TWI739241B - 具優異填料性質之包含玻尿酸水凝膠之填料、其製法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於含有玻尿酸水凝膠之填料，具有相對於修飾度之該填料中所含玻尿酸之單位含量(w/w%)的特定拉提能力範圍。該填料因上述拉提能力而展現改良之高黏彈特性，以及同時具有單相玻尿酸水凝膠填料及雙相玻尿酸水凝膠填料之優點，因而展現高組織回復性質。此外，不僅即使注入皮膚時具有低位移可能性下亦可長時間維持形狀，而且藉由極少地使用交聯劑而使玻尿酸之修飾最小化因而可使玻尿酸之形狀維持自然狀態，此外，可降低免疫反應及副作用之可能性，因此軟組織回復或體積膨脹及皺紋的改善優異。

Description

具優異填料性質之包含玻尿酸水凝膠之填料、其製法及其用途 相關申請案之交互參照
本申請案主張2018年12月20日向韓國智慧財產局(Korean Intellectual Property Office)提出申請之韓國專利申請案10-2018-0166747號的優先權之權益，其全文係以引用方式併入本文中。
本發明係關於含有玻尿酸水凝膠之填料，更具體而言係關於其中填料中所含玻尿酸的單位含量(w/w%)之拉提能力相對於修飾度(MoD)的比率高之含有玻尿酸水凝膠之填料，該填料因而展現優異性質以及具有優異的皺紋改善及組織回復能力；以及關於其製備方法。
人類皮膚組織係經由含有諸如膠原蛋白、彈性蛋白等蛋白質和醣胺聚醣的細胞外基質來維持其結構。當因外部衝擊、疾病或老化等而發生軟組織缺損時，已將 組織增加(例如軟組織增加(soft tissue enhancement))用於醫學和美容目的。此增加係經由整形手術而以手術進行，或者以非手術方式藉由將生物組織或合成的聚合物化學物質注入受影響部位以增加及膨脹軟組織的體積而回復及校正形狀。於該例中，基於美容目的而作為類似於皮膚組織之組分插入特定部位以增大軟組織從而放大臉頰、嘴唇、胸部、臀部等的體積以及藉由減少皮膚上之細紋和深皺紋而用以改善皺紋或輪廓校正(contour correction)的材料，係稱為軟組織增大材料(soft tissue augmentation material)，且通常亦稱為皮膚填料(dermal filler)。最早研發之與該等填料有關的第一代皮膚填料包括諸如Zyderm及Zyplast產品，其係藉由萃取動物來源蛋白質(即，諸如牛及豬之動物性蛋白質)而製造；以及使用人類膠原蛋白製造之Cosmoderm或Cosmoplast。然而，因藥效持續期間短以及必須在手術前一個月進行皮膚過敏性測試的不便，近年來其鮮少用於外科手術。
第二代填料為玻尿酸(hyaluronic acid)(亦稱為「HA」)填料，其具有比膠原蛋白填料更長之效果持續期間，且係由與構成人體之成分相似的多醣類--N-乙醯基-D-葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)及D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)--構成。因此，其具有諸如皮膚過敏反應等副作用少、容易操作及移除、以及可吸引水以維持皮膚水分以及亦可維持體積及彈性的優點，因而適合用作皮膚填料。
然而，玻尿酸本身於人體內具有僅數小時的短半衰期，其應用受限，因此已進行研究以藉由交聯而增長玻尿酸之半衰期(於體內之持久性)。例如，美國專利4,582,865號揭示使用二乙烯基碸(divinyl sulfone，DVS)作為交聯劑之交聯的玻尿酸衍生物，其水凝膠形式已以商品名Hylaform®銷售。此外，美國專利5,827,937號揭示使用多官能環氧化合物作為交聯劑以製備交聯的玻尿酸衍生物之方法，其中，使用1,4-丁二醇二環氧丙基醚(1,4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)(交聯劑)作為多官能環氧化合物(polyfunctional epoxy compound)所製備的呈水凝膠形式之交聯的玻尿酸Restylane®已獲得美國食品藥物管理局(FDA)核准，且為全世界市售之填料。
此交聯的玻尿酸填料包括由單相(single phase)製成之填料(單相HA填料(monophasic HA filler))及由雙相(bi-phase)製成之填料(雙相HA填料(biphasic HA filler))。由於單相玻尿酸填料係使用含有交聯的玻尿酸之均質溶液製備，因此其具有低彈性及高內聚性(cohesivity)。因而，將單相玻尿酸填料注入皮膚時，不太可能脫離注射部位，但具有注射之形狀無法長時間維持的問題。
雙相玻尿酸填料係僅由交聯的玻尿酸粒子製備、或藉由與類似於液相之非交聯的玻尿酸(未處理、非交聯的玻尿酸，線性HA(linear HA))混合而製備，因而其通常具有高彈性及低內聚性。因此，當雙相HA填料注入皮膚時，可長時間維持形狀，但存在極有可能脫離注射部位的問題。此雙相HA填料之典型實例為上述Restylane®(Galderma)。
因此，單相HA填料及雙相HA填料分別具有優點及缺點，而且有其中混合該等填料以具有習用單相玻尿酸填料及雙相玻尿酸填料之全部性質的例子，但在此情況下，單相玻尿酸填料及雙相玻尿酸填料之優點反而一起降低，使彼等不適合作為填料。因此，需要可長時間維持其形狀同時脫離注射部位的可能性低之填料。
此外，為了以此方式調整交聯的玻尿酸之流變性質(諸如彈性及內聚性)及降解期(degradation period)，應從一開始就調整在交聯產物製備期間反應之玻尿酸的濃度以及所添加之交聯劑的比率。此外，通常，為了改善流變性質或降解期，必須提高反應濃度或添加大量交聯劑。在該情況下，不容易以高濃度製造，且在純化程序期間難以完全去除大量添加之交聯劑，這會造成諸如因殘留之交聯劑所導致的毒性之問題。
[ 技術問題 ]
本發明已設計以解決先前技術所遭遇的問題，且本發明之一目的係提供含有玻尿酸水凝膠之填料，其在彈性及內聚性(為填料性能之指標)方面均具有優異性質，使其不太可能脫離注射部位，可長時間保持形狀，以及在具有低交聯劑含量同時具有優異效果諸如組織回復能力及皺紋改善，因而展現優異生物相容性(biocompatibility)；以及，含有上述玻尿酸水凝膠填料之用於組織修復的生物材料。
本發明另一目的係提供此填料之製造方法。
本發明又另一目的係提供使用上述填料之組織回復或皺紋改善方法。[ 技術方案 ]
本案發明人已進行研究以解決如上述之先前技術的問題，結果意外發現，填料中所含玻尿酸的單位含量(w/w%)之拉提能力(lift capability)相對於修飾度(modification degree)(MoD)的比率為特定範圍時，彈性及內聚性均改善，因而同時獲致單相填料之高內聚性及雙相填料之高彈性的流變性質。此外，填料中所含玻尿酸的單位含量(w/w%)之拉提能力相對於修飾度之比率為特定範圍時，填料於注入人體時容易成為所希望形式、保持形狀達所希望的期間、展現優異填料性質(填料組分實質上不會位移至身體其他部分)、以及可因減少使用交聯劑而使會於體內發生的毒性問題最小化，此外，可藉由使玻尿酸之修飾最小化及使玻尿酸分子維持自然狀態而降低免疫反應及副作用的可能性。已基於此等結果而完成本發明。
作為實現上述本發明目的之一態樣，本發明係關於含有包括玻尿酸、其鹽或交聯的玻尿酸之玻尿酸水凝膠之填料，填料中所含玻尿酸的單位含量(w/w%)之拉提能力相對於修飾度(mol%)的比率表示為60至180((Pa*N/(w/w)%)/mol%)；以及，包括注射該填料之步驟的用於改善皺紋及組織回復之方法。即，相對於填料中之玻尿酸單位含量(w/w%)與修飾度(mol%)之拉提能力(可確認填料是否展現作為填料之優異性質)，係藉由將拉提能力除以相對於含有玻尿酸水凝膠之填料的總重之玻尿酸的比率以獲得每玻尿酸單位含量之拉提能力的值、再將該值除以修飾度而得，如後文之方程式3所示。
較佳的，填料係用於注入諸如皮膚之軟組織，以及填料可用作具有填充性質之填料，例如諸如，因填充生物組織及填充皺紋所造成的皺紋之改善、臉部重塑(remodeling)或塑形(contouring)、或軟組織之修復或增加體積。
下文茲更詳細說明本發明。
本發明之填料中包含的玻尿酸水凝膠中所含玻尿酸(下文亦稱為「HA」)為其中由N-乙醯基-D-葡萄糖胺及D-葡萄糖醛酸構成之雙醣單元係線性連接的生物聚合物(biopolymer)材料，該玻尿酸經常存在於眼睛的玻璃狀液、關節之滑液、雞冠等等之中，且具有優異生物相容性，因而已廣泛用於醫療及醫療儀器領域，諸如眼科手術輔助劑、關節功能改善劑、藥物遞輸材料、滴注劑(instillation)、皺紋改善劑等等，或用於美容領域。
於一較佳實施態樣中，根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料可包括1至3重量%之玻尿酸(以填料之總重為基準計)。
此外，根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料可不只包括玻尿酸還進一步包括水、麻醉劑、或其組合。
具體而言，根據本發明之玻尿酸水凝膠中所含的玻尿酸可指玻尿酸或玻尿酸之鹽。玻尿酸之鹽包括例如無機鹽(諸如玻尿酸鈉(sodium hyaluronate)、玻尿酸鉀、玻尿酸鈣、玻尿酸鎂、玻尿酸鋅、玻尿酸鈷(cobalt hyaluronic acid)等)，以及有機鹽(諸如玻尿酸四丁基銨(hyaluronic acid tetrabutylammonium)等)，但不限於此。
此外，玻尿酸或其鹽可藉由適合的交聯劑交聯。交聯的玻尿酸衍生物可為使用交聯劑交聯玻尿酸本身或其鹽所製備之玻尿酸或玻尿酸鹽的交聯產物。根據本發明之玻尿酸水凝膠(hyaluronic acid hydrogel)包括玻尿酸之交聯產物。本發明中，交聯劑包括交聯劑本身或呈與玻尿酸反應且鍵結至玻尿酸分子的形式之交聯劑。根據本發明之玻尿酸水凝膠展現如下述之低修飾度且包括交聯的玻尿酸與非交聯的玻尿酸二者。
關於交聯，可利用在鹼性水溶液存在下使用交聯劑之方法。鹼性水溶液可為NaOH及KOH，較佳為NaOH水溶液，但不限於此。在該情況，可使用濃度為0.1至0.5 N之NaOH水溶液。關於本發明之填料中所含交聯的玻尿酸，特別是，即使交聯劑係以低濃度且少量使用時，填料中所含玻尿酸的單位含量(w/w%)之拉提能力相對於交聯的玻尿酸之修飾度(mol%)之比率顯示為特定範圍，因而展現高流變性質(彈性、內聚性)。
交聯劑，作為包括二或更多環氧官能基之化合物，可變化之，且其較佳實例包括1,4-丁二醇二環氧丙基醚(1,4-butandiol diglycidyl ether)(BDDE)、乙二醇二環氧丙基醚(ethylene glycol diglycidyl ether)(EGDGE)、1,6-己二醇二環氧丙基醚(1,6-hexanediol diglycidyl ether)、丙二醇二環氧丙基醚(propylene glycol diglycidyl ether)、聚丙二醇二環氧丙基醚(polypropylene glycol diglycidyl ether)、聚四亞甲基二醇二環氧丙基醚(polytetramethylene glycol diglycidyl ether)、新戊二醇二環氧丙基醚(neopentyl glycol diglycidyl ether)、聚甘油聚環氧丙基醚(polyglycerol polyglycidyl ether)、二甘油聚環氧丙基醚(diglycerol polyglycidyl ether)、甘油聚環氧丙基醚(glycerol polyglycidyl ether)、三甲基丙烷聚環氧丙基醚(tri-methylpropane polyglycidyl ether)、1,2-(雙(2,3-環氧基丙氧基)伸乙基(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene)、新戊四醇聚環氧丙基醚(pentaerythritol polyglycidyl ether)、及山梨醇聚環氧丙基醚(sorbitol polyglycidyl ether)。其中，就具有低毒性而言，特佳為二環氧化合物系(biepoxide-based)1,4-丁二醇二環氧丙基醚。
本發明中，交聯反應中所使用之玻尿酸的平均分子量可為2,000,000 Da或更高、2,300,000 Da或更高、或2,500,000 Da或更高，例如，2,000,000至4,000,000 Da、2,300,000至4,000,000 Da、2,000,000至3,700,000 Da、2,200,000至3,700,000 Da、或2,500,000至3,500,000 Da。
本文所使用之用語「拉提能力(lift capability)」亦稱為「組織回復能力(tissue restoration capacity)」，且以流變計(rheometer)測量水凝膠之物理性質時，其可表達為將反映彈性之儲存彈性模數(storage elastic modulus)乘以反映內聚性之黏性試驗時的內聚力(cohesive force)所獲得之值。具體而言，其可表達為下列方程式1。 [方程式1] 拉提能力(Pa*N)=儲存彈性模數X內聚力
方程式1中，填料之儲存彈性模數(G')為填料之彈性且其單位為帕(Pascal)(Pa)，內聚力為藉由涉及以等速軸向拉伸樣本之黏性試驗(tack test)所測量的峰值正向力(peak normal force)，且單位為N(牛頓)。
關於以流變計測量之填料的物理性質，用語「彈性(elasticity)」(以儲存彈性模數表示)係指對材料或物體施加力時形狀改變但於移除該力時回復其原形狀之性質。彈性係以儲存彈性模數(G')表示，且單位為帕(Pa)。於一較佳實施態樣中，根據本發明之玻尿酸水凝膠填料展現具有約400至800 Pa之儲存彈性模數的彈性。
此外，用語「內聚性(cohesivity)」為於填料粒子之間作用的吸引力，其意指能使填料粒子聚集(aggregate)之性質。填料之內聚性愈高，能支撐注入填料之組織的力便愈大。通常，內聚性可由黏性試驗等測量，且係測量於載至流變計上之後在以等速拉伸下的內聚力，且其單位為N(牛頓)。一較佳實施態樣中，根據本發明之玻尿酸水凝膠填料展現約1.0至1.7 N之內聚性。
以彈性與內聚性(藉由流變計測量)之乘積表達的拉提能力為使填料注射部位膨脹及回復之能力。高拉提能力意指組織回復能力優異，且注射填料後之填料位移(migration)小。
本發明中，玻尿酸水凝膠或包含彼之填料的拉提能力係以如方程式1所示之將儲存彈性模數乘以黏性試驗之內聚力所獲得之值使用，或可表達為相對於填料中所含玻尿酸含量(w/w%)的拉提能力。
於根據本發明一實施態樣之含有玻尿酸水凝膠之填料中，相對於填料中所含玻尿酸之單位含量(w/w%)的拉提能力之數值可為200(Pa*N/w/w%)或更高、230(Pa*N/w/w%)或更高、或250(Pa*N/w/w%)或更高之範圍，例如，其可為200至650(Pa*N/w/w%)、230至650(Pa*N/w/w%)、240至650(Pa*N/w/w%)、250至650(Pa*N/w/w%)、200至640(Pa*N/w/w%)、230至640(Pa*N/w/w%)、240至640(Pa*N/w/w%)、250至640(Pa*N/w/w%)、200至630(Pa*N/w/w%)、230至640(Pa*N/w/w%)、240至630(Pa*N/w/w%)、或250至630(Pa*N/w/w%)之範圍。
並且，本發明中，用語「修飾度(modification degree)(MoD)」為交聯劑(例如，BDDE)之莫耳數(n)對雙醣單元(N-乙醯基-D-葡萄糖胺(GlcNAc)+D-葡萄糖醛酸)(其為對玻尿酸進行交聯處理所獲得之玻尿酸水凝膠中所含的玻尿酸之重複單元)之莫耳數的比率(mol%)，且係以化學計量比率(stoichiometric ratio)計算。玻尿酸水凝膠之修飾度(mol%)可以下列方程式2表示。 [方程式2] 修飾度(mol%)=(交聯劑之莫耳數/(N-乙醯基-D-葡萄糖胺+D-葡萄糖醛酸)之莫耳數)* 100。
本發明中，特別是，含有市售玻尿酸水凝膠之填料中的玻尿酸水凝膠展現6 mol%或更高之修飾度，而根據本發明之填料中的玻尿酸水凝膠之修飾度範圍為5 mol%或更低、4 mol%或更低，較佳為2至5 mol%、3至5 mol%、2至4 mol%、或3至4 mol%。
較佳的，根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料具有填料中所含玻尿酸的單位含量(w/w%)之拉提能力相對於玻尿酸水凝膠之修飾度之比率的值具有上述範圍之特徵，因而，該填料具有優異填料性質，尤其是不僅具有如單相填料之高內聚性，亦具有如雙相填料之高彈性，此外，交聯劑之含量最小化且玻尿酸之修飾最小化，以及其因盡可能使玻尿酸分子維持自然狀態而展現低免疫反應及可能副作用。
具體而言，根據本發明之填料中，填料中所含玻尿酸的單位含量(w/w%)之拉提能力相對於填料之修飾度的比率係以下列方程式3表達。 [方程式3] 每玻尿酸單位含量之拉提能力相對於修飾度=A/B
方程式3中，A為相對於填料中所含玻尿酸的單位含量(w/w%)之拉提能力，而B意指根據方程式2之填料的修飾度。
此外，根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料中的玻尿酸粒子，較佳為交聯的玻尿酸粒子，可展現各種形狀。此外，此等粒子之平均直徑可為300至400 μm。
於一較佳實施態樣中，根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料可包括1至3重量%、較佳為1.5至2.5重量%之玻尿酸(相對於填料總重)。此外，根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料可不只包括玻尿酸還進一步包括水、麻醉劑、或其組合。
麻醉劑包括本領域已知之一或多種麻醉劑，較佳為局部麻醉劑(topical anesthetic agent)，一或更多麻醉劑之濃度為能有效緩和注射組成物時經歷之疼痛的量。麻醉劑之實例可選自由下列所組成之群組：氨布卡因(ambucaine)、阿莫拉酮(amolanone)、阿米卡因(amylocaine)、苯諾西納(benoxinate)、苯佐卡因(benzocaine)、貝托卡因(betoxycaine)、二苯胺明(biphenamine)、布比卡因(bupivacaine)、布他卡因(butacaine)、布坦本(butamben)、布坦卡因(butanilicaine)、布特撒明(butethamine)、丁氧卡因(butoxycaine)、卡替卡因(carticaine)、氯普魯卡因(chloroprocaine)、古柯乙烯(cocaethylene)、可卡因(cocaine)、環甲卡因(cyclomethycaine)、待布卡因(dibucaine)、二甲異喹(dimethisoquin)、二甲卡因(dimethocaine)、狄珀洛東(diperodon)、地環奈(dicyclonine)、艾克定(ecgonidine)、艾克寧(ecgonine)、氯乙烷(ethyl chloride)、依替卡因(etidocaine)、β-優卡因(beta-eucaine)、尤普羅辛(euprocin)、非那可明(fenalcomine)、福莫卡因(fomocaine)、己卡因(hexylcaine)、羥丁卡因(hydroxytetracaine)、對胺基苯甲酸異丁酯(isobutyl p-aminobenzoate)、甲磺酸亮氨卡因(leucinocaine mesylate)、左沙屈爾(levoxadrol)、利多卡因(lidocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、美普利兒卡因(meprylcaine)、美布卡因(metabutoxycaine)、氯甲烷(methyl chloride)、麥替卡因(myrtecaine)、納帕因(naepaine)、安妥卡因(octocaine)、鄰卡因(orthocaine)、息痛佳音(oxethazaine)、對乙氧卡因(parethoxycaine)、芬那卡因(phenacaine)、酚(phenol)、匹派魯卡因(piperocaine)、匹多卡因(piridocaine)、聚多卡醇(polidocanol)、普拉莫星(pramoxine)、必洛卡因(prilocaine)、普魯卡因(procaine)、丙泮卡因(propanocaine)、普洛拍拉卡因(proparacaine)、丙哌卡因(propipocaine)、丙氧卡因(propoxycaine)、假可卡因(psuedococaine)、吡咯卡因(pyrrocaine)、羅哌卡因(ropivacaine)、水楊醇(salicyl alcohol)、特他卡因(tetracaine)、托利卡因(tolycaine)、三甲卡因(trimecaine)、佐拉明(zolamine)、及其鹽。於一實施態樣中，麻醉劑可為利多卡因，例如呈利多卡因鹽酸鹽形式。
於根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料中，填料中所含麻醉劑之濃度，以填料總重為基準計，可為組成物之約0.1重量%至約1.0重量%，例如，約0.2重量%至約0.5重量%。較佳的，可為0.3重量%。
此外，本文所述之組成物中的麻醉劑之濃度可為治療有效濃度，意指其為就外科手術的便利性及病患順從性而言足以提供治療益處而不會對病患有害之濃度。
根據本發明之填料可進一步包括緩衝劑，只要是用於玻尿酸水凝膠之製備，可使用任何緩衝劑而無限制。此緩衝劑之較佳實例包括選自由下列所組成之群組中之至少一緩衝劑：檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙酸、二乙基巴比妥酸(diethyl barbituric acid)、乙酸鈉、參(羥基甲基)甲基胺基)丙磺酸)(tris(hydroxymethyl) methylamino)propanesulfonic acid))(TAPS)、2-雙(2-羥基乙基)胺基)乙酸(Bicine)、參(羥基甲基)銨甲烷(tris(hydroxymethyl)ammonium methane)(Tris)、N-(2-羥基-1,1-雙(羥基甲基)乙基)甘胺酸(N-(2-hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl)glycine)(Tricine)、4-(2-羥基乙基)-1-哌𠯤乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)(HEPES)、2-[[1,3-二羥基-2-(羥基甲基)丙-2-基]胺基]甲磺酸(2-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]amino]methanesulfonic acid)(TES)、及哌𠯤-N,N’-雙(2-乙磺酸)(piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid))(PIPES)，但不限於此。可適當調整緩衝液中所含組分之含量，較佳可含有相對於緩衝劑為0.3至2.0 g/L之濃度。
此外，根據本發明之填料可進一步包括等滲壓劑(isotonic agent)，只要是用於玻尿酸水凝膠之製備，可使用此滲壓劑而無限制，以及可包含於緩衝劑中。作為較佳等滲壓劑，可使用氯化鈉，但等滲壓劑不限於此。等滲壓劑之含量可視需要適當調整，以及含量可為例如7.0至9.0 g/L(相對於緩衝劑)，但不限於此。
根據本發明之一實施態樣中，使用含有氯化鈉、磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉(於注射用水中)的緩衝劑。
於另一態樣中，除上述組分外，根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料可進一步包括可包含於填料製備中的可接受組分。
此外，本發明之特徵在於具有根據方程式3之高參數值的玻尿酸填料中實質上不含殘餘交聯劑，殘餘交聯劑之含量較佳為0.5 ppm或更低，其為檢測極限(limit of detection)。
根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料藉由具有在60至180之範圍的根據方程式3之特性參數而展現彈性、內聚性、生物相容性及毒性方面之優異性質，因而，可極有效地用於美容或治療目的。作為一具體實例，含有玻尿酸水凝膠之填料可用於因填充生物組織及填充皺紋而改善皺紋，臉部重塑，或諸如嘴唇、鼻子、臀部、臉頰或胸部之軟組織的修復或增加體積。含有玻尿酸水凝膠之填料可以適合此等目的之劑型投予，較佳可為注射。
於另一態樣中，本發明係關於具有如上述之高黏彈性及內聚性的含有玻尿酸水凝膠之填料的製備方法，該方法包括下列步驟： (a)將玻尿酸或其鹽置入交聯劑及鹼性水溶液中，攪拌該混合物然後使之反應以製備交聯的玻尿酸水凝膠； (b)將步驟(a)所製備之該玻尿酸水凝膠粗略切碎； (c)製備緩衝液； (d)使用步驟(c)所製備之該緩衝液清洗及溶脹(swelling)步驟(b)所製備之切碎的玻尿酸水凝膠； (e)將步驟(d)中經清洗且經溶脹之玻尿酸水凝膠壓碎(crushing)；以及 (f)將步驟(e)所製備之水凝膠填入注射器，然後將其滅菌。
步驟(a)為在鹼性水溶液相中使用交聯劑交聯玻尿酸或其鹽以製備交聯的玻尿酸水凝膠之步驟，且關於玻尿酸或其鹽、交聯劑、及交聯的玻尿酸水凝膠之相關事項，於包括玻尿酸水凝膠之填料中所述者可類似地應用。
特別是，根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料的製備方法之特徵係使用具有平均分子量為2,000,000 Da或更高、2,300,000 Da或更高、或2,500,000 Da或更高，例如，2,000,000至4,000,000 Da、2,300,000至4,000,000 Da、2,000,000至3,700,000 Da、2,200,000至3,700,000 Da、或2,500,000至3,500,000 Da的聚合物玻尿酸(polymer hyaluronic acid)。此外，只要已知為適於製備玻尿酸水凝膠之鹼性水溶液，可使用該鹼性水溶液而無限制。例如，其可為NaOH、KOH、NaHCO3 、LiOH或其組合，較佳為NaOH。鹼性水溶液之濃度可為0.1至0.5N，但不限於此。使用在如上述分子量範圍之玻尿酸時，在交聯用之鹼性水溶液中之降解效應相對小，因而可製備具有強物理性質之交聯的玻尿酸凝膠。
此外，根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料的製備方法之特徵在於以高濃度反應玻尿酸或其鹽。具體而言，以鹼性水溶液之混合物的總重為基準計，玻尿酸或其鹽之濃度為10至25重量%，且交聯劑之濃度相對於上述添加之玻尿酸或其鹽的單位為1至10 mol%。使用超過上述範圍之高濃度的交聯劑濃度時，獲得具有過高彈性的填料。濃度低於上述範圍時，彈性過低，因而無法展現適當黏彈性。具體而言，步驟(a)可藉由將玻尿酸或其鹽與交聯劑及鹼性水溶液混合、攪拌且均勻地混合該混合物來進行。交聯反應可於室溫或更高溫度進行，較佳係於25至40℃之範圍的溫度進行15至22小時。
至於切碎步驟(cutting step)，可使用各種已知之玻尿酸水凝膠切碎步驟。於一實施態樣中，可獲得呈餅(cake)狀之於反應後製備之交聯的凝膠，以及可使用諸如切草器(straw cutter)之切具將此分成半月形，例如分成六份。然後，切碎程序可藉由使用具有固定刀刃間隔之粗切機(rough cutting machine)使如上述切開之凝膠通過(較佳為二或更多次)來進行。
步驟(c)為製備用以清洗及溶脹步驟(b)中所切碎之交聯的玻尿酸水凝膠之緩衝液的步驟，且該緩衝液可根據已知之緩衝液製備方法製備。此外，緩衝液可進一步包括麻醉劑。於本發明一具體實施態樣中，緩衝液係藉由將磷酸一氫鈉(sodium monohydrogen phosphate)(12水合物(12 hydrate))、一水合磷酸二氫鈉(sodium dihydrogen phosphate monohydrate)(一水合物(monohydrate))、氯化鈉、及利多卡因鹽酸鹽(lidocaine hydrochloride)溶於含有注射用水之緩衝槽(buffer tank)中而製備。只要是用於玻尿酸水凝膠之製備，可使用緩衝液而無限制。此緩衝液之較佳實例包括選自由下列所組成之群組中之至少一緩衝液：檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙酸、二乙基巴比妥酸、乙酸鈉、參(羥基甲基)甲基胺基)丙磺酸)(TAPS)、2-雙(2-羥基乙基)胺基)乙酸(Bicine)、參(羥基甲基)銨甲烷(Tris)、N-(2-羥基-1,1-雙(羥基甲基)乙基)甘胺酸(Tricine)、4-(2-羥基乙基)-1-哌𠯤乙磺酸(HEPES)、2-[[1,3-二羥基-2-(羥基甲基)丙-2-基]胺基]甲磺酸(TES)、及哌𠯤-N,N’-雙(2-乙磺酸)(PIPES)，但不限於此。
步驟(d)為以步驟(c)所製備之緩衝液清洗及溶脹步驟(b)中所切碎之交聯的玻尿酸水凝膠之步驟，且該步驟(d)可重複一或多次。完成清洗及溶脹時，可去除洗滌液。
步驟(e)為壓碎經清洗及溶脹的水凝膠之步驟，且該壓碎可以各種壓碎方法進行，但較佳為擠出(extrusion)。
於另外的實施態樣中，可對步驟(e)之後所製備的水凝膠進行諸如滅菌及/或消泡之程序。其可定量填充於適合的容器(諸如注射器)中、密封以及滅菌。[ 有利效果 ]
由於根據本發明之填料具有填料中所含玻尿酸的單位含量(w/w%)之拉提能力(相對於特定修飾度)之數值特徵，其展現改良之高黏彈性質，同時具有單相玻尿酸水凝膠填料及雙相玻尿酸水凝膠填料之優點，因而展現高組織回復性質。此外，注入皮膚時，其不僅長時間維持其形狀同時具有低位移可能性，而且亦可因使用最少量交聯劑而可使玻尿酸之修飾最小化以及可使玻尿酸分子維持自然狀態及降低免疫反應及副作用的可能性，而且在軟組織(諸如臉頰、胸部、鼻子、嘴唇及臀部)回復或體積膨脹及皺紋改善性質方面優異。
下文，茲以實例更詳細說明本發明。然而，該等實例僅供舉例說明目的，本發明之範圍不限於該等實例或受其限制。[ 實施例 ] 實施例 1 ：根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料的製備 1
為製備根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料，進行下列程序。
秤重分子量為2.5 MDa至3.5 MDa之玻尿酸鈉(sodium hyaluronate)、氫氧化鈉、及1,4-丁二醇二環氧丙基醚(1,4-butandiol diglycidyl ether)(BDDE)。於反應期間，玻尿酸鈉之濃度為16 wt%，且相對於所添加之玻尿酸鈉單位的BDDE之mol%為4%。另外製備及過濾濃度為0.25 N之氫氧化鈉(NaOH)水溶液。將秤重的玻尿酸鈉、0.25N氫氧化鈉水溶液、及1,4-丁二醇二環氧丙基醚(BDDE)置入混合槽且均勻地混合，及將該混合槽置入恆溫水浴並在30℃溫度下反應隔夜以完成交聯反應。然後，將反應後之交聯的玻尿酸水凝膠粗略切碎。並且，將鹽及麻醉劑溶於含有注射用水之緩衝槽中，使磷酸氫二鈉水合物(sodium hydrogen phosphate hydrate)(十二水合物(dodecahydrate))之濃度為1.26 g/L、一水合磷酸二氫鈉(一水合物)之濃度為0.46 g/L、氯化鈉之濃度為7 g/L，及利多卡因鹽酸鹽之濃度為3 g/L，以製備緩衝液。
使用一些緩衝液作為第一緩衝液(primary buffer solution)，且經由0.22 μm過濾器移至清洗槽。將先前製備之粗略切碎的玻尿酸水凝膠移至含有第一緩衝液之清洗槽然後予以攪拌。對玻尿酸水凝膠進行第一清洗及溶脹，然後，於溶脹完成時，去除清洗溶液。隨後，經由0.22 μm過濾器將第二緩衝液(secondary buffer solution)移至清洗槽，然後予以攪拌，對水凝膠進行第二清洗及溶脹，然後，於清洗及溶脹完成時，去除清洗溶液。之後，經由適合的0.22 μm過濾器將第三緩衝液(tertiary buffer solution)移至清洗槽然後予以攪拌，對玻尿酸水凝膠進行第三清洗及溶脹。然後，於清洗及溶脹完成時，去除清洗溶液。
完成第三清洗及溶脹之後，確認清洗溶液的pH係在中性範圍，並將經清洗及溶脹之玻尿酸水凝膠壓碎然後移至擠出機槽(extruder tank)以測量重量，添加緩衝液以使凝膠之重量達到目標重量，並進行第一次含量校正(primary content correction)。第一次含量校正完成時，將玻尿酸水凝膠壓碎且移至擠出機槽。之後，將壓碎的玻尿酸水凝膠移至熱處理槽並均質化，其後測量含量，並將緩衝液添加至其中以進行第二次含量校正(secondary content correction)。於121℃或更高之溫度下熱處理第二次含量校正後之玻尿酸水凝膠至少1分鐘，於裝載入注射器之前在減壓下攪拌該玻尿酸水凝膠以進行除氣(degassing)。之後，將預定量之玻尿酸水凝膠真空填充(vacuum-fill)至各注射器，同時以橡膠塞塞住。已填充之注射器在最終滅菌器中於121℃或更高的溫度下蒸汽滅菌(steam sterilize)至少8分鐘。 實施例 2 ：根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料的製備 2
為製備根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料，進行下列程序。
秤重分子量為2.5 MDa至3.5 MDa之玻尿酸鈉、氫氧化鈉、及1,4-丁二醇二環氧丙基醚(BDDE)。於反應期間，玻尿酸鈉之濃度為15 wt%，且相對於所添加之玻尿酸鈉單位的BDDE之mol%為4%。另外製備及過濾濃度為0.25 N之氫氧化鈉(NaOH)水溶液。將秤重的玻尿酸鈉、0.25N氫氧化鈉水溶液、及1,4-丁二醇二環氧丙基醚(BDDE)置入混合槽且均勻地混合，及將該混合槽置入恆溫水浴並在30℃溫度下反應隔夜以完成交聯反應。然後，將反應後之交聯的玻尿酸水凝膠粗略切碎。並且，將鹽及麻醉劑溶於含有注射用水之緩衝槽中，使磷酸氫二鈉水合物(十二水合物)之濃度為1.26 g/L、一水合磷酸二氫鈉(一水合物)之濃度為0.46 g/L、氯化鈉之濃度為7 g/L，及利多卡因鹽酸鹽之濃度為3 g/L，以製備緩衝液。
使用一些緩衝液作為第一緩衝液，且經由0.22 μm過濾器移至清洗槽。將先前製備之粗略切碎的玻尿酸水凝膠移至含有第一緩衝液之清洗槽然後予以攪拌。對玻尿酸水凝膠進行第一清洗及溶脹，然後，於溶脹完成時，去除清洗溶液。隨後，經由0.22 μm過濾器將第二緩衝液移至清洗槽，然後予以攪拌，對水凝膠進行第二清洗及溶脹，然後，於清洗及溶脹完成時，去除清洗溶液。之後，經由適合的0.22 μm過濾器將第三緩衝液移至清洗槽然後予以攪拌，對玻尿酸水凝膠進行第三清洗及溶脹。然後，於清洗及溶脹完成時，去除清洗溶液。
完成第三清洗及溶脹之後，確認清洗溶液的pH係在中性範圍，並將經清洗及溶脹之玻尿酸水凝膠壓碎然後移至擠出機槽以測量重量，添加緩衝液以使凝膠之重量達到目標重量，並進行第一次含量校正。第一次含量校正完成時，將玻尿酸水凝膠壓碎且移至擠出機槽。之後，將壓碎的玻尿酸水凝膠移至熱處理槽並均質化，其後測量含量，並將緩衝液添加至其中以進行第二次含量校正。於121℃或更高之溫度下熱處理第二次含量校正後之玻尿酸水凝膠至少1分鐘，於裝載入注射器之前在減壓下攪拌該玻尿酸水凝膠以進行除氣。之後，將預定量之玻尿酸水凝膠真空填充至各注射器，同時以橡膠塞塞住。已填充之注射器在最終滅菌器中於121℃或更高的溫度下蒸汽滅菌至少10分鐘。 實驗例 1 ：包含根據本發明製備之玻尿酸水凝膠之填料之基於方程式 3 的參數研究
使用流變計(rheometer)分析所製備之實施例1及2的流變性質。為了與本發明之填料比較，亦分析及比較市售之含玻尿酸水凝膠的填料調配物之彈性。市售填料調配物(如比較例1至10)及分析條件如下。＜ 比較例 1 至 10＞ 比較例1：具有利多卡因(Lidocaine)之Juvederm Volift 比較例2：具有利多卡因之Juvederm Voluma 比較例3：Stylage M利多卡因 比較例4：Stylage L利多卡因 比較例5：Stylage XL利多卡因 比較例6：Teosyal PureSense Deepline利多卡因 比較例7：Teosyal PureSense Ultradeep利多卡因 比較例8：Teosyal PureSense Ultimate利多卡因 比較例9：Belotero Intense利多卡因 比較例10：Belotero Volume利多卡因 ＜分析條件＞儲存彈性模數 (G') 之分析條件 (1)測試儀器：流變計(Anton Paar Ltd., MCR301)振盪及旋轉流變計(Oscillatory and Rotational Rheometer) (2)頻率：1 Hz (3)溫度：25℃ (4)應變(Strain)：4 % (5)測量幾何(Measuring geometry)：25 mm板/板(25 mm plate/plate) (9)測量間隙(Measuring gap)：1.0 mm根據黏性試驗之內聚力之分析條件 (1)測試儀器：流變計(Anton Paar Ltd., MCR301)振盪及旋轉流變計 (2)間隙：初始位置：1.0 mm，最終位置：15 mm (3)速度：0.93 mm/s (4)溫度：25℃ (5)測量幾何：25 mm板/板修飾度之分析條件 (1)測試儀器：FT-NMR系統(Jeol Ltd., ECA500/ ECZ400S)， (2)脈衝(Pulse)：30˚ (3)掃描(Scans)：512 (4)鬆弛時間(Relaxation time)(延遲(delay))：5 s (5)溫度：25℃
於上述分析條件下，各頻率之儲存彈性模數(G′)，以及藉由黏性試驗所測量之內聚性係顯示於下表1。此外，拉提能力係由儲存彈性模數及內聚性計算(基於方程式1)，而修飾度係根據方程式2計算。基於此，根據方程式3計算相關於修飾度之填料中所含玻尿酸的單位含量(w/w%)之拉提能力，然後各數值結果係顯示於下表1。
Figure 02_image001
由表1可看出，確認根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料的根據方程式3之參數顯示為71.3及177.7 Pa*N/(w/w)%)/mol%，然而比較例1至9之其他市售填料顯示數值為9.2至23.4 Pa *N/(w/w)%)/mol%)。即，可看出相較於其他市售填料，根據本發明之含有玻尿酸水凝膠之填料顯示根據方程式3之參數值的差異為至少3倍(實施例2相較於比較例5)，至多達19倍(實施例1相較於比較例9)。確認比較例1至10中，許多填料的拉提能力亦不比實施例1及2高，以及一些比較例中拉提能力顯示與實施例2相同數值但修飾度之數值高，因而根據方程式3之實際參數大幅下降。
綜上所述，可確認根據本發明之實施例1及2展現根據方程式3之高參數值，即，填料中所含玻尿酸的單位含量(w/w%)之拉提能力(相對於修飾度)為高的。因而，該填料不僅展現顯著物理性質，且亦展現低修飾度。由此可看出，使用少量交聯材料可降低將該填料注入體內期間因交聯劑而可能發生之副作用的可能性，因而最適合作為用於注入人體的填料。

Claims (26)

  1. 一種填料，其包含包括玻尿酸之玻尿酸水凝膠(hyaluronic acid hydrogel)，其中，該玻尿酸為交聯的玻尿酸；其中，根據下列方程式3，該填料中所含玻尿酸的單位含量(w/w%)之拉提能力相對於修飾度(mol%)的比率表示為60至180((Pa*N/(w/w)%)/mol%)：[方程式3]每玻尿酸單位含量之拉提能力相對於修飾度=A/B其中，A表示將下列方程式1所示之拉提能力除以該填料所含玻尿酸的單位含量(w/w%)所得之值，而B表示下列方程式2所示之修飾度：[方程式1]拉提能力(Pa*N)=儲存彈性模數X內聚力 [方程式2]修飾度(mol%)=(鍵結至整個玻尿酸分子的交聯劑之總莫耳數/(N-乙醯基-D-葡萄糖胺+D-葡萄糖醛酸)之總莫耳數)*100。
  2. 如請求項1之包含包括玻尿酸之玻尿酸水凝膠的填料，其中，A值表示為200至650((Pa*N/(w/w)%)/mol%)。
  3. 如請求項1之包含包括玻尿酸之玻尿酸水凝膠的填料，其中，B值表示修飾度為2至5mol%。
  4. 如請求項1之包含包括玻尿酸之玻尿酸水 凝膠的填料，其中，儲存彈性模數(storage elastic modulus)表示為400至800Pa，以及藉由黏性試驗(Tack test)測量之內聚力(cohesive force)表示為1.0至1.7N。
  5. 如請求項1之包含包括玻尿酸之玻尿酸水凝膠的填料，其中，該填料具有單相(monophasic)玻尿酸填料及雙相(biphasic)玻尿酸填料之所有性質。
  6. 如請求項1之包含包括玻尿酸之玻尿酸水凝膠的填料，其中，該交聯的玻尿酸係藉由交聯玻尿酸或其鹽而獲得。
  7. 如請求項6之包含包括玻尿酸之玻尿酸水凝膠的填料，其中，該交聯的玻尿酸係藉由交聯具有分子量為2,500,000Da或更高之玻尿酸或其鹽而獲得。
  8. 如請求項6之包含包括玻尿酸之玻尿酸水凝膠的填料，其中，該交聯的玻尿酸係藉由以選自由下列所組成之群組中之至少一種交聯劑交聯而獲得：1,4-丁二醇二環氧丙基醚(BDDE)、乙二醇二環氧丙基醚(EGDGE)、1,6-己二醇二環氧丙基醚、丙二醇二環氧丙基醚、聚丙二醇二環氧丙基醚、聚四亞甲基二醇二環氧丙基醚(polytetramethylene glycol diglycidyl ether)、新戊二醇二環氧丙基醚、聚甘油聚環氧丙基醚(polyglycerol polyglycidyl ether)、二甘油聚環氧丙基醚(diglycerol polyglycidyl ether)、甘油聚環氧丙基醚(glycerol polyglycidyl ether)、三甲基丙烷聚環氧丙基醚(tri-methylpropane polyglycidyl ether)、1,2-(雙(2,3-環氧基丙 氧基)伸乙基(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene)、新戊四醇聚環氧丙基醚(pentaerythritol polyglycidyl ether)、及山梨醇聚環氧丙基醚(sorbitol polyglycidyl ether)。
  9. 如請求項8之包含包括玻尿酸之玻尿酸水凝膠的填料，其中，該交聯劑為1,4-丁二醇二環氧丙基醚(BDDE)。
  10. 如請求項8之包含包括玻尿酸之玻尿酸水凝膠的填料，其中，該交聯劑之殘留量為0.5ppm或更低。
  11. 如請求項1之包含包括玻尿酸之玻尿酸水凝膠的填料，其進一步包含麻醉劑。
  12. 如請求項11之包含包括玻尿酸之玻尿酸水凝膠的填料，其中，該麻醉劑為利多卡因(lidocaine)或其鹽。
  13. 如請求項11之包含包括玻尿酸之玻尿酸水凝膠的填料，其中，該填料係用於皮膚注射。
  14. 如請求項11之包含包括玻尿酸之玻尿酸水凝膠的填料，其中，該填料係用於改善皺紋、軟組織回復(soft tissue restoration)或體積膨脹、或者塑形(contouring)。
  15. 一種如請求項1至14中任一項之包含玻尿酸水凝膠的填料之製備方法，該方法包括下列步驟：(a)將玻尿酸或其鹽置入交聯劑及鹼性水溶液中，攪拌該混合物以製備交聯的玻尿酸水凝膠； (b)將步驟(a)所製備之該玻尿酸水凝膠粗略切碎；(c)製備緩衝液；(d)使用步驟(c)所製備之該緩衝液清洗及溶脹(swelling)步驟(b)所製備之粗略切碎的玻尿酸水凝膠；(e)將步驟(d)中經清洗且經溶脹之玻尿酸水凝膠壓碎；以及(f)將步驟(e)所製備之水凝膠填入注射器，然後將其滅菌。
  16. 如請求項15之製備方法，其中，該鹼性水溶液為NaOH、KOH、NaHCO3、LiOH或其組合之水溶液。
  17. 如請求項15之製備方法，其中，該鹼性水溶液具有0.1N至0.5N之濃度。
  18. 如請求項15之製備方法，其中，該交聯劑為1,4-丁二醇二環氧丙基醚。
  19. 如請求項15之製備方法，其中，玻尿酸或其鹽之濃度為該玻尿酸或其鹽相對於該玻尿酸或其鹽與鹼性水溶液的混合物之總重的重量比，且為10至25重量%。
  20. 如請求項15之製備方法，其中，步驟(a)係於25至40℃進行15至22小時。
  21. 如請求項15之製備方法，其中，步驟(c)之該緩衝液包括選自由下列所組成之群組中之至少一者：檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙酸、二乙基巴比妥 酸(diethyl barbituric acid)、乙酸鈉、參(羥基甲基)甲基胺基)丙磺酸)(TAPS)、2-雙(2-羥基乙基)胺基)乙酸(Bicine)、參(羥基甲基)銨甲烷(tris(hydroxymethyl)ammonium methane)(Tris)、N-(2-羥基-1,1-雙(羥基甲基)乙基)甘胺酸(Tricine)、4-(2-羥基乙基)-1-哌
    Figure 108146661-A0305-02-0035-1
    乙磺酸(HEPES)、2-[[1,3-二羥基-2-(羥基甲基)丙-2-基]胺基]甲磺酸(TES)、及哌
    Figure 108146661-A0305-02-0035-2
    -N,N’-雙(2-乙磺酸)(PIPES)。
  22. 如請求項15之製備方法，其中，該緩衝液進一步包括麻醉劑及等滲壓劑。
  23. 一種預填充之注射器，其填充有如請求項1至14中任一項之包含玻尿酸水凝膠的填料。
  24. 一種用於組織回復(tissue restoration)之生物材料，其包含如請求項1至14中任一項之玻尿酸水凝膠填料。
  25. 一種用於組織回復之方法，其包含注射如請求項1至14中任一項之玻尿酸水凝膠填料。
  26. 一種用於改善皺紋之方法，其包含注射如請求項1至14中任一項之玻尿酸水凝膠填料。
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