KR101855878B1 - 진피 필러용 하이드로젤 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 기계적 물성 조절이 용이하고, 기계적 물성 및 지속성이 개선된 진피 필러용 하이드로젤 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 사용함으로써 높은 기계적 물성이 요구되는 신체 부위에 필러로서 적용이 가능하고, 본 발명의 방법을 이용하면 제조되는 진피 필러용 하이드로젤의 기계적 물성을 용이하게 조절할 수 있다.

Description

진피 필러용 하이드로젤 조성물{Hydrogel Composition for Dermal Fillers}
본 발명은 기계적 물성 조절이 용이하고, 기계적 물성 및 지속성이 개선된 진피 필러용 하이드로젤 조성물에 관한 것이다.
개인들의 미용에 관한 관심이 나날이 증대됨에 따라, 미용 성형 분야 또한 큰 발전을 거듭하고 있다. 비교적 큰 외형적 변화를 가져오는 외과적 수술 외에도, 간편한 주사 치료를 통해 주름 제거 등의 효과를 볼 수 있는 보톨리늄 독소(예를 들어, 상표명 "보톡스"), 필러(filler) 등의 주입은 날로 보편화 되고 있다. 진피 필러는, 예를 들어 안면 라인 개선 및 주름 감소 등을 위해 환자에게 주입되는 제제이고, 주름을 일으키는 안면 근육을 마비시키는 원리를 이용하는 보톡스와는 달리, 안면 주름 및 패인 곳에 주입되어 공간을 채워넣는 원리를 이용한다.
종래 필러의 소재로서 생체친화 소재인 히알루론산 계열 화합물이 빈번하게 이용되어 왔다.
히알루로난(Hyaluronan)으로도 알려진 히알루론산(HA)은 인체 전체에 걸쳐 결합, 상피 및 신경 조직에 널리 분포되어 있는 비-설페이트화된 글리코스아미노글리칸이다. 히알루론산은 피부의 여러 상이한 층에 풍부하며, 예를 들면, 양호한 수분공급을 보장하는 기능, 세포외 매트릭스의 조직을 보조하는 기능, 충전물질로서 작용하는 기능; 및 조직 재생 메커니즘에 관여하는 기능과 같은 복합적인 기능을 갖는다. 그러나, 노화와 더불어, 피부에 존재하는 히알루론산, 콜라겐, 엘라스틴, 및 다른 매트릭스 중합체의 양은 감소한다. 예를 들면, 예컨대, 태양으로부터의 자외선에 대한 반복적 노출은 진피 세포로 하여금 이들의 히알루로난의 생산을 줄이는 것은 물론이고 이의 분해 속도를 증가시키게 한다. 이러한 물질의 손실은, 예컨대, 주름, 구멍, 수분 손실, 및/또는 노화에 기여하는 기타 바람직하지 않은 상태를 유발한다. 주사가능한 진피 필러는 피부 노화에 성공적으로 사용되고 있다. 진피 필러는, 이들 피부 상태를 치료하기 위해, 손실된 내생적인 매트릭스 중합체를 대체하거나, 또는 기존의 매트릭스 중합체의 기능을 증진/촉진할 수 있다.
종래 히알루론산으로 만들어진 필러는 레스틸렌(Restylane), 이브아르(Ivoire), 큐젤(Cutegel), 쥬비덤(Juvederm) 퍼펙타(Perfectha), 테오시알(Teosyal), 로필란(Rofilan), 엘레베스(Elevess), 엘라비에(Elavie), 글라이톤(Glytone), 프린세스(Princess) 등이 있으나, 장기적인 사용이 어렵고, 코 높임 등 의 용도로 이용하기에는 기계적 물성(G')이 낮은 문제가 있었다. 따라서, 장기 지속되는 필러로서 폴리메틸메타아크릴레이트, 칼슘 하이드록실아파타이트, 폴리락틱산, 폴리알킬리마이드 등의 무기물질을 필러 소재로 이용하고 있는 실정이다.
생체적합성이 뛰어난 소재인 히알루론산을 이용하면서도, 기계적 물성(G')이 용이하게 조절되고, 높은 기계적 물성을 발휘할 수 있으며, 지속성이 개선된 필러 소재의 개발될 필요성이 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 기계적 물성 조절이 용이하고, 기계적 물성 및 지속성이 개선된 진피 필러용 하이드로젤 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 알긴산이 결합된 히알루론산을 이가 양이온에 의해 가교시키는 경우, 종래 히알루론산 하이드로젤에 비하여 기계적 물성 및 지속성이 개선된 진피 필러용 하이드로젤을 제조할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 진피 필러용 하이드로젤 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 진피 필러용 하이드로젤의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 히알루론산, 상기 히알루론산에 결합된 알긴산, 및 이온 가교제를 포함하는 이온 가교성 히알루론산 하이드로젤;을 포함하고, 상기 이온 가교제는 2가의 양이온 또는 이의 염인 것을 특징으로 하는 진피 필러용 하이드로젤 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 기계적 물성 조절이 용이하고, 기계적 물성 및 지속성이 개선된 진피 필러용 하이드로젤 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 알긴산이 결합된 히알루론산을 이가 양이온에 의해 가교시키는 경우, 종래 히알루론산 하이드로젤에 비하여 기계적 물성 및 지속성이 개선된 진피 필러용 하이드로젤을 제조할 수 있음을 규명하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "진피 필러"는 대상(subject)의 피부에 형성된 주름, 함몰, 흉터 등의 개선 또는 치료를 위해 사용되는 것으로서, 구체적으로는 이마, 미간, 팔자주름과 같은 주름의 개선, 코 높임, 피부 국소부 부피의 증가, 흉터 부위 개선 등의 목적을 위해 진피에 주입하기 위한 생체적합성 물질을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "화학가교 히알루론산 필러"는 화학 가교제를 사용하여 제조된 종래의 히알루론산 필러를 의미할 수 있고, 화학가교제를 첨가하여 제조된 히알루론산 필러라면 모두 해당될 수 있으며, 현재 상용화되어 판매되고 있는 필러 제품인 레스틸렌(Restylane), 이브아르(Ivoire), 큐젤(Cutegel), 쥬비덤(Juvederm) 퍼펙타(Perfectha), 테오시알(Teosyal), 로필란(Rofilan), 엘레베스(Elevess), 엘라비에(Elavie), 글라이톤(Glytone), 프린세스(Princess) 등을 예로 들 수 있다.
본 발명에 따른 진피 필러용 하이드로젤 조성물은 화학가교 히알루론산 필러를 더 포함할 수 있고, 이를 통해 하기 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 진피 필러의 기계적 물성을 월등히 향상시킬 수 있다.
이때, 상기 이온 가교성 히알루론산 하이드로젤과 상기 화학가교 히알루론산 필러의 중량비는 1:1-9일 수 있고, 더욱 구체적으로는 1:1일 수 있다.
본 발명의 진피 필러용 하이드로젤 조성물은 알긴산이 도입된 히알루론산이 2가 양이온에 의하여 가교됨으로써 하이드로젤을 형성하게 된다. 구체적으로 예를 들어 Ca2 +, Ba2 +, Cu2 +, Fe2 +, 및 Mg2 +와 같은 2가 양이온이 히알루론산에 도입된 알긴산과의 상호작용에 의해 가교를 일으키고, 하이드로젤을 형성하게 된다. 상기 하이드로젤은, 히알루론산과 알긴산이 결합되지 않은 단순 혼합물로부터 형성된 하이드로젤에 비하여 더욱 높은 기계적 물성(G')을 갖도록 조절될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 2가 양이온은 칼슘, 바륨 또는 마그네슘 이온일 수 있다. 본 발명의 칼슘, 바륨 또는 마그네슘 이온은 알긴산이 결합된 히알루론산에 대하여 설페이트 또는 클로라이드 염의 형태로 제공될 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 칼슘클로라이드, 칼슘 설페이트, 바륨 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 설페이트 등을 첨가함으로써 2가 양이온을 도입할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 10-3000 Pa의 기계적 물성(G')을 가질 수 있다. 더 구체적으로 20-3000 pa, 더욱 더 구체적으로 500-3000 pa, 더욱 더 구체적으로 500-2500 pa, 더욱 더 구체적으로 1000-2500 pa, 더욱 더 구체적으로 1500-2500 pa의 기계적 물성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 1500-2500 pa의 기계적 물성을 가질 수 있으며, 상기 조성물은 골격 보강용 진피 필러 조성물로서 이용할 수 있다. 종래 히알루론산 필러의 경우, 골격 보강용으로 사용하기에 기계적 물성이 낮은 문제가 있었으나, 본 발명의 하이드로젤을 이용하는 경우, 개선된 기계적 물성으로 인해 골격 보강 용도로 이용할 수 있다. 본 명세서 상의 용어 "골격 보강용"이란 콧대, 광대, 턱선을 포함하는 안면 윤곽에 변형을 가하기 위한 용도를 의미할 수 있으며, 상기 골격 보강용 진피 필러의 경우 주름 제거의 목적을 갖는 필러에 비해 높은 기계적 물성을 요할 수 있다.
본 명세서 상의 용어 기계적 물성(G')은 전단 저장 계수(shear storage modulus) 또는 탄성계수(Elastic modulus)를 의미할 수 있고, 구체적으로 전당 저장 계수는 시료에 밀어주는 힘을 전달하여 전단시험을 함으로써 시료에 일정한 변형을 가하는데 필요한 힘을 의미할 수 있으며, 탄성계수는 시료를 잡아당기는 힘에 의해 전단시험을 함으로써 시료에 일정한 변형을 가하는데 필요한 힘을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 알긴산은 분자량이 10000-1000000 g/몰일 수 있고, 본 발명의 히알루론산은 분자량이 10000-2500000 g/몰일 수 있다. 보다 더 구체적으로는 본 발명의 알긴산은 분자량이 20000 내지 500000 g/몰인 것을 이용할 수 있고, 더욱 구체적으로는 50000 내지 500000 g/몰인 것을 이용할 수 있으며, 더욱 구체적으로 100000 내지 300000 g/몰인 것을 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 히알루론산은 분자량이 100000 내지 2500000 g/몰인 것을 이용할 수 있고, 더 구체적으로는 300000 내지 2500000 g/몰인 것을 이용할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 500000 내지 1500000 g/몰인 것을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 히알루론산과 알긴산의 중량비는 4:1 내지 1:2일 수 있다. 상술한 히알루론산과 알긴산의 중량비는 하이드로젤 조성물에 포함되는 히알루론산과 알긴산 각각의 총중량의 비율을 의미할 수 있다. 본 발명인 하이드로젤 조성물에 포함되는 히알루론산과 알긴산의 결합 조성비는 히알루론산젤의 기계적 물성(G')을 조절할 수 있는 요소 중에 하나로서, 진피 필러의 사용 부위 및 사용 목적에 따라 요구되는 물성의 달성을 위해 히알루론산과 알긴산의 결합 조성비를 적절하게 조절할 수 있으며, 중량비로 나타낸 히알루론산과 알긴산의 결합 조성비는 4:1 내지 1:2 범위에서 적절하게 이용 할 수 있다. 더 구체적으로는 히알루론산과 알긴산을 2:1 내지 1:1.5, 더욱 더 구체적으로는 2:1 내지 1:1의 중량비로 이용할 수 있다.
본 발명의 2가 양이온은 하이드로젤의 제조과정에서 원하는 기계적 물성의 달성을 위해 그 양을 원하는 범위에서 조절하여 사용할 수 있다. 2가 양이온의 종류 및 그 염의 형태에 따라, 용해도 등을 고려하여 적절한 양을 선정하여 혼합할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 2가 양이온 염은 5 mM 내지 100 mM의 칼슘 설페이트일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 2가 양이온 염은 1 mM 내지 50 mM의 칼슘 클로라이드일 수 있다.
칼슘 클로라이드를 이용하는 경우, 칼슘 설페이트를 이용하는 경우에 비하여 더욱 소량의 사용만으로도 높은 기계적 물성을 갖는 하이드로젤을 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 히알루론산과 알긴산의 결합은 공유결합일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 공유결합은 알긴산의 카복실기 및 히알루론산의 카복실기와 공유결합-형성 가능한 링커를 통해 이루어진 것일 수 있다. 본 발명의 공유결합은 히알루론산과 알긴산 사이의 직접적인 결합일 수 있고, 또는 상술한 바와 같이 링커를 통한 결합일 수 있다. 본 발명의 링커는 하나의 분자가 히알루론산과 알긴산 모두와 결합을 형성하고, 이에 의해 히알루론산과 알긴산을 결합시키는 역할을 한다. 보다 더 구체적으로 본 발명의 링커는 히알루론산에 포함된 카복실기 및 알긴산에 포함된 카복실기와 공유결합 형성이 가능한 적어도 2개 이상의 기능기 부분을 포함하는 당업계에 공지된 링커를 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 링커는 다이아민, 다이비닐설폰, 1,4-뷰테인다이올, 다이글리시딜 에테르(BDDE) 및 글루타르알데히드, 카보다이이미드, 하이드록시석신이미드, 이미도에스터, 말레이미드, 할로아세틸, 다이설파이드, 하이드로아자이드, 알콕시아민으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다. 보다 더 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 링커로서 다이아민을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 진통제를 추가적으로 더 포함할 수 있다. 본 발명의 진피 필러용 하이드로젤 조성물은 국소 주사를 통해 진피 내로 주입되고, 주입된 부위에서 단기적인 통증을 유발할 수 있다. 이러한 통증을 완화시키기 위하여 진통제를 추가적으로 주사할 수도 있으나, 진통제가 포함된 하이드로젤 조성물을 이용함으로써 1회의 주사만으로 같은 효과를 달성할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 진통제는 리도카인, 메피바카인, 부피바카인, 프로카인, 클로로프로카인, 에티도카인, 프릴로카인 다이클로닌, 헥실카인, 프로카인, 코카인, 케타민, 몰핀, 프라목신, 프로포폴, 페놀, 날록손, 메페리딘, 부토르판올, 펜타조신, 몰핀-6-글루쿠로나이드, 코데인, 다이하이드로코데인, 다이아몰핀, 덱스트로프로폭시펜, 페티딘, 펜타닐, 알펜타닐, 알파프로딘, 부프레노르핀, 덱스트로모라미드, 다이페녹실레이트, 다이피파논, 헤로인(다이아세틸몰핀), 하이드로코돈(다이하이드로코데이논), 하이드로몰폰(다이하이드로몰피논), 레보파놀, 멥타지놀, 메타돈, 메토폰(메틸다이하이드로몰피논), 날부핀, 옥시코돈(다이하이드로하이드록시코데이논), 옥시몰폰(다이하이드로하이드록시몰피논), 페나독손, 페나조신, 레미펜타닐, 트라마돌, 테트라카인 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 더 구체적으로는 리도카인을 이용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 추가적인 약제학적으로 허용 가능한 수성 담체 또는 부형제와 혼합하는 것에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면 완충된 염수와 같은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 물론 피부학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체, 매체(vehicle) 또는 매질(medium)을 포함하는, 국소 약학적 또는 미용 약학적 조성물에서 전형적으로 사용되는 기타 성분들을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어, "피부학적으로 또는 약학적으로 허용가능한"은 상술한 조성물 또는 성분이 피부 접촉시 과다한 독성, 부적합성, 알레르기 반응 등을 유발하지 않는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 조성물은 선택적으로 완충제, 보존제, 등장 조절제, 염, 항산화제, 삼투질 농도 조절제, 유화제, 습윤제 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 약제학적으로 허용가능한 성분을 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 완충제는 본 명세서에 개시된 하이드로젤 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있는 완충제이며, 단, 얻어진 제제는 약제학적으로 허용가능하다. 약제학적으로 허용가능한 완충제의 비제한적 예는 아세테이트 완충제, 보레이트 완충제, 시트레이트 완충제, 중성 완충 식염수, 포스페이트 완충제 및 포스페이트 완충 식염수를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 완충제의 임의의 농도는 본 명세서에 개시된 하이드로젤 조성물을 제형화하는데 유용할 수 있으며, 단, 활성 성분의 유효량은 완충제의 이런 유효한 농도를 고려하여 계산될 수 있다. 생리적으로 허용가능한 완충제 농도는 예를 들어 약 0.1 mM 내지 약 900 mM의 범위이지만 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용가능한 완충제의 pH는 조절될 수 있으며, 단 얻어진 제제는 약제학적으로 허용가능하다. 필요한 경우 산 또는 염기가 하이드로젤 조성물의 pH를 조절하는데 사용될 수 있다. 임의의 완충된 pH 수준은 약제학적 조성물을 제형화하는데 유용할 수 있으며, 단, 기질 중 합체 활성 성분의 치료적 유효량은 이런 효과적인 pH 수준을 고려하여 계산될 수 있다. 생리적으로 허용가능한 pH는 예를 들어 약 pH 5.0 내지 약 pH 8.5의 범위 내이지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 하이드로젤 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0, 또는 약 6.5 내지 약 7.5, 약 7.0 내지 약 7.4, 또는 약 7.1 내지 약 7.3일 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 보존제는 나트륨 메타바이설파이트, 나트륨 티오설페이트, 아세틸시스테인, 뷰틸화된 하이드록시아니솔 및 뷰틸화된 하이드록시톨루엔을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로뷰탄올, 티메로살, 페닐수은 아세테이트, 페닐수은 나이트레이트, 안정화된 옥시클로로 조성물, 예를 들어, 퓨라이트(PURITE)(등록상표)(캘리포니아주 얼바인에 소재한 앨러건 인코포레이티드) 및 킬레이트제, 예를 들어, DTPA 또는 DTPA-비스아마이드, 칼슘 DTPA, 및 CaNaDTPA-비스아마이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 하이드로젤 조성물에 유용한 약제학적으로 허용 가능한 등장 조절제는, 예를 들어 염화나트륨 및 염화칼륨; 및 글라이세린과 같은 염을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 조성물은 염으로서 제공될 수 있으며, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 산에 의해 형성될 수 있다. 염은 대응되는 유리 염기 형태보다 수성 또는 다른 양성자성 용매 중에서 더 가용성인 경향이 있다. 이들 및 약학계에 공지된 다른 물질은 본 명세서에 개시된 하이드로젤 조성물에 포함될 수 있는 것으로 이해된다.
나아가 필요한 경우, 본원 조성물은 주름과 같은 피부 노화의 개선과 같은 미용용으로 또는 신경근육 관련 질환의 치료 분야에서 통상적으로 이용되는 임의의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 주사용 조성물로서, 미세한 바늘을 지니는 주사 장치를 이용하여 대상(subject)의 피부 영역에 투여되는 형태로 이용될 수 있다. 본 명세서 상의 용어 미세한 바늘을 지니는 주사 장치는 예를 들어 21 게이지 내지 32 게이지 정도의 바늘을 지니는 주사 장치를 의미할 수 있다. 대상(subject)에 대한 하이드로젤 조성물의 투여 경로는 전형적으로 대상(subject) 및/또는 시술자에 의해 요망되는 미용적 및/또는 임상적 효과, 그리고 조성물이 투여되는 신체 부분 또는 영역에 기반하여 결정될 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물은 국소적으로 또는 직접적 외과적 이식에 의해 바늘이 있는 주사기, 피스톨(예를 들어, 수공-압축 피스톨), 카테터를 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 개시된 하이드로젤 조성물은, 예를 들어, 진피 영역 또는 피하 영역과 같은 피부 영역 내로 투여될 수 있다.
본 발명의 하이드로젤 조성물의 적합한 투여량은 투여 방식, 대상(subject)의 연령, 체중, 성, 투여 시간 및 투여부위와 같은 요인들에 의해 다양하게 결정될 수 있다. 한편, 본 발명의 하이드로젤 조성물의 투여량은 바람직하게는 1회 당 0.001-100 mg/kg(체중)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 진피 필러용 하이드로젤 조성물의 제조 방법을 제공한다:
(a) 제1 반응 물질인 알긴산 또는 히알루론산과 링커를 반응시켜 알긴산 또는 히알루론산의 카르복실기에 링커를 공유 결합시키는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 반응 결과물에 제2 반응 물질인 히알루론산 또는 알긴산을 반응시켜, 링커를 통하여 연결된 알긴산-결합 히알루론산 개질체를 수득하는 단계; 및
(c) 생성된 알긴산-결합 히알루론산 개질체에 2가 양이온 또는 이의 염을 첨가하여 가교를 형성시켜 이온 가교성 히알루론산 하이드로젤을 수득하는 단계.
본 발명의 단계(a)는 알긴산 또는 히알루론산과 링커를 반응시켜 알긴산 또는 히알루론산의 카르복실기에 링커를 공유 결합시키는 단계로서, 이용되는 링커는 상술한 하이드로젤 조성물에 포함될 수 있는 링커와 동일하다. 본 명세서상의 용어 "제1 반응 물질"은 히알루론산 또는 알긴산 중 링커와 먼저 반응하여 결합을 형성하는 물질을 의미할 수 있다. 본 발명의 링커는 제1 반응 물질에 포함된 모든 카르복실기 전부에 결합할 수 있는 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 단계(b)는 링커가 결합된 히알루론산 또는 알긴산을 제2 반응 물질과 반응시켜 링커를 통해 히알루론산과 알긴산을 결합시키는 단계이다. 본 명세서상의 용어 "제2 반응 물질"은 히알루론산 또는 알긴산 중 제1 반응 물질로 선택된 화합물이 아닌 나머지 다른 화합물을 의미할 수 있다. 본 명세서상의 용어 "알긴산-결합 히알루론산 개질체"는 알긴산이 결합된 상태의 히알루론산을 의미할 수 있다. 히알루론산과 알긴산의 중량비를 조절함으로써, 생성되는 하이드로젤의 기계적 물성을 용이하게 조절하는 것이 가능하고, 특히 종래 히알루론산 하이드로젤에 비해 더욱 높은 기계적 물성(G')을 갖는 하이드로젤을 얻을 수 있다.
본 발명의 단계(c)는 생성된 알긴산-결합 히알루론산 개질체에 2가 양이온 또는 이의 염을 첨가하여 가교 반응을 일으켜 젤화시키는 단계이다. 첨가되는 2가 양이온과 알긴산의 상호작용에 의해 가교 반응이 일어나고, 이를 통해 하이드로젤을 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 (c) 단계 이후에, 상기 수득한 이온 가교성 히알루론산 하이드로젤을 화학가교 히알루론산 필러와 혼합하는 단계;를 더 포함할 수 있고, 이를 통해 하기 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 진피 필러의 기계적 물성을 월등히 향상시킬 수 있다.
이때, 상기 이온 가교성 히알루론산 하이드로젤과 상기 화학가교 히알루론산 필러의 혼합 중량비는 1:1-9일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 1:1일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 2가 양이온은 칼슘, 바륨 또는 마그네슘 이온일 수 있다. 본 발명의 칼슘, 바륨 또는 마그네슘 이온은 알긴산이 결합된 히알루론산에 대하여 설페이트 또는 클로라이드 염의 형태로 이용될 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 칼슘클로라이드, 칼슘 설페이트, 바륨 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 또는 마그네슘 설페이트 화합물의 형태로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 (c) 단계 이후에, 본 발명의 하이드로젤에 진통제를 첨가하는 단계를 추가적으로 더 포함한다.
본 발명에 따른 "진피 필러용 하이드로젤 조성물의 제조방법"은 본 발명의 다른 양태인 "진피 필러용 하이드로젤 조성물"을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 중복되는 내용을 원용하며, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 중복되는 내용에 대한 기재는 생략하도록 한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 이온 가교성 히알루론산 하이드로젤을 포함하는 화학가교-히알루론산 필러의 기계적 물성 보강용 조성물을 제공한다:
(a) 히알루론산;
(b) 상기 히알루론산에 결합된 알긴산; 및
(c) 이온 가교제로서의 2가 양이온 또는 이의 염.
종래 화학가교-히알루론산 필러의 경우, 상술한 바와 같이 화학가교제를 이용함으로써 발생하는 문제점 외에도, 높은 기계적 물성을 갖는 하이드로젤을 제조하는데 어려움이 있었다. 본 발명의 조성물을 이용하는 경우, 화학가교-히알루론산 필러의 기계적 물성을 보강하는 용도로 이용될 수 있다. 이는 종래 진피 필러용 조성물로 이용해온 공지의 물질을 그대로 이용하면서 손쉽게 기계적 물성에 변화를 줄 수 있다는 장점이 있고, 화학가교-히알루론산 필러에 의해 달성할 수 있는 기계적 물성의 한계를 보다 높여줄 수 있다는 장점이 있다.
이때, 상기 이온 가교성 히알루론산 하이드로젤과 상기 화학가교-히알루론산 필러의 중량비는 1:1-9일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 1:1일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 히알루론산은 분자량이 500000 g/몰 내지 2500000 g/몰일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 2가 양이온은 칼슘, 바륨 또는 마그네슘 이온일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 2가 양이온은 클로라이드 염의 형태로 첨가될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 클로라이드 염은 칼슘 클로라이드일 수 있다.
본 발명에 따른 화학가교-히알루론산 필러의 기계적 물성 보강용 조성물은 상술한 본 발명의 일양태인 진피 필러용 하이드로젤 조성물을 이용하는 것으로서, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 지속성 및 기계적 물성(G')이 향상된 진피 필러용 하이드로젤 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 진피 필러용 하이드로젤의 제조 방법을 제공한다.
(c) 본 발명은 화학가교-히알루론산 필러의 기계적 물성 보강용 조성물을 제공한다.
(d) 본 발명의 조성물을 이용하면 높은 기계적 물성이 요구되는 신체 부위에 적용이 가능하다.
(e) 본 발명의 방법을 이용하면 제조되는 진피 필러용 하이드로젤의 기계적 물성을 용이하게 조절하는 것이 가능하다.
도 1은 알긴산-그래프트화 히알루론산(HGA) 및 칼슘 이온의 존재 하에서의 이의 하이드로젤 형성에 대한 이론적인 설명을 나타낸다. 히알루론산(HA)은 먼저 에틸렌디아민(NH2-HA)으로 개질시켰다. 그 후, NH2-HA를 카보다이이미드 캐미스트리를 통해 알긴산(AL)과 반응시켰다.
도 2a는 칼슘 이온의 존재(+) 또는 부재(-) 조건에서, 혼합 후의 히알루론산(HA) 또는 알긴산-그래프트화-히알루론산(HGA) 용액의 이미지를 나타낸다.
도 2b는 주사기 바늘을 통한 주입 후의 HGA의 이미지를 나타낸다.
도 2c는 칼슘 이온의 존재하에서의 HGA1(원) 및 HA(사각형) 용액의 저장 탄성계수(G', 채워진 표시) 및 손실 탄성계수(G", 비어있는 표시)의 변화를 나타낸다.
도 2d는 히알루론산 함량에 의존하는 저장 탄성계수의 변화를 나타낸다.
도 2e는 알긴산-그래프트화 히알루론산 젤([HGA1]=2 중량%) 내의 칼슘 농도에 의존하는 저장 탄성계수 변화를 나타낸다.
도 2f는 HGA 젤의 젤화 시간을 나타낸다.
도 2g는 알긴산 분자 중량에 의존하는 HGA 젤의 저장 탄성계수([HGA1]=2 중량%, [CaSO4]=29.7 Mm)를 나타낸다.
도 3a는 37℃에서 2주 동안 히알루로니다아제로 처리한 후의 히알루론산/알긴산 혼합 젤 또는 알긴산-그래프트화-히알루론산 젤 모두의 건조 중량의 변화를 나타낸다.
도 3b는 알긴산/히알루론산 혼합 젤의 횡단면 SEM 이미지를 나타낸다.
도 3c는 37℃에서 2주간 히알루로니다아제로 배양([폴리머]=2 중량%, 히알루론산/알긴산(mg/mg)=1, [Ca2 +]=29.7 mM, [히알루로니다아제]=100 μg/ml)한 후의 알긴산-그래프트화 히알루론산 젤의 횡단면 SEM 이미지를 나타낸다.
도 4a는 히알루론산, 알긴산 및 알긴산-그래프트화 히알루론산의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 4b는 알긴산-그래프트화 히알루론산의 정량적 그래프트 효능에 대한 DMMB분석 결과를 나타낸다.
도 5a-5b는 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 개질체에 사용된 히알루론산 분자량에 따른 하이드로젤 물성 비교 결과를 나타낸다. 도 5a는 1000 kD의 히알루론산을 포함하는 알긴산-결합 히알루론산 개질체를 이용한 경우의 하이드로젤의 물성을 나타낸다. 도 5b는 1000 kD의 히알루론산을 포함하는 알긴산-결합 히알루론산 개질체를 이용한 경우의 하이드로젤의 물성을 나타낸다. 도 5a 및 5b의 가로축은 알긴산-결합 히알루론산 개질체의 농도를 나타낸다.
도 6a-6c는 기존의 화학가교 히알루론산 필러에 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤을 혼합하였을 때의 물성 변화 실험 결과를 나타낸다. 도 6a는 기존 필러 큐젤 Aqua S(한국비엔씨 사)와 평균 분자량 1000 kD의 히알루론산을 포함하는 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤을 50:50으로 혼합한 경우의 물성을 나타낸다. 도 6b는 기존 필러 큐젤 Aqua S와 평균 분자량 1500 kD의 히알루론산을 포함하는 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤을 50:50으로 혼합한 경우의 물성을 나타낸다. 도 6c는 기존 필러 큐젤 S(한국비엔씨 사)와 평균 분자량 1500 kD의 히알루론산을 포함하는 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤을 50:50으로 혼합한 경우의 물성을 나타낸다. 도 6a 내지 6c의 가로축은 사용된 하이드로젤의 종류 및 사용 농도를 나타낸다.
도 7은 기존의 화학가교 히알루론산 필러에 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤을 혼합하였을 때의 혼합 중량비에 따른 세포독성 시험 결과를 나타낸다.
도 8은 기존의 화학가교 히알루론산 필러에 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤을 혼합하였을 때의 혼합 중량비에 따른 물성(탄성계수) 변화 시험 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 재료 및 방법
실시예 1: 알긴산-결합 히알루론산 개질체의 제조
아민 기의 도입을 위해, 히알루론산(분자량 600000-850000;Lifecore)을 에틸렌다이아민(Sigma-Aldrich)과 반응시켰다. NH2-히알루론산의 합성은 EDC/NHS 반응을 이용하여 종래 알려진 방법으로 합성하였다. 반응 동안 히알루론산 사슬 사이의 가교 결합의 억제를 위하여, 10배 몰 비율인 과량의 에틸렌다이아민을 첨가하였다. 그리고 실온에서 20 시간 동안 반응시켰다. 상기 용액을 투석하고 활성탄으로 처리하였으며, 멸균을 위해 0.22 μm의 필터로 여과하였고, 동결 건조했다. 알긴산을 종래 알려진 방법에 따라 카보다이이미드 케미스트리를 통해 NH2-히알루론산과 결합시켰다(참조: 도 1).
실시예 2: 핵 자기 공명 분광법
히알루론산, 알긴산 및 알긴산-결합 히알루론산 개질체를 70 ℃에서 1H NMR 분광기(Bruker avance 500 MHz)에 의해 분석하였다. 샘플을 3 mg/ml에서 D2O에서 용해시켰다.
실시예 3: 디메틸 메틸렌 블루 ( DMMB ) 분석
알긴산-결합 히알루론산 개질체 내의 알긴산/히알루론산 함량을 정량하기 위해 DMMB 분석을 수행하였다. 즉, 16 mg의 DMMB를 25 ml의 에탄올에 용해시켰고, 필터 페이퍼로 여과하였으며, 0.17 M의 소듐 포르메이트 및 1 ml의 포름산을 포함하는 100 ml의 1 M 구아니딘 하이드로클로라이드를 여과한 DMMB와 혼합하였다. 용액을 탈이온수와 500 ml의 총 부피가 되도록 혼합하였다. 각각의 샘플을 탈이온수로 희석하고, 0.1 중량%의 용액을 얻었다. 1 ml의 DMMB 용액을 100 μl의 각 샘플에 추가하고, 30분 동안 격렬하게 혼합하였다. 복합체를 침전시키기 위해 배양한 샘플을 12000 g로 10분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하였고, 실온에서 30분간 건조시켰다. 펠릿을 1 ml의 탈복합 용액으로 용해시켰다. 10% 1-프로판올 및 4 M 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유하는 50 mM의 소듐 아세테이즈 버퍼(pH 6.8)를 가지고 탈복합 용액을 제조하였다. 혼합 30분 후, 100 μl의 각 샘플을 96-웰 플레이트로 옮겼다. 분광광도계(SpectraMax M2; Molecular Devices)를 이용하여 656 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 4: 효소 안정성 시험
알긴산-결합 히알루론산 개질체(HGA1)를 PBS 내에서 용해시켰고, 1 mm 두께의 스페이서를 갖는 두 글래스 플레이트를 이용하여 칼슘 설페이트와 혼합하여 젤([폴리머]=2 중량%, [CaSO4]=29.7 mM)을 형성시켰다. 펀치(10 mm 직경)를 이용하여 젤 디스크를 얻었고, 0에서 100 μg/ml의 농도 범위의 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 함유하는 PBS 용액 내로 투입하였고, 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 건조 중량을 측정하기 전에 젤 디스크를 냉동시키고 동결건조 시켰다. 또한 히알루론산 및 알긴산의 물리적 혼합물을 대조구([polymer]= 2 중량%, [CaSO4]=29.7 mM)로 사용하였다. 히알루로니다아제를 처리한 후, 스캐닝 전자 현미경(S-4800 UHR FE-SEM; Hitachi)를 이용하여 젤의 횡단면 이미지를 관찰하였다.
실시예 5: 유동 측정(Rheological measurement)
콘-앤-플레이트(20 mm 직경 플레이트, 4° 콘 각도) 픽스쳐(coneand-plate fixture)(Bohlin Gemini 150)를 갖는 회전 레오미터를 이용하여 이온 가교 알긴산-결합 히알루론산 젤의 점탄성 특성을 측정하였다. 150 μm 갭 오프닝을 콘 및 플레이트의 정점에 설정하였고, 작동 온도를 37±0.1℃로 일정하게 설정했다.
알긴산-결합 히알루론산 개질체를 PBS에 용해하였다. 2중량%의 폴리머 용액은 폴리머 용액의 알긴산 함량에 의존하는 양(알긴산 1g 당 0.42g의 CaSO4가 혼합될 수 있는 양)의 CaSO4 슬러리와 혼합했다. 이온 가교 된 하이드로젤의 기계적 특성은 회전 레오미터(Bohlin Gemini 150)를 이용하여 측정 하였다. 0.5 Hz로 측정하였고, 온도를 37±0.1℃로 일정하게 유지했다.
실시예 6: 통계 분석
모든 데이터는 평균±표준편차(n = 6)로 제시된다. 통계 분석은 Student's t-검정을 이용하여 수행하였다. *P-값<0.05 및 **P<0.01는 통계학적으로 의미 있는 것으로 간주하였다.
실시예 7: 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 개질체에 사용된 히알루론산 분자량에 따른 하이드로젤 물성 비교
분자량이 1000000 g/몰 또는 1500000 g/몰인 히알루론산을 이용하여 합성한 알긴산-결합 히알루론산 개질체를 PBS에 용해하였다. 2중량%의 폴리머용액은 폴리머 용액의 알긴산 함량에 의존하는 양(알긴산 1g 당 0.42g의 CaSO4가 혼합될 수 있는 양)의 CaSO4 슬러리와 혼합했다. 이온 가교 된 하이드로젤의 기계적 특성은 회전 레오미터(Bohlin Gemini 150)를 이용하여 측정 하였다. 0.5 Hz로 측정하였고, 온도를 37±0.1℃로 일정하게 유지했다.
실시예 8: 화학가교 히알루론산 필러와 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 개질체를 혼합하였을 때의 물성 변화
(1) 시판 성형용 필러인 ㈜한국비엔씨의 큐젤 Aqua S 또는 큐젤 S와 분자량이 1000000 g/몰 또는 1500000 g/몰인 히알루론산을 이용하여 합성한 알긴산-결합 히알루론산 개질체를 두 개의 주사기를 사용하여 혼합하였다. 2중량%의 폴리머 용액은 폴리머 용액의 알긴산 함량에 의존하는 양(알긴산 1g 당 0.42g의 CaSO4가 혼합될 수 있는 양)의 CaSO4 슬러리와 혼합했다. 이온 가교 된 하이드로젤의 기계적 특성은 회전 레오미터(Bohlin Gemini 150)를 이용하여 측정 하였다. 0.5 Hz로 측정하였고, 온도를 37±0.1℃로 일정하게 유지했다.
(2) 또한, 시판 성형용 필러로 ㈜휴메딕스의 엘라비에와 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤의 혼합 중량비를 각각 9:1. 7:3, 5:5로 혼합 후 탄성계수를 측정하였다.
실시예 9: 화학가교 히알루론산 필러와 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 개질체 혼합물의 세포독성 시험
먼저, 알긴산-결합 히알루론산을 calcium sulfate (60mM)로 이온가교 후, ㈜화학가교 히알루론산 필러인 ㈜휴메딕스의 엘라비에와 다양한 혼합비로 혼합물을 제조하였다 (엘라비에:알긴산-결합 히알루론산 = 9:1, 7:3, 5:5).
다음으로, ATDC5 mouse chondrogenic cell line(ECACC)을 10ug/ml human transferring (Sigma-Aldrich), 3 × 10-8M sodium selenite (Sigma-Aldrich), 5% FBS, 1% antibiotics가 포함된 DMEM/F-12 배양액을 이용해 세포를 배양하였다. 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양하였고, Transwell 0.4um polyester membrane 12-well plate (Costar)에 각 well 당 세포를 5000개씩 배양하였다. 300 ul 부피의 상기 제조된 다양한 혼합비의 화학가교 히알루론산 필러와 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 개질체의 혼합물을 membrane 위에 준비하고 배양액에 잠기게 한 후 EZ-cytox 검사를 실시하여 세포독성을 평가하였다.
실험결과
1. 알긴산-결합 히알루론산의 특성화
알긴산-결합 히알루론산(HGA)을 디자인하였고, 이온 가교성 히알루론산의 제조로 합성하였다. 즉 처음으로 히알루론산(HA)을 에틸렌디아민(NH2-HA)으로 개질시켰고, 카보다이이미드에 의해 알긴산으로 컨쥬게이션시켰다(HA-g-AL)(참조: 도 1). 다양한 알긴산-결합 히알루론산 샘플을 합성하였다. 히알루론산과 알긴산의 중량비를 1:1, 2:1 및 4:1(이하 각각 HGA1, HGA2, 및 HGA4라 지칭함)로 하여 샘플을 합성하였다.
알긴산-결합 히알루론산(HGA)을 1H-NMR 분광기(참조: 도 4a)에 의해 확인하였다. 4.2-4.4의 δ피크 영역이 에틸렌디아민으로 개질 후 증가하였으며, 이는 히알루론산(NH2-HA)에 대한 에틸렌디아민의 성공적인 도입을 나타낸다. 알긴산의 NH2-히알루론산 개질 후, 알긴산 및 히알루론산의 구체적인 피크는 δ=4.2-4.7 및 δ=2.5-2.6(NCOCH3)에서의 스펙트럼 상에서 각각 볼 수 있다. HA-g-AL의 결합(graft) 효율을 스펙트럼으로부터의 폴리머 함량을 계산함으로써 측정하였다(HGA1-93.7%, HGA2=82.6%, HGA4=94.7%). 또한, 결합 효율을 다이메틸메틸렌블루(DMMB) 분석으로 측정하였다(참조: 도 4b). 히알루론산은 DMMB 염료에 부착되지 않았다; 그러므로 상기 분석으로부터 HA-g-AL의 알긴산의 함량만을 측정하였다(HGA1=90.4±4.9%, HGA2=86.0±7.9%, HGA4=83.6±9.0%). 상기 발견 된 결과가 1H-NMR 스펙트럼으로부터 수득 된 것과 상당히 일치하였다.
2. 알긴산-결합 히알루론산의 하이드로젤 형성
히알루론산 용액을 칼슘 이온과 혼합한 경우([히알루론산]=2 중량%, [CaSO4]=30 mM) 하이드로젤이 형성되지 않았다. 대조적으로 칼슘 이온의 존재하에서, 알긴산-결합 히알루론산은 젤을 형성할 수 있었다([HGA1]=2 중량%, [CaSO4]=30 mM)(참조: 도 2a). 히알루론산-기반의 하이드로젤에서의 대부분의 독성-관련 이슈들은 중합체와 연관된 이슈들로부터 발생하기보다는 화학적 가교제의 이용으로부터 유발된다[37, 38]. 체내 이식 후 화학적 가교 시약에 의해 발생되는 전형적인 히알루론산 젤에서의 독성-관련 이슈들은 이온 가교성 히알루론산-기반 하이드로젤의 사용에 의해 극복될 수 있다. 이온 가교 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤은 23-G 바늘을 갖는 실린더를 통해 주입될 수 있다(참조: 도 2b). 이는 신체에 대한 약물 및/또는 세포의 최소 침습 전달을 가능케 한다는 관점에서 또한 매력적이다.
3. 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤의 특성화
알긴산-결합 히알루론산 젤의 점탄성 및 젤화 거동을 회전식 레오미터를 이용하여 조사하였다(참조: 도 2c 내지 2g). HGA1 용액을 칼슘 이온과 혼합할 때, 다양한 주파수에서 저장 탄성률(G')은 손실 탄성률(G")보다 더욱 높았고(참조: 도 2c), 이는 혼합물이 이온 가교를 통해 하이드로젤 구조를 구축한다는 것을 나타낸다. 대조적으로 히알루론산 용액은 칼슘 첨가에 대하여 하이드로젤을 형성하지 않는다. 다음으로 이온 가교 알긴산-결합 히알루론산 젤의 기계적 특성에 대한 알긴산 함량의 효과를 조사하였다(참조: 도 2d). 시험한 모든 샘플에 대한 일정한(constant) 폴리머 및 칼슘 농도 상에서 하이드로젤을 제조하였다([폴리머]=2 중량%, [CaSO4]=30 mM). 히알루론산 및 알긴산 사이의 중량 비율은 다양했다. 알긴산에 대한 히알루론산의 중량비율이 1로부터 4로 증가함에 따라 젤의 기계적 특성은 2.5±0.2 kPa로부터 0.075±0.001 kPa까지 크게 변경되었다. 그리고나서 이온 가교 하이드로젤의 탄성의 변화가 칼슘 농도에 따라 어떻게 변화하는지 조사하였다(참조: 도 2e). 칼슘 설페이트 농도가 7.4 mM에서 30 mM까지 증가함에 따라, 알긴산-결합 히알루론산 젤의 G' 값은 0.3±0.1 kPa에서 2.7±0.6 kPa까지 증가하였다. 그러나 칼슘 설페이트 농도가 60 mM까지 증가할 때, 더 이상의 증가는 관찰할 수 없었다. 알긴산-결합 히알루론산 젤의 젤화 시간은 젤에서의 알긴산 함량에 의해 중요한 영향을 받지 않았다(참조: 도 2f). 알긴산-결합 히알루론산 젤의 전단 탄성계수는 알긴산 분자량에 의존한다(참조: 도 2g). 알긴산 분자량이 50000 g/mol에서 250000 g/mol까지 증가함에따라, 이온 가교 젤의 G' 또한 0.04±0.003에서 2.4±0.2 kPa까지 증가하였다. 50000 g/mol 또는 100000 g/mol의 알긴산으로 제조한 알긴산-결합 히알루론산 젤은 불량한 기계적 특성을 보였고, 심지어 칼슘 이온의 존재하에서도 그러했다. 세포 거동(예를 들어, 접착, 증식 및 이동)과 관련한 폴리머 스캐폴드의 기계적 특성들을 조절하는 것은 매우 중요하다[39-41]. 게다가 기계적 특성들은 또한 조직 재생에 즉각적인 영향을 갖는 줄기세포 분화의 조절에 중요하다[41-44]. 조직 공학에서의 사용에 매우 매력적일 수 있는 알긴산-결합 히알루론산 젤의 기계적 특성은 중합체 조성 및 칼슘 이온 농도의 조절을 통해 쉽게 조절가능하다.
4. 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤의 효소 안정성
알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤을 in vitro 효소 반응에 대한 안정성을 시험하기 위해 히알루로니다아제로 처리하였다. 2주 배양 시간 상에 젤 중량의 약간의 감소가 관찰되었다. 젤 중량은 효소 농도에 의존하였다(참조: 도 3a). 하이드로젤은 효소가 없는 대조군 조건과 비교하여 2주 동안 100 μg/ml 히알루로니다아제로 처리한 후의 대략 80%의 그들의 초기 중량을 유지하였다. 알긴산-결합 히알루론산 젤은 효소 처리한 후 양호하게 팩킹된 다공성 구조를 유지하였다(참조: 도 3c). 대조적으로 히알루론산 및 알긴산의 단순 혼합물로부터 제조된 젤은 배양 동안 심지어 1 μg/ml의 히알루로니다아제의 존재하에서 젤 중량의 상당한 감소를 나타내었다. 히알루로니다아제 함량과 관련없이, 대략 40%의 중량 감소를 관찰하였다. 상기 중량 감소는 젤 상의 히알루론산 함량에 기반한 예상과 유사하다. 히알루로니다아제로 처리한 후의 히알루론산/알긴산 혼합 젤 횡단면 이미지는 효소 분해의 의해 상당한 젤 손실을 보였다(참조: 도 3b). 히알루론산은 히알루로니아다제의 작용에 의해 작은 올리고사카라이드 절편으로 절단되었다[45, 46]. 그러나 히알루론산은 in vitro의 내재성 히알루로니다아제(endogeneous hyaluronidase)에 의한 가교 또는 화학적 변형의 부재 하에서 빠르게 분해되었다[47]. 전달된 세포로부터의 새로운 ECM 발달 동안, 젤이 3-D 구조적 환경을 제공하고 스캐폴드로서의 그들의 완전성을 유지해야하기 때문에, 빠른 젤 분해는 많은 타입의 조직의 재생에 불리할 수 있다. 칼슘 이온을 첨가했을 때, 오직 혼합물 내의 알긴산 만이 젤 형성에 참여하기 때문에, 히알루론산/알긴산 혼합된 하이드로젤은 완전한 상호 관통 폴리머 네트워크 구조들을 형성하지 않는다. 혼합된 젤 내의 히알루론산은 히알루로니다아제의 작용에 의해 대부분 전체적으로 분해되었다(참조: 도 3). 반면에 알긴산-결합 히알루론산 내의 히알루론산의 분해는, 히알루로니다아제에 의한 느린 젤 분해를 이끄는 알긴산 체인의 공유결합성 컨쥬게이션에 의해 제한되었다. 이는 상기의 젤들이 in vivo 적용에 혼합 젤보다 더욱 적절하도록 만들 수 있다.
5. 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 개질체에 사용된 히알루론산 분자량에 따른 하이드로젤 물성 비교 결과
히알루론산 분자량이 다른 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤의 점탄성 거동을 회전식 레오미터를 이용하여 조사하였다(참조: 도 5a 내지 5b). HGA 용액을 칼슘 이온과 혼합할 때, 분자량이 큰 히알루론산으로부터 합성한 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤이 가장 높은 저장 탄성률(G')을 보였다. 예를 들어 동일한 폴리머 농도 2%에서 비교하면, 히알루론산 분자량이 1000000 g/mol에서 1500000 g/mol으로 증가하는 경우 알긴산-결합 히알루론산 젤의 G' 값은 480 Pa에서 600 Pa로 증가하였다. 시험한 모든 샘플은 일정한(constant) 알긴산/칼슘 농도 비율로 하이드로젤을 제조하였다. 이는 동일한 알긴산 분자량 및 칼슘이온 농도에서 히알루론산 분자량이 알긴산-결합 히알루론산 젤의 물성에 중요한 영향을 끼친다는 것을 의미한다. 또한 알긴산-결합 히알루론산 개질체의 농도가 감소하면 G' 값도 감소하였다.
6. 화학가교 히알루론산 필러에 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 개질체 를 혼합하였을 때의 물성 변화 관찰 결과
(1) 히알루론산 분자량이 다른 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤을 시판 성형용 필러 제품인 ㈜한국비엔씨의 큐젤 Aqua S와 혼합한 후 점탄성 거동의 변화를 회전식 레오미터를 이용하여 조사하였다(참조: 도 6a 내지 6b). 큐젤 Aqua S와 히알루론산 분자량이 1000000 g/mol인 알긴산-결합 히알루론산 젤을 50:50(중량비)으로 혼합한 경우(2% gel로 표시되었음), 기존 제품의 G' 값 보다 2 배 이상증가하였다. 히알루론산 분자량이 1500000 g/mol인 알긴산-결합 히알루론산 젤을 큐젤 Aqua S와 50:50(중량비)으로 혼합한 경우(2% gel로 표시되었음)는 3배 이상으로 물성이 증가함을 확인하였다. 또한 ㈜한국비엔씨의 큐젤 S와 알긴산-결합 히알루론산 젤을 혼합한 후 점탄성 거동의 변화를 회전식 레오미터를 이용하여 조사하였다(참조: 도 6c). 히알루론산 분자량이 1500000 g/mol인 알긴산-결합 히알루론산 젤을 큐젤 S와 50:50(중량비)으로 혼합한 경우(2% gel로 표시되었음)는 기존 제품 대비 약 1.5배의 물성이 증가함을 확인하였다. 이는 기존 성형용 필러 제품에 알긴산-결합 히알루론산 젤을 단순하게 혼합함으로써 기존 제품의 물성을 쉽게 향상시킬 수 있다는 것을 의미하고, 젤의 혼합비율뿐만 아니라 합성에 사용된 히알루론산 분자량 조절에 의해서도 물성 변화를 용이하게 할 수 있다는 것을 의미한다. 기존 제품의 경우 필러용 젤의 물성을 향상시키기 위해서는 화학가교제 사용량을 증가시켜야 하지만 이에 수반되는 잠재적인 독성이 우려된다. 그러나 알긴산-결합 히알루론산 개질체를 사용하는 경우 칼슘이온만으로 가교가 성립되어 젤이 형성되기 때문에 이러한 안전성의 우려없이 젤의 물성을 다양하게 조절할 수 있는 장점을 가진다.
(2) 도 8은 기존의 화학가교 히알루론산 필러에 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤을 혼합하였을 때의 혼합 중량비에 따른 물성(탄성계수) 변화 시험 결과를 나타낸다. 이를 통해 엘라비에와 이온가교 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤 혼합물의 탄성계수는 이온가교 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤의 함량이 높아질수록 증가하는 경향을 보임을 확인하였고, 특히 엘라비에와 이온가교 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤을 5:5의 비율로 혼합하였을 경우 엘라비에를 단독으로 사용하였을 경우보다 약 35%가량 물성(탄성계수)이 증가하는 것을 확인하였다(도 8).
7. 화학가교 히알루론산 필러와 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 개질체 혼합물의 세포독성 시험 결과
도 7은 기존의 화학가교 히알루론산 필러에 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤을 혼합하였을 때의 혼합 중량비에 따른 세포독성 시험 결과를 나타낸다.
이를 통해 종래 화학가교 히알루론산 필러 제품인 엘라비에를 단독으로 사용한 경우 96% 이상의 세포가 생존하며, 화학가교제를 사용하지 않는 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤의 경우 100%에 가까운 세포가 생존함을 확인하였다. 또한, 엘라비에와 이온가교성 알긴산-결합 히알루론산 하이드로젤의 혼합물의 경우에도 91% 이상의 높은 세포 생존율을 보여주었는바, 이들의 혼합물이 세포 독성에 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 7).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (20)

  1. 히알루론산, 상기 히알루론산에 공유결합된 알긴산, 및 이온 가교제를 포함하는 이온 가교성 히알루론산 하이드로젤; 및
    화학가교 히알루론산 필러를 포함하고,
    상기 이온 가교제는 2가의 양이온 또는 이의 염이고,
    상기 이온 가교성 히알루론산 하이드로젤과 상기 화학가교 히알루론산 필러의 중량비는 1:1-9인 진피 필러용 하이드로젤 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 2가 양이온은 칼슘, 바륨 또는 마그네슘 이온인 진피 필러용 하이드로젤 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 골격 보강용인 진피 필러용 하이드로젤 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 알긴산은 분자량이 10000-1000000 g/몰이고, 상기 히알루론산은 분자량이 10000-2500000 g/몰인 진피 필러용 하이드로젤 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 히알루론산과 알긴산의 중량비는 4:1 내지 1:2인 진피 필러용 하이드로젤 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 2가 양이온 염은 5 mM 내지 100 mM의 칼슘 설페이트인 진피 필러용 하이드로젤 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 2가 양이온 염은 1 mM 내지 50 mM의 칼슘 클로라이드인 진피 필러용 하이드로젤 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 결합은 알긴산의 카복실기 및 히알루론산의 카복실기와 공유결합-형성 가능한 링커를 통해 이루어진 공유결합인 진피 필러용 하이드로젤 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 링커는 다이아민, 다이비닐설폰, 1,4-뷰테인다이올, 다이글리시딜 에테르(BDDE) 및 글루타르알데히드, 카보다이이미드, 하이드록시석신이미드, 이미도에스터, 말레이미드, 할로아세틸, 다이설파이드, 하이드로아자이드, 알콕시아민으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 진피 필러용 하이드로젤 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 리도카인, 메피바카인, 부피바카인, 프로카인, 클로로프로카인, 에티도카인, 프릴로카인 다이클로닌, 헥실카인, 프로카인, 코카인, 케타민, 몰핀, 프라목신, 프로포폴, 페놀, 날록손, 메페리딘, 부토르판올, 펜타조신, 몰핀-6-글루쿠로나이드, 코데인, 다이하이드로코데인, 다이아몰핀, 덱스트로프로폭시펜, 페티딘, 펜타닐, 알펜타닐, 알파프로딘, 부프레노르핀, 덱스트로모라미드, 다이페녹실레이트, 다이피파논, 헤로인, 하이드로코돈, 하이드로몰폰, 레보파놀, 멥타지놀, 메타돈, 메토폰, 날부핀, 옥시코돈, 옥시몰폰, 페나독손, 페나조신, 레미펜타닐, 트라마돌, 테트라카인 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 진통제를 더 포함하는 진피 필러용 하이드로젤 조성물.
  13. (a) 제1 반응 물질인 알긴산 또는 히알루론산과 링커를 반응시켜 알긴산 또는 히알루론산의 카르복실기에 링커를 공유 결합시키는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 반응 결과물에 제2 반응 물질인 히알루론산 또는 알긴산을 반응시켜, 링커를 통하여 연결된 알긴산-결합 히알루론산 개질체를 수득하는 단계;
    (c) 생성된 알긴산-결합 히알루론산 개질체에 2가 양이온 또는 이의 염을 첨가하여 가교를 형성시켜 이온 가교성 히알루론산 하이드로젤을 수득하는 단계; 및
    상기 (c) 단계 이후에, 상기 수득한 이온 가교성 히알루론산 하이드로젤을 화학가교 히알루론산 필러와 혼합하는 단계;를 포함하고,
    상기 이온 가교성 히알루론산 하이드로젤과 상기 화학가교 히알루론산 필러의 혼합 중량비는 1:1-9인 진피 필러용 하이드로젤 조성물의 제조방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제13항에 있어서,
    상기 2가 양이온은 칼슘, 바륨 또는 마그네슘 이온인 진피 필러용 하이드로젤 조성물의 제조방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 2가 양이온은 칼슘 클로라이드 염의 형태로 첨가되는 진피 필러용 하이드로젤 조성물의 제조방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 (c) 단계 이후에, 상기 하이드로젤에 리도카인, 메피바카인, 부피바카인, 프로카인, 클로로프로카인, 에티도카인, 프릴로카인 다이클로닌, 헥실카인, 프로카인, 코카인, 케타민, 몰핀, 프라목신, 프로포폴, 페놀, 날록손, 메페리딘, 부토르판올, 펜타조신, 몰핀-6-글루쿠로나이드, 코데인, 다이하이드로코데인, 다이아몰핀, 덱스트로프로폭시펜, 페티딘, 펜타닐, 알펜타닐, 알파프로딘, 부프레노르핀, 덱스트로모라미드, 다이페녹실레이트, 다이피파논, 헤로인, 하이드로코돈, 하이드로몰폰, 레보파놀, 멥타지놀, 메타돈, 메토폰, 날부핀, 옥시코돈, 옥시몰폰, 페나독손, 페나조신, 레미펜타닐, 트라마돌, 테트라카인 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 진통제를 첨가하는 단계;를 더 포함하는 진피 필러용 하이드로젤 조성물의 제조방법.
  19. 다음을 포함하는 이온 가교성 히알루론산 하이드로젤; 및 화학가교-히알루론산 필러를 포함하고,
    상기 이온 가교성 히알루론산 하이드로젤과 상기 화학가교-히알루론산 필러의 중량비는 1:1-9인 화학가교-히알루론산 필러의 기계적 물성 보강용 조성물:
    (a) 히알루론산;
    (b) 상기 히알루론산에 공유결합된 알긴산; 및
    (c) 이온 가교제로서의 2가 양이온 또는 이의 염.
  20. 삭제
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