ES2898771T3 - Indazoles sustituidos útiles para el tratamiento y la prevención de enfermedades alérgicas y/o inflamatorias en animales - Google Patents

Indazoles sustituidos útiles para el tratamiento y la prevención de enfermedades alérgicas y/o inflamatorias en animales Download PDF

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Abstract

Compuestos de la Fórmula general (I): **(Ver fórmula)** en la que: R1 es alquilo C1-C6, donde el grupo alquilo C1-C6 esta no sustituido o mono o polisustituidos de manera idéntica o diferente por halógeno, hidroxilo, un grupo no sustituido o mono o polisustituido con halógeno de cicloalquilo C3- C6, o un R6, R7SO2, R7SO o R8O, o un grupo seleccionado de: **(Ver fórmula)** y **(Ver fórmula)** donde * representa el punto de unión del grupo con el resto de la molécula; R2 y R3 siempre tienen la misma definición y ambos son hidrógeno o alquilo C1-C6; R4 es halógeno, ciano, un alquilo C1-C6 no sustituido o mono o polisustituido de manera idéntica o diferente o un cicloalquilo C3-C6 no sustituido o mono o polisustituido de manera idéntica o diferente, y los sustituyentes son seleccionados de halo e hidroxilo; R5 es hidrógeno, halógeno o un alquilo C1-C6 no sustituido o mono o polisustituido con halógeno; R6 es un heterociclo saturado monocíclico no sustituido o monosustituido o disustituido con metilo, que tiene 4 a 6 átomos del anillo, que contiene heteroátomo o un heterogrupo del grupo de O, S, SO y So2; R7 es alquilo C1-C6, donde el grupo alquilo C1-C6 esta no sustituido o monosustituido o polisustituido de manera idéntica o diferente por halógeno, hidroxilo o cicloalquilo C3-C6; o R7 es cicloalquilo C3-C6; R8 es alquilo C1-C6, donde el grupo alquilo C1-C6 esta no sustituido o monosustituido o polisustituido de manera idéntica o diferente por halógeno; y los diastereómeros, los enantiómeros, las sales, los solvatos o los solvatos de las sales, para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades alérgicas y/o inflamatorias en animales.

Description

DESCRIPCIÓN
Indazoles sustituidos útiles para el tratamiento y la prevención de enfermedades alérgicas y/o inflamatorias en animales
La presente solicitud hace referencia al uso de nuevos indazoles sustituidos para el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales y a su uso para la producción de medicamentos para el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales, en especial de dermatitis atópicas y/o dermatitis alérgica por pulgas, y en especial en animales domésticos, en particular en perros.
La presente invención hace referencia al uso de nuevos indazoles sustituidos de la fórmula general (I) que inhibe la quinasa 4 asociada al receptor de interleucina 1 (IRAK4).
La IRAK4 humana (quinasa 4 asociada al receptor de interleucina 1) tiene un rol clave en la activación del sistema inmunológico. Por lo tanto, la quinasa es una importante molécula terapéutica diana para el desarrollo de sustancias que inhiben la inflamación. La IRAK4 se expresa por medio de una multitud de células y media la transducción de señal de receptores de tipo Toll (TLR), excepto TLR3, y receptores de la interleucina (Il)-1p que consisten en el IL-1R (receptor), IL-18R, IL-33R y IL-36R (Janeway and Medzhitov, Annu. Rev. Immunol., 2002; Dinarello, Annu. Rev. Immunol., 2009; Flannery and Bowie, Biochemical Pharmacology, 2010).
Ni los ratones knockout con IRAK4, ni las células humanas de pacientes con IRAK4 insuficiente reaccionan a la estimulación por TLR (excepto TLR3) y la familia Il-1p (Suzuki, Suzuki, et al., Nature, 2002; Davidson, Currie, et al., The Journal of Immunology, 2006; Ku, von Bernuth, et al., JEM, 2007; Kim, Staschke, et al., JEM, 2007).
La unión de los ligandos para TLR o los ligandos de la familia Il-1p al respectivo receptor lleva a la captación y unión de MyD88 [gen de la respuesta primaria de diferenciación Mieloide (88)] con el receptor. Como resultado, MyD88 interactúa con IRAK4, lo que da como resultado la formación de un complejo activo que interactúa o activa las quinasas IRAK1 o IRAK2 (Kollewe, Mackensen, et al., Journal of Biological Chemistry, 2004; Precious et al., J. Biol. Chem., 2009). Como resultado, se activa la vía de señalización del NF (factor nuclear)-KB y la vía de señalización de la MAPK (quinasa de proteína activada por mitógeno) (Wang, Deng, et al., Nature, 2001). La activación tanto de la vía de señalización NF-kB como de la vía de señalización MAPK conduce a procesos que se asocian con distintos procesos inmunológicos. Por ejemplo, existe una expresión aumentada de diversas moléculas y enzimas de señal inflamatoria como las citoquinas, quimoquinas y COX-2 (ciclooxigenasa-2), y estabilidad mRNA aumentada de genes asociados a la inflamación, por ejemplo COX-2, IL-6 (interleucina-6), IL-8 (Holtmann, Enninga, et al., Journal of Biological Chemistry, 2001; Datta, Novotny, et al., The Journal of Immunology, 2004). Además, estos procesos pueden estar asociados a la proliferación y diferenciación de tipos particulares de células, por ejemplo: monocitos, macrófagos, células dendríticas, células T y células B (Wan, Chi, et al., Nat Immunol, 2006; McGettrick and J. O'Neill, British Journal of Haematology, 2007).
El rol principal de IRAK4 en la patología de diversos trastornos inflamatorios ya se mostró por comparación directa de los ratones de tipo silvestre (WT) con animales modificados genéticamente que tienen una forma inactivada por quinasa de IRAK4 (IRAK4 KDKI). Los animales con IRAK4 KDKI tienen un cuadro clínico mejorado en el modelo animal de la esclerosis múltiple, ateroesclerosis, infarto de miocardio y mal de Alzheimer (Rekhter, Staschke, et al., Biochemical and Biophysical Research Communication, 2008; Maekawa, Mizue, et al., Circulation, 2009; Staschke, Dong, et al., The Journal of Immunology, 2009; Kim, Febbraio, et al., The Journal of Immunology, 2011; Cameron, Tse, et al., The Journal of Neuroscience, 2012). Además, se halló que la eliminación de IRAK4 en el modelo animal protege contra la miocarditis viral mediante una reacción antiviral mejorada con inflamación sistémica reducida de manera simultánea (Valaperti, Nishii, et al., Circulation, 2013). También se mostró que la expresión de IRAK4 se correlaciona con la actividad de la enfermedad del síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (Sun, Yang, et al., PLoS ONE, 2014). Además, se mostró la gran importancia de IRAK4 para la producción de IFNa (interferon alfa) medido por complejo inmunológico por medio de Células Dendríticas Plasmocitoides, un proceso clave en la patogénesis de lupus eritematoso sistémico (SLE) (Chiang et al., The Journal of Immunology, 2010). Además, la vía de señalización está asociada con la obesidad (Ahmad, R., P. Shihab, et al., Diabetology & Metabolic Syndrome, 2015). Al igual que el rol esencial de IRAK4 en la inmunidad congénita, también existen indicios de que IRAK4 influencia la diferenciación de las células Th17 T, componentes de inmunidad adaptativa. En ausencia de la actividad de la quinasa IRAK4, se generan menos células T que producen IL-17 (Células T Th17) en comparación con ratones WT. La inhibición de IRAK4 permite la profilaxis y/o el tratamiento de aterosclerosis, diabetes mellitus tipo 1, artritis reumatoide, espondiloartritis (en especial espondiloartritis psoríasica y enfermedad de Bekhterev), lupus eritematoso, psoriasis, vitiligo, arteritis de célula gigante, síndrome crónico del intestino irritable y enfermedades virales, por ejemplo VIH (virus de inmunodeficiencia humana), virus de la hepatitis (Staschke, et al., The Journal of Immunology, 2009; Marquez, et al., Ann Rheum Dis, 2014; Zambrano-Zaragoza, et al., International Journal of Inflammation, 2014; Wang, et al., Experimental and Therapeutic Medicine, 2015; Ciccia, et al., Rheumatology, 2015).
Debido a un rol principal de IRAK4 en la cascada de señal mediada por MyD88 de TLR (excepto TLR3) y la familia del receptor IL-1, la inhibición de IRAK4 puede ser utilizada por la profilaxis y/o el tratamiento de trastornos mediados por los receptores mencionados.
El arte previo describe una multitud de inhibidores de IRAK4 (véase, por ejemplo, Annual Reports in Medicinal Chemistry (2014), 49, 117 - 133).
Las solicitudes US8293923 y US20130274241 describen que los inhibidores de IRAK4 tienen una estructura de indazol 3-sustituida. No existe descripción de indazoles 2-sustituidos.
Los documentos WO2013106254 y WO2011153588 describen derivados de indazol 2,3-disustituidos.
El documento WO2007091107 describe derivados de indazol 2-sustituidos para el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne. Los compuestos descritos no tienen sustitución de 6-hidroxialquilo.
El documento WO2015091426 describe indazoles, como el Ejemplo 64, sustituido en la posición 2 por una cadena lateral carboxamida.
Figure imgf000003_0001
El documento WO2015104662 describe indazoles 2-sustituidos de la siguiente fórmula general:
Figure imgf000003_0002
En donde R2 es un grupo alquilo o cicloalquilo. Existen descripciones explícitas de indazoles 2-sustituidos que tienen un grupo metilo, 2-metoxietilo y ciclopentilo en la posición 2 (Ejemplos 1, 4 y 76). También se describe en el Ejemplo 117 un derivado de indazol que tiene un sustituyente hidroxietilo en la posición 1. Sin embargo, no se describen derivados de indazol que tengan un sustituyente 3-hidroxi-3-metilbutilo en la posición 1 o en la posición 2.
Los indazoles que tienen un grupo alquilo sustituido con hidróxilo en la posición 2 se abarcan, de forma genérica, por la fórmula general, pero no se describen de forma explícita en el documento WO2015104662.
Los indazoles que tienen un grupo alquilo en la posición 2 donde el grupo alquilo se sustituye, de manera adicional, por un grupo metilsulfonilo no se abarcan por la fórmula general y las definiciones de los sustituyentes de R2 en el documento WO2015104662.
Además del patrón de sustitución descrito anteriormente del indazol en las posiciones 1 y 2, el documento WO2015104662 describe indazoles que se sustituyen en la posición 6 para los que R1 se define de la siguiente manera: alquilo, ciano, -NRaRb o grupos sustituidos de manera opcional seleccionados de cicloalquilo, arilo, heterociclilo, donde los sustituyentes son, de manera independiente, alquilo, alcoxi, halógeno, hidroxilo, hidroxialquilo, amino, aminoalquilo, nitro, ciano, haloalquilo, haloalcoxi, -OCOCH2-O-alquilo, -OP(O)(O-alquilo)2 o -CH2-OP(O)(O-alquilo)2. Para los compuestos de indazol en donde R1 es un grupo alquilo, la fecha de presentación eficaz es el 7 de enero de 2015 (fecha de presentación internacional del documento WO2015104662). Las solicitudes Indias 416/CHE/2014 y 3018/CHE/2014 cuya prioridad se reivindica no describe ningún compuesto de indazol para el que R1 sea un grupo alquilo.
Por ende, los compuestos de indazol de la siguiente fórmula general:
Figure imgf000003_0003
En donde R1 es un grupo alquilo sustituido de manera opcional descrito por primera vez el 7 de enero de 2015 y, por lo tanto, luego de la fecha de prioridad de la presente solicitud.
Los ejemplos de los sustituyentes en la posición 6 descritos en el documento WO2015104662 para Ri son ciclopropilo, ciclohexilo, ciano, 3-fluorofenilo y sustituyentes heterocíclicos saturados. Los indazoles que tienen un grupo alquilo sustituido con hidroxilo en la posición 6 no se describen de manera explícita en el documento WO2015104662.
Los compuestos utilizados en la presente invención también se describen en la solicitud copendiente de patente PCT/EP2015/077596, publicada como WO2016083433 el 2 de junio de 2016.
Las opciones de tratamiento actuales para alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales, por ejemplo: para enfermedades alérgicas de la piel, que incluyen, de forma típica, el uso de esteroides y ciclosporina — ambos asociados con efectos adversos. Recientemente, un inhibidor de la quinasa de janus (JAK) se aprobó para el uso de la Dermatitis Atópica Canina (CAD) que, de manera sintomática, proporciona alivio del prurito, sin embargo, el régimen de dosificación puede nuevamente ser limitado por los efectos adversos. El tratamiento de CAD con un agente de modificación de la enfermedad y sus efectos adversos relacionados con el tratamiento sigue siendo una necesidad médica insatisfecha.
El problema abordado por la presente invención es el de proporcionar una mejor opción de tratamiento para las enfermedades inflamatorias y/o la alergia en animales.
Los presentes inhibidores de IRAK4 son en especial adecuados para el tratamiento y para la prevención de trastornos inflamatorios en animales caracterizados por un sistema inmunológico que reacciona de manera desproporcionada. Se debe hacer una mención particular a la Dermantitis Atópica Canina, a la Dermatitis Alérgica por pulgas en perros y gatos, enfermedad inflamatoria intestinal en perros y gatos, osteoartritis y dolor inflamatorio en perros, gatos, caballos y ganado, enfermedad recurrente no infecciosa en las vías respiratorias en caballos (también conocida como enfermedad pulmonar obstructiva crónica, arcadas), hipersensibilidad a los insectos en caballos (también conocida como alergia a las picaduras de culicoides, eccema estival), asma felino, enfermedad respiratoria bovina, mastitis y endometritis en ganado y enfermedad respiratoria porcina.
La dermatitis atópica, por ejemplo, es una enfermedad común en animales de compañia, en particular en gatos y perros.
Como un ejemplo específico, la Dermatitis Atópica Canina (CAD) es una de las enfermedades más comunes en perros. La CAD puede afectar a los pacientes en edad temprana y volverse recurrente a través de su vida. En un estudio de Lund et al. 1999, que investigó a 31484 perros en 52 prácticas privadas en los Estados Unidos de América, la prevalencia de CAD fue del 8,7 %. La CAD es la segunda causa más común de prurito canino luego de la Dermatitis Alérgica por Pulgas (FAD).
La dermatitis atópica canina puede definirse como una enfermedad inflamatoria y pruritica alérgica de la piel genéticamente prediscupuesta con rasgos clínicos característicos asociados con IgE, más comúnmente dirigido contra los alérgenos del ambiente (Halliwell, Veterinary Immunology and Immunopathology, 2006), como ácaros y polen, que son increíblemente difíciles de evitar para las mascotas, debido a que los ácaros se encuentran en todos lados y el polen penetra el aire libre.
La dermatitis atópica canina es una enfermedad compleja y que depende de un gran número de factores que involucran la desregularización inmunológica, la sensibilización alérgica, defectos en la barrera cutánea, la colonización microbiana y los factores medioambientales.
IgE no es un prerrequisito para el desarrollo de los signos clínicos en todos los casos y se definió a una entidad clínica separada conocida como dermatitis de tipo atópica como “una enfermedad inflamatoria y prurítica de la piel con características clínicas idénticas a aquellas que se vieron en la Dermatitis Atópica Canina en donde no puede documentarse una respuesta de IgE al medioambiente y otros alérgenos” (Nuttall et al., Vet. Record, 2013).
Los síntomas más comunes de la Dermatitis Atópica Canina incluyen picazón, rascado excesivo, frotarse contra la alfombra, pérdida de pelo, piel grasosa o escamada con mal olor, mordisqueo excesivo de las patas y áreas como la ingle y axilas. Con el paso del tiempo, la piel arañada puede desarrollar puntos rojos - áreas en carne viva, inflamadas - que pueden infectarse.
Actualmente, el tratamiento de erupciones agudas de la dermatitis atópica (AD) debe involucrar la búsqueda, y luego la eliminación, de la causa de las erupciones, baños con champús suaves y el control del prurito y la lesiones en la piel con intervenciones que incluyen glucocorticoides u oclacitinib de forma tópica y/u oral. Para la CAD crónica, las primeras etapas de control son la identificación y la prevención de factores eruptivos, al igual que asegurarse de que haya una higiene y cuidado adecuados de la piel y del pelaje; esto podría incluir baños más frecuentes y, en lo posible, el aumento del consumo de ácido graso esencial. La medicación actualmente más eficaz para reducir el prurito crónico y las lesiones en la piel son los glucocorticoides tópicos y orales, la ciclosporina oral, el oclacitinib oral y, cuando estén disponibles, las interferonas recombinantes inyectables. La inmunoterapia específica de alérgeno y las aplicaciones tópicas intermitentes de glucocorticoides son las únicas intervenciones que pueden evitar o retrasar la recurrencia de erupciones de AD. (Olivry et al., BMC Veterinary Research, 2015)
Como otro ejemplo específico, la dermatitis alérgica por pulgas (FAD) o la hipersensibilidad a la picadura de pulgas es la enfermedad dermatológica más común en los perros domésticos (Scott et al., In: Muller and Kirk's Small Animal Dermatology, 2001), causada por la pulga más frecuente, por lejos, en perros y gatos: Ctenocephalides felis (Beresford-Jones, J Small Animal Practice, 1981; Chesney, Veterinary Record, 1995). Los gatos también pueden desarrollar FAD, que es una de las causas principales de la dermatitis miliar felina.
FAD es más frecuente durante el verano, aunque en el clima cálido las infestaciones de pulgas pueden persistir durante el año. En las regiones templadas del norte, la cercana asociación de mascotas y sus pulgas con las viviendas de los humanos crea condiciones que permiten un problema a lo largo del año. Las temperaturas extremas y la baja humedad tienden a inhibir el desarrollo de las pulgas.
Cuando se alimentan, las pulgas inyectan saliva que contiene varios compuestos similares a la histamina, enzimas, polipéptidos y amino ácidos que abarcan una gran variedad de tamaños (40-60 kD) e inducen la hipersensibilidad de Tipo I, Tipo IV y basófila. Los perros propensos a las pulgas expuestos de forma intermitente a las picaduras de pulgas desarrollan reacciones ya sea, de manera inmediata (15 min) o retardada (24-48 hr), o ambas, y niveles detactables tanto de anticuerpos antipulgas circulantes IgE como IgG. Los perros expuestos de manera continua a las picaduras e pulgas tienen bajos niveles de estos anticuerpos circulantes y o no desarrollan reacciones en la piel o las desarrollan más tarde y en un grado considerablemente reducido. Esto podría indicar que la tolerancia inmunológica se puede desarrollar de manera natural en perros expuestos de manera continua a las picaduras de pulga. Aunque a patofisiología de FAD en gatos se comprende muy poco, pueden existir mecanismos similares.
La pulga del gato (Ctencephalides felis) produce la irritación severa en animales y personas y es responsable de la Dermatitis Alérgica por pulgas. Los síntomas típicos son: prurito, inflamación de la piel o lesiones en la piel (eritema, escamas, pápulas, costras y liquenificación). Estas lesiones se ven más comúnmente a lo largo del lomo y en la base de la cola.
A medida que la afección progresa podría haber pérdida de pelo, pelos quebradizos, llagas supurantes o costrosas, protuberancias y enrojecimiento e inflamación general de la piel. Las llagas pueden ser muy dolorosas. En casos graves la piel se vuelve gruesa y oscura, de forma predominantes en el área del lomo del perro y en la base de la cola. El perro, en sí mismo, se provoca el daño con la automutilación debido a una picazón severa.
En general, la prevención y el tratamiento de la infestación por pulgas es la opción de tratamiento de elección. Más comúnmente se utilizan los neonicotinoides, como el imidacloprid o los bloqueadores del canal de cloruro regulado por ácido gamma-aminobutírico (GABA), como el fipronil. En casos donde los síntomas de la dermatitis alérgica de la piel no se solucionan, se utilizan los tratamientos mencionados bajo CAD, como los glucocorticoides tópicos y orales, la ciclosporina oral y el oclacitinib oral.
La presente invención proporciona los compuestos de la fórmula (I)
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en donde:
R1 es alquilo C1-C6, donde el grupo alquilo C1-C6 no está sustituido o está mono- o polisustituido de forma idéntica o distinta por halógeno, hidróxilo, un cicloalquilo C3-C6 no sustituido o mono- o poli-halogensustituido o un R6, R7SO2, R7SO o grupo R8O, o un grupo que se selecciona de:
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Donde * representa el sitio de unión del grupo con el resto de la molécula;
R2 y R3 siempre tienen la misma definición y ambos son ya sea hidrógeno o alquilo C1-C6;
R4 es halógeno, ciano, un alquilo C1-C6 no sustituido o sustituido de forma individual o múltiple, idéntica o diferente o un cicloalquilo C3-C6 no sustituido o sustituido de forma individual o múltiple, idéntica o diferente, y los sustituyentes se seleccionan del grupo de halógeno e hidróxilo;
R5 es hidrógeno, halógeno o un alquilo C1-C6 no sustituido o mono- o poli-halogen-sustituido;
R6 es un heterociclo saturado monocíclico mono- o di-metil-sustituido que tiene de 4 a 6 átomos del anillo, que contiene un heteroátomo o un héterogrupo del grupo de O, S, SO y SO2;
R7 es alquilo C1-C6, donde el grupo alquilo C1-C6 no está sustituido o está mono- o polisustituido de forma idéntica o distinta por halógeno, hidróxilo o cicloalquilo C3-C6, O R7 es alquilo C3-C6;
R8 es alquilo C1-C6, donde el grupo alquilo C1-C6 no está sustituido o está mono- o polisustituido de forma idéntica o distinta por halógeno;
Y los diastereómeros, enantiómeros, sales, solvatos o solvatos de sus sales,
Para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales.
En el caso de los usos mencionados de los inetrmediarios de síntesis y ejemplos de trabajo de la invención descrita de ahora en adelante, cualquier compuesto especificado en la forma de una sal de la base o ácido correspondientes es, por lo general, una sal de composición estequiométrica exacta desconocida, como se obtuvo mediante la preparación respectiva y/o el proceso de purificación. A menos que se especifique en más detalle, las adiciones a los nombres y fórmulas estructurales, como “hidrocloruro”, “trifluoroacetato”, “sal de sodio” o "x HCl", "x CF3COOH", "x Na+” no deben entenderse, entonces, en sentido estequiométrico en el caso de estas sales, sino que tienen un carácter méramente descriptivo en relación con los componentes que forman las sales allí presentes.
Esto aplica en consecuencia si los intermedios de síntesis o los ejemplos de trabajo o sus sales se obtuvieron en forma de solvatos, por ejemplo hidratos de composición estequiométrica desconocida (si son de un tipo definido) por la preparación y/o los procesos de purificación descritos.
Los compuestos presentes son los compuestos de la fórmula (I) y las sales, solvatos y solvatos de sus sales, los compuestos que están incluidos por la fórmula (I) y son de las fórmulas mencionadas debajo y las sales, solvatos y solvatos de sus sales y los compuestos que que están incluidos por la fórmula (I) y se mencionan debajo como formas de realización de las sales, solvatos y solvatos de sus sales si los compuestos que están incluidos por la fórmula (I) y se mencionan debajo ya no son sales, solvatos y solvatos de las sales.
Las sales preferidas en el contexto de la presente invención son sales fisiológicament aceptables de los compuestos presentes. Sin embargo, la presente descripción también incluye sales que en sí mismas son inadecuadas para aplicaciones farmacéuticas pero que pueden utilizarse, por ejemplo, para el aislamiento o purificación de los compuestos presentes.
Las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos presentes incluyen sales de adición ácida de ácidos minerales, ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos, por ejemplo: ácido fosfórico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido toluensulfónico, ácido bencensulfónico, ácido naftalendisulfónico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico:, ácido fumárico, ácido maleico y ácido benzoico.
Las sales fisiológicamente aceptables de los presentes compuestos también incluyen sales de bases comvencionales, a modo de ejemplo y con preferencia sales de metal álcali (por ejemplo: sales de sodio y de potasio), sales de metal alcalinotérreo (por ejemplo: sales de calcio y de magnesio) y sales de amonio que derivan de amonio o aminas orgánicas que tienen de 1 a 16 átomos de carbono, a modo de ejemplo y con preferencia etilamina, dietilamina, trietilamina, etildiisopropilamina, monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina, diciclohexilamina, dimetilaminoetanol, procaina, dibencilamina, N-metilmorfolina, arginina, lisina, etilendiamina y N-metilpiperidina. Los solvatos en el contexto de la invención se describen como aquellas formas de los compuestos presentes que forman un complejo en estado sólido o líquido por coordinación con moléculas solventes. Los hidratos son una forma específica de los solvatos en donde la coordinación es con agua.
Los presentes compuestos pueden, según su estructura, existir en formas estereoisoméricas diferentes, es decir: en forma de isómeros de configuración o de otra forma, si es adecuado, de isómeros de conformación (enantiómeros y/o diastereómeros, que incluyen aquellos en el caso de atropisómeros). Por lo tanto, la presente invención abarca el uso de enentiómeros y diastereómeros y sus respectivas mezclas. Los constituyentes esteroisoméricamente homogéneos pueden aislarse de estas mezclas de enentiómeros y/o diastereómeros de una manera conocida; se utilizan con preferencia procesos cromatográficos, en especial cromatografía HPLC en una fase aquiral o quiral.
Si los presentes compuestos pueden ocurrir en formas tautoméricas, la presente invención abarca el uso de todas las formas tautoméricas.
La presente invención también abarca el uso de todas las variantes isotópicas adecuadas de los compuestos presentes. Una variante isotópica de un compuesto presente se entiende en la presente como significado de compuesto en donde al menos un átomo dentro del presente compuesto se intercambió por otro átomo del mismo número atómico, pero con una masa atómica diferente que la masa atómica que por lo general o de forma predominante ocurre en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en un compuesto presente son aquellos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor, cloro, bromo y yodo, como 2H (deuterio), 3H (tritio), 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 32P, 33P, 33S, 34S, 35S, 36S, 18F, 36Cl, 82Br, 123I, 124I, 129I y 131I. Las variantes isotópicas particulares de un compuesto presente, como, en particular, aquellas en donde uno o más isótopos radioactivos se incorporaron, pueden ser beneficiosas, por ejemplo, para la examinación del mecanismo de acción o de la distribución del ingrediente activo en el cuerpo; debido a la facilidad comparativa de preparabilidad y detectabilidad, en particular compuestos etiquetados con isótopos 3H o 14C son adecuados para este propósito. Además, la incorporación de isótopos, por ejemplo de deuterio, pueden llevar a beneficios terapéuticos particulares como consecuencia de una estabilidad metabólica mayor del compuesto, por ejemplo una extensión de la vida media en el cuerpo o una reducción en la dosis activa requerida; estas modificaciones de los compuestos presentes pueden entonces, en algunos casos, también constituir una forma de realización preferida del uso de la presente invención. Las variantes isotópicas de los compuestos presentes pueden prepararse por los procesos conocidos para aquellos versados en la materia, por ejemplo por los métodos descritos más abajo y los procedimientos descritos en los ejemplos de trabajo, al utilizar modificaciones isotópicas correspondientes de los reactivos respectivos y/o de los compuestos de inicio.
La presente invención además proporciona el uso de todas las formas cristalinas y polimorfas posibles de los compuestos presentes, donde los polimorfos pueden estar presentes ya sea como polimorfos individuales o como una mezcla de una pluralidad de polimorfos en todos los grados de concentración.
En el contexto de la presente invención, a menos que se especifique lo contrario, los sustituyentes tienen los siguientes significados:
Alquilo en el contexto de la invención represente un grupo alquilo de cadena recta o ramificada que tiene la cantidad particular de átomos de carbono especificados. Los ejemplos incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, 1 -metilpropilo, 2-metilpropilo, ferf-butilo, n-pentilo, 1 -etilpropilo, 1 -metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2,2-dimetilpropilo, n-hexilo, 1 -metilpentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1 -etilbutilo y 2-etilbutilo. Se le da preferencia a metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo y 2,2-dimetilpropilo.
Cicloalquilo en el contexto de la invención es un grupo alquilo saturado monociclo que tiene la cantidad de átomos de carbono especificados en cada caso. Los ejemplos preferidos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.
Alcoxi en el contexto de la invención represente un grupo alcoxi de cadena recta o ramificada que tiene la cantidad particular de átomos de carbono especificados. Se prefieren los átomos de carbono 1 a 6. Los ejemplos incluyen metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, 1-metilpropoxi, n-butoxi, isobutoxi, ferf-butoxi, n-pentoxi, isopentoxi, 1-etilpropoxi, 1-metilbutoxi, 2-metilbutoxi, 3-metilbutoxi y n-hexoxi. Se le da preferencia particular a un grupo alcoxi lineal o ramificados que toene de 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos que pueden mencionarse como preferidos son metoxi, etoxi, n-propoxi, 1-metilpropoxi, n-butoxi e isobutoxi.
Halógeno en el contexto de la invención es flúor, cloro y bromo. Se le da preferencia al flúor.
Hidroxilo en el contexto de la invención en OH.
Un heterociclo saturado monocíclico es un heterociclo saturado monocíclico que tiene de 4 a 6 átomos del anillo y contiene un heteroátomo o un héterogrupo del grupo de O, S, SO y SO2. Se prefiere un heterociclo que tiene un heteroátomo o un heterogrupo del grupo de O, So y SO2. Los ejemplos incluyen: oxetano, tetrahidrofurano, tetrahidro-2H-piran-4-ilo, 1,1 -dioxidotetrahidro-2H-tiopiran-3-ilo, 1,1 -dioxidotetrahidro-2H-tiopiran-2-ilo, 1,1-dioxidotetrahidro-2H-tiopiran-4-ilo, 1,1-dioxidotetrahidrotiofen-3-ilo, 1,1-dioxidotetrahidrotiofen-2-ilo, 1,1-dioxidotietan-2-ilo o 1,1-dioxidotietan-3-ilo. Se le da preferencia particular en la presente a oxetano y tetrahidrofurano. Muy en particular, se prefiere oxetan-3-ilo.
Un símbolo * en un enlace denota el sitio de unión en la molécula.
Cuando se sustituyen grupos en los compuestos presentes, los grupos pueden ser mono- o polisustituidos, a menos que se especifique lo contrario. En el contexto de la presente invención, todos los grupos que ocurren más de una vez se definen de forma independiene entre sí. Se prefiere la sustitución por uno, dos o tres sustituyentes idénticos o diferentes.
Una forma de realización preferida de R1 es un grupo C2-C6 alquilo sustituido con 1, 2 o 3 átomos de flúor. Se le da preferencia particular a 2,2,2-trifluoroetilo, 3,3,3-trifluoropropilo y 4,4,4-trifluorobutilo. Se le da preferencia muy particular al grupo 4,4,4-trifluorobutilo.
Otra forma de realización preferida de R1 es un grupo alquilo C2-C6 sustituido con uno o dos grupos hidroxilo o un alcoxi C1-C3 o un alcoxi C1-C3 tri-fluorin-sustituido. Se le da preferencia particular a un grupo alquilo C2-C5 sustituido con hidroxilo o alcoxi C1-C3 o trifluorometoxi o 2,2,2-trifluoroetoxi. Se le da preferencia muy particular a 3-hidroxi-3metilbutilo, 3-metoxipropilo, 3-hidroxipropilo, 3-trifluorometoxipropilo, 2-metoxietilo o 2-hidroxietilo. Es de especial preferencia el grupo 3-hidroxi-3-metilbutilo.
Más preferentemente, R1 es un grupo alquilo C2-C6 sustituido con un grupo alquilo C I-C 6-SO2. Es de preferencia particular un grupo alquilo C2-C4 metil-SO2-sustituido. Se prefiere en especial para R12-(metilsulfonil)etilo o 3-(metilsulfonil)propilo. Del último grupo, se prefiere en particular 2-(metilsulfonil)etilo.
Se prefiere de manera adicional, R1 alquilo C1-C3 sustituido con oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidro-2H-piran-4-ilo, 1,1-dioxidotetrahidro-2H-tiopiran-3-ilo, 1,1-dioxidotetrahidro-2H-tiopiran-2-ilo, 1,1-dioxidotetrahidro-2H-tiopiran-4-ilo, 1,1 -dioxidotetrahidrotiofen-3-ilo, 1,1 -dioxidotetrahidrotiofen-2-ilo, 1,1 -dioxidotietan-2-ilo o 1,1 -dioxidotietan-3-ilo. Se le da preferencia particular a un grupo alquilo C1-C3 sustituido con un grupo oxetano. De especial preferencia para R1 es un grupo oxetan-3-ilmetilo.
Para R2 y R3, que siempre tienen la misma definición, se prefieren el hidrógeno o el metilo. Se prefiere, en particular, metilo.
En el caso de R4, se le da preferencia a un grupo alquilo C1-C3 no sustituido o mono- o poli-halogen-sustituido o un grupo alquilo C1-C3 sustituido con un grupo hidroxilo o un grupo alquilo C1-C3 sustituido con un grupo hidroxilo y tres átomos de flúor.
Para R4, se le da preferencia particular a los siguientes grupos: metilo, etilo, trifluoro-alquilo C1-C3, difluoro-alquilo C1-C3, hidroximetilo, 1 -hidroxietilo, 2-hidroxipropan-2-ilo y 2,2,2-trifluoro-1-hidroxietilo. Para R4, se le da preferencia particular a los grupos metilo, trifluorometilo y difluorometilo. Se le da preferencia particular en la presente a un grupo trifluorometilo.
Una forma de realización preferida de R5 es hidrógeno, flúor, cloro o alquilo C1-C3. Con mayor preferencia, R5 es hidrógeno, flúor o metilo. Con mayor preferencia, R5 es hidrógeno o flúor.
Se le da preferencia particular también a los compuestos en donde R4 es metilo o trifluorometilo y R5 es flúor. Se le da preferencia muy particular a los compuestos en los que R4 es metilo y R5 es flúor, donde R5 se encuentra en una posición orto con R4.
Para R6, las formas de realización incluyen oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidro-2H-piran-4-ilo, 1,1-dioxidotetrahidro-2H-tiopiran-3-ilo, 1,1-dioxidotetrahidro-2H-tiopiran-2-ilo, 1,1-dioxidotetrahidro-2H-tiopiran-4-ilo, 1,1-dioxidotetrahidrotiofen-3-ilo, 1,1 -dioxidotetrahidrotiofen-2-ilo, 1,1 -dioxidotietan-2-ilo o 1,1 -dioxidotietan-3-ilo. Se le da preferencia particular en la presente a oxetanilo. Muy en particular, se prefiere oxetan-3-ilo.
R7 está exclusivamente conectado con los grupos funcionales -SO 2- y -SO-, es decir: es un grupo R7-sustituido -SO2-o SO. En este sentido, R7 es con preferencia alquilo C1-C4, donde el grupo alquilo C1-C4 no está sustituido o monosustituido con hidroxilo o por ciclopropilo o sustituido con tres átomos de flúor. De adicional preferencia para R7 es un grupo ciclopropilo. De particular preferencia para R7son metilo, etilo o hidroxietilo. Se le da preferencia muy particular a metilo para R7.
Esto quiere decir que, en el caso de un grupo alquilo C1-C6 sustituido con R7SO2- o R7SO-, en el contexto de R1, se le da preferencia a un alquilo C1-C6 sustituido con un alquilo C1 -C6-SO2 o un alquilo C1-C6-SO. Para R1, se le da prefencia en la presente especialmente a metilsulfoniletilo y metilsulfonilpropilo. Se le da preferencia muy particular en la presente a metilsulfoniletilo.
Para R8, se le da preferencia a un grupo alquilo C1-C4 no sustituido o un grupo alquilo C1-C4 tri-fluorin-sustituido. Se le da preferencia particular a metilo, etilo, trifluorometilo o 2,2,2-trifluoroetilo. Se le da preferencia muy particular a metilo, trifluorometilo o 2,2,2-trifluoroetilo.
Como se describió anteriormente, la enzima intracelular kinasa 4 asociada al receptor de interleucina 1 (IRAK4) juega una parte integral en la vía de señalización de receptores activados por citoquinas y ligandos TLR que están implicados en procesos inflamatorios. Además de la inflamación, IRAK4 también está implicado en la señalización de procesos alérgicos. Estos procesos alérgicos tienen un rol importante en la patogénesis de enfermedades alérgicas de la piel, como la dermatitis atópica.
Por ejemplo, IL-33 una reciente adición a la familia IL-1 de citoquinas que también incluye IL-18 y IL-1, se une y activa los receptores IL-33 (IL-33R) que luego se asocian con MyD88, IRAK4 y TRF6 (Schmitz et al, Immunity, 2005). IRAK4 es un componente esencial de esta vía de señalización. IL-33R está fuertemente expresada en células T colaboradoras de tipo 2 (Th2), mastocitos y eosinófilos. IL-33 activa estas células y fomenta las respuestas inmunológicas Th2 (Schmitz et al, Immunity, 2005). Estos tipos de células están implicadas en la patogénesis de la dermatitis atópica. Los niveles de IL-33 en el suero se correlacionan con la gravedad de la dermatitis atópica en hombres y disminuyen durante el tratamiento con esteroides tópicos e inhibidor de calcineurina (Tamagawa-Mineoka et al, J American Academy Dermatology, 2014). Se mostró en modelos de Dermatitis Atópica Canina aguda que el gen IL-33 se reguló en forma ascendente de manera significativa en las lesiones de la piel (Schamber et al., G3 (Bethesda), 2014; Olivry et al, Journal of Investigative Dermatology, 2016).
Además, un segundo miembro de la familia de citoquinas IL-1, IL-18 se vió implicado en la dermatitis atópica. Los niveles de suero de IL-18 aumentaron con la intensidad de la dermatitis atópica en niños (Sohn et al, Allergy and Asthma Proceedings, 2004). Se mostró en modelos de Dermatitis Atópica Canina aguda que el gen IL-18 se reguló en forma ascendente de manera significativa en las lesiones de la piel (Schamber et al., g 3 (Bethesda), 2014; Olivry et al, Journal of Investigative Dermatology, 2016). Además, la inflamación y picazón similar a la dermatitis atópica se iniciaron por la sobre liberación de IL-18 y se aceleraron por IL-1 en ratones (Konishi et al, Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002). Una vez más, IRAK4 mostró ser un componente esencial de la cascada de señalización IL-18 (Suzuki et al, J Immunology, 2003). De manera similar, IRAK4 es fundamental para la señalización de ligandos IL-1 y TLR (Suzuki et al, Nature, 2002). Se conoce a los agonistas de TLR por inducir la picazón (Liu et al, Neuroscience bulletin, 2012), un síntoma importante de la dermatitis atópica y las terapias anti IL-1 se utilizan por fuera de lo indicado para tratar la dermatitis atópica. Además, los polimorfismos en IRAK4 se asocian con la IgE elevada en enfermedades alérgicas como el asma y la rinosinusitis crónica (Tewfik et al, Allergy, 2009). Los niveles de IgE también son elevados en la dermatitis atópica.
Por ende, ya que IRAK4 es una parte fundamental de las vías de señalización que están activadas por una cantidad de citoquinas, los ligandos de TLR e IRAK4 tienen polimorfismos asociados con el nivel de IgE elevado, la inhibición de IRAK4 es una estrategia terapéutica importante para el tratamiento de las enfermedades alérgicas de la piel como la dermatitis atópica. Además, en los animales de compañia (en especial perros y gatos) tanto la dermatitis atópica como la Dermatitis Alérgica por pulgas son indicaciones adecuadas ya que ambas enfermedades están formadas por la hipersensibilidad de Tipo 1 que involucra anticuerpos IgE, células Th2, mastocitos y eosinófilos. Además, las FAD pueden estar formadas por la hipersensibilidad de Tipo IV en donde están involucradas IL-1 y IL-18.
Los presentes compuestos actúan como inhibidores de la quinasa IRAK4 y, por lo tanto, tienen un espectro útil de actividad farmacológica imprevisible para el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales.
Se prefieren los compuestos de la fórmula (I) en donde
R1 es alquilo C1-C6, donde el grupo alquilo C1-C6 no está sustituido o está mono- o polisustituido de forma idéntica o distinta por flúor, hidróxilo o un grupo R6, R7SO2, R7SO o R8O.
R2 y R3 siempre tienen la misma definición y ambos son tanto hidrógeno como alquilo C1-C3;
R4 es halógeno, ciano o alquilo C1-C3, donde el grupo alquilo C1-C3 no está sustituido o está mono- o polisustituido de forma idéntica o distinta por halógeno o hidroxilo;
R5 es hidrógeno, flúor, cloro o alquilo C1-C3;
R6 es oxetanilo o tetrahidrofuranilo;
R7 es alquilo C1-C4, donde el grupo alquilo C1-C4 no está sustituido o está monosustituido con hidroxilo o por ciclopropilo o está sustituido con tres átomos de flúor;
R8 es C1-C4 alquilo no sustituido o C1-C4 alquilo tri-fluorin-sustituido;
Y los diastereómeros, enantiómeros, sales, solvatos o solvatos de sus sales,
Para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales.
Se le da preferencia adición a los compuestos de la fórmula (I) en donde
R1 es alquilo C2-C6, donde C2-C6-alquino no está sustituido, o alquilo C2-C6 está mono-, di- o tri-fluorinsustituido o alquilo C2-C6 está monosustituido con hidroxilo, R6, R7SO2, o R8O, o en donde R1 es un alquilo C1-C3 sustituido con oxetanilo;
R2 y R3 siempre tienen la misma definición y ambos son tanto hidrógeno como metilo;
R4 es un grupo alquilo C1-C3 no sustituido o mono- o poli-halogen-sustituido o un grupo alquilo C1-C3 sustituido con un grupo hidroxilo o un grupo alquilo C1-C3 sustituido con un grupo hidroxilo y tres átomos de flúor;
R5 es hidrógeno, flúor o alquilo C1-C3;
R7 es alquilo C1-C3;
R8 es alquilo C1-C4, donde el grupo alquilo C1-C4 no está sustituido o está mono-, di- o tri-fluorin-sustituido;
Y los diastereómeros, enantiómeros, sales, solvatos o solvatos de sus sales,
Para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales.
Se le da preferencia particular a los compuestos de la fórmula general (I) en donde
R1 es un grupo alquilo C2-C5 sustituido con hidroxilo o alcoxi C1-C3 o trifluorometoxi o 2,2,2-trifluoroetoxi o trifluorometilo o es un grupo alquilo C2-C4 sustituido con metil-SO2 o es un grupo alquilo C1-C2 sustituido con oxetan-3-ilo;
R2 y R3 siempre tienen la misma definición y ambos son tanto hidrógeno como metilo;
R4 es metilo, etilo, trifluoro-alquilo C1-C3, difluoro-alquilo C1-C3, hidroximetilo, 1-hidroxietilo, 2-hidroxipropan-2-ilo y 2,2,2-trifluoro-1 -hidroxietilo y
R5 es hidrógeno, flúor o metilo;
Y los diastereómeros, enantiómeros, sales, solvatos o solvatos de sus sales,
Para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales.
Muy en particular, se prefieren los compuestos en donde
R1 es 4,4,4-trifluorobutilo, 3-hidroxi-3-metilbutilo, 3-hidroxibutilo, 3-metoxipropilo, 3-hidroxipropilo, 3-hidroxi-2-metilpropilo, 3-hidroxi-2,2-dimetilpropilo, 3-trifluorometoxipropilo, 2-metoxietilo, 2-hidroxietilo, 2-(metilsulfonil)etilo o 3-(metilsulfonil)propilo;
R2 y R3 son tanto metilo o hidrógeno y
R4 es difluorometilo, trifluorometilo o metilo y
R5 es hidrógeno o flúor;
Y los diastereómeros, enantiómeros, sales, solvatos o solvatos de sus sales,
Para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales.
Muy en particular, también se prefieren los compuestos en donde
R1 es 3-hidroxi-3-metilbutilo, 3-hidroxibutilo, 3-hidroxi-2-metilpropilo, 3-hidroxi-2,2-dimetilpropilo, 3-(metilsulfonil)propilo o 2-(metilsulfonil)etilo;
R2 y R3 son ambos metilo;
R4 es difluorometilo o trifluorometilo; y
R5 es hidrógeno;
Y los diastereómeros, enantiómeros, sales, solvatos o solvatos de sus sales,
Para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales.
De manera adicional, también se le da preferencia particular a los compuestos en donde
R1 es 3-hidroxi-3-metilbutilo, 3-hidroxibutilo, 3-hidroxi-2-metilpropilo, 3-hidroxi-2,2-dimetilpropilo, 3-(metilsulfonil)propilo o 2-(metilsulfonil)etilo;
R2 y R3 son ambos metilo;
R4 es metilo y
R5 es flúor, donde R5 está en posición orto con R4;
Y los diastereómeros, enantiómeros, sales, solvatos o solvatos de sus sales,
Para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales.
La presente invención proporciona especialmente a los siguientes compuestos:
1) N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(2-metoxietil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
2) N-[6-(Hidroximetil)-2-(2-metoxietil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
3) N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(3-metoxipropil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
4) N-[6-(hidroximetil)-2-(3-metoxipropil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
5) N-[2-(2-Hidroxietil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
6) N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(3-hidroxipropil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
7) N-[2-(2-Hidroxietil)-6-(hidroximetil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
8) N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(oxetan-3-ilmetil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
9) N-[6-(hidroximetil)-2-(oxetan-3-ilmetil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
10) N-{6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-[3-(metilsulfonil)propil]-2H-indazol-5-il}-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida 11) N-[2-(3-Hidroxi-3-metilbutil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida 12) N-{6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-[2-(metilsulfonil)etil]-2H-indazol-5-il}-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida 13) 6-(Difluorometil)-N-[2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]piridin-2-carboxamida 14) 6-(Difluorometil)-N-{6-(2-hidroxipropan-2-il)-2-[2-(metilsulfonil)etil]-2H-indazol-5-il}piridin-2-carboxamida 15) 6-(Difluorometil)-N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-2-(3-hidroxipropil)-2H-indazol-5-il]piridin-2-carboxamida
16) N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(4,4,4-trifluorobutil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida 17) N-{6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-[3-(trifluorometoxi)propil]-2H-indazol-5-il}-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida 18) N-{6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-[3-(2,2,2-trifluoroetoxi)propil]-2H-indazol-5-il}-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
19) 5-Fluoro-N-[2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-metilpiridin-2-carboxamida 20) N-[2-(3-Hidroxi-3-metilbutil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-metilpiridin-2-carboxamida
21 ) 6-(2-Hidroxipropan-2-il)-N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-2-(4,4,4-trifluorobutil)-2H-indazol-5-il]piridin-2-carboxamida 22) N-{2-[2-(1-HidroxiciclopropM)etil]-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il}-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida,
Para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales.
La presente invención además proporciona los compuestos de la fórmula general (III)
Figure imgf000011_0001
en donde
R1 es 4,4,4-trifluorobutilo, 3-hidroxi-3-metilbutilo, 3-metoxipropilo, 3-hidroxipropilo, 3-hidroxibutilo, 3-hidroxi-2-metilpropilo, 3-hidroxi-2,2-dimetilpropilo, 3-trifluorometoxipropilo, 2-metoxietilo, 2-hidroxietilo, 2-(metilsulfonil)etilo, 3-(metilsulfonil)propilo o 2-(1 -hidroxiciclopropil)etilo;
R4 es difluorometilo, trifluorometilo o metilo; y
R5 es hidrógeno o flúor;
Y los diastereómeros, enantiómeros, sales, solvatos o solvatos de sus sales,
Para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales.
Se le da especial preferencia a los siguientes compuestos de la fórmula general (III):
metilo 5-{[(5-fluoro-6-metilpiridin-2-il)carbonil]amino}-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-2H-indazol-6-carboxilato y
metilo 2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato, Para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales.
Los compuestos de la fórmula general (III) son adecuados para la preparación de una porción de los compuestos de la fórmula general (I).
Además, los compuestos de la fórmula general (III) son inhibidores del receptor de interleucina 1 asociado a quinasa 4 (IRAK4).
Los compuestos de la fórmula general (III) pueden prepararse a partir de los compuestos de la fórmula general (II)
Figure imgf000011_0002
en donde
R1 es 4,4,4-trifluorobutilo, 3-hidroxi-3-metilbutilo, 3-metoxipropilo, 3-hidroxipropilo, 3-hidroxi-2-metilpropilo, 3-hidroxi-2,2-dimetilpropilo, 3-trifluorometoxipropilo, 2-metoxietilo, 2-hidroxietilo, 2-(metilsulfonil)etilo, 3-(metilsulfonil)propilo o 2-(1-hidroxiciclopropil)etilo;
R4 es difluorometilo, trifluorometilo o metilo; y
R5 es hidrógeno o flúor;
Por la reacción de (II) con haluros de alquilo sustituidos de manera adecuada o alquil 4-metilbencensulfonatos en presencia de carbonato de potasio.
Además, los compuestos de la fórmula general (I) pueden prepararse a partir de compuestos de la fórmula (III)
Figure imgf000012_0001
en donde
R1 es 4,4,4-trifluorobutilo, 3-hodroxi-3-metilbutilo, 3-hidroxibutilo, 3-metoxipropilo, 3-hidroxipropilo, 3-hidroxi-2-metilpropilo, 3-hidroxi-2,2-dimetilpropilo, 3-trifluorometoxipropilo, 2-metoxietilo, 2-hidroxietilo, 3-(metilsulfonil)propilo 2-(1-hidroxiciclopropil)etilo;
R2 y R3 son metilo;
R4 es difluorometilo, trifluorometilo o metilo; y
R5 es hidrógeno o flúor;
Por una reacción de Grignard con bromuro de metilmagnesio.
Los presentes compuestos actúan como inhibidores de la quinasa IRAK4 y tienen un espectro útil de actividad farmacológica imprevisible.
Se le da más preferencia a los compuestos de la Fórmula (I), o a los compuestos particularmente mencionados supra, para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales domésticos, en particular en gatos y perros, más en particular en perros.
El término “animales domésticos” en este contexto incluye, por ejemplo, mamíferos, como hamsters, conejillos de indias, ratas, ratones, chinchillas, hurones o en particular perros, gatos; aves de corral; reptiles, anfibios o peces de acuario.
Se le da más preferencia a los compuestos de la fórmula (I), o a los compuestos particularmente mencionados supra, para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de la dermatitis alérgica en animales domésticos, en particular la dermatitis alérgica en caninos y felinos, y más en particular en la dermatitis alérgica en caninos. Se le da preferencia particular a los compuestos de la fórmula (I), o a los compuestos particularmente mencionados supra, para el uso en el tratamiento y/o la proxilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales de granja, en particular en ovejas, cabras, caballos, ganado y cerdos, y más en particular en ganado y cerdos.
El término “animales de granja” en este contexto incluye, por ejemplo, mamíferos, como caballos, ovejas, cabras, búfalos, renos, gamos o en particular ganado o cerdos.
Se le da preferencia particular a los compuestos de la fórmula (I), o a los compuestos mencionados particularmente supra, para utilizar en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de dermatitis atópica, la dermatitis Alérgica por Pulgas, enfermedad inflamatoria intestinal, osteoartritis y dolor por inflamación, enfermedad en las vías respiratorias recurrente no infecciosa, hipersensibilidad a los insectos, enfermedad respiratoria, mastitis y endometritis en animales, en particular dermatitis atópica y Dermatitis Alérgica por Pulgas.
Se le da preferencia particular a los compuestos de la fórmula (I), o a los compuestos mencionados particularmente supra, para utilizar en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de dermatitis atópica canina, dermatitis Alérgica por Pulgas en perros y gatos, enfermedad inflamatoria intestinal en perros y gatos, osteoartritis y dolor por inflamación en perros, gatos, caballos o ganado, enfermedad en las vías respiratorias recurrente no infecciosa en caballos, hipersensibilidad a los insectos en caballos, asma felina, enfermedad respiratoria bobina, mastitis en ganado, endometritis en ganado y enfermedad respiratoria porcina.
Se le da preferencia muy particular a los compuestos de la Fórmula (I), o a los compuestos particularmente mencionados supra, para el uso en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de Dermatitis Atópica Canina Y Dermatitis Alérgica por Pulgas en perros o gatos, más en particular en perros.
Se le da preferencia muy particular a los compuestos de la Fórmula (I), o a los compuestos particularmente mencionados supra, para el uso en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de osteoartritis y dolor por inflamación en ganado, enfermedad respiratoria bovina, mastitis en ganado, endometritis en ganado y enfermedad respiratoria porcina.
En relación a los compuestos de la fórmula (III), se le da más preferencia a los compuestos de la Fórmula (III), para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales domésticos, en particular en gatos y perros, más en particular en perros.
Se le da más preferencia a los compuestos de la fórmula (III) para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de dermatitis alérgica en animales domésticos, en particular la dermatitis alérgica canina y felina, y más en particular la dermatitis alérgica canina.
Se le da más preferencia a los compuestos de la Fórmula (III), para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales de granja, en particular en ovejas, cabras, caballos, ganado y cerdos, y más en particular en ganado y cerdos.
Se le da preferencia particular a los compuestos de la fórmula (III) para utilizar en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de dermatitis atópica, la dermatitis Alérgica por Pulgas, enfermedad inflamatoria intestinal, osteoartritis y dolor por inflamación, enfermedad en las vías respiratorias recurrente no infecciosa, hipersensibilidad a los insectos, asma, enfermedad respiratoria, mastitis y endometritis en animales, en particular dermatitis atópica y Dermatitis Alérgica por Pulgas.
Se le da preferencia particular a los compuestos de la fórmula (III) para utilizar en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de dermatitis atópica canina, dermatitis Alérgica por Pulgas en perros y gatos, enfermedad inflamatoria intestinal en perros o gatos, osteoartritis y dolor por inflamación en perros, gatos, caballos o ganado, enfermedad en las vías respiratorias recurrente no infecciosa en caballos, hipersensibilidad a los insectos en caballos, asma felina, enfermedad respiratoria bovina, mastitis en ganado, endometritis en ganado y enfermedad respiratoria porcina.
Se le da preferencia muy particular a los compuestos de la Fórmula (III) para el uso en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de Dermatitis Atópica Canina Y Dermatitis Alérgica por Pulgas en perros o gatos, más en particular en perros.
Se le da preferencia muy particular a los compuestos de la Fórmula (III) para el uso en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de osteoartritis y dolor por inflamación en ganado, enfermedad respiratoria bovina, mastitis en ganado, endometritis en ganado y enfermedad respiratoria porcina.
A modo de ejemplo, los ejemplos de compuestos 11, 12, 13, 19 (como se muestra debajo) se evaluaron en un ensayo IRAK4 TR-FRET in vitro detallado debajo mediante el uso de enzima IRAK4 canina recombinante. Los valores IC50 de cada compuesto se calcularon para la inhibición de IRAK4 canina. Los compuestos de ejemplo (11, 12, 13, 19) se identificaron como útiles para el tratamiento de enfermedades alérgicas de la piel en animales, en particular en perros y gatos, como dermatitis atópica y Dermatitis Alérgica por Pulgas. Los compuestos de ejemplo 11, 12, 13, 19 donde cada inhibidor potente de IRAK4 canina con valores IC50 de 1,7; 9,2; 2,2; 7,6 nM, respectivamente. Los valores IC50 para cada uno de estos ejemplos de compuestos también fueron similares a los valores IC50 calculados para la inhibición de la IRAK4 humana.
Como otro ejemplo, el compuesto de ejemplo 12 también se evaluó en un ensayo in vitro para establecer los efectos de los compuestos en la producción de citoquina inducida por (LPS) lipopolisacárido por células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en caninos. El compuesto de ejemplo 12 inhibió la producción del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) de citoquina proinflamatoria por medio de PBMC canina inducida por LPS, en una manera relacionada con la concentración. PBMc incluye tipos de células como células dendríticas, linfocitos T y B, al igual que nonocitos cada uno de los cuales están implicado en la dermatitis atópica y el TNFa está elevado en pacientes con dermatitis atópica (Sumimoto et al, Archives of Disease in Childhood, 1992). Este ejemplo también se ilustra en la Figura 7.
Por lo tanto, los presentes compuestos demuestran la inhibición de la enzima IRAK4 canina recombinante y la producción de citoquina por PBMC canina que indica el beneficio terapéutico potencial de estos ejemplos de compuesto en Dermatitis Atópica canina y Dermatitis Alérgica por Pulgas.
Además, el compuesto de ejemplo 12 también se evalúo in vivo en otro estudio para establecer los efectos de los compuestos en el tratamiento de signos clínicos asociados con dermatitis alérgica canina, en particular en dermatitis atópica canina (CAD), en un modelo de ácaros del polvo. El compuesto de ejemplo 12 reduce de manera significativa los signos clínicos de CAD como el edema y eritema en la piel. Este ejemplo también se ilustra en las Figuras 11 y 12.
Por ende, los presentes compuestos demuestran la reducción de signos clínicos característicos de dermatitis alérgica canina, por lo tanto, indican un beneficio terapéutico de estos ejemplos de compuesto en dermatitos alérgica canina, en particular en Dermatitis Atópica Canina (CAD). También, se evaluó el compuesto de ejemplo 12 en un modelo in vivo de dermatitis alérgica por pulgas (FAD) cambian para establecer los efectos antipruriginosos de los compuestos. El tratamiento con el compuesto de Ejemplo 12 reduce de manera sustancial el prurito asociado con enfermedades alérgicas como la Dermatitis Alérgica por Pulgas. Este ejemplo también se ilustra en la Figura 13.
Por ende, los presentes compuestos demuestran la reducción de signos clínicos patognomónicos asociados con la dermatitis alérgica como inflamación en la piel y el prurito entonces que indica un beneficio terapéutico de estos ejemplos de compuestos en la dermatitis alérgica canina, en particular en dermatitis alérgica por pulgas (FAD) y en la dermatitis atópica canina (CAD).
El término “dermatitis alérgica canina” en este contexto incluye en particular la dermatitis atópica canina (CAD) y la dermatitis alérgica por pulgas (FAD).
Como otro ejemplo, el compuesto de ejemplo 12 también se evaluó en un ensayo ex vivo para establecer los efectos de los compuestos en la producción de citoquina inducida por (LPS) lipopolisacárido por células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en bovinos. El compuesto de ejemplo 12 inhibió la producción del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) de citoquina proinflamatoria por medio de PBMC bovina inducida por LPS, en una manera relacionada con la concentración. PBMc incluye tipos de célula como células dendríticas, linfocitos T y B, al igual que monocitos cada uno de los cuales está implicado en enfermedades inflamatorias e infecciosas como respuesta inmunológica proinflamatoria superada como las enfermedades respiratorias (Sterner-Kock, Haider, et al., Tropical Anima1Health and Production, 2016), las enfermedades entéricas (Pan, Rostagnio, et al., Veterinary Immunology and Immunopathology, 2015) y la mastitis (Zheng, Xu, et al., Free Radical Biology and Medicine, 2016) en donde el TNFa está elevado en estos pacientes. Este ejemplo también se ilustra en las Figuras 8 y 9.
Por ende, los compuestos presentes demuestran inhibición de la produción de citoquina por PBMC bovina que indica el beneficio terapéutico potencial de estos ejemplos de compuesto en enfermedades inflamatorias y/o infecciosas como enfermedades respiratorias, enfermedades entéricas y mastitis.
Como otro ejemplo, el compuesto de ejemplo 12 también se evaluó en un ensayo ex vivo para establecer los efectos de los compuestos en la producción de citoquina inducida por (LPS) lipopolisacárido por células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en porcinos. El compuesto de ejemplo 12 inhibió la producción del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) de citoquina proinflamatoria por medio de PBMc porciona inducida por LPS. PBMC incluye tipos de células como células dendríticas, linfocitos T y B, al igual que monocitos cada uno de los cuales está implicado en enfermedades inflamatorias e infecciosas con una respuesta inmunológica proinflamatoria superada como las enfermedades respiratorias y las enfermedades entéricas en donde el TNFa está elevado en estos pacientes. Este ejemplo también se ilustra en la Figura 10.
Por ende, los compuestos presentes demuestran inhibición de la produción de citoquina por PBMC porcina que indica el beneficio terapéutico potencial de estos ejemplos de compuesto en enfermedades inflamatorias y/o infecciosas como enfermedades respiratorias y enfermedades entéricas.
La profilaxis y/o el tratamiento del prurito y el dolor, en especial del dolor agudo, crónico, inflamatorio o neuropático en animales, también se proporciona por los presentes compuestos.
Además, los presentes compuestos son adecuados para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos del dolor, en especial del dolor agudo, crónico, inflamatorio y neuropático en animales. Esto incluye con preferencia la hiperalgesia, alodinia, dolor por artritis (como osteoartrítis, artritis reumatoide y espondiloartritis), dolor premenstrual, dolor asociado a la endometriosos, dolor postoperatorio, dolor por cistitis intersticial, CRPS (síndrome del dolor regional complejo), neuralgia trigeminal, dolor por postatitis, dolor causado por lesiones en la médula espinal, dolor inducido por inflamación, dolor en la espalda baja, dolor por cáncer, dolor asociado a la quimioterapia, neuropatía inducida por el tratamiento contra el VIH, dolor inducido por quemadura y dolor crónico.
En el contexto de la presente invención, el término “tratamiento” o “tratar” incluye la inhibición, el retraso, el control, el alivio, la atenuación, la restricción, la reducción, la supresión, la repulsión o la cura de una enfermedad, una afección, un trstorno, una lesión o un problema de salud, o el desarrollo, el curso o la progresión de estos estados y/o los síntomas de estos estados. El término “terapia” se entiende en la presente como sinónimo del término “tratamiento”.
Los términos “prevención”, “profilaxis” y “preclusión” se utilizan como sinónimos en el contexto de la presente invención y hacen referencia a la prevención o reducción del riesgo de contraer, experimentar, sufrir o tener una enfermedad, afección, trastorno, lesión o un problema de salud o el desarrollo o avance de estos estados y/o los síntomas de estos estados.
El tratamiento o la prevención de una enfermedad, condición, desorden, una lesión o un problema de salud puede ser parcial o completo.
Los presentes compuestos se pueden utilizar solos o, si se requiere, en combinación con otros ingredientes activos. La presente invención además proporciona medicamentos que contienen al menos uno de los presentes compuestos y uno o más de otros ingredientes activos, para el tratamiento y/o la prevención de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales. Los ejemplos preferidos de ingredientes activos adecuados para combinaciones incluyen: Se debe hacer mención general a los ingredientes activos como antibacterianos (por ejemplo: penicilinas, vancomicina, ciprofloxacina), antivirales (por ejemplo: aciclovir, oseltamivir) y sustancias antimicóticas (por ejemplo: naftifin, nistantina) y gamaglobulinas, compuestos inmunomodulatorios e inmunosupresores como cilosporina, Methotrexat®, antagonistas del TNF (por ejemplo: Humira®, Etanercept, Infliximab), inhibidores de IL-1 (por ejemplo: Anakinra, Canakinumab, Rilonacept), inhibidores de fosfodiesterasa (e.g. Apremilast), inhibidores de Jak/STAT (por ejemplo: Tofacitinib, Baricitinib, GLPG0634), leflunomida, ciclofosfamida, rituximab, belimumab, tacrolimus, rapamicina, micofenolato de mofetilo, interferonas, corticosteroides (por ejemplo: prednisona, prednisolona, metilprednisolona, hidrocortisona, betametasona), ciclofosfamida, azatioprima y sulfasalazina; paracetamol, sustancias antiinflamatorias no esteroides (NSAIDS) (aspirina, ibuprofeno, naproxeno, etodolac, celecoxib, colchicina).
Además de los mencionados anteriormente, los inhibidores de IRAK4 de la invención también pueden combinarse con los siguientes ingrdientes activos:
Sustancias para el tratamiento de trastornos pulmonares, por ejemplo: beta-2-simpaticomiméticos (e.g. salbutamol), anticolinérgicos (e.g. Glicopirronio), metilxantinas (e.g. Teofilina), antagonistas del receptor de leucotrieno (e.g. montelukast), inhibidores de PDE-4 (fosfodiesterasa de tipo 4) (e.g. roflumilast), metotrexat, anticuerpos IgE, azatioprina y ciclofosfamida, preparaciones que contienen cortisol; sustancias para el tratamiento de la osteoartritis como las sustancias antiinflamatorias no esteroides (NSAID). Además de las dos terapias mencionadas, el metotrezato y la biología para la terapia con células B y células T (e.g. rituximab, abatacept) deben mencionarse para los trastornos reumatoides, por ejemplo: artritis reumatoide, espondiloartritis y artritis idiopática juvenil. Las sustancias neurotróficas como los inhibidores de acetilcolinesterasa (e.g. Donepezil), inhibidores de MAO (monoaminooxidasa) (e.g. Selegilina), interferonas y anticonvulsivantes (e.g. Gabapentin); ingredientes activos para el tratamiento de los trastornos cardiovasculares como betabloqueantes (e.g. Metoprolol), inhibidores de ACE (e.g. Benazepril), bloqueadores receptores de angiotensina (e.g. losartan, valsartan), diuréticos (e.g. Hidroclorotiazida), bloqueadores del canal de calcio (e.g. nifedipina), estatinas (e.g. simvastatina, fluvastatina); medicamentos antidiabéticos, por ejemplo metformina, glinidas (e.g. Nateglinida), inhibidores de DPP-4 (dipeptidil peptidasa-4) (e.g. linagliptina, saxagliptina, sitagliptina, vildagliptina), SGLT2 (cotransportador de sodio/glucosa 2) inhibidores/ gliflozina (e.g. dapagliflozina, empagliflozina), miméticos de incretina (péptido insulinotrópico dependiente de la hormone glucosa (GIP) y análogos/agonistas del péptido 1 similar al glucagón 1 (GLP-1)) (e.g. exenatida, liraglutida, lixisenatida), inhibidores de a-glucosidasa (e.g. acarbose, miglitol, voglibiose) y sulfonilureas (e.g. glibenclamida, tolbutamida), sensibilizadores de insulina (e.g. pioglitazona) y terapia con isnulina (e.g. Insulina NPH, insulina lispro) Ingredientes activos como mesalazina, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurina o metotrexato, bacteria probiótica (Mutaflor, VSL#3®, Lactobacillus GG, Lactobacillus plantarum, L. acidophilus, L. casei, Bifidobacterium infantis 35624, Enterococcus fecium SF68, Bifidobacterium longum, Escherichia coli Nissle 1917), antibióticos, por ejemplo: ciprofloxacina y metronidazol, medicamentos antidiarreicos, por ejemplo: loperamida, o laxantes (bisacodil) para el tratamiento contra las enfermedades inflamatorias intestinales crónicas. Inmunosupresores como los glucocorticoides y las sustancias antiinflamatorias no esteroides (NSAID), cortisona, cloroquina, ciclosporina, azatioprina, belimumab, rituximab, ciclofosfamida para el tratamiento contra el lupus eritematoso. Análogos de la vitamin D3, por ejemplo calcipotriol, tacalcitol o calcitriol, ácido salicílico, urea, ciclosporina, metotrexato, efalizumab para los trastornos dermatológicos.
Se deben mencionar a los medicamentos que comprenden al menos uno de los compuestos presentes y uno o más de otros ingredientes activos para el uso inventivo, en especial los inhibidores de EP4 (inhibidores del receptor 4 de la prostaglandina E2), inhibidores de P2x3 (P2X purinoceptor 3), inhibidores de PTGES (inhibidores de la sintasa prostaglandina E) o inhibidores de AKR1C3 (inhibidores del miembro C3 de la familia 1 de aldo-ceto reductasa), para el tratamiento y/o la prevención de los trastornos antes mencionados.
Los presentes compuestos pueden actuar en forma sistemática y/o local. Para este propósito, pueden administrarse de una manera adecuada, por ejemplo: por ruta oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, bucal, rectal, cutánea, transdérmica o conjuntival, a través del oído o como un implante o stent.
Los presentes compuestos pueden administrarse en formas de administración adecuadas para estas rutas de administración.
Las formas de administración adecuadas para la administración oral son aquellas que trabajan según el arte previo y liberan los compuestos presentes en forma rápida y/o de manera modificada y que contienen los compuestos presentes en forma cristalina y/o amorfa y/o disuelta, por ejemplo: tabletas (tabletas sin recubrir o recubiertas, por ejemplo: recubrimientos resistentes a los jugos gástricos o de disolución retardada o insolubles, que controlan la liberación del presente compuesto), tabletas o películas/oblatos que se desintegran rápidamente en la cavidad oral, películas/liofilizatos, cápsulas (por ejemplo: cápsulas duras o blandas de gelatina), tabletas recubiertas con azúcar, masticables (por ejemplo: masticables suaves), gránulos, granulados, polvos, emulsiones, suspensiones, aerosoles o soluciones.
La administración parenteral puede logarse al evitar la etapa de resorción (por ejmplo: por ruta intravenosa, intraarterial, intracrdiaca, intraespinal o intralumbar) o con la inclusión de una resorción (por ejemplo: mediante una ruta intramuscular, subcutánea, intracutánea, percutánea o intraperitoneal). Las formas de administración adecuadas para la administración parenteral incluyen las preparaciones para la inyección e infusión en forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, liofilizantes o polvos estériles.
Para las otras rutas de administración, los ejemplos adecuados con las formas de medicamentos inhalables (que incluye inhaladores en polvo, nebulizadores), gotas nasales, soluciones o sprays, tabletas, películas/oblatos o cápsulas para la administración lingual, sublingual o bucal, supositorios, preparaciones para los oídos o los ojos, cápsulas vaginales, suspensiones acuosas (lociones, mezclas para agitar), suspensiones lipofílicas, pomadas, cremas, formulaciones para verter, sistemas terapéuticos transdérmicos (e.g. Parches), leches, pastas, espumas, polvos para dispersar, implantes o stents.
Se le da preferencia a la administración oral o parenteral, en especial a la administración oral.
Los presentes compuestos pueden convertirse en las formas de administración mencionadas. Esto puede lograrse de una manera conocida per se al mezclar con excipientes adecuados inertes, notóxicos, farmacéuticos. Estos excipientes incluyen portadores (por ejemplo celulosa microcristalina, lactosa, manitol), solventes (e.g. Glicoles de polietileno líquido), emulsionantes y dispersantes o agentes humectantes (por ejemplo: dodecilsulfato de sodio, oleato de polioxisorbitol), aglutinates (por ejemplo: polivinilpirrolidona), polímeros sintéticos y naturales (por ejemplo: albumina), estabilizantes (por ejemplo: antioxidantes, por ejemplo: ácido ascórbico), colorantes (por ejemplo: pigmentos inorgánicos, por ejemplo: óxidos de hierro) y correctantes del sabor y/o del olor.
La presente invención además proporciona medicamentos que comprenden al menos un compuesto presente, en forma típica junto con uno o más excipientes adecuados inertes, notóxicos, farmacéuticos, para el uso en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de alergias y/o enfermedades inflamatorias en animales.
En general, se halló que fue ventajoso en el caso de administración parenteral para administrar cantidades de alrededor de 0,001 a 1 mg/kg, con preferencia alrededor de 0,01 a 0,5 mg/kg, de peso corporal para lograr resultados eficaces. En el caso de la administración oral, la dosis es de alrededor de 0,01 a 100 mg/kg, con preferencia alrededor de 0,01 a 20 mg/kg, con mayor preferencia 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal.
De todas formas, podría ser necesario en algunos casos desviarse de las cantidades establecidas, específicamente como una función del peso corporal, ruta de administración, respuesta individual al ingrediente activo, naturaleza de la preparaión y tiempo o intervalo sobre el que tiene lugar la administración. Por lo tanto, en algunos casos puede ser suficiente administrar menos que la cantidad mínima mecionada anteriormente, mientras que en otros casos, el límite superior mecionado debe excederse. En el caso de la administración de grandes cantidades, podría ser aconsejable dividirlas en muchas dosis individuales durante el día.
Los siguientes ejemplos de trabajo ilustran la invención. La invención no está restringida a los ejemplos.
A menos que se establezca lo contrario, los porcentajes en las pruebas y los ejemplos que siguen son porcentajes en peso; las partes son partes en peso. Las relaciones de los solventes, las relaciones de dilución y los datos de concentración para el líquido/ las soluciones líquidas tienen base en cada caso en el volumen.
Preparación de los compuestos
La preparación de los presentes compuestos se ilustra por los esquemas de síntesis de siguen:
Los materiales de inicio utilizados para la síntesis de los presentes compuestos son los ácidos carboxílicos (intermedio V3), que son asequibles en comercios o pueden prepararse por medio de rutas conocidas en la bibliografía o de manera análoga a las rutas conocidas de la bibliografía (véase, por ejemplo: European Journal of Organic Chemistry 2003, 8, 1559 - 1568, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1990, 38, 9, 2446 - 2458, Synthetic Communications 2012, 42, 658 -666, Tetrahedron, 2004, 60, 51, 11869 -11874) (véase, por ejemplo, Esquema de Síntesis 1). Algunos ácidos carboxílicos V3 pueden prepararse a partir de los ésteres carboxílicos (Intermedio V2) por hidrólisis (cf., por ejemplo, la reacción de etil 6-(hidroximetil)piridin-2-carboxilato con una solución de hidróxido de sodio acuoso en metanol, WO2004113281) o - en el caso de un éster de ferf-butilo - por la reacción con un ácido, por ejemplo cloruro de hidrógeno o ácido trifluoroacético (cf., por ejemplo, Dalton Transactions, 2014, 43, 19, 7176 - 7190). Los ácidos carboxílicos V3 también pueden utilizarse en forma de sus sales de metal álcali. Los Intermedios V2 puede, de manera opcional, también prepararse a partir de los Intermedios V1 que tienen un cloro, bromo o yodo como sustituyente X1 por reacción en una atmósfera de monóxido de carbono, de manera opcional a presión elevada, en presencia de un ligando de fosfina, por ejemplo: 1,3-bis(difenilfosfin)propano, un compuesto de paladio, por ejemplo: acetato de paladio(II), y una base, por ejemplo: trietilamina, con la adición de etanol o metanol en un solvente, por ejemplo: dimetil sulfóxido (para métodos de preparación véase, por ejemplo: los documentos WO2012112743, WO 2005082866, Chemical Communications (Cambridge, England), 2003, 15, 1948 - 1949, WO200661715). Los intermedion V1 son asequibles en comercios o pueden prepararse por rutas conocidas en la bibliografía. Los métodos de preparación ilustrativa se detallan en el documento WO 2012061926, European Journal of Organic Chemistry, 2002, 2, 327 - 330, Synthesis, 2004, 10, 1619 -1624, Journal of the American Chemical Society, 2013, 135, 32, 12122 -12134, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2014, 24, 16, 4039 -4043, US2007185058, WO2009117421.
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Esquema de Síntesis 1
X1 es cloro, bromo o yodo.
Rd es metilo, etilo, bencilo o ferc-butilo.
R4, R5 son como se los definió en la fórmula general (I).
El Metil 5-amino-1H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 2) puede obtenerse al partir de metilo 1H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 0) según el Esquema de Síntesis 2 por nitración y reducción del grupo nitro del Intermedio 1 con hidrógeno en presencia de paladio en carbón de forma análoga con el documento WO 2008/001883. Para la preparación de los Intermedio 3 que se obtienen a partir del Intermedio 2, es posible utilizar diversos reactivos de acoplamiento conocidos de la bibliografía (Amino ácidos, péptidos, proteinas en química orgánica, Vol.3 - Bloques de Construcción, catálisis y Química de Acoplamiento, Andrew B. Hughes, Wiley, Capítulo 12 - Reactivos de Péptidos-Acoplamientos, 407-442; Chem. Soc. Rev., 2009, 38, 606). Por ejemplo, es posible utilizar hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida en combinación con hidrato de 1-hidroxi-1H-benzotriazol (HOBt, WO2012107475; Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008 , 18, 2093), (1H-benzotriazol-1-iloxi)(dimetilamino)-N,N-dimetilmetaniminio tetrafluoroborato (TBTU, CAS 125700-67-6), (dimetilamino)-N,N-dimetil(3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-3-iloxi)metanaminio hexafluorofosfato (HATU, CAS 148893-10-1), propanfosfónico anhídrido (como solución en acetato de etilo o DMF, CAS68957-94-8) o di-1H-imidazol-1-ilmetanona (CDI) con reactivos de acoplamiento, con adición de una base como trietilamina o N-etil-N-isopropilpropan-2-amina en cada caso a la mezcla de reacción. Se le da preferencia al uso de TBTU y N-etil-N-isopropilpropan-2-amina en THF.
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Esquema de Síntesis 2
Los sustituyentes R4, R5 son como se los definió en la fórmula general (I).
Al partir de los Intermedios 3, es posible preparar derivados de indazol 2-sustituidos (Intermedio 4) (véase el esquema de síntesis 3). Las reacciones útiles para este propósito incluyen aquellas con cloruros de alquilo opcionalmente sustituidos, bromuros de alquilo, yoduros de alquilo o alquil 4-metilbencensulfonatos. Los haluros de alquilo o alquil 4-metilbencensulfonatos utilizados son asequibles en comercios o pueden prepararse de forma análoga a las rutas conocidas de la bibliografía (para la preparación de alquil 4-metilbencensulfonatos, un ejemplo es la reacción de un alcohol adecuado con cloruro de 4-metilbencensulfonilo en presencia de trietilamina o piridina; véase, por ejemplo: Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2006, 14, 124277 -4294). De manera opcional, en el caso de utilizar cloruros de alquilo o bromuros de alquilo, también es posible agregar un yoduro de metal álcali como yoduro de potasio o yoduro de sodio. Las bases utilizadas pueden ser, por ejemplo, carbonato de potasio, carbonato de cesio o hidruro de sodio. En el caso de haluros de alquilo reactivos, también es posible en algunos casos utilizar N-ciclohexil-N-metilciclohexanamina. Los solventes útiles incluyen, por ejemplo: 1-metilpirrolidin-2-ona, DMF, DMSO o THF. De manera opcional, los haluros de alquilo o alquil 4-metilbencensulfonatos utilizados pueden tener grupos funcionales que, de manera opciona, fueron protegidos por un grupo protector de antemano (véase también: P. G. M. Wuts, T. W. Greene, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, cuarta edición, ISBN: 9780471697541). Si se utilizan, por ejemplo, los haluros de alquilo o alquil 4-metilbencensulfonatos quw tienen uno o más grupos hidroxilo, estos grupos hidroxilo pueden, de manera opcional, protegerse por un grupo íerí-butil(dimetil)sililo o un grupo protector similar que contiene silicona conocido para las personas versadas en la materia. De forma alternativa, los grupos hidroxilo también pueden protegerse por el grupo tetrahidro-2H-piran (THP) o por el grupo acetilo o benzoilo. Los grupos protectores utilizados pueden, entonces, pueden separarse después de la síntesis del Intermedio 4, o de otra forma luego de la síntesis de (I). Si, por ejemplo, se utiliza un grupo tert-butil(dimetilsililo) como grupo protector, puede separarse mediante el uso de floruro de tetrabutilamonio en un solvente como, por ejemplo, THF. Un grupo protector THP puede separarse, por ejemplo, mediante el uso de ácido 4-metilbencensulfónico (de manera opcional en forma de monohidrato). Los grupos acetilo o benzoilo pueden separarse por tratamiento con solución de hidróxido de sodio acuosa.
De manera opcional, los haluros de alquilo o los alquil 4-metilbencensulfonatos utilizados pueden contener grupos funcionales que pueden transformarse por reacciones de oxidación o reducción conocidas por aquellos versados en la materia (véase, por ejemplo: Science of Synthesis, Georg Thieme Verlag). Si, por ejemplo, el grupo funcional es un grupo sulfuro, este puede oxidarse por métodos conocidos en la bibliografía a un sulfóxido o un grupo sulfona. En el caso de un grupo sulfóxido, puede oxidarse de igual manera a un grupo sulfona. Para estas etapas de oxidación, es posible utilizar, por ejemplo: ácido 3-cloroperbenzoico (CAS 937-14-4) (en este sentido, véase también, por ejemplo, US201094000 para la oxidación de un derivado de 2-(metilsulfanil)etil-1H-pirazol a un derivado de 2-(metilsulfinil)etil-1H-pirazol y la oxidación de otro derivado de 2-(metilsulfanil)etil-1H-pirazol a un derivado de (metilsulfonil)etil-1H-pirazol). Si los haluros de alquilo o tosilatos utilizados contienen un grupo ceto, este puede reducirse por métodos de reducción conocidos por las personas versadas en la materia a un grupo alcohol (véase, por ejemplo: Chemische Berichte, 1980, 113, 1907 - 1920 por el uso de borohidruro de sodio). Estas etapas de oxidación o reducción pueden efectuarse luego de la síntesis del intermedio 4 o, de otra manera, luego de la sintesis de los compuestos presentes de la Fórmula general (I). De forma alternativa, el Intermedio 4 puede prepararse a través de una reacción Mitsunobu (véase, por ejemplo: K. C. K. Swamy et. al. Chem. Rev. 2009, 109, 2551 - 2651) de Intermedio 3 con alcoholes de alquilo opcionalmente sustituidos. Es posible utilizar diversas fosfinas como trifenilfosfina, tributilfosfina o 1,2-difenilfosfinoetano en combinación con azocarboxilato de diisopropilo (CAS 2446-83-5) u otros derivados de diazeno mencionados en la bibliografía (K. C. K. Swamy et. al. Chem. Rev. 2009, 109, 2551 - 2651). Se le da preferencia al uso de trifenilfosfina y azodicarboxilato de diisopropilo. Si el alcohol de alquilo soporta un grupo funcional, es posible - como en el caso de las reacciones antesmencionadas con los haluros de alquilo - para estrategias protectoras de grupo conocidas (Pueden hallarse otros indicadores en P. G. M. Wuts, T. W. Greene, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, cuarta edición, ISBN: 9780471697541) y - en el casi de las reacciones antesmencionaldas con haluros de alquilo - para etapas de oxidación o reducción pueden efectuarse de manera correspondiente a la síntesis del intermedio 4 o, de otra manera, luego de la sintesis de los compuestos presentes de la fórmula general (I). Al partir del Intermedio 4, los compuestos presentes de la fórmula general (I) donde R2 y R3 se definen como alquilo C1-C6 (donde R2 y R3 tienen la misma definición) pueden obtenerse a partir de una reacción de Grignard (cf., por ejemplo; la reacción de un derivado de 1H-indazol-6-carboxilato con bromuro de metilmagnesio en el documento EP 2489663). Es posible utilizar haluro de alquilmagnesio para la reacción de grignard. Se le da preferencia particular al cloruro de metilmagnesio o al bromuro de metilmagnesio en THF o dietiléter o, de otra forma, en mezclas de THF y dietiléter. De manera alternativa, al partir del Intermedio 4, los compuestos presentes de la fórmula general (I) donde R2 y R3 se definen como alquilo C1-C6 (donde R2 y R3 tienen la misma definición) pueden obtenerse a partir de una reacción con un reactivo de alquillitio (cf., por ejemplo; la reacción de un derivado de metil 2-amino-4-cloro-1-metil-1H-benzimidazol-7-carboxilato con isopropillitio o tert-butillitio en el documento WO2006116412). Al partir del Intermedio 4, es posible preparar los compuestos presentes de la Fórmula general (I) donde R2 y R3 se definenh como H por reducción con hidruro de aluminio litio en THF, borohidruro de litio en THF o borohidruro de sodio en THF, de manera opcional con adición de metanol, o mezclas de borohidruro de litio y borohidruro de sodio.
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Esquema de Síntesis 3
Los sustituyentes R1, R2, R3, R4, R5 son como se los definió en la fórmula general (I).
Al partir del Intermedio 3, El Intermedio 5 donde R2 y R3 se definen como alquilo C1-C6 (donde R2 y R3 tienen la misma definición) pueden obtenerse a partir de una reacción de Grignard (cf., por ejemplo, el Esquema de Síntesis 4). Para este propósito, es posible utilizar haluros de alquilmagnesio adecuados, por ejemplo cloruro de metilmagnesio o al bromuro de metilmagnesio en THF o dietiléter o, de otra forma, en mezclas de THF y dietiléter.
Al partir del Intermedio 5, es posible entonces preparar una porción (I-a) de los compuestos presentes (I) donde R2 y R3 se definen como alquilo C1-C6 (donde R2y R3tienen la misma definición). Para este propósito, de manera análoga al Esquema de Síntesis 3 (preparación del intermedio 39, las reacciones útiles son aquellas del Intermedio 5 con cloruros de alquilo opcionalmente sustituidos, bromuros de alquilo, yoduros de alquilo o alquil 4-metilbencensulfonatos. Es posible utilizar estrategias protectoras de grupo de manera análoga a aquellas descritas en el Esquema de Síntesis 3.
De manera alternativa, para la preparación de una porción (I-a) de los compuestos presentes (I) donde R2 y R3 son como se los define en alquilo C1-C6 (donde R2y R3 tienen la misma definición), es posible utilizar la reacción Mitsunoby del Intermedio 5 con alcoholes de alquilo opcionalmente sustituidos (de manera análoga con el Esquema de Síntesis 3).
Si R1 en los compuestos de la fórmula (I-a) incluye un grupo funcional adecuado es ,de manera opcional, posible luego, en analogía al Esquema de Síntesis 3, utilizar reacciones de oxidación o reducción para la preparación de otros compuestos presentes.
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Esquema de Síntesis 4
Los sustituyentes R1, R4, R5 son como se los definió en la fórmula general (I). R2y R3 siempre tienen la misma definición y ambos son alquilo C1-C6.
Al partir del Intermedio 1, es posible preparar el Intermedio 4 de una forma alternativa (véase el Esquema de Síntesis 5). Primero que nada, el Intermedio 1 se convierte en el Intermedio 6 por métodos como en el esquema de Síntesis 3 (preparación del Intermedio 4 a partir del Intermedio 3).
El Intermedio 6 puede, entonces, convertirse en el Intermedio 7 por reacción de un grupo nitro. Por ejemplo, el grupo nitro puede reducrise con paladio o carbono en una atmósfera de hidrógeno (cf., por ejemplo, el documento WO2013174744 para la reducción de 6-isopropoxi-5-nitro-1H-indazol a 6-isopropoxi-1H-indazol-5-amina) o por el uso de hierro y cloruro de amonio en agua y etanol (véase, por ejemplo, también Journal of the Chemical Society, 1955, 2412-2419), o por el uso de cloruro de estaño(II) (CAS 7772-99-8). Se prefiere el uso de hierro y cloruro de amonio en agua y etanol. La preparación del Intermedio 4 a partir del Intermedio 7 puede llevarse a cabo de manera análoga al esquema de Síntesis 2 (preparación del Intermedio 3 a partir del Intermedio 2).
Como se describió en el Esquema de Síntesis 3, es posible de manera opcional utilizar también estrategias protectoras de grupo en el caso del esquema de Síntesis 5. De manera opcional, es posible además, al partir del Intermedio 6 o del Intermedio 7, como se describió en el esquema de Síntesis 3, llevar a cabo reacciones de oxidación o reducción conocidas por las personas versadas en la materia (cf., por ejemplo: Science of Synthesis, Georg Thieme Verlag).
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Esquema de Síntesis 5
Los sustituyentes R1, R4, R5 son como se los definió en la fórmula general (I).
Síntesis de los compuestos de ejemplo
Abreviaturas elucidaciones
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Los nombres químicos de los intermedios y ejemplos se generaron mediante el uso del sofware ACD / LABS (versión del lote 12.01.).
Métodos
En algunos casos, los compuestos presentes y sus precursores y/o intermedios se analizaron por LC-MS.
Método A1: UPLC (MeCN-HCOOH):
Instrumento: Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001; columna: Acquity UPLC BEH C18 1,7 50 x 2,1 mm; eluyente A: agua 0,1 % por vol. De ácido fórmico (99 %), eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0-1,6 min 1-99 % B; 1,6-2,0 min 99 % B; velocidad de flujo 0,8 ml/min; temperatura: 60 °C; inyección: 2 pl; DAD detección: 210-400 nm; MS ESI+, ESI-, grado de detección 160-1000 m/z; ELSD.
Método A2: UPLC (MeCN-NHa):
Instrumento: Waters Acquity UPLC-MS SQD 3001; columna: Acquity UPLC BEH C18 1,7 50 x 2,1 mm; eluyente A: agua 0,2 % por vol. De amoníaco (32 %), eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0-1,6 min 1-99 % B; 1,6-2,0 min 99 % B; velocidad de flujo 0,8 ml/min; temperatura: 60 °C; inyección: 2 pl; DAD detección: 210-400 nm; MS ESI+, ESI-, grado de detección 160-1000 m/z; ELSD.
Método A3: (LC-MS)
Instrumento: Agilent 1290 Infinity LC; columna: Acquity UPLC BEH C18 1,750 x 2,1 mm; eluyente A: agua 0,05 % por vol. de ácido fórmico, eluyente B: acetonitrilo 0,05 % por vol. de ácido fórmico, gradiente: 0-1,7 min 2-90 % B; 1,7-2,0 min 90 % B; velocidad de flujo 1,2 ml/min; temperatura: 60 °C; inyección: 2 pl; DAD detección: 190-390 nm; MS: Agilent TOF 6230.
Método A4: (LC-MS)
Instrumento: Waters Acquity; columna: Kinetex (Phenomenex), 50 x 2 mm; eluyente A: agua 0,05 % por vol. de ácido fórmico, eluyente B: acetonitrilo 0,05 % por vol. De ácido fórmico; gradiente: 0-1,9 min 1-99 % B; 1,9-2,1 min 99 % B; velocidad de flujo 1,5 ml/min; temperatura: 60 °C; inyección: 0,5 pl; DAD detección: 200-400 nm.
En algunos casos, los compuestos presentes y sus precursores y/o intermedios se purificaron mediante los siguientes métodos ilustrativos HPLC preparativos:
Método P1: sistema: Sistema de Autopurificación Waters: Bomba 2545, Administrador de Muestras 2767, CFO, DAD 2996, ELSD 2424, SQD; columna: XBridge C18 5 pm 100 x 30 mm; eluyente A: agua 0,1 % por vol. de ácido fórmico, eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0-8 min 10-100 % B; 8-10 min 100 % B; flujo: 50 ml/min; temperatura: temperatura ambiente; solución: max. 250 mg / max. 2,5 ml DMSO o DMF; inyección: 1 x 2,5 ml; detección: DAD grado de detección 210-400 nm; MS ESI+, ESI-, grado de detección 160-1000 m/z.
Método P2: sistema: Sistema de Autopurificación Waters: Bomba 254, Administrador de Muestras 2767, CFO, DAD 2996, ELSD 2424, SQD 3100; columna: XBridge C185 pm 10 x 30 mm; eluyente A: agua 0,2 % por vol. de amoníaco (32 %), eluyente B: metanol; gradiente: 0-8 min 30-70 % B; flujo: 50 ml/min; temperatura: temperatura ambiente; detección: DAD grado de detección 210-400 nm; MS ESI+, ESI-, grado de detección 160-1000 m/z; ELSD.
Método P3: sistema: Labomatic, bomba: HD-5000, colector de fracción: LABOCOL Vario-4000, detector UV: Knauer UVD 2,1S; columna: XBridge C185 pm 100x30 mm; eluyente A: agua 0,2 % por vol. de amoníaco (25 %), eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0-1 min 15 % B, 1-6,3 min 15-55 % B; 6,3-6,4 min 55-100 % B; 6,4-7,4 min 100 % B; flujo: 60 ml/min; temperatura: temperatura ambiente; solución: max. 250 mg / 2 ml DMSO; inyección: 2 x 2 ml; detección: UV 218 nm; Software: SCPA PrepCon5.
Método P4: sistema: Labomatic, bomba: HD-5000, colector de fracción: LABOCOL Vario-4000, detector UV: Knauer UVD 2,1S; columna: Chromatorex RP C18 10 pm 125 x 30 mm; eluyente A: agua 0,1 % por vol. de ácido fórmico, eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0-15 min 65 - 100 % B; flujo: 60 ml/min; temperatura: temperatura ambiente; solución: max. 250 mg / 2 ml DMSO; inyección: 2 x 2 ml; detección: UV 254 nm; Software: SCPA PrepCon5.
Método P5: sistema: Sepiatec: Prep SFC100, columna: Chiralpak IA 5 pm 250x20 mm; eluyente A: dióxido de carbono, eluyente B: etanol; gradiente: isocrático 20 % B; flujo: 80 ml/min; temperatura: 40 °C; solución: max. 250 mg / 2 ml DMSO; inyección: 5 x 0,4 ml; detección: UV 254 nm.
Método P6: sistema: Agilent: Prep 1200, 2 x bomba de prep, DLA, MWD, Gilson: Liquid Handler215; columna: Chiralcel OJ-H 5 pm 250 x 20 mm; eluyente A: hexano, eluyente B: etanol; gradiente: isocrático 30 % B; flujo: 25 ml/min; temperatura: 25 °C; solución: 187 mg / 8 ml etanol/metanol; inyección: 8 x 1,0 ml; detección: UV 280 nm.
Método P7: sistema: Labomatic, bomba: HD-5000, colector de fracción: LABOCOL Vario-4000, detector UV: Knauer UVD 2,1S; columna: XBridge C185 pm 100 x 30 mm; eluyente A: agua 0,1 % por vol. de ácido fórmico, eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0-3 min: 65 % B isocrático, 3-13 min: 65-100 % B; flujo: 60 ml/min; temperatura: temperatura ambiente; solución: max. 250 mg / 2 ml DMSO; inyección: 2 x 2 ml; detección: UV 254 nm.
Método P8: sistema: Agilent: Prep 1200, 2 x bombda de prep, DLA, MWD, Gilson: Liquid Handler 215; columna: Chiralpak IF 5 pm 250 x 20 mm; eluyente A: etanol, eluyente B: metanol; gradiente: isocrático 50 % B; flujo: 25 ml/min; temperatura: 25 °C; solución: 600 mg / 7 ml N,N-dimetilformamida; inyección: 10 x 0,7 ml; detección: UV 254 nm.
En algunos casos, las mezclas de sustancias se purificaron por cromatografía de columna en gel de sílice.
Para la preparación de algunos de los presentes compuestos y sus precursores y/o intermedios, se llevó a cabo una purificación de cromatografía de columna (“cromatografía flash”) en gel de sílice mediante el uso de dispositivos Isolera® de Biotage. Esto se realizó al utilizar cartuchos de Biotage, por ejemplo el cartucho SNAP Cartridge, KP_SIL” de distinto tamaño y los cartuchos "Interchim Puriflash Silica HP 15Um flash column” de diferente tamaño.
Materiales de partida
Intermedio V2-1
Metil 6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-2-carboxilato
Figure imgf000022_0001
Se disolvieron 2,00 g (9,26 mmol) de 2-(6-bromopiridin-2-il)propan-2-ol (CAS 638218-78-7) en 20 ml de metanol y 20 ml de DMSO. Luego, se agregaron 250 mg de 1,3-bis(difenilfosfin)propano, 130 mg de acetato de paladio(II) y 3 ml de trietilamina. La mezcla de reacción se depuró tres veces con monóxido de carbono a temperatura ambiente y se agitó en una atmósfera de 13 bar de monóxido de carbono durante 30 min. La atmósfera de monóxido de carbono se eliminó al aplicar vacío y la mezcla se agitó a una atmósfera de 14 bar de monóxido de carbono a 100 °C durante 24 h. La autoclave se descomprimió, se agregó agua a la mezcla de reacción, y la mezcla de reacción se extrajo tres veces con acetato de etilo, se lavó con una solución de hidrogencarbonato de sodio acuoso saturado y solución de cloruro de sodio, se filtró a través de un filtro hidrófobo y se concentró. Esto proporció un producto crudo de 1,60 g.
UPLC-MS (Método A1): Rt = 0,76 min (UV detector: TIC), masa hallada 195,00.
Intermedio V3-1
Potasio 6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-2-carboxilato
Figure imgf000022_0002
Se cargaron inicialmente 1,60 g del productto crudo del Intermedio 0-1 en 15 ml de metanol, se agregaron 0,74 g de hidróxido de potasio y la mezcla se agitó a 50 °C durante 16,5 h. Luego de la concentración, se obtuvieron 2,1 g de un residuo que se utilizó sin más purificación. UPLC-MS (Método A1): Rt = 0,47 min (UV detector: TIC), masa hallada 181,00.
Intermedio 1-1
Metil 5-nitro-1H-indazol-6-carboxilato
Figure imgf000022_0003
Se disolvieron 4,60 g (26,1 mmol) de metil 1H-indazol-6-carboxilato (CAS No: 170487-40-8) en 120 ml de ácido sulfúrico (96 %) y se enfriaron a -15 °C en un matraz de tres cuellos que tienen un agitador CPG, un embudo de adición y un termómetro interno. Durante un periodo de 15 min, el ácido nitrante (10 ml de 96 % ácido sulfúrico en 5 ml de 65 % ácido nítrico), que se preparó y enfrió de antemano, se agregó gota a gota a esta solución. Luego de que finalizó la adición gota a gota, la mezcla se agitó durante una hora más (temperatura interna a -13 °C). Se agregó la mezcla de reacción al hielo, y el precipitado se filtró con succión, se lavó con agua y se secó en una cabina de secado a 50 °C a presión reducida. Se obtuvieron 5,49 g del compuesto del título.
UPLC-MS (Método A2): Rt = 0,75 min
MS (ESIpos): m/z = 222(M+H)+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 3,87 (s, 3 H); 7,96 (s, 1 H); 8,44 (s, 1 H); 8,70 (s, 1 H); 13,98 (br. s., 1 H).
Intermedio 2-1
Metil 5-amino-1H-indazol-6-carboxilato
Figure imgf000023_0001
Se disolvieron 4,40 g (19,8 mmol) de metil 5-nitro-1H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 1-1) en 236 ml de metanol y se hidrogenaron con 1,06 g (0,99 mmol) de paladio en carbono activado a presión de hidrógeno estándar a 25 °C durante 3 h. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite, el filtro se lavó con metanol y se concentró el filtrado. Se obtuvieron 3,53 g del compuesto del título.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 3,85 (s, 3 H) 6,01 (s, 2 H) 6,98 (s, 1 H) 7,79 - 7,91 (m, 1 H) 7,99 (s, 1 H) 12,84 (br. s., 1 H).
Intermedio 3-1
Metil 5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-1H-indazol-6-carboxylato
Figure imgf000023_0002
Se cargaron inicialmente 4,95 g (25,9 mmol) de ácido 6-(trifluorometil)piridin-2-carboxílico en 45 ml de THF. Se agregaron 9,07 g (28,2 mmol) de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio tetrafluoroborato y 4,92 ml (28,2 mmol) de N-etil-N-isopropilpropan-2-amina y la mezcla se agitó a 25 °C durante 30 min. Luego, se agregaron 4,50 g (23,5 mmol) de metil 5-amino-1H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 2-1) y la mezcla se agitó a 25 °C durante 24 horas. La mezcla de reacción se filtró con succión a través de un filtro de membrana y los sólidos se lavaron con THF y con agua y se secaron en una cabina de secado durante la noche. Se obtuvieron 7,60 g del compuesto del título.
UPLC-MS (Método A2): Rt = 1,16 min
MS (ESlpos): m/z = 365 (M+H)+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 3,97 (s, 3 H); 8,13 - 8,27 (m, 2 H); 8,30 (s, 1 H); 8,33 - 8,45 (m, 1 H); 8,45 - 8,51 (m, 1 H); 9,15 (s, 1 H); 12,57 (s, 1 H); 13,44 (s, 1 H).
Intermedio 3-2
Metil 5-({[6-(difluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-1H-indazol-6-carboxylato
Figure imgf000023_0003
Se cargaron inicialmente 2,85 g (23,5 mmol) de ácido 6-(difluorometil)piridin-2-carboxílico en 30 ml de THF. Se agregaron 6,05 g (18,8 mmol) de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio tetrafluoroborato y 3,3 ml de N-etil-N-isopropilpropan-2-amina y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, se agregaron 3,00 g (15,7 mmol) de metil 5-amino-1H-indazol-6-carboxilato y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se mezcló con agua y el precipitado se filtró con succión y se lavó de manera repetida con agua y diclorometano. Esto proporcionó 1,53 g (27 % de teoría) del compuesto del título. Se separaron las fases del filtrado, la fase orgánica se concentró, se mezcló con un poco de diclorometano y se suspendió en un baño de ultrasonido y el precipitado se filtró con succión. Esto proporcionó otros 1,03 g del compuesto del título.
1H-NMR (fracción del primero producto, 300MHz, DMSO-d6): 8 [ppm]= 3,99 (s, 3H); 7,09 (t, 1H); 8,00 (d, 1H); 8,21 -8,40 (m, 4H); 9,14 (s, 1H); 12,53 (s, 1H); 13,44 (s, 1H).
Intermedio 3-3
Metil 5-({[6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-2-il]carbonil}amino)-1H-indazol-6-carboxylato
Figure imgf000024_0001
Se cargaron inicialmente 2,10 g de potasio 6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-2-carboxilato (Intermedio V3-1) en 15 ml de THF. Se agregaron 3,69 g (11,5 mmol) de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio tetrafluoroborato y 2,00 ml de N-etil-N-isopropilpropan-2-amina y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. Luego, se agregaron 1,83 g (9,58 mmol) de metil 5-amino-1H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 2-1) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 19 h. La mezcla se mezcló con agua y acetato de etilo, los sólidos sin disolver se filtraron, las fases del filtrado se separaron, y la fase acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo, se lavó con una solución de cloruro de sodio, se filtró a través de un filtro hidrófobo, se concentró y se purificó por medio de cromatografía de columna en gel de sílice (hexano/acetato de etilo). Luego de que se eliminaron los solventes, se obtuvieron 1,56 g del compuesto del título como una espuma amarilla.
UPLC-MS (Método A1): Rt = 1,00 min (UV detector: TIC Smooth), masa hallada 354,00. 1H-NMR (500MHz,DMSO-d6): 8 [ppm] = 1,63 (s, 6H); 3,97 (s, 3H); 5,37(s ,1H); 7,90 - 7,95 (m, 1H); 8,03-8,07 (m, 2H); 8,23(s, 1H); 8,29 (s, 1H); 9,19 (s, 1H); 12,79 (s, 1H); 13,41 (br.s., 1H).
Intermedio 4-1
Metil 2-(oxetan-3-ilmetil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxylato
Figure imgf000024_0002
Se disolvieron 1,00 g (2,66 mmol) de metil 5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-1H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 3-1) en 10 ml de DMF y, luego de la adición de 1,10 g (7,99 mmol) de carbonato de potasio y 221 mg (1,33 mmol9 de yoduro de potasio, la mezcla se agitó a 25 °C durante 30 min. Se agregaron 603 mg (3,99 mmol) de 3-bromometiloxetano, y la mezcla se agitó a 25 °C durante 24 h. La mezcla de reacción se dividió entre agua y acetato de etilo. La mezcla se extrajo dos veces con acetato de etilo y las fases orgánicas combinadas se filtraron a través de un filtro hidrófobo y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna en gel de sílice (hexano/acetato de etilo). Se obtuvieron 260 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (Método A2): Rt = 1,24 min
MS (ESIpos): m/z = 435(M+H)+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 3,49 - 3,64 (m, 1 H); 3,95 (s, 3 H); 4,49 (t, 2 H); 4,68 (dd, 2 H); 4,81 (d, 2 H); 8,20 (dd, 1 H); 8,35 - 8,41 (m, 1 H); 8,43 - 8,49 (m, 2 H); 8,55 - 8,58 (m, 1 H); 9,06 (s, 1 H); 12,53 (s, 1 H).
Intermedio 4-2
Metil 2-(2-metoxietil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato
Figure imgf000025_0001
Se disolvieron 1,00 g (2,75 mmol) de metil 5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-1H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 3-1) en 5 ml de DMF, y se agregaron mientras se mezclaba 387 |jl (4,12 mmol) de 2-bromoetil metil éter; 1,14 g (8,23 mmol) de carbonato de potasio y 228 mg (1,37 mmol) de yoduro de potasio. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 24 horas, se diluyó con agua y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se filtraron a través de un filtro hidrófobo y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna en gel de sílice (hexano/acetato de etilo). Se obtuvieron 12 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (Método A1): Rt = 1,24 min
MS (ESlpos): m/z = 423 (M+H)+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 3,24 (s, 3 H); 3,86 (t, 2 H); 3,96 (s, 3 H); 4,65 (t, 2 H); 8,21 (dd, 1 H); 8,35 - 8,42 (m, 1 H); 8,43 - 8,51 (m, 2 H); 8,52 (d, 1 H); 9,06 (s, 1 H); 12,53 (s, 1 H).
Intermedio 4-3
Metil 2-(3-metoxipropil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato
Figure imgf000025_0002
Se disolvieron 1,00 g (2,75 mmol) de metil 5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-1H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 3-1) en 5 ml de DMF, y se agregaron mientras se mezclaba 460 j l (4,12 mmol) de 1-bromo-3-metoxipropano; 1,14 g (8,23 mmol) de carbonato de potasio y 228 mg (1,37 mmol) de yoduro de potasio. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 72 horas, se diluyó con agua y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se filtraron a través de un filtro hidrófobo y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna en gel de sílice (hexano/acetato de etilo). Se obtuvieron 28 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (Método A1): Rt = 1,29 min
MS (ESlpos): m/z = 437 (M+H)+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 2,17 (quin, 2 H); 3,24 (s, 3 H); 3,33 - 3,36 (m, 2 H); 3,96 (s, 3 H); 4,53 (t, 2 H); 8,21 (dd, 1 H); 8,35 - 8,42 (m, 1 H); 8,45 - 8,49 (m, 2 H); 8,54 (d, 1 H); 9,06 (s, 1 H); 12,54 (s, 1 H).
Intermedio 4-4
Metil 2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato
Método de preparación 1
Figure imgf000025_0003
Se cargaron inicialmente 930 mg (2,55 mmol) de metil 5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-1H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 3-1), 1,06 g de carbonato de potasio y 212 mg de yoduro de potasio en 9 ml de DMF y la mezcla se agitó durante 15 min. Luego, se agregaron 0,62 ml de 4-bromo-2-metilbutan-2-ol y la mezcla se agitó a 60 °C durante 16 h. la mezcla se mezcló con agua y se extrajo dos veces con acetato de etilo, y el extracto se lavó tres veces con solución de cloruro de sodio saturado, se filtró y se concentró. Purificación de cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/ acetato de etilo) para obtener 424 mg del compuesto del título. UPLC-MS (Método A2): Rt = 1,21 min (UV detector: TIC), masa hallada 450,00.
1H-NMR (400MHz, DMSO-da): 8 [ppm]= 1,16 (s, 6 H) 2,02 -2,11 (m, 2 H) 3,96 (s, 3 H) 4,51 -4,60 (m, 3 H) 8,20 (dd, J=7,83; 1,01 Hz, 1 H) 8,39 (s, 1 H) 8,45 (s, 2 H) 8,55 (d, J=0,76 Hz, 1 H) 9,05 (s, 1 H) 12,52 (s, 1 H)
Método de preparación 2
Se cargaron inicialmente 1,95 g (7,03 mmol) de metil 5-amino-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 7-1) en 30 ml de THF. Se agregaron 1,48 g (7,73 mmol) de ácido 6-(trifluorometil)piridin-2-carboxílico; 2,71 g (8,44 mmol) de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio tetrafluoroborato y 1,47 ml (8,44 mmol) de N-etil-N-isopropilpropan-2-amina y la mezcla se agitó a 25 °C durante 20,5 h. Se agregó agua, la mezcla se extrajo tres veces con acetato de etilo y los extractos se lavaron con solución de cloruro de sodio, se filtraron a través de un filtro hidrófobo y se concentraron. El residuo se separó mediante cromatografía de columna en gel de sílice (gradiente de hexano/acetato de etilo). Se obtuvieron 2,79 g del compuesto del título.
UPLC-MS (Método A1): Rt = 1,23 min (UV detector: TIC), masa hallada 450,00.
Intermedio 4-5
Metil 2-(2-{[ferf-butM(dimetil)silM]oxi}etil)-5-({[6-(trífluorometil)pmdm-2-il]carboml}ammo)-2H-mdazol-6-carboxilato
Figure imgf000026_0001
Se cargaron incialmente 1,00 g (2,66 mmol, 97 %) de metil 5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-1H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 3-1) en 50 ml de DMF; se agregaron mientras se mezclaba 1,10 g (7,99 mmol) de carbonato de potasio y 221 mg (1,33 mmol) de yoduro de potasio, y la mezcla se agitó a 25 °C durante 30 min. Luego, se agregaron 857 pl (3,99 mmol) de (2-bromoetoxi) (terc-butil)dimetilsilano, y la mezcla se agitó a 25 °C durante 24 h. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se filtraron a través de un filtro hidrófobo y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna en gel de sílice (hexano/acetato de etilo). Se obtuvieron 400 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (Método A1): Rt = 1,58 min
MS (ESIpos): m/z = 523(M+H)+
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = -0,18 - -0,13 (m, 6 H); 0,74 (s, 9 H); 3,96 (s, 3 H); 4,08 (t, 2 H); 4,57 (t, 2 H); 8,15 - 8,25 (m, 1 H); 8,32 - 8,43 (m, 1 H); 8,43 - 8,52 (m, 3 H); 9,07 (s, 1 H); 12,53 (s, 1 H).
Intermedio 4-6
Metil 2-(3-{[ferf-butM(dimetN)sNN]oxi}propM)-5-({[6-(trífluorometN)pmdm-2-il]carboml}ammo)-2H-mdazol-6-carboxilato
De foma análoga al intermedio 4-5, se disolvieron 1,00 g (2,75 mmol) de metil 5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-1H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 3-1) en 10 ml de DMF; se agregaron mientras se mezclaba 1,14 g (8,24 mmol) de carbonato de potasio y 228 mg (1,37 mmol) de yoduro de potasio, y la mezcla se agitó a 25 °C durante 30 min. Luego, se agregaron 1,04 g (4,12 mmol) de (3-bromopropoxi)(ferc-butil)dimetilsilano, y la mezcla se agitó a 25 °C durante 24 h. La mezcla de reacción se filtró y la torta de filtro se lavó con acetato de etilo. La mezcla de reacción se dividió entre agua y acetato de etilo y la fase acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se filtraron a través de un filtro hidrófobo y se concentraron. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa para obtener 428 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (Método A1): Rt = 1,63 min
MS (ESIpos): m/z = 537(M+H)+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = -0,02 - 0,06 (m, 6 H); 0,87 (s, 9 H); 2,14 (quin, 2 H); 3,62 (t, 2 H); 3,96 (s, 3 H); 4,54 (t, 2 H); 8,20 (d, 1 H); 8,35 - 8,42 (m, 1 H); 8,43 - 8,48 (m, 3 H); 8,49 - 8,53 (m, 1 H); 9,06 (s, 1 H). Intermedio 4-7
Metil 5-({[6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-2-il]carbonil}amino)-2-(4,4,4-trifluorobutil)-2H-indazol-6-carboxilato
Figure imgf000027_0001
Se cargaron inicialmente 300 mg (0,80 mmol) 5-({[6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-2-il]carbonil}amino)-1H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 3-3) en 4,5 ml de DMF. Sen agregaron 287 mg (1,21 mmol) de 1,1,1-trifluoro-4-iodobutano y 333 mg de carbonato de potasio y la mezcla se agitó a 100 °C durante 23 h. Se agregó agua y la mezcla se extrajo tres veces con acetato de etilo. La mezcla se concentró y el producto se purificó mediante HpLC preparativa. Esto proporcionó 72 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (Método A1): Rt = 1,26 min (UV detector: TIC), masa hallada 464,17.
Intermedio 4-8
Metil 5-{[(5-fluoro-6-metilpiridin-2-il)carbonil]amino}-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-2H-indazol-6-carboxilato
Figure imgf000027_0002
Se hicieron reaccionar 195 mg (0,46 mmol) de metil 5-amino-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 7-1) con 78 mg (0,50 mmol) de ácido 5-fluoro-6-metilpiridin-2-carboxílico análogo al Intermedio 4-4 (Método de preparación 2) dentro de 19,5 h. Se obtuvieron 228 mg de un producto crudo luego de una preparación acuosa análoga.
UPLC-MS (Método A1): Rt = 1,20 min (UV detector: TIC), masa hallada 414,00.
Intermedio 4-9
Metil 2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-5-{[(6-metilpiridin-2-il)carbonil]amino}-2H-indazol-6-carboxilato
Figure imgf000028_0001
Se hicieron reaccionar 195 mg (0,45 mmol) de metil 5-amino-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 7-1) con 70 mg (0,50 mmol) de ácido 6-metilpiridin-2-carboxílico análogo a la preparación del Intermedio 4-4 (Método de preparación 2) dentro de 19,5 h. Se obtuvieron 278 mg del compuesto del título como un producto crudo luego de una preparación acuosa análoga.
UPLC-MS (Método A1): Rt = 1,14 min (UV detector: TIC), masa hallada 396,00.
Intermedio 4-10
Metil 2-[3-(2,2,2-trifluoroetoxi)propil]-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato
Figure imgf000028_0002
Se agitó una mezcla de 250 mg (0,58 mmol) de metil 5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-1H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 3-1), 193 mg (0,88 mmol) de 3-bromopropil 2,2,2-trifluoroetil éter, 242 mg de carbonato de potasio y 145 mg de yoduro de potasio en 3 ml de DMF a 100 °C durante 20 h. Se agregó agua, la mezcla se extrajo con acetato de etilo y el extracto se lavó con una solución de cloruro de sodio y se concentró. La purificación mediante HPLC preparativa proporcionó 52 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (Método A1): Rt = 1,39 min (UV detector: TIC), masa hallada 504,12.
Intermedio 4-11
Metil 5-({[6-(difluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-2H-indazol-6-carboxilato
Figure imgf000028_0003
Se cargaron inicialmente 2,00 g de 5-amino-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 7-1) en 40 ml de THF. Se agregaron 1,50 g de ácido 6-(difluorometil)piridin-2-carboxílico, 2,78 g de 0-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU, número CAS 125700-67-6) y 1,5 ml de N-etil-N-isopropilpropan-2-amina y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. Se agregó agua, la mezcla se extrajo tres veces con acetato de etilo y las fases orgánicas combinadas se lavaron con solución de cloruro de sodio y se filtraron a través de un filtro hidrófobo. La mezcla se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/acetato de etilo). Esto proporcionó 3,05 g del compuesto del título como un sólido amarillo.
UPLC-MS (Método A1): Rt = 1,15 min (detector UV TIC), masa hallada 432,00.
1H-NMR (400MHz, DMSO-da): 8 [ppm]= 1,17 (s, 6H); 2,04 -2,11 (m, 2H); 3,99 (s, 3H); 4,52 -4,60 (m, 3H); 7,10 (t, 1H); 8,00 (dd, 1H); 8,28 -8,38 (m, 2H); 8,44 -8 ,47 (m, 1H); 8,56 (d, 1H); 9,05 (s, 1H); 12,49 (s, 1H).
Intermedio 5-1
N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-1H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
Figure imgf000029_0001
A una solución, que se enfrió con agua helada, de 1,50 g (4,12 mmol) de metilo 5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-lH-indazole-6-carboxilato (Intermedio 3-1) en 20 ml de THF se agregó con cuidado 6,9 ml (equivalente a 5) de una solución de 3M bromuro de metilmagnesio en dietiléter. La mezcla se agitó mientras se enfriaba durante una hora y a temperatura ambiente durante 19,5 horas. Se agregaron otros 2 equivalentes de la solución de bromuro de metilmagnesio y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante otras 24 horas. Se agregó una solución de cloruro de amonio saturado en fase acuosa, dicha mezcla se agitó y se extrajo tres veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución de cloruro de sodio, luego se filtraron en un filtro hidrofóbico y se concentraron. El residuo se purificó con gel sílice cromatografía de columna (hexano/acetato de etilo). Se obtuvieron 763 mg del compuesto del título.
1H-NMR (400MHz, DMSO-da): 8 [ppm]= 1,63 (s, 6H), 5,99 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 8,06 (s, 1H), 8,14 - 8,19 (m, 1H), 8,37 (t, 1H), 8,46 (d, 1H), 8,78 (s, 1H), 12,32 (s, 1H), 12,97 (s, 1H).
Intermedio 5-2
6-(Difluorometil)-N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-1H-indazol-5-il]piridin-2-carboxamida
Figure imgf000029_0002
De manera análoga a la preparación de los Intermedios 5-1, se hicieron reaccionar 2,40 g (6,93 mmol) de metilo 5-({[6-(difluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-1H-indazole-6-carboxilato (Intermedio 3-2) en 10 ml de THF con tres porciones de una solución de 3M bromuro de metilmagnesio en dietiléter (6,9 ml, luego se agitó a temperatura ambiente durante 45 minutos; 11,6 ml, luego se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas; 6,9 ml, luego se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas). Después de la preparación como para Intermedio 5-1, se obtuvo 2,39 de un producto crudo, que también se usaron sin purificación adicional.
Intermedio 6-1
Metilo 2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-5-nitro-2H-indazole-6-carboxilato
Figure imgf000029_0003
Inicialmente se cargaron 5,00 g (22,6 mmol) de metilo 5-nitro-1H-indazole-6-carboxilato (Intermedio1-1) en 40ml de DMF. Se agregaron 5,65 g (33,9 mmol) de 4-bromo-2-metilbutan-2-ol, 9,37 g (67,8 mmol) de carbonato de potasio y 5,63 g (33,9 mmol) de yoduro de potasio y la mezcla se agitó a 100 °C durante 20 horas. Se agregó agua, la mezcla se extrajo tres veces con acetato de etilo y los extractos se lavaron con una solución de cloruro de sodio, se filtraron con un filtro hidrófobo y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/acetato de etilo). Los sólidos obtenidos se agitaron con dietiléter, se filtraron mediante succión, se lavaron con dietiléter y se secaron. Se obtuvieron 2,49 g del compuesto del título.
UPLC-MS (método A1): Rt = 0,93 min (Detector de UV: TIC), masa encontrada 307,00.
1H-NMR (400MHz, DMSO-da): 8 [ppm]= 1,15 (s, 6H), 2,02 - 2,11 (m, 2H), 3,84 (s, 3H), 4,54 (s, 1H), 4,58 - 4,65 (m, 2H), 8,05 (s, 1H), 8,69 (s, 1H), 8,86 (s, 1H).
Intermedio 7-1
Metilo 5-amino-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-2H-indazol-6-carboxilato
Figure imgf000030_0001
Se agregaron 4,53 g de hierro y 217 mg de cloruro de amonio a 2,49 g (8,10 mmol) de metilo 2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-5-nitro-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 6-1) en 30 ml de etanol y 10 ml de agua, la mezcla se agitó a 90 °C durante 21,5 horas. La mezcla se filtró a través de Celite y se lavó con etanol tres veces, luego el filtrado se concentró y el residuo se mezcló con agua. La extracción se realizó tres veces con acetato de etilo (para mejorar la separación de fases, se agregó una solución de cloruro de sodio). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución de cloruro de sodio, luego se filtraron en un filtro hidrofóbico y se concentraron. Esto produjo 1,95 g (85 % de la teoría) del compuesto del título.
UPLC-MS (método A1): Rt = 0,67 min (Detector de UV: TIC), masa encontrada 277,00.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): 8 [ppm]= 1,14 (s, 6H), 1,96 - 2,08 (m, 2H), 3,85 (s, 3H), 4,39 - 4,51 (m, 3H), 5,81 (s, 2H), 6,80 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 8,18 (s, 1H).
Ejemplos de trabajo
Ejemplo 1
N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(2-metoxietil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridine-2-carboxamida
Figure imgf000030_0002
Se disolvió 75 mg (0,18 mmol) de metilo 2-(2-metoxietil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 4-2) en 500 j l de THF y se mezcló con 887 j l (0,89 mmol) de una solución 1 M de bromuro de metilmagnesio en THF. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 60 minutos. A continuación, se agregó con cuidado 1 ml de una solución de cloruro de amonio en fase acuosa saturada y la mezcla se filtró. La fase acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo, luego, las fases orgánicas se combinaron, se filtraron con un filtro hidrófobo y se concentraron. El residuo se disolvió en 3 ml de DMSO y se purificó mediante HPLC preparativa. Las fracciones que contenían el producto se liofilizaron. Se obtuvieron 20 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (método A1): Rt = 1,08 min
MS (APCI+): m/z = 423 (M+H)+
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 1,62 (s, 6 H), 3,22 (s, 3 H), 3,82 (t, 2 H), 4,55 (t, 2 H), 5,96 (s, 1 H), 7,57 (s, 1 H), 8,16 (d1 H), 8,29 - 8,42 (m, 2 H), 8,42 - 8,50 (m, 1 H), 8,71 (s, 1 H), 12,36 (s, 1 H)
Ejemplo 2
N-[6-(Hidroximetil)-2-(2-metoxietil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridine-2-carboxamida
Figure imgf000031_0001
Se suspendieron 13 mg (0,36 mmol) de hidruro de litio y aluminio en 1 ml de THF y la mezcla se enfrió a 0 °C. Se agregó por goteo 75 mg (0,17 mmol) de metilo 2-(2-metoxietil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 4-2) diluidos en 500 j l de THF y la mezcla se agitó a 25 °C durante 60 minutos. La mezcla se diluyó con agua y se extrajo dos veces con acetato de etilo y las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución de cloruro de sodio, se filtraron mediante un filtro hidrófobo, se concentraron y se secaron a presión reducida. Esto produjo 13 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (método A2): Rt = 0,99 min
MS (ESlpos): m/z = 394 (M+H)+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 3,23 (s, 3 H), 3,83 (t, 2 H), 4,56 (t, 2 H), 4,69 (d, 2 H), 5,77 (t, 1 H), 7,57 (s, 1 H), 8,19 (d, 1 H), 8,33 -8,41 (m, 2 H), 8,43 -8,47 (m, 1 H), 8,51 (s, 1 H), 11,20 (s, 1 H)
Ejemplo 3
N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(3-metoxipropil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridine-2-carboxamida
Figure imgf000031_0002
Se disolvieron 75 mg (0,17 mmol) de metilo 2-(3-metoxipropil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 4-3) 500 j l de THF y se mezcló con 859 j l (0,86 mmol) de solución 1 M de bromuro de metilmagnesio en THF. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 60 minutos. A continuación, se agregó con cuidado 1 ml de una solución de cloruro de amonio en fase saturada y la mezcla se filtró. La fase acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo y las fases se combinaron, se filtraron con filtro hidrófobo y se concentraron. El residuo se disolvió en 3 ml de DMSO y se purificó mediante HPLC preparativa. Las fracciones que contenían el producto se liofilizaron. Se obtuvieron 25 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (método A1): Rt = 1,13 min
MS (ESlpos): m/z = 437 (M+H)+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 1,62 (s, 6 H), 2,14 (quin, 2 H), 3,23 (s, 3 H), 3,26 - 3,32 (m, 2 H), 4,44 (t, 2 H), 5,95 (s, 1 H), 7,58 (s, 1 H), 8,16 (d, 1 H), 8,31 - 8,40 (m, 2 H), 8,43 - 8,48 (m, 1 H), 8,72 (s, 1 H), 12,36 (s, 1 H).
Ejemplo 4
N-[6-(Hidroximetil)-2-(3-metoxipropil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
Figure imgf000031_0003
Se suspendieron 13 mg de hidruro de litio y aluminio en THF y la mezcla se enfrió a 0 °C. Se agregó por goteo 75 mg (0,17 mmol) de metilo 2-(3-metoxipropil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 4-3) en THF y la mezcla alcanzó una temperatura ambiente en 30 minutos. La mezcla se diluyó con agua y se filtró, el residuo se lavó con acetato de etilo y el filtrado se extrajo con acetato de etilo. Las fases acetato de etilo combinadas se lavaron con una solución de cloruro de sodio, luego se filtraron en un filtro hidrofóbico y se concentraron. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa.
1H NMR (300 MHz, DMSO-da): 8 [ppm] = 2,14 (quin, 2 H), 3,23 (s, 3 H), 3,29 (t, 2 H), 4,45 (t, 2 H), 4,68 (d, 2 H), 5,77 (t, 1 H), 7,58 (s, 1 H), 8,18 (d, 1 H), 8,32 -8,48 (m, 3 H), 8,51 (s, 1 H), 11,21 (s, 1 H).
Ejemplo 5
N-[2-(2-Hidroxietil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
Estadio A:
Preparación de N-[2-(2-{[ferf-butil(dimetil)silil]oxi}etil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
Figure imgf000032_0001
Se disolvieron 100 mg (0,19 mmol) de metilo 2-(2-{[ferf-butil(dimetil)silil]oxi}etil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 4-5) en 1 ml de THF y se mezcló con 669 pl (0,67 mmol) de solución 1 M de bromuro de metilmagnesio en THF. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 60 minutos. Se agregó 287 pl (0,29 mmol) de solución 1 M de bromuro de metilmagnesio en THF y la mezcla se agitó a 25 °C durante 3 horas. A continuación, se agregó con cuidado 20 ml de solución de cloruro de amonio en fase saturada y se filtró. La fase acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo, las fases orgánicas se combinaron, se secaron con sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron y secaron a presión reducida. Esto dio como resultado 50 mg de N-[2-(2-{[ferf-butil(dimetil)silil]oxi}etil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida.
UPLC-MS (método A2): Rt = 1,51 min
MS (ESlpos): m/z = 523 (M+H)+
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = -0,17 --0,09 (m, 6 H), 0,78 (s, 9 H), 1,62 (s, 6 H), 4,04 (t, 2 H), 4,47 (t, 2 H), 5,98 (s, 1 H), 7,57 (s, 1 H), 8,16 (d, 1 H), 8,29 (s, 1 H), 8,37 (t, 1 H), 8,45 (d, 1 H), 8,73 (s, 1 H), 12,38 (s, 1 H).
Estadio B:
Figure imgf000032_0002
Se disolvieron 50 mg (96 pmol) de N-[2-(2-{[rerr-butil(dimetil)silil]oxi}etii)-6-(hidroximetil)-2H-indazoi-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida en 1,0 ml de THF y se mezcló con 144 pl (0,14 mmol) de solución 1 M de bromuro de metilmagnesio en THF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla se diluyó con agua y se extrajo dos veces con acetato de etilo y las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución de cloruro de sodio en fase saturada, luego se filtraron con un filtro hidrófobo y se concentraron. Esto da como resultado 36 mg de N-[2-(2-hidroxietil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida(Ejemplo 5).
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): d [ppm] = 1,62 (s, 6H), 3,86 (q, 2H), 4,43 (t, 2H), 4,95 (t, 1H), 5,94 (s, 1H), 7,57 (s, 1H), 8,16 (dd, 1H), 8,30 (s, 1H), 8,37 (t, 1H), 8,45 (d, 1H), 8,72 (s, 1H), 12,36 (s, 1H).
UPLC-MS (método A2): Rt = 0,97 min (Detector de UV: TIC), masa encontrada 408,00.
Ejemplo 6
N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(3-hidroxipropil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
Estadio A:
Preparación de N-[2-[2-3-{[íerí-butil(dimetil)silil]oxi}propil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida.
Figure imgf000033_0001
Se disolvió 50 mg (0,09 mmol) de metilo 2-(3-{[ferf-butil(dimetil)silil]oxi} propilo)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 4-6) en 500 pl de THF y se mezcló con 326 pl (0,33 mmol) de solución 1 M de bromuro de metilmagnesio en THF. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 60 minutos. A continuación, se agregó con cuidado 20 ml de una solución de cloruro de amonio en fase saturada y la mezcla se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se filtraron mediante el filtro hidrófobo, se concentraron y se secaron a presión reducida. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvo 40 mg de N-[2-3-{[ferf-butil(dimetil)silil]oxi}propil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida.
UPLC-MS (método A1): Rt = 1,58 min
MS (ESlpos): m/z = 537 (M+H)+
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 0,02 - 0,05 (m, 6 H), 0,84 - 0,91 (m, 9 H), 1,62 (s, 6 H), 2,02 - 2,18 (m, 2 H), 3,55 - 3,62 (m, 2 H), 4,45 (t, 2 H), 5,96 (s, 1 H), 7,57 (s, 1 H), 8,16 (d, 1 H), 8,31 (s, 1 H), 8,33 - 8,42 (m, 1 H), 8,45 (d, 1 H), 8,72 (s, 1 H), 12,37 (s, 1 H).
Estadio B:
Figure imgf000033_0002
Se disolvieron 37 mg (0,07 mmol) de N-[2-(2-{[ferf-butil(dimetil)silil]oxi} propilo)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida en 500 pl de THF y se mezcló con 207 pl (0,21 mmol) de solución 1 M de fluoruro de tetrabutilamonio en THF. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 2 horas. La mezcla se diluyó con agua y se extrajo dos veces con acetato de etilo y las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución de cloruro de sodio en fase saturada, luego se filtraron y se concentraron. Luego de la purificación mediante HPLC preparativa, se obtuvo 10 mg de N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-2-(3-hidroxipropil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida (Ejemplo 6, contiene el componente secundario).
UPLC-MS (método A2): Rt = 1,00 min
MS (ESlpos): m/z = 423 (M+H)+
1H NMR señales seleccionadas (400 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 1,61 (s), 2,00 - 2,12 (m), 3,38 (t, 2 H), 4,44 (t, 2 H), 4,62 (br. s., 1 H), 5,93 (br. s., 1 H), 7,55 (s, 1 H), 8,13 (d, 1 H), 8,27 - 8,38 (m, 2 H), 8,43 (d, 1 H), 8,71 (s, 1 H), 12,30 (br. s., 1 H).
Ejemplo 7
N-[2-(2-Hidroxietil)-6-(hidroximetil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
Estadio A:
N-[2-(2-{[ferf-Butil(dimetil)silil]oxi}etil)-6-(hidroximetil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometM)piridin-2-carboxamida
Figure imgf000034_0001
Se disolvió 100 mg (0,19 mmol) de metilo 2-(2-{[íerí-butil(dimetil)silil]oxi}etil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 4-5) en 1 ml de THF y se mezcló con 191 |jl (0,38 mmol) de solución 2 M de borohidruro de litio. La mezcla se agito a 25 °C durante 24 horas. Se agregó 14 mg (0,38 mmol) de borohidruro de sodio y se agregó 500 j l de metanol, la mezcla se agito a 25 °C durante 4 horas. Se agregaron otros 14 mg (0,38 mmol) de borohidruro de sodio y la mezcla se agitó a 25 °C durante 24 horas. A la mezcla de reacción se agregó agua con cuidado y se removió la fase orgánica. Luego, la mezcla se extrajo dos veces con acetato de etilo y las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución de cloruro de sodio en fase saturada, se filtraron con un filtro hidrófobo y se concentraron. El residuo se absorbió en 2 ml de DMSO y se purificó mediante HPLC preparativa. Esto dio como resultado 30 mg de N-[2-(2-{[íerí-butil(dimetil)silil]oxi}etil)-6-(hidroximetil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida.
UPLC-MS (método A2): Rt = 1,44 min
MS (ESlpos): m/z = 495 (M+H)+
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = -0,16 - -0,12 (m, 6 H), 0,75 - 0,79 (m, 9 H), 4,05 (t, 2 H), 4,48 (t, 2 H), 4,69 (d, 2 H), 5,75 - 5,77 (m, 1 H), 7,57 (s, 1 H), 8,18 (dd, 1 H), 8,30 - 8,33 (m, 1 H), 8,38 (t, 1 H), 8,45 (d, 1 H), 8,51 (s, 1 H), 11,20 (s, 1 H).
Estadio B:
Figure imgf000034_0002
Se disolvió 33 mg (0,07 mmol) de N-[2-(2-{[íerí-butil(dimetil)silil]oxi}etil)-6-(hidroximetil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida en 1 ml de THF y se mezcló con 100 j l (0,10 mmol) de solución 1 M de fluoruro de tetrabutilamonio en THF. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 1 hora. La mezcla se diluyó con agua y se extrajo dos veces con acetato de etilo y las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución de cloruro de sodio en fase saturada, se filtraron con un filtro hidrófobo, se concentraron y se secaron a presión reducida. Se obtuvo 25 mg de N-[2-(2-hidroxietil)-6-(hidroximetil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida (Ejemplo 7).
UPLC-MS (método A2): Rt = 0,87 min
MS (ESlpos): m/z = 381 (M+H)+
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 3,87 (q, 2 H), 4,44 (t, 2 H), 4,69 (d, 2 H), 4,98 (t, 1 H), 5,70 - 5,81 (m, 1 H), 7,57 (s, 1 H), 8,11 - 8,23 (m, 1 H), 8,31 - 8,42 (m, 2 H), 8,43 -8,49 (m, 1 H), 8,51 (s, 1 H), 11,20 (s, 1 H).
Ejemplo 8
N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(oxetan-3-ilmetil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
Figure imgf000035_0001
Se disolvió 50 mg (0,12 mmol) de metilo 2-(oxetan-3-ilmetil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato (intermedio 4-1) en 500 |jl de THF y se mezcló con 576 |jl (0,58 mmol) de solución 1 M de bromuro de metilmagnesio en THF. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 60 minutos. A continuación, se agregó con cuidado 20 ml de una solución de cloruro de amonio en fase acuosa saturada y la mezcla se concentró. La fase acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo; las fases orgánicas se combinaron, se secaron con sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron. El residuo se disolvió en 2,0 ml de DMSO y se purificó mediante HPLC preparativa. Las fracciones que contenían el producto se liofilizaron. Se obtuvieron 30 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (método A2): Rt = 1,03 min
MS (ESipos): m/z = 435 (M+H)+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 1,62 (s, 6 H), 3,45 - 3,61 (m, 1 H), 4,48 (t, 2 H), 4,66 (dd, 2 H), 4,72 (d, 2 H), 5,94 (s, 1 H), 7,57 (s, 1 H), 8,16 (d, 1 H), 8,33 - 8,42 (m, 2 H), 8,42 - 8,47 (m, 1 H), 8,72 (s, 1 H), 12,36 (s, 1 H).
Ejemplo 9
N-[6-(Hidroximetil)-2-(oxetan-3-ilmetil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
Figure imgf000035_0002
Se disolvió 75 mg (0,17 mmol) de metilo 2-(oxetan-3-ilmetil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 4-1) en 1 ml de una mezcla de THF/metanol (1:1) y se agregó 8 mg (0,21 mmol) de borohidruro de sodio. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C durante 60 minutos. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se mezcló con agua. La suspensión se agitó vigorosamente durante 15 minutos y los sólidos se filtraron por succión, se lavaron dos veces con agua y dos veces con dietiléter, y se secaron a presión reducida. Se obtuvieron 48 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (método A2): Rt = 0,94 min
MS (ESipos): m/z = 407 (M+H)+
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm] = 3,55 (s, 1 H), 4,48 (t, 2 H), 4,61 - 4,77 (m, 6 H), 7,57 (s, 1 H), 8,18 (dd, 1 H), 8,33 - 8,49 (m, 3 H), 8,51 (s, 1 H), 11,21 (s, 1 H).
Ejemplo 10
N-16-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-[3-(metilsulfonil)propil]-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
Figure imgf000035_0003
Una mezcla de 500 mg (1,32 mmol) de N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-1H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida (Intermedio 5-1), 569 mg de carbonato de potasio y 114 mg de yoduro de potasio en 5,0 ml de DMF se agitaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se agregó 414 mg de 1-bromo-3-(metilsulfonil)propano y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se agregó agua, luego la mezcla se extrajo dos veces con acetato de etilo y los extractos se lavaron con una solución de cloruro de sodio y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gradiente de diclorometano/metanol). La fracción del producto se agitó con dietiléter, se filtró y se secó. Se obtuvieron 59 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (método A2): Rt = 1,02 min
MS (ESIpos): m/z = 485 (M+H)+
1H-NMR (300MHz, DMSO-da): 8 [ppm]= 1,63 (s, 6H), 2,26 - 2,42 (m, 2H), 2,99 (s, 3H), 3,06 - 3,16 (m, 2H), 4,55 (t, 2H), 5,96 (s, 1H), 7,60 (s, 1H), 8,16 (d, 1H), 8,33 - 8,48 (m, 3H), 8,73 (s, 1H), 12,37 (s, 1H).
Ejemplo 11
N-[2-(3-Hidroxi-3-metilbutil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
Figure imgf000036_0001
Métodos de preparación 1
Primero, se cargó 705 mg (1,57 mmol) de metilo 2-(3-hidroxi -3-metilbutil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-caroxilato (Intermedio 4-4) en 10 ml de THF y se enfrió con agua helada. Se agregó 2,6 ml (5,0 equivalentes) de solución 3M bromuro de metilmagnesio (en dietiléter) y la mezcla se agitó mientras se enfriaba con agua helada durante una hora y a temperatura ambiente durante 4,5 horas. Otro equivalente 1 de la solución de bromuro de metilmagnesio se agregó y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20,5 horas. Otro equivalente 1 también de la solución de bromuro de metilmagnesio se agregó y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 22 horas. La mezcla de reacción se mezcló con una solución de cloruro de amonio en fase acuosa saturada, se agitó y se extrajo tres veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución de cloruro de sodio, luego se filtraron en un filtro hidrófobo y se concentraron. Esto dio como resultado 790 mg del residuo que se purifico mediante HPLC preparativa. Esto dio como resultado 234 mg del compuesto del título y 164 mg de la fracción del producto que se agitó con dietiléter. Se obtuvieron 146 mg del compuesto del título después de que se filtró por succión seguido del secado.
UPLC-MS (método A1): Rt = 1,10 min (Detector de UV: TIC), masa encontrada 450,00.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): 8 [ppm]= 1,14 (s, 6H), 1,61 (s, 6H), 1,99 - 2,08 (m, 2H), 4,42 - 4,55 (m, 3H), 5,93 (s, 1H), 7,56 (s, 1H), 8,15 (dd, 1H), 8,32 - 8,39 (m, 2H), 8,41 - 8,47 (m, 1H), 8,70 (s, 1H), 12,34 (s, 1H).
Métodos de preparación 2
Una mezcla de 500 mg (1,37 mmol) de N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-1H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida (Intermedio 5-1), 569 mg de carbonato de potasio y 114 mg de yoduro de potasio en 5 ml de DMF se agitaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se agregó 344 mg (equivalente1,5) de 4-bromo-2-metilbutan-2-ol y la mezcla se calentó a 100 °C durante 2 horas. Se agregó otro equivalente 0,5 de 4-bromo-2-metilbutan-2-ol y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Se mezcló con agua y se extrajo dos veces con acetato de etilo y las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución de cloruro de sodio en fase saturada y se filtró mediante el filtro hidrófobo y se concentró. El residuo se purificó con gel sílice cromatografía de columna (hexano/acetato de etilo). Esto dio como resultado 100 mg de la fracción del producto que se agitó con dietiléter. El sólido se filtró y se secó. Se obtuvieron 60 mg del compuesto del título.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): 8 [ppm]= 1,14 (s, 6 H), 1,61 (s, 6H), 1,99 -2,07 (m, 2 H), 4,43 -4,52 (m, 3 H) 5,94 (s, 1 H) 7,57 (s, 1 H) 8,15 (dd, 1H) 8,33 - 8,40 (m, 2 H), 8,42 - 8,48 (m, 1H), 8,71 (s, 1 H), 12,35 (s, 1H)
Ejemplo 12
N-{6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-[2-(metilsulfonil) etilo]-2H-indazol-5-il}-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
Figure imgf000037_0001
Se suspendieron 160 mg (0,44 mmol) de N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-1H-indazol-5-il]-6-(tnfluorometil)pindin-2-carboxamida (Intermedio 5-1) con 182 mg de carbonato de potasio y 36 mg de yoduro de potasio en 1,0 ml de DMF y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se agregó 123 mg de 2-bromoetilo metilo sulfona (0,66 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Luego se agregó agua, la mezcla se extrajo dos veces con acetato de etilo y los extractos se lavaron con una solución de cloruro de sodio en fase acuosa saturada, se filtraron mediante el filtro hidrófobo y se concentraron. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa para obtener 20 mg del producto del título.
UPLC (método A2): Rt = 1,01 min;
MS (ESIpos): m/z = 471 (M+H)+
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8 [ppm]= 1,63 (s, 6 H), 2,90 (s, 3 H), 3,85 (t, 2 H), 4,86 (t, 2 H), 5,97 (s, 1 H), 7,59 (s, 1 H), 8,13 - 8,19 (m, 1 H), 8,37 (s, 1 H), 8,41 - 8,48 (m, 2 H), 8,74 (s, 1H), 12,37 (s, 1H).
Ejemplo 13
6-(Difluorometil)-N-[2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]piridin-2-carboxamida
Figure imgf000037_0002
Métodos de preparación 1
Una mezcla de 250 mg de 6-(difluorometil)-N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-1H-indazol-5-il]piridin-2-carboxamida (producto crudo del Intermedio 5-2), 144 mg de yoduro de potasio y 239 mg de carbonato de potasio en 2,5 ml de DMF se agitaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se agregó 145 mg (0,87 mmol) de 4-bromo-2-metilbutan-2-ol y la mezcla se agito a 110 °C durante 3 horas. Se agregó otro equivalente 96 mg de 4-bromo-2-metilbutan-2-ol y la mezcla se agitó a 110 °C durante 4 horas. Se agrego con agua, la mezcla se extrajo dos veces con acetato de etilo y los extractos se lavaron con una solución de cloruro de sodio en fase acuosa semisaturada, se filtró mediante el filtro hidrófobo y se concentró. La purificación se logró con cromatografía en columna de gel sílice (hexano/acetato de etilo). Se obtuvieron 61 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (método A1): Rt = 1,00 min (Detector de UV: TIC), masa encontrada 432,00.
1H-NMR (300MHz, DMSO-d6): 8 [ppm]= 1,14 (s, 6H), 1,63 (s, 6H), 1,97 - 2,08 (m, 2H), 4,41 - 4,55 (m, 3H), 5,99 (s, 1H), 7,03 (t, 1H), 7,56 (s, 1H), 7,94 -8 ,00 (m, 1H), 8,24 -8,38 (m, 3H), 8,71 (s, 1H), 12,49 (s, 1H).
Método de preparación 2
De manera análoga a la preparación del Ejemplo 11 (Preparación del Método 1), se hicieron reaccionar 3,00 g de metilo 5-({[6-(difluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 4­ 11) con una solución de bromuro de metilmagnesio (en dietiléter). Luego de purificar el producto crudo mediante agitación con dietiléter, luego se filtró por HPLC preparativa, se obtuvieron 1,37 g del compuesto del título.
Ejemplo 14
6-(Difluorometil)-N-{6-(2-hidroxipropan-2-il)-2-[2-(metilsulfonil)etil]-2H-indazol-5-il}piridin-2-carboxamida
Figure imgf000038_0001
se agito a temperatura ambiente durante 15 minutos una mezcla de 250 mg de 6-(difluorometil)-N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-1H-indazol-5-il]piridin-2-carboxamida (producto crudo del Intermedio 5-2), 144 mg de yoduro de potasio y 239 mg de carbonato de potasio en 2,5 ml de DMF. Se agrego 162 mg de 2-bromoetil metilo sulfona (0,87 mmol) y la mezcla se agito a 110 °C durante 3 horas. Se agrego agua, la mezcla se extrajo dos veces con acetato de etilo y el extracto se lavó con una solución de cloruro de sodio en fase acuosa semisaturada, luego se filtró mediante el filtro hidrófobo y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa y las fracciones del producto también se purificaron mediante purificación de cromatografía en columna en gel sílice (hexano/acetato de etilo).
1H-NMR (400MHz, DMSO-da): 8 [ppm]= 1,65 (s, 6H), 2,90 (s, 3H), 3,85 (t, 2H), 4,85 (t, 2H), 6,03 (s, 1H), 7,04 (t, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,98 (d, 1H), 8,25 -8 ,36 (m, 2H), 8,43 (s, 1H), 8,75 (s, 1H), 12,52 (s, 1H).
Ejemplo 15
6-(Difluorometil)-N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-2-(3-hidroxipropil)-2H-indazol-5-il]piridin-2-carboxamida Estadio A:
Preparación de N-[2-(3-{[ferf-butil(dimetil)silil]oxi}propil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-(difluorometil)piridin-2-carboxamida
Figure imgf000038_0002
Una mezcla de 250 mg de 6-(difluorometil)-N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-1H-indazol-5-il]piridin-2-carboxamida (Intermedio 5-2), 48 mg de yoduro de potasio y 239 mg de carbonato de potasio en 2,5 ml de DMF se agito a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego se agregó 219 mg (0,87 mmol, 1,5 equivalentes) de (3-bromopropoxi)(terf-butil)dimetilsilano y la mezcla agito a 110 °C durante 3 horas. Se agrego otro equivalente 1 de (3-bromopropoxi)(terf-butil)dimetilsilano y la mezcla se agito a 100 °C durante 4 horas. Se agrego agua, a continuación, se extrajo la mezcla con acetato de etilo y el extracto se lavó con una solución de cloruro de sodio en fase acuosa, se filtró mediante filtro hidrófobo y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna (hexano/acetato de etilo). Se obtuvieron 92 mg del compuesto del título.
Estadio B:
Figure imgf000038_0003
De manera análoga a la preparación del Ejemplo 6, Estadio B, se hicieron reaccionar 92 mg de N-[2-(3-{[terfbutil(dimetil)silil]oxi}propil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-(difluorometil)piridin-2-carboxamida con 0,53 ml de una solución 1 M de fluoruro de tetrabutilamonio en THF durante 1 hora. La preparación acuosa en Ejemplo 6 y la purificación mediante HPLC preparativa dio como resultado 46 mg del título del compuesto.
UPLC-MS (método A1): Rt = 0,92 min (Detector de UV: TIC), masa encontrada 404,00.
1H-NMR (400MHz, DMSO-da): 8 [ppm]= 1,64 (s, 6H), 2,05 (quin, 2H), 3,35 - 3,46 (m, 2H), 4,45 (t, 2H), 4,64 (t, 1H), 5,99 (s, 1H), 7,04 (t, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,95 -7 ,99 (m, 1H), 8,25 -8,36 (m, 3H), 8,73 (s, 1H), 12,50 (s, 1H).
Ejemplo 16
N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(4,4,4-trifluorobutil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
Figure imgf000039_0001
Una mezcla de 210 mg (0,58 mmol) de N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-1H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida (Intermedio 5-1) en 3 ml de DMF se mezcló con 0,11 ml (0,87 mmol) de 1,1,1-trifluoro-4-yodobutano y 239 mg carbonato de potasio y la mezcla se agito a 80 °C durante 6 horas. Luego de añadir agua, la mezcla se extrajo tres veces con acetato de etilo y las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución de cloruro de sodio en fase saturada, se filtró mediante filtro hidrófobo y se concentró. El producto crudo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 19 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (método A1): Rt = 1,27 min (Detector de UV: TIC), masa encontrada 474,15.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): 8 [ppm]= 1,62 (s, 6H), 2,10 -2,33 (m), 4,49 (t, 2H), 5,94 (s, 1H), 7,59 (s, 1H), 8,13 -8,18 (m, 1H), 8,32 - 8,41 (m, 2H), 8,41 - 8,47 (m, 1H), 8,72 (s, 1H), 12,35 (s, 1H).
Ejemplo 17
N-{6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-[3-(trifluorometoxi)propil]-2H-indazol-5-il}-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
Figure imgf000039_0002
Primero, se cargó 150 mg (0,33 mmol) de N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-1H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida (Intermedio 5-1) en 2 ml de THF. Se agregó 58 mg (0,40 mmol) de 3-(trifluorometoxi)propan-1-ol, 131 mg de trifenilfosfina y 71 pl de azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD, CAS 2446-83-5) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 19 horas. Se agrego 0,83 ml de solución (2M) de hidróxido de sodio y la mezcla se agito a 40 °C durante 5 horas. La mezcla se diluyó con agua y se extrajo tres veces con acetato de etilo y las fases orgánicas combinadas se concentraron y se purificaron mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 16 mg del compuesto del título como un producto crudo.
UPLC-MS (método A2): Rt = 1,26 min (Detector de UV: TIC), masa encontrada 490,14.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6, señales seleccionadas): 8 [ppm]= 1,61 (s, 6H), 1,84 (d, 1H), 2,32 (quint., 2H), 4,08 (t, 2H), 4,51 (t, 2H), 7,58 (s, 1H), 8,15 (d, 1H), 8,31 - 8,39 (m, 2H), 8,44 (d, 1H), 8,72 (s, 1H), 12,35 (s, 1H).
Ejemplo 18
N-{6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-[3-(2,2,2-trifluoroetoxi)propil]-2H-indazol-5-il}-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
Figure imgf000040_0001
De manera análoga a la preparación del Ejemplo 11 (Método de preparación 1), se hicieron reaccionar 52 mg (0,10 mmol) de metilo 2-[3-(2,2,2-trifluoroetoxi)propil]-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil}amino)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 4-10) en 3 ml de THF con 2 * 171 j l de una solución 3M de bromuro de magnesio en dietiléter. La purificación mediante HPLC preparativa produjo 12 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (método A1): Rt = 1,25 min (Detector de UV: TIC), masa encontrada 504,16.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-da): 8 [ppm] = 1,63 (s, 6H), 2,20(quin, 2H), 3,58(t, 2H),4,05(q, 2H), 4,47(t, 2H),5,94(s, 1H), 7,58 (s, 1H), 8,15 (dd, 1H), 8,32 (s, 1H), 8,36 (t, 1H), 8,45(d, 1H), 8,73 (s, 1H), 12,36 (s,1H).
Ejemplo 19
5-Fluoro-N-[2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-metilpiridin-2-carboxamida
Figure imgf000040_0002
Primero, se cargó 228 mg (0,31 mmol) de metilo 5-{[(5-fluor-6-metilpiridin-2-il)carbonil]amino}-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 4-8) en 4,5 ml de THF y se enfrió con agua helada. Se agrego 0,63 ml de una solución 3M de bromuro de metilmagnesio (en dietiléter) y la mezcla se agito mientras se enfriaba en agua helada durante 2 horas y a temperatura ambiente durante 21 horas. La mezcla de reacción se mezcló con una solución de cloruro de amonio en fase acuosa saturada y se extrajo tres veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se concentraron. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 82 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (método A2): Rt = 1,03 min (Detector de UV: TIC), masa encontrada 414,21.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): 8 [ppm]= 1,13 (s, 6H), 1,63 (s, 6H), 1,99 - 2,05 (m, 2H), 2,55 - 2,59 (m, 3H), 4,42 - 4,50 (m, 3H), 5,95 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,83 (t, 1H), 8,05 (dd, 1H), 8,31 (s, 1H), 8,68 (s, 1H), 12,33 (s, 1H).
Ejemplo 20
N-[2-(3-Hidroxi-3-metilbutil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-metilpiridin-2-carboxamida
Figure imgf000040_0003
Primero, se cargó 278 mg (0,48 mmol) de metilo 2-(3- hidroxi -3-metilbutil)-5-({[6-(metilpiridin-2-il)carbonil] amino}-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 4-9) en 5,0 ml de THF y se enfrió con agua helada. Se agregó 0,97 ml de una solución 3M bromuro de metilmagnesio (en dietiléter) y la mezcla se agito mientras se enfriaba con agua helada durante 2 horas y a temperatura ambiente durante 20,5 horas. Otros 0,48 ml de una solución de bromuro de metilmagnesio se agregaron y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 67 horas. Luego la mezcla se mezcló con una solución de cloruro de amonio en fase acuosa saturada y se extrajo tres veces con acetato de etilo y los extractos se lavaron con una solución de cloruro de sodio, se filtraron mediante un filtro hidrófobo y se concentraron. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa. Se obtuvieron 111 mg del compuesto del título.
UPLC-MS (método A2): Rt = 0,97 min (Detector de UV: TIC), masa encontrada 396,22.
1H-NMR (400MHz, DMSO-da): 8 [ppm]= 1,15 (s, 6H), 1,64 (s, 6H), 2,00 - 2,08 (m, 2H), 2,61 (s, 3H), 4,41 - 4,59 (m, 3H), 5,92 (s, 1H), 7,50 (dd, 1H), 7,56 (s, 1H), 7,90 - 7,99 (m, 2H), 8,33 (s, 1H), 8,70 (s, 1H), 12,39 (s, 1H).
Ejemplo 21
6-(2-Hidroxipropan-2-il)-N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-2-(4,4,4-trifluorobutil)-2H-indazol-5-il]piridin-2-carboxamida
Figure imgf000041_0001
Una solución de 72 mg (0,16 mmol) de 5-({[6-(2-hidroxipropan-2-il)piridin-2-il]carbonil}amino)-2-(4,4,4-trifluorobutil)-2H-indazol-6-carboxilato (Intermedio 4-7) en 10 ml de THF se enfrió con agua helada. Se agregó 0,26 ml de una solución 3M bromuro de metilmagnesio en dietiléter y la mezcla se agito durante 2 horas y a temperatura ambiente durante 20 horas. Otro 1 ml de una solución 3M de bromuro de metilmagnesio se agregaron y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 24 horas. Se agrego una solución de cloruro de amonio en fase acuosa saturada y se extrajo tres veces con acetato de etilo y los extractos se lavaron con una solución de cloruro de sodio y se concentraron. HPLC preparativa produjo 22 mg (31 % de la teoría) del compuesto del título.
UPLC-MS (método A2): Rt = 1,15 min (Detector de UV: TIC), masa encontrada 464,20.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): 8 [ppm]= 1,56 (s, 6H), 1,64 (s, 6H), 2,07 -2,34 (m, 4H), 4,49 (t, 2H), 5,32 (s, 1H), 6,05 (s, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,87 (dd, 1H), 7,99 - 8,05 (m, 2H), 8,35 (s, 1H), 8,79 (s, 1H), 12,45 (s, 1H).
Ejemplo 22
N-{2-[2-(1-HidroxicidopropN)etM]-6-(2-hidroxipropan-2-M)-2H-mdazol-5-M}-6-(trifluorometM)piridm-2-carboxamida
Figure imgf000041_0002
Primero, se cargó 250 mg (0,69 mmol) de N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-1H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida (Intermedio 5-1) en 5 ml de DMSO. Se agrego 159 mg (0,96 mmol) de 1-(2-bromoetil)ciclopropanol, 285 mg de carbonato de potasio y 171 mg de yoduro de potasio y la mezcla se agito a 100 °C durante 5 horas. Se agrego agua y la mezcla se extrajo tres veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con una solución de cloruro de sodio, luego se filtraron en un filtro hidrófobo y se concentraron. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (columna: Waters XBridge C18 5|j 100x30mm, eluyente A: agua 0,1 % por volumen de ácido fórmico (99 %), eluyente B: acetonitrilo). La liofilización produjo 45 mg del compuesto del título.
1H-NMR (500MHz, DMSO-d6): 8 [ppm]= 0,18 -0,22 (m, 2H), 0,48 -0,52 (m, 2H), 1,62 (s, 6H), 2,08 (t, 2H), 4,54 -4,60 (m, 2H), 5,36 (s, 1H), 5,96 (s, 1H), 7,57 (s, 1H), 8,16 (dd, 1H), 8,34 - 8,39 (m, 2H), 8,45 (d, 1H), 8,72 (s, 1H), 12,36 (s, 1H).
Evaluación de la eficacia fisiológica
Ensayo de inhibición de IRAK4
La actividad inhibidora del IRAK4 de las presentes sustancias se midió según el ensayo IRAK4 TR-FRET (TR-FRET por sus siglas en ingles = resolución temporal- transferencia lineal de energía) que se describirá a continuación.
Se uso como enzima una proteína de fusión recombinante a partir del GST del terminal-N (glutatión S-transferasa) e IRAK4 humana que se expresa en células de insectos infectadas con baculovirus (Hi5, BTI-TN-5B1-4, línea de células que se adquirieron de Invitrogen, catalogo No. B855-02) y se purifico mediante cromatografía de afinidad. El sustrato que se usó para la reacción de quinasa era el péptido biotinilado biotin-Ahx-KKARFSRFAGSSPSQASFAEPG (Terminal-C en forma de amida) puede adquirirse, por ejemplo, de Biosyntan GmbH (Berlin-Buch).
Para el ensayo, se prepararon 11 diferentes concentraciones en el rango de 20 pM a 0,073 nM a partir de una solución de 2 mN DMSO de la prueba de la sustancia. Se colocaron con una pipeta 50 nl de la respectiva solución en una placa de microtitulación negra de fondo plano de 384 cavidades, (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania), se agregó 2 pl de la solución de IRAK4 en un amortiguador de ensayo [50 mM HEPES pH 7,5, 5 mM MgCl2, 1,0 mM diriotreitol, 30 pM ortovanadato de sodio activado, 0,1 % (w/v) de gammaglobulina bovina (BGG) 0,04,% (v/v) nonidet-P40 (Sigma)] y la mezcla se incubo durante 15 minutos para permitir que las sustancias se pre fijaran a la enzima antes de la reacción de quinasa. La reacción quinasa se inició mediante el agregado de 3 pl de la solución de trifosfato de adenosina (ATP, 1,67 mM = concentraciones finales en 5 pl del volumen del ensayo: 1 mM) y un sustrato de péptido (0,83 pM = concentraciones finales en 5 pl del volumen del ensayo: 0,5 pM) en un amortiguador de ensayo y la mezcla resultante se incubo a 22 °C por el tiempo de reacción durante 45 minutos. La concentración del IRAK4 se ajustó a la respectiva actividad de la enzima y el ensayo se llevó a cabo en un rango lineal. Las concentraciones típicas eran de alrededor de 0,2 nM. La reacción se detuvo agregando 5 pl de una solución de TR-FRET de agentes de detención [0,1 pM estreptavidina-XL665 (Cisbio Bioassays; Francia, catalogo No. 610SAXLG)] y 1,5 nM del anticuerpo antifosfoserina [Merck Millipore, "STK Antibody", catalogo No. 35-002] y 0,6 nM del anticuerpo anti-IgG1 de ratón etiquetado con LANCE EU-W1024 (Perkin-Elmer, producto No. AD0077; como alternativa, es posible usar el anticuerpo anti-IgG1 de ratón etiquetado con criptato de terbio de Cisbio Bioassays) en una solución EDTA en fase acuosa (100 mM EDTA, 0,4 % [w/v] albúmina de suero bovino [BSA] en 25 mM HEPES pH 7,5).
La mezcla resultante se incubó a 22 °C durante 1 hora para lograr la formación de un complejo del sustrato fosforilado biotinilado y los reagentes de detención. La cantidad de sustrato fosforilado fue evaluada para medir la transferencia lineal de energía a partir del anticuerpo anti-IgG1 de ratón etiquetado con quelato de europio hasta la estreptavidina-XL665. Para este fin, las emisiones de fluorescencia a 620 nm y 665 nm se midieron luego de excitación a 350 nm en un instrumento que mide TR-FRET, por ejemplo, un Rubystar (BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemania) o un Viewlux (Perkin-Elmer). La relación de las emisiones a 665 nm y 622 nm se tomó como una medida de la cantidad de sustrato fosforilado. La información se normalizó (reacción enzimática sin la prueba de la sustancia = 0 % de inhibición; todos los otros componentes del ensayo, pero sin enzima = 100 % de inhibición). Normalmente, la prueba de sustancias se evaluó en la misma placa de microtitulación a 11 diferentes concentraciones que oscilan de 20 pM a 0,073 nM (20 pM, 5,7 pM, 1,6 pM, 0,47 pM, 0,13 pM, 38 nM, 11 nM, 3,1 nM, 0,89 nM, 0,25 nM y 0,073 nM). Se prepararon las series de diluciones previo al ensayo (2 mM a 7,3 nM en 100 % DMSO) mediante diluciones en serie. Valores IC50 se calcularon mediante un ajuste de 4 parámetros.
Tabla
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La actividad inhibidora de las presentes sustancias de formula general (III) con respecto a IRAK4 se midió de la misma manera en el ensayo IRAK4 TR-FRET que se describió anteriormente. Lo siguiente se menciona a modo de ejemplo: el compuesto Intermedio 4-2 con un C50 = 21,7 nM, Intermedio 4-3 con un IC50 = 13,0 nM e Intermedio 4-4 con un IC50 = 6,2 nM.
Secreción TNF-a en células THP-1
La prueba se adapta para probar sustancias por su habilidad de inhibir la secreción de TNF-a (factor de necrosis tumoral alfa) en células THP-1 (línea celular de leucemia monolítica aguda humana). La TNF-a es una citoquina que aparece en el proceso inflamatorio. En esta prueba, la secreción TNF-a SE DESENCADENA POR MEDIO DE LA INCUBACION CON lipopolisacárido bacteriano.
Las células THP-1 se mantuvieron en un cultivo celular de suspensión continua [RPMI 1460 medio con L-Glutamax (Gibco, Cat. No. 61870-044) enriquecido con suero de ternero bovino (FCS: por sus siglas en inglés) 10 %
(Invitrogen, Cat. No. 10082-147), 1 % penicilina/estreptomicina (Gibco BRL, Cat. No. 15140-114)] no debe exceder la concentración celular de 1x106 células/ml. El ensayo se llevó a cabo en un medio de cultivo celular (RPMI 1460 medio con L-Glutamax enriquecido con FCS 10 %).
En cada caso, se incorporaron 2-2,5 pl de la suspensión celular (correspondiente a 4000 células) por cavidad en una placa de prueba de 384 cavidades (Greiner, Cat. No. 784076), en cada uno de los cuales 40-50 nl de la sustancia se disolvió en 100 % DMSO. Para esto se usaron 10 diferentes concentraciones en un rango que oscila de 20 pM a 0,073 nM por cada sustancia. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos, 2-2,5 pl de 0,1 pg/ml LPS (Sigma, Escherichia coli 055: B5, Cat. No. L5418) disuelto en un medio de cultivo celular (concentraciones finales 0,05 pg/ml) se incorporaron en cada cavidad. Como control neutral, las células fueron tratadas con 0,05 pg/ml LPS y 1 % DMSO, pero como control inhibidor solamente con 1 % DMSO.
Las placas se centrifugaron a 80 g. durante 30 segundos y se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2 y 95 % de humedad atmosférica durante 17 horas. La cantidad de TNF-a se determinó mediante el KIT DE detención TNF-alfa HTRF (Cisbio, Cat. No. 62TNFPEB/C). Para este propósito, para la prueba HTRF (Fluorescencia homogénea de Resolución Temporal) se agregaron 2 pl de la solución de detención en cada caso, que consiste en anti-TNF-a-XL665 conjugado y anti-TNF-a-criptato conjugado disueltos en el amortiguador de reconstitución de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la adición, la mezcla se incubo a temperatura ambiente durante 3 horas o toda la noche a 4 °C. Las señales se leyeron a 620/665 mediante un instrumento de mediación que permite HTRF tales como la BMG PheraStar.
La actividad de las sustancias esta expresada como la relación entre el control inhibidor o neutral en porcentaje. Los valores IC50 se calcularon mediante un ajuste de 4 parámetros.
Ta - -1
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Producción In vitro de citoquinas en células mononucleares de sangre periférica (PBMC: por sus siglas en inglés) humana estimuladas por LPS (lipopolisacárido)
Se examinó el efecto de los compuestos presentes de la Fórmula general (I) en la producción inducida de citoquinas en PBMC humana. La producción de citocinas se estimuló por LPS, un ligando TLR4, los cuales genera la activación de la señalización mediada por IRAK4.
La PBMC humana se obtuvo a partir de sangre humana anticoagulada. Para este fin, se colocaron 15 ml de Ficoll-Paque (Biochrom, Cat. No. L6115) en una pipeta en tubos Leucosep y se agregó 20 ml de sangre humana. Luego de centrifugar la sangre a 800 g durante 15 minutos a temperatura ambiente, se removió y descartó el plasma incluyendo las plaquetas. Las PBMC se transfirieron a tubos de centrifugado y se completó con p Bs (solución salina amortiguada con fosfato) (Gibco, Cat. N.° 14190). La suspensión celular se centrifugo a temperatura ambiente a 250 g durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. Las PBMC se suspendieron en medio completo (RPMI 1640, sin L-glutamina (PAA, Cat. No. E15-039), 10 % FCS; 50 U/ml penicilina, 50 pg/ml estreptomicina (PAA, Cat. No. P11-010) y 1 % L-glutamina (Sigma, Cat. No. G7513)).
El ensayo se llevó a cabo en medio completo. Las PBMC se plantaron en placas de 96 cavidades a una densidad celular de 2,5x105 celular/cavidad. Los compuestos presentes se sometieron a dilución en serie en un volumen constante de 100 % DMSO y se utilizaron en el ensayo a 8 diferentes concentraciones que oscilan de 10 pM a 3 nM de manera tal que la concentración final de DMSO fue de 0,4 % DMSO. Antes de la estimulación, las células se incubaron con aquella durante 30 minutos. Para inducir la secreción de citoquina, las células se estimularon con 0,1 pg/ml LPS (Sigma, Escherichia coli 0128:B12, Cat. No. L2887) durante 24 horas. El ensayo de viabilidad celular se determinó por luminiscencia CellTiter-Glo® (Promega, Cat. No. G7571 (G755/G756A)) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cantidad de TNF-a secretada en el sobrenadante del cultivo celular se determinó mediante el kit Human ProInflammatory 9-Plex Tissue Culture (MSD, Cat. No. K15007B) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A modo de ejemplo, el Ejemplo del Compuesto 11 y el Ejemplo del Compuesto 12 tiene actividad < 1 pM.
Secreción In vitro de interleuquina (IL)-23 de células dendrítica humana (Dc) estimulada por TLR-4/TLR-7
Se examino el efecto en DC humana de los compuestos presentes de la Fórmula general (I) en la producción inducida de la citoquina proinflamatoria IL-23 la cual tiene un papel fundamental en la generación de células TH-17. Cabe destacar que las células TH-17 cumplen una función esencial en la patogénesis de trastornos tales como artritis reumatoide, artritis psoriásica, enfermedad de Bekhterev (espondilitis anquilosante) o también esclerosis múltiple (Lubberts, Nat. Rev. Rheumatol., 2015; Marinoni et al., Auto. Immun. Highlights, 2014; Isailovic et al., J. Autoimmun., 2015; Staschke et al., J Immunol., 2009). Para detectar el efecto de los compuestos presentes en la producción de IL-23, monocitos humanos primarios (aislamiento a partir de PBMC humana mediante la separación magnética [Miltenyi Biotech, Monocyte Isolation Kit, Cat. No. 130-091-153] y mediante la adición de factores de crecimiento (GM-CSF humana recombinante [PeproTech, Cat. No. 300-03] y iL-4 [PeproTech, Cat. No. 200-04]) en medio completo (VLE (endotoxina muy baja) Rp M i 1640 [Biochrom AG, Cat. No. FG1415], 10 % Suero bovino Fetal (FBS) [Gibco, Cat -No.
10493-106]; 50 pM P-mercaptoetanol (Gibco, Cat. No. 31350], 50 U/ml penicilina y estreptomicina [Gibco, Cat. No.
15140-114]) se diferenciaron en cultivo durante 6 días hasta DC. Luego de cultivar las DC, se suspendieron en un medio completo y se plantaron en una densidad celular de 2x105 celular/cavidad en una placa de 96 cavidades (Costar, Cat. N.° 3599). Los compuestos presentes se sometieron a dilución en serie en un volumen constante de 100 % DMSO y se utilizaron en el ensayo a 9 diferentes concentraciones que oscilan de 10 pM a 1 nM. Se aseguro que la concentración DMSO presente siempre estuviera a 0,1 % DMSO para cada una de las 9 concentraciones usadas. Con los compuestos presentes las DC se sometieron a 30 minutos de preincubación. En adelante, las DC se estimularon para producir IL-23 por adición de 10 ng/ml LPS (Sigma, Escherichia coli serotype 0127:B8, Cat. No. L3129) (TLR4 ligando) y 2,5 pg/ml de TLR-7/8 ligando R848 (Invivogen, Cat. No. Tlrl-r848-5) ambas activan la vía de señalización mediada por IRAK4 en un incubador (37 °C, 95 %rH, 5 % CO2) durante 24 horas. Luego del tiempo de incubación de 24 horas, los sobrenadantes se cultivaron y se analizaron mediante un hIL-23 ELISA disponible en el comercio (eBiosciences, Cat. No. 88-7237-88), lo cual se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante. Los resultados de la inhibición de IL-23 en las DC humana se muestran a modo de ejemplo para el Ejemplo del Compuesto 12 en la Figura 1.
Producción In vitro de IFN en células dendríticas plasmocitoides (pDC) humana estimuladas apor TLR-7/8- o TLR-9
Con la ayuda de esta prueba, se puede estudiar el efecto de los compuestos presentes de la Fórmula general (I) sobre la producción de IFN a (interferón alfa) en pDC humana, una citoquina clave en la patogénesis de lupus eritematoso sistémico(Mathian et al., Arthritis Rheum, 2009; Crow M.K., Rheum Dis Clin N Am, 2010), Para este fin, las PBMC humana se aislaron de la sangre tal como se describió anteriormente y las DC plasmocitoides se aislaron a partir de estas mediante el kit de separación de células disponible en el comercio (Miltenyi Biotech, Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, Cat. No. 130-097-415). Las pDC obtenidas se volvieron a suspender en un medio completo (RPMI 1640 GlutaMax [Gibco, Cat. No. 61870-010] enriquecido con 10 % FBS [Gibco, Cat. 10493-106) y 50 mM penicilina/estreptomicina (Gibco, Cat. No. 15140-114]) y se plantaron a una densidad celular de 5x104 células/cavidad en una placa de microtitulación de 96 cavidades (Costar, Cat. N.° 3599). Los compuestos presentes se sometieron a dilución en serie en un volumen constante de 100 % DMSO y se utilizaron en el ensayo a 9 diferentes concentraciones que oscilan de 10 pM a 1 nM. Se aseguro que la concentración DMSO presente siempre estuviera a 0,1 % DMSO para cada una de las 9 concentraciones que se analizaron. Con los compuestos presentes las pDC se sometieron a 30 minutos de preincubación. Las DC se estimularon con un ligando de TLR7/8 (imiquimod, R837, Invivogen, Cat. No. tlrl-imq) o con un ligando de TLR-9 (CPG-A, ODN2216, Invivogen, Cat. No. Tlrl-2216-1) y esto generó la vía de señalización mediada por IRAK4. Luego de incubación durante 24 horas, se removieron y analizaron los sobrenadantes de cultivo celular mediante IFN humano disponible en el comercio a ELISA (IFNalpha Multi-Subtype ELISA Kit, pbl Assay Science, Cat. N.° 41105 -1). Los resultados de la inhibición de las DC humana de IFN a se muestran a modo de ejemplo para el Ejemplo del Compuesto 12 en la Figura 2.
Modelo In vivo de inflamación mediada por TLR
Los compuestos de la Fórmula general (I) se examinaron por su eficacia in vivo en un modelo de inflamación In vivo mediada por TLR. En particular, este modelo mecanicista muestra el efecto potencial de los compuestos presentes en patologías mediadas por TLR4 ya que se utilizó un modelo de inflamación mediado por LPS. En este modelo, se dividieron en grupos de 5 animales cada uno de ratones hembras Balb/c (8 semanas de edad; Charles River Laboratories, Alemania) El grupo de control se trató con vehículo en el cual la sustancia se había disuelto (sustancia vehículo) y además con vehículo en el cual se había disuelto LPS. Los grupos de tratamiento con sustancia como el grupo de control positivo recibió una dosis de 0,2 mg LPS/kg de peso corporal (Sigma, Cat. No. L4391) lipopolisacáridos a partir de E. coli 0111:B4) intraperitoneal (i.p.). Además, el grupo de control positivo se trató con la sustancia vehículo antes mencionada. La sustancia se administró de forma oral 16 horas antes de producir la inducción de inflamación mediante la administración de LPS. Para examinar el efecto de los compuestos presentes en la inflamación, se tomaron muestras de sangre de los animales después de 1,5 hora. La concentración de citoquinas particulares en el plasma se determinó mediante el kit Ratón ProInflammatory 7-Plex Tissue Culture (MSD, Cat. No. K15012B) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los inhibidores IRK4 son efectivos en el modelo de inflamación mediada por TLR. La Figura 3 muestra la cantidad de TNF-a en el plasma, la cual se reduce de manera dependiente de la dosis mediante la administración del Ejemplo del Compuesto 11 en comparación con la concentración inducida por LPS.
Modelo In vivo de inflamación mediada por IL-1p
Para evaluar la eficacia potencial de los compuestos de la Fórmula general (I) en patologías mediadas por IL-1p, se administró i.p de IL-1p a ratones hembra Balb/c (8 semanas de edad, Charles River Laboratories, Alemania) y se examinó el efecto de los compuestos presentes en la secreción de citoquina mediada por IL-1p. Había 5 animales en cada grupo. El grupo de control se trató con el vehículo que se usó para disolver la sustancia y el IL-1p. Los grupos de tratamiento con sustancia y el grupo de control positivo fueron administrados i.p. con 90 pg IL-1p /kg peso corporal. (R&D, Cat. No. 401-ML/CF). La sustancia o su vehículo en el grupo de control positivo se administró 6 horas antes de la administración del IL-1p. Luego de 2 horas de la administración del IL-1p, se determinó la TNF-a en el plasma aislado de la sangre mediante el kit Mouse ProInflammatory 7-Plex Tissue Culture Kit (MSD, Cat. No. K15012B) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La administración de IL-1p generó una concentración elevada de TNF-a en el plasma la cual se inhibió mediante el tratamiento con el Ejemplo del Compuesto 11 y 12. Esto se ilustra en la Figura 4.
Modelo in vivo de artritis inducida por colágeno.
Para determinar la actividad anti inflamatoria de los compuestos de la Fórmula general (I), se examinó la eficacia del modelo in vivo de artritis inducida. Para este fin, se les administró a las ratas macho Lewis (de aproximadamente 100­ 125 g, Charles River Laboratories, Alemania) 100 pl de una solución adyuvante completo de Freund (CFA: por sus siglas en inglés) (M. tuberculosis H37Ra [Difo Lab, Cat. No. -231141] disueltos en un adyuvante incompleto de Freund [Difco Lab, Cat. No. -263910]) en el músculo de la cola por vía subcutánea el día 0. Había 8 ratas en cada grupo. Un grupo de control sano y un grupo de control con enfermedad fueron incluidos en el estudio. A cada grupo de control se le administró el tratamiento p.o. Con el vehículo de la prueba de la sustancia. El tratamiento con distintas dosis de la prueba de la sustancia se llevó a cabo de manera preventiva, es decir, empezando del día 0, mediante administración oral. En el día 0, las condiciones de los animales se determinaron según el índice de actividad de la enfermedad (índice de la gravedad de artritis según un sistema de puntos). Los puntos se asignaron según el alcance de la inflamación de la articulación 0 a 4 por la presencia de un eritema que incluye articulación inflamada (0 = ninguna; 1 = Leve; 2 = moderada; 3 = distintivo; 4 = grave) para las patas traseras y agregados. Para determinar la eficacia de los compuestos anti inflamatorios, la actividad de la enfermedad de los animales se asignó mediante un sistema de puntos a partir del día 8 cuando los animales empezaron a mostrar señales de artritis y, a continuación, 3 veces por semana hasta el final (día 20). Un sistema estadístico se realizó a partir del análisis de virianza de factor individual (ANOVA: por sus siglas en ingles) y de la comparación del grupo de control mediante el análisis comparativo múltiple (Dunnett's test).
La administración de CFA en ratas produjo artritis aguda con inflamación distintiva de la articulación en ratas. Esta artritis inducida se inhibió mediante el tratamiento con el Ejemplo del Compuesto 11. Esto se ilustra en la Figura 5.
Modelo in vivo de artritis inducida por anticuerpo de colágeno en ratones.
Se examinó el efecto anti inflamatorio de los compuestos de la Fórmula general (I) en un modelo murino de artritis. Para este fin, cada ratón femenino Balb/c (aproximadamente de 9 semanas de edad, Charles River Laboratories, Kingston, Canadá) recibieron vía inyección intravenosa en el día 0 con 200 pl de un cóctel de anticuerpos que contenía colágeno (10 mg/ml; ArthritoMab, MD Bioproducts) en la vena de la cola (excepto por el grupo de control en este estudio). En el día 6, cada uno de los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 200 pl de LPS. Había 10 ratones en cada grupo. Un grupo de control sano y un grupo de control con enfermedad fueron incluidos en el estudio. A cada grupo de control se le administró el tratamiento p.o. Con el vehículo de la prueba de la sustancia. El tratamiento con distintas dosis de la prueba de la sustancia se llevó a cabo de manera preventiva, es decir, empezando del día 0, mediante administración oral. Durante el curso del experimento, el alcance de la enfermedad recibió una puntación según un sistema de puntos para la actividad de la enfermedad en las cuatro patas. En esta entrega de puntos, las patas sanas no reciben puntos, mientras que se entregan los puntos a partir de 1 [inflamación suave, por ejemplo, del (los) pie(s)] a 4 [inflamación grave que alcanza toda la pata] en cada caso según el alcance particular de la inflamación en la articulación que aparece a partir del pie por el metatarso hasta la articulación del tobillo, como se explica a continuación:
• 0 = normal
• 1 = eritema e inflamación suave localizada en el tarsiano o tobillo o pie
• 2 = eritema e inflamación suave desde el tobillo al metatarso (2 segmentos)
• 3 = eritema e inflamación moderada desde el tobillo hasta la articulación del metatarso.
• 4 = eritema e inflamación aguda que comprende el metatarso, pie y dedos.
Para estos parámetros, las condiciones se determinaron de antemano un día antes del comienzo del experimento (día -1) y este puntaje de actividad de la enfermedad recibió puntos 3 veces por semana a partir del día 8 en adelante. Un sistema estadístico se realizó a partir del análisis de virianza de factor individual (ANOVA: por sus siglas en ingles) y de la comparación del grupo de control mediante el análisis comparativo múltiple (Dunnett's test).
La administración i.v. de un cóctel de anticuerpos que contenía colágeno que incluye la siguiente administración i.p. de LPS en ratones lo que genera artritis aguda con inflamación distintiva de las articulaciones. Esta artritis inducida se inhibió mediante el tratamiento con el Ejemplo del Compuesto 12. Esto se ilustra en la Figura 6.
Modelo In vivo de NASH en ratón
Para inducir NASH con un experimento, se inyectaron 200 pg estreptozocina (STZ; Sigma-Aldrich, USA) por vía subcutánea en 45 ratones machos C57BL/6 de 2 días. En las primeras 4 semanas, estos animales son alimentados a voluntad con una dieta con alto contenido graso (HFD; 57 cal% grasa, #HFD32 de CLEA, Japón). En la semana 6, los animales son randomizados en 3 grupos (de 15 animales cada grupo). Mientras que uno de los grupos no recibe algún tratamiento, a los otros dos grupos se les administra de manera oral el vehículo o la sustancia de prueba durante 4 semanas. Luego de 4 semanas de tratamiento, todos los animales son sacrificados sin dolor con anestesia y los hígados fueron removidos y fijados para los estudios histológicos en la solución Bouin's (H. Denk, "Fixierung histologischer Praparate" [Fixing of Histological Preparations], en: P. Bock (ed.): "Romeis Mikroskopische Technik" [Romei's Microscopy Techniques], Urban & Schwarzenberg, Munich-Vienna-Baltimore 1989, 17th edition, página 97, ISBN 3-541-11227-1). Luego, las muestras de los hígados se incrustaron en parafina y se realizan secciones en parafina de 5 pm. Las secciones histológicas de cada hígado se tiñen a) para determinar el índice de actividad de NAS con hematoxilina eosina (HC) y b) para determinar la fibrosis del hígado con picro-rojo sirio (Waldeck, Alemania). El índice de actividad de NAFLD se determina en las secciones hematoxilina eosina según el criterio recomendado por D.E. Kleiner et al., Hepatology 41 (2005), 1313-1321 (Tabla 1). Para la cuantificación histológica de las áreas fibróticas, se toman 5 fotos digitales (DFC280; Leica, Alemania) por cada sección con un microscopio compuesto con 200 aumentos y el porcentaje de la fibrosis se determina con el programa ImageJ (National Institute of Health, USA).
Modelo In vivo en ratón db/db
Se utilizaron 30 ratones db/db machos de 8 semanas de edad. Este es un modelo muy aceptado para obesidad, resistencia a la insulina y diabetes clase 2 (Aileen JF King; The use of animal models in diabetes research; British Journal of Pharmacology 166 (2012), 877-894). Durante este experimento, los animales recibieron una dieta estándar (RM1(E) 801492, SDS) y agua corriente a voluntad. Los animales fueron randomizados en 3 grupos (10 animales por grupo) y se les administró de forma oral la sustancia de prueba durante 6 semanas. Durante el periodo de prueba, se tomaron muestras de sangre de los animales en distintas etapas (antes de comenzar el tratamiento, 3 semanas después del comienzo del tratamiento y 2 días antes de terminar el tratamiento) para determinar los parámetros de sensibilidad a la insulina (e.g. HbA1c, contenido de glucosa, contenido de insulina). Además, un OGTT (prueba oral de tolerancia a la glucosa) como parámetro para determinar la sensibilidad a la insulina se lleva a cabo un día antes de comenzar el tratamiento y dos días antes de terminar el tratamiento. Además, se calcula el índice HOMA-IR (niveles de insulina en ayunas (mU/l) * niveles de glucosa en ayunas (mmol/l) / 22,5).
Modelo In vivo de xenotrasplante asociado a linfoma de células p
Se examinó el efecto antitumoral de los compuestos de la Fórmula general (I) en modelos murino de xenotrasplante. Para este fin, ratones femeninos C.B-17 SCID se implantaron por vía subcutánea con líneas celulares humana de linfoma de células B, por ejemplo, TMD-8. En un tamaño medio de tumor de 20-30 mm2, se comienza con un tratamiento mono terapéutico vía oral con un compuesto presente o por administración de un compuesto junto con una terapia estándar, cada una vía oral. Sin embargo, los animales son randomizados de antemano. Este tratamiento se finaliza cuando el grupo de control sin tratar tiene tumores grandes. El tamaño del tumor y el peso corporal se determinan tres veces por semana. La pérdida de peso corporal se mide por un tratamiento que se relación con la toxicidad (> 10 % = critica, se detiene el tratamiento hasta la recuperación, > 20 % = tóxico, finalización). El área del tumor se detecta con un calibre digital electrónico [alto (mm) x ancho (mm)]. Al finalizar el estudio, también se determina el peso del tumor. La eficacia del anti tumor define la relación peso tumor del tratamiento con el control (T/C) [peso del tumor del grupo de tratamiento día X/peso del tumor del grupo de control día X] o la relación del área tumoral. del tratamiento con el control [área tumoral del grupo de tratamiento día X/área tumoral del grupo de control día X] Un compuesto que tiene T/C mayor a 0,5 se considera activo (eficaz). Un sistema estadístico se realizó a partir del análisis de virianza de factor individual ANOVA (por sus siglas en ingles) y de la comparación del grupo de control mediante el análisis comparativo por pares (Dunnett's test).
Ensayo de quinasa de IRAK4 canina
La actividad inhibidora del IRAK4 de los compuestos presentes en IRAK4 canina se midió en el ensayo TR-FRET (TR-FRET= resolución temporal- transferencia lineal de energía) mencionado anteriormente.
Se uso como enzima una proteína de fusión recombinante a partir del HIS del terminal-N (Polihistidina) y IRAK4 canina que se expresa en células de insecto infectadas con baculovirus (Hi5, BTI-TN-5B1-4, línea de células que se adquirieron de Invitrogen, catalogo No. B855-02) y se purifico mediante cromatografía de afinidad. El sustrato que se usó para la reacción de quinasa era el péptido biotinilado biotin-Ahx-KKARFSRFAGSSPSQASFAEPG (Terminal-C en forma de amida) el cual puede adquirirse, por ejemplo, de Biosyntan GmbH (Berlin-Buch).
Para el ensayo, se prepararon 11 diferentes concentraciones en el rango de 20 pM a 0,073 nM a partir de una solución de 2 mN de la prueba de la sustancia DMSO. Se colocaron con una pipeta 50 nl de la respectiva solución en una placa de microtitulación negra de fondo plano de 384 cavidades, (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania), se agregó 2 pl de la solución de Irak4 en un amortiguador de ensayo [50 mM HEPES pH 7,5, 5 mM MgCl2, 1,0 mM diriotreitol, 30 pM ortovanadato de sodio activado, 0,1 % (w/v) de gammaglobulina bovina (BGG) 0,04 % (v/v) nonidet-P40 (Sigma)] y la mezcla se incubo durante 15 minutos para permitir que las sustancias se pre fijaran a la enzima antes de la reacción de quinasa. La reacción quinasa se inició mediante el agregado de 3 pl de la solución de trifosfato de adenosina (ATP, 1,67 mM = concentraciones finales en 5 pl del volumen del ensayo: 1 mM) y sustrato de péptido (0,83 pM = concentraciones finales en 5 pl del volumen del ensayo: 0,5 pM) en un amortiguador de ensayo y la mezcla resultante se incubo a 22 °C por el tiempo de reacción durante 45 minutos. La concentración del Irak4 se ajustó a la respectiva actividad de la enzima y de tal manera que el ensayo se llevó a cabo en un rango lineal. Las concentraciones típicas eran de alrededor de 0,1 nM. La reacción se detuvo agregando 5 pl de una solución de TR-FRET de agentes de detención [0,1 pM estreptavidina-XL665 (Cisbio Bioassays; Francia, catalogo No. 610SAXLG)] y 1,5 nM del anticuerpo anti-fosfoserina [Merck Millipore, "STK Antibody", catalogo No. 35-002] y 0,6 nM del anticuerpo anti-IgG1 de ratón etiquetado con LANCE EU-W1024 (Perkin-Elmer, producto No. AD0077; como alternativa, es posible usar el anticuerpo anti-IgG1 de ratón etiquetado con criptato de terbio de Cisbio Bioassays) en una solución EDTA en fase acuosa (100 mM EDTA, 0,4 % [w/v] albúmina de suero bovino [BSA] en 25 mM HEPES pH 7,5).
La mezcla resultante se incubó a 22 °C durante 1 hora para lograr la formación de un complejo del sustrato fosforilado biotinilado y los reagentes de detención. La cantidad de sustrato fosforilado fue evaluada para medir la transferencia lineal de energía a partir del anticuerpo anti-IgG1 de ratón etiquetado con quelato de europio hasta la estreptavidina-XL665. Para este fin, las emisiones de fluorescencia a 620 nm y 665 nm se midieron luego de excitación a 350 nm en un instrumento que mide TR-FRET, por ejemplo, un Rubystar (BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemania) o un Viewlux (Perkin-Elmer). La relación de las emisiones a 665 nm y 622 nm se tomó como una medida de la cantidad de sustrato de sustrato fosforilado. La información se normalizo (reacción enzimática sin la sustancia d prueba = 0 % de inhibición; todos los otros compuestos, pero sin enzima = 100 % de inhibición). Normalmente, la prueba de sustancias se evaluó en la misma placa de microtitulación a 11 diferentes concentraciones que oscilan de 20 pM a 0,073 nM (20 pM, 5,7 pM, 1,6 pM, 0,47 pM, 0,13 pM, 38 nM, 11 nM, 3,1 nM, 0,89 nM, 0,25 nM y 0,073 nM). Se prepararon las series de diluciones previo al ensayo (de 2 mM a 7,3 nM en 100 % DMSO) mediante diluciones en serie. Los valores IC50 se calcularon mediante un ajuste de 4 parámetros.
Tabla 3: Valores ICso-apartir de dos experimentos de compuestos ejemplos en el ensayo de quinasa de IRAK4 canina
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Producción de citoquina in vitro en células mononucleares de sangre periférica canino (PBMC) estimuladas por lipopolisacárido (LPS)
Se examinó el efecto de los compuestos presentes de la Fórmula general (I) en la producción de citoquinas en PBMC canino. Se indujo la producción de citocinas por LPS, ligando de TLR4 lo que genero la activación de la señal mediada por IRAK 4.
Las PBMC canino se obtuvieron a partir de sangre anticoagulada de perro. Para este fin, se preparó plasma canica rica en leucocitos a partir de 15 ml de sangre de perro mediante centrifugación a 400 g durante 15 minutos a 4 °C, después cultivo y luego se obtuvo la suspensión de la PMBC canino y la capa leucocitoma en el plasma. Siete (7) ml Ficoll-Paque Plus (Fischer Scientific, Cat. No. 11778538) se colocaron con una pipeta en un tubo de centrifugación y 7 ml de plasma rica en leucocitos se colocaron en capas sobre el Ficoll-Paque Plus. Luego de la centrifugación del tubo a 400 g durante 20 minutos a 4 °C, las PBMC canino se cultivaron a partir de la interfase del plasma canino y del Ficoll-Paque Plus. Las PBMC de transfirieron a un tubo de centrifugación fresco y se agregó con 1X solución salina equilibrada Hanks (HBSS) sin Ca2+/Mg2+
(Sigma-Aldrich, Cat. No. H9394). La suspensión celular se centrifugo a 400 g durante 5 minutos a 4 °C y se descartó el sobrenadante. El pelet celular se volvió a suspender en 0,2 % salina hipotónica para lisar cualquier rastro de glóbulos rojos. Luego de 30 segundos la suspensión celular se volvió isotónica y se centrifugó a 400 g durante 5 minutos a 4 °C. El pelet celular se volvió a suspender en HBSS sin Ca2+/Mg2+ para un lavado final y se centrifugó a 400 g durante 5 minutos a 4 °C. Las PBMC se volvieron a suspender en un medio completo (RPMI 1640, con GlutaMAX (Sigma-Aldrich, Cat. No. R0883), 10 % FCS; 50 U/ml penicilina, 50 pg/ml estreptomicina (Sigma-Aldrich, Cat. No. P4333)).
El ensayo se llevó a cabo en medio completo. Las PBMC se plantaron en placas de 96 cavidades a una densidad celular de 2,5 x 105 celular/cavidad. Los compuestos presentes se disolvieron en DMSO y fueron sometidos a dilución en serie en un medio completo. Los compuestos se utilizaron en el ensayo a 8 diferentes concentraciones que oscilan de 3 nM a 10 pM de manera tal que la concentración final de DMSO fue de 0,0003- 0,4 %. Para inducir la secreción de citocina, se estimularon las células con 0,1 pg/ml LPS (Sigma-Aldrich, Escherichia coli 0111:B4, Cat. No. L3024) durante 24 horas. Se determinó la viabilidad celular mediante el uso de 0,2 % de azul de tripano (Sigma-Aldrich, Cat. No. T8154). La cantidad de TNF-a secretada en el sobrenadante del cultivo celular se determinó mediante NFa DuoSet Elisa (R&D Systems, Cat. No. DY1507) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A modo de ejemplo, el Ejemplo del Compuesto 12 inhibió la producción de TNFa mediante la PBMC canino estimulada con LPS. Esto se ilustra en la Figura 7.
Producción de citoquina in vitro en células mononucleares de sangre periférica bovino (PBMC) estimuladas por lipopolisacárido (LPS)
Se examinó el efecto de los compuestos presentes de la Fórmula general (I) en la producción inducida de citocinas en PBMC bovino. Se indujo la producción de citocinas por LPS, ligando de TLR4 lo que genero la activación de la señal mediada por IRAK 4.
Las PBMC bovino se obtuvieron a partir de sangre de ganado bovino anticoagulada. Para este fin, se preparó plasma de bovino rica en leucocitos a partir de 500 ml de sangre de ganado bovino mediante centrifugación a 1000 g durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA), después cultivo y luego se obtuvo la suspensión de la PMBC bovino y la capa leucocítica de un volumen igual de PBS/5 mM EDTA (TA). Treinta (30) ml Ficoll-Paque Plus (Fischer Scientific, Cat. No. 11778538) se colocaron con una pipeta en un tubo Leucosep y 30 ml de la mezcla de PBMC bovino capa leucocítica /PBS/EDTA se colocaron en capas sobre el Ficoll-Paque Plus. Luego de la centrifugación del tubo a 800g durante 25 minutos a RT, las PBMC bovino se cultivaron a partir de la interfase del plasma bovino y del Ficoll-Paque Plus. Las PBMC se transfirieron a un tubo de centrifugado fresco y se mezcló con PBS/ 5 mM EDTA frio. La suspensión celular se centrifugo a 350g durante 10 minutos a 4 °C y se descartó el sobrenadante. El pelet celular se volvió a suspender en 0,2 % salina hipotónica para lisar cualquier rastro de glóbulos rojos. Luego de 30 segundos la suspensión celular se volvió isotónica y se centrifugó a 500g durante 5 minutos a 4 °C. Las pelet celular PBMC luego se volvieron a suspender en un medio completo (DMEM con GlutaMAX (ThermoFisher, Cat. No. 32430100), 10 % de suero de caballo (ATCC® 30-2040™), 20 |jM 13-mercaptoetanol (ThermoFisher Cat. No. 31350010 [solución de reserva: 50 mM).
El ensayo se llevó a cabo en medio completo. Las PBMC se plantaron en placas de 24 cavidades a una densidad celular de 1x106 celular/cavidad. Los compuestos presentes se disolvieron en DMSO y fueron sometidos a dilución en serie en un medio completo. Los compuestos de ejemplos se utilizaron en el ensayo a 8 diferentes concentraciones que oscilan de 0,003 j M a 10 |jM de manera tal que la concentración final de DMSO fue de 0,5 %. Para estimular la secreción de citocina, las células fueron estimuladas con 1 jg/m l (Fig. 8) y 0,1 jg/m l LPS (Fig. 9) (LPS de E. coli K12; Invivogen # tlrl-eklps) durante 24 horas. Se determino la viabilidad celular mediante una solución Türk (Merck Millipore # 1092770100).
La cantidad de TNFa secretada en el sobrenadante del cultivo celular de la PBMC bovino expuesta a LPS se determinó mediante el uso de anticuerpos TNFa anti bovino en conejos con base en la lectura de ELISA. El ensayo ELISA se realizó en platos ELISA de 384 cavidades, que se recubrieron con 5 jg/m l del anticuerpo TNFa anti bovino en conejos (BioRad, AHP2383) en 50 mM de amortiguador Na2CO3/NaHCO3 pH 9,6 en 10 jl/cavidad durante la noche a 4 °C. Luego de remover el anticuerpo y enjuagar las cavidades tres veces con 50 j l del amortiguador de lavado (PBS, 0,05 % (v/v) Tween 20), las cavidades se incubaron durante 90 minutos a 37 °C con 40 j l del amortiguador de bloqueo (PBS, 0,05 % (v/v) Tween 20, 1 % (w/v) albúmina de suero bovino). Luego, se removió el amortiguador de bloqueo y se agregaron muestras del sobrenadante de cultivo (20 jl/well). Luego de incubación durante 90 minutos a 37 °C, se removieron las muestras y las cavidades se enjuagaron tres veces con 50 j l del amortiguador de lavado. Se agrego a las placas (20 jl/cavidad) un 1 jg/m l del anticuerpo conjugado TNFa-biotina anti bovino en conejos (BioRad, AHP2383B) en un amortiguador de bloqueo, el cual se incubó durante 60 minutos a 37 °C. Luego de remover el anticuerpo biotinilado y enjugar las cavidades con 50 j l del amortiguador de lavado tres veces, se agregó 20 jl/cavidad de fosfatasa alcalina ExtrAvidin™-(Sigma, E2636), 1 :10.000 diluida en el amortiguador de bloqueo, durante una hora a 37 °C. Luego de remover la fosfatasa alcalina ExtrAvidin™ y enjugar tres veces las cavidades con amortiguador de lavado, el desarrollo de la reacción/color enzimático se inició agregando 50 jl/cavidad de amortiguador de desarrollo (5 mM fosfatasa para-nitrofenilo (pNPP) en 50 mM Na2CO3/NaHCO3 pH 9,6, 2 mM MgCh). Se registro la densidad óptica a 405 nm longitud de onda. Se registraron puntos de información para mediciones cinéticas cada 5 minutos durante una hora, las mediciones del criterio de valoración se tomaron durante dos horas. A modo de ejemplo, el Ejemplo del Compuesto 12 inhibió la producción de TNFa mediante la PBMC bovino estimulada con LPS. Esto se muestra en la Figuras 8 y 9.
Producción de citoquina in vitro en células mononucleares de sangre periférica porcino (PBMC) estimuladas por lipopolisacárido (LPS)
Se examinó el efecto de los compuestos presentes de la Fórmula general (I) en la producción inducida de citocinas en PBMC porcino. Se indujo la producción de citocinas por LPS, ligando de TLR4 lo que generó la activación de la señal mediada por IRAK 4.
Las PBMC porcino se obtuvieron a partir de sangre de porcino anticoagulada. Para este fin, se preparó plasma de porcino rica en leucocitos a partir de 36 ml de sangre de ganado porcino mediante centrifugación a 1000 g durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA), después cultivo y luego se obtuvo la suspensión de la PMBC porcino y la capa leucocítica de un volumen igual de PBS/5 mM EDTA (TA). Treinta (30) ml Ficoll-Paque Plus (Fischer Scientific, Cat. No. 11778538) se colocaron con una pipeta en un tubo Leucosep y 30 ml de la mezcla de PBMC bovino capa leucocitica/PBS/EDTA se colocaron en capas sobre el Ficoll-Paque Plus. Luego de la centrifugación del tubo a 800g durante 25 minutos a RT, las PBMC porcino se cultivaron a partir de la interfase del plasma porcino y del Ficoll-Paque Plus. Las PBMC se transfirieron a un tubo de centrifugado fresco y se mezcló con PBS/ 5 mM EDTA frio. La suspensión celular se centrifugo a 350g durante 10 minutos a 4 °C y se descartó el sobrenadante. El pelet celular se volvió a suspender en 0,2 % salina hipotónica para lisar cualquier rastro de glóbulos rojos. Luego de 30 segundos la suspensión celular se volvió isotónica y se centrifugó a 500g durante 5 minutos a 4 °C. Las pelet celular PBMC luego se volvieron a suspender en un medio completo (DMEM con GlutaMAX (ThermoFisher, Cat. No. 32430100), 10 % de suero de caballo (ATCC® 30-2040™), 20 j M 13-mercaptoetanol (ThermoFisher Cat. No. 31350010 [solución de reserva: 50 mM).
El ensayo se llevó a cabo en medio completo. Las PBMC se plantaron en placas de 24 cavidades a una densidad celular de 1x106 celular/cavidad. Los compuestos presentes se disolvieron en DMSO y fueron sometidos a dilución en serie en un medio completo. Los compuestos de ejemplos se utilizaron en el ensayo a 8 diferentes concentraciones que oscilan de 0,003 j M a 10 j M de manera tal que la concentración final de DMSO fue de 0,5 %. Para estimular la secreción de citocina, las células fueron estimuladas con LPS (LPS de E. coli K12; Invivogen # tlrl-eklps) en una concentración que oscila de 0,01 a 1 ng/ml durante 24 horas. Se determino la viabilidad celular mediante una solución Türk (Merck Millipore # 1092770100).
La cantidad de TNFa secretada en el sobrenadante del cultivo celular de la PBMC porcino expuesta a LPS se determinó mediante el uso de anticuerpos TNFa anti porcino en conejos con base en la lectura de ELISA. El ensayo ELISA se realizó en platos ELISA de 384 cavidades, que se recubrieron con 3 jg/m l del anticuerpo TNFa anti porcino en conejos (BioRad, AHP2397) en 50 mM de amortiguador Na2CO3/NaHCO3 pH 9,6 en 10 jl/cavidad durante 48 horas a 4 °C. Luego de remover el anticuerpo y enjuagar las cavidades tres veces con 50 |jl del amortiguador de lavado (PBS, 0,05 % (v/v) Tween 20), las cavidades se incubaron durante 60 minutos a 37 °C con 50 j l del amortiguador de bloqueo (PBS, 0,05 % (v/v) Tween 20, 1 % (w/v) albúmina de suero bovino). Luego, se removió el amortiguador de bloqueo y se agregaron muestras del sobrenadante de cultivo (20 jl/well). Luego de incubación durante 90 minutos a 37 °C, se removieron las muestras y las cavidades se enjuagaron tres veces con 50 j l del amortiguador de lavado. Se agrego a las placas (20 jl/cavidad) un 0,25 jg/m l del anticuerpo conjugado TNFa-biotina anti porcino en conejos (BioRad, AHP2397B) en un amortiguador de bloqueo, el cual se incubó durante 60 minutos a 37 °C. Luego de remover el anticuerpo biotinilado y enjugar las cavidades con 50 j l del amortiguador de lavado tres veces, se agregó 20 jl/cavidad de fosfatasa alcalina ExtrAvidin™-(Sigma, E2636), 1:10.000 diluida en el amortiguador de bloqueo, durante una hora a 37 °C. Luego de remover la fosfatasa alcalina ExtrAvidin™ y enjugar tres veces las cavidades con 50 j l de amortiguador de lavado, el desarrollo de la reacción/color enzimático se inició agregando 90 jl/cavidad de amortiguador de desarrollo (5 mM fosfatasa para-nitrofenilo (pNPP) en 50 mM Na2CO3/NaHCO3 pH 9,6, 2 mM MgCh). Se registro la densidad óptica a 405 nm longitud de onda. Se registraron puntos de información para mediciones cinéticas cada 5 minutos durante una hora, las mediciones del criterio de valoración se tomaron durante dos horas. A modo de ejemplo, el 10 jM del Ejemplo del Compuesto 12 inhibió la producción de TNFa mediante la PBMC bovino estimulada con 0,1 ng/ml LPS. Esto se muestra en la Figura 10.
Modelo in vivo de dermatitis alérgica canina inducida por Ácaros del polvo doméstico
Para evaluar la eficacia potencial anti alérgica/anti inflamatoria de los compuestos de la Fórmula general (I), se utilizó un modelo de ácaros del polvo doméstico (HDM por sus siglas en ingles) en perros Beagle sensibilizados. La sensibilización a HDM consistió en una serie de inyecciones de antígeno HDM (10 jg , Greer Laboratories, Lenoir, NC, USA) y Alhydrogel® (0,2 ml, InvivoGen, San Diego, CA 921221, USA) como adyuvante en intervalos de aproximadamente dos semanas. El proceso de sensibilización fue monitoreado y se confirmó mediante la prueba intradérmica. Una vez que los perros dieron positivo en la prueba intradérmica para HDM, un mes después de la sensibilización, el antígeno HDM (135 |jg) se aplicó de manera tópica pinchando la piel (con micro agujas de 2 mm) del perro Beagle adulto en la parte interior de la pata posterior y se examinó el efecto de los compuestos para señales de dermatitis alérgica, por ejemplo, eritema y edema. Había 2 grupos con 4 animales cada uno: 1 grupo de control con placebo y 1 grupo tratado con el Ejemplo del Compuesto 12. El grupo de control se trató de forma oral con cápsulas de gelatina que contenían micro celulosa, mientras que el grupo tratado con el Ejemplo del Compuesto 12 se trató de forma oral con cápsulas de gelatina que contenían el Ejemplo del Compuesto 12 y micro celulosa. La administración del Ejemplo del Compuesto 12 o el placebo comenzó 5 días antes de la exposición con antígeno HDM y continuo durante 2 días luego de la exposición. La frecuencia del tratamiento era de una vez al día, con una dosis de 10 mg/kg peso corporal en el caso del Ejemplo del Compuesto 12. En los dos grupos, la eritema y edema fueron evaluadas mediante VAS (Escala análoga visual), luego de 30 minutos del comienzo de la exposición y a diferentes momentos durante 48 horas. Las muestras de placas se analizaron para determinar la exposición del compuesto en relación con las evaluaciones clínicas. Edema y eritema sufrieron una reducción importante luego del tratamiento con el Ejemplo del compuesto 12. Esto se muestra en la Tabla 4 y 5 y Figuras 11 y 12.
Tabla 4: Eritema (en unidades VAS) luego del tratamiento con el Ejemplo del Compuesto 12 versus el lacebo
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Modelo In vivo de prurito de dermatitis alérgica a las pulgas
Para evaluar el efecto potencial anti prurítico de los compuestos de la Fórmula general (I), se utilizó un modelo de Dermatitis alérgica a las pulgas (FAD por sus siglas en ingles). Solo perros adultos con antecedentes de FAD fueron inscritos en el estudio. La fase de vida del estudio consistió en dos etapas: fase de inducción prurito (2 semanas) seguido por la fase de Tratamiento (2 semanas). Se infecto a los perros con pulgas Ctenocephalides (primera exposición con 100 pulgas/perro, todas las exposiciones siguientes con 30 pulgas/perro) dos veces por semana durante ambas fases del estudio. Había 2 grupos con 12 animales cada uno: 1 grupo de control con placebo y 1 grupo trata con el Ejemplo del Compuesto 12. El grupo de control se trató de forma oral con cápsulas de gelatina que contenían micro celulosa, mientras que el grupo tratado con el Ejemplo del Compuesto 12 se trató de forma oral con cápsulas de gelatina que contenían el Ejemplo del Compuesto 12 y micro celulosa. La frecuencia del tratamiento era de una vez al día, con una dosis de 20 mg/kg peso corporal en el caso del Ejemplo del Compuesto 12. Al comienzo del día 1 luego del tratamiento y cada tres días, los perros se registraron durante 4 horas y se determinó el comportamiento prurito como rasguños, lamiendo y mordidas. Las muestras de plasma se analizaron para determinar la exposición del compuesto en relación con las evaluaciones clínicas. El prurito sufrió una reducción notable luego de 10 días de tratamiento con el Ejemplo del Compuesto 12. Esto se ilustra en la Tabla 6 y Figura 13.
Tabla 6: Reducción del comportamiento prurito en comparación con la referencia luego del tratamiento con el Ejemplo del Compuesto 12 versus placebo (como porcentaje-cambio a partir de la referencia de los días lue o del tratamiento
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Figura 1: Inhibición de IL-23 en DC generado a partir de monocitos humano para el Ejemplo del compuesto 12. Los datos se presentan como valores promedio con desviación estándar.
Figura 2: Inhibición de INF-a en (A) imiquimod (R837)- o (B) DC plasmocitoides humana estimulada por CpG-A para el ejemplo del compuesto 12. Los datos se presentan como valores promedio con desviación estándar.
Figura 3: Tratamiento para la inflamación estimulada por LPS con el Ejemplo del Compuesto 11 que genera una reducción de la cantidad de TNF-a secretada. Los datos se presentan como valores promedio con desviación estándar.
Figura 4: Tratamiento para la inflamación estimulada por IL-1p- con el Ejemplo del Compuesto 11(izquierda) y 12 (derecha) que genera una reducción dependiente de la dosis en la cantidad de TNF-a secretada. Los datos se presentan como valores promedio con desviación estándar.
Figura 5: Efectos antiinflamatorios del Ejemplo del Compuesto 11 en un animal con modelo de artritis reumatoide (modelo de rata inducido por adyuvantes). Importante inhibición dependiente de la dosis sobre la inflamación en articulaciones reumáticas según el puntaje para la actividad de la enfermedad. Los datos corresponden a valores promedio desviación estándar. Análisis de la varianza de factor individual ANOVA seguido por múltiples análisis comparativos con el grupo de control de CFA mediante el Dunnett's test; *p < 0,05; **p < 0,01;***p < 0,001; ****p < 0,0001.
Figura 6: Efectos antiinflamatorios del Ejemplo del Compuesto 12 en un animal con modelo de artritis reumatoide (modelo de ratón inducido por anticuerpo de colágeno). Importante inhibición dependiente de la dosis sobre la inflamación en articulaciones reumáticas según el puntaje para la actividad de la enfermedad. Los datos corresponden a valores promedio desviación estándar. La importancia estadística entre el control del anticuerpo de colágeno (AK) y el grupo de tratamiento se calculó mediante el análisis de la varianza de factor individual ANOVA seguido de múltiples análisis comparativos (Dunnett's test) (*p < 0,05; **p < 0,01;***p < 0,001; ****p < 0,0001).
Figura 7: Inhibición para la producción de TNFa inducida por LPS mediante PBMC canino para el Ejemplo del Compuesto 12. Los datos se presentan como valores promedio con desviación estándar.
Figura 8 : Inhibición dependiente de la dosis por el Ejemplo del Compuesto 12 de la producción de TNFa por PBMC bovino estimulada por 1 LPS (mediciones cinéticas). La información muestra los valores medios con desviación estándar con triplicados biológicos en cada medida duplicada. El valor IC50 determinado a partir de la curva es de 120 nM.
Figura 9 : Inhibición dependiente de la dosis por el Ejemplo del Compuesto 12 de la producción de TNFa por PBMC bovino estimulada por 0,1 LPS (mediciones cinéticas). La información muestra los valores medios con desviación estándar con triplicados biológicos en cada medida duplicada. El valor IC50 determinado a partir de la curva es de 70,5 nM.
Figura 10: Inhibición dependiente de la dosis por el Ejemplo del Compuesto 12 de la producción de TNFa por PBMC bovino estimulada por 0,1 LPS (mediciones cinéticas). Los datos se presentan como valores promedio con desviación estándar de triplicados biológicos que se midió cada una en duplicado.
Figura 11: Tratamiento para un modelo de dermatitis alérgica canina inducida por ácaros del polvo doméstico con el Ejemplo del Compuesto 12 que reduce el eritema (a). Los datos se presentan como valores promedio con desviación estándar.
Figura 12: Tratamiento para un modelo de dermatitis alérgica canina inducida por ácaros del polvo doméstico con el Ejemplo del Compuesto 12 que reduce el edema (b). Los datos se presentan como valores promedio con desviaciones estándar.
Figura 13: Efecto anti prurítico del Ejemplo del Compuesto 12 en un modelo de Dermatitis alérgica por picadura de pulgas en animales. La información se expresa en porcentaje de cambio a partir de la referencia que corresponde a valores medios.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Compuestos de la Fórmula general (I):
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    en la que:
    R1 es alquilo C1-C6, donde el grupo alquilo C1-C6 esta no sustituido o mono o polisustituidos de manera idéntica o diferente por halógeno, hidroxilo, un grupo no sustituido o mono o polisustituido con halógeno de cicloalquilo C3-C6, o un R6, R7SO2, R7SO o R8O, o un grupo seleccionado de:
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    donde * representa el punto de unión del grupo con el resto de la molécula;
    R2 y R3 siempre tienen la misma definición y ambos son hidrógeno o alquilo C1-C6;
    R4 es halógeno, ciano, un alquilo C1-C6 no sustituido o mono o polisustituido de manera idéntica o diferente o un cicloalquilo C3-C6 no sustituido o mono o polisustituido de manera idéntica o diferente, y los sustituyentes son seleccionados de halo e hidroxilo;
    R5 es hidrógeno, halógeno o un alquilo C1-C6 no sustituido o mono o polisustituido con halógeno;
    R6 es un heterociclo saturado monocíclico no sustituido o monosustituido o disustituido con metilo, que tiene 4 a 6 átomos del anillo, que contiene heteroátomo o un heterogrupo del grupo de O, S, SO y So2;
    R7 es alquilo C1-C6, donde el grupo alquilo C1-C6 esta no sustituido o monosustituido o polisustituido de manera idéntica o diferente por halógeno, hidroxilo o cicloalquilo C3-C6; o R7 es cicloalquilo C3-C6;
    R8 es alquilo C1-C6, donde el grupo alquilo C1-C6 esta no sustituido o monosustituido o polisustituido de manera idéntica o diferente por halógeno;
    y los diastereómeros, los enantiómeros, las sales, los solvatos o los solvatos de las sales,
    para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades alérgicas y/o inflamatorias en animales.
    2. Los compuestos de acuerdo con la reivindicación 1, donde
    R1 es alquilo C1-C6, donde el grupo alquilo C1-C6 esta no sustituido o monosustituido o polisustituido de manera idéntica o diferente por flúor, hidroxilo o un grupo R6, R7SO2, R7SO o R8O;
    R2 y R3 siempre tienen la misma definición y ambos son hidrogeno o alquilo C1-C3;
    R4 es halógeno, ciano o alquilo C1-C3, donde el grupo alquilo C1-C3 esta no sustituido o monosustituido o polisustituido de manera idéntica o diferente por halógeno o hidroxilo;
    R5 es hidrógeno, flúor, cloruro o alquilo C1-C3;
    R6 es oxetanilo o tetrahidrofuranilo;
    R7 es alquilo C1-C4, donde el grupo alquilo C1-C4 esta no sustituido o monosustituido con hidroxilo o por ciclopopilo o sustituido con tres átomos de flúor;
    R8 es un grupo alquilo C1-C4 no sustituido o un grupo alquilo C1-C4 trisustituido con flúor.
    3. Compuestos de acuerdo las reivindicaciones 1 o 2, donde R4 es difluorometilo, trifluorometilo o metilo.
    4. Compuestos de acuerdo con las reivindicaciones 1,2 o 3, donde R5 es hidrógeno o flúor.
    5. Compuestos de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, 3 o 4, donde R 2y R3 son hidrógeno o metilo.
    6. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 2, donde
    R1 alquilo C2-C6, donde el grupo alquilo C2-C6 esta no sustituido o el grupo alquilo C2-C6 este monosustituido, disustituido o trisustituido con flúor o el grupo alquilo C2-C6 este monosustituido con hidroxilo, R6, R7SO2 o R8O, o R1 es un grupo alquilo C1-C3 sustituido con oxetanilo;
    R2 y R3 siempre tienen la misma definición y ambos son hidrogeno o metilo;
    R4 es un grupo alquilo C1-C3 no sustituido o monosustituido o polisustituido con halógeno o un grupo alquilo C1-C3 sustituido con un grupo hidroxilo o un grupo alquilo C1-C3 sustituido con un grupo hidroxilo y tres átomos de flúor;
    R5 es hidrógeno, flúor o alquilo C1-C3;
    R7 es alquilo C1-C3;
    R8 es alquilo C1-C4 donde el grupo alquilo C1-C4 esta no sustituido o monosustituido, disustituido o trisustituido con flúor.
    7. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 6, en los que
    R1 es un grupo alquilo C2-C5 sustituido con hidroxilo o alcoxi C1-C3 o trifluorometoxi o 2,2,2-trifluoroetoxi o trifluorometilo o es un grupo alquilo C2-C4 sustituido con metil-SO2 o es un grupo alquilo C1-C2 sustituido con oxetan-3-ilo;
    R2 y R3 siempre tienen la misma definición y son hidrogeno o metilo;
    R4 es metilo, etilo, trifluoro-alquilo C1-C3, difluoro-alquilo C1-C3, hidroximetilo, 1 -hidroxietilo, 2-hidroxipropano-2-ilo y 2,2,2-trifluoro-1-hidroxietilo;
    R5 es hidrógeno, flúor o metilo.
    8. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 7, en los que
    R1 es 4,4,4-trifluorobutilo, 3-hidroxi-3-metilbutilo, 3-hidroxibutilo, 3-metoxipropilo, 3-hidroxipropilo, 3-hidroxi-2-metilpropilo, 3-hidroxi-2,2-dimetilpropilo, 3-trifluorometoxipropilo, 2-metoxietilo, 2-hidroxietilo, 2-(metilsulfonilo)etilo o 3-(metilsulfonilo)propilo;
    R2 y R3son metilo o hidrógeno;
    R4 es difluorometilo, trifluorometilo o metilo;
    R5 es hidrógeno o flúor.
    9. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 8, en los que
    R1 es 3-hidroxi-3-metilbutilo, 3-hidroxibutilo, 3-hidroxi-2-metilpropilo, 3-hidroxi-2,2-dimetilpropilo, 3-(metilsulfonil)propilo o 2-(metilsulfonilo)etilo;
    R2 y R3 son metilo;
    R4 es difluorometilo o trifluorometilo;
    R5 es hidrógeno.
    10. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 8, en los que
    R1 es 3-hidroxi-3-metilbutilo, 3-hidroxibutilo, 3-hidroxi-2-metilpropilo, 3-hidroxi-2,2-dimetilpropilo, 3-(metilsulfonil)propilo o 2-(metilsulfonilo)etilo;
    R2 y R3 son metilo;
    R4 es metilo;
    R5 es flúor donde R5 está en la posición orto a R4.
    11. Compuestos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10 como se muestra a continuación:
    1) N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(2-metioxietil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
    2) N-[6-(Hidroximetil)-2-(2-metoxietil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
    3) N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(3-metoxipropil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
    4) N-[6-(Hidroximetil)-2-(3-metoxipropil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
    5) N-[2-(2-Hidroxietil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
    6) N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(3-hidroxipropil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
    7) N-[2-(2-Hidroxietil)-6-(hidroximetil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
    8) N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(oxetan-3-ilmetil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
    9) N-[6-(Hidroximetil)-2-(oxetan-3-ilmetil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
    10) N-{6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-[3-(metilsulfonil)propil]-2H-indazol-5-il}-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida 11) N-[2-(3-Hidroxi-3-metilbutil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida 12) N-{6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-[2-(metilsulfonil)etil]-2H-indazol-5-il}-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida 13) 6-(Difluorometil)-N-[2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]piridin-2-carboxamida 14) 6-(Difluorometil)-N-{6-(2-hidroxipropan-2-il)-2-[2-(metilsulfonil)etil]-2H-indazol-5-il}piridin-2-carboxamida 15) 6-(Difluorometil)-N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-2-(3-hidroxipropil)-2H-indazol-5-il]piridin-2-carboxamida
    16) N-[6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-(4,4,4-trifluorobutil)-2H-indazol-5-il]-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida 17) N-{6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-[3-(trifluorometoxi)propil]-2H-indazol-5-il}-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida 18) N-{6-(2-Hidroxipropan-2-il)-2-[3-(2,2,2-trifluoroetoxi)propil]-2H-indazol-5-il}-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida
    19) 5-Fluoro-N-[2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-metilpiridin-2-carboxamida 20) N-[2-(3-Hidroxi-3-metilbutil)-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il]-6-metilpiridin-2-carboxamida
    21) 6-(2-Hidroxipropan-2-il)-N-[6-(2-hidroxipropan-2-il)-2-(4,4,4-trifluorobutil)-2H-indazol-5-il]piridin-2-carboxamida 22) N-{2-[2-(1-Hidroxiciclopropil)etil]-6-(2-hidroxipropan-2-il)-2H-indazol-5-il}-6-(trifluorometil)piridin-2-carboxamida.
    12. Compuesto de la Fórmula general (I) como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11 para usar en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades alérgicas y/o inflamatorias en animales domésticos.
    13. Compuesto de la Fórmula general (I) como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11 para usar en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades alérgicas y/o inflamatorias en animales de granja.
    14. Compuesto de la Fórmula general (I) como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12, o como se define en la Reivindicación 12, para usar en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de dermatitis atópica, Dermatitis Alérgica a las pulgas, enfermedad intestinal inflamatoria, osteoartritis y dolor inflamatorio, enfermedad de las vías respiratorias recurrente no infecciosa, hipersensibilidad a los insectos, asma, enfermedad respiratoria, mastitis y endometritis en animales.
    15. Compuesto de la Fórmula general (I) como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 1a 11 en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de Dermatitis Atópica Canina, Dermatitis Alérgica a las pulgas en perros y gatos, enfermedad intestinal inflamatoria en perros y gatos, osteoartritis y dolor inflamatorio en perros, gatos, caballos o ganado, enfermedad de las vías respiratorias recurrente no infecciosa en caballos, hipersensibilidad a los insectos en caballos, asma felina, enfermedad respiratoria en bovinos, mastitis en ganado y endometritis en ganado y enfermedad respiratoria porcina.
    16. Compuesto de la Fórmula general (I) como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11 para usar en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de Dermatitis Atópica Canina y Dermatitis Alérgica a las pulgas en perros y gatos.
    17. Compuesto de la Fórmula general (I) como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11 para usar en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de osteoartritis y dolor inflamatorio en ganado, enfermedad respiratoria bovina, mastitis en ganado, endometritis en ganado y enfermedad respiratoria porcina.
    18. Fármaco que comprende un compuesto de la Fórmula (I) como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11 en combinación con un excipiente farmacéuticamente adecuado, no toxico e inerte para usar en un método para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades alérgicas y/o inflamatorias en animales.
    19. Compuestos de la Fórmula general (III)
    Figure imgf000055_0001
    en la que
    R1 es 4,4,4-trifluorobutilo, 3-hidroxi-3-metilbutilo, 3-metoxipropilo, 3-hidroxipropilo, 3-hidroxibutilo, 3-hidroxi-2-metilpropilo, 3-hidroxi-2,2-dimetilpropilo, 3-trifluorometoxipropilo, 2-metoxietilo, 2-hidroxietilo, 2-(metilsulfonilo)etilo, 3-(metilsulfonilo)propilo o 2-(1 -hidroxiciclopropilo)etilo;
    R4 es difluorometilo, trifluorometilo o metilo; y
    R5 es hidrógeno o flúor;
    y los diastereómeros, los enantiómeros, las sales, los solvatos o los solvatos de las sales,
    para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades alérgicas y/o inflamatorias en animales.
    20. Compuestos de la Reivindicación 19 como se muestra a continuación:
    5-{[(5-fluoro-6-metilpiridin-2-il)carbonil]amino}-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-2H-indazol-6-carboxilato de metilo y 2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-5-({[6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbonil} amino)-2H-indazol-6-carboxilato de metilo, para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades alérgicas y/o inflamatorias en animales.
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