在本發明之上下文中，除非另外指定，否則取代基具有以下含義：
烷基
在本發明之上下文中表示具有指定具體碳原子數之直鏈或具支鏈烷基。實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、第三丁基、正戊基、1-乙基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基及2-乙基丁基。較佳者係甲基、乙基、正丙基、正丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基及2,2-二甲基丙基。
環烷基
在本發明之上下文中係具有在每一情形下指定之碳原子數之單環飽和烷基。較佳實例包括環丙基、環丁基、環戊基及環己基。
烷氧基
在本發明之上下文中表示具有指定具體碳原子數之直鏈或具支鏈烷氧基。1至6個碳原子較佳。實例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、1-甲基丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第三丁氧基、正戊氧基、異戊氧基、1-乙基丙氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲基丁氧基及正己氧基。尤佳者係具有1至4個碳原子之直鏈或具支鏈烷氧基。可提及為較佳之實例係甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基丙氧基、正丁氧基及異丁氧基。
鹵素
在本發明之上下文中係氟、氯及溴。較佳者係氟。
羥基
在本發明之上下文中係OH。
單環飽和雜環
係具有4至6個環原子且含有來自O、S、SO及SO
2
之群之雜原子或雜基的單環飽和雜環。具有來自O、SO及SO
2
之群之雜原子或雜基之雜環較佳。實例包括：氧雜環丁烷、四氫呋喃、四氫-2H-吡喃-4-基、1,1-二氧離子基四氫-2H-噻喃-3-基、1,1-二氧離子基四氫-2H-噻喃-2-基、1,1-二氧離子基四氫-2H-噻喃-4-基、1,1-二氧離子基四氫噻吩-3-基、1,1-二氧離子基四氫噻吩-2-基、1,1-二氧離子基硫雜環丁-2-基或1,1-二氧離子基硫雜環丁-3-基。此處之尤佳者係氧雜環丁烷及四氫呋喃。極佳者係氧雜環丁-3-基。 鍵處之符號*表示分子中之鍵結位點。 除非另外指定，否則當通式(I)化合物中之基團經取代時，該等基團可經單取代或多取代。在本發明之上下文中，出現一次以上之所有基團皆彼此獨立地定義。經一個、兩個或三個相同或不同取代基取代較佳。 R
1
之較佳實施例係經1個、2個或3個氟原子取代之C
2
-C
6
-烷基。尤佳者係2,2,2-三氟乙基、3,3,3-三氟丙基及4,4,4-三氟丁基。極佳者係4,4,4-三氟丁基。 R
1
之另一較佳實施例係經一或兩個羥基或一個C
1
-C
3
-烷氧基或三氟取代之C
1
-C
3
-烷氧基取代之C
2
-C
6
-烷基。尤佳者係經羥基或C
1
-C
3
-烷氧基或三氟甲氧基或2,2,2-三氟乙氧基取代之C
2
-C
5
-烷基。極佳者係3-羥基-3-甲基丁基、3-甲氧基丙基、3-羥基丙基、3-三氟甲氧基丙基、2-甲氧基乙基或2-羥基乙基。尤佳者係3-羥基-3-甲基丁基。 進一步較佳地，R
1
係經C
1
-C
6
-烷基-SO
2
基團取代之C
2
-C
6
-烷基。甲基-SO
2
-取代之C
2
-C
4
-烷基尤佳。R
1
之尤佳者係2-(甲基磺醯基)乙基或3-(甲基磺醯基)丙基。根據後一基團，2-(甲基磺醯基)乙基尤佳。 另外較佳地，R
1
係經以下基團取代之C
1
-C
3
-烷基：氧雜環丁基、四氫呋喃基、四氫-2H-吡喃-4-基、1,1-二氧離子基四氫-2H-噻喃-3-基、1,1-二氧離子基四氫-2H-噻喃-2-基、1,1-二氧離子基四氫-2H-噻喃-4-基、1,1-二氧離子基四氫噻吩-3-基、1,1-二氧離子基四氫噻吩-2-基、1,1-二氧離子基硫雜環丁-2-基或1,1-二氧離子基硫雜環丁-3-基。尤佳者係經氧雜環丁烷基取代之C
1
-C
3
-烷基。R
1
之尤佳者係氧雜環丁-3-基甲基。 對於總是具有相同定義之R
2
及R
3
，氫或甲基較佳。甲基尤佳。 在R
4
之情形下，較佳者係未經取代或單或多鹵素取代之C
1
-C
3
-烷基或經一個羥基取代之C
1
-C
3
-烷基或經一個羥基及三個氟原子取代之C
1
-C
3
-烷基。 對於R
4
，尤佳者係以下基團：甲基、乙基、三氟-C
1
-C
3
-烷基、二氟-C
1
-C
3
-烷基、羥基甲基、1-羥基乙基、2-羥基丙-2-基及2,2,2-三氟-1-羥基乙基。對於R
4
，尤佳者係甲基、三氟甲基及二氟甲基。此處之尤佳者係三氟甲基。 R
5
之較佳實施例係氫、氟、氯或C
1
-C
3
-烷基。更佳地，R
5
係氫、氟或甲基。最佳地，R
5
係氫或氟。 尤佳者亦為R
4
係甲基或三氟甲基且R
5
係氟之化合物。極佳者係R
4
係甲基且R
5
係氟、其中R
5
處於R
4
之鄰位之化合物。 對於R
6
，較佳實施例包括氧雜環丁基、四氫呋喃基、四氫-2H-吡喃-4-基、1,1-二氧離子基四氫-2H-噻喃-3-基、1,1-二氧離子基四氫-2H-噻喃-2-基、1,1-二氧離子基四氫-2H-噻喃-4-基、1,1-二氧離子基四氫噻吩-3-基、1,1-二氧離子基四氫噻吩-2-基、1,1-二氧離子基硫雜環丁-2-基或1,1-二氧離子基硫雜環丁-3-基。此處之尤佳者係氧雜環丁基。極佳者係氧雜環丁-3-基。 R
7
排他性地連接至官能基-SO
2
-及-SO-，即係R
7
取代之-SO
2
-或SO基團。就此而言，R
7
較佳係C
1
-C
4
-烷基，其中C
1
-C
4
-烷基未經取代或經羥基或經環丙基單取代或經三個氟原子取代。R
7
之另外較佳者係環丙基。R
7
之尤佳者係甲基、乙基或羥基乙基。R
7
之極佳者係甲基。 此意指在經R
7
SO
2
-或R
7
SO-取代之C
1
-C
6
-烷基之情形下，在R
1
之背景下，較佳者係經C
1
-C
6
-烷基-SO
2
或C
1
-C
6
-烷基-SO取代之C
1
-C
6
-烷基。對於R
1
，此處之較佳者尤其係甲基磺醯基乙基及甲基磺醯基丙基。極佳者係甲基磺醯基乙基。 對於R
8
，較佳者係未經取代之C
1
-C
4
-烷基或三氟取代之C
1
-C
4
-烷基。尤佳者係甲基、乙基、三氟甲基或2,2,2-三氟乙基。極佳者係甲基、三氟甲基或2,2,2-三氟乙基。 較佳者係式(I)化合物，其中 R
1
係C
1
-C
6
-烷基，其中C
1
-C
6
-烷基未經取代或相同或不同地經氟、羥基或R
6
、R
7
SO
2
、R
7
SO或R
8
O基團單取代或多取代； R
2
及R
3
總是具有相同定義且皆為氫或C
1
-C
3
-烷基； R
4
係鹵素、氰基或C
1
-C
3
-烷基，其中C
1
-C
3
-烷基未經取代或相同或不同地經鹵素或羥基單取代或多取代； R
5
係氫、氟、氯或C
1
-C
3
-烷基； R
6
係氧雜環丁基或四氫呋喃基； R
7
係C
1
-C
4
-烷基，其中C
1
-C
4
-烷基未經取代或經羥基或經環丙基單取代或經三個氟原子取代； R
8
係未經取代之C
1
-C
4
-烷基或三氟取代之C
1
-C
4
-烷基； 及其非鏡像異構物、鏡像異構物、代謝物、鹽、溶劑合物或該等鹽之溶劑合物之用途，其用於治療及/或預防由IRAK4介導之自體免疫病症，尤其用於治療及預防多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、關節炎(牛皮癬關節炎
、
別赫捷列夫氏病、類風濕性關節炎、反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎)、慢性發炎性腸病(克隆氏病、潰瘍性結腸炎)、異位性皮膚炎及過敏性濕疹。 較佳者另外係式(I)化合物，其中 R
1
係C
2
-C
6
-烷基，其中C
2
-C
6
-烷基未經取代，或 C
2
-C
6
-烷基經單氟、二氟或三氟取代，或 C
2
-C
6
-烷基經羥基、R
6
、R
7
SO
2
或R
8
O單取代， 或其中R
1
係氧雜環丁基取代之C
1
-C
3
-烷基； R
2
及R
3
總是具有相同定義且皆為氫或甲基； R
4
係未經取代或單或多鹵素取代之C
1
-C
3
-烷基或經一個羥基取代之C
1
-C
3
-烷基或經一個羥基及三個氟原子取代之C
1
-C
3
-烷基； R
5
係氫、氟或C
1
-C
3
-烷基； R
7
係C
1
-C
3
烷基； R
8
係C
1
-C
4
-烷基，其中C
1
-C
4
-烷基未經取代或經單氟、二氟或三氟取代； 及其非鏡像異構物、鏡像異構物、代謝物、鹽、溶劑合物或該等鹽之溶劑合物之用途，其用於治療及/或預防由IRAK4介導之自體免疫病症，尤其用於治療及預防多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、關節炎(牛皮癬關節炎、別赫捷列夫氏病、類風濕性關節炎、反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎)、慢性發炎性腸病(克隆氏病、潰瘍性結腸炎)、異位性皮膚炎及過敏性濕疹。 尤佳者亦係通式(I)化合物，其中 R
1
係C
2
-C
5
-烷基，其經羥基或C
1
-C
3
-烷氧基或三氟甲氧基或2,2,2-三氟乙氧基或三氟甲基取代，或 係甲基-SO
2
-取代之C
2
-C
4
-烷基，或 係氧雜環丁-3-基取代之C
1
-C
2
-烷基； R
2
及R
3
總是具有相同定義且皆為氫或甲基； R
4
係甲基、乙基、三氟-C
1
-C
3
-烷基、二氟-C
1
-C
3
-烷基、羥基甲基、1-羥基乙基、2-羥基丙-2-基及2,2,2-三氟-1-羥基乙基，且 R
5
係氫、氟或甲基； 及其非鏡像異構物、鏡像異構物、代謝物、鹽、溶劑合物或該等鹽之溶劑合物之用途，其用於治療及/或預防由IRAK4介導之自體免疫病症，尤其用於治療及預防多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、關節炎(牛皮癬關節炎、別赫捷列夫氏病、類風濕性關節炎、反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎)、慢性發炎性腸病(克隆氏病、潰瘍性結腸炎)、異位性皮膚炎及過敏性濕疹。 極佳者係化合物，其中 R
1
係4,4,4-三氟丁基、3-羥基-3-甲基丁基、3-羥基丁基、3-甲氧基丙基、3-羥基丙基、3-羥基-2-甲基丙基、3-羥基-2,2-二甲基丙基、3-三氟甲氧基丙基、2-甲氧基乙基、2-羥基乙基、2-(甲基磺醯基)乙基或3-(甲基磺醯基)丙基； R
2
及R
3
皆為甲基或氫，且 R
4
係二氟甲基、三氟甲基或甲基，且 R
5
係氫或氟； 及其非鏡像異構物、鏡像異構物、代謝物、鹽、溶劑合物或該等鹽之溶劑合物之用途，其用於治療及/或預防由IRAK4介導之自體免疫病症，尤其用於治療及預防多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、關節炎(牛皮癬關節炎、別赫捷列夫氏病、類風濕性關節炎、反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎)、慢性發炎性腸病(克隆氏病、潰瘍性結腸炎)、異位性皮膚炎及過敏性濕疹。 極佳者亦為化合物，其中 R
1
係3-羥基-3-甲基丁基、3-羥基丁基、3-羥基-2-甲基丙基、3-羥基-2,2-二甲基丙基、3-(甲基磺醯基)丙基或2-(甲基磺醯基)乙基； R
2
及R
3
皆為甲基； R
4
係二氟甲基或三氟甲基；且 R
5
係氫； 及其非鏡像異構物、鏡像異構物、代謝物、鹽、溶劑合物或該等鹽之溶劑合物之用途，其用於治療及/或預防由IRAK4介導之自體免疫病症，尤其用於治療及預防多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、關節炎(牛皮癬關節炎、別赫捷列夫氏病、類風濕性關節炎、反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎)、慢性發炎性腸病(克隆氏病、潰瘍性結腸炎)、異位性皮膚炎及過敏性濕疹。 尤佳者另外亦為化合物，其中 R
1
係3-羥基-3-甲基丁基、3-羥基丁基、3-羥基-2-甲基丙基、3-羥基-2,2-二甲基丙基、3-(甲基磺醯基)丙基或2-(甲基磺醯基)乙基； R
2
及R
3
皆為甲基； R
4
係甲基，且 R
5
係氟，其中R
5
處於R
4
之鄰位； 及其非鏡像異構物、鏡像異構物、代謝物、鹽、溶劑合物或該等鹽之溶劑合物之用途，其用於治療及/或預防由IRAK4介導之自體免疫病症，尤其用於治療及預防多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、關節炎(牛皮癬關節炎、別赫捷列夫氏病、類風濕性關節炎、反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎)、慢性發炎性腸病(克隆氏病、潰瘍性結腸炎)、異位性皮膚炎及過敏性濕疹。 本發明尤其提供以下化合物於治療及/或預防由IRAK4介導之自體免疫病症之用途： 1) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(2-甲氧基乙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 2) N-[6-(羥基甲基)-2-(2-甲氧基乙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 3) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(3-甲氧基丙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 4) N-[6-(羥基甲基)-2-(3-甲氧基丙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 5) N-[2-(2-羥基乙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 6) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(3-羥基丙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 7) N-[2-(2-羥基乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 8) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(氧雜環丁-3-基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 9) N-[6-(羥基甲基)-2-(氧雜環丁-3-基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 10) N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[3-(甲基磺醯基)丙基]-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 11) N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 12) N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[2-(甲基磺醯基)乙基]-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 13) 6-(二氟甲基)-N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺 14) 6-(二氟甲基)-N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[2-(甲基磺醯基)乙基]-2H-吲唑-5-基}吡啶-2-甲醯胺 15) 6-(二氟甲基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(3-羥基丙基)-2H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺 16) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(4,4,4-三氟丁基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 17) N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[3-(三氟甲氧基)丙基]-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 18) N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[3-(2,2,2-三氟乙氧基)丙基]-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺 19) 5-氟-N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-甲基吡啶-2-甲醯胺 20) N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-甲基吡啶-2-甲醯胺 21) 6-(2-羥基丙-2-基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(4,4,4-三氟丁基)-2H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺 22) N-{2-[2-(1-羥基環丙基)乙基]-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺。 本發明進一步提供上文所提及化合物1)至22)之用途，其用於治療及/或預防多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、關節炎(牛皮癬關節炎、別赫捷列夫氏病、類風濕性關節炎、反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎)、慢性發炎性腸病(克隆氏病、潰瘍性結腸炎)、異位性皮膚炎及過敏性濕疹。 本發明進一步提供通式(III)化合物
(III) 其中 R
1
係4,4,4-三氟丁基、3-羥基-3-甲基丁基、3-甲氧基丙基、3-羥基丙基、3-羥基丁基、3-羥基-2-甲基丙基、3-羥基-2,2-二甲基丙基、3-三氟甲氧基丙基、2-甲氧基乙基、2-羥基乙基、2-(甲基磺醯基)乙基、3-(甲基磺醯基)丙基或2-(1-羥基環丙基)乙基； R
4
係二氟甲基、三氟甲基或甲基；且 R
5
係氫或氟； 及其非鏡像異構物、鏡像異構物、代謝物、鹽、溶劑合物或該等鹽之溶劑合物之用途，其用於治療及/或預防由IRAK4介導之自體免疫病症。 本發明之另一實施例係通式(III)化合物之用途，其中R
1
、R
4
及R
5
係如上文所定義，其用於治療及/或預防多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、關節炎(牛皮癬關節炎、別赫捷列夫氏病、類風濕性關節炎、反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎)、慢性發炎性腸病(克隆氏病、潰瘍性結腸炎)、異位性皮膚炎及過敏性濕疹。 本發明之另一同樣實施例係以下通式(III)化合物之用途： 5-{[(5-氟-6-甲基吡啶-2-基)羰基]胺基}-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯，及 2-(3-羥基-3-甲基丁基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯，其用於治療及/或預防由IRAK4介導之自體免疫病症，尤其用於治療及/或預防多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、關節炎(牛皮癬關節炎、別赫捷列夫氏病、類風濕性關節炎、反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎)、慢性發炎性腸病(克隆氏病、潰瘍性結腸炎)、異位性皮膚炎及過敏性濕疹。 通式(III)化合物係介白素-1受體相關激酶-4 (IRAK4)之抑制劑。 通式(I)化合物起IRAK4激酶抑制劑之作用且具有不可預見之有用藥理學活性譜。 因此，除上文所提及之標的物外，本發明亦提供通式(I)化合物於治療及/或預防男性及動物疾病之用途。 尤佳用本發明IRAK4抑制劑治療及/或預防自體免疫病症，例如發炎性神經病症(MS)、發炎性關節病症(各種形式之關節炎)、發炎性皮膚病症(牛皮癬、異位性皮膚炎及過敏性濕疹)、發炎性腸病(IBD)及多器官病症(SLE)。 通式(I)化合物適於預防及/或治療多種病症及疾病相關狀態，尤其由TLR (TLR3除外)及/或IL-1受體家族介導之病症及/或病理直接由IRAK4介導之病症。IRAK4相關病症包括多發性硬化、關節炎(牛皮癬關節炎、類風濕性關節炎、別赫捷列夫氏病、反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎)、痛風、沃格特-小柳-原田症候群、全身性紅斑狼瘡、慢性發炎性腸病(克隆氏病、潰瘍性結腸炎)、牛皮癬、異位性皮膚炎及過敏性濕疹。 通式(I)化合物亦可用於預防及/或治療由MyD88及TLR (TLR3除外)介導之病症。此病症包括多發性硬化、類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎、別赫捷列夫氏病、全身性紅斑狼瘡、骨關節炎、休格倫氏症候群、巨細胞動脈炎、敗血症、多發性肌炎及皮肌炎、皮膚病症(例如牛皮癬、異位性皮膚炎、斑禿、過敏性濕疹、反常性痤瘡及尋常性痤瘡)、慢性發炎性腸病(例如克隆氏病及潰瘍性結腸炎)。 由於本發明通式(I)化合物之作用機制，其適於預防及/或治療TLR介導之病症，例如類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎、別赫捷列夫氏病、牛皮癬、異位性皮膚炎、全身性紅斑狼瘡、貝賽特氏病、痛風。另外，本發明通式(I)化合物適於預防及/或治療多發性硬化、成年發作型史迪爾氏病、過敏性濕疹及慢性發炎性腸病(例如潰瘍性結腸炎及克隆氏病)。 通式(I)化合物亦提供搔癢症及疼痛、尤其急性、慢性、發炎性及神經病性疼痛之預防及/或治療。 此外，通式(I)化合物適於治療及/或預防經由IL-1受體家族介導之病症。該等病症包括CAPS (隱熱蛋白相關週期症候群)，包括FCAS (家族性冷因性自體發炎性症候群)、MWS (穆-韋二氏症候群)、NOMID (新生兒發作型多系統發炎性疾病)及CONCA (慢性嬰兒型、神經、皮膚及關節)症候群、FMF (家族性地中海熱)、HIDS (高IgD症候群)、TRAPS (腫瘤壞死因子受體1相關之週期性症候群)、幼年型特發性關節炎、成年發作型史迪爾氏病、痛風、阿德邁德-貝賽特氏病、類風濕性關節炎、牛皮癬、關節炎、別赫捷列夫氏病、反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎、骨關節炎、乾性角膜結膜炎及休格倫氏症候群、多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、斑禿、1型糖尿病、2型糖尿病及心肌梗塞後遺症。肺病症(例如氣喘、COPD、特發性間質性肺炎及ARDS)、慢性發炎性腸病(例如克隆氏病及潰瘍性結腸炎)與IL-1受體家族失調相關且適於通式(I)化合物之治療及/或預防用途。 通式(I)化合物亦可用於治療及/或預防IL-1受體家族介導之神經病症(例如多發性硬化)及皮膚病學病症(例如牛皮癬、異位性皮膚炎、反常性痤瘡、斑禿及過敏性接觸性皮膚炎)。 另外，通式(I)化合物適於治療及/或預防疼痛病症，尤其急性、慢性、發炎性及神經病性疼痛。此病症較佳包括痛覺過敏、觸摸痛、來自關節炎(例如骨關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、別赫捷列夫氏病及反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎)之疼痛、術後疼痛、由脊髓損傷引起之疼痛、發炎誘發之疼痛、下背痛及慢性疼痛。 本發明亦進一步提供使用有效量之至少一種通式(I)化合物治療及/或預防病症、尤其上文所提及病症之方法。 在本發明之上下文中，術語「治療(treatment或treating)」包括抑制、延遲、遏制、減輕、減弱、限制、減少、阻抑、逐退或治癒疾病、病況、病症、損傷或健康問題，或該等狀態及/或該等狀態之症狀之發生、病程或進展。術語「療法」在此處應理解為與術語「治療」同義。 術語「預防(prevention、prophylaxis)」或「排除」在本發明之上下文中同義使用，且係指避免或降低染上、經歷、罹患或患有疾病、病況、病症、損傷或健康問題或該等狀態及/或該等狀態之症狀之發生或推進的風險。 對於由IRAK4介導之自體免疫病症，出於本發明之目的，「預防(prevention、prophylaxis)」或「排除」應理解為意指在該病症緩解後用於預防再發(復發)之維持療法。此意指可預防或至少延遲新的急性發炎性發作。 「病症之緩解」應理解為意指身體或精神性疾病症狀之暫時或永久停止但不達成永久恢復。 「再發」或「復發」應理解為意指疾病或其症狀在暫時成功地治療後或在自發緩解後重新出現。 可部分或完全地治療或預防疾病、病況、病症、損傷或健康問題。 通式(I)化合物可單獨使用或(若需要)與其他活性成分組合使用。本發明進一步提供含有至少一種通式(I)化合物及一或多種其他活性成分之藥劑，其尤其用於治療及/或預防上文所提及之病症。適於組合之活性成分之較佳實例包括： 一般可提及諸如以下等活性成分：抗細菌物質(例如青黴素(penicillin)、萬古黴素(vancomycin)、環丙沙星、莫匹羅星)、抗病毒物質(例如阿昔洛韋(aciclovir)、奧司他韋(oseltamivir))及抗黴菌物質(例如納提芬(naftifin)、製黴素(nystatin))、γ球蛋白、免疫調節及免疫抑制化合物(例如環孢素)、Methotrexat®、TNF阻斷劑(例如Humira®、依那西普、英利昔單抗、戈利木單抗及聚乙二醇化賽妥珠單抗)、IL-1抑制劑(例如阿那白滯素(anakinra)、卡那單抗(canakinumab)、列洛西普(rilonacept))、磷酸二酯酶抑制劑(例如阿普斯特)、通常Jak/STAT (例如托法替尼、巴瑞替尼(baricitinib)、GLPG0634)、來氟米特、芬戈莫德、特立氟胺、富馬酸二甲酯(例如tecfidera)、IL-6拮抗劑(Actemra、賽瑞蘆單抗(sarilumab))、IL-2抑制劑(例如Stelara)、乙酸格拉替雷(例如Copaxone、Glatopa)、Tysabri、環磷醯胺、利妥昔單抗、貝利木單抗、鈣調神經磷酸酶抑制劑(例如他克莫司)、雷帕黴素(rapamycin)、嗎替麥考酚酯、干擾素(例如betaferon)、皮質類固醇/糖皮質激素(例如普賴松、普賴蘇濃、地塞米松(dexamethasone)、甲基普賴蘇濃、氫化可體松(hydrocortisone)、倍他米松(betamethasone))、環磷醯胺、硫唑嘌呤及磺胺塞拉金；對乙醯胺基酚、抗組織胺(例如氮卓斯汀(azelastine，Allergodil
®
)、羥嗪(hydroxyzine，Atarax
®
)、克雷滿汀(clemastine，Tavegil
®
))、非類固醇抗發炎物質(NSAIDS) (阿斯匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、依託度酸(etodolac)、塞來昔布(celecoxib)、秋水仙鹼(colchicine))。 除上文所提及之彼等外，本發明IRAK4抑制劑亦可與以下活性成分組合： 6-巰嘌呤、ACE抑制劑(例如貝那普利(benazepril))、乙醯膽鹼酯酶抑制劑(例如多奈派齊(donepezil))、血管收縮肽受體阻斷劑(例如氯沙坦(losartan)、纈沙坦(valsartan))、陰離子交換劑(例如考來烯胺(colestyramin)、考來替泊(colestipol)、考來維侖(colesevelam))、抗生素(例如環丙沙星及甲硝唑)、抗CD3抗體、抗副交感神經劑(例如格隆銨(glycopyrronium))、抗糖尿病藥(例如二甲雙胍)、止瀉藥(例如洛哌丁胺)或輕瀉藥(比沙可啶)、抗驚厥藥(例如加巴噴丁(gabapentin))；抗T淋巴球球蛋白/抗淋巴球球蛋白、阿普斯特、硫唑嘌呤、巴利昔單抗、貝利木單抗、β-2擬交感神經藥(例如沙丁胺醇(salbutamol))、β-阻斷劑(例如美托洛爾(metoprolol))、β-干擾素(IFN-β) (例如IFN β-1b、IFN β-1a Avonex®及Betaferon®)、用於B細胞及T細胞療法之生物劑(例如利妥昔單抗、阿巴西普)、鈣調神經磷酸酶抑制劑(例如他克莫司)、鈣通道阻斷劑(例如硝苯地平(nifedipine))、氯喹、可體松、環磷醯胺、環孢素、達克珠單抗(daclizumab)、二羥基蒽酚、利尿劑(例如氫氯噻嗪)、DPP-4 (二肽基肽酶4)抑制劑(例如利拉利汀(linagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、西他列汀(sitagliptin)、維格列汀(vildagliptin))、依折麥布(ezetimib)、他汀(statin) (例如斯伐他汀(simvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin))、纖維酸(例如苯紮貝特(bezafibrate)、依託貝特(etofibrate)、非諾貝特(fenofibrate)、吉非羅齊(gemfibrozil))、芬戈莫德、富馬酸酯(富馬酸二甲酯)、乙酸格拉替雷、格列奈(glinide) (例如那格列奈(nateglinide))、糖皮質激素、尿素、羥基氯喹、IgE抗體、免疫球蛋白、免疫抑制藥物(例如米托蒽醌(mitoxantrone)、硫唑嘌呤及環磷醯胺)、腸促胰島素模擬物(激素葡萄糖依賴性促胰島素性肽(GIP)-及類升糖素肽1 (GLP-1)-類似物/激動劑) (例如艾塞那肽(exenatide)、利拉魯肽(liraglutide)、利西拉肽(lixisenatide))、胰島素敏化劑(例如吡格列酮(pioglitazone))及胰島素療法(例如NPH胰島素、賴脯胰島素)、干擾素、整聯蛋白抗體(例如維多珠單抗、那他珠單抗)、Jak/STAT抑制劑(例如托法替尼、巴瑞替尼、GLPG0634)、含皮質醇製劑、白三烯受體拮抗劑(例如孟魯司特(montelukast))、來氟米特、MAO (單胺基氧化酶)抑制劑(例如司來吉蘭(selegiline))、美沙拉嗪(mesalazine)、胺甲喋呤、甲基黃嘌呤(例如茶鹼(theophylline))、那他珠單抗、菸鹼酸衍生物(例如菸鹼酸/拉羅皮蘭(laropiprant))、PDE-4 (4型磷酸二酯酶)抑制劑(例如羅氟司特(roflumilast))、光療法、益生菌(Mutaflor, VSL#3®、乳桿菌GG、胚芽乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌、嬰兒雙歧桿菌35624、屎腸球菌SF68、長雙歧桿菌、尼氏大腸桿菌1917)、雷帕黴素、類視色素、利妥昔單抗、柳酸、蘇金單抗、SGLT2 (鈉/葡萄糖共轉運蛋白2)抑制劑/格列淨(gliflozin)(例如達格列淨(dapagliflozin)、恩格列淨(empagliflozin))、他汀(例如斯伐他汀、氟伐他汀)、磺胺塞拉金、磺醯脲(例如格列本脲(glibenclamide)、甲苯磺丁脲)、特立氟胺、托珠單抗、局部類固醇、優特克單抗、維多珠單抗、維生素D3類似物(例如卡泊三醇(calcipotriol)、他卡西醇(tacalcitol)或骨化三醇(calcitriol))；細胞分裂抑制劑(例如硫唑嘌呤、嗎替麥考酚酯、黴酚酸、依維莫司或西羅莫司)及α-葡萄糖苷酶抑制劑(例如阿卡波糖(acarbose)、米格列醇(miglitol)、伏利波糖(voglibose))。 亦應提及包含至少一種通式(I)化合物及一或多種用於治療及/或預防上文所提及病症之其他活性成分之藥劑，該一或多種其他活性成分尤其係EP4抑制劑(前列腺素E2受體4抑制劑)、P2X3抑制劑(P2X嘌呤受體3)、PTGES抑制劑(前列腺素E合酶抑制劑)、P2X4抑制劑(P2X嘌呤受體4)、MKNK1/2抑制劑(MAP激酶相互作用絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶1/2)或AKR1C3抑制劑(醛-酮還原酶家族1成員C3抑制劑)。 通式(I)化合物可全身及/或局部起作用。出於此目的，其可以適宜方式投與，例如藉由經口、非經腸、皮下、關節內、經肺、經鼻、舌下、經舌、經頰、經直腸、經皮、穿皮或結膜途徑、經由耳或作為植入物或支架投與。 通式(I)化合物可以適於該等投與途徑之投與形式投與。 適於經口投與之投與形式係根據先前技術作用並快速及/或以改良方式釋放通式(I)化合物且含有呈結晶及/或非晶形及/或溶解形式之通式(I)化合物者，例如錠劑(無包衣或包衣錠劑，例如具有控制本發明化合物釋放之抗胃液或延遲溶解或不溶性包衣)、在口腔中快速崩解之錠劑或膜/扁圓劑(oblates)、膜/凍乾劑、膠囊(例如硬或軟明膠膠囊)、糖包衣錠劑、顆粒、丸劑、粉劑、乳液、懸浮液、氣溶膠或溶液。 非經腸投與可以避免吸收步驟(例如藉由靜脈內、動脈內、關節內、心內、脊柱內或腰椎內(intralumbar)途徑)或以納入吸收(例如藉由肌內、皮下、皮內、經皮或腹膜內途徑)來實現。適於非經腸投與之投與形式包括注射及輸注製劑，呈溶液、懸浮液、乳液、凍乾劑或無菌粉劑形式。 關於其他投與途徑，適宜實例係可吸入藥劑形式(包括粉劑吸入器、噴霧器)、滴鼻劑、溶液或噴霧劑，用於經舌、舌下或經頰投與之錠劑、膜/扁圓劑或膠囊，栓劑，耳或眼製劑，水性懸浮液(洗劑、振盪混合物)、親脂性懸浮液、軟膏、乳霜、經皮治療系統(例如貼片)、乳劑(milk)、糊劑、泡沫、撒粉(sprinkling powders)、移植物或支架。 較佳係經口或非經腸投與、尤其經口投與。 通式(I)化合物可轉化成所提及之投與形式。此可以本身已知之方式藉由與惰性、無毒、醫藥上適宜之賦形劑混合來實現。該等賦形劑包括載劑(例如微晶纖維素、乳糖、甘露醇)、溶劑(例如液體聚乙二醇)、乳化劑及分散劑或潤濕劑(例如十二烷基硫酸鈉、聚氧山梨醇酐油酸酯)、黏合劑(例如聚乙烯吡咯啶酮)、合成及天然聚合物(例如白蛋白)、穩定劑(例如抗氧化劑，例如抗壞血酸)、著色劑(例如無機顏料，例如氧化鐵)及調味劑及/或矯味劑。 本發明進一步提供藥劑，其包含至少一種本發明化合物通常與一或多種惰性、無毒、醫藥上適宜之賦形劑一起；及其於上文所提及目的之用途。 一般而言，已發現在非經腸投與之情形下有利地投與約0.001 mg/kg體重至1 mg/kg體重、較佳約0.01 mg/kg體重至0.5 mg/kg體重之量以達成有效結果。在經口投與之情形下，劑量為約0.01 mg/kg體重至100 mg/kg體重、較佳約0.01 mg/kg體重至20 mg/kg體重、且最佳0.1至10 mg/kg體重。 然而，在一些情形下偏離所述量可能係必需的，特定而言隨體重、投與途徑、個體對活性成分之反應、製劑之性質或進行投與之時間或間隔而變化。因此，在一些情形下，可使用低於上文所提及最低量即足以管控，而在其他情形下必須超出所提及上限。在投與較大量之情形下，可適當地將該等量分成若干個別劑量並全天投與。 下列工作實例對本發明加以說明。本發明並不限於該等實例。 除非另外陳述，否則以下測試及實例中之百分比係重量百分比；份數係重量份數。液體/液體溶液之溶劑比、稀釋比及濃度數據在每一情形下皆基於體積。
通式 (I) 化合物之製備
本申請案中所述之化合物及其製備呈現於現尚未公開之申請案PCT/EP2015/077596中。 通式(I)化合物之製備藉由下文合成方案圖解說明。 用於合成通式(I)化合物之起始材料係羧酸(中間體V3)，其在市面上有售或可藉由自文獻已知之途徑或以與自文獻已知之途徑類似之方式製備(參見例如European Journal of Organic Chemistry 2003, 8, 1559 - 1568；Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1990, 38, 9, 2446 - 2458；Synthetic Communications 2012, 42, 658 - 666；Tetrahedron, 2004, 60, 51, 11869 - 11874) (參見例如合成方案1)。一些羧酸V3可自羧酸酯(中間體V2)開始藉由水解(參見例如6-(羥基甲基)吡啶-2-甲酸乙酯與甲醇中之氫氧化鈉水溶液之反應，WO200411328)或在第三丁基酯之情形下藉由與酸(例如鹽酸或三氟乙酸)反應(參見例如Dalton Transactions, 2014, 43, 19, 7176 - 7190)來製備。羧酸V3亦可以其鹼金屬鹽形式使用。中間體V2亦可視情況自帶有氯、溴或碘作為取代基X
1
之中間體V1、藉由在一氧化碳氣氛中、視情況在升高壓力下、在膦配體(例如1,3-雙(二苯基膦基)丙烷)、鈀化合物(例如乙酸鈀(II))及鹼(例如三乙胺)存在下反應、藉由添加溶劑(例如二甲亞碸)中之乙醇或甲醇來製備(關於製備方法參見例如WO2012112743；WO 2005082866；Chemical Communications (Cambridge, England), 2003, 15, 1948 - 1949；WO200661715)。中間體V1在市面上有售或可藉由自文獻已知之途徑製備。說明性製備方法闡述於以下文獻中：WO 2012061926；European Journal of Organic Chemistry, 2002, 2, 327 - 330；Synthesis, 2004, 10, 1619 - 1624；Journal of the American Chemical Society, 2013, 135, 32, 12122 - 12134；Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2014, 24, 16, 4039 - 4043；US2007185058；WO2009117421。
合成方案1 X
1
係氯、溴或碘。 R
d
係甲基、乙基、苄基或第三丁基。 R
4
、R
5
各自如通式(I)中所定義。 5-胺基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體2)可自1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體0)開始根據合成方案2藉由在炭載鈀存在下以類似於WO 2008/001883之方式硝化及用氫還原中間體1之硝基獲得。對於自中間體2開始製備中間體3，可使用自文獻已知之多種偶合劑(Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry，第3版 - Building Blocks, Catalysis and Coupling Chemistry, Andrew B. Hughes, Wiley，第12章 - Peptide-Coupling Reagents, 407-442；Chem. Soc. Rev., 2009, 38, 606)。舉例而言，可使用1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與1-羥基-1H-苯并三唑水合物(HOBt, WO2012107475；Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008 , 18, 2093)、(1H-苯并三唑-1-基氧基)(二甲基胺基)-N,N-二甲基甲銨四氟硼酸鹽(TBTU, CAS 125700-67-6)、(二甲基胺基)-N,N-二甲基(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)甲銨六氟磷酸鹽(HATU, CAS 148893-10-1)、丙烷膦酸酐(呈於乙酸乙酯或DMF中之溶液，CAS68957-94-8)或二-1H-咪唑-1-基甲酮(CDI)之組合作為偶合劑，在每一情形下將鹼(例如三乙胺或N-乙基-N-異丙基丙-2-胺)添加至反應混合物中。較佳使用THF中之TBTU及N-乙基-N-異丙基丙-2-胺。
合成方案2 取代基R
4
、R
5
各自如通式(I)中所定義。 可自中間體3開始製備2-取代之吲唑衍生物(中間體4) (參見合成方案3)。可用於此目的之反應包括與視情況取代之烷基氯化物、烷基溴化物、烷基碘化物或4-甲苯磺酸烷基酯之彼等。所用烷基鹵化物或4-甲苯磺酸烷基酯在市面上有售或可以與自文獻已知之途徑類似之方式製備(關於4-甲苯磺酸烷基酯之製備，一個實例係適宜醇與4-甲苯磺醯氯在三乙胺或吡啶存在下之反應；參見例如Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2006, 14, 12 4277 - 4294)。視情況，在使用烷基氯化物或烷基溴化物之情形下，亦可添加鹼金屬碘化物，例如碘化鉀或碘化鈉。所用鹼可為例如碳酸鉀、碳酸銫或氫化鈉。在反應性烷基鹵化物之情形下，亦可在一些情形下使用N-環己基-N-甲基環己胺。有用溶劑包括例如1-甲基吡咯啶-2-酮、DMF、DMSO或THF。視情況，所用烷基鹵化物或4-甲苯磺酸烷基酯可具有已視情況預先經保護基團保護之官能基(亦參見P. G. M. Wuts, T. W. Greene,
Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis
，第4版，ISBN: 9780471697541)。若使用例如具有一或多個羥基之烷基鹵化物或4-甲苯磺酸烷基酯，則該等羥基可視情況經第三丁基(二甲基)矽基或熟習此項技術者所熟悉之類似含矽保護基團保護。或者，羥基亦可經四氫-2H-吡喃(THP)基團或經乙醯基或苯甲醯基保護。所用保護基團隨後可在合成中間體4後或在合成(I)後脫離。若使用例如第三丁基(二甲基矽基)作為保護基團，則可使用例如溶劑(例如THF)中之四丁基氟化銨脫離。THP保護基團可例如使用4-甲苯磺酸(視情況呈一水合物形式)脫離。乙醯基或苯甲醯基可藉由用氫氧化鈉水溶液處理來脫離。 視情況，烷基鹵化物所用或4-甲苯磺酸烷基酯可含有可藉由熟習此項技術者已知之氧化或還原反應轉化之官能基(參見例如
Science of Synthesis
, Georg Thieme Verlag)。若例如官能基係硫醚基，則此可藉由文獻中已知之方法氧化成亞碸或碸基。在亞碸基之情形下，此同樣可氧化成碸基。對於該等氧化步驟，可使用例如3-氯過氧苯甲酸(CAS 937-14-4) (就此而言，關於將2-(甲基硫基)乙基-1H-吡唑衍生物氧化成2-(甲基亞磺醯基)乙基-1H-吡唑衍生物及將另一2-(甲基硫基)乙基-1H-吡唑衍生物氧化成2-(甲基磺醯基)乙基-1H-吡唑衍生物亦參見例如US201094000)。若所用烷基鹵化物或甲苯磺酸酯含有酮基，則此可藉由熟習此項技術者已知之還原方法還原成醇基(關於硼氫化鈉之使用參見例如Chemische Berichte, 1980, 113, 1907 - 1920)。該等氧化或還原步驟可在合成中間體4後或在合成通式(I)化合物後實現。或者，中間體4可經由中間體3與視情況取代之烷基醇之光延反應(參見例如K. C. K. Swamy等人，Chem. Rev. 2009, 109, 2551 - 2651)來製備。可使用各種膦(例如三苯基膦、三丁基膦或1,2-二苯基膦基乙烷)與偶氮二甲酸二異丙基酯(CAS 2446-83-5)或文獻(K. C. K. Swamy等人，Chem. Rev. 2009, 109, 2551 - 2651)中所提及之其他二氮烯衍生物之組合。較佳使用三苯基膦及偶氮二甲酸二異丙基酯。若烷基醇帶有官能基，則如在上文所提及與烷基鹵化物反應之情形下，已知保護基團策略(其他指示可參見P. G. M. Wuts, T. W. Greene, Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis，第4版，ISBN: 9780471697541)係可能的，且如在上文所提及與烷基鹵化物反應之情形下，對應於中間體4之合成或通式(I)化合物合成後之氧化或還原步驟可能實現。可自中間體4開始，藉由格任亞反應(Grignard reaction) (參見例如EP 2489663中1H-吲唑-6-甲酸甲酯衍生物與甲基溴化鎂之反應)獲得本發明通式(I)化合物，其中R
2
及R
3
定義為C
1
-C
6
-烷基(其中R
2
及R
3
具有相同定義)。對於格任亞反應，可使用烷基鹵化鎂。尤佳者係THF或二乙醚或THF及二乙醚之混合物中之甲基氯化鎂或甲基溴化鎂。或者，可自中間體4開始，藉由與烷基鋰試劑反應(參見例如WO2006116412中2-胺基-4-氯-1-甲基-1H-苯并咪唑-7-甲酸甲酯衍生物與異丙基鋰或第三丁基鋰之反應)獲得通式(I)化合物，其中R
2
及R
3
定義為C
1
-C
6
-烷基(其中R
2
及R
3
具有相同定義)。可自中間體4開始，藉由與THF中之氫化鋰鋁、THF中之硼氫化鋰或THF中之硼氫化鈉反應、視情況添加甲醇或硼氫化鋰及硼氫化鈉之混合物來製備通式(I)化合物，其中R
2
及R
3
定義為H。
合成方案3 取代基R
1
、R
2
、R
3
、R
4
、R
5
各自如通式(I)中所定義。 可自中間體3開始，藉由格任亞反應獲得中間體5，其中R
2
及R
3
定義為C
1
-C
6
-烷基(其中R
2
及R
3
具有相同定義) (參見例如合成方案4)。出於此目的，可使用適宜烷基鹵化鎂，例如THF中或二乙醚中或THF及二乙醚之混合物中之甲基氯化鎂或甲基溴化鎂。 然後可自中間體5開始，製備通式(I)化合物之部分(I-a)，其中R
2
及R
3
定義為C
1
-C
6
-烷基(其中R
2
及R
3
具有相同定義)。出於此目的，以與合成方案3 (中間體3之製備)類似之方式，有用反應係中間體5與視情況取代之烷基氯化物、烷基溴化物、烷基碘化物或4-甲苯磺酸烷基酯之反應。可使用與合成方案3中所述之策略類似之保護基團策略。 或者，為製備通式(I)化合物之部分(I-a) (其中R
2
及R
3
定義為C
1
-C
6
-烷基，其中R
2
及R
3
具有相同定義)，可使用中間體5與視情況取代之烷基醇之光延反應(類似於合成方案3)。 若式(I-a)化合物中之R
1
包括適宜官能基，則隨後可視情況以與合成方案3類似之方式使用氧化或還原反應來製備其他本發明化合物。
合成方案4 取代基R
1
、R
4
、R
5
各自如通式(I)中所定義。R
2
及R
3
總是具有相同定義且皆為C
1
-C
6
-烷基。 可自中間體1開始，以替代方式製備中間體4 (參見合成方案5)。首先，藉由如合成方案3 (自中間體3製備中間體4)中之方法將中間體1轉化成中間體6。 然後可藉由還原硝基將中間體6轉化成中間體7。舉例而言，硝基可在氫氣氛下用碳載鈀還原(關於將6-異丙氧基-5-硝基-1H-吲唑還原成6-異丙氧基-1H-吲唑-5-胺參見例如WO2013174744)或藉由使用水及乙醇中之鐵及氯化銨還原(亦參見例如Journal of the Chemical Society, 1955, 2412-2419)或藉由使用氯化錫(II) (CAS 7772-99-8)還原。較佳使用水及乙醇中之鐵及氯化銨。自中間體7製備中間體4可以與合成方案2 (自中間體2製備中間體3)類似之方式實現。 如針對合成方案3所述，亦可視情況在合成方案5之情形下使用保護基團策略。視情況，可另外自中間體6或中間體7開始，如針對合成方案3所述實施熟習此項技術者已知之氧化或還原反應(參見例如
Science of Synthesis
, Georg Thieme Verlag)。
合成方案5 取代基R
1
、R
4
、R
5
各自如通式(I)中所定義。
實例化合物之合成 縮寫及說明
術語
氯化鈉溶液
總是意指飽和氯化鈉水溶液。 中間體及實例之化學名稱係使用ACD / LABS (Batch 12.01版.)軟體生成。
方法
在一些情形下，通式(I)化合物及其前體及/或中間體係藉由LC-MS分析。 方法A1：UPLC (MeCN-HCOOH)： 儀器：Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001；管柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7 50 × 2.1 mm；溶析液A：水+ 0.1體積%甲酸(99%)，溶析液B：乙腈；梯度：0-1.6 min 1%-99% B，1.6-2.0 min 99% B；流速0.8 ml/min；溫度：60℃；注射：2 µl；DAD掃描：210-400 nm；MS ESI+、ESI-掃描範圍160-1000 m/z；ELSD。 方法A2：UPLC (MeCN-NH
3
)： 儀器：Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001；管柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7 50 × 2.1 mm；溶析液A：水+ 0.2體積%氨(32%)，溶析液B：乙腈；梯度：0-1.6 min 1%-99% B，1.6-2.0 min 99% B；流速0.8 ml/min；溫度：60℃；注射：2 µl；DAD掃描：210-400 nm；MS ESI+、ESI-掃描範圍160-1000 m/z；ELSD。 方法A3：(LC-MS) 儀器：Agilent 1290 Infinity LC；管柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7 50 × 2.1 mm；溶析液A：水+ 0.05體積%甲酸，溶析液B：乙腈+ 0.05體積%甲酸；梯度：0-1.7 min 2%-90% B，1.7-2.0 min 90% B；流速1.2 ml/min；溫度：60℃；注射：2 µl；DAD掃描：190-390 nm；MS：Agilent TOF 6230。 方法A4：(LC-MS) 儀器：Waters Acquity；管柱：Kinetex (Phenomenex), 50 × 2 mm；溶析液A：水+ 0.05體積%甲酸，溶析液B：乙腈+ 0.05體積%甲酸；梯度：0-1.9 min 1%-99% B，1.9-2.1 min 99% B；流速1.5 ml/min；溫度：60℃；注射：0.5 µl；DAD掃描：200-400 nm。 在一些情形下，通式(I)化合物及其前體及/或中間體係藉由以下說明性製備型HPLC方法來純化： 方法P1：系統：Waters自動純化系統：幫浦2545，樣品管控器2767, CFO, DAD 2996, ELSD 2424, SQD；管柱：XBridge C18 5 µm 100 × 30 mm；溶析液A：水+ 0.1體積%甲酸，溶析液B：乙腈；梯度：0-8 min 10%-100% B, 8-10 min 100% B；流速：50 ml/min；溫度：室溫；溶液：max. 250 mg / max. 2.5 ml DMSO或DMF；注射：1 × 2.5 ml；檢測：DAD掃描範圍210-400 nm；MS ESI+、ESI-掃描範圍160-1000 m/z。 方法P2：系統：Waters自動純化系統：幫浦254，樣品管控器2767, CFO, DAD 2996, ELSD 2424, SQD 3100；管柱：XBridge C18 5 µm 10 × 30 mm；溶析液A：水+ 0.2體積%氨(32%)，溶析液B：甲醇；梯度：0-8 min 30%-70% B；流速：50 ml/min；溫度：室溫；檢測：DAD掃描範圍210-400 nm；MS ESI+、ESI-掃描範圍160-1000 m/z；ELSD。 方法P3：系統：Labomatic，幫浦：HD-5000，部分收集器：LABOCOL Vario-4000，UV檢測器：Knauer UVD 2.1S；管柱：XBridge C18 5 µm 100×30 mm；溶析液A：水+ 0.2體積%氨(25%)，溶析液B：乙腈；梯度：0-1 min 15% B，1-6.3 min 15%-55% B, 6.3-6.4 min 55%-100% B, 6.4-7.4 min 100% B；流速：60 ml/min；溫度：室溫；溶液：max. 250 mg / 2 ml DMSO；注射：2 × 2 ml；檢測：UV 218 nm；軟體：SCPA PrepCon5。 方法P4：系統：Labomatic，幫浦：HD-5000，部分收集器：LABOCOL Vario-4000，UV檢測器：Knauer UVD 2.1S；管柱：Chromatorex RP C18 10 µm 125 × 30 mm；溶析液A：水+ 0.1體積%甲酸，溶析液B：乙腈；梯度：0-15 min 65% - 100% B；流速：60 ml/min；溫度：室溫；溶液：max. 250 mg / 2 ml DMSO；注射：2 × 2 ml；檢測：UV 254 nm；軟體：SCPA PrepCon5。 方法P5：系統：Sepiatec：製備型SFC100，管柱：Chiralpak IA 5 µm 250×20 mm；溶析液A：二氧化碳，溶析液B：乙醇；梯度：等梯度20% B；流速：80 ml/min；溫度：40℃；溶液：max. 250 mg / 2 ml DMSO；注射：5 × 0.4 mL；檢測：UV 254 nm。 方法P6：系統：Agilent：製備型1200, 2 ×製備型幫浦，DLA, MWD, Gilson：液體處置器215；管柱：Chiralcel OJ-H 5 µm 250 × 20 mm；溶析液A：己烷，溶析液B：乙醇；梯度：等梯度30% B；流速：25 ml/min；溫度：25℃；溶液：187 mg / 8 ml乙醇/甲醇；注射：8 × 1.0 ml；檢測：UV 280 nm。 方法P7：系統：Labomatic，幫浦：HD-5000，部分收集器：LABOCOL Vario-4000，UV檢測器：Knauer UVD 2.1S；管柱：XBridge C18 5 µm 100 × 30 mm；溶析液A：水+ 0.1體積%甲酸，溶析液B：乙腈；梯度：0-3 min：65% B等梯度，3-13 min：65%-100% B；流速：60 ml/min；溫度：室溫；溶液：max. 250 mg / 2 ml DMSO；注射：2 × 2 ml；檢測：UV 254 nm。 方法P8：系統：Agilent：製備型1200, 2 ×製備型幫浦，DLA, MWD, Gilson：液體處置器215；管柱：Chiralpak IF 5 µm 250 × 20 mm；溶析液A：乙醇，溶析液B：甲醇；梯度：等梯度50% B；流速：25 ml/min；溫度：25℃；溶液：600 mg / 7 ml N,N-二甲基甲醯胺；注射：10 × 0.7 ml；檢測：UV 254 nm。 在一些情形下，物質混合物係藉由矽膠上之管柱層析來純化。 為製備一些通式(I)化合物及其前體及/或中間體，在矽膠上使用來自Biotage之Isolera
®
裝置實施管柱層析純化(「急速層析」)。此係使用來自Biotage之柱(例如不同大小之「SNAP柱KP_SIL」柱及來自Interchim之不同大小之「Interchim Puriflash二氧化矽HP 15UM急速管柱」柱)來進行。
起始材料 中間體 V2-1 6-(2- 羥基丙 -2- 基 ) 吡啶 -2- 甲酸甲酯
將2.00 g (9.26 mmol) 2-(6-溴吡啶-2-基)丙-2-醇(CAS 638218-78-7)溶解於20 ml甲醇及20 ml DMSO中。隨後，添加250 mg 1,3-雙(二苯基膦基)丙烷、130 mg乙酸鈀(II)及3 ml三乙胺。在室溫下用一氧化碳將反應混合物吹掃三次且在13 bar一氧化碳氣氛下攪拌30 min。藉由施加真空移除一氧化碳氣氛且在14 bar一氧化碳氣氛下在100℃下將混合物攪拌24 h。對高壓釜降壓，將水添加至反應混合物中，且用乙酸乙酯將反應混合物萃取三次，用飽和碳酸氫鈉水溶液及氯化鈉溶液洗滌，經由疏水過濾器過濾並濃縮。此獲得1.60 g粗產物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 0.76 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值195.00。
中間體 V3-1 6-(2- 羥基丙 -2- 基 ) 吡啶 -2- 甲酸鉀 首先將1.60 g中間體0-1粗產物裝填於15 ml甲醇中，添加0.74 g氫氧化鉀且在50℃下將混合物攪拌16.5 h。濃縮後，此獲得2.1 g殘餘物，其不經進一步純化即使用。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 0.47 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值181.00。
中間體 1-1 5- 硝基 -1H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 將4.60 g (26.1 mmol) 1H-吲唑-6-甲酸甲酯(CAS編號：170487-40-8)溶解於120 ml硫酸(96%)中，且在具有CPG攪拌器、滴液漏斗及內部溫度計之三頸燒瓶中冷卻至-15℃。在15 min時段內，將已預先製備並冷卻之硝化酸(10 ml 96%硫酸於5 ml 65%硝酸中)逐滴添加至此溶液中。結束逐滴添加後，將混合物再攪拌1 h (內部溫度為-13℃)。將反應混合物添加至冰中，且藉由抽吸過濾掉沈澱物，用水洗滌並在乾燥櫥中在50℃下在減壓下乾燥。獲得5.49 g標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 0.75 min MS (ESIpos): m/z = 222(M+H)
+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.87 (s, 3 H), 7.96 (s, 1 H), 8.44 (s, 1 H), 8.70 (s, 1 H), 13.98 (br. s., 1 H)。
中間體 2-1 5- 胺基 -1H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 將4.40 g (19.8 mmol) 5-硝基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體1-1)溶解於236 ml甲醇中，且在標準氫氣氛下在25℃下用1.06 g (0.99 mmol)活性碳載鈀氫化3 h。經由矽藻土過濾反應混合物，用甲醇洗滌過濾器，並濃縮濾液。獲得3.53 g標題化合物。
1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.85 (s, 3 H) 6.01 (s, 2 H) 6.98 (s, 1 H) 7.79 - 7.91 (m, 1 H) 7.99 (s, 1 H) 12.84 (br. s., 1 H)。
中間體 3-1 5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-1H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 首先將4.95 g (25.9 mmol) 6-(三氟甲基)吡啶-2-甲酸裝填於45 ml THF中。添加9.07 g (28.2 mmol) O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽及4.92 ml (28.2 mmol) N-乙基-N-異丙基丙-2-胺且在25℃下將混合物攪拌30 min。隨後，添加4.50 g (23.5 mmol) 5-胺基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體2-1)且在25℃下將混合物攪拌24 h。藉由抽吸經由膜過濾器過濾反應混合物並用THF及用水洗滌固體，且在乾燥櫥中乾燥過夜。獲得7.60 g標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 1.16 min MS (ESIpos): m/z = 365 (M+H)
+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.97 (s, 3 H), 8.13 - 8.27 (m, 2 H), 8.30 (s, 1 H), 8.33 - 8.45 (m, 1 H), 8.45 - 8.51 (m, 1 H), 9.15 (s, 1 H), 12.57 (s, 1 H), 13.44 (s, 1 H)。
中間體 3-2 5-({[6-( 二氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-1H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 首先將2.85 g (23.5 mmol) 6-(二氟甲基)吡啶-2-甲酸裝填於30 ml THF中。添加6.05 g (18.8 mmol) O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽及3.3 ml N-乙基-N-異丙基丙-2-胺且在室溫下將混合物攪拌10分鐘。隨後，添加3.00 g (15.7 mmol) 5-胺基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯且在室溫下將混合物攪拌過夜。將反應混合物與水混合，且藉由抽吸過濾掉沈澱物並用水及二氯甲烷重複洗滌。此獲得1.53 g (理論值之27%)標題化合物。分離濾液之各相，將有機相濃縮，與少量二氯甲烷混合並懸浮於超音波浴中，且藉由抽吸過濾掉沈澱物。此獲得另外1.03 g標題化合物。 1H-NMR (第一產物部分，300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 3.99 (s, 3H), 7.09 (t, 1H), 8.00 (d, 1H), 8.21 - 8.40 (m, 4H), 9.14 (s, 1H), 12.53 (s, 1H), 13.44 (s, 1H)。
中間體 3-3 5-({[6-(2- 羥基丙 -2- 基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-1H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯
首先將2.10 g 6-(2-羥基丙-2-基)吡啶-2-甲酸鉀(中間體V3-1)裝填於15 ml THF中。添加3.69 g (11.5 mmol) O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽及2.00 ml N-乙基-N-異丙基丙-2-胺且在室溫下將混合物攪拌15 min。隨後，添加1.83 g (9.58 mmol) 5-胺基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體2-1)且在室溫下將混合物攪拌19 h。將混合物與水及乙酸乙酯混合，過濾掉未溶解之固體，分離濾液之各相，且用乙酸乙酯將水相萃取兩次，用氯化鈉溶液洗滌，經由疏水過濾器過濾，濃縮並藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化。移除溶劑後，獲得1.56 g黃色泡沫狀標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.00 min (UV檢測器：TIC Smooth)，質量實驗值354.00。 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.63 (s, 6H), 3.97 (s, 3H), 5.37(s ,1H), 7.90 - 7.95 (m, 1H), 8.03-8.07 (m, 2H), 8.23(s, 1H),8.29 (s, 1H), 9.19 (s, 1H), 12.79 (s, 1H), 13.41 (br.s., 1H)。
中間體 4-1 2-( 氧雜環丁 -3- 基甲基 )-5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 將1.00 g (2.66 mmol) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)溶解於10 ml DMF中，且在添加1.10 g (7.99 mmol)碳酸鉀及221 mg (1.33 mmol)碘化鉀後，在25℃下將混合物攪拌30 min。添加603 mg (3.99 mmol) 3-溴甲基氧雜環丁烷，且在25℃下將混合物攪拌24 h。將反應混合物分配於水與乙酸乙酯之間。用乙酸乙酯將混合物萃取兩次，且經由疏水過濾器過濾合併之有機相並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。獲得260 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 1.24 min MS (ESIpos): m/z = 435(M+H)
+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.49 - 3.64 (m, 1 H), 3.95 (s, 3 H), 4.49 (t, 2 H), 4.68 (dd, 2 H), 4.81 (d, 2 H), 8.20 (dd, 1 H), 8.35 - 8.41 (m, 1 H), 8.43 - 8.49 (m, 2 H), 8.55 - 8.58 (m, 1 H), 9.06 (s, 1 H), 12.53 (s, 1 H)。
中間體 4-2 2-(2- 甲氧基乙基 )-5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯
將1.00 g (2.75 mmol) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)溶解於5 ml DMF中，且在攪拌的同時添加387 µl (4.12 mmol) 2-溴乙基甲醚、1.14 g (8.23 mmol)碳酸鉀及228 mg (1.37 mmol)碘化鉀。在25℃下將反應混合物攪拌24 h，用水稀釋並用乙酸乙酯萃取兩次。經由疏水過濾器過濾合併之有機相並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。獲得12 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.24 min MS (ESIpos): m/z = 423 (M+H)
+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.24 (s, 3 H), 3.86 (t, 2 H), 3.96 (s, 3 H), 4.65 (t, 2 H), 8.21 (dd, 1 H), 8.35 - 8.42 (m, 1 H), 8.43 - 8.51 (m, 2 H), 8.52 (d, 1 H), 9.06 (s, 1 H), 12.53 (s, 1 H)。
中間體 4-3 2-(3- 甲氧基丙基 )-5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯
將1.00 g (2.75 mmol) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)溶解於5 ml DMF中，且在攪拌的同時添加460 µl (4.12 mmol) 1-溴-3-甲氧基丙烷、1.14 g (8.23 mmol)碳酸鉀及228 mg (1.37 mmol)碘化鉀。在25℃下將反應混合物攪拌72 h，用水稀釋並用乙酸乙酯萃取兩次。經由疏水過濾器過濾合併之有機相並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。獲得28 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.29 min MS (ESIpos): m/z = 437 (M+H)
+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 2.17 (quin, 2 H), 3.24 (s, 3 H), 3.33 - 3.36 (m, 2 H), 3.96 (s, 3 H), 4.53 (t, 2 H), 8.21 (dd, 1 H), 8.35 - 8.42 (m, 1 H), 8.45 - 8.49 (m, 2 H), 8.54 (d, 1 H), 9.06 (s, 1 H), 12.54 (s, 1 H)。
中間體 4-4 2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 製備方法 1 首先將930 mg (2.55 mmol) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)、1.06 g碳酸鉀及212 mg碘化鉀裝填於9 ml DMF中且將混合物攪拌15 min。然後添加0.62 ml 4-溴-2-甲基丁-2-醇且在60℃下將混合物攪拌16 h。將混合物與水混合並用乙酸乙酯萃取兩次，且用飽和氯化鈉溶液將萃取物洗滌三次，過濾並濃縮。矽膠上之管柱層析純化(己烷/乙酸乙酯)獲得424 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 1.21 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值450.00。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.16 (s, 6 H) 2.02 - 2.11 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.51 - 4.60 (m, 3 H) 8.20 (dd,
J
=7.83, 1.01 Hz, 1 H) 8.39 (s, 1 H) 8.45 (s, 2 H) 8.55 (d,
J
=0.76 Hz, 1 H) 9.05 (s, 1 H) 12.52 (s, 1 H)
製備方法 2
首先將1.95 g (7.03 mmol) 5-胺基-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體7-1)裝填於30 ml THF中。添加1.48 g (7.73 mmol) 6-(三氟甲基)吡啶-2-甲酸、2.71 g (8.44 mmol) O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽及1.47 ml (8.44 mmol) N-乙基-N-異丙基丙-2-胺，且在25℃下將混合物攪拌20.5 h。添加水，用乙酸乙酯將混合物萃取三次並用氯化鈉溶液洗滌萃取物，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯梯度)分離殘餘物。獲得2.79 g標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.23 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值450.00。
中間體 4-5 2-(2-{[ 第三丁基 ( 二甲基 ) 矽基 ] 氧基 } 乙基 )-5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 首先將1.00 g (2.66 mmol, 97%) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)裝填於50 ml DMF中，在攪拌的同時添加1.10 g (7.99 mmol)碳酸鉀及221 mg (1.33 mmol)碘化鉀，且在25℃下將混合物攪拌30 min。隨後，添加857 µl (3.99 mmol) (2-溴乙氧基)(第三丁基)二甲基矽烷且在25℃下將混合物攪拌24 h。用水稀釋反應混合物並用乙酸乙酯萃取。經由疏水過濾器過濾合併之有機相並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。獲得400 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.58 min MS (ESIpos): m/z = 523(M+H)
+ 1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = -0.18 - -0.13 (m, 6 H), 0.74 (s, 9 H), 3.96 (s, 3 H), 4.08 (t, 2 H), 4.57 (t, 2 H), 8.15 - 8.25 (m, 1 H), 8.32 - 8.43 (m, 1 H), 8.43 - 8.52 (m, 3 H), 9.07 (s, 1 H), 12.53 (s, 1 H)。
中間體 4-6 2-(3-{[ 第三丁基 ( 二甲基 ) 矽基 ] 氧基 } 丙基 )-5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 以與中間體4-5類似之方式，將1.00 g (2.75 mmol) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)溶解於10 ml DMF中，在攪拌的同時添加1.14 g (8.24 mmol)碳酸鉀及228 mg (1.37 mmol)碘化鉀，且在25℃下將混合物攪拌30 min。隨後，添加1.04 g (4.12 mmol) (3-溴丙氧基)(第三丁基)二甲基矽烷且在25℃下將混合物攪拌24 h。過濾反應混合物並用乙酸乙酯洗滌濾餅。將反應混合物分配於水與乙酸乙酯之間且用乙酸乙酯將水相萃取兩次。經由疏水過濾器過濾合併之有機相並濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物，獲得428 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.63 min MS (ESIpos): m/z = 537(M+H)
+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = -0.02 - 0.06 (m, 6 H), 0.87 (s, 9 H), 2.14 (quin, 2 H), 3.62 (t, 2 H), 3.96 (s, 3 H), 4.54 (t, 2 H), 8.20 (d, 1 H), 8.35 - 8.42 (m, 1 H), 8.43 - 8.48 (m, 3 H), 8.49 - 8.53 (m, 1 H), 9.06 (s, 1 H)。
中間體 4-7 5-({[6-(2- 羥基丙 -2- 基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2-(4,4,4- 三氟丁基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 首先將300 mg (0.80 mmol) 5-({[6-(2-羥基丙-2-基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-3)裝填於4.5 ml DMF中。添加287 mg (1.21 mmol) 1,1,1-三氟-4-碘丁烷及333 mg碳酸鉀且在100℃下將混合物攪拌23 h。添加水，並用乙酸乙酯將混合物萃取三次。濃縮混合物且藉由製備型HPLC純化產物。此獲得72 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.26 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值464.17。
中間體 4-8 5-{[(5- 氟 -6- 甲基吡啶 -2- 基 ) 羰基 ] 胺基 }-2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 使195 mg (0.46 mmol) 5-胺基-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體7-1)與78 mg (0.50 mmol) 5-氟-6-甲基吡啶-2-甲酸以與中間體4-4 (製備方法2)類似之方式在19.5 h內反應。在類似水性後處理後獲得228 mg粗產物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.20 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值414.00。
中間體 4-9 2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-5-{[(6- 甲基吡啶 -2- 基 ) 羰基 ] 胺基 }-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 使195 mg (0.45 mmol) 5-胺基-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體7-1)與70 mg (0.50 mmol) 6-甲基吡啶-2-甲酸以與製備中間體4-4 (製備方法2)類似之方式在19.5 h內反應。在類似水性後處理後獲得278 mg呈粗產物形式之標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.14 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值396.00。
中間體 4-10 2-[3-(2,2,2- 三氟乙氧基 ) 丙基 ]-5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 在100℃下，將250 mg (0.58 mmol) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)、193 mg (0.88 mmol) 3-溴丙基2,2,2-三氟乙基醚、242 mg碳酸鉀及145 mg碘化鉀於3 ml DMF中之混合物攪拌20 h。添加水，用乙酸乙酯萃取混合物且用氯化鈉溶液洗滌萃取物並濃縮。藉由製備型HPLC純化，獲得52 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.39 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值504.12。
中間體 4-11 5-({[6-( 二氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯
首先將2.00 g 5-胺基-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體7-1)裝填於40 ml THF中。添加1.50 g 6-(二氟甲基)吡啶-2-甲酸、2.78 g
O
-(苯并三唑-1-基)-
N
,
N
,
N
',
N
'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU, CAS編號125700-67-6)及1.5 ml N-乙基-N-異丙基丙-2-胺且在室溫下將混合物攪拌24 h。添加水，用乙酸乙酯將混合物萃取三次，且用氯化鈉溶液洗滌合併之有機相並經由疏水過濾器過濾。濃縮混合物並藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。此獲得3.05 g黃色固體狀標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt = 1.15 min (UV檢測器TIC)，質量實驗值432.00。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.17 (s, 6H), 2.04 - 2.11 (m, 2H), 3.99 (s, 3H), 4.52 - 4.60 (m, 3H), 7.10 (t, 1H), 8.00 (dd, 1H), 8.28 - 8.38 (m, 2H), 8.44 - 8.47 (m, 1H), 8.56 (d, 1H), 9.05 (s, 1H), 12.49 (s, 1H)。
中間體 5-1 N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-1H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 向1.50 g (4.12 mmol) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)於20 ml THF中之冷卻於冰水冷卻浴中之溶液小心地添加6.9 ml (5當量)於二乙醚中之3M甲基溴化鎂溶液。在用冰浴冷卻的同時將混合物攪拌1 h並在室溫下攪拌19.5 h。再添加2當量之甲基溴化鎂溶液且在室溫下將混合物再攪拌24 h。添加飽和氯化銨水溶液並將混合物攪拌且用乙酸乙酯萃取三次。用氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。獲得763 mg標題化合物。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.63 (s, 6H), 5.99 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 8.14 - 8.19 (m, 1H), 8.37 (t, 1H), 8.46 (d, 1H), 8.78 (s, 1H), 12.32 (s, 1H), 12.97 (s, 1H)。
中間體 5-2 6-( 二氟甲基 )-N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-1H- 吲唑 -5- 基 ] 吡啶 -2- 甲醯胺
以與中間體5-1之製備類似之方式，使10 ml THF中之2.40 g (6.93 mmol) 5-({[6-(二氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-2)與三份於二乙醚中之3M甲基溴化鎂溶液(6.9 ml，然後在室溫下攪拌45 min；11.6 ml，然後在室溫下攪拌2 h；6.9 ml，然後在室溫下攪拌2 h)反應。如針對中間體5-1後處理後，獲得2.39 g粗產物，其不經進一步純化即進一步使用。
中間體 6-1 2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-5- 硝基 -2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 首先將5.00 g (22.6 mmol) 5-硝基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體1-1)裝填於40 ml DMF中。添加5.65 g (33.9 mmol) 4-溴-2-甲基丁-2-醇、9.37 g (67.8 mmol)碳酸鉀及5.63 g (33.9 mmol)碘化鉀且在100℃下將混合物攪拌20 h。添加水，用乙酸乙酯將混合物萃取三次並用氯化鈉溶液洗滌萃取物，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。藉由與二乙醚一起攪拌萃取所獲得之固體，藉由抽吸過濾掉，用二乙醚洗滌且乾燥。獲得2.49 g標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 0.93 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值307.00。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.15 (s, 6H), 2.02 - 2.11 (m, 2H), 3.84 (s, 3H), 4.54 (s, 1H), 4.58 - 4.65 (m, 2H), 8.05 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.86 (s, 1H)。
中間體 7-1 5- 胺基 -2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯
將4.53 g鐵及217 mg氯化銨添加至30 ml乙醇及10 ml水中之2.49 g (8.10 mmol) 2-(3-羥基-3-甲基丁基)-5-硝基-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體6-1)中，且在90℃下將混合物攪拌21.5 h。經由矽藻土過濾混合物且經由乙醇洗滌三次，並濃縮濾液且將殘餘物與水混合。用乙酸乙酯萃取三次(以改良相分離，添加氯化鈉溶液)。用氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。此獲得1.95 g (理論值之85%)標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 0.67 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值277.00。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.14 (s, 6H), 1.96 - 2.08 (m, 2H), 3.85 (s, 3H), 4.39 - 4.51 (m, 3H), 5.81 (s, 2H), 6.80 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 8.18 (s, 1H)。
工作實例 實例 1 N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-(2- 甲氧基乙基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 將75 mg (0.18 mmol) 2-(2-甲氧基乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-2)溶解於500 µl THF中且與887 µl (0.89 mmol)於THF中之1 M甲基溴化鎂溶液混合。在25℃下將反應混合物攪拌60 min。隨後，小心地添加1 ml飽和氯化銨水溶液且過濾混合物。用乙酸乙酯將水相萃取兩次，且合併有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。將殘餘物溶解於3 ml DMSO中並藉由製備型HPLC純化。冷凍乾燥含有產物之部分。獲得20 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.08 min MS (ESIpos): m/z = 423 (M+H)
+ 1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.62 (s, 6 H), 3.22 (s, 3 H), 3.82 (t, 2 H), 4.55 (t, 2 H), 5.96 (s, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 8.16 (d1 H), 8.29 - 8.42 (m, 2 H), 8.42 - 8.50 (m, 1 H), 8.71 (s, 1 H), 12.36 (s, 1 H)
實例 2 N-[6-( 羥基甲基 )-2-(2- 甲氧基乙基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 將13 mg (0.36 mmol)氫化鋰鋁懸浮於1 ml THF中且將混合物冷卻至0℃。逐滴添加75 mg (0.17 mmol)溶解於500 µl THF中之2-(2-甲氧基乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-2)且在25℃下將混合物攪拌60 min。用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取兩次，且用氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾，濃縮且在減壓下乾燥。此獲得13 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 0.99 min MS (ESIpos): m/z = 394 (M+H)
+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.23 (s, 3 H), 3.83 (t, 2 H), 4.56 (t, 2 H), 4.69 (d, 2 H), 5.77 (t, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 8.19 (d, 1 H), 8.33 - 8.41 (m, 2 H), 8.43 - 8.47 (m, 1 H), 8.51 (s, 1 H), 11.20 (s, 1 H)
實例 3 N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-(3- 甲氧基丙基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 將75 mg (0.17 mmol) 2-(3-甲氧基丙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-3)溶解於500 µl THF中且與859 µl (0.86 mmol)於THF中之1 M甲基溴化鎂溶液混合。在25℃下將反應混合物攪拌60 min。隨後，小心地添加1 ml飽和氯化銨溶液且過濾混合物。用乙酸乙酯將水相萃取兩次，且合併有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。將殘餘物溶解於3 ml DMSO中並藉由製備型HPLC純化。冷凍乾燥含有產物之部分。獲得25 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.13 min MS (ESIpos): m/z = 437 (M+H)
+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.62 (s, 6 H), 2.14 (quin, 2 H), 3.23 (s, 3 H), 3.26 - 3.32 (m, 2 H), 4.44 (t, 2 H), 5.95 (s, 1 H), 7.58 (s, 1 H), 8.16 (d, 1 H), 8.31 - 8.40 (m, 2 H), 8.43 - 8.48 (m, 1 H), 8.72 (s, 1 H), 12.36 (s, 1 H)。
實例 4 N-[6-( 羥基甲基 )-2-(3- 甲氧基丙基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 將13 mg氫化鋰鋁懸浮於THF中且將混合物冷卻至0℃。逐滴添加75 mg (0.17 mmol)於THF中之2-(3-甲氧基丙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-3)且使混合物在30 min內達到室溫。用水稀釋混合物並過濾，用乙酸乙酯洗滌殘餘物且用乙酸乙酯萃取濾液。用氯化鈉溶液洗滌合併之乙酸乙酯相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物。
1
H NMR (300 MHz, DMSO-
d 6
): δ [ppm] = 2.14 (quin, 2 H), 3.23 (s, 3 H), 3.29 (t, 2 H), 4.45 (t, 2 H), 4.68 (d, 2 H), 5.77 (t, 1 H), 7.58 (s, 1 H), 8.18 (d, 1 H), 8.32 - 8.48 (m, 3 H), 8.51 (s, 1 H), 11.21 (s, 1 H)。
實例 5 N-[2-(2- 羥基乙基 )-6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 階段 A ：
製備N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺
將100 mg (0.19 mmol) 2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-5)溶解於1 ml THF中且與669 µl (0.67 mmol)於THF中之1 M甲基溴化鎂溶液混合。在25℃下將反應混合物攪拌60 min。再添加287 µl (0.29 mmol)於THF中之1 M甲基溴化鎂溶液且在25℃下將混合物攪拌3 h。隨後，小心地添加20 ml飽和氯化銨溶液且過濾混合物。用乙酸乙酯將水相萃取兩次，且合併有機相，經硫酸鎂乾燥，過濾，濃縮且在減壓下乾燥。此獲得50 mg N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 1.51 min MS (ESIpos): m/z = 523(M+H)
+ 1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = -0.17 - -0.09 (m, 6 H), 0.78 (s, 9 H), 1.62 (s, 6 H), 4.04 (t, 2 H), 4.47 (t, 2 H), 5.98 (s, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 8.16 (d, 1 H), 8.29 (s, 1 H), 8.37 (t, 1 H), 8.45 (d, 1 H), 8.73 (s, 1 H), 12.38 (s, 1 H)。
階段 B ： 將50 mg (96 µmol) N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺溶解於1.0 ml THF中且與144 µl (0.14 mmol)於THF中之1 M四丁基氟化銨溶液混合。在室溫下將反應混合物攪拌1 h。用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取兩次，且用飽和氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。此獲得36 mg N-[2-(2-羥基乙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(實例5)。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): d [ppm] = 1.62 (s, 6H), 3.86 (q, 2H), 4.43 (t, 2H), 4.95 (t, 1H), 5.94 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 8.16 (dd, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.37 (t, 1H), 8.45 (d, 1H), 8.72 (s, 1H), 12.36 (s, 1H)。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 0.97 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值408.00。
實例 6 N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-(3- 羥基丙基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 階段 A ：
製備N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺
將50 mg (0.09 mmol) 2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}丙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-6)溶解於500 µl THF中且與326 µl (0.33 mmol)於THF中之1 M甲基溴化鎂溶液混合。在25℃下將反應混合物攪拌60 min。隨後，小心地添加20 ml飽和氯化銨溶液且用乙酸乙酯將混合物萃取兩次。經由疏水過濾器過濾合併之有機相，濃縮且在減壓下乾燥。藉由製備型HPLC純化殘餘物。獲得40 mg N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.58 min MS (ESIpos): m/z = 537(M+H)
+ 1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.02 - 0.05 (m, 6 H), 0.84 - 0.91 (m, 9 H), 1.62 (s, 6 H), 2.02 - 2.18 (m, 2 H), 3.55 - 3.62 (m, 2 H), 4.45 (t, 2 H), 5.96 (s, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 8.16 (d, 1 H), 8.31 (s, 1 H), 8.33 - 8.42 (m, 1 H), 8.45 (d, 1 H), 8.72 (s, 1 H), 12.37 (s, 1 H)。
階段 B ： 將37 mg (0.07 mmol) N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺溶解於500 µl THF中且與207 µl (0.21 mmol)於THF中之1 M四丁基氟化銨溶液混合。在25℃下將反應混合物攪拌2 h。用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取兩次，且用飽和氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，過濾並濃縮。藉由製備型HPLC純化後，獲得10 mg N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(3-羥基丙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(實例6，含有次要組分)。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 1.00 min MS (ESIpos): m/z = 423 (M+H)
+ 1
H NMR所選信號(400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.61 (s), 2.00 - 2.12 (m), 3.38 (t, 2 H), 4.44 (t, 2 H), 4.62 (br. s., 1 H), 5.93 (br. s., 1 H), 7.55 (s, 1 H), 8.13 (d, 1 H), 8.27 - 8.38 (m, 2 H), 8.43 (d, 1 H), 8.71 (s, 1 H), 12.30 (br. s., 1 H)。
實例 7 N-[2-(2- 羥基乙基 )-6-( 羥基甲基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 階段 A ：
N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺
將100 mg (0.19 mmol) 2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-5)溶解於1 ml THF中且與191 µl (0.38 mmol) 2 M硼氫化鋰溶液混合。在25℃下將混合物攪拌24 h。添加14 mg (0.38 mmol)硼氫化鈉及500 µl甲醇，且在25℃下將混合物攪拌4 h。再添加14 mg (0.38 mmol)硼氫化鈉，且在25℃下將混合物攪拌24 h。將水小心地添加至反應混合物中並移除有機相。然後用乙酸乙酯將混合物萃取兩次，且用飽和氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。將殘餘物吸收於2 ml DMSO中並藉由製備型HPLC純化。此獲得30 mg N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 1.44 min MS (ESIpos): m/z = 495(M+H)
+ 1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = -0.16 - -0.12 (m, 6 H), 0.75 - 0.79 (m, 9 H), 4.05 (t, 2 H), 4.48 (t, 2 H), 4.69 (d, 2 H), 5.75 - 5.77 (m, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 8.18 (dd, 1 H), 8.30 - 8.33 (m, 1 H), 8.38 (t, 1 H), 8.45 (d, 1 H), 8.51 (s, 1 H), 11.20 (s, 1 H)。
階段 B ： 將33 mg (0.07 mmol) N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺溶解於1 ml THF中且與100 µl (0.10 mmol)於THF中之1 M四丁基氟化銨溶液混合。在25℃下將反應混合物攪拌1 h。用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取兩次，且用飽和氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾，濃縮且在減壓下乾燥。獲得25 mg N-[2-(2-羥基乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(實例7)。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 0.87 min MS (ESIpos): m/z = 381 (M+H)
+ 1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.87 (q, 2 H), 4.44 (t, 2 H), 4.69 (d, 2 H), 4.98 (t, 1 H), 5.70 - 5.81 (m, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 8.11 - 8.23 (m, 1 H), 8.31 - 8.42 (m, 2 H), 8.43 - 8.49 (m, 1 H), 8.51 (s, 1 H), 11.20 (s, 1 H)。
實例 8 N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-( 氧雜環丁 -3- 基甲基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 將50 mg (0.12 mmol) 2-(氧雜環丁-3-基甲基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-1)溶解於500 µl THF中且與576 µl (0.58 mmol)於THF中之1 M甲基溴化鎂溶液混合。在25℃下將反應混合物攪拌60 min。隨後，小心地添加20 ml飽和氯化銨水溶液且濃縮混合物。用乙酸乙酯將水相萃取兩次，且合併有機相，經硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮。將殘餘物溶解於2.0 ml DMSO中並藉由製備型HPLC純化。冷凍乾燥含有產物之部分。獲得30 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 1.03 min MS (ESIpos): m/z = 435 (M+H)
+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.62 (s, 6 H), 3.45 - 3.61 (m, 1 H), 4.48 (t, 2 H), 4.66 (dd, 2 H), 4.72 (d, 2 H), 5.94 (s, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 8.16 (d, 1 H), 8.33 - 8.42 (m, 2 H), 8.42 - 8.47 (m, 1 H), 8.72 (s, 1 H), 12.36 (s, 1 H)。
實例 9 N-[6-( 羥基甲基 )-2-( 氧雜環丁 -3- 基甲基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 將75 mg (0.17 mmol) 2-(氧雜環丁-3-基甲基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-1)溶解於1 ml THF/甲醇(1:1)混合物中，且添加8 mg (0.21 mmol)硼氫化鈉。在25℃下將混合物攪拌60 min。濃縮反應混合物，且將殘餘物與水混合。將懸浮液劇烈攪拌15 min，且藉由抽吸過濾掉固體，用水洗滌兩次且用二乙醚洗滌兩次，並在減壓下乾燥。獲得48 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 0.94 min MS (ESIpos): m/z = 407 (M+H)
+ 1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.55 (s, 1 H), 4.48 (t, 2 H), 4.61 - 4.77 (m, 6 H), 7.57 (s, 1 H), 8.18 (dd, 1 H), 8.33 - 8.49 (m, 3 H), 8.51 (s, 1 H), 11.21 (s, 1 H)。
實例 10 N-{6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-[3-( 甲基磺醯基 ) 丙基 ]-2H- 吲唑 -5- 基 }-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 在室溫下，將500 mg (1.32 mmol) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)、569 mg碳酸鉀及114 mg碘化鉀於5.0 ml DMF中之混合物攪拌15 min。添加414 mg 1-溴-3-(甲基磺醯基)丙烷且在室溫下將混合物攪拌過夜。添加水，用乙酸乙酯將混合物萃取兩次且用氯化鈉溶液洗滌萃取物並濃縮。藉由管柱層析(二氯甲烷/甲醇梯度)純化殘餘物。藉由與二乙醚一起攪拌萃取產物部分，獲得59 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 1.02 min MS (ESIpos): m/z = 485 (M+H)+
1
H-NMR (300 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.63 (s, 6H), 2.26 - 2.42 (m, 2H), 2.99 (s, 3H), 3.06 - 3.16 (m, 2H), 4.55 (t, 2H), 5.96 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 8.16 (d, 1H), 8.33 - 8.48 (m, 3H), 8.73 (s, 1H), 12.37 (s, 1H)。
實例 11
N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺
製備方法1 首先將705 mg (1.57 mmol) 2-(3-羥基-3-甲基丁基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-4)裝填於10 ml THF中且在冰水冷卻浴中冷卻。添加2.6 ml (5.0當量) 3M甲基溴化鎂溶液(於二乙醚中)且在用冰浴冷卻的同時將混合物攪拌1 h並在室溫下攪拌4.5 h。再添加1當量之甲基溴化鎂溶液且在室溫下將混合物攪拌20.5 h。再添加1當量之甲基溴化鎂溶液且在室溫下將混合物攪拌22 h。將反應混合物與飽和氯化銨水溶液混合，攪拌且用乙酸乙酯萃取三次。用氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。此獲得790 mg殘餘物，藉助製備型HPLC純化該殘餘物。此獲得234 mg標題化合物及164 mg產物部分，藉由與二乙醚一起攪拌萃取該產物部分。藉由抽吸過濾然後乾燥後，再獲得146 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.10 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值450.00。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.14 (s, 6H), 1.61 (s, 6H), 1.99 - 2.08 (m, 2H), 4.42 - 4.55 (m, 3H), 5.93 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 8.15 (dd, 1H), 8.32 - 8.39 (m, 2H), 8.41 - 8.47 (m, 1H), 8.70 (s, 1H), 12.34 (s, 1H)。 製備方法2 在室溫下，將500 mg (1.37 mmol) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)、569 mg碳酸鉀及114 mg碘化鉀於5 ml DMF中之混合物攪拌15 min。添加344 mg (1.5當量) 4-溴-2-甲基丁-2-醇且將混合物加熱至100℃並保持2 h。再添加0.5當量之4-溴-2-甲基丁-2-醇且在室溫下將混合物攪拌16 h。將混合物與水混合並用乙酸乙酯萃取兩次，且用飽和氯化鈉溶液洗滌合併之有機相並經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析純化(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。此獲得100 mg產物部分，藉由與二乙醚一起攪拌萃取該產物部分。乾燥後，獲得60 mg標題化合物。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.14 (s, 6 H), 1.61 (s, 6H), 1.99 - 2.07 (m, 2 H), 4.43 - 4.52 (m, 3 H) 5.94 (s, 1 H) 7.57 (s, 1 H) 8.15 (dd, 1H) 8.33 - 8.40 (m, 2 H), 8.42 - 8.48 (m, 1 H), 8.71 (s, 1 H), 12.35 (s, 1 H)
實例 12
N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[2-(甲基磺醯基)乙基]-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺
將160 mg (0.44 mmol) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)與182 mg碳酸鉀及36 mg碘化鉀一起懸浮於1.0 ml DMF中，且在室溫下將混合物攪拌15 min。然後添加123 mg 2-溴乙基甲基碸(0.66 mmol)且在室溫下將混合物攪拌過夜。添加水，用乙酸乙酯將混合物萃取兩次且用飽和氯化鈉水溶液洗滌萃取物，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物，獲得20 mg標題化合物。 UPLC (方法A2): R
t
= 1.01 min； MS (ESIpos): m/z = 471 (M+H)+
1
H NMR (400 MHz, DMSO-
d 6
): δ [ppm]= 1.63 (s, 6 H), 2.90 (s, 3 H), 3.85 (t, 2 H), 4.86 (t, 2 H), 5.97 (s, 1 H), 7.59 (s, 1 H), 8.13 - 8.19 (m, 1 H), 8.37 (s, 1 H), 8.41 - 8.48 (m, 2 H), 8.74 (s, 1 H), 12.37 (s, 1 H)。
實例 13
6-(二氟甲基)-N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺
製備方法1 在室溫下，將250 mg 6-(二氟甲基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺(中間體5-2之粗產物)、144 mg碘化鉀及239 mg碳酸鉀於2.5 ml DMF中之混合物攪拌15 min。添加145 mg (0.87 mmol) 4-溴-2-甲基丁-2-醇，在110℃下將混合物攪拌3 h，再添加96 mg 4-溴-2-甲基丁-2-醇且在110℃下將混合物攪拌4 h。添加水，用乙酸乙酯將混合物萃取兩次並用半飽和氯化鈉水溶液洗滌，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)實現純化。獲得61 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.00 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值432.00。
1
H-NMR (300 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.14 (s, 6H), 1.63 (s, 6H), 1.97 - 2.08 (m, 2H), 4.41 - 4.55 (m, 3H), 5.99 (s, 1H), 7.03 (t, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.94 - 8.00 (m, 1H), 8.24 - 8.38 (m, 3H), 8.71 (s, 1H), 12.49 (s, 1H)。 製備方法2 以與實例11之製備(製備方法1)類似之方式，使3.00 g 5-({[6-(二氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-11)與3M甲基溴化鎂溶液(於二乙醚中)反應。藉由與二乙醚一起萃取攪拌、隨後藉由製備型HPLC純化粗產物後，獲得1.37 g標題化合物。
實例 14
6-(二氟甲基)-N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[2-(甲基磺醯基)乙基]-2H-吲唑-5-基}吡啶-2-甲醯胺
在室溫下，將250 mg 6-(二氟甲基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺(中間體5-2之粗產物)、144 mg碘化鉀及239 mg碳酸鉀於2.5 ml DMF中之混合物攪拌15 min。添加162 mg 2-溴乙基甲基碸(0.87 mmol)且在110℃下將混合物攪拌3 h。添加水，用乙酸乙酯將混合物萃取兩次且用半飽和氯化鈉水溶液洗滌萃取物，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物且另外藉由矽膠上之管柱層析純化(己烷/乙酸乙酯)純化產物部分。獲得40 mg標題化合物。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.65 (s, 6H), 2.90 (s, 3H), 3.85 (t, 2H), 4.85 (t, 2H), 6.03 (s, 1H), 7.04 (t, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.98 (d, 1H), 8.25 - 8.36 (m, 2H), 8.43 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 12.52 (s, 1H)。
實例 15 6-( 二氟甲基 )-N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-(3- 羥基丙基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ] 吡啶 -2- 甲醯胺 階段 A ：
製備N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(二氟甲基)吡啶-2-甲醯胺
在室溫下，將250 mg 6-(二氟甲基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺(中間體5-2)、48 mg碘化鉀及239 mg碳酸鉀於2.5 ml DMF中之混合物攪拌15 min。添加219 mg (0.87 mmol, 1.5當量) (3-溴丙氧基)(第三丁基)二甲基矽烷且在110℃下將混合物攪拌3 h。再添加1當量之(3-溴丙氧基)(第三丁基)二甲基矽烷且在100℃下將混合物攪拌4 h。添加水，用乙酸乙酯萃取混合物並用氯化鈉水溶液洗滌萃取物，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。獲得92 mg標題化合物。
階段 B ： 以與實例6、階段B之製備類似之方式，使92 mg N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(二氟甲基)吡啶-2-甲醯胺與0.53 ml於THF中之1 M四丁基氟化銨溶液在1 h內反應。如實例6中進行水性後處理並藉由製備型HPLC純化，獲得46 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 0.92 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值404.00。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.64 (s, 6H), 2.05 (quin, 2H), 3.35 - 3.46 (m, 2H), 4.45 (t, 2H), 4.64 (t, 1H), 5.99 (s, 1H), 7.04 (t, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.95 - 7.99 (m, 1H), 8.25 - 8.36 (m, 3H), 8.73 (s, 1H), 12.50 (s, 1H)。
實例 16 N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-(4,4,4- 三氟丁基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 將210 mg (0.58 mmol) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)於3 ml DMF中之混合物與0.11 ml (0.87 mmol) 1,1,1-三氟-4-碘丁烷及239 mg碳酸鉀混合，且在80℃下將混合物攪拌6 h。添加水後，用乙酸乙酯將混合物萃取三次，且用飽和氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由製備型HPLC純化粗產物。獲得19 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.27 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值474.15。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.62 (s, 6H), 2.10 - 2.33 (m), 4.49 (t, 2H), 5.94 (s, 1H), 7.59 (s, 1H), 8.13 - 8.18 (m, 1H), 8.32 - 8.41 (m, 2H), 8.41 - 8.47 (m, 1H), 8.72 (s, 1H), 12.35 (s, 1H)。
實例 17 N-{6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-[3-( 三氟甲氧基 ) 丙基 ]-2H- 吲唑 -5- 基 }-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 首先將150 mg (0.33 mmol) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)裝填於2 ml THF中。添加58 mg (0.40 mmol) 3-(三氟甲氧基)丙-1-醇、131 mg三苯基膦及71 µl偶氮二甲酸二異丙基酯(DIAD, CAS 2446-83-5)且在室溫下將混合物攪拌19 h。添加0.83 ml氫氧化鈉溶液(2M)且在40℃下將混合物攪拌5 h。用水稀釋混合物且用乙酸乙酯萃取三次，並濃縮合併之有機相且藉由製備型HPLC純化。獲得16 mg呈粗產物形式之標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 1.26 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值490.14。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
，所選信號): δ [ppm]= 1.61 (s, 6H), 1.84 (d, 1H), 2.32 (quint., 2H), 4.08 (t, 2H), 4.51 (t, 2H), 7.58 (s, 1H), 8.15 (d, 1H), 8.31 - 8.39 (m, 2H), 8.44 (d, 1H), 8.72 (s, 1H), 12.35 (s, 1H)。
實例 18 N-{6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-[3-(2,2,2- 三氟乙氧基 ) 丙基 ]-2H- 吲唑 -5- 基 }-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺
以與實例11之製備(製備方法1)類似之方式，使3 ml THF中之52 mg (0.10 mmol) 2-[3-(2,2,2-三氟乙氧基)丙基]-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-10)與2 × 171 µl於二乙醚中之3M溴化鎂鎂溶液反應。藉由製備型HPLC純化，獲得12 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): R
t
= 1.25 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值504.16。
1
H-NMR (500 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm] = 1.63 (s, 6H), 2.20(quin, 2H), 3.58(t, 2H),4.05(q, 2H), 4.47(t, 2H),5.94(s, 1H), 7.58 (s, 1H), 8.15 (dd, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.36 (t, 1H), 8.45(d, 1H), 8.73 (s, 1H), 12.36 (s,1H)。
實例 19 5- 氟 -N-[2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6- 甲基吡啶 -2- 甲醯胺 首先將228 mg (0.31 mmol) 5-{[(5-氟-6-甲基吡啶-2-基)羰基]胺基}-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-8)裝填於4.5 ml THF中且在冰冷卻浴中冷卻。添加0.63 ml 3M甲基溴化鎂溶液(於二乙醚中)且在用冰浴冷卻的同時將混合物攪拌2 h並在室溫下攪拌21 h。將反應混合物與飽和氯化銨水溶液混合且用乙酸乙酯萃取三次。濃縮合併之有機相。藉由製備型HPLC純化殘餘物。獲得82 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 1.03 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值414.21。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.13 (s, 6H), 1.63 (s, 6H), 1.99 - 2.05 (m, 2H), 2.55 - 2.59 (m, 3H), 4.42 - 4.50 (m, 3H), 5.95 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.83 (t, 1H), 8.05 (dd, 1H), 8.31 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 12.33 (s, 1H)。
實例 20 N-[2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6- 甲基吡啶 -2- 甲醯胺 首先將278 mg (0.48 mmol) 2-(3-羥基-3-甲基丁基)-5-{[(6-甲基吡啶-2-基)羰基]胺基}-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-9)裝填於5.0 ml THF中且在冰冷卻浴中冷卻。添加0.97 ml 3M甲基溴化鎂溶液(於二乙醚中)且在用冰浴冷卻的同時將混合物攪拌2 h並在室溫下攪拌20.5 h。再添加0.48 ml 3M甲基溴化鎂溶液且在室溫下將混合物攪拌67 h。將混合物與飽和氯化銨水溶液混合且用乙酸乙酯萃取三次，並用氯化鈉溶液洗滌萃取物，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物。獲得111 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 0.97 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值396.22。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.15 (s, 6H), 1.64 (s, 6H), 2.00 - 2.08 (m, 2H), 2.61 (s, 3H), 4.41 - 4.59 (m, 3H), 5.92 (s, 1H), 7.50 (dd, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.90 - 7.99 (m, 2H), 8.33 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 12.39 (s, 1H)。
實例 21 6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-(4,4,4- 三氟丁基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ] 吡啶 -2- 甲醯胺 將72 mg (0.16 mmol) 5-({[6-(2-羥基丙-2-基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2-(4,4,4-三氟丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-7)於10 ml THF中之溶液冷卻於冰/水冷卻浴中。添加0.26 ml於二乙醚中之3M甲基溴化鎂溶液並將混合物攪拌2 h且然後在室溫下攪拌20 h。再添加1當量之3M甲基溴化鎂溶液且在室溫下將混合物攪拌24 h。添加飽和氯化銨水溶液，用乙酸乙酯將混合物萃取三次並用氯化鈉溶液洗滌萃取物且濃縮。製備型HPLC獲得22 mg (理論值之31%)標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): R
t
= 1.15 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值464.20。
1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 1.56 (s, 6H), 1.64 (s, 6H), 2.07 - 2.34 (m, 4H), 4.49 (t, 2H), 5.32 (s, 1H), 6.05 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.87 (dd, 1H), 7.99 - 8.05 (m, 2H), 8.35 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 12.45 (s, 1H)。
實例 22 N-{2-[2-(1- 羥基環丙基 ) 乙基 ]-6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2H- 吲唑 -5- 基 }-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺
首先將250 mg (0.69 mmol) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)裝填於5 ml DMSO中。添加159 mg (0.96 mmol) 1-(2-溴乙基)環丙醇、285 mg碳酸鉀及171 mg碘化鉀且在100℃下將混合物攪拌5 h。添加水並用乙酸乙酯將混合物萃取三次。用氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Waters XBridge C18 5µ 100×30mm，溶析液A：水+ 0.1體積%甲酸(99%)，溶析液B：乙腈)純化殘餘物。冷凍乾燥獲得45 mg標題化合物。
1
H-NMR (500 MHz, DMSO-d
6
): δ [ppm]= 0.18 - 0.22 (m, 2H), 0.48 - 0.52 (m, 2H), 1.62 (s, 6H), 2.08 (t, 2H), 4.54 - 4.60 (m, 2H), 5.36 (s, 1H), 5.96 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 8.16 (dd, 1H), 8.34 - 8.39 (m, 2H), 8.45 (d, 1H), 8.72 (s, 1H), 12.36 (s, 1H)。
多種自體免疫病症中之生理效能之評估 IRAK4 激酶分析
在下文所述之IRAK4 TR-FRET分析(TR-FRET =時間解析螢光共振能量轉移)中量測本發明物質之IRAK4抑制活性。 使用在感染桿狀病毒之昆蟲細胞(Hi5、BTI-TN-5B1-4細胞系，購自Invitrogen，目錄號B855-02)中表現並經由親和層析純化之N端GST (麩胱甘肽S-轉移酶)及人類IRAK4的重組融合蛋白作為酶。用於激酶反應之受質係生物素化肽生物素-Ahx-KKARFSRFAGSSPSQASFAEPG (C端呈醯胺形式)，可購自例如Biosyntan GmbH (Berlin-Buch)。 對於分析，自測試物質於DMSO中之2 mM溶液製備介於20 µM至0.073 nM範圍內之11種不同濃度。將50 nl各別溶液吸量至黑色低體積384孔微量滴定板(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)中，添加IRAK4於分析緩衝液[50 mM HEPES (pH 7.5)、5 mM MgCl
2
、1.0 mM二硫蘇糖醇、30 µM經活化正釩酸鈉、0.1% (w/v)牛γ-球蛋白(BGG)、0.04% (v/v) nonidet-P40 (Sigma)]中之2 µl溶液，且將混合物培育15 min以允許物質與酶在激酶反應之前預結合。然後藉由添加三磷酸腺苷(ATP, 1.67 mM = 於5 µl分析體積中之最終濃度：1 mM)及肽受質(0.83 µM = 於5 µl分析體積中之最終濃度：0.5 µM)於分析緩衝液中之3 µl溶液起始激酶反應，且將所得混合物在22℃培育45 min之反應時間。將IRAK4之濃度調節至各別酶活性且設定使得分析係在線性範圍內實施。典型濃度為約0.2 nM之等級。藉由添加TR-FRET檢測試劑[0.1 µM鏈黴抗生物素蛋白-XL665 (Cisbio Bioassays; France，目錄號610SAXLG)]及1.5 nM抗磷絲胺酸抗體[Merck Millipore, 「STK抗體」，目錄號35-002]及0.6 nM LANCE EU-W1024標記之抗小鼠-IgG抗體(Perkin-Elmer，產品編號AD0077；或者，可使用來自Cisbio Bioassays之鋱穴狀化合物標記之抗小鼠-IgG抗體)於EDTA水溶液(100 mM EDTA、0.4 % [w/v]牛血清白蛋白[BSA]於25 mM HEPES pH 7.5中)中之5 µl溶液來終止反應。 將所得混合物在22℃培育1 h以允許形成生物素化磷酸化受質及檢測試劑之錯合物。然後藉由量測自銪螯合物標記之抗小鼠IgG抗體至鏈黴抗生物素蛋白-XL665之共振能量轉移來評估磷酸化受質之量。為此，於TR-FRET量測儀器(例如Rubystar (BMG Labtechnologies, Offenburg, Germany)或Viewlux (Perkin-Elmer))中在350 nm激發後在620 nm及665 nm量測螢光發射。將665 nm及622 nm之發射之比率作為磷酸化受質之量之量度。將數據正規化(無測試物質之酶反應= 0%抑制；所有其他分析組分但沒有酶= 100%抑制)。通常，測試物質係在相同微量滴定板上以介於20 µM至0.073 nM範圍內之11種不同濃度(20 µM、5.7 µM、1.6 µM、0.47 µM、0.13 µM、38 nM、11 nM、3.1 nM、0.89 nM、0.25 nM及0.073 nM)測試。在分析之前藉由連續稀釋製備稀釋系列(2 mM至7.3 nM於100% DMSO中)。藉由4-參數擬合計算IC
50
值。
表 1 ：
IRAK4激酶分析中實例化合物之IC
50
值
同樣在上文所述之IRAK4 TR-FRET分析中量測通式(III)化合物對IRAK4之抑制活性。例如提及以下化合物：IC
50
= 21.7 nM之中間體4-2、IC
50
= 13.0 nM之中間體4-3及IC
50
= 6.2 nM之中間體4-4。
THP-1 細胞中之 TNF-α 分泌
藉助此測試，可測試物質抑制THP-1細胞(人類單核球性急性白血病細胞系)中之TNF-α (腫瘤壞死因子α)分泌之能力。TNF-α係參與所舉自體免疫病症(例如類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、別赫捷列夫氏病、牛皮癬、克隆氏病、潰瘍性結腸炎等)之發炎過程之關鍵細胞介素。在此測試中，TNF-α分泌係藉由與細菌脂多醣(LPS)一起培育來觸發。 將THP-1細胞保持在連續懸浮細胞培養物[含有L-Glutamax之RPMI 1460培養基(Gibco，目錄號61870-044)，其補充有10%胎牛血清(FCS) (Invitrogen，目錄號10082-147)、1%青黴素/鏈黴素(streptomycin) (Gibco BRL，目錄號15140-114)]中，且不應超過1×10
6
個細胞/ml之細胞濃度。在細胞培養基(含有L-Glutamax之RPMI 1460培養基，其補充有10% FCS)中實施該分析。 在每一情形下，將每孔2-2.5 µl細胞懸浮液(對應於4000個細胞)分配至384孔測試板(Greiner，目錄號784076)中，在每孔中40-50 nl物質已溶解於100% DMSO中。對於每一物質，此係使用介於20 µM至0.073 nM範圍內之10種不同濃度來進行。將細胞在室溫下培育15 min。然後將2-2.5 µl溶解於細胞培養基(final concentration 0.05 µg/ml)中之0.1 µg/ml LPS (Sigma，大腸桿菌055:B5，目錄號L5418)分配至每孔中。作為中性對照，用0.05 µg/ml LPS及1% DMSO處理細胞，且作為抑制劑對照，僅用1% DMSO處理細胞。 將板在80 g下離心30 s且在37℃、5% CO
2
及95%大氣濕度下培育17 h。使用TNF-α HTRF檢測套組(Cisbio，目錄號62TNFPEB/C)測定TNF-α之量。為此，根據製造商之說明書，在每一情形下添加2 µl由溶解於重構緩衝液中之抗TNF-α-XL665偶聯物及抗TNF-α-穴狀化合物偶聯物組成之檢測溶液用於HTRF (均相時間解析螢光)測試。添加後，將混合物在室溫下培育3 h或在4℃下過夜。然後在620/665 nm下使用支持HTRF之量測儀器(例如BMG PheraStar)讀取信號。 物質之活性表示為中性與抑制劑對照之間之比率(%)。使用4-參數擬合計算IC
50
值。
表 2 ：
實例化合物針對THP-1細胞中之TNF-α分泌之IC
50
值
人類 PBMC ( 末梢血單核細胞 ) 中活體外 LPS ( 脂多醣 ) 誘導之細胞介素產生
檢查通式(I)化合物對人類PBMC中之經誘導細胞介素產生之效應。細胞介素產生在此處係由LPS (TLR4配體)誘導，其引起IRAK4介導之信號路徑活化。 自抗凝聚人類全血獲得人類PBMC。出於此目的，首先將15 ml Ficoll-Paque (Biochrom，目錄號L6115)裝填於Leucosep管中且添加20 ml人類血液。將血液在室溫下在800 g下離心15 min後，移除包括血小板之血漿且丟棄。將PBMC轉移至離心管中且用PBS (磷酸鹽緩衝鹽水) (Gibco，目錄號14190)補足。將細胞懸浮液在室溫下在250 g下離心10 min且丟棄上清液。將PBMC重懸浮於完全培養基(RPMI 1640，不含L-麩醯胺酸(PAA，目錄號E15-039)、10% FCS；50 U/ml青黴素、50 µg/ml鏈黴素(PAA，目錄號P11-010)及1% L-麩醯胺酸(Sigma，目錄號G7513))中。 亦在完全培養基中實施該分析。將PBMC以2.5×10
5
個細胞/孔之細胞密度接種於96孔板中。使通式(I)化合物經受恆定體積之100% DMSO中之連續稀釋且以介於10 µM至3 nM範圍內之8種不同濃度用於分析中，使得最終DMSO濃度為0.4% DMSO。在實際刺激之前，隨後將細胞與其一起預培育30 min。為誘導細胞介素分泌，用0.1 µg/ml LPS (Sigma，大腸桿菌0128:B12，目錄號L2887)刺激細胞達24小時。根據製造商之說明書使用CellTiter-Glo發光分析(Promega，目錄號G7571 (G755/G756A))測定細胞活力。根據製造商之說明書使用人類促發炎9重組織培養套組(MSD，目錄號K15007B)測定細胞培養上清液中分泌之TNF-α之量。舉例而言，實例化合物11及實例化合物12具有活性≤ 1 µM。
人類樹突細胞 (DC) 之活體外 TLR4/TLR7 誘導之介白素 (IL)-23 分泌
在人類DC中檢查通式(I)化合物對誘導產生在生成TH-17細胞(IL-17產生T輔助細胞)方面起重要作用之促發炎細胞介素IL-23之效應。陳述TH-17細胞在諸如以下等病症之發病機制中起關鍵作用：類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、別赫捷列夫氏病(關節黏連性脊椎炎)、牛皮癬、異位性皮膚炎、全身性紅斑狼瘡或多發性硬化(Lubberts, Nat. Rev. Rheumatol., 2015；Marinoni等人，Auto. Immun. Highlights, 2014；Isailovic等人，J. Autoimmun., 2015；Richtlin及Krueger, Curr Opin Rheumatol. 2016年5月; 28(3):204-10；Leonardi等人，Allergy Asthma Proc. 2015；Araújo等人，Rev Bras Rheumatol. 2016；Staschke等人，J Immunol., 2009)。為檢測通式(I)化合物對IL-23產生之效應，使人類原代單核球(藉助磁分離[Miltenyi Biotech，單核球分離套組，目錄號130-091-153]並在完全培養基(VLE (極低內毒素) RPMI 1640 [Biochrom AG，目錄號FG1415]、10%胎牛血清(FBS) [Gibco，目錄號10493-106]；50 µM β-巰基乙醇[Gibco，目錄號31350]、50 U/ml青黴素及鏈黴素[Gibco，目錄號15140-114])中添加生長因子(重組人類GM-CSF [PeproTech，目錄號300-03]及IL-4 [PeproTech，目錄號200-04])自人類PBMC分離)在培養物中在6天內分化以獲得DC。收穫DC後，將其重懸浮於完全培養基中且以2×10
7
個細胞/孔之細胞密度接種於96孔板(Costar，目錄號3599)中。使通式(I)化合物經受恆定體積之100% DMSO中之連續稀釋且以介於10 µM至1 nM範圍內之9種不同濃度用於分析中。在此處確保對於所用9種濃度中之每一者，所存在之DMSO濃度總是為0.1% DMSO。將DC與通式(I)化合物一起預培育30分鐘。此後，在培育器(37℃、95% rH、5% CO
2
)中藉助10 ng/ml之LPS (Sigma，大腸桿菌血清型0127:B8，目錄號L3129) (TLR4配體)及2.5 µg/ml之TLR7/8配體R848 (Invivogen，目錄號tlrl-r848-5) (二者皆引起IRAK4介導之信號傳導路徑活化)刺激DC達24小時以產生IL-23。在24小時之此培育時間後，移除上清液且藉助市售hIL-23 ELISA(eBiosciences，目錄號88-7237-88)分析，其係根據製造商之說明書實施。例如，實例化合物12對人類DC中之IL-23之抑制之結果顯示於圖1中。
活體外 人類 Th17 細胞對介白素 (IL)-17 分泌之刺激
在人類Th17細胞中研究通式(I)化合物對誘導產生促發炎細胞介素IL-17 (其視為類風濕性關節炎、牛皮癬關節炎、別赫捷列夫氏病(關節黏連性脊椎炎)、反應性關節炎、牛皮癬、異位性皮膚炎、全身性紅斑狼瘡、慢性發炎性腸病亦及多發性硬化之發病機制中之關鍵細胞介素)之抑制作用。為此，首先，自抗凝聚人類全血如下獲得人類PBMC：將20 ml人類血液添加至初始預先裝填有15 ml Ficoll-Paque (Biochrom，目錄號L6115)之leucosep管中。將血液在室溫下在800 g下離心15 min，且然後移除包括血小板之血漿並丟棄。將PBMC轉移至離心管中且用PBS (磷酸鹽緩衝鹽水) (Gibco，目錄號14190)補足。將細胞懸浮液在室溫下在250 g下離心10 min，且丟棄上清液。將PBMC重懸浮於完全培養基(RPMI 1640，不含L-麩醯胺酸(PAA，目錄號E15-039)、10% FCS；50 U/ml青黴素、50 µg/ml鏈黴素(PAA，目錄號P11-010)及1% L-麩醯胺酸(Sigma，目錄號G7513))中。隨後，藉由管柱(LS管柱，Miltenyi Biotech，目錄號130-042-401)上之磁細胞分離(CD4+ T細胞分離套組，Miltenyi Biotech，目錄號130-096-533)自PBMC分離CD4+ T細胞。將以此方式獲得之CD4+ T細胞以5×10
4
個CD4+ T細胞/孔之細胞密度接種於96孔板(平底，Costar，目錄號3599)中。此分析亦係使用完全培養基來實施。使通式(I)化合物經受恆定體積之100% DMSO中之連續稀釋且以介於10 μM至1 nM範圍內之9種不同濃度用於分析中，使得最終DMSO濃度為0.1% DMSO。將細胞與各別濃度之通式(I)化合物於培育器中一起預培育30分鐘。然後添加由抗CD3/抗CD28珠粒(2500個珠粒/50 000個細胞；T細胞活化套組，Miltenyi Biotech，目錄號130-091-441)、重組人類(rh) IL-23 (20 ng/ml；eBioscience，目錄號14-8239-63)、rhIL-1β (20 ng/ml；eBioscience，目錄號34-8018)、rhIL-6 (20 ng/ml；eBioscience，目錄號34-8069)及rhIL-2 (100 IU/ml；eBioscience，目錄號SRP3085)組成之Th17分化混合劑，CD4+ T細胞藉助該Th17分化混合劑在6天內分化成Th17細胞，且同時刺激以產生IL-17。在培育器中培育6天後，移除細胞培養物上清液且使用商業hIL-17 ELISA (人類IL-17a ELISA Ready-SET-Go, eBiosciences，目錄號88-7176-88)來分析，其係根據製造商之說明書來實施。例如，實例化合物12對Th17細胞分化亦及因此最終對IL-17產生之抑制之結果顯示於圖2中。
活體外 TLR7/8 或 TLR9 誘導之人類漿細胞樣樹突細胞 (pDC) 之 IFN-α 產生
藉助此測試，可在人類pDC中研究通式(I)化合物對全身性紅斑狼瘡之發病機制中之關鍵細胞介素IFN-α (干擾素-α)產生之效應(Mathian等人，Arthritis Rheum, 2009；Crow M.K., Rheum Dis Clin N Am, 2010)。出於此目的，如上文所述，自全血分離人類PBMC且藉助市售細胞分離套組(Miltenyi Biotech，漿細胞樣樹突細胞分離套組II，目錄號130-097-415)自其分離漿細胞樣DC (pDC)。將由此獲得之pDC重懸浮於完全培養基(RPMI 1640 + GlutaMax [
Gibco
，目錄號61870-010]，補充有10% FBS [Gibco，目錄號10493-106]及50 U青黴素/鏈黴素[Gibco，目錄號15140-114])中且以5×10
4
個細胞/孔之細胞密度平鋪於96孔微量滴定板(Costar，目錄號3599)中。使通式(I)化合物經受恆定體積之100% DMSO中之連續稀釋且以介於10 µM至1 nM範圍內之9種不同濃度用於分析中。在此處確保對於所用9種濃度中之每一者，所存在之DMSO濃度總是為0.1% DMSO。將pDC與通式(I)化合物一起預培育30分鐘。用TLR7/8配體(咪喹莫特，R837,Invivogen，目錄號tlrl-imq)或用TLR9配體(CPG-A, ODN2216, Invivogen，目錄號tlrl-2216-1)刺激pDC且此引起IRAK-4介導之信號傳導路徑活化。培育24小時後，移除細胞培養上清液且藉助市售人類IFN-α ELISA (IFNα多亞型ELISA套組，pbl Assay Science，目錄號41105-1)分析。例如，實例化合物12對人類漿細胞樣DC中之IFN-α之抑制之結果顯示於圖3中。
活體內 TLR 介導之發炎模型
在活體內TLR介導之發炎模型中檢查通式(I)化合物之活體內效能。由於使用LPS介導之發炎模型，此機制模型具體而言顯示通式(I)化合物對TLR4介導之病症之潛在效應。在此模型中，將雌性NMRI小鼠(約6週齡；Charles River Laboratories, Germany)分成每組5隻動物組。用物質已溶解之媒劑(乙醇-花生油10:90 v/v) (物質媒劑)亦及用LPS已溶解之媒劑治療健康對照組。與受質治療組一樣，亦向陽性對照組腹膜內(i.p.)投與在每一情形下0.2 mg之LPS/kg體重(Sigma，目錄號L4391) (來自大腸桿菌0111:B4之脂多醣)。另外，用上文所述之物質媒劑治療陽性對照組。在藉由投與LPS誘導發炎之前1小時經口投與物質。為檢查通式(I)化合物對發炎之效應，在1.5小時後自動物獲取最終血樣。根據製造商之說明書使用小鼠TNF-α及小鼠IL-6 Ready-SET-Go ELISA套組(eBioscience，mTNFα目錄號88-7324-88，mIL-6目錄號88-7064-88)測定血漿中細胞介素TNF-α及IL-6之濃度。IRAK4抑制劑在TLR介導之發炎模型中有活性。施加LPS可快速誘導血漿中之促發炎細胞介素(例如TNF-α及IL-6)，此藉由用通式(I)化合物處理以劑量依賴性方式被抑制。此例如對於化合物12及11顯示於圖4中。在一些實驗中，亦在動物模型中測試臨床上相關之比較物質(例如TNF拮抗劑阿達木單抗(Humira
®
)或依那西普，二者在每一情形下係在用劑量為1.5 mg/kg、5 mg/kg及10 mg/kg之LPS誘導發炎之前1 h經皮下投與)，以比較抑制有效性。
活體內 佐劑誘發之關節炎模型
為確定通式(I)化合物之抗發炎活性，在關節炎模型中檢查其活體內效能。出於此目的，在第0天，向雄性路易士大鼠(Lewis rat) (約100-125 g, Charles River Laboratories, Germany)之尾根中各自皮下投與100 µl完全弗氏佐劑(CFA)溶液(結核分枝桿菌(
M. tuberculosis
) H37Ra [Difo Lab，目錄號-231141]，溶解於不完全弗氏佐劑[Difco Lab，目錄號-263910]中)。每組中有n = 8隻大鼠。在該研究中包括健康對照組及疾病對照組二者。以預防性方式(自第0天)或以治療性方式(自第9天)僅給予每一對照組測試物質之媒劑(克列莫佛(Cremophor)-乙醇-水40:10:50 v/v/v)之經口治療。同樣以預防性方式或以治療性方式藉由經口施加開始不同劑量之測試物質之治療。在第0天，根據疾病活動性評分(基於積分系統之關節炎嚴重性之等級)預先確定動物之起始病況。在此積分系統(評分)中，根據關節發炎之程度，針對紅斑(包括關節腫脹)之存在授予兩個後爪0至4之積分(0 =無；1 =輕度；2 =中度；3 =顯著；4 =重度)且將其加在一起。為確定化合物之抗發炎效能，藉助疾病活動性評分自第8天(動物首先展現關節炎體徵時)開始及隨後每週3次直至結束(第20天)對動物之疾病狀況進行評分。另外，在實驗進程期間，使用自動握力測試計(IITC Life Science Inc., USA)將動物之握力測定為痛覺過敏之量度。作為關節腫脹之量度，亦經由器官充滿度量測計(IITC Life Science Inc., USA)量測各爪之體積作為關節腫脹之量度。在第20天時，終止實驗且在MRT (磁共振斷層掃描儀；MAGNETOM Avanto syngo MR B17, Siemens, Germany)中在吸入性麻醉(異氟醚)下使用MRT序列STIR (短時反轉恢復序列用於脂肪信號抑制及檢測水腫)作為成像方法實施磁共振成像掃描來分析關節炎之嚴重程度。此外，尤其藉由用150 μl無菌鹽水關節內沖洗膝關節自關節炎關節獲得滑液且使用來自Meso Scale Discovery (MSD)之商業多重ELISA儀器(促發炎面板1；目錄號K15059D-1)檢查所存在之細胞介素濃度。然後使用膝關節生檢分析組織中之細胞介素濃度(藉由來自MSD之多重ELISA)或CRP含量(大鼠C-反應蛋白，目錄號557825, BD Bioscience)或彈性蛋白酶活性(作為嗜中性球浸潤之量度)，或以組織病理學方式檢查滑液以及關節內及關節周組織中之發炎症狀。為此，在-196℃下在冷卻珠磨機(CryoMill；Retsch GmBH, Germany)中磨碎膝關節生檢，在每一情形下將200 mg溶解於適當緩衝液中用於細胞介素分析(於0.5 ml RPMI1640培養基，Gibco中)或用於彈性蛋白酶活性(於1 ml均質緩衝液[pH 7.0；室溫儲存；5 g 5%十六烷基三甲基溴化銨、2.09 g 10 mM MOPS，在30-35℃下添加900 ml純淨水]中)。為量化嗜中性球彈性蛋白酶(NE)之蛋白酶活性，使用對NE具有高特異性之螢光標記之受質[MeOSuc- AAPV - AMC (N-甲氧基琥珀醯基-Ala-Ala-Pro-Val-7-胺基-4-甲基香豆素)，目錄號I-1270, Bachem, Germany] (Castillo等人，1979；Wiesner等人，2005)。使用重組鼠類NE (目錄號4517-SE-010, R&D Systems, Germany；溶解於均質緩衝液中，參見上文)作為標準曲線，且使用均質緩衝液作為空白值。對於彈性蛋白酶分析，在每一情形下使用25 µl關節均質物並將其吸量至黑色96孔微量滴定板(平底，NUNC, Germany)中，且然後與25 µl於冷TrisBSA緩衝液(0.1% BSA [部分V]、0.1 M參(羥基甲基)胺基甲烷、1 M NaCl於1升水中；pH 8.5；儲存在4℃下)中之1 mM MeOSuc-AAPV-AMC受質溶液混合。使用預熱之讀板儀(SpectraMax M2, Molecular Devices)，在30 min後在37℃及λ
Ex
= 380 nm及λ
Em
= 460 nm下量測微量滴定板中之螢光，且使用NE標準曲線藉助軟體SoftmaxPro 6.4計算嗜中性球彈性蛋白酶之量。對於組織病理學評價，進而使用評分，其端視所討論各別參數(發炎、軟骨損傷、滑液增生、血管翳、骨損傷、骨膜變化)之損傷程度針對病理性關節損傷之存在或嚴重性授予0至4之積分(0 =無；1 =輕度；2 =中度；3 =顯著；4 =重度)。使用單因子方差分析(ANOVA)且藉助多重比較分析(Dunnett測試)與對照組比較來實現統計分析。 在大鼠中皮下投與CFA會引起大鼠中具有顯著關節發炎之急性關節炎。以實例性方式，此大鼠關節炎模型代表人類關節炎(例如牛皮癬關節炎、類風濕性關節炎、反應性關節炎及別赫捷列夫氏病)情形下之關節發炎(Bendele, J Musculoskel Neuron Interact 2001；McCann等人，Arthritis Res Ther, 2010)。藉由用實例化合物11預防性亦及治療性治療，可顯著抑制佐劑誘發之關節炎，且組織學及MRI數據尤其指示與DMARD (疾病改質抗風濕藥)相同之疾病改質作用。此藉由圖5圖解說明。在一些實驗中，亦在動物模型中測試每隔三天皮下投與之臨床上相關之比較物質，即TNF拮抗劑依那西普(10 mg/kg或25 mg/kg，自第0天)，以比較抑制有效性。
小鼠中之活體內膠原抗體誘發之關節炎模型
在另一鼠類關節炎模型中檢查通式(I)化合物之抗發炎效應。出於此目的，在第0天向雌性Balb/c小鼠(約9週齡，Charles River Laboratories, Kingston, Canada)之尾靜脈中各自靜脈內注射200 µl膠原抗體混合劑(10 mg/ml；ArthritoMab, MD Bioproducts) (納入研究中之健康對照組除外)。在第6天，進而使該等小鼠各自接受200 µl LPS之另一腹膜內注射。每組中有n = 10隻小鼠。在該研究中包括健康對照組及疾病對照組二者。以預防性方式(即自第0天)或以治療性方式(自第9天)僅給予每一對照組測試物質之媒劑(乙醇:花生油10:90 v/v)之經口治療。同樣以預防性方式或以治療性方式藉由經口投與開始不同劑量之測試物質之治療。在實驗進程期間，基於所有四個爪上疾病活動性評分之積分授予系統對疾病之程度進行評分。在此積分授予中，不授予健康爪積分，而在每一情形下針對源自腳趾經由蹠關節至踝關節之關節發炎之具體程度授予1 [例如腳趾之輕度發炎]至4 [延伸至整個爪之重度發炎]之積分，如下文所解釋： • 0 =正常 • 1 =紅斑及輕度腫脹，限於跗骨或踝或腳趾 • 2 =紅斑及輕度腫脹，自踝延伸至蹠(2肢段) • 3 =紅斑及中度腫脹，自踝延伸遠至蹠關節 • 4 =紅斑及重度腫脹，涵蓋蹠、足及腳趾。 同時，在實驗進程中，經由器官充滿度量測計(IITC Life Science Inc., USA)量測爪體積作為關節腫脹之量度。對於此參數，在每一情形下預先在實驗開始前一天(第-1天)測定起始病況，且隨後自第8天以後每週三次對疾病活動性評分及爪體積進行評分。在第21天時，終止實驗且檢查膝關節生檢用於滑液以關節內及關節周組織中之發炎症狀之組織病理學分析。對於組織病理學評價，同樣使用評分，其端視所討論各別參數(發炎、軟骨損傷、滑液增生、血管翳、骨損傷、骨膜變化)之損傷程度針對病理性關節損傷之存在或嚴重性授予0至4之積分(0 =無；1 =輕度；2 =中度；3 =顯著；4 =重度)。使用單因子方差分析(ANOVA)且藉助多重比較分析(Dunnett測試)與對照組比較來實現統計分析。 在小鼠中靜脈內投與膠原抗體混合劑(包括後續腹膜內投與LPS)會引起小鼠中具有顯著關節發炎之急性關節炎(Holmdahl等人，APMIS 1989；McCann等人，Arthritis Res Ther, 2010)且因此代表用於關節炎適應症牛皮癬關節炎、類風濕性關節炎、反應性關節炎及別赫捷列夫氏病之另一動物模型。藉由用實例化合物12預防性亦及治療性治療，可顯著抑制此膠原抗體誘發之關節炎，且後爪關節之組織病理學數據指示疾病改質作用。此藉由圖6來圖解說明。
小鼠中之活體內 MOG33-35 誘發之慢性 EAE ( 實驗性自體免疫腦脊髓炎 ) 模型
為確定通式(I)化合物之抗發炎活性，在多發性硬化(MS)之實驗性動物模型中檢查該等化合物之活體內效能。慢性MOG
33-35
(髓鞘寡突膠質細胞醣蛋白)誘發之EAE (實驗性自體免疫腦脊髓炎)模型係用於測試藥理學物質於MS患者中之潛在用途之標準動物模型。為此，將雌性C57BL/6小鼠(19-20 g；Jackson Laboratories, Bar Harbor, USA)隨機化且以10至15隻動物/組之組強度使用。在第0天時利用皮下注射在每一情形下0.1 ml之溶液(包含200 μg MOG
33-35
肽，乳化於100 μl補充有結核分枝桿菌(MT；8 mg/ml，H37RA株)之CFA (完全弗氏佐劑；2 mg/ml)中)，藉由另外腹膜內投與(第0天及第2天) 200 ng百日咳毒素(PTx；溶解於0.1 ml PBS中(2 μg/ml))來誘導EAE病症，且經34天監測其進展。實驗亦包含健康對照組及疾病對照組二者，其皆已用實例化合物12之媒劑(乙醇:花生油10:90 v/v)經口治療。相反，作為預防性療法，即自第0天，藉由經口投與使治療組接受不同日劑量之實例化合物12。每日檢查諸如EAE之發病率及症狀等參數。在此處，使用代表病症之嚴重程度之積分系統對EAE症狀進行評分(EAE疾病活動性評分)： • 0 =正常、健康 • 1 =無力/麻痺的小鼠尾部 • 2 =無力/麻痺的小鼠尾部且後爪虛弱 • 3 =無力/麻痺的小鼠尾部且後爪完全麻痹 • 4 =麻痺的尾部、後爪完全麻痹且前爪部分麻痹 • 5 =所有前爪及後爪完全麻痹、安樂死 在EAE誘導後第34天時，終止實驗且尤其自小鼠抽取血液用於後續生物標記物分析，且抽取骨髓用於神經軸退化及淋巴球浸潤之組織病理學評價。對於病症嚴重程度之之組織病理學評價，用蘇木精、伊紅及羅克沙爾固藍(luxol fast blue)對骨髓進行染色，且然後使用積分系統對神經軸退化、淋巴球浸潤至白質中及淋巴球浸潤至灰質中進行盲化評分(0 =正常，無發現物；1 =少量發現物；2 =輕度發現物；3 =中度發現物；4 =顯著發現物；5 =重度發現物)。使用單因子方差分析ANOVA且藉由多重比較分析(Dunnett測試)與對照組比較來實施統計分析。藉由用實例化合物12治療，可抑制誘發性EAE (MS之實驗模型)。在此處，實例化合物與亦在實驗中作為臨床比較物質進行測試之類固醇(普賴蘇濃；自第0天每日經口1 mg/kg)或特立氟胺(Aubagio
®
；自第0天每日經口10 mg/kg)之效能相當或甚至優於其效能。此圖解說明於圖7中。
小鼠中活體內咪喹莫特誘發之牛皮癬模型
在牛皮癬動物模型中檢查通式(I)化合物之抗發炎效應。在小鼠中，局部投與TLR7/8配體及強效免疫活化劑咪喹莫特(IMQ)會引起皮膚上之牛皮癬樣表型。因此，經7天，將每天3.5 mg咪喹莫特(等效於70 mg 5% Aldara
®
乳霜，Meda AB)局部施加至小鼠之已預先剃毛之背部皮膚上及雙耳(外側)。而使亦經測試之健康對照組接受石蠟油。隨後，與健康對照組一樣，以預防性方式、即自第0天用測試化合物之媒劑(Solutol HS15-水(40/60 v/v))每日經口(p.o.)治療IMQ疾病對照。亦在第0天開始不同劑量之測試化合物之每日經口治療。在每一情形下，組大小為n = 10隻動物。在實驗期間，藉助積分系統使用下文所述之臨床評分每天視覺評價牛皮癬之表現：
同時，每天使用數位卡尺(Kutimeter; Horex Digital Caliper, Helios-Preisser, Germany)量測背部皮膚及雙耳之厚度及/或水腫形成。每2天檢查每一小鼠之體重。在第7天時，終止實驗且在將動物殺死後，將背部皮膚及雙耳固定於福馬林中用於後續組織病理學評價。在切片機(Leica, Germany)中之石蠟皮膚切片(2 μm)之蘇木精/伊紅染色後，由病理學家以盲化形式實施耳及背部皮膚之此組織病理學評價。在此處，檢查以下態樣且藉助積分系統評價其嚴重程度(對於所檢查之每一參數)：角化不全(特徵在於在角質層中剩餘細胞核或細胞核殘餘物之角化受損)/角化過度(皮膚過度角化)及免疫細胞浸潤至真皮或表皮中。在此處，如下評價所檢查之每一組織學參數： • 0 =正常 • 1 =輕度變化 • 2 =中度變化 • 3 =顯著變化 然後將所有組織學參數加在一起且表示為總組織學評分。另外，量測皮膚切片中表皮之厚度。小鼠中IMQ介導之皮膚發炎代表用於適應症牛皮癬或用於牛皮癬關節炎之皮膚表型之動物模型(van der Fits等人，J Immunol 2009)。藉由用實例化合物12治療，可抑制誘發性牛皮癬。在此處，實例化合物與亦在實驗中作為臨床比較物質進行測試之類固醇(倍他米松，Celestene
®
；每日經口2.5 mg/kg)或TNF拮抗劑(依那西普；每隔一天腹膜內5 mg/kg)之效能相當或甚至優於其效能。此藉由圖8來圖解說明。
小鼠中活體內 DNFB 誘發之皮膚發炎模型
小鼠中DNFB (2,4-二硝基-1-氟苯)誘發之過敏性接觸性皮膚炎(接觸性過敏)模型代表在主要由1型T輔助淋巴球(Th1細胞)介導之延遲型免疫反應(延遲型過敏性；DTH)背景下之發炎性皮膚病症。此Th1介導之皮膚發炎反應代表牛皮癬、牛皮癬關節炎及過敏性接觸性濕疹期間之發炎過程之實例(Roese等人，Exp Dermatol. 2012)。為觸發皮膚發炎，預先在第0天及第1天，使用在每一情形下25 μl之0.5%強度(w/v) DNFB溶液(2,4-二硝基氟苯，目錄號70-34-8, Sigma Aldrich, Germany；溶解於丙酮/橄欖油中；4/1；v/v)敏化雌性NMRI小鼠(22-24 g, Charles River, Germany)之背部剃毛皮膚(面積約10 cm
2
)。在每一情形下，組大小為n = 10隻小鼠。然後在第5天藉由在每一情形下將20 μl之0.3%強度(w/v) DNFB溶液(於丙酮/橄欖油；4/1；v/v中)局部施加至雙耳外側(每耳之面積為約2 cm
2
)來觸發皮膚發炎。亦在實驗中皆測試健康對照組(僅用溶劑丙酮/橄欖油[4/1; v/v]「敏化及觸發」)、疾病對照組(用DNFB敏化及觸發)及刺激對照(僅用溶劑敏化，用DNFB觸發)。。在觸發皮膚發炎之前1 h僅用測試物質之媒劑(乙醇:花生油，10:90 v/v)經口治療該等對照組，使治療組同樣經口接受適宜劑量之測試物質。在第6天(觸發發炎後24小時)，使用數位卡尺個別地測定每一耳之耳厚度，且測定每一小鼠之耳重量。藉由隨後分析耳均質物(其係藉由在1.5 ml均質緩衝液中將耳均質化(由Feinmechanik-Werkstatt, Bayer AG, Germany製造之自動均質器) 20 sec且隨後離心(15 000 rpm；12℃, 20 min)並移除上清液獲得)，可測定尤其彈性蛋白酶活性作為嗜中性球浸潤至發炎組織中之量度。為量化嗜中性球彈性蛋白酶(NE)之蛋白酶活性，使用對NE具有高度特異性之螢光標記之受質(MeOSuc - AAPV - AMC；目錄號I-1270, Bachem, Germany) (Castillo等人，1979；Wiesner等人，2005)。在此處，使用重組鼠類NE (目錄號4517-Se-010, R&D Systems, Germany；溶解於均質緩衝液中)作為標準曲線且使用均質緩衝液作為空白值。對於彈性蛋白酶分析，使用在每一情形下25 μl之耳均質物並將其吸量至黑色96孔微量滴定板(平底，NUNC, Germany)中且然後與25 μl於冷TrisBSA緩衝液中之1 mM MeOSuc-AAPV-AMC受質溶液混合。在30 min後在37℃及λ
Ex
= 380 nm及λ
Em
= 460 nm下使用預熱之讀板儀(SpectraMax M2, Molecular Devices)量測微量滴定板中之螢光，且用軟體SoftmaxPro 6.4使用NE標準曲線計算嗜中性球彈性蛋白酶之量。 藉由用實例化合物11及實例化合物12治療，可抑制由DNFB觸發之ThH1介導之皮膚發炎。此顯示於圖9中。
小鼠中活體內 TMA 誘發之皮膚發炎模型
小鼠中TMA (偏苯三酸酐)誘發之過敏性接觸性皮膚炎(接觸性過敏)模型代表在主要由嗜酸性球及2型T輔助淋巴球(THh2細胞)介導之延遲型免疫反應(延遲型過敏性；DTH)背景下之發炎性皮膚病症。此Th2介導之皮膚發炎反應代表異位性皮膚炎期間及接觸性過敏期間之發炎過程之實例(Sur等人，BMC Complement Altern Med. 2015)。為觸發皮膚發炎，預先在第0天，使用在每一情形下50 μl之3%強度(w/v) TMA溶液(目錄號552-30-7, Sigma Aldrich, Germany；溶解於丙酮/肉豆蔻酸異丙酯中；4/1；v/v)敏化雌性NMRI小鼠(22-24 g, Charles River, Germany)之背部剃毛皮膚(面積約10 cm
2
)。在每一情形下，組大小為n = 10隻小鼠。然後在第5天，藉由在每一情形下將10 μl之3%強度(w/v) TMA溶液(於丙酮/肉豆蔻酸異丙酯中；4/1；v/v)局部施加至雙耳外側(每一耳之面積為約2 cm
2
)來觸發皮膚發炎。亦在實驗中測試健康對照組(僅用溶劑丙酮/肉豆蔻酸異丙酯[4/1；v/v]「敏化及觸發」)及疾病對照組(用TMA敏化及觸發)二者。而僅在觸發皮膚發炎之前1 h用測試物質之媒劑(乙醇:花生油10:90 v/v)經口治療該等對照組，使治療組同樣經口接受適宜劑量之測試物質。在第6天(觸發發炎後24小時)，使用數位卡尺個別地測定每一耳之耳厚度，且測定每一小鼠之耳重量。藉由隨後分析可如上文所述獲得之耳均質物，可測定尤其彈性蛋白酶活性作為嗜中性球浸潤至發炎組織中之量度，如上文所述(在「DNFB誘發之皮膚模型」下)。藉由用實例化合物12治療，可抑制由TMA觸發之Th2介導之皮膚發炎。使用參數耳厚度(δ耳厚度=第6天之耳厚度減去原始耳厚度)，此顯示於圖10中，其表示發炎病程期間之水腫形成。
小鼠中活體內 DSS 誘發之結腸炎模型
為確定通式(I)化合物之抗發炎潛能，在腸發炎動物模型DSS (聚葡萄糖硫酸鈉)誘發之結腸炎模型中評價該等化合物。將DSS經由飲用水投與敏感小鼠會罹患具有典型臨床症狀(例如血性腹瀉、體重損失、在結腸中形成水腫)之急性腸發炎(結腸炎)。因此，IBD (發炎性腸病)之實驗性動物模型包含適應症克隆氏病及潰瘍性結腸炎(Okaysu等人，Gastroenterol, 1990；Dieleman等人，Gastroenterol, 1994)。自第0天直至且包括第5天，使雄性C57BL/6小鼠(6-8週；Charles River, USA; n = 10-12隻小鼠/組)經由飲用水接受每日新鮮製備之3%強度DSS (35-48 kDa；目錄號DB001；TDB Consultancy AB, Sweden)以觸發結腸炎。而使亦經測試之健康對照組(n = 8隻小鼠)接受正常飲用水。在每一情形下，僅用測試物質之媒劑(乙醇:花生油10:90 v/v)經口治療對照組(健康對照及結腸炎疾病對照)。以預防性方式、即自第0天藉由經口投與第一DSS劑量實施不同劑量之測試物質之治療。在此處，在實驗進程期間，每日評價體重及可能甚至血性腹瀉之存在(經由0-4分之積分系統[評分]評價，其中0 =正常成形糞便，1 =軟成形糞便，2 =軟不成形糞便，3 =水性糞便/腹瀉，4 =血性腹瀉) 。在此處，使用隱血試劑測試(目錄號3060；Beckman Coulter, Germany)檢測潛血糞便。另外，在第10天及第16天時，在使用異氟醚之吸入性麻醉下實施視頻內視鏡檢法(Karl Storz Endoskope, Germany)以評價結腸炎之嚴重性，其中使用0至4分之積分系統(評分)如下評價腸損傷之程度： • 0 =正常、健康 • 1 =血管分佈減少 • 2 =血管分佈減少且易碎 • 3 =易碎且糜爛 • 4 =潰瘍形成且出血 在末次內視鏡檢法後，終止實驗，經由大靜脈移除血液且檢查結腸之長度及重量(二者代表結腸炎相關之腸壁增厚，其與結腸炎之嚴重性相關聯)作為間接標記物。。另外亦在固定於福馬林中後藉由石蠟切片之蘇木精/伊紅染色以組織病理學方式分析腸(各自來自遠端及近端之一個2 cm片段)。小鼠中之誘發性DSS結腸炎(慢性發炎性腸病(IBD)之實驗模型)能夠藉由用實例化合物12治療來抑制。實例化合物12之效能與作為臨床上相關之參考物質納入實驗中之經批准生物劑(抗IL-12p40，自第0天腹膜內10 mg/kg Q3D [每隔三天]或抗TNF Humira
®
[阿達木單抗]，自第0天皮下10 mg/kg Q3D)之效能相當。此圖解說明於圖12中。
小鼠中活體內姥鮫烷誘發之 SLE 模型
為確定通式(I)化合物之抗發炎活性，在SLE (全身性紅斑狼瘡)模型中評價化合物之活體內效能。姥鮫烷(礦物油(2,6,10,14-四甲基十五烷))在注射至小鼠中後會引起全身性紅斑狼瘡伴有特徵性器官參與(例如腎炎、輕度糜爛性關節炎)、典型自體抗體產生(例如抗雙鏈(ds) DNA抗體) (Leiss等人，Lupus 2013)以及1型干擾素(例如IFN-α)及TLR信號依賴，如在男性中所述(Satoh等人，Proc Natl Acad Sci USA, 1995；Thibault等人，Arthritis Res Ther. 2009；Thibault等人，J Clin Invest. 2008；Wu等人，Acta Pharmacol Sin. 2015；Hagberg及Rönnblom, Scand J Immunol, 2015)。因此，在第0天，在每一情形下將500 μl之姥鮫烷(Sigma，目錄號1921-70-6)腹膜內投與雌性Balb/c小鼠(20-22 g, Charles River Laboratories, USA)。在每一情形下，組大小為n = 10隻小鼠。亦在實驗中測試健康對照組及疾病對照組二者。僅用測試物質之媒劑(乙醇:花生油10:90 v/v)經口治療兩個對照組。以預防性方式、即自第0天藉由在姥鮫烷注射後約1 h經口投與來實施不同劑量之測試物質之治療。另外，在第0天時，測定動物之尿液蛋白質狀況(蛋白尿，使用考馬斯(Coomassie)亮藍G 250量測，使用BSA [牛血清白蛋白]作為參考)基線、自體抗體濃度(例如抗dsDNA)及血清肌酸酐值以及爪體積(使用器官充滿度量測計)。在實驗進程期間，進而在姥鮫烷注射後第2週、第4週及第6週監測該等參數：每週爪體積、尿液蛋白質狀況及自體抗體以及血清肌酸酐。在藉由姥鮫烷觸發SLE後6週，終止實驗並將腎固定於10%中性緩衝福馬林中用於組織病理學評價，且隨後藉由用蘇木精及伊紅(H及E)染色病理性評價5 μm石蠟切片。在此處，使用積分系統(0 =健康，1 =少量腎組織變化，2 =輕度變化，3 =中度變化，4 =顯著腎組織變化)來評價及分類組織學發現。作為姥鮫烷誘發之SLE之關鍵特徵之狼瘡性腎炎能夠藉由用實例化合物12治療來抑制。實例化合物12稍優於作為臨床參考物質納入實驗中之免疫抑制劑環磷醯胺(自第0天經口50 mg/kg每週一次)。根據腎病理之評價，此圖解說明於圖11中。
小鼠中活體內 PLP139-151 誘發之復發緩解型 EAE 模型
為確定通式(I)化合物之抗發炎潛能，在復發緩解型MS動物模型中評價該等化合物於治療性治療急性MS發作或於預防新發作之活體內效能。復發緩解型PLP
139-151
(蛋白脂質蛋白)誘發之EAE模型係用於測試藥理學物質於MS患者中之潛在用途之標準動物模型。為觸發復發緩解型EAE，在第0天時，在小鼠背部之四個不同側(2個在上頸區中，2個在下頸區中，自尾基約2 cm顱部)上，將含有PLP
139-151
/CFA之乳液(Hooke Kit™ PLP
139-151
/CFA乳液；目錄號EK-0120; Hooke Laboratories, Lawrence MA, USA)皮下注射(0.05 ml/注射位點)至雌性SJL小鼠(8-10週齡，Jackson Laboratories Bar Harbor, USA)中。不免疫亦經測試之健康對照組(n = 5隻小鼠)。除此對照組外，亦在實驗中測試EAE疾病對照。在研究進程期間，用測試物質之媒劑(乙醇:花生油10:90 v/v)經口治療兩個對照組。在第一次發作期間或在發作後以治療性方式實施不同劑量之測試物質或其媒劑之每日經口治療。在此處，EAE發作後之治療性治療(第一次發作；在第12天開始治療)用於確定治療急性MS發作之可能性，而第一次發作後實例化合物之治療性治療(在第19天開始治療)意欲發現測試物質可預防新發作之程度。在此PLP
139-151
誘發之EAE模型中，第一EAE症狀在約第11天出現。自第9天，每日盲化評價臨床EAE症狀，評價係使用代表病症之嚴重性之積分系統(評分；自0 =健康至5 =垂死之積分)來實施(評分指數與MOG-EAE模型中相同)。在研究進程期間亦監測體重及死亡率。
(I) 其中： R1
係C1
-C6
-烷基，其中C1
-C6
-烷基未經取代或相同或不同地經以下單取代或多取代： 鹵素、羥基、未經取代或單或多鹵素取代之C3
-C6
-環烷基或R6
、R7
SO2
、R7
SO或R8
O基團， 或選自以下之基團：
及
其中*代表基團與分子其餘部分之鍵結點； R2
及R3
總是具有相同定義且皆為氫或C1
-C6
-烷基； R4
係鹵素、氰基、未經取代或相同或不同地單或多取代之C1
-C6
-烷基或未經取代或相同或不同地單或多取代之C3
-C6
-環烷基，且取代基選自鹵素及羥基之群； R5
係氫、鹵素或未經取代或單或多鹵素取代之C1
-C6
-烷基； R6
係未經取代或單或二甲基取代之具有4至6個環原子之單環飽和雜環，其含有來自O、S、SO及SO2
之群之雜原子或雜基； R7
係C1
-C6
-烷基，其中C1
-C6
-烷基未經取代或相同或不同地經鹵素、羥基或C3
-C6
-環烷基單取代或多取代， 或R7
係C3
-C6
-環烷基； R8
係C1
-C6
-烷基，其中C1
-C6
-烷基未經取代或相同或不同地經鹵素單取代或多取代； 及其非鏡像異構物、鏡像異構物、代謝物、鹽、溶劑合物或該等鹽之溶劑合物，其用於治療及/或預防由IRAK4介導之自體免疫病症。 本發明之另一實施例係關於通式(I)化合物之用途，其用於治療及/或預防多發性硬化、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、異位性皮膚炎及過敏性濕疹、關節炎(具體而言牛皮癬關節炎、別赫捷列夫氏病、類風濕性關節炎、反應性關節炎、全身性幼年型特發性關節炎)、慢性發炎性腸病(具體而言克隆氏病、潰瘍性結腸炎)。 出於本發明之目的，多發性硬化(MS) (亦稱為散播性腦脊髓炎(ED))應理解為意指慢性發炎性中樞神經系統病症，其涵蓋腦及脊髓且在其病程期間神經結構、具體而言髓鞘被自體反應性免疫系統破壞。在大多數情形下，該病症發作於成年初期，且其可導致諸如視力受損、疼痛及/或麻痹等多種症狀。女性中多發性硬化之頻率約為男性的兩倍。MS仍無法治癒，但使用諸如特立氟胺、富馬酸二甲酯及芬戈莫德等藥劑可減弱其病程。MS之病程可因個體不同而極其不同。MS之兩種最重要進展形式係間歇性及慢性進展型(進行性)病程。通常(在約80%之患者中)，初始間歇性緩解病程(復發緩解型，簡寫為RR-MS)後來變成慢性進行性病程(次發進展型，簡寫為SP-MS)。較少(在約10%之MS病例中)甚至在開始時存在慢性進展型病程(原發進展型，簡寫為PP-MS)，且預先無法注意到任何病症發作。 出於本發明之目的，全身性紅斑狼瘡(SLE)應理解為意指慢性且危及生命之自體免疫病症，其可導致多種器官病理、皮膚表現(例如蝴蝶斑)及腎病症(狼瘡性腎炎)。在此處，形成分泌抗DNA (去氧核糖核酸)及其他自體抗體之自體反應性B細胞使得形成病原上相關之免疫複合物。該等複合物隨後可經由胞內體核酸特異性類鐸受體(TLR)、具體而言TLR7及TLR9活化免疫系統之細胞，例如漿細胞樣樹突細胞(pDC)。此可產生I型干擾素(例如IFN-α及TNF-α) (Chen等人，Clinic Rev Allerg Immunol, 2015)。除INF-α及TNF-α外，在SLE患者中亦觀察到與健康個體相比IL-6及IFN-γ之血清含量顯著增加(Lyn-Cook等人，Mol Immunol, 2014)。另外，循環ThH17細胞(17型T輔助細胞)之頻率增加及隨後IL-17血清含量增加，其皆與該病症之嚴重程度相關聯(Zambrano-Zargoza等人，Int J Inflamm, 2014)。 出於本發明之目的，牛皮癬應理解為意指具有間歇性進展及增加的皮膚剝落之慢性皮膚發炎。特徵性症狀係強烈剝落且較佳在膝、肘及頭皮處出現之銀白色圓形皮膚病灶。受侵襲區域通常極癢。由Th1及Th17細胞(1型或17型T輔助細胞)介導之慢性發炎反應負責牛皮癬之發生。在此發炎反應期間，產生諸如IFN-γ、TNF-α、IL-23及IL-17等促發炎細胞介素(Deng等人，Clin Rev Allergy Immunol. 2016；Zambrano-Zargoza等人，Int J Inflamm, 2014；Chen等人，Clinic Rev Allerg Immunol, 2015)。此使得角質細胞約7倍更快速地增殖並遷移至皮膚之角質層中(在牛皮癬患者之情形下此僅耗時約4天而非28天)。此使得表皮快速新生。除皮膚外，通常亦侵襲指甲，展示凹痕及淺棕色斑。在約25%之患者中，關節亦受侵襲，其稱為牛皮癬關節炎(Raychaudhuri等人，Clin Rheumatol., 2015)。 出於本發明之目的，異位性皮膚炎(神經性皮膚炎)及過敏性濕疹應理解為意指與搔癢相關之慢性發炎性皮膚病症。而過敏性濕疹係免疫系統對外部過敏原之特異性不適當過度反應之結果，該外部過敏原本身對生物體無害，而是在神經性皮膚炎患者之情形下降低皮膚之保護功能。在異位性患者中，與物理、化學或生物刺激接觸隨後可導致發炎。異位性皮膚炎通常開始於嬰兒期及兒童期且通常隨發作進展，其可與具有少數症狀之時期(若有)交替(Malajian及Guttman-Yassky, Cytokine, 2015)。過敏反應(例如過敏性濕疹)可觸發或維持異位性皮膚炎(Fischer等人，Der Hautarzt, 2003)。在許多神經性皮膚炎患者中可檢測到增加的免疫球蛋白E (IgE)含量，其在過敏反應中起重要作用。過敏性濕疹需要藉由上皮測試暴露病因(即過敏原)，且隨後避開過敏原至關重要。Th2型免疫反應為發炎性皮膚病症所常見，即由於過敏原接觸或由於缺陷性皮膚障壁及因此例如細菌之浸潤，經由TLR或IL-1家族受體刺激該等患者之自體反應性免疫系統，使得Th2細胞活化。因此免疫反應，產生諸如IL-4、IL-5、IL-13、IL-18、IL-33等促發炎細胞介素(Kaesler等人，J Allergy Clin Immunol. 2014；Panzer等人，Exp Dermatol, 2014；Skabytska等人，J Dtsch Dermatol Ges, 2016；Paul, Cytokine, 2015；Malajian及Guttman-Yassky, Cytokine, 2015；McKenzie, Ann Am Thorac Soc. 2014)。 出於本發明之目的，關節炎(牛皮癬關節炎、類風濕性關節炎、反應性關節炎、別赫捷列夫氏病、全身性幼年型特發性關節炎)應理解為意指發炎性關節病症。在此處，特徵在於脊柱關節發炎之軸性關節炎(例如別赫捷列夫氏病)不同於主要侵襲四肢關節(例如腳趾、踝、膝、手指、手或肘)之外周關節炎。在此處，外周關節炎可為對稱(即身體兩側之相同關節皆受侵襲(例如類風濕性關節炎))或不對稱的(即發炎關節不均勻地分佈於身體兩側上(例如牛皮癬關節炎))。在此處，發炎關節之活動性因疼痛而受限，且上方之皮膚變紅且發熱。關節炎病症之特徵在於間歇性進行性進展，其可導致關節破壞及嚴重失能甚至傷殘。自體反應性B細胞、Th1細胞及Th17細胞亦及促發炎細胞介素(例如IFN-γ、TNF、IL-6、IL-12、IL-23及IL-17)在關節炎病理過程之誘導亦及進展中起關鍵作用。該等免疫細胞亦誘導金屬蛋白酶之產生以及破骨細胞之成熟及活化，其隨後導致受侵襲關節中之軟骨及骨破壞(Raychaudhuri等人，Clin Rheumatol, 2015；Burmester等人，Ann Rheum Dis, 2015；Furst及Emery, Rheumatol, 2014；McInnes及Schett, Engl J Med, 2011)。 出於本發明之目的，慢性發炎性腸病(IBD)及其主要形式克隆氏病及潰瘍性結腸炎應理解為意指可持續一生之間歇性胃腸道發炎。儘管克隆氏病及潰瘍性結腸炎共享許多病理特徵及臨床症狀(例如具有腹絞痛及隨後體重損失之血性腹瀉)，其亦在許多態樣中有所不同。而在克隆氏病之情形下，發炎可發生於自口腔至肛門之整個胃腸道中，在潰瘍性結腸炎患者之情形下其限於結腸。另外，在克隆氏病之情形下，腸發炎之擴散較不均勻，即健康及發炎期交替，而在潰瘍性結腸炎之情形下，發炎均勻地自肛門擴散於結腸上。另外，亦可存在胃腸道以外之症狀，例如在關節及皮膚，亦及肝發炎。此外，潰瘍性結腸炎患者具體而言具有增加的腸癌風險(Geremia等人，Autoimmunity Rev, 2014)。兩種疾病更頻繁發生於20歲與40歲之間，然而亦可侵襲兒童及青少年。慢性發炎性腸病無法治癒；然而，可藉由用藥劑(例如藉由磺胺塞拉金、類固醇或生物劑(例如抗TNF抗體))治療及改變生活方式來減小該疾病發作之頻率及強度。 在下文所述之本發明合成中間體及工作實例之情形下，以相應鹼或酸之鹽形式指定之任一化合物通常係未知確切化學計量組成之鹽，如藉由各別製備及/或純化製程所獲得。除非更詳細指定，否則名稱及結構式(例如「鹽酸鹽」、「三氟乙酸鹽」、「鈉鹽」或「x HCl」、「x CF3
COOH」、「x Na+
」)之添加在該等鹽之情形下不應因此以化學計量意義理解，而僅具有關於其中所存在之鹽形成組分之描述性特徵。 若合成中間體或工作實例或其鹽係藉由本文所述之製備及/或純化製程以未知化學計量組成(若其為所定義類型)之溶劑合物形式(例如水合物)獲得，則此相應地適用。 式(I)化合物應理解為意指化合物以及例如其鹽、溶劑合物及該等鹽之溶劑合物、式(I)所涵蓋且具有下文所提及式之化合物及其鹽、溶劑合物及該等鹽之溶劑合物以及式(I)所涵蓋且下文提及為實施例之化合物及其鹽、溶劑合物及該等鹽之溶劑合物(若式(I)所涵蓋且下文所提及之化合物不為鹽、溶劑合物及該等鹽之溶劑合物)。 在本發明之上下文中，較佳鹽係通式(I)化合物之生理上可接受之鹽。然而，本發明亦涵蓋自身不適於醫藥應用但可用於例如分離或純化通式(I)化合物之鹽。 通式(I)化合物之生理上可接受之鹽包括礦物酸、羧酸及磺酸之酸加成鹽，例如以下酸之鹽：鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸、馬來酸及苯甲酸。 通式(I)化合物之生理上可接受之鹽亦包括習用鹼之鹽，例如且較佳地鹼金屬鹽(例如鈉鹽及鉀鹽)、鹼土金屬鹽(例如鈣鹽及鎂鹽)，及衍生自氨或具有1至16個碳原子之有機胺之銨鹽，例如且較佳地乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二異丙胺、單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二環己胺、二甲基胺基乙醇、普魯卡因(procaine)、二苄基胺、N-甲基嗎啉、精胺酸、離胺酸、乙二胺及N-甲基六氫吡啶。 溶劑合物在本發明之上下文中定義為藉由與溶劑分子配位形成呈固態或液態之複合物之通式(I)化合物之彼等形式。水合物係溶劑合物之與水配位之特定形式。 通式(I)化合物端視其結構可以不同立體異構形式存在，即呈構形異構物或(若適宜)構象異構物(鏡像異構物及/或非鏡像異構物，包括在阻轉異構物情形下之彼等)之形式。因此，本發明涵蓋鏡像異構物及非鏡像異構物及其各別混合物。立體異構均質成分可以已知方式自鏡像異構物及/或非鏡像異構物之該等混合物分離；較佳使用層析製程、尤其於非手性或手性相上之HPLC層析用於此目的。 若通式(I)化合物可以互變異構體形式存在，則本發明涵蓋所有互變異構形式。 通式(I)化合物亦可以通式(I)化合物之所有適宜同位素變體形式存在。本發明化合物之同位素變體在本文中應理解為意指本發明化合物內之至少一個原子已更換為具有相同原子序、但具有不同於通常或主要在自然界中存在之原子質量的原子質量之另一原子之化合物。可納入本發明化合物中之同位素之實例係以下之同位素：氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴及碘，例如2
H (氘)、3
H (氚)、13
C、14
C、15
N、17
O、18
O、32
P、33
P、33
S、34
S、35
S、36
S、18
F、36
Cl、82
Br、123
I、124
I、129
I及131
I。本發明化合物之具體同位素變體、例如尤其已納入一或多種放射性同位素之彼等可有益於例如檢查體內之作用機制或活性成分分佈；由於相對較容易地製備及檢測，經3
H或14
C同位素標記之化合物尤其適於此目的。另外，同位素(例如氘)之納入可因化合物之較高代謝穩定性而產生特定治療益處，例如體內之半衰期延長或所需之活性劑量降低；因此，通式(I)化合物之該等改質形式在一些情形下亦可構成本發明之較佳實施例。通式(I)化合物之同位素變體可藉由熟習此項技術者已知之製程(例如藉由下文進一步闡述之方法及工作實例中所述之程序)、藉由使用各別試劑及/或起始化合物之相應同位素改質形式製備。 術語通式(I)化合物另外亦涵蓋通式(I)化合物之前藥。術語「前藥」在本上下文中係指自身可具有生物活性或無活性、但在其於體內滯留期間轉化(例如代謝或水解)成通式(I)化合物之化合物。
合成方案1 X1
係氯、溴或碘。 Rd
係甲基、乙基、苄基或第三丁基。 R4
、R5
各自如通式(I)中所定義。 5-胺基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體2)可自1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體0)開始根據合成方案2藉由在炭載鈀存在下以類似於WO 2008/001883之方式硝化及用氫還原中間體1之硝基獲得。對於自中間體2開始製備中間體3，可使用自文獻已知之多種偶合劑(Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry，第3版 - Building Blocks, Catalysis and Coupling Chemistry, Andrew B. Hughes, Wiley，第12章 - Peptide-Coupling Reagents, 407-442；Chem. Soc. Rev., 2009, 38, 606)。舉例而言，可使用1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與1-羥基-1H-苯并三唑水合物(HOBt, WO2012107475；Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008 , 18, 2093)、(1H-苯并三唑-1-基氧基)(二甲基胺基)-N,N-二甲基甲銨四氟硼酸鹽(TBTU, CAS 125700-67-6)、(二甲基胺基)-N,N-二甲基(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)甲銨六氟磷酸鹽(HATU, CAS 148893-10-1)、丙烷膦酸酐(呈於乙酸乙酯或DMF中之溶液，CAS68957-94-8)或二-1H-咪唑-1-基甲酮(CDI)之組合作為偶合劑，在每一情形下將鹼(例如三乙胺或N-乙基-N-異丙基丙-2-胺)添加至反應混合物中。較佳使用THF中之TBTU及N-乙基-N-異丙基丙-2-胺。
合成方案2 取代基R4
、R5
各自如通式(I)中所定義。 可自中間體3開始製備2-取代之吲唑衍生物(中間體4) (參見合成方案3)。可用於此目的之反應包括與視情況取代之烷基氯化物、烷基溴化物、烷基碘化物或4-甲苯磺酸烷基酯之彼等。所用烷基鹵化物或4-甲苯磺酸烷基酯在市面上有售或可以與自文獻已知之途徑類似之方式製備(關於4-甲苯磺酸烷基酯之製備，一個實例係適宜醇與4-甲苯磺醯氯在三乙胺或吡啶存在下之反應；參見例如Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2006, 14, 12 4277 - 4294)。視情況，在使用烷基氯化物或烷基溴化物之情形下，亦可添加鹼金屬碘化物，例如碘化鉀或碘化鈉。所用鹼可為例如碳酸鉀、碳酸銫或氫化鈉。在反應性烷基鹵化物之情形下，亦可在一些情形下使用N-環己基-N-甲基環己胺。有用溶劑包括例如1-甲基吡咯啶-2-酮、DMF、DMSO或THF。視情況，所用烷基鹵化物或4-甲苯磺酸烷基酯可具有已視情況預先經保護基團保護之官能基(亦參見P. G. M. Wuts, T. W. Greene,Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis
，第4版，ISBN: 9780471697541)。若使用例如具有一或多個羥基之烷基鹵化物或4-甲苯磺酸烷基酯，則該等羥基可視情況經第三丁基(二甲基)矽基或熟習此項技術者所熟悉之類似含矽保護基團保護。或者，羥基亦可經四氫-2H-吡喃(THP)基團或經乙醯基或苯甲醯基保護。所用保護基團隨後可在合成中間體4後或在合成(I)後脫離。若使用例如第三丁基(二甲基矽基)作為保護基團，則可使用例如溶劑(例如THF)中之四丁基氟化銨脫離。THP保護基團可例如使用4-甲苯磺酸(視情況呈一水合物形式)脫離。乙醯基或苯甲醯基可藉由用氫氧化鈉水溶液處理來脫離。 視情況，烷基鹵化物所用或4-甲苯磺酸烷基酯可含有可藉由熟習此項技術者已知之氧化或還原反應轉化之官能基(參見例如Science of Synthesis
, Georg Thieme Verlag)。若例如官能基係硫醚基，則此可藉由文獻中已知之方法氧化成亞碸或碸基。在亞碸基之情形下，此同樣可氧化成碸基。對於該等氧化步驟，可使用例如3-氯過氧苯甲酸(CAS 937-14-4) (就此而言，關於將2-(甲基硫基)乙基-1H-吡唑衍生物氧化成2-(甲基亞磺醯基)乙基-1H-吡唑衍生物及將另一2-(甲基硫基)乙基-1H-吡唑衍生物氧化成2-(甲基磺醯基)乙基-1H-吡唑衍生物亦參見例如US201094000)。若所用烷基鹵化物或甲苯磺酸酯含有酮基，則此可藉由熟習此項技術者已知之還原方法還原成醇基(關於硼氫化鈉之使用參見例如Chemische Berichte, 1980, 113, 1907 - 1920)。該等氧化或還原步驟可在合成中間體4後或在合成通式(I)化合物後實現。或者，中間體4可經由中間體3與視情況取代之烷基醇之光延反應(參見例如K. C. K. Swamy等人，Chem. Rev. 2009, 109, 2551 - 2651)來製備。可使用各種膦(例如三苯基膦、三丁基膦或1,2-二苯基膦基乙烷)與偶氮二甲酸二異丙基酯(CAS 2446-83-5)或文獻(K. C. K. Swamy等人，Chem. Rev. 2009, 109, 2551 - 2651)中所提及之其他二氮烯衍生物之組合。較佳使用三苯基膦及偶氮二甲酸二異丙基酯。若烷基醇帶有官能基，則如在上文所提及與烷基鹵化物反應之情形下，已知保護基團策略(其他指示可參見P. G. M. Wuts, T. W. Greene, Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis，第4版，ISBN: 9780471697541)係可能的，且如在上文所提及與烷基鹵化物反應之情形下，對應於中間體4之合成或通式(I)化合物合成後之氧化或還原步驟可能實現。可自中間體4開始，藉由格任亞反應(Grignard reaction) (參見例如EP 2489663中1H-吲唑-6-甲酸甲酯衍生物與甲基溴化鎂之反應)獲得本發明通式(I)化合物，其中R2
及R3
定義為C1
-C6
-烷基(其中R2
及R3
具有相同定義)。對於格任亞反應，可使用烷基鹵化鎂。尤佳者係THF或二乙醚或THF及二乙醚之混合物中之甲基氯化鎂或甲基溴化鎂。或者，可自中間體4開始，藉由與烷基鋰試劑反應(參見例如WO2006116412中2-胺基-4-氯-1-甲基-1H-苯并咪唑-7-甲酸甲酯衍生物與異丙基鋰或第三丁基鋰之反應)獲得通式(I)化合物，其中R2
及R3
定義為C1
-C6
-烷基(其中R2
及R3
具有相同定義)。可自中間體4開始，藉由與THF中之氫化鋰鋁、THF中之硼氫化鋰或THF中之硼氫化鈉反應、視情況添加甲醇或硼氫化鋰及硼氫化鈉之混合物來製備通式(I)化合物，其中R2
及R3
定義為H。
合成方案3 取代基R1
、R2
、R3
、R4
、R5
各自如通式(I)中所定義。 可自中間體3開始，藉由格任亞反應獲得中間體5，其中R2
及R3
定義為C1
-C6
-烷基(其中R2
及R3
具有相同定義) (參見例如合成方案4)。出於此目的，可使用適宜烷基鹵化鎂，例如THF中或二乙醚中或THF及二乙醚之混合物中之甲基氯化鎂或甲基溴化鎂。 然後可自中間體5開始，製備通式(I)化合物之部分(I-a)，其中R2
及R3
定義為C1
-C6
-烷基(其中R2
及R3
具有相同定義)。出於此目的，以與合成方案3 (中間體3之製備)類似之方式，有用反應係中間體5與視情況取代之烷基氯化物、烷基溴化物、烷基碘化物或4-甲苯磺酸烷基酯之反應。可使用與合成方案3中所述之策略類似之保護基團策略。 或者，為製備通式(I)化合物之部分(I-a) (其中R2
及R3
定義為C1
-C6
-烷基，其中R2
及R3
具有相同定義)，可使用中間體5與視情況取代之烷基醇之光延反應(類似於合成方案3)。 若式(I-a)化合物中之R1
包括適宜官能基，則隨後可視情況以與合成方案3類似之方式使用氧化或還原反應來製備其他本發明化合物。
合成方案4 取代基R1
、R4
、R5
各自如通式(I)中所定義。R2
及R3
總是具有相同定義且皆為C1
-C6
-烷基。 可自中間體1開始，以替代方式製備中間體4 (參見合成方案5)。首先，藉由如合成方案3 (自中間體3製備中間體4)中之方法將中間體1轉化成中間體6。 然後可藉由還原硝基將中間體6轉化成中間體7。舉例而言，硝基可在氫氣氛下用碳載鈀還原(關於將6-異丙氧基-5-硝基-1H-吲唑還原成6-異丙氧基-1H-吲唑-5-胺參見例如WO2013174744)或藉由使用水及乙醇中之鐵及氯化銨還原(亦參見例如Journal of the Chemical Society, 1955, 2412-2419)或藉由使用氯化錫(II) (CAS 7772-99-8)還原。較佳使用水及乙醇中之鐵及氯化銨。自中間體7製備中間體4可以與合成方案2 (自中間體2製備中間體3)類似之方式實現。 如針對合成方案3所述，亦可視情況在合成方案5之情形下使用保護基團策略。視情況，可另外自中間體6或中間體7開始，如針對合成方案3所述實施熟習此項技術者已知之氧化或還原反應(參見例如Science of Synthesis
, Georg Thieme Verlag)。
合成方案5 取代基R1
、R4
、R5
各自如通式(I)中所定義。實例化合物之合成 縮寫及說明 
首先將1.60 g中間體0-1粗產物裝填於15 ml甲醇中，添加0.74 g氫氧化鉀且在50℃下將混合物攪拌16.5 h。濃縮後，此獲得2.1 g殘餘物，其不經進一步純化即使用。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 0.47 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值181.00。中間體 1-1 5- 硝基 -1H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 
將4.60 g (26.1 mmol) 1H-吲唑-6-甲酸甲酯(CAS編號：170487-40-8)溶解於120 ml硫酸(96%)中，且在具有CPG攪拌器、滴液漏斗及內部溫度計之三頸燒瓶中冷卻至-15℃。在15 min時段內，將已預先製備並冷卻之硝化酸(10 ml 96%硫酸於5 ml 65%硝酸中)逐滴添加至此溶液中。結束逐滴添加後，將混合物再攪拌1 h (內部溫度為-13℃)。將反應混合物添加至冰中，且藉由抽吸過濾掉沈澱物，用水洗滌並在乾燥櫥中在50℃下在減壓下乾燥。獲得5.49 g標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 0.75 min MS (ESIpos): m/z = 222(M+H)+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.87 (s, 3 H), 7.96 (s, 1 H), 8.44 (s, 1 H), 8.70 (s, 1 H), 13.98 (br. s., 1 H)。中間體 2-1 5- 胺基 -1H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 
將4.40 g (19.8 mmol) 5-硝基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體1-1)溶解於236 ml甲醇中，且在標準氫氣氛下在25℃下用1.06 g (0.99 mmol)活性碳載鈀氫化3 h。經由矽藻土過濾反應混合物，用甲醇洗滌過濾器，並濃縮濾液。獲得3.53 g標題化合物。1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.85 (s, 3 H) 6.01 (s, 2 H) 6.98 (s, 1 H) 7.79 - 7.91 (m, 1 H) 7.99 (s, 1 H) 12.84 (br. s., 1 H)。中間體 3-1 5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-1H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 
首先將4.95 g (25.9 mmol) 6-(三氟甲基)吡啶-2-甲酸裝填於45 ml THF中。添加9.07 g (28.2 mmol) O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽及4.92 ml (28.2 mmol) N-乙基-N-異丙基丙-2-胺且在25℃下將混合物攪拌30 min。隨後，添加4.50 g (23.5 mmol) 5-胺基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體2-1)且在25℃下將混合物攪拌24 h。藉由抽吸經由膜過濾器過濾反應混合物並用THF及用水洗滌固體，且在乾燥櫥中乾燥過夜。獲得7.60 g標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 1.16 min MS (ESIpos): m/z = 365 (M+H)+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.97 (s, 3 H), 8.13 - 8.27 (m, 2 H), 8.30 (s, 1 H), 8.33 - 8.45 (m, 1 H), 8.45 - 8.51 (m, 1 H), 9.15 (s, 1 H), 12.57 (s, 1 H), 13.44 (s, 1 H)。中間體 3-2 5-({[6-( 二氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-1H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 
首先將2.85 g (23.5 mmol) 6-(二氟甲基)吡啶-2-甲酸裝填於30 ml THF中。添加6.05 g (18.8 mmol) O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽及3.3 ml N-乙基-N-異丙基丙-2-胺且在室溫下將混合物攪拌10分鐘。隨後，添加3.00 g (15.7 mmol) 5-胺基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯且在室溫下將混合物攪拌過夜。將反應混合物與水混合，且藉由抽吸過濾掉沈澱物並用水及二氯甲烷重複洗滌。此獲得1.53 g (理論值之27%)標題化合物。分離濾液之各相，將有機相濃縮，與少量二氯甲烷混合並懸浮於超音波浴中，且藉由抽吸過濾掉沈澱物。此獲得另外1.03 g標題化合物。 1H-NMR (第一產物部分，300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm]= 3.99 (s, 3H), 7.09 (t, 1H), 8.00 (d, 1H), 8.21 - 8.40 (m, 4H), 9.14 (s, 1H), 12.53 (s, 1H), 13.44 (s, 1H)。中間體 3-3 5-({[6-(2- 羥基丙 -2- 基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-1H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯
首先將2.10 g 6-(2-羥基丙-2-基)吡啶-2-甲酸鉀(中間體V3-1)裝填於15 ml THF中。添加3.69 g (11.5 mmol) O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽及2.00 ml N-乙基-N-異丙基丙-2-胺且在室溫下將混合物攪拌15 min。隨後，添加1.83 g (9.58 mmol) 5-胺基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體2-1)且在室溫下將混合物攪拌19 h。將混合物與水及乙酸乙酯混合，過濾掉未溶解之固體，分離濾液之各相，且用乙酸乙酯將水相萃取兩次，用氯化鈉溶液洗滌，經由疏水過濾器過濾，濃縮並藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化。移除溶劑後，獲得1.56 g黃色泡沫狀標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.00 min (UV檢測器：TIC Smooth)，質量實驗值354.00。 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.63 (s, 6H), 3.97 (s, 3H), 5.37(s ,1H), 7.90 - 7.95 (m, 1H), 8.03-8.07 (m, 2H), 8.23(s, 1H),8.29 (s, 1H), 9.19 (s, 1H), 12.79 (s, 1H), 13.41 (br.s., 1H)。中間體 4-1 2-( 氧雜環丁 -3- 基甲基 )-5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 
將1.00 g (2.66 mmol) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)溶解於10 ml DMF中，且在添加1.10 g (7.99 mmol)碳酸鉀及221 mg (1.33 mmol)碘化鉀後，在25℃下將混合物攪拌30 min。添加603 mg (3.99 mmol) 3-溴甲基氧雜環丁烷，且在25℃下將混合物攪拌24 h。將反應混合物分配於水與乙酸乙酯之間。用乙酸乙酯將混合物萃取兩次，且經由疏水過濾器過濾合併之有機相並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。獲得260 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 1.24 min MS (ESIpos): m/z = 435(M+H)+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.49 - 3.64 (m, 1 H), 3.95 (s, 3 H), 4.49 (t, 2 H), 4.68 (dd, 2 H), 4.81 (d, 2 H), 8.20 (dd, 1 H), 8.35 - 8.41 (m, 1 H), 8.43 - 8.49 (m, 2 H), 8.55 - 8.58 (m, 1 H), 9.06 (s, 1 H), 12.53 (s, 1 H)。中間體 4-2 2-(2- 甲氧基乙基 )-5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯
將1.00 g (2.75 mmol) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)溶解於5 ml DMF中，且在攪拌的同時添加387 µl (4.12 mmol) 2-溴乙基甲醚、1.14 g (8.23 mmol)碳酸鉀及228 mg (1.37 mmol)碘化鉀。在25℃下將反應混合物攪拌24 h，用水稀釋並用乙酸乙酯萃取兩次。經由疏水過濾器過濾合併之有機相並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。獲得12 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.24 min MS (ESIpos): m/z = 423 (M+H)+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.24 (s, 3 H), 3.86 (t, 2 H), 3.96 (s, 3 H), 4.65 (t, 2 H), 8.21 (dd, 1 H), 8.35 - 8.42 (m, 1 H), 8.43 - 8.51 (m, 2 H), 8.52 (d, 1 H), 9.06 (s, 1 H), 12.53 (s, 1 H)。中間體 4-3 2-(3- 甲氧基丙基 )-5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯
將1.00 g (2.75 mmol) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)溶解於5 ml DMF中，且在攪拌的同時添加460 µl (4.12 mmol) 1-溴-3-甲氧基丙烷、1.14 g (8.23 mmol)碳酸鉀及228 mg (1.37 mmol)碘化鉀。在25℃下將反應混合物攪拌72 h，用水稀釋並用乙酸乙酯萃取兩次。經由疏水過濾器過濾合併之有機相並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。獲得28 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.29 min MS (ESIpos): m/z = 437 (M+H)+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 2.17 (quin, 2 H), 3.24 (s, 3 H), 3.33 - 3.36 (m, 2 H), 3.96 (s, 3 H), 4.53 (t, 2 H), 8.21 (dd, 1 H), 8.35 - 8.42 (m, 1 H), 8.45 - 8.49 (m, 2 H), 8.54 (d, 1 H), 9.06 (s, 1 H), 12.54 (s, 1 H)。中間體 4-4 2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 製備方法 1 
首先將930 mg (2.55 mmol) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)、1.06 g碳酸鉀及212 mg碘化鉀裝填於9 ml DMF中且將混合物攪拌15 min。然後添加0.62 ml 4-溴-2-甲基丁-2-醇且在60℃下將混合物攪拌16 h。將混合物與水混合並用乙酸乙酯萃取兩次，且用飽和氯化鈉溶液將萃取物洗滌三次，過濾並濃縮。矽膠上之管柱層析純化(己烷/乙酸乙酯)獲得424 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 1.21 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值450.00。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.16 (s, 6 H) 2.02 - 2.11 (m, 2 H) 3.96 (s, 3 H) 4.51 - 4.60 (m, 3 H) 8.20 (dd,J
=7.83, 1.01 Hz, 1 H) 8.39 (s, 1 H) 8.45 (s, 2 H) 8.55 (d,J
=0.76 Hz, 1 H) 9.05 (s, 1 H) 12.52 (s, 1 H)製備方法 2
首先將1.95 g (7.03 mmol) 5-胺基-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體7-1)裝填於30 ml THF中。添加1.48 g (7.73 mmol) 6-(三氟甲基)吡啶-2-甲酸、2.71 g (8.44 mmol) O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽及1.47 ml (8.44 mmol) N-乙基-N-異丙基丙-2-胺，且在25℃下將混合物攪拌20.5 h。添加水，用乙酸乙酯將混合物萃取三次並用氯化鈉溶液洗滌萃取物，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯梯度)分離殘餘物。獲得2.79 g標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.23 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值450.00。中間體 4-5 2-(2-{[ 第三丁基 ( 二甲基 ) 矽基 ] 氧基 } 乙基 )-5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 
首先將1.00 g (2.66 mmol, 97%) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)裝填於50 ml DMF中，在攪拌的同時添加1.10 g (7.99 mmol)碳酸鉀及221 mg (1.33 mmol)碘化鉀，且在25℃下將混合物攪拌30 min。隨後，添加857 µl (3.99 mmol) (2-溴乙氧基)(第三丁基)二甲基矽烷且在25℃下將混合物攪拌24 h。用水稀釋反應混合物並用乙酸乙酯萃取。經由疏水過濾器過濾合併之有機相並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。獲得400 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.58 min MS (ESIpos): m/z = 523(M+H)+ 1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = -0.18 - -0.13 (m, 6 H), 0.74 (s, 9 H), 3.96 (s, 3 H), 4.08 (t, 2 H), 4.57 (t, 2 H), 8.15 - 8.25 (m, 1 H), 8.32 - 8.43 (m, 1 H), 8.43 - 8.52 (m, 3 H), 9.07 (s, 1 H), 12.53 (s, 1 H)。中間體 4-6 2-(3-{[ 第三丁基 ( 二甲基 ) 矽基 ] 氧基 } 丙基 )-5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 
以與中間體4-5類似之方式，將1.00 g (2.75 mmol) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)溶解於10 ml DMF中，在攪拌的同時添加1.14 g (8.24 mmol)碳酸鉀及228 mg (1.37 mmol)碘化鉀，且在25℃下將混合物攪拌30 min。隨後，添加1.04 g (4.12 mmol) (3-溴丙氧基)(第三丁基)二甲基矽烷且在25℃下將混合物攪拌24 h。過濾反應混合物並用乙酸乙酯洗滌濾餅。將反應混合物分配於水與乙酸乙酯之間且用乙酸乙酯將水相萃取兩次。經由疏水過濾器過濾合併之有機相並濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物，獲得428 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.63 min MS (ESIpos): m/z = 537(M+H)+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = -0.02 - 0.06 (m, 6 H), 0.87 (s, 9 H), 2.14 (quin, 2 H), 3.62 (t, 2 H), 3.96 (s, 3 H), 4.54 (t, 2 H), 8.20 (d, 1 H), 8.35 - 8.42 (m, 1 H), 8.43 - 8.48 (m, 3 H), 8.49 - 8.53 (m, 1 H), 9.06 (s, 1 H)。中間體 4-7 5-({[6-(2- 羥基丙 -2- 基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2-(4,4,4- 三氟丁基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 
首先將300 mg (0.80 mmol) 5-({[6-(2-羥基丙-2-基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-3)裝填於4.5 ml DMF中。添加287 mg (1.21 mmol) 1,1,1-三氟-4-碘丁烷及333 mg碳酸鉀且在100℃下將混合物攪拌23 h。添加水，並用乙酸乙酯將混合物萃取三次。濃縮混合物且藉由製備型HPLC純化產物。此獲得72 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.26 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值464.17。中間體 4-8 5-{[(5- 氟 -6- 甲基吡啶 -2- 基 ) 羰基 ] 胺基 }-2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 
使195 mg (0.46 mmol) 5-胺基-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體7-1)與78 mg (0.50 mmol) 5-氟-6-甲基吡啶-2-甲酸以與中間體4-4 (製備方法2)類似之方式在19.5 h內反應。在類似水性後處理後獲得228 mg粗產物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.20 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值414.00。中間體 4-9 2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-5-{[(6- 甲基吡啶 -2- 基 ) 羰基 ] 胺基 }-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 
使195 mg (0.45 mmol) 5-胺基-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體7-1)與70 mg (0.50 mmol) 6-甲基吡啶-2-甲酸以與製備中間體4-4 (製備方法2)類似之方式在19.5 h內反應。在類似水性後處理後獲得278 mg呈粗產物形式之標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.14 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值396.00。中間體 4-10 2-[3-(2,2,2- 三氟乙氧基 ) 丙基 ]-5-({[6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 
在100℃下，將250 mg (0.58 mmol) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)、193 mg (0.88 mmol) 3-溴丙基2,2,2-三氟乙基醚、242 mg碳酸鉀及145 mg碘化鉀於3 ml DMF中之混合物攪拌20 h。添加水，用乙酸乙酯萃取混合物且用氯化鈉溶液洗滌萃取物並濃縮。藉由製備型HPLC純化，獲得52 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.39 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值504.12。中間體 4-11 5-({[6-( 二氟甲基 ) 吡啶 -2- 基 ] 羰基 } 胺基 )-2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯
首先將2.00 g 5-胺基-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體7-1)裝填於40 ml THF中。添加1.50 g 6-(二氟甲基)吡啶-2-甲酸、2.78 gO
-(苯并三唑-1-基)-N
,N
,N
',N
'-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU, CAS編號125700-67-6)及1.5 ml N-乙基-N-異丙基丙-2-胺且在室溫下將混合物攪拌24 h。添加水，用乙酸乙酯將混合物萃取三次，且用氯化鈉溶液洗滌合併之有機相並經由疏水過濾器過濾。濃縮混合物並藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。此獲得3.05 g黃色固體狀標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt = 1.15 min (UV檢測器TIC)，質量實驗值432.00。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.17 (s, 6H), 2.04 - 2.11 (m, 2H), 3.99 (s, 3H), 4.52 - 4.60 (m, 3H), 7.10 (t, 1H), 8.00 (dd, 1H), 8.28 - 8.38 (m, 2H), 8.44 - 8.47 (m, 1H), 8.56 (d, 1H), 9.05 (s, 1H), 12.49 (s, 1H)。中間體 5-1 N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-1H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 
向1.50 g (4.12 mmol) 5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-1)於20 ml THF中之冷卻於冰水冷卻浴中之溶液小心地添加6.9 ml (5當量)於二乙醚中之3M甲基溴化鎂溶液。在用冰浴冷卻的同時將混合物攪拌1 h並在室溫下攪拌19.5 h。再添加2當量之甲基溴化鎂溶液且在室溫下將混合物再攪拌24 h。添加飽和氯化銨水溶液並將混合物攪拌且用乙酸乙酯萃取三次。用氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。獲得763 mg標題化合物。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.63 (s, 6H), 5.99 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 8.14 - 8.19 (m, 1H), 8.37 (t, 1H), 8.46 (d, 1H), 8.78 (s, 1H), 12.32 (s, 1H), 12.97 (s, 1H)。中間體 5-2 6-( 二氟甲基 )-N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-1H- 吲唑 -5- 基 ] 吡啶 -2- 甲醯胺
以與中間體5-1之製備類似之方式，使10 ml THF中之2.40 g (6.93 mmol) 5-({[6-(二氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體3-2)與三份於二乙醚中之3M甲基溴化鎂溶液(6.9 ml，然後在室溫下攪拌45 min；11.6 ml，然後在室溫下攪拌2 h；6.9 ml，然後在室溫下攪拌2 h)反應。如針對中間體5-1後處理後，獲得2.39 g粗產物，其不經進一步純化即進一步使用。中間體 6-1 2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-5- 硝基 -2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯 
首先將5.00 g (22.6 mmol) 5-硝基-1H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體1-1)裝填於40 ml DMF中。添加5.65 g (33.9 mmol) 4-溴-2-甲基丁-2-醇、9.37 g (67.8 mmol)碳酸鉀及5.63 g (33.9 mmol)碘化鉀且在100℃下將混合物攪拌20 h。添加水，用乙酸乙酯將混合物萃取三次並用氯化鈉溶液洗滌萃取物，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。藉由與二乙醚一起攪拌萃取所獲得之固體，藉由抽吸過濾掉，用二乙醚洗滌且乾燥。獲得2.49 g標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 0.93 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值307.00。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.15 (s, 6H), 2.02 - 2.11 (m, 2H), 3.84 (s, 3H), 4.54 (s, 1H), 4.58 - 4.65 (m, 2H), 8.05 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.86 (s, 1H)。中間體 7-1 5- 胺基 -2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-2H- 吲唑 -6- 甲酸甲酯
將4.53 g鐵及217 mg氯化銨添加至30 ml乙醇及10 ml水中之2.49 g (8.10 mmol) 2-(3-羥基-3-甲基丁基)-5-硝基-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體6-1)中，且在90℃下將混合物攪拌21.5 h。經由矽藻土過濾混合物且經由乙醇洗滌三次，並濃縮濾液且將殘餘物與水混合。用乙酸乙酯萃取三次(以改良相分離，添加氯化鈉溶液)。用氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。此獲得1.95 g (理論值之85%)標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 0.67 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值277.00。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.14 (s, 6H), 1.96 - 2.08 (m, 2H), 3.85 (s, 3H), 4.39 - 4.51 (m, 3H), 5.81 (s, 2H), 6.80 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 8.18 (s, 1H)。工作實例 實例 1 N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-(2- 甲氧基乙基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 
將75 mg (0.18 mmol) 2-(2-甲氧基乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-2)溶解於500 µl THF中且與887 µl (0.89 mmol)於THF中之1 M甲基溴化鎂溶液混合。在25℃下將反應混合物攪拌60 min。隨後，小心地添加1 ml飽和氯化銨水溶液且過濾混合物。用乙酸乙酯將水相萃取兩次，且合併有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。將殘餘物溶解於3 ml DMSO中並藉由製備型HPLC純化。冷凍乾燥含有產物之部分。獲得20 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.08 min MS (ESIpos): m/z = 423 (M+H)+ 1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.62 (s, 6 H), 3.22 (s, 3 H), 3.82 (t, 2 H), 4.55 (t, 2 H), 5.96 (s, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 8.16 (d1 H), 8.29 - 8.42 (m, 2 H), 8.42 - 8.50 (m, 1 H), 8.71 (s, 1 H), 12.36 (s, 1 H)實例 2 N-[6-( 羥基甲基 )-2-(2- 甲氧基乙基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 
將13 mg (0.36 mmol)氫化鋰鋁懸浮於1 ml THF中且將混合物冷卻至0℃。逐滴添加75 mg (0.17 mmol)溶解於500 µl THF中之2-(2-甲氧基乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-2)且在25℃下將混合物攪拌60 min。用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取兩次，且用氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾，濃縮且在減壓下乾燥。此獲得13 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 0.99 min MS (ESIpos): m/z = 394 (M+H)+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.23 (s, 3 H), 3.83 (t, 2 H), 4.56 (t, 2 H), 4.69 (d, 2 H), 5.77 (t, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 8.19 (d, 1 H), 8.33 - 8.41 (m, 2 H), 8.43 - 8.47 (m, 1 H), 8.51 (s, 1 H), 11.20 (s, 1 H)實例 3 N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-(3- 甲氧基丙基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 
將75 mg (0.17 mmol) 2-(3-甲氧基丙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-3)溶解於500 µl THF中且與859 µl (0.86 mmol)於THF中之1 M甲基溴化鎂溶液混合。在25℃下將反應混合物攪拌60 min。隨後，小心地添加1 ml飽和氯化銨溶液且過濾混合物。用乙酸乙酯將水相萃取兩次，且合併有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。將殘餘物溶解於3 ml DMSO中並藉由製備型HPLC純化。冷凍乾燥含有產物之部分。獲得25 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.13 min MS (ESIpos): m/z = 437 (M+H)+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.62 (s, 6 H), 2.14 (quin, 2 H), 3.23 (s, 3 H), 3.26 - 3.32 (m, 2 H), 4.44 (t, 2 H), 5.95 (s, 1 H), 7.58 (s, 1 H), 8.16 (d, 1 H), 8.31 - 8.40 (m, 2 H), 8.43 - 8.48 (m, 1 H), 8.72 (s, 1 H), 12.36 (s, 1 H)。實例 4 N-[6-( 羥基甲基 )-2-(3- 甲氧基丙基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 
將13 mg氫化鋰鋁懸浮於THF中且將混合物冷卻至0℃。逐滴添加75 mg (0.17 mmol)於THF中之2-(3-甲氧基丙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-3)且使混合物在30 min內達到室溫。用水稀釋混合物並過濾，用乙酸乙酯洗滌殘餘物且用乙酸乙酯萃取濾液。用氯化鈉溶液洗滌合併之乙酸乙酯相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物。1
H NMR (300 MHz, DMSO-d 6
): δ [ppm] = 2.14 (quin, 2 H), 3.23 (s, 3 H), 3.29 (t, 2 H), 4.45 (t, 2 H), 4.68 (d, 2 H), 5.77 (t, 1 H), 7.58 (s, 1 H), 8.18 (d, 1 H), 8.32 - 8.48 (m, 3 H), 8.51 (s, 1 H), 11.21 (s, 1 H)。實例 5 N-[2-(2- 羥基乙基 )-6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 階段 A ：
製備N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺
將100 mg (0.19 mmol) 2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-5)溶解於1 ml THF中且與669 µl (0.67 mmol)於THF中之1 M甲基溴化鎂溶液混合。在25℃下將反應混合物攪拌60 min。再添加287 µl (0.29 mmol)於THF中之1 M甲基溴化鎂溶液且在25℃下將混合物攪拌3 h。隨後，小心地添加20 ml飽和氯化銨溶液且過濾混合物。用乙酸乙酯將水相萃取兩次，且合併有機相，經硫酸鎂乾燥，過濾，濃縮且在減壓下乾燥。此獲得50 mg N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 1.51 min MS (ESIpos): m/z = 523(M+H)+ 1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = -0.17 - -0.09 (m, 6 H), 0.78 (s, 9 H), 1.62 (s, 6 H), 4.04 (t, 2 H), 4.47 (t, 2 H), 5.98 (s, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 8.16 (d, 1 H), 8.29 (s, 1 H), 8.37 (t, 1 H), 8.45 (d, 1 H), 8.73 (s, 1 H), 12.38 (s, 1 H)。階段 B ： 
將50 mg (96 µmol) N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺溶解於1.0 ml THF中且與144 µl (0.14 mmol)於THF中之1 M四丁基氟化銨溶液混合。在室溫下將反應混合物攪拌1 h。用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取兩次，且用飽和氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。此獲得36 mg N-[2-(2-羥基乙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(實例5)。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
): d [ppm] = 1.62 (s, 6H), 3.86 (q, 2H), 4.43 (t, 2H), 4.95 (t, 1H), 5.94 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 8.16 (dd, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.37 (t, 1H), 8.45 (d, 1H), 8.72 (s, 1H), 12.36 (s, 1H)。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 0.97 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值408.00。實例 6 N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-(3- 羥基丙基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 階段 A ：
製備N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺
將50 mg (0.09 mmol) 2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}丙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-6)溶解於500 µl THF中且與326 µl (0.33 mmol)於THF中之1 M甲基溴化鎂溶液混合。在25℃下將反應混合物攪拌60 min。隨後，小心地添加20 ml飽和氯化銨溶液且用乙酸乙酯將混合物萃取兩次。經由疏水過濾器過濾合併之有機相，濃縮且在減壓下乾燥。藉由製備型HPLC純化殘餘物。獲得40 mg N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.58 min MS (ESIpos): m/z = 537(M+H)+ 1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.02 - 0.05 (m, 6 H), 0.84 - 0.91 (m, 9 H), 1.62 (s, 6 H), 2.02 - 2.18 (m, 2 H), 3.55 - 3.62 (m, 2 H), 4.45 (t, 2 H), 5.96 (s, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 8.16 (d, 1 H), 8.31 (s, 1 H), 8.33 - 8.42 (m, 1 H), 8.45 (d, 1 H), 8.72 (s, 1 H), 12.37 (s, 1 H)。階段 B ： 
將37 mg (0.07 mmol) N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺溶解於500 µl THF中且與207 µl (0.21 mmol)於THF中之1 M四丁基氟化銨溶液混合。在25℃下將反應混合物攪拌2 h。用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取兩次，且用飽和氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，過濾並濃縮。藉由製備型HPLC純化後，獲得10 mg N-[6-(2-羥基丙-2-基)-2-(3-羥基丙基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(實例6，含有次要組分)。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 1.00 min MS (ESIpos): m/z = 423 (M+H)+ 1
H NMR所選信號(400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.61 (s), 2.00 - 2.12 (m), 3.38 (t, 2 H), 4.44 (t, 2 H), 4.62 (br. s., 1 H), 5.93 (br. s., 1 H), 7.55 (s, 1 H), 8.13 (d, 1 H), 8.27 - 8.38 (m, 2 H), 8.43 (d, 1 H), 8.71 (s, 1 H), 12.30 (br. s., 1 H)。實例 7 N-[2-(2- 羥基乙基 )-6-( 羥基甲基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 階段 A ：
N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺
將100 mg (0.19 mmol) 2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-5)溶解於1 ml THF中且與191 µl (0.38 mmol) 2 M硼氫化鋰溶液混合。在25℃下將混合物攪拌24 h。添加14 mg (0.38 mmol)硼氫化鈉及500 µl甲醇，且在25℃下將混合物攪拌4 h。再添加14 mg (0.38 mmol)硼氫化鈉，且在25℃下將混合物攪拌24 h。將水小心地添加至反應混合物中並移除有機相。然後用乙酸乙酯將混合物萃取兩次，且用飽和氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。將殘餘物吸收於2 ml DMSO中並藉由製備型HPLC純化。此獲得30 mg N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 1.44 min MS (ESIpos): m/z = 495(M+H)+ 1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = -0.16 - -0.12 (m, 6 H), 0.75 - 0.79 (m, 9 H), 4.05 (t, 2 H), 4.48 (t, 2 H), 4.69 (d, 2 H), 5.75 - 5.77 (m, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 8.18 (dd, 1 H), 8.30 - 8.33 (m, 1 H), 8.38 (t, 1 H), 8.45 (d, 1 H), 8.51 (s, 1 H), 11.20 (s, 1 H)。階段 B ： 
將33 mg (0.07 mmol) N-[2-(2-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺溶解於1 ml THF中且與100 µl (0.10 mmol)於THF中之1 M四丁基氟化銨溶液混合。在25℃下將反應混合物攪拌1 h。用水稀釋混合物並用乙酸乙酯萃取兩次，且用飽和氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾，濃縮且在減壓下乾燥。獲得25 mg N-[2-(2-羥基乙基)-6-(羥基甲基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(實例7)。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 0.87 min MS (ESIpos): m/z = 381 (M+H)+ 1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.87 (q, 2 H), 4.44 (t, 2 H), 4.69 (d, 2 H), 4.98 (t, 1 H), 5.70 - 5.81 (m, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 8.11 - 8.23 (m, 1 H), 8.31 - 8.42 (m, 2 H), 8.43 - 8.49 (m, 1 H), 8.51 (s, 1 H), 11.20 (s, 1 H)。實例 8 N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-( 氧雜環丁 -3- 基甲基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 
將50 mg (0.12 mmol) 2-(氧雜環丁-3-基甲基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-1)溶解於500 µl THF中且與576 µl (0.58 mmol)於THF中之1 M甲基溴化鎂溶液混合。在25℃下將反應混合物攪拌60 min。隨後，小心地添加20 ml飽和氯化銨水溶液且濃縮混合物。用乙酸乙酯將水相萃取兩次，且合併有機相，經硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮。將殘餘物溶解於2.0 ml DMSO中並藉由製備型HPLC純化。冷凍乾燥含有產物之部分。獲得30 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 1.03 min MS (ESIpos): m/z = 435 (M+H)+ 1
H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.62 (s, 6 H), 3.45 - 3.61 (m, 1 H), 4.48 (t, 2 H), 4.66 (dd, 2 H), 4.72 (d, 2 H), 5.94 (s, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 8.16 (d, 1 H), 8.33 - 8.42 (m, 2 H), 8.42 - 8.47 (m, 1 H), 8.72 (s, 1 H), 12.36 (s, 1 H)。實例 9 N-[6-( 羥基甲基 )-2-( 氧雜環丁 -3- 基甲基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 
將75 mg (0.17 mmol) 2-(氧雜環丁-3-基甲基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-1)溶解於1 ml THF/甲醇(1:1)混合物中，且添加8 mg (0.21 mmol)硼氫化鈉。在25℃下將混合物攪拌60 min。濃縮反應混合物，且將殘餘物與水混合。將懸浮液劇烈攪拌15 min，且藉由抽吸過濾掉固體，用水洗滌兩次且用二乙醚洗滌兩次，並在減壓下乾燥。獲得48 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 0.94 min MS (ESIpos): m/z = 407 (M+H)+ 1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.55 (s, 1 H), 4.48 (t, 2 H), 4.61 - 4.77 (m, 6 H), 7.57 (s, 1 H), 8.18 (dd, 1 H), 8.33 - 8.49 (m, 3 H), 8.51 (s, 1 H), 11.21 (s, 1 H)。實例 10 N-{6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-[3-( 甲基磺醯基 ) 丙基 ]-2H- 吲唑 -5- 基 }-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 
在室溫下，將500 mg (1.32 mmol) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)、569 mg碳酸鉀及114 mg碘化鉀於5.0 ml DMF中之混合物攪拌15 min。添加414 mg 1-溴-3-(甲基磺醯基)丙烷且在室溫下將混合物攪拌過夜。添加水，用乙酸乙酯將混合物萃取兩次且用氯化鈉溶液洗滌萃取物並濃縮。藉由管柱層析(二氯甲烷/甲醇梯度)純化殘餘物。藉由與二乙醚一起攪拌萃取產物部分，獲得59 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 1.02 min MS (ESIpos): m/z = 485 (M+H)+1
H-NMR (300 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.63 (s, 6H), 2.26 - 2.42 (m, 2H), 2.99 (s, 3H), 3.06 - 3.16 (m, 2H), 4.55 (t, 2H), 5.96 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 8.16 (d, 1H), 8.33 - 8.48 (m, 3H), 8.73 (s, 1H), 12.37 (s, 1H)。實例 11
N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺
製備方法1 首先將705 mg (1.57 mmol) 2-(3-羥基-3-甲基丁基)-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-4)裝填於10 ml THF中且在冰水冷卻浴中冷卻。添加2.6 ml (5.0當量) 3M甲基溴化鎂溶液(於二乙醚中)且在用冰浴冷卻的同時將混合物攪拌1 h並在室溫下攪拌4.5 h。再添加1當量之甲基溴化鎂溶液且在室溫下將混合物攪拌20.5 h。再添加1當量之甲基溴化鎂溶液且在室溫下將混合物攪拌22 h。將反應混合物與飽和氯化銨水溶液混合，攪拌且用乙酸乙酯萃取三次。用氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。此獲得790 mg殘餘物，藉助製備型HPLC純化該殘餘物。此獲得234 mg標題化合物及164 mg產物部分，藉由與二乙醚一起攪拌萃取該產物部分。藉由抽吸過濾然後乾燥後，再獲得146 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.10 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值450.00。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.14 (s, 6H), 1.61 (s, 6H), 1.99 - 2.08 (m, 2H), 4.42 - 4.55 (m, 3H), 5.93 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 8.15 (dd, 1H), 8.32 - 8.39 (m, 2H), 8.41 - 8.47 (m, 1H), 8.70 (s, 1H), 12.34 (s, 1H)。 製備方法2 在室溫下，將500 mg (1.37 mmol) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)、569 mg碳酸鉀及114 mg碘化鉀於5 ml DMF中之混合物攪拌15 min。添加344 mg (1.5當量) 4-溴-2-甲基丁-2-醇且將混合物加熱至100℃並保持2 h。再添加0.5當量之4-溴-2-甲基丁-2-醇且在室溫下將混合物攪拌16 h。將混合物與水混合並用乙酸乙酯萃取兩次，且用飽和氯化鈉溶液洗滌合併之有機相並經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析純化(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。此獲得100 mg產物部分，藉由與二乙醚一起攪拌萃取該產物部分。乾燥後，獲得60 mg標題化合物。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.14 (s, 6 H), 1.61 (s, 6H), 1.99 - 2.07 (m, 2 H), 4.43 - 4.52 (m, 3 H) 5.94 (s, 1 H) 7.57 (s, 1 H) 8.15 (dd, 1H) 8.33 - 8.40 (m, 2 H), 8.42 - 8.48 (m, 1 H), 8.71 (s, 1 H), 12.35 (s, 1 H)實例 12
N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[2-(甲基磺醯基)乙基]-2H-吲唑-5-基}-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺
將160 mg (0.44 mmol) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)與182 mg碳酸鉀及36 mg碘化鉀一起懸浮於1.0 ml DMF中，且在室溫下將混合物攪拌15 min。然後添加123 mg 2-溴乙基甲基碸(0.66 mmol)且在室溫下將混合物攪拌過夜。添加水，用乙酸乙酯將混合物萃取兩次且用飽和氯化鈉水溶液洗滌萃取物，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物，獲得20 mg標題化合物。 UPLC (方法A2): Rt
= 1.01 min； MS (ESIpos): m/z = 471 (M+H)+1
H NMR (400 MHz, DMSO-d 6
): δ [ppm]= 1.63 (s, 6 H), 2.90 (s, 3 H), 3.85 (t, 2 H), 4.86 (t, 2 H), 5.97 (s, 1 H), 7.59 (s, 1 H), 8.13 - 8.19 (m, 1 H), 8.37 (s, 1 H), 8.41 - 8.48 (m, 2 H), 8.74 (s, 1 H), 12.37 (s, 1 H)。實例 13
6-(二氟甲基)-N-[2-(3-羥基-3-甲基丁基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺
製備方法1 在室溫下，將250 mg 6-(二氟甲基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺(中間體5-2之粗產物)、144 mg碘化鉀及239 mg碳酸鉀於2.5 ml DMF中之混合物攪拌15 min。添加145 mg (0.87 mmol) 4-溴-2-甲基丁-2-醇，在110℃下將混合物攪拌3 h，再添加96 mg 4-溴-2-甲基丁-2-醇且在110℃下將混合物攪拌4 h。添加水，用乙酸乙酯將混合物萃取兩次並用半飽和氯化鈉水溶液洗滌，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由矽膠上之管柱層析(己烷/乙酸乙酯)實現純化。獲得61 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.00 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值432.00。1
H-NMR (300 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.14 (s, 6H), 1.63 (s, 6H), 1.97 - 2.08 (m, 2H), 4.41 - 4.55 (m, 3H), 5.99 (s, 1H), 7.03 (t, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.94 - 8.00 (m, 1H), 8.24 - 8.38 (m, 3H), 8.71 (s, 1H), 12.49 (s, 1H)。 製備方法2 以與實例11之製備(製備方法1)類似之方式，使3.00 g 5-({[6-(二氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-11)與3M甲基溴化鎂溶液(於二乙醚中)反應。藉由與二乙醚一起萃取攪拌、隨後藉由製備型HPLC純化粗產物後，獲得1.37 g標題化合物。實例 14
6-(二氟甲基)-N-{6-(2-羥基丙-2-基)-2-[2-(甲基磺醯基)乙基]-2H-吲唑-5-基}吡啶-2-甲醯胺
在室溫下，將250 mg 6-(二氟甲基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺(中間體5-2之粗產物)、144 mg碘化鉀及239 mg碳酸鉀於2.5 ml DMF中之混合物攪拌15 min。添加162 mg 2-溴乙基甲基碸(0.87 mmol)且在110℃下將混合物攪拌3 h。添加水，用乙酸乙酯將混合物萃取兩次且用半飽和氯化鈉水溶液洗滌萃取物，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物且另外藉由矽膠上之管柱層析純化(己烷/乙酸乙酯)純化產物部分。獲得40 mg標題化合物。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.65 (s, 6H), 2.90 (s, 3H), 3.85 (t, 2H), 4.85 (t, 2H), 6.03 (s, 1H), 7.04 (t, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.98 (d, 1H), 8.25 - 8.36 (m, 2H), 8.43 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 12.52 (s, 1H)。實例 15 6-( 二氟甲基 )-N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-(3- 羥基丙基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ] 吡啶 -2- 甲醯胺 階段 A ：
製備N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(二氟甲基)吡啶-2-甲醯胺
在室溫下，將250 mg 6-(二氟甲基)-N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]吡啶-2-甲醯胺(中間體5-2)、48 mg碘化鉀及239 mg碳酸鉀於2.5 ml DMF中之混合物攪拌15 min。添加219 mg (0.87 mmol, 1.5當量) (3-溴丙氧基)(第三丁基)二甲基矽烷且在110℃下將混合物攪拌3 h。再添加1當量之(3-溴丙氧基)(第三丁基)二甲基矽烷且在100℃下將混合物攪拌4 h。添加水，用乙酸乙酯萃取混合物並用氯化鈉水溶液洗滌萃取物，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由管柱層析(己烷/乙酸乙酯)純化殘餘物。獲得92 mg標題化合物。階段 B ： 
以與實例6、階段B之製備類似之方式，使92 mg N-[2-(3-{[第三丁基(二甲基)矽基]氧基}丙基)-6-(2-羥基丙-2-基)-2H-吲唑-5-基]-6-(二氟甲基)吡啶-2-甲醯胺與0.53 ml於THF中之1 M四丁基氟化銨溶液在1 h內反應。如實例6中進行水性後處理並藉由製備型HPLC純化，獲得46 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 0.92 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值404.00。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.64 (s, 6H), 2.05 (quin, 2H), 3.35 - 3.46 (m, 2H), 4.45 (t, 2H), 4.64 (t, 1H), 5.99 (s, 1H), 7.04 (t, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.95 - 7.99 (m, 1H), 8.25 - 8.36 (m, 3H), 8.73 (s, 1H), 12.50 (s, 1H)。實例 16 N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-(4,4,4- 三氟丁基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 
將210 mg (0.58 mmol) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)於3 ml DMF中之混合物與0.11 ml (0.87 mmol) 1,1,1-三氟-4-碘丁烷及239 mg碳酸鉀混合，且在80℃下將混合物攪拌6 h。添加水後，用乙酸乙酯將混合物萃取三次，且用飽和氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由製備型HPLC純化粗產物。獲得19 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.27 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值474.15。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.62 (s, 6H), 2.10 - 2.33 (m), 4.49 (t, 2H), 5.94 (s, 1H), 7.59 (s, 1H), 8.13 - 8.18 (m, 1H), 8.32 - 8.41 (m, 2H), 8.41 - 8.47 (m, 1H), 8.72 (s, 1H), 12.35 (s, 1H)。實例 17 N-{6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-[3-( 三氟甲氧基 ) 丙基 ]-2H- 吲唑 -5- 基 }-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺 
首先將150 mg (0.33 mmol) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)裝填於2 ml THF中。添加58 mg (0.40 mmol) 3-(三氟甲氧基)丙-1-醇、131 mg三苯基膦及71 µl偶氮二甲酸二異丙基酯(DIAD, CAS 2446-83-5)且在室溫下將混合物攪拌19 h。添加0.83 ml氫氧化鈉溶液(2M)且在40℃下將混合物攪拌5 h。用水稀釋混合物且用乙酸乙酯萃取三次，並濃縮合併之有機相且藉由製備型HPLC純化。獲得16 mg呈粗產物形式之標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 1.26 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值490.14。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
，所選信號): δ [ppm]= 1.61 (s, 6H), 1.84 (d, 1H), 2.32 (quint., 2H), 4.08 (t, 2H), 4.51 (t, 2H), 7.58 (s, 1H), 8.15 (d, 1H), 8.31 - 8.39 (m, 2H), 8.44 (d, 1H), 8.72 (s, 1H), 12.35 (s, 1H)。實例 18 N-{6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-[3-(2,2,2- 三氟乙氧基 ) 丙基 ]-2H- 吲唑 -5- 基 }-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺
以與實例11之製備(製備方法1)類似之方式，使3 ml THF中之52 mg (0.10 mmol) 2-[3-(2,2,2-三氟乙氧基)丙基]-5-({[6-(三氟甲基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-10)與2 × 171 µl於二乙醚中之3M溴化鎂鎂溶液反應。藉由製備型HPLC純化，獲得12 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A1): Rt
= 1.25 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值504.16。1
H-NMR (500 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm] = 1.63 (s, 6H), 2.20(quin, 2H), 3.58(t, 2H),4.05(q, 2H), 4.47(t, 2H),5.94(s, 1H), 7.58 (s, 1H), 8.15 (dd, 1H), 8.32 (s, 1H), 8.36 (t, 1H), 8.45(d, 1H), 8.73 (s, 1H), 12.36 (s,1H)。實例 19 5- 氟 -N-[2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6- 甲基吡啶 -2- 甲醯胺 
首先將228 mg (0.31 mmol) 5-{[(5-氟-6-甲基吡啶-2-基)羰基]胺基}-2-(3-羥基-3-甲基丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-8)裝填於4.5 ml THF中且在冰冷卻浴中冷卻。添加0.63 ml 3M甲基溴化鎂溶液(於二乙醚中)且在用冰浴冷卻的同時將混合物攪拌2 h並在室溫下攪拌21 h。將反應混合物與飽和氯化銨水溶液混合且用乙酸乙酯萃取三次。濃縮合併之有機相。藉由製備型HPLC純化殘餘物。獲得82 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 1.03 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值414.21。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.13 (s, 6H), 1.63 (s, 6H), 1.99 - 2.05 (m, 2H), 2.55 - 2.59 (m, 3H), 4.42 - 4.50 (m, 3H), 5.95 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.83 (t, 1H), 8.05 (dd, 1H), 8.31 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 12.33 (s, 1H)。實例 20 N-[2-(3- 羥基 -3- 甲基丁基 )-6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ]-6- 甲基吡啶 -2- 甲醯胺 
首先將278 mg (0.48 mmol) 2-(3-羥基-3-甲基丁基)-5-{[(6-甲基吡啶-2-基)羰基]胺基}-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-9)裝填於5.0 ml THF中且在冰冷卻浴中冷卻。添加0.97 ml 3M甲基溴化鎂溶液(於二乙醚中)且在用冰浴冷卻的同時將混合物攪拌2 h並在室溫下攪拌20.5 h。再添加0.48 ml 3M甲基溴化鎂溶液且在室溫下將混合物攪拌67 h。將混合物與飽和氯化銨水溶液混合且用乙酸乙酯萃取三次，並用氯化鈉溶液洗滌萃取物，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物。獲得111 mg標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 0.97 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值396.22。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.15 (s, 6H), 1.64 (s, 6H), 2.00 - 2.08 (m, 2H), 2.61 (s, 3H), 4.41 - 4.59 (m, 3H), 5.92 (s, 1H), 7.50 (dd, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.90 - 7.99 (m, 2H), 8.33 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 12.39 (s, 1H)。實例 21 6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-N-[6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2-(4,4,4- 三氟丁基 )-2H- 吲唑 -5- 基 ] 吡啶 -2- 甲醯胺 
將72 mg (0.16 mmol) 5-({[6-(2-羥基丙-2-基)吡啶-2-基]羰基}胺基)-2-(4,4,4-三氟丁基)-2H-吲唑-6-甲酸甲酯(中間體4-7)於10 ml THF中之溶液冷卻於冰/水冷卻浴中。添加0.26 ml於二乙醚中之3M甲基溴化鎂溶液並將混合物攪拌2 h且然後在室溫下攪拌20 h。再添加1當量之3M甲基溴化鎂溶液且在室溫下將混合物攪拌24 h。添加飽和氯化銨水溶液，用乙酸乙酯將混合物萃取三次並用氯化鈉溶液洗滌萃取物且濃縮。製備型HPLC獲得22 mg (理論值之31%)標題化合物。 UPLC-MS (方法A2): Rt
= 1.15 min (UV檢測器：TIC)，質量實驗值464.20。1
H-NMR (400 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 1.56 (s, 6H), 1.64 (s, 6H), 2.07 - 2.34 (m, 4H), 4.49 (t, 2H), 5.32 (s, 1H), 6.05 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.87 (dd, 1H), 7.99 - 8.05 (m, 2H), 8.35 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 12.45 (s, 1H)。實例 22 N-{2-[2-(1- 羥基環丙基 ) 乙基 ]-6-(2- 羥基丙 -2- 基 )-2H- 吲唑 -5- 基 }-6-( 三氟甲基 ) 吡啶 -2- 甲醯胺
首先將250 mg (0.69 mmol) N-[6-(2-羥基丙-2-基)-1H-吲唑-5-基]-6-(三氟甲基)吡啶-2-甲醯胺(中間體5-1)裝填於5 ml DMSO中。添加159 mg (0.96 mmol) 1-(2-溴乙基)環丙醇、285 mg碳酸鉀及171 mg碘化鉀且在100℃下將混合物攪拌5 h。添加水並用乙酸乙酯將混合物萃取三次。用氯化鈉溶液洗滌合併之有機相，經由疏水過濾器過濾並濃縮。藉由製備型HPLC (管柱：Waters XBridge C18 5µ 100×30mm，溶析液A：水+ 0.1體積%甲酸(99%)，溶析液B：乙腈)純化殘餘物。冷凍乾燥獲得45 mg標題化合物。1
H-NMR (500 MHz, DMSO-d6
): δ [ppm]= 0.18 - 0.22 (m, 2H), 0.48 - 0.52 (m, 2H), 1.62 (s, 6H), 2.08 (t, 2H), 4.54 - 4.60 (m, 2H), 5.36 (s, 1H), 5.96 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 8.16 (dd, 1H), 8.34 - 8.39 (m, 2H), 8.45 (d, 1H), 8.72 (s, 1H), 12.36 (s, 1H)。多種自體免疫病症中之生理效能之評估 IRAK4 激酶分析
在下文所述之IRAK4 TR-FRET分析(TR-FRET =時間解析螢光共振能量轉移)中量測本發明物質之IRAK4抑制活性。 使用在感染桿狀病毒之昆蟲細胞(Hi5、BTI-TN-5B1-4細胞系，購自Invitrogen，目錄號B855-02)中表現並經由親和層析純化之N端GST (麩胱甘肽S-轉移酶)及人類IRAK4的重組融合蛋白作為酶。用於激酶反應之受質係生物素化肽生物素-Ahx-KKARFSRFAGSSPSQASFAEPG (C端呈醯胺形式)，可購自例如Biosyntan GmbH (Berlin-Buch)。 對於分析，自測試物質於DMSO中之2 mM溶液製備介於20 µM至0.073 nM範圍內之11種不同濃度。將50 nl各別溶液吸量至黑色低體積384孔微量滴定板(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)中，添加IRAK4於分析緩衝液[50 mM HEPES (pH 7.5)、5 mM MgCl2
、1.0 mM二硫蘇糖醇、30 µM經活化正釩酸鈉、0.1% (w/v)牛γ-球蛋白(BGG)、0.04% (v/v) nonidet-P40 (Sigma)]中之2 µl溶液，且將混合物培育15 min以允許物質與酶在激酶反應之前預結合。然後藉由添加三磷酸腺苷(ATP, 1.67 mM = 於5 µl分析體積中之最終濃度：1 mM)及肽受質(0.83 µM = 於5 µl分析體積中之最終濃度：0.5 µM)於分析緩衝液中之3 µl溶液起始激酶反應，且將所得混合物在22℃培育45 min之反應時間。將IRAK4之濃度調節至各別酶活性且設定使得分析係在線性範圍內實施。典型濃度為約0.2 nM之等級。藉由添加TR-FRET檢測試劑[0.1 µM鏈黴抗生物素蛋白-XL665 (Cisbio Bioassays; France，目錄號610SAXLG)]及1.5 nM抗磷絲胺酸抗體[Merck Millipore, 「STK抗體」，目錄號35-002]及0.6 nM LANCE EU-W1024標記之抗小鼠-IgG抗體(Perkin-Elmer，產品編號AD0077；或者，可使用來自Cisbio Bioassays之鋱穴狀化合物標記之抗小鼠-IgG抗體)於EDTA水溶液(100 mM EDTA、0.4 % [w/v]牛血清白蛋白[BSA]於25 mM HEPES pH 7.5中)中之5 µl溶液來終止反應。 將所得混合物在22℃培育1 h以允許形成生物素化磷酸化受質及檢測試劑之錯合物。然後藉由量測自銪螯合物標記之抗小鼠IgG抗體至鏈黴抗生物素蛋白-XL665之共振能量轉移來評估磷酸化受質之量。為此，於TR-FRET量測儀器(例如Rubystar (BMG Labtechnologies, Offenburg, Germany)或Viewlux (Perkin-Elmer))中在350 nm激發後在620 nm及665 nm量測螢光發射。將665 nm及622 nm之發射之比率作為磷酸化受質之量之量度。將數據正規化(無測試物質之酶反應= 0%抑制；所有其他分析組分但沒有酶= 100%抑制)。通常，測試物質係在相同微量滴定板上以介於20 µM至0.073 nM範圍內之11種不同濃度(20 µM、5.7 µM、1.6 µM、0.47 µM、0.13 µM、38 nM、11 nM、3.1 nM、0.89 nM、0.25 nM及0.073 nM)測試。在分析之前藉由連續稀釋製備稀釋系列(2 mM至7.3 nM於100% DMSO中)。藉由4-參數擬合計算IC50
值。表 1 ：
IRAK4激酶分析中實例化合物之IC50
值
