。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=0.75分鐘。

MS(ESIpos)：m/z=222(M+H)⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=3.87(s,3 H),7.96(s,1 H),8.44(s,1 H),8.70(s,1 H),13.98(br.s.,1 H)。

中間體2-1 5-胺基-1H-吲唑-6-羧酸甲酯

將4.40克(19.8毫莫耳)的5-硝基-1H-咪唑-6-羧酸甲酯(中間體1-1)溶解在236毫升甲醇中，並用1.06克(0.99毫莫耳)在活性碳上的鈀在標準氫氣壓力下在25℃氫化3小時。將反應混合物經由矽藻土過濾，用甲醇清洗過濾液，濃縮過濾液。得到3.53克標題化合物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=3.85(s,3 H)6.01(s,2 H)6.98(s,1 H)7.79-7.91(m,1 H)7.99(s,1 H)12.84(br.s.,1 H)。

中間體3-1 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-羧酸甲酯e

將4.95克(25.9毫莫耳)的6-(三氟甲基)吡啶-2-羧酸先添加至45毫升 THF中。加入9.07克(28.2毫莫耳)的O-(苯並三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基四氟硼酸脲及4.92毫升(28.2毫莫耳)的N-乙基-N-異丙基丙-2-胺並將混合物在25℃下攪拌30分鐘。隨後，加入4.50克(23.5毫莫耳)的5-胺基-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體2-1)並將混合物在25℃下攪拌24小時。將反應混合物經由膜過濾器抽吸過濾，固體用THF和水清洗，並在乾燥箱中乾燥過夜。得到7.60克標題化合物。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=1.16分鐘

MS(ESIpos)：m/z=365(M+H)⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=3.97(s,3 H),8.13-8.27(m,2 H),8.30(s,1 H),8.33-8.45(m,1 H),8.45-8.51(m,1 H),9.15(s,1 H),12.57(s,1 H),13.44(s,1 H)。

中間體3-2 甲基5-({[6-(二氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-羧酸甲酯

將2.85克(23.5毫莫耳)的6-(二氟甲基)吡啶-2-羧酸先添加至30毫升THF中。加入6.05克(18.8毫莫耳)的O-(苯並三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基四氟硼酸脲及3.3毫升N-乙基-N-異丙基丙-2-胺並將混合物在室溫下攪拌10分鐘。隨後，加入3.00克(15.7毫莫耳)的5-胺基-1H-吲唑-6-羧酸甲酯並將混合物在室溫下攪拌過夜。將反應混合物與水混合，抽吸濾出沉澱並用水及二氯甲烷反覆清洗。得到1.53克(理論值的27%)標題化合物。分離濾液相，將有機相濃縮，與少許二氯甲烷混合並懸浮於超音波浴中，並抽吸濾出的沉澱物。得到另外1.03克標題化合物。

1H-NMR(第一個產品部分，300MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=3.99(s,3H),7.09(t,1H),8.00(d,1H),8.21-8.40(m,4H),9.14(s,1H),12.53(s,1H),13.44(s,1H)。

中間體3-3 5-({[6-(2-羥基丙-2-基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-羧酸甲酯

將2.10克的6-(2-羥基丙-2-基)吡啶-2-羧酸鉀(中間體V3-1)先添加至15毫升THF中。加入3.69克(11.5毫莫耳)的O-(苯並三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基四氟硼酸脲及2.00毫升N-乙基-N-異丙基丙-2-胺並將混合物在室溫下攪拌15分鐘。隨後，加入1.83克(9.58毫莫耳)的5-胺基-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體2-1)並將混合物在室溫下攪拌19小時。將混合物與水和乙酸乙酯混合，將未溶解的固體過濾，將濾液相分離，水相用乙酸乙酯萃取兩次，用氯化鈉溶液清洗，經由疏水過濾器過濾，濃縮並在矽膠上經由管柱層析法純化(己烷/乙酸乙酯)。除去溶劑後，得到1.56克黃色泡沫狀標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.00分鐘(UV偵測器：TIC Smooth)，發現質量354.00。

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=1.63(s,6H),3.97(s,3H),5.37(s,1H),7.90-7.95(m,1H),8.03-8.07(m,2H),8.23(s,1H),8.29(s,1H),9.19(s,1H),12.79(s,1H),13.41(br.s.,1H)。

中間體4-1 2-(氧雜環丁烷-3-基甲基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯

將1.00克(2.66毫莫耳)的5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體3-1)溶解在10毫升DMF中，加入1.10克(7.99毫莫耳) 的碳酸鉀及221毫克(1.33毫莫耳)的碘化鉀後，將混合物在25℃下攪拌30分鐘。加入603毫克(3.99毫莫耳)的3-溴甲基氧雜環丁烷，並將混合物在25℃下攪拌24小時。將反應混合物分配在水及乙酸乙酯之間。將混合物用乙酸乙酯萃取兩次，合併的有機相經由疏水性過濾器過濾並濃縮。殘留物在矽膠上經由管柱層析法純化(己烷/乙酸乙酯)。得到260毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=1.24分鐘

MS(ESIpos)：m/z=435(M+H)⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=3.49-3.64(m,1 H),3.95(s,3 H),4.49(t,2 H),4.68(dd,2 H),4.81(d,2 H),8.20(dd,1 H),8.35-8.41(m,1 H),8.43-8.49(m,2 H),8.55-8.58(m,1 H),9.06(s,1 H),12.53(s,1 H)。

中間體4-2 2-(2-甲氧基乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯

將1.00克(2.75毫莫耳)的5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體3-1)溶解在5毫升DMF中，並在攪拌下加入387微升(4.12毫莫耳)的2-溴乙基甲基醚、1.14克(8.23毫莫耳)的碳酸鉀及228毫克(1.37毫莫耳)的碘化鉀。將反應混合物在25℃下攪拌24小時，用水稀釋並用乙酸乙酯萃取兩次。將合併的有機相經由疏水性過濾器過濾並濃縮。殘留物在矽膠上經由管柱層析法純化(己烷/乙酸乙酯)。得到12毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.24分鐘

MS(ESIpos)：m/z=423(M+H)⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=3.24(s,3 H),3.86(t,2 H),3.96(s,3 H),4.65(t,2 H),8.21(dd,1 H),8.35-8.42(m,1 H),8.43-8.51(m,2 H),8.52(d,1 H),9.06(s,1 H),12.53(s,1 H)。

中間體4-3 2-(3-甲氧基丙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯

將1.00克(2.75毫莫耳)的5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體3-1)溶解在5毫升丙烷、1.14克(8.23毫莫耳)的碳酸鉀及228毫克(1.37毫莫耳)的碘化鉀。將反應混合物在25℃下攪拌72小時，用水稀釋並用乙酸乙酯萃取兩次。將合併的有機相經由疏水性過濾器過濾並濃縮。殘留物在矽膠上經由管柱層析法純化(己烷/乙酸乙酯)。得到28毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.29分鐘

MS(ESIpos)：m/z=437(M+H)⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=2.17(quin,2 H),3.24(s,3 H),3.33-3.36(m,2 H),3.96(s,3 H),4.53(t,2 H),8,21(dd,1 H),8.35-8.42(m,1 H),8.45-8.49(m,2 H),8.54(d,1 H),9.06(s,1 H),12.54(s,1 H)。

中間體4-4 2-(3-羥基-3-甲基丁基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯 製備方法1

將930毫克(2.55毫莫耳)的5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體3-1)、1.06克碳酸鉀及212毫克碘化鉀先添 加至9毫升DMF中並將混合物攪拌15分鐘。然後加入0.62毫升4-溴-2-甲基丁-2-醇並將混合物在60℃ f攪拌16小時。將混合物與水混合並用乙酸乙酯萃取兩次，萃取液用飽和氯化鈉溶液清洗三次，過濾並濃縮。在矽膠上經由管柱層析法純化(己烷/乙酸乙酯)後得到424毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=1.21分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量450.00。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.16(s,6 H)2.02-2.11(m,2 H)3.96(s,3 H)4.51-4.60(m,3 H)8.20(dd,J=7.83,1.01Hz,1 H)8.39(s,1 H)8.45(s,2 H)8.55(d,J=0.76Hz,1 H)9.05(s,1 H)12.52(s,1 H)。

製備方法2

將1.95克(7.03毫莫耳)的5-胺基-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體7-1)先添加至30毫升THF中。加入1.48克(7.73毫莫耳)的6-(三氟甲基)吡啶-2-羧酸、2.71克(8.44毫莫耳)的O-(苯並三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基四氟硼酸脲及1.47毫升(8.44毫莫耳)的N-乙基-N-異丙基丙-2-胺並將混合物在25℃攪拌20.5小時。加入水，混合物用乙酸乙酯萃取三次，萃取液用氯化鈉溶液清洗，經由疏水過濾器過濾並濃縮。將殘留物在矽膠上經由管柱層析法分離(己烷/乙酸乙酯梯度)。得到2.79克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.23分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量450.00。

中間體4-5 2-(2-{[tert-丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯

將1.00克(2.66毫莫耳，97%)的5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基1羰基}胺基)-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體3-1)先添加至50毫升DMF中，在攪拌下加入1.10克(7.99毫莫耳)碳酸鉀及221毫克(1.33毫莫耳)碘化鉀，並將混合物在25℃攪拌30分鐘。隨後，加入857微升(3.99毫莫耳)的(2-溴乙氧基)(第 三丁基)二甲基矽烷並將混合物在25℃攪拌24小時。將反應混合物用水稀釋，用乙酸乙酯萃取。將合併的有機相經由疏水性過濾器過濾並濃縮。將殘留物在矽膠上經由管柱層析法純化(己烷/乙酸乙酯)。得到400毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.58分鐘

MS(ESIpos)：m/z=523(M+H)⁺

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=-0.18--0.13(m,6 H),0.74(s,9 H),3.96(s,3 H),4.08(t,2 H),4.57(t,2 H),8.15-8.25(m,1 H),8.32-8.43(m,1 H),8.43-8.52(m,3 H),9.07(s,1 H),12.53(s,1 H)。

中間體4-6 2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}丙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯

類似於中間體4-5，將1.00克(2.75毫莫耳)的5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體3-1)溶解在10毫升DMF中，在攪拌下加入1.14克(8.24毫莫耳)碳酸鉀及228毫克(1.37毫莫耳)碘化鉀，並將混合物在25℃攪拌30分鐘。隨後，加入1.04克(4.12毫莫耳)的(3-溴丙氧基)(第三丁基)二甲基矽烷並將混合物在25℃攪拌24小時。將反應混合物過濾，濾餅用乙酸乙酯清洗。將反應混合物分配在水及乙酸乙酯之間，水相用乙酸乙酯萃取兩次。將合併的有機相經由疏水性過濾器過濾並濃縮。經由製備級HPLC純化殘留物，得到428毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.63分鐘

MS(ESIpos)：m/z=537(M+H)⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=-0.02-0.06(m,6 H),0.87(s,9 H),2.14(quin,2 H),3.62(t,2 H),3.96(s,3 H),4.54(t,2 H),8.20(d,1 H),8.35- 8.42(m,1 H),8.43-8.48(m,3 H),8.49-8.53(m,1 H),9.06(s,1 H)。

中間體4-7 5-({[6-(2-羥基丙-2-基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2-(4,4,4-三氟丁基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯

將300毫克(0.80毫莫耳)的5-({[6-(2-羥基丙-2-基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體3-3)先添加至4.5毫升DMF中。加入287毫克(1.21毫莫耳)的1,1,1-三氟-4-碘基丁烷及333毫克碳酸鉀並將混合物在100℃攪拌23小時。加入水，用乙酸乙酯萃取3次。將混合物濃縮，產物經由製備級HPLC純化。得到72毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.26分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量464.17。

中間體4-8 5-{[(5-氟-6-甲基吡啶-2-基)羰基]胺基}-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯

將195毫克(0.46毫莫耳)的5-胺基-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-羧酸甲乙酯(中間體7-1)與78毫克(0.50毫莫耳)的5-氟-6-甲基吡啶-2-羧酸類似於中間體4-4(製備方法2)反應19.5小時。在類似的水處理後獲得228毫克粗產物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.20分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量414.00。

中間體4-9 2-(3-羥基-3-甲基丁基)-5-{[(6-甲基吡啶-2-基)羰基]胺基}-2H-吲唑-6-羧酸甲酯

將195毫克(0.45毫莫耳)的5-胺基-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體7-1)與70毫克(0.50毫莫耳)的6-甲基吡啶-2-羧酸類似於中間體4-4(製備方法2)反應19.5小時。在類似的水處理後獲得278毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.14分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量396.00。

中間體4-10 2-[3-(2,2,2-三氟乙氧基)丙基]-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯

將250毫克(0.58毫莫耳)的5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體3-1)、193毫克(0.88毫莫耳)的3-溴丙基2,2,2-三氟乙基醚、242毫克碳酸鉀及145毫克碘化鉀在3毫升DMF中的混合物在100℃攪拌20小時。加入水，將混合物用乙酸乙酯萃取，萃取液用氯化鈉溶液清洗並濃縮。經由製備級HPLC純化，得到52毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.39分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量504.12。

中間體4-11 5-({[6-(二氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯

將2.00克的5-胺基-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體7-1)先添加至40毫升THF中。加入1.50克的6-(二氟甲基)吡啶-2-羧酸、2.78克的O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基鈾四氟硼酸鹽(TBTU,CAS Number 125700-67-6)及1.5毫升的N-乙基-N-異丙基丙2-胺並將混合物在室溫攪拌24小時。加入水，將混合物用乙酸乙酯萃取三次，合併的有機相用氯化鈉溶液清洗並經由疏水過濾器過濾。將混合物濃縮，將殘留物在矽膠上經由管柱層析法純化(己烷/乙酸乙酯)。得到3.05克標題化合物之黃色固體。

UPLC-MS(方法A1)：Rt=1.15分鐘(UV偵測器TIC)，發現質量432.00。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.17(s,6H),2.04-2.11(m,2H),3.99(s,3H),4.52-4.60(m,3H),7.10(t,1H),8.00(dd,1H),8.28-8.38(m,2H),8.44-8.47(m,1H),8.56(d,1H),9.05(s,1H),12.49(s,1H)。

中間體5-1 N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

在冰-水冷卻浴中冷卻的1.50克(4.12毫莫耳)的5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}吲哚-6-羧酸甲酯(中間體3-1)在20毫升THF的溶液中小心地加入6.9毫升(5當量)3M甲基溴化鎂的乙醚溶液。將混合物在冰浴冷卻下攪拌1小時並在室溫下攪拌19.5小時。加入另外2當量的甲基溴化鎂溶液並將混合物在室溫下再攪拌24小時。加入飽和的氯化銨水溶液並將混合物用乙酸乙酯攪拌並萃取三次。將合併的有機相用氯化鈉溶液清洗，經由疏水性過濾器過濾並濃縮。將殘留物在矽膠上經由管柱層析法純化(己烷/乙酸乙酯)。得到 763毫克標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.63(s,6H),5.99(s,1H),7.49(s,1H),8.06(s,1H),8.14-8.19(m,1H),8.37(t,1H),8.46(d,1H),8.78(s,1H),12.32(s,1H),12.97(s,1H)。

中間體5-2 6-(二氟甲基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺

類似於中間體5-1的製備，將2.40克(6.93毫莫耳)的5-({[6-(二氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲哚-6-羧酸甲酯(中間體3-2)在10毫升THF中與3份3M甲基溴化鎂溶液在乙醚中反應(6.9毫升，然後在室溫下攪拌45分鐘；11.6毫升，然後在室溫下攪拌2小時；6.9毫升，然後在室溫下攪拌2小時)。在類似於中間體5-1的處理後，得到2.39克粗產物，其不經進一步純化而步使用。

中間體6-1 2-(3-羥基-3-甲基丁基)-5-硝基-2H-吲唑-6-羧酸甲酯

將5.00克(22.6毫莫耳)的5-硝基-1H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體1-1)先添加至40毫升DMF中。加入5.65克(33.9毫莫耳)的4-溴-2-甲基丁-2-醇、9.37克(67.8毫莫耳)碳酸鉀及5.63克(33.9毫莫耳)碘化鉀並將混合物在100℃攪拌20小時。加入水，將混合物用乙酸乙酯萃取三次，萃取液用氯化鈉溶液清洗，經由疏水過濾器過濾並濃縮。將殘留物在矽膠上經由管柱層析法純化(己烷/乙酸乙酯)。將得到的固體與乙醚一起攪拌，抽吸過濾，用乙醚清洗並乾燥。得到2.49克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=0.93分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量307.00。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.15(s,6H),2.02-2.11(m,2H),3.84(s,3H),4.54(s,1H),4.58-4.65(m,2H),8.05(s,1H),8.69(s,1H),8.86(s,1H).

中間體7-1 5-胺基-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯

將4.33克鐵及217毫克氯化銨添加至2.49克(8.10毫莫耳)的2-(3-羥基-3-甲基丁基)-5-硝基-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體6-1)在30毫升乙醇及10毫升水的溶液中，將混合物在90℃攪拌21.5小時。將混合物經由矽藻土過濾並用乙醇清洗三次，將濾液濃縮並將殘留物與水混合。用乙酸乙酯萃取3次(為了改善相分離，加入氯化鈉溶液)。將合併的有機相用氯化鈉溶液清洗，經由疏水性過濾器過濾並濃縮。得到1.95克(理論值的85%)標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=0.67分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量277.00。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.14(s,6H),1.96-2.08(m,2H),3.85(s,3H),4.39-4.51(m,3H),5.81(s,2H),6.80(s,1H),8.05(s,1H),8.18(s,1H)。

實施例 實例1 N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(2-甲氧基乙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

將75毫克(0.18毫莫耳)的2-(2-甲氧基乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-2)溶解在500微升THF中並與887微升(0.89毫莫耳)在THF中的1M甲基溴化鎂溶液混合。將反應混合物在25℃攪拌60分鐘。隨後，小心加入1毫升飽和的氯化銨水溶液並過濾混合物。將水相用乙酸乙酯萃取兩次，合併有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。將殘留物溶於3毫升DMSO中，並經由製備級HPLC純化。將含產物的部份冷凍乾燥。得到20毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.08分鐘

MS(ESIpos)：m/z=423(M+H)⁺

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=1.62(s,6 H),3.22(s,3 H),3.82(t,2 H),4.55(t,2 H),5.96(s,1 H),7.57(s,1 H),8.16(d1 H),8.29-8.42(m,2 H),8.42-8.50(m,1 H),8.71(s,1 H),12.36(s,1 H)。

實例2 N-[6-(羥基甲基)-2-(2-甲氧基乙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

將13毫克(0.36毫莫耳)氫化鋁鋰懸浮在1毫升THF中，將混合物冷卻至0℃。滴入溶解在500微升THF中的75毫克(0.17毫莫耳)的2-(2-甲氧基乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-2)並將混合物在25℃攪拌60分鐘。將混合物用水稀釋，用乙酸乙酯萃取兩次，合併的有機相用氯化鈉溶液清洗，經由疏水過濾器過濾，濃縮並減壓乾燥。得到13毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=0.99分鐘

MS(ESIpos)：m/z=394(M+H)⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=3.23(s,3 H),3.83(t,2 H),4.56(t,2 H),4.69(d,2 H),5.77(t,1 H),7.57(s,1 H),8.19(d,1 H),8.33-8.41(m,2 H), 8.43-8.47(m,1 H),8.51(s,1 H),11.20(s,1 H)。

實例3 N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(3-甲氧基丙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

將75毫克(0.17毫莫耳)的2-(3-甲氧基丙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-3)溶解在500微升THF中並與859微升(0.86毫莫耳)在THF中的1M甲基溴化鎂溶液混合。將反應混合物在25℃攪拌60分鐘。隨後，小心加入1毫升飽和的氯化銨水溶液並過濾混合物。將水相用乙酸乙酯萃取兩次，合併有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。將殘留物溶於3毫升DMSO中，並經由製備級HPLC純化。將含產物的部份冷凍乾燥。得到25毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.13分鐘

MS(ESIpos)：m/z=437(M+H)⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=1.62(s,6 H),2.14(quin,2 H),3.23(s,3 H),3.26-3.32(m,2 H),4.44(t,2 H),5.95(s,1 H),7.58(s,1 H),8.16(d,1 H),8.31-8.40(m,2 H),8.43-8.48(m,1 H),8.72(s,1 H),12.36(s,1 H)。

實例4 N-[6-(羥基甲基)-2-(3-甲氧基丙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

將13毫克氫化鋁鋰懸浮在1毫升THF中並將混合物冷卻至0℃。滴入在THF中的75毫克(0.17毫莫耳)的2-(3-甲氧基乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-3)並在30分鐘內使混合物達到室溫。將混合物用水稀釋並過濾，將殘留物用乙酸乙酯清洗並將過濾液用乙酸乙酯萃取，合併的乙酸乙酯相用氯化鈉溶液清洗，經由疏水過濾器過濾並濃縮並。將殘留物經由製備級HPLC純化。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d ₆)：δ[ppm]=2.14(quin,2 H),3.23(s,3 H),3.29(t,2 H),4.45(t,2 H),4.68(d,2 H),5.77(t,1 H),7.58(s,1 H),8.18(d,1 H),8.32-8.48(m,3 H),8.51(s,1 H),11.21(s,1 H)。

實例5 N-[2-(2-羥基乙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-s-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 步驟A： N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺之製備

將100毫克(0.19毫莫耳)的2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-5)溶解在1毫升THF中並與669微升(0.67毫莫耳)在THF中的1M甲基溴化鎂溶液混合。將反應混合物在25℃攪拌60分鐘。隨後，小心加入1毫升飽和的氯化銨水溶液並過濾混合物。加入另一個287微升(0.29毫莫耳)在THF中的1M甲基溴化鎂溶液並將混合物在25℃攪拌3小時。隨後，小心加入20毫升飽和的氯化銨水溶液並過濾混合物。將水相用乙酸乙酯萃取兩次，合併有機相，經由硫酸鎂乾燥，過濾，濃縮並在減壓下乾燥。得到50毫克的N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲 唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=1.51分鐘

MS(ESIpos)：m/z=523(M+H)⁺

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=-0.17--0.09(m,6 H),0.78(s,9 H),1.62(s,6 H),4.04(t,2 H),4.47(t,2 H),5.98(s,1 H),7.57(s,1 H),8.16(d,1 H),8.29(s,1 H),8.37(t,1 H),8.45(d,1 H),8.73(s,1 H),12.38(s,1 H)。

步驟B：

將50毫克(96微莫耳)的N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺溶解在1.0毫升THF中並與0.14微升(0.14毫莫耳)的四丁基氟化銨在THF中的1M溶液混合。將反應混合物在室溫下攪拌1小時。將混合物用水稀釋，用乙酸乙酯萃取兩次，合併的有機相用飽和的氯化鈉溶液清洗，經由疏水性過濾器過濾並濃縮。得到36毫克的N-[2-(2-羥基乙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(實例5)。

¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：d[ppm]=1.62(s,6H),3.86(q,2H),4.43(t,2H),4.95(t,1H),5.94(s,1H),7.57(s,1H),8.16(dd,1H),8.30(s,1H),8.37(t,1H),8.45(d,1H),8.72(s,1H),12.36(s,1H).

UPLC-MS(方法A2)：R_t=0.97分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量408.00。

實例6 N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(3-羥基丙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺之製備

將50毫克(0.09毫莫耳)的2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}丙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-6)溶解在500微升THF中並與326微升(0.33毫莫耳)甲基溴化鎂在THF中的1M溶液混合。將反應混合物在25℃攪拌60分鐘。隨後，小心加入20毫升飽和的氯化銨水溶液並將混合物用乙酸乙酯萃取兩次，將合併的有機相經由疏水過濾器過濾，濃縮並在減壓下乾燥。將殘留物經由製備級HPLC純化。得到40毫克的N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.58分鐘

MS(ESIpos)：m/z=537(M+H)⁺

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.02-0.05(m,6 H),0.84-0.91(m,9 H),1.62(s,6 H),2.02-2.18(m,2 H),3.55-3.62(m,2 H),4.45(t,2 H),5.96(s,1 H),7.57(s,1 H),8.16(d,1 H),8.31(s,1 H),8.33-8.42(m,1 H),8.45(d,1 H),8.72(s,1 H),12.37(s,1 H)。

步驟B：

將37毫克(0.07毫莫耳)of N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺溶解在500微升THF中並與207微升(0.21毫莫耳)四丁基氟化銨在THF中的1M溶液混合。將反應混合物在25℃攪拌2小時。將混合物用水稀釋並用乙酸乙酯 萃取兩次，合併的有機相用飽和的氯化鈉溶液清洗，過濾並濃縮。經由製備級HPLC純化。得到10毫克的N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(3-羥基丙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(實例6，含有次級成分)。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=1.00分鐘

MS(ESIpos)：m/z=423(M+H)⁺

¹H NMR選擇的信號(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=1.61(s),2.00-2.12(m),3.38(t,2 H),4.44(t,2 H),4.62(br.s.,1 H),5.93(br.s.,1 H),7.55(s,1 H),8.13(d,1 H),8.27-8.38(m,2 H),8.43(d,1 H),8.71(s,1 H),12.30(br.s.,1 H)。

實例7 N-[2-(2-羥基乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 步驟A： N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

將100毫克(0.19毫莫耳)的2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-5)溶解在1毫升THF中並與191微升(0.38毫莫耳)的2M硼氫化鋰溶液混合。將混合物在25℃下攪拌24小時。加入14毫克(0.38毫莫耳)硼氫化鈉及500微升甲醇，並將混合物在25℃攪拌4小時。加入另外14毫克(0.38毫莫耳)硼氫化鈉，將混合物在25℃下攪拌24小時。將水小心添加至反應混合物中並除去有機相。然後將混合物用乙酸乙酯萃取兩次，並將合併的有機相用飽和的氯化鈉溶液清洗，經由疏水性過濾器過濾並濃縮。將殘留物溶解在2毫升DMSO中並經由製備級HPLC純化。得到30毫克的N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=1.44分鐘

MS(ESIpos)：m/z=495(M+H)⁺

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=-0.16--0.12(m,6 H),0.75-0.79(m,9 H),4.05(t,2 H),4.48(t,2 H),4.69(d,2 H),5.75-5.77(m,1 H),7.57(s,1 H),8,18(dd,1 H),8.30-8.33(m,1 H),8.38(t,1 H),8.45(d,1 H),8.51(s,1 H),11.20(s,1 H)。

步驟B：

將33毫克(0.07毫莫耳)of N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺溶解在1毫升THF中並與100微升(0.10毫莫耳)四丁基氟化銨在THF中的1M溶液混合。將反應混合物在25℃攪拌1小時。將混合物用水稀釋，用乙酸乙酯萃取兩次，合併的有機相用飽和的氯化鈉溶液清洗，經由疏水過濾器過濾，濃縮並減壓乾燥。得到25毫克的N-[2-(2-羥基乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(實例7)。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=0.87分鐘

MS(ESIpos)：m/z=381(M+H)⁺

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=3.87(q,2 H),4.44(t,2 H),4.69(d,2 H),4.98(t,1 H),5.70-5.81(m,1 H),7.57(s,1 H),8.11-8.23(m,1 H),8.31-8.42(m,2 H),8.43-8.49(m,1 H),8.51(s,1 H),11.20(s,1 H)。

實例8 N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(氧雜環丁烷-3-基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

將50毫克(0.12毫莫耳)的2-(氧雜環丁烷-3-基甲基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-1)溶解在500微升THF中並與576微升(0.58毫莫耳)甲基溴化鎂在THF中的1M溶液混合。將反應混合物在25℃攪拌60分鐘。隨後，小心加入20毫升飽和的氯化銨水溶液並將混合物濃縮。將水相用乙酸乙酯萃取兩次，並將有機相合併，經由硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮。將殘留物溶解在2.0毫升DMSO中並經由製備級HPLC純化。將含產物的部份冷凍乾燥。得到30毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=1.03分鐘

MS(ESIpos)：m/z=435(M+H)⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=1.62(s,6 H),3.45-3.61(m,1 H),4.48(t,2 H),4.66(dd,2 H),4.72(d,2 H),5.94(s,1 H),7.57(s,1 H),8.16(d,1 H),8.33-8.42(m,2 H),8.42-8.47(m,1 H),8.72(s,1 H),12.36(s,1 H)。

實例9 N-[6-(羥基甲基)-2-(氧雜環丁烷-3-基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

75毫克(0.17毫莫耳)的2-(氧雜環丁烷-3-基甲基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-1)溶解在1毫升THF/甲醇(1：1)的混合物中，並加入8毫克(0.21毫莫耳)硼氫化鈉。將混合物在25℃攪拌60分鐘。將反應混合物濃縮，將殘留物與水混合。將懸浮液劇烈攪 拌15分鐘，並抽吸將固體過濾，用水清洗兩次，用二乙基醚清洗兩次，並在減壓下乾燥。得到48毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=0.94分鐘

MS(ESIpos)：m/z=407(M+H)⁺

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=3.55(s,1 H),4.48(t,2 H),4.61-4.77(m,6 H),7.57(s,1 H),8.18(dd,1 H),8.33-8.49(m,3 H),8.51(s,1 H),11.21(s,1 H)。

實例10 N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[3-(甲基磺醯基)丙基]-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

將500毫克(1.32毫莫耳)的N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)、569毫克碳酸鉀及114毫克碘化鉀在5.0毫升DMF中的混合物在室溫攪拌15分鐘。加入414毫克1-溴-3-(甲基磺醯基)丙烷並將混合物在室溫攪拌過夜。加入水，將混合物用乙酸乙酯萃取兩次，萃取液用氯化鈉溶液清洗並濃縮。將殘留物在矽膠上經由管柱層析法純化(二氯甲烷/甲醇梯度)。將產物部份用乙醚攪拌，過濾並乾燥。得到59毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=1.02分鐘

MS(ESIpos)：m/z=485(M+H)+

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.63(s,6H),2.26-2.42(m,2H),2.99(s,3H),3.06-3.16(m,2H),4.55(t,2H),5.96(s,1H),7.60(s,1H),8.16(d,1H),8.33-8.48(m,3H),8.73(s,1H),12.37(s,1H)。

實例11 N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

製備方法1

將705毫克(1.57毫莫耳)的2-(3-羥基-3-甲基丁基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-4)先添加至10毫升THF中並在冰-水冷卻浴中冷卻。加入2.6毫升(5.0當量)甲基溴化鎂的3M溶液(在乙醚中)，並將混合物攪拌，同時用冰浴冷卻1小時，並在室溫下攪拌4.5小時。加入另外1當量的甲基溴化鎂溶液，將混合物在室溫下攪拌20.5小時。加入另外1當量的甲基溴化鎂溶液，將混合物在室溫下攪拌22小時。將反應混合物與飽和的氯化銨水溶液混合，用乙酸乙酯萃取三次。將合併的有機相用氯化鈉溶液清洗，經由疏水性過濾器過濾並濃縮。得到790毫克殘留物，將其經由製備級HPLC純化。得到234毫克標題化合物及164毫克的產物部份並將其與乙醚一起攪拌，抽吸過濾後乾燥，另外得到146毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.10分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量450.00。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.14(s,6H),1.61(s,6H),1.99-2.08(m,2H),4.42-4.55(m,3H),5.93(s,1H),7.56(s,1H),8.15(dd,1H),8.32-8.39(m,2H),8.41-8.47(m,1H),8.70(s,1H),12.34(s,1H)。

製備方法2

將500毫克(1.37毫莫耳)的N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)、569毫克碳酸鉀及114毫克碘化鉀在5毫升DMF中的混合物在室溫攪拌15分鐘。加入344毫克(1.5當量)的4-溴-2-甲基丁-2-醇並將混合物加熱至100℃經2小時。加入另外0.5當量的4-溴-2-甲基丁-2-醇並將混合物在室溫攪拌16小時。將混合物與水混合並用乙酸乙酯萃取兩次，合併的有機相用飽和的氯化鈉溶液清洗，經由疏水性過濾器過濾並濃縮。殘留物在矽膠上經由管柱層析法(己烷/乙酸乙酯)純化。得到100毫克產物部份並將其與乙醚攪拌。將固體過濾並乾燥。得到 60毫克標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.14(s,6 H),1.61(s,6H),1.99-2.07(m,2 H),4.43-4.52(m,3 H)5.94(s,1 H)7.57(s,1 H)8.15(dd,1H)8.33-8.40(m,2 H),8.42-8.48(m,1 H),8.71(s,1 H),12.35(s,1 H)。

實例12 N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[2-(甲基磺醯基)乙基]-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

將160毫克(0.44毫莫耳)的N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)與182毫克碳酸鉀及36毫克碘化鉀一起懸浮在1.0毫升DMF中，並將混合物在室溫下攪拌15分鐘。然後加入123毫克2-溴乙基甲基碸(0.66毫莫耳)，將混合物在室溫下攪拌過夜。加入水，將混合物用乙酸乙酯萃取兩次，萃取液用飽和的氯化鈉水溶液清洗，經由疏水過濾器過濾並濃縮。經由製備級HPLC純化殘留物，得到20毫克標題化合物。

UPLC(方法A2)：R_t=1.01分鐘

MS(ESIpos)：m/z=471(M+H)+

¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)：δ[ppm]=1.63(s,6 H),2.90(s,3 H),3.85(t,2 H),4.86(t,2 H),5.97(s,1 H),7.59(s,1 H),8.13-8.19(m,1 H),8.37(s,1 H),8.41-8.48(m,2 H),8.74(s,1 H),12.37(s,1 H)。

實例13 6-(二氟甲基)-N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺

製備方法1

將250毫克的6-(二氟甲基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺(中間體5-2之粗產物)、144毫克碘化鉀級239毫克碳酸鉀在2.5毫升DMF中的混合物在室溫下攪拌15分鐘。加入145毫克(0.87毫莫耳)的4-溴-2-甲基丁-2-醇，將混合物在110℃攪拌3小時，加入另外%毫克的4-溴-2-甲基丁-2-醇並將混合物在110℃攪拌4小時。加入水，將混合物用乙酸乙酯萃取兩次，萃取液用半飽和的氯化鈉水溶液清洗，經由疏水過濾器過濾並濃縮。在矽膠上經由管柱層析法(己烷/乙酸乙酯)進行純化。得到61毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.00分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量432.00。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.14(s,6H),1.63(s,6H),1.97-2.08(m,2H),4.41-4.55(m,3H),5.99(s,1H),7.03(t,1H),7.56(s,1H),7.94-8.00(m,1H),8.24-8.38(m,3H),8.71(s,1H),12.49(s,1H)。

製備方法2

類似於實例11之製備(製備方法1)，3.00克的5-({[6-(二氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-11)與甲基溴化鎂的3M溶液(在乙醚中)反應。粗產物經由與乙醚攪拌，經由製備級HPLC過濾純化後，得到1.37克標題化合物。

實例14 6-(二氟甲基)-N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[2-(甲基磺醯基)乙基]-2H-吲唑-5-基}吡啶-2-甲醯胺

將250毫克的6-(二氟甲基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺(中間體5-2之粗產物)、144毫克碘化鉀及239毫克碳酸鉀在2.5毫升DMF中的混合物在室溫下攪拌15分鐘。加入162毫克的2-溴乙基甲基碸(0.87毫莫耳)並將混合物在110℃攪拌3小時。加入水，將混合物用乙酸乙酯萃取兩次，萃取液用半飽和的氯化鈉水溶液清洗，經由疏水過濾器過濾並濃縮。將殘留物經由製備級HPLC純化並將產物部份另外在矽膠上經由管柱層析法純化(己烷/乙酸乙酯)。得到40毫克標題化合物。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.65(s,6H),2.90(s,3H),3.85(t,2H),4.85(t,2H),6.03(s,1H),7.04(t,1H),7.59(s,1H),7.98(d,1H),8.25-8.36(m,2H),8.43(s,1H),8.75(s,1H),12.52(s,1H)。

實例15 6-(二氟甲基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(3-羥基丙基)-2H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺 步驟A： N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(二氟甲基)吡啶-2-甲醯胺之製備

將250毫克的6-(二氟甲基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺(中間體5-2)、48毫克碘化鉀及239毫克碳酸鉀在2.5毫升DMF中的混合物在室溫下攪拌15分鐘。加入219毫克(0.87毫莫耳，1.5當量)的(3-溴丙氧基)第三丁基)二甲基矽烷並將混合物在110℃攪拌3小時。加入另外 1當量的(3-溴丙氧基)第三丁基)二甲基矽烷並將混合物在100℃攪拌4小時。加入水，將混合物用乙酸乙酯萃取，萃取液用氯化鈉水溶液清洗，經由疏水過濾器過濾並濃縮。將殘留物經由管柱層析法純化(己烷/乙酸乙酯)。得到92毫克標題化合物。

步驟B：

類似於實例6步驟B之製備，將92毫克的N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(二氟甲基)吡啶-2-甲醯胺與0.53毫升四丁基氟化銨在溶液反應1小時。根據實例6的水性處理並經由製備級HPLC純化後，得到46毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=0.92min(UV偵測器：TIC)，發現質量404.00。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.64(s,6H),2.05(quin,2H),3.35-3.46(m,2H),4.45(t,2H),4.64(t,1H),5.99(s,1H),7.04(t,1H),7.57(s,1H),7.95-7.99(m,1H),8.25-8.36(m,3H),8.73(s,1H),12.50(s,1H)。

實例16 N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(4,4,4-三氟丁基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

將210毫克(0.58毫莫耳)的N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)在3毫升DMF中的混合物與0.11毫升(0.87毫莫耳)的1,1,1-三氟-4-碘基丁烷及239毫克碳酸鉀混合，並將混合物 在80℃攪拌6小時。加入水後，將混合物用乙酸乙酯萃取三次，合併的有機相用飽和的氯化鈉溶液清洗，經由疏水性過濾器過濾並濃縮。經由製備級HPLC純化粗產物。得到19毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.27分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量474.15。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.62(s,6H),2.10-2.33(m),4.49(t,2H),5.94(s,1H),7.59(s,1H),8.13-8.18(m,1H),8.32-8.41(m,2H),8.41-8.47(m,1H),8.72(s,1H),12.35(s,1H)。

實例17 N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[3-(三氟甲氧基)丙基]-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

將150毫克(0.33毫莫耳)的N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)先添加至2毫升THF中。加入58毫克(0.40毫莫耳)的3-(三氟甲氧基)丙-1-醇、131毫克三苯基膦及71微升偶氮二羧酸二異丙酯(DIAD,CAS 2446-83-5)並將混合物在室溫下攪拌19小時。加入0.83毫升氫氧化鈉溶液(2M)並將混合物在40℃攪拌5小時。將混合物用水稀釋並用乙酸乙酯萃取三次，合併的有機相濃縮並經由製備級HPLC純化。得到16毫克標題化合物之粗產物。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=1.26分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量490.14。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆，選擇的信號s)：δ[ppm]=1.61(s,6H),1.84(d,1H),2.32(quint.,2H),4.08(t,2H),4.51(t,2H),7.58(s,1H),8.15(d,1H),8.31-8.39(m,2H),8.44(d,1H),8.72(s,1H),12.35(s,1H)。

實例18 N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[3-(2,2,2-三氟乙氧基)丙基]-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

類似於實例11之製備(製備方法1),52毫克(0.10毫莫耳)的2-[3-(2,2,2-三氟乙氧基)丙基]-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-10)在3毫升THF中與2×171微升在乙醚中的3M溴化鎂溶液反應。經由製備級HPLC純化後得到12毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A1)：R_t=1.25分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量504.16。

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.63(s,6H),2.20(quin,2H),3.58(t,2H),4.05(q,2H),4.47(t,2H),5.94(s,1H),7.58(s,1H),8.15(dd,1H),8.32(s,1H),8.36(t,1H),8.45(d,1H),8.73(s,1H),12.36(s,1H)。

實例19 5-氟-N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-甲基吡啶-2-甲醯胺

將228毫克(0.31毫莫耳)的5-{[(5-氟-6-甲基吡啶-2-基)羰基]胺基}-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-8)先添加至4.5毫升THF中並用冰冷卻浴冷卻。加入0.63毫升的3M溴化鎂溶液(在乙醚中)並將混合物在冰浴冷卻下攪拌2小時，並在室溫下攪拌21小時。將反應混合物與飽和的氯化銨水溶液混合並用乙酸乙酯萃取三次。將合併的有機相濃縮。將殘留物經由製備級HPLC純化。得到82毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=1.03分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量414.21。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.13(s,6H),1.63(s,6H),1.99-2.05(m,2H),2.55-2.59(m,3H),4.42-4.50(m,3H),5.95(s,1H),7.54(s,1H),7.83(t,1H),8.05(dd,1H),8.31(s,1H),8.68(s,1H),12.33(s,1H)。

實例20 N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-甲基吡啶-2-甲醯胺

將278毫克(0.48毫莫耳)的2-(3-羥基-3-甲基丁基)-5-{[(6-甲基吡啶-2-基)羰基]胺基}-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-9)先添加至5.0毫升THF中並用冰冷卻浴冷卻。加入0.97毫升的3M溴化鎂溶液(在乙醚中)並將混合物在冰浴冷卻下攪拌2小時，並在室溫下攪拌20.5小時。加入另外0.48毫升的3M甲基溴化鎂溶液，將混合物在室溫下攪拌67小時。將混合物與飽和的氯化銨水溶液混合並用乙酸乙酯萃取三次，萃取液用氯化鈉溶液清洗，經由疏水過濾器過濾並濃縮。將殘留物經由製備級HPLC純化。得到111毫克標題化合物。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=0.97分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量396.22。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.15(s,6H),1.64(s,6H),2.00-2.08(m,2H),2.61(s,3H),4.41-4.59(m,3H),5.92(s,1H),7.50(dd,1H),7.56(s,1H),7.90-7.99(m,2H),8.33(s,1H),8.70(s,1H),12.39(s,1H)。

實例21 6-(2-羥基丙-2-基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(4,4,4-三氟丁基)-2H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺

將72毫克(0.16毫莫耳)的5-({[6-(2-羥基丙-2-基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2-(4,4,4-三氟丁基)-2H-吲唑-6-羧酸甲酯(中間體4-7)在10毫升THF中 的溶液在冰/水冷卻浴中冷卻。加入0.26毫升在乙醚中的3M甲基溴化鎂溶液並將混合物攪拌2小時，然後在室溫下攪拌20小時。加入另外1當量的3M甲基溴化鎂溶液，將混合物在室溫下攪拌24小時。加入飽和的氯化銨水溶液，將混合物用乙酸乙酯萃取三次，萃取液用氯化鈉溶液清洗並濃縮。製備級HPLC得到22毫克(理論值的31%)標題化合物。

UPLC-MS(方法A2)：R_t=1.15分鐘(UV偵測器：TIC)，發現質量464.20。

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=1.56(s,6H),1.64(s,6H),2.07-2.34(m,4H),4.49(t,2H),5.32(s,1H),6.05(s,1H),7.60(s,1H),7.87(dd,1H),7.99-8.05(m,2H),8.35(s,1H),8.79(s,1H),12.45(s,1H)。

實例22 N-{2-[2-(1-羥基環丙基)乙基]-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺

將250毫克(0.69毫莫耳)的N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)先添加至5毫升DMSO中。加入159毫克(0.96毫莫耳)的1-(2-溴乙基)環丙醇、285毫克碳酸鉀及171毫克碘化鉀並將混合物在100℃攪拌5小時。加入水，將混合物用乙酸乙酯萃取三次。將合併的有機相用氯化鈉溶液清洗，經由疏水性過濾器過濾並濃縮。將殘留物經由製備級HPLC純化(管柱：Waters XBridge C18 5μ 100x30毫米，流洗液A：水+0.1體積%的甲酸(99%)，流洗液B：乙腈)。冷凍乾燥，得到45毫克標題化合物。

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)：δ[ppm]=0.18-0.22(m,2H),0.48-0.52(m,2H),1.62(s,6H),2.08(t,2H),4.54-4.60(m,2H),5.36(s,1H),5.96(s,1H),7.57(s,1H),8.16(dd,1H),8.34-8.39(m,2H),8.45(d,1H),8.72(s,1H),12.36(s,1H)。

生理功效評估 IRAK4激酶測定

下文描述本發明物質在IRAK4 TR-FRET測定(TR-FRET=時間解析螢光共振能量轉移)中測量的IRAK4抑制活性。

將在桿狀病毒感染的昆蟲細胞(Hi5，BTI-TN-5B1-4，購自Invitrogen的細胞系，目錄號B855-02)中表現的來自N末端GST(穀胱甘肽S-轉移酶)及人類IRAK4的重組融合蛋白，並經由親和層析法純化，作為酶使用。用於激酶反應的受質是生物素化的肽生物素-Ahx-KKARFSRFAGSSPSQASFAEPG(醯胺形式的C-末端)，其可購自例如Biosyntan GmbH(Berlin-Buch)。

對於測定，從測試物質的2毫莫耳濃度DMSO溶液製備從20微莫耳濃度至0.073毫微莫耳濃度範圍內的11種不同濃度。將50微升各溶液移液到黑色小容量384孔微量滴定板(Greiner Bio-One,Frickenhausen,Germany)中，加入IRAK4在測定緩衝液中的2微升溶液[50毫莫耳濃度HEPES pH 7.5、5毫莫耳濃度MgCl₂、1.0毫莫耳濃度二硫蘇糖醇、30微莫耳濃度活化的原釩酸鈉、0.1%(w/v)的牛γ-球蛋白(BGG)0.04%(v/v)諾乃洗滌劑-P40(Sigma)]並將混合物溫育15分鐘以允許物質在激酶反應之前預先與酶結合。然後經由在測定緩衝液中加入3微升三磷酸腺苷溶液(ATP,1.67毫莫耳濃度=在5微升測定體積中的最終濃度：1毫莫耳濃度)及肽受質(0.83微莫耳濃度=在5微升測定體積中的最終濃度：0.5微莫耳濃度)開始激酶反應，並將所得混合物在22℃溫育45分鐘的反應時間。將IRAK4的濃度調整至酶的相應活性，並使得測定是在線性範圍內進行。典型的濃度約為0.2毫微莫耳濃度。經由加入TR-FRET檢測試劑[0.1微莫耳濃度鏈黴親和素-XL665(Cisbio Bioassays；France，目錄編號610SAXLG)]及1.5毫微莫耳濃度抗磷酸絲氨酸抗體[Merck Millipore,"STK Antibody"，目錄編號35-002]及0.6毫微莫耳濃度LANCE EU-W1024-標記的抗小鼠IgG抗體(Perkin-Elmer，產品編號AD0077；或者是，可以使用從Cisbio Bioassays的铽穴體標記的抗小鼠IgG抗體)在EDTA水溶液(100毫微莫耳濃度EDTA,0.4%[w/v]牛血清白蛋白[BSA]在25毫微莫耳濃度HEPES pH 7.5)中的5微升溶液而停止反應。

將所得混合物在22℃下溫育1小時以形成生物素化磷酸化基質及檢測試劑的複合物。然後經由測量從銪螯合物標記的抗小鼠-IgG抗體對鏈黴親和素-IX665的共振能量轉移來評估磷酸化受質的量。為此，在TR-FRET測量儀器例如Rubystar(BMG Labtechnologies,Offenburg,Germany)或者Viewlux(Perkin-Elmer)中在350毫微米激發後測量在620毫微米及665毫微米處的螢光發射。將665毫微米和622毫微米處的發射比作為磷酸化受質量的量度。將數據歸一化(不含測試物質的酶反應=0%抑制；不含酶的所有其他測定組分=100%抑制)。通常，測試物質是在從20微莫耳濃度至0.073毫微莫耳濃度範圍內的11種不同濃度在相同的微量滴定板上測試(20微莫耳濃度、5.7微莫耳濃度、1.6微莫耳濃度、0.47微莫耳濃度、0.13微莫耳濃度、38毫微莫耳濃度、11毫微莫耳濃度、3.1毫微莫耳濃度、0.89毫微莫耳濃度、0.25毫微莫耳濃度及0.073毫微莫耳濃度)。稀釋系列在測定之前(在100%DMSO中為2毫莫耳濃度至7.3毫微莫耳濃度)經由連續稀釋製備。經由4-參數擬合計算IC₅₀值。

通式(III)的本發明物質相對於IRAK4的抑制活性同樣在上述IRAK4 TR-FRET測定中測定。以下舉例說明：化合物中間體4-2的IC₅₀=21.7毫微莫耳濃度，中間體4-3的IC₅₀=13.0毫微莫耳濃度，中間體4-4的IC₅₀=6.2毫微莫耳濃度。

在THP-1細胞中的TNF-α分泌

此測試適合於測試物質在THP-1細胞(人類單核細胞急性白血病細胞系)中抑制TNF-α(腫瘤壞死因子α)分泌的能力。NF-α是涉及發炎過程的細胞因子。在此試驗中，經由與細菌脂多醣(LPS)溫育來觸發TNF-α分泌。

將THP-1細胞保持在連續懸浮細胞培養中[RPMI 1460培養基含L-Glutamax(Gibco，目錄編號61870-044)，補充有胎牛血清(FCS)10%(Invitrogen，目錄編號10082-147)、1%青黴素/鏈黴素(Gibco BRL，目錄編號15140-114)]並且不應超過1×10⁶細胞/毫升的細胞濃度。該測定是在細胞培養基(補充有FCS 10%的L-Glutamax的RPMI 1460培養基)中進行。

在各情況下，將2-2.5微升每孔的細胞懸浮液(對應於4000個細胞)分配到384孔試驗板(Greiner,Cat.No.784076)，其中各含溶解在100%DMSO中的40-50毫微升物質。對於每種物質是使用從20微莫耳濃度至0.073毫微莫耳濃度範圍內的10種不同濃度進行。將細胞在室溫下溫育15分鐘。然後將溶於細胞培養基的2-2.5微升0.1微克/毫升LPS(Sigma,Escherichia coli 055：B5,Cat.No.L5418)(最終濃度0.05微克/毫升)分配到每個孔中。作為中性對照，細胞是用0.05微克/毫升LPS及1%DMSO處理，作為抑制劑對照，僅用1%DMSO處理。

將試驗板在80g下離心30秒，並在37℃，5%CO₂及95%大氣濕度下溫育17小時。使用TNF-α HTRF Detection Kit(Cisbio,Cat.No.62TNFPEB/C)測定TNF-α的量。為此，在各情形中加入2微升的檢測溶液，其是由抗-TNF-α-XL665共軛物和及抗-TNF-α-穴體溶解共軛物根據製造商說明書溶解在重組緩衝液中組成，用於HTRF(均質時差性螢光)試驗。加入後，將混合物在室溫下溫育3小時或在4℃下溫育過夜。然後使用HTRF啟用的測量儀器例如BMG PheraStar在620/665毫微米讀取信號。

物質的活性是表示為中性和抑制劑控制之間的百分比。使用4參數擬合計算IC₅₀值。

體外LPS(脂多醣)誘導的人體PBMCs(外周血液單核細胞)中的細胞因子產生

檢測本發明通式(I)化合物對誘導人體PBMCs中的細胞因子產生的影響。細胞因子的產生在此是經由TLR4配體之LPS引起，其導致IRAK4介導的信號通路的激活。

人體PBMCs是從抗凝血人全血獲得。為此目的，首先將15毫升Ficoll-Paque(Biochrom，目錄編號L6115)吸移到Leucosep管中，並加入20毫升人血。將血液在室溫下以800g離心15分鐘後，取出包含血小板的血漿並丟棄。將PBMCs轉移到離心管中並用PBS(磷酸鹽緩衝的鹽水)(Gibco，目錄編號14190)調整。將細胞懸浮液在室溫下以250g離心10分鐘並棄去上清液。將PBMCs再度懸浮於完全培養基(RPMI 1640，沒有L-谷氨醯胺(PAA，目錄編號E15-039),10% FCS；50U/毫升青黴素，50微克/毫升鏈黴素 (PAA，目錄編號P11-010)及1% L-谷氨醯胺(Sigma，目錄編號G7513))中。

該測定也在完全培養基中進行。將PBMCs以2.5×10⁵個細胞/孔的細胞密度接種在96孔板中。將本發明化合物在恆定體積的100%DMSO中進行連續稀釋，並在10微莫耳濃度至3毫微莫耳濃度範圍內的8種不同濃度的測定中使用，使得最終的DMSO濃度為0.4%DMSO。在實際刺激之前，將細胞與其預溫育30分鐘。為了誘導細胞因子分泌，用0.1微克/毫升LPS(Sigma,Escherichia coli 0128：B12,Cat.No.L2887)刺激細胞24小時。根據製造商的說明書，使用CellTiter-Glo發光測定(Promega，目錄編號G7571(G755/G756A))測定細胞活力。根據製造商的說明書，使用Human ProInflammatory 9-Plex Tissue Culture Kit(MSD，目錄編號K15007B)測定細胞培養上清液中分泌的TNF-α的量。作為實例，實例化合物11及實例化合物12具有

1微莫耳濃度的活性。

體外TLR-4/TLR-7誘導的人類樹突狀細胞(DCs)的白細胞介素(IL)-23分泌

在人類DCs中檢測本發明通式(I)化合物對誘導產生促發炎細胞因子IL-23的作用，其在產生TH-17細胞中扮演重要的角色。據指出，TH-17細胞在諸如類風濕性關節炎、銀屑病關節炎、貝克赫特氏病(Bekhterev's disease)(強直性脊柱炎)或多發性硬化症等疾病的發病機理有關鍵作用(Lubberts,Nat.Rev.Rheumatol.,2015；Marinoni et al.,Auto.Immun.Highlights,2014；Isailovic et al.,J.Autoimmun.,2015；Staschke et al.,J Immunol.,2009)。為了檢測本發明化合物對IL-23產生的影響，將人類初級單核細胞(使用磁分離從人PBMCs分離[Miltenyi Biotech,Monocyte Isolation Kit，目錄編號130-091-153]並經由加人生長因子(重組人類GM-CSF[PeproTech，目錄編號300-03]及IL-4[PeproTech，目錄編號200-04])在完全培養基(VLE(非常低的內毒素)RPMI 1640[Biochrom AG，目錄編號FG1415]、10%胎牛血清(FBS)[Gibco，目錄編號10493-106]；50微莫耳濃度β-巰基乙醇(Gibco，目錄編號31350],50U/毫升青黴素及鏈黴素[Gibco，目錄編號15140-114])在培養基內分化6天成為DCs。收穫DCs後，將其重新懸浮於完全培養基中，並以2× 10⁵個細胞/孔的細胞密度接種在96孔板(Costar，目錄編號3599)中。將本發明化合物在恆定體積的100%DMSO中進行連續稀釋，並在10微莫耳濃度至1毫微莫耳濃度範圍內的9種不同濃度的測定中使用。這裡確保存在的DMSO濃度對於所使用的各個9種濃度總是0.1%DMSO。使用本發明化合物將DCs預處理30分鐘。隨後，刺激使產生IL-23是經由加入10毫微克/毫升LPS(Sigma,Escherichia coli serotype 0127：B8，目錄編號L3129)(TLR4配體)及2.5微克/毫升TLR-7/8配體R848(Invivogen，目錄編號tlrl-r848-5)，兩者都激活IRAK4介導的信號通路，在培養箱(37℃,95%rH,5% CO₂)中培養24小時。在24小時的溫育時間後，收穫上清液並使用市售的hIL-23 ELISA(eBiosciences，目錄編號88-7237-88)根據製造商的說明書進行分析。圖1中實例化合物12是以實例的方式顯示在人DCs中IL-23的抑制結果。

體外TLR-7/8-或TLR-9誘導的人漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)的IFN α產生

借助於此試驗，可以研究本發明通式(I)化合物對人類pDCs中IFN α(干擾素-α)產生的作用，其是系統性紅斑狼瘡發病機理中的關鍵細胞因子(Mathian et al.,Arthritis Rheum,2009；Crow M.K.,Rheum Dis Clin N Am,2010)。為此目的，如上所述從全血中分離人PBMCs，並使用市售細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotech,Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II，目錄編號130-097-415)從其中分離漿細胞樣DCs(pDCs)。將獲得的pDCs再次懸浮於完全培養基中(RPMI 1640+GlutaMax[Gibco，目錄編號61870-010]補充10% FBS[Gibco，目錄編號10493-106]及50U青黴素/鏈黴素[Gibco，目錄編號15140-114])並在96孔微量滴定板(Costar，目錄編號3599)中以5×10⁴個細胞/孔的細胞密度接種。將本發明化合物在恆定體積的100%DMSO中進行連續稀釋，並在10微莫耳濃度至1毫微莫耳濃度範圍內的9種不同濃度的測定中使用。這裡確保存在的DMSO濃度對於所使用的各個9種濃度總是0.1%DMSO。使用本發明化合物將DCs預處理30分鐘。使用TLR7/8配體(imiquimod,R837,Invivogen，目錄編號tlrl-imq)或TLR-9配體(CPG-A, ODN2216,Invivogen，目錄編號tlrl-2216-1)刺激pDCs且這導致激活IRAK4介導的信號通路。在24小時的溫育時間後，收穫上清液並使用市售的IFNα ELISA(IFNalpha Multi-Subtype ELISA Kit,pbl Assay Science，目錄編號41105-1)進行分析。圖2中實例化合物12是以實例的方式顯示在人漿細胞樣DCs中IFN α的抑制結果。

TLR介導發炎的體內模式

檢測本發明通式(I)化合物在體內TLR介導的發炎模式中的體內功效。因為使用LPS介導的發炎模式，此機制模式特別顯示本發明化合物對TLR4介導的病症的潛在影響。在該模式中，將雌性Balb/c小鼠(約8週齡；Charles River Laboratories，德國)分組且每組有5隻動物。對照組是用其中物質經溶解(物質媒劑)的媒劑及用其中LPS經溶解的媒劑處理。物質處理組以及陽性對照組是腹膜內(i.p.)接受0.2毫克LPS/公斤體重(Sigma，目錄編號L4391)(來自大腸桿菌0111：B4的脂多醣)。另外，用上述物質媒劑處理陽性對照組。在經由施用LPS誘導發炎之前16小時口服該物質。為了檢測本發明化合物對發炎的影響，在1.5小時後從動物取血樣。根據製造商的說明書，使用Mouse ProInflammatory 7-Plex Tissue Culture Kit(MSD，目錄編號K15012B)測定血漿中特定細胞因子的濃度。RAK4抑制劑在TLR介導的發炎模式中是有效的。圖3顯示血漿中的TNF-α的量，與LPS誘導的濃度相比，其是以劑量依賴性方式經由施用實例化合物11而降低。

IL-1 β介導發炎的體內模型

為了評估本發明通式(I)化合物在IL-1 β介導的病症中的潛在功效，將IL-1 β腹膜內給藥至雌性Balb/c小鼠(約8週齡，Charles River Laboratories，德國)並檢測本發明化合物對IL-1 β介導的細胞因子分泌的影響。每組有5隻動物。對照組是使用溶解物質及IL-1 β的媒劑進行處理。物質處理組及陽性對照組各腹膜內注射90微克IL-1 β/公斤體重(R&D，目錄編號401-ML/CF)。在施用IL-1 β前6小時給予陽性對照組物質或媒劑。在給予IL-1 β後2小時，根據製造商的說明書，使用Mouse ProInflammatory 7-Plex Tissue Culture Kit(MSD，目錄編號K15012B)測定從血液分離的血漿中的TNF-α。投予IL-1 β導致TNF-α血漿濃度升高，其經由使用實例化合物11及12處理而被抑制。這由圖4說明。

體內佐劑誘導的關節炎模式

為了確定本發明通式(I)化合物的抗發炎活性，在關節炎模式中檢測其體內功效。為此目的，在第0天皮下滴入尾巴，分別給予雄性Lewis大鼠(約100-125克，Charles River Laboratories，德國)溶解在不完全弗氏(Freund's)佐劑[Difco Lab，目錄編號-263910])中的100微升完全弗氏佐劑(CFA)溶液(結核分枝桿菌H37Ra[Difo Lab，目錄編號-231141])。每組n=8隻。健康對照組及疾病控制組均納入研究。每個對照組僅用測試物質的媒劑口服處理。以預防方式，也就是從第0天開始經由口服給藥，以不同劑量的測試物質進行處理。在第0天，根據疾病活動評分(基於點系統的關節炎嚴重程度評估)另外確定動物的起始條件。根據兩隻後爪關節發炎擴展的程度，從0至4的出現紅斑包括關節腫脹來評價(0=無；1=輕度；2=中度；3=明顯；4=嚴重)並加總起來。為了確定化合物的抗發炎功效，從第8天開始，當動物首先顯示關節炎的跡象，隨後每週3次，直到結束時，經由疾病活動評分評分動物的疾病活性直到結束(第20天)。使用單因素變異分析(ANOVA)進行統計分析，並經由多項比較分析(Dunnett檢驗)與對照組進行比較。

大鼠皮下注射CFA給藥導致大鼠具有明顯關節發炎的急性關節炎。該誘發的關節炎可以經由使用實例化合物11處理而抑制。此由圖5說明。

體內膠原抗體誘導的小鼠關節炎模式

在另一個老鼠關節炎模式中檢測本發明通式(I)化合物的抗發炎效應。為此目的，將雌性Balb/c小鼠(約9週齡，Charles River Laboratories,Kingston,Canada)在第0天各靜脈內注射200微升膠原蛋白抗體混合物(10毫克/毫升；ArthritoMab，MD Bioproducts)進入尾靜脈(研究中包括的健康對照組除外)。在第6天，這些小鼠然後分別接受腹膜內注射200微升的LPS。每組有n=10隻小鼠。健康對照組及疾病控制組均納入研究。每個對照組僅 用測試物質的媒劑口服處理。以預防方式，也就是從第0天開始經由口服給藥，以不同劑量的測試物質進行處理。在實驗過程中，根據所有四隻爪子的疾病活動得分的點數制度，對疾病的程度進行評分。在這個積點中，健康的爪子沒有得分，而從1[輕度發炎，例如腳趾]到4[在整個爪子上發生嚴重發炎]的點被授予每種情況，用於從腳趾經由蹠骨關節到腳踝關節發生的關節發炎的特定程度，如下所述：

●0=正常

●1=紅斑及輕度腫脹局限於跗骨或腳踝或腳趾

●2=從腳踝延伸到蹠骨的紅斑及輕度腫脹(2段)

●3=從腳踝關節延伸至蹠骨關節的紅斑及中度腫脹

●4=紅斑和嚴重腫脹，包括蹠骨、腳及腳趾

對於此參數，起始條件是在實驗開始前一天(第-1天)確定的，並且該疾病活動評分隨後從第8天開始每週評分3次。使用單因素變異分析(ANOVA)進行統計分析，並經由多項比較分析(Dunnett檢驗)與對照組進行比較。

小鼠皮下注射給藥膠原蛋白抗體混合物，包括隨後腹腔給藥LPS導致具有明顯關節發炎的急性關節炎。該誘發的關節炎可以經由使用實例化合物12處理而抑制。此由圖6說明。

體內NASH小鼠模式

為了實驗性誘發NASH，在45隻雄性2日齡C57BL/6小鼠中皮下注射200微克鏈脲黴素(STZ；Sigma-Aldrich,USA)。從4週齡開始，這些動物隨意地以高脂肪飲食(HFD；57kcal%脂肪，#HFD32來自CLEA,Japan)進食。在6週齡時，將動物隨機分成3組(每組15隻動物)。雖然其中一組未接受任何處理，但其他2組在4週內每天口服給予媒劑或測試物質。在4週的處理後，所有動物在麻醉下無痛處死，肝臟被去除並固定供在Bouin溶液中的組織學研究(H.Denk,"Fixierung histologischer Präparate"[Fixing of Histological Preparations],in：P.Böck(ed.)："Romeis Mikroskopische Technik"[Romei's Microscopy Techniques],Urban & Schwarzenberg,Munich-Vienna-Baltimore 1989,17th edition,page 97,ISBN 3-541-11227-1)。 隨後，將肝臟樣品包埋在石蠟中，並製造5微米厚的石蠟切片。每個肝臟的組織切片染色a)用蘇木精-伊紅(HC)用於測定NAFLD活性評分(NAS)，及b)用Picro-Sirius紅(Waldeck,Germany)用於測定肝纖維化。在蘇木精-伊紅切片中測定NAFLD活性評分是根據D.E.Kleiner et al.,Hepatology 41(2005),1313-1321(Table 1)推薦的標準(表1)。於纖維化區域的組織學定量，是在200倍顯微鏡放大下拍取5張數位照片(DFC280；Leica,Germany)，並使用ImageJ Software(National Institute of Health,USA)確定纖維化百分率。

體內db/db小鼠模式

使用30隻雄性8週齡的db/db小鼠。此模式是一種被廣泛接受的肥胖、胰島素抵抗及第2型糖尿病模式(Aileen JF King；The use of animal models in diabetes research；British Journal of Pharmacology 166(2012),877-894)。在實驗過程中，動物接受標準飲食(RM1(E)801492,SDS)和自由飲水。將動物隨機分成3組(每組10隻動物)，並在6週內用測試物質口服處理。在研究期間，在不同時間點(治療開始前3週、治療開始3週、治療結束前2天)從動物取血，測定胰島素敏感性參數(如HbA1c、葡萄糖含量、胰島素含量)。此外，作為用於測定胰島素敏感性參數的OGTT(口服葡萄糖耐受試驗)在開始治療前1天及治療結束後2天進行。此外，計算HOMA-IR指數(空腹胰島素水平(mU/升)*空腹血糖水平(毫莫耳/升)/22.5)。

體內B細胞淋巴瘤相關的異種移植模式

在鼠異種移植模式中研究本發明通式(I)化合物的抗腫瘤活性。為此目的，將雌性C.B-17 SCID小鼠皮下植入人類B細胞淋巴瘤細胞系，例如，TMD-8。在平均腫瘤大小為20-30平方毫米的情況下，開始使用本發明化合物口服單醫療處理，或經由給予本發明化合物與標準醫療組合，各自口服給藥。然而，動物是事先隨機化。只要未治療的對照組有大腫瘤，就結束治療。腫瘤大小及體重每週測定三次。體重減少是治療相關毒性的衡量標準(>10%=關鍵，治療停止直到恢復，>20%=有毒，終止)。經由電子測徑儀[長度(毫米)×寬度(毫米)]檢測腫瘤區域。在研究結束時，也測定腫瘤重 量。抗腫瘤功效定義治療組與對照組的腫瘤重量比(T/C)[治療組第x天腫瘤重量/對照組第x天腫瘤重量]或治療組與對照組的腫瘤面積比[治療組在第x天的腫瘤面積/對照組在第x天的腫瘤面積]。具有T/C大於0.5的化合物定義為活性(有效)。使用單因素變異分析(ANOVA)進行統計分析，並經由多項比較分析(Dunnett檢驗)與對照組進行比較。

犬IRAK4激酶測定

本發明化合物對犬IRAK4的IRAK4抑制活性是在下文描述的Irak4 TR-FRET測定法(TR-FRET=時間解析螢光共振能量轉移)中測量。

表現在桿狀病毒感染的昆蟲細胞(Hi5,BTI-TN-5B1-4，購自Invitrogen的細胞系，目錄編號B855-02)並經由親和層析法純化的來自N端HIS(聚組氨酸)及犬Irak4的重組融合蛋白作為酶使用。用於激酶反應的基質是生物素化的肽生物素-Ahx-KKARFSRFAGSSPSQASFAEPG(在醯胺形式的C-末端)，其是購自例如Biosyntan GmbH(Berlin-Buch)。對於該測定，從測試物質在DMSO中的2毫莫耳濃度溶液製備從20微莫耳濃度至0.073毫微莫耳濃度範圍的11種不同濃度。將50毫微升各溶液移液到黑色小容量384孔微量滴定板(GreinerBio-One,Frickenhausen,Germany)中，加入Irak4在測定緩衝液中的2微升溶液[50毫莫耳濃度HEPES pH 7.5、5毫莫耳濃度MgCl₂、1.0毫莫耳濃度二硫蘇糖醇、30微莫耳濃度活化的原釩酸鈉、0.1%(w/v)牛γ-球蛋白(BGG)0.04%(v/v)諾乃洗滌劑-P40(Sigma)]並將混合物溫育15分鐘使物質在激酶反應之前預先與酶結合。然後經由加入三磷酸腺苷(ATP，1.67毫莫耳濃度=在5微升測定體積中的最終濃度：1毫莫耳濃度)及肽基質(0.83微莫耳濃度=在5微升測定體積中的最終濃度：0.5微莫耳濃度)在測定緩衝液中的3微升溶液而開始激酶反應，並將所得的混合物在22℃溫育45分鐘的反應時間。將Irak4的濃度調整至酶的各活性，並將其設定為在線性範圍內進行測定。典型的濃度約為0.1毫微莫耳濃度。經由加入TR-FRET檢測試劑[0.1微莫耳濃度鏈親和素-XL665(Cisbio Bioassays；France，目錄編號610SAXLG)]及1.5毫微莫耳濃度抗磷酸絲氨酸抗體Merck Millipore,"STK Antibody"，目錄編號35-002]及0.6毫微莫耳濃度LANCE EU-W1024- 標記的抗小鼠IgG抗體(Perkin-Elmer，產品編號AD0077；或者是，可以使用從Cisbio Bioassays的铽穴體標記的抗小鼠IgG抗體)在EDTA水溶液(100毫微莫耳濃度EDTA,0.4%[w/v]牛血清白蛋白[BSA]在25毫微莫耳濃度HEPES pH 7.5)中的5微升溶液而停止反應。

將所得的混合物在22℃下溫育1小時以形成生物素化磷酸化的基質及檢測試劑的複合物。然後經由測量從銪螯合物標記的抗小鼠-IgG抗體對鏈黴親和素-IX665的共振能量轉移來評估磷酸化基質的量。為此，在TR-FRET測量儀器例如Rubystar(BMG Labtechnologies,Offenburg,Germany)或者Viewlux(Perkin-Elmer)中在350毫微米激發後測量在620毫微米及665毫微米處的螢光發射。將665毫微米和622毫微米處的發射比作為磷酸化基質量的量度。將數據歸一化(不含測試物質的酶反應=0%抑制；不含酶的所有其他測定組分=100%抑制)。通常，測試物質是在從20微莫耳濃度至0.073毫微莫耳濃度範圍內的11種不同濃度在相同的微量滴定板上測試(20微莫耳濃度、5.7微莫耳濃度、1.6微莫耳濃度、0.47微莫耳濃度、0.13微莫耳濃度、38毫微莫耳濃度、11毫微莫耳濃度、3.1毫微莫耳濃度、0.89毫微莫耳濃度、0.25毫微莫耳濃度及0.073毫微莫耳濃度)。稀釋系列在測定之前(在100%DMSO中為2毫莫耳濃度至7.3毫微莫耳濃度)經由連續稀釋製備。經由4-參數擬合計算IC₅₀值。

體外脂多醣(LPS)誘導的經由犬外周血液單核細胞(PBMCs)的細胞因子生成

檢測本發明通式(I)化合物對在犬PBMCs中誘導的細胞因子產生的影響。細胞因子的產生在此是經由LPS誘導，LPS是TLR4配體，其導致激活IRAK4介導的信號通路。

犬PBMCs是從抗凝血的狗全血中獲得。為此目的，從15毫升狗血經由在4℃以400g離心15分鐘，收穫後將犬PBMCs白膜層懸浮在血漿中，製備富含白細胞的血漿。將7毫升Ficoll-Paque Plus(Fischer Scientific，目錄編號11778538)移液到離心管中，並將7毫升富含白細胞的血漿層疊在Ficoll-Paque Plus的頂部。在4℃以400g離心20分鐘後，從犬血漿及Ficoll-Paque Plus的界面收穫犬PBMCs。將PBMCs轉移到新的離心管中，並用不含Ca²⁺/Mg²⁺的Hanks’Balanced Salt Solution 1x(HBSS)(Sigma-Aldrich，目錄編號H9394)調整。將細胞懸浮液在4℃以400g離心5分鐘並將上清液丟棄。然後將細胞丸粒重新懸浮在0.2%低滲鹽水中以裂解任何殘留的紅血球細胞。經30秒後，使細胞懸浮液等滲，並在4℃以400g離心5分鐘。然後將細胞丸粒重新懸浮於不含Ca²⁺/Mg²⁺的HBSS中用於最後洗滌，並在4℃以400g離心5分鐘。然後將PBMCs重新懸浮於完全培養基(RPMI 1640含GlutaMAX(Sigma-Aldrich，目錄編號R0883),10% FCS；50U/毫升青黴素、50微克/毫升鏈黴素(Sigma-Aldrich，目錄編號P4333))中。

該測定也在完全培養基中進行。將PBMCs以2.5×10⁵個細胞/孔的細胞密度接種在96孔板中。將本發明化合物在DMSO中溶解並在完全培養基中進行連續稀釋。化合物實例是在從3毫微莫耳濃度至10微莫耳濃度的範圍內的8個不同濃度在測定中使用，使得最終DMSO濃度為0.0003-0.4%。為了誘導細胞因子分泌，用0.1微克/毫升的LPS(Sigma-Aldrich,Escherichia coli 0111：B4，目錄編號L3024)刺激細胞24小時。使用0.2%台盼藍(Sigma-Aldrich，目錄編號T8154)測定細胞活力。根據製造商的說明書，使用犬TNF α DuoSet Elisa(R&D Systems，目錄編號DY1507)測定細胞培養上 清液中分泌的TNF-α的量。作為實例，實例化合物12抑制使用LPS刺激經由犬PBMCs產生TNF α。此由圖7說明。

體外脂多醣(LPS)誘導的經由牛外周血液單核細胞(PBMCs)的細胞因子產生

研究本發明通式(I)化合物對在牛PBMCs中誘導的細胞因子產生的影響。細胞因子的產生在此是經由LPS誘導，LPS是TLR4配體，其導致激活IRAK4介導的信號通路。

牛PBMCs是從抗凝血的牛全血中獲得。為此，從500毫升牛血經由在室溫(RT)以1000g離心20分鐘，收穫後將牛PBMCs白膜層懸浮在等體積的PBS/5毫莫耳濃度EDTA(RT)中，製備富含牛白細胞的血漿。將30毫升Ficoll-Paque Plus(Fischer Scientific，目錄編號11778538)移液到Leucosep管中，並將30毫升牛PBMCs白膜層/PBS/EDTA混合物層疊在Ficoll-Paque Plus的頂部。在室溫下以800g將管離心25分鐘後，從牛血漿及Ficoll-Paque Plus的界面收穫牛PBMCs。將PBMCs轉移到新的離心管中，並用冷的PBS/5毫莫耳濃度EDTA調整。將細胞懸浮液在4℃以350g離心10分鐘並將上清液丟棄。然後將細胞丸粒重新懸浮在0.2%低滲鹽水中以裂解任何殘留的紅血球細胞。經30秒後，使細胞懸浮液等滲，並在4℃以500g離心5分鐘。然後將PBMCs細胞丸粒重新懸浮於完全培養基(DMEM含GlutaMAX(ThermoFisher，目錄編號2430100)、10%馬血清(ATCC® 30-2040^TM)、20微莫耳濃度β-巰基乙醇(ThermoFisher，目錄編號31350010[儲備溶液：50毫莫耳濃度])中。

此測定也在完全培養基中進行。將PBMCs以1×10⁶個細胞/孔的細胞密度接種在24孔板中。將本發明化合物溶解在DMSO中並在完全培養基中進行系列稀釋。化合物實例是在從0.003微莫耳濃度至10微莫耳濃度範圍內的8種不同濃度在測定中使用，使得最終的DMSO濃度是0.5%。為了誘導細胞因子分泌，用1微克/毫升(圖8)及0.1微克/毫升LPS(圖9)(來自大腸桿菌K12；Invivogen # tlrl-eklps的LPS)刺激細胞24小時。使用Türk溶液(Merck Millipore # 1092770100)測定細胞活力。

在LPS暴露的牛PBMCs的細胞培養上清液中分泌的TNF α量，是用兔子抗牛TNF α抗體基於ELISA的方法測定。ELISA測定是在384孔ELISA板中進行，其經塗覆5微克/毫升的兔子抗牛TNF α抗體(BioRad,AHP2383)並在10微升/孔的50毫莫耳濃度Na₂CO₃/NaHCO₃ pH 9.6緩衝液中在4℃下放置過夜。

移除抗體後並用50微升洗滌緩衝液(PBS,0.05%(v/v)Tween 20)沖洗孔三次，將孔在37℃用40微升阻滯緩衝液(PBS,0.05%(v/v)Tween 20,1%(w/v)牛血清白蛋白)溫育90分鐘。隨後，移除阻滯緩衝液，加入培養上清液樣品(20微升/孔)。在37℃溫育90分鐘後，取出樣品並用50微升洗滌緩衝液沖洗孔3次。將在阻滯緩衝液中的1微克/毫升兔子抗牛TNF α-生物素共軛抗體(BioRad,AHP2383B)添加至板中(20微升/孔)並在37℃溫育60分鐘。移除生物素化抗體後，用50微升洗滌緩衝液沖洗孔3次，在37℃下加入20微升/孔在阻滯緩衝液中稀釋的ExtrAvidin^TM鹼性磷酸酶(Sigma,E2636),1：10.000經1小時。移除ExtrAvidin^TM鹼性磷酸酶後，用50微升洗滌緩衝液沖洗孔3次，經由加入50微升/孔的顯影緩衝液(5毫莫耳濃度對硝基苯基磷酸酯(pNPP)在50毫莫耳濃度Na₂CO₃/NaHCO₃ pH 9.6、2毫莫耳濃度MgCl₂中)開始酶促反應/顏色發展。在405毫微米波長處記錄光密度。對於動力學測量，每5分鐘記錄數據點歷經1小時，在2小時後進行終點測量。作為實例，實例化合物12抑制經由用LPS刺激牛PBMCs的TNF α產生。此由圖8和9說明。

體外脂多醣(LPS)誘導的豬外周血液單核細胞(PBMCs)的細胞因子產生

作為另一個實例，檢測本發明通式(I)化合物對在豬PBMCs中誘導的細胞因子產生的影響。細胞因子的產生在此是經由LPS誘導，LPS是TLR4配體，其導致激活IRAK4介導的信號通路。

豬PBMCs是從抗凝血的豬全血中獲得。為此，從36毫升豬血經由在室溫(RT)以1000g離心20分鐘，收穫後將豬PBMCs白膜層懸浮在等體積的PBS/5毫莫耳濃度EDTA(RT)中，製備富含豬白細胞的血漿。將30毫升Ficoll-Paque Plus(Fischer Scientific，目錄編號11778538)移液到Leucosep 管中，並將30毫升豬PBMCs白膜層/PBS/EDTA混合物層疊在Ficoll-Paque Plus的頂部。在室溫下以800g將管離心25分鐘後，從豬血漿及Ficoll-Paque Plus的界面收穫豬PBMCs。將PBMCs轉移到新的離心管中，並用冷的PBS/5毫莫耳濃度EDTA調整。將細胞懸浮液在4℃以350g離心10分鐘並將上清液丟棄。然後將細胞丸粒重新懸浮在0.2%低滲鹽水中以裂解任何殘留的紅血球細胞。經30秒後，使細胞懸浮液等滲，並在4℃以500g離心5分鐘。然後將PBMCs細胞丸粒重新懸浮於完全培養基(DMEM含GlutaMAX(ThermoFisher，目錄編號2430100)、10%馬血清(ATCC® 30-2040^TM)、20微莫耳濃度β-巰基乙醇(ThermoFisher，目錄編號31350010[儲備溶液：50毫莫耳濃度])中。

此測定也在完全培養基中進行。將PBMCs以1×10⁶個細胞/孔的細胞密度接種在24孔板中。將本發明化合物溶解在DMSO中並在完全培養基中進行系列稀釋。化合物實例是在從0.003微莫耳濃度至10微莫耳濃度範圍內的8種不同濃度在測定中使用，使得最終的DMSO濃度是0.5%。為了誘導細胞因子分泌，用0.01至1毫微克/毫升濃度範圍的LPS(來自大腸桿菌K12；Invivogen # tlrl-eklps的LPS)刺激細胞24小時。使用Türk溶液(Merck Millipore # 1092770100)測定細胞活力。

在LPS暴露的豬PBMCs的細胞培養上清液中分泌的TNF α量，是用兔子抗豬TNF α抗體基於ELISA的方法測定。ELISA測定是在384孔ELISA板中進行，其經塗覆5微克/毫升的兔子抗豬TNF α抗體(BioRad,AHP2397)並在10微升/孔的50毫莫耳濃度Na₂CO₃/NaHCO₃ pH 9.6緩衝液中在4℃下放置48小時。

移除抗體後並用50微升洗滌緩衝液(PBS,0.05%(v/v)Tween 20)沖洗孔三次，將孔在37℃用40微升阻滯緩衝液(PBS,0.05%(v/v)Tween 20,1%(w/v)牛血清白蛋白)溫育60分鐘。隨後，移除阻滯緩衝液，加入培養上清液樣品(20微升/孔)。在37℃溫育90分鐘後，取出樣品並用50微升洗滌緩衝液沖洗孔3次。將在阻滯緩衝液中的1微克/毫升兔子抗豬TNF α-生物素共軛抗體(BioRad,AHP2397B)添加至板中(20微升/孔)並在37℃溫育60分鐘。移除生物素化抗體後，用50微升洗滌緩衝液沖洗孔3次，在37℃下加 入20微升/孔在阻滯緩衝液中稀釋的ExtrAvidin^TM鹼性磷酸酶(Sigma,E2636),1：10.000經1小時。移除ExtrAvidinT^M鹼性磷酸酶後，用50微升洗滌緩衝液沖洗孔3次，經由加入90微升/孔的顯影緩衝液(5毫莫耳濃度對硝基苯基磷酸酯(pNPP)在50毫莫耳濃度Na₂CO₃/NaHCO₃ pH 9.6、2毫莫耳濃度MgCl₂中)開始酶促反應/顏色發展。在405毫微米波長處記錄光密度。對於動力學測量，每5分鐘記錄數據點歷經1小時，在2小時後進行終點測量。作為實例，10微莫耳濃度的實例化合物12抑制經由用0.1毫微克/毫升的LPS刺激豬PBMCs的TNF α產生。此由圖10說明。

房屋塵蟎誘發犬過敏性皮膚炎的體內模式

使用房塵蟎(HDM)敏感化的Beagle犬模式，評估本發明通式(I)化合物的潛在抗過敏/抗發炎功效。其中，HDM敏化包括在約兩週的時間間隔的一系列皮下注射HDM抗原(10微克，Greer Laboratories,Lenoir,NC,USA)及Alhydrogel®(0.2毫升，InvivoGen,San Diego,CA 921221,USA)作為輔助劑。經由皮內皮膚測試監測並確認致敏過程。一旦犬對HDM皮膚皮內測試呈陽性時，除了最後一次致敏之外的一個月，將HDM抗原(135微克)局部施用並刺入成年比格犬後腿的皮膚內部(使用2毫米長的微針)並測定本發明化合物對過敏性皮膚炎徵象的影響，例如紅斑及水腫。共有2組，每組4隻：1個安慰劑對照組及1個用實例化合物12處理的組。對照組用含有微纖維素的明膠膠囊口服處理，而用實例化合物12處理的組是口服處理含有實例化合物12及微纖維素的明膠膠囊。用HDM抗原攻擊前5天開始施用實例化合物12或安慰劑，並持續至挑戰後2天。處理頻率為每日一次，在實例化合物12的情況下，劑量為10毫克/公斤體重。在挑戰後30分鐘及48小時的不同時間點，使用VAS(視覺模擬量表(Visual Analogue Scale))評估2組的紅斑及水腫。分析血漿樣品以測定化合物暴露與臨床評估的關係。用實例化合物12處理後，水腫及紅斑顯著減少。這由表4及5以及圖11及12說明。

蚤過敏性皮膚炎的體內瘙癢模式

使用了蚤過敏性皮膚炎模式(FAD)，評估本發明通式(I)化合物的抗瘙癢效應。只有具有FAD病史的成年犬才參加研究。研究的壽命期分為兩個階段：瘙癢誘導期(2週)，接著是治療階段(2週)。在兩個研究階段，每週兩次都會使狗感染櫛頭蚤(Ctenocephalides)跳蚤(首先挑戰100隻跳蚤/狗，隨後都挑戰30隻跳蚤/狗)。共有2組每組12隻動物：1個安慰劑對照組及1個 用實例化合物12處理的組。對照組用含有微纖維素的明膠膠囊口服處理，而用實例化合物12處理的組是口服處理含有實例化合物12及微纖維素的明膠膠囊。處理頻率為每天一次，在實例化合物12的情況下，劑量為20毫克/公斤體重。在處理後1天開始且在每三天記錄狗4小時，並且以秒計算用在刮、舔、咬的時間作為測定用在瘙癢行為的時間。分析血漿樣品以測定化合物暴露與臨床評估的關係。用實例化合物12處理10後，瘙癢症顯著減少。這由表6以及圖13說明。

Claims (15)

1. 一種下式化合物或其非對掌異構體、對掌異構體、代謝體或鹽用於製備治療及/或預防狗中的過敏性皮膚炎的藥物之用途，

   

   包含將該化合物以口服方式施用予該狗。
2. 如請求項1之用途，其中該過敏性皮膚炎係異位性皮膚炎。
3. 如請求項1之用途，其中該過敏性皮膚炎係跳蚤過敏性皮膚炎。
4. 如請求項2之用途，其中該化合物或醫藥上可接受之鹽係以10至20mg每公斤體重之每日劑量投予該狗。
5. 如請求項3之用途，其中該化合物或醫藥上可接受之鹽係以約10mg每公斤體重之劑量以口服方式投予該狗。
6. 如請求項4之用途，其中該化合物係以約20mg每公斤體重之劑量以口服方式投予該狗。
7. 如請求項6之用途，其中該化合物或醫藥上可接受之鹽係以錠劑或膠囊形式以口服方式投予該狗，該錠劑或膠囊包含惰性、無毒、醫藥上市和支賦形劑。
8. 如請求項1之用途，其中該過敏性皮膚炎係異位性皮膚炎或跳蚤過敏性皮膚炎。
9. 如請求項1之用途，其係治療。
10. 如請求項4之用途，其係治療。
11. 如請求項5之用途，其係治療。
12. 如請求項9之用途，其中該化合物係醫藥上可接受之鹽。
13. 如請求項10之用途，其中該化合物係醫藥上可接受之鹽。
14. 如請求項11之用途，其中該化合物係醫藥上可接受之鹽。
15. 一種下式化合物或其非醫藥上可接受之鹽用於製備治療狗中的過敏性皮 膚炎的藥物之用途，

    

    其中該化合物係以錠劑或膠囊投予，該錠劑或膠囊包含遞送10至20mg每公斤體重之劑量的該化合物的量。

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