TWI702219B - 選擇性雌激素受體降解劑 - Google Patents

選擇性雌激素受體降解劑 Download PDF

Info

Publication number
TWI702219B
TWI702219B TW108123257A TW108123257A TWI702219B TW I702219 B TWI702219 B TW I702219B TW 108123257 A TW108123257 A TW 108123257A TW 108123257 A TW108123257 A TW 108123257A TW I702219 B TWI702219 B TW I702219B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
compound
cancer
formula
analysis
phenyl
Prior art date
Application number
TW108123257A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202019935A (zh
Inventor
丹尼爾 瓊 沙爾
裘利 安 巴斯坦
傑佛瑞 丹尼爾 科漢
歐慕迪那 魯必歐
Original Assignee
美商美國禮來大藥廠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=67470734&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TWI702219(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 美商美國禮來大藥廠 filed Critical 美商美國禮來大藥廠
Publication of TW202019935A publication Critical patent/TW202019935A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI702219B publication Critical patent/TWI702219B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/04—Ortho-condensed systems
    • C07D491/044—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring
    • C07D491/052—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring the oxygen-containing ring being six-membered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4709—Non-condensed quinolines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4741—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having oxygen as a ring hetero atom, e.g. tubocuraran derivatives, noscapine, bicuculline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Finger-Pressure Massage (AREA)
  • Orthopedics, Nursing, And Contraception (AREA)

Abstract

本發明提供根據下式之新穎選擇性雌激素受體降解劑(SERDs)：
Figure 01_image001
、 其醫藥上可接受之鹽，及其醫藥組合物，其中R 1或R 2係獨立地選自Cl、F、-CF 3或-CH 3，及另一者係氫，及其使用方法。

Description

選擇性雌激素受體降解劑
本發明係關於選擇性雌激素受體降解劑(SERD)。
選擇性雌激素受體降解劑(SERD)結合至雌激素受體(ER)並下調由ER介導之轉錄活性。由SERD引起的此種降解及下調可用於治療細胞增殖病症，諸如癌症。SERD之一些小分子實例已揭示於文獻(參見，例如，WO2005073204、WO2014205136及WO2016097071)中。然而，已知的SERD尚未如有效治療癌症般有用。例如，發現具有更佳藥物動力學(PK)及藥效動力學(PD)特性、臨床上更高效率及良好口服生物可利用性之SERD將非常有助於治療癌症。有效抑制由ER介導之轉錄之純拮抗劑SERD將明顯有益於治療癌症。需要新穎SERD來治療癌症，諸如乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌、子宮癌、胃癌及肺癌以及由於出現的抗性引起的突變。特定言之，需要新穎SERD來治療ER陽性乳癌、胃癌及/或肺癌。
本文提供下式之化合物：
Figure 02_image007
、 及其醫藥上可接受之鹽、及其醫藥組合物。在該式中，R 1或R 2係獨立地選自Cl、F、-CF 3或-CH 3，及另一者係氫。
亦提供使用如本文所述的化合物、其醫藥上可接受之鹽及其醫藥組合物來治療乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌、子宮癌、胃癌或肺癌之方法。該等方法包括對有需要的患者投與治療有效量之如本文所述的化合物或其醫藥上可接受之鹽。
進一步提供用於療法中之如本文所述的化合物及其醫藥上可接受之鹽。本文所述的化合物及其醫藥上可接受之鹽可用於治療乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌、子宮癌、胃癌或肺癌。
進一步提供以如本文所述的化合物及其醫藥上可接受之鹽在製備用於治療乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌、子宮癌、胃癌或肺癌之藥物中之用途。
本申請案依35 U.S.C. §119(e)主張2018年7月12日申請之美國臨時申請案序號62/697,100之權益；該案之揭示內容係以引用的方式併入本文中。
本文揭示充作SERD之新穎四環化合物及其醫藥鹽。本文描述的新發明的SERD提供對由ER介導之轉錄之抑制，其可用於治療癌症，諸如乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌、子宮癌、胃癌及肺癌以及由於出現的抗性引起的突變。此等SERD可作為單一藥劑使用或與其他類別之藥物(包括選擇性雌激素受體調節劑(SERM)、芳香酶抑制劑、CDK4抑制劑、CDK6抑制劑、PI3K抑制劑及mTOR抑制劑)組合使用，以治療激素受體陽性癌症，諸如乳癌、胃癌及/或肺癌。
本文描述新穎化合物由式I表示：
Figure 02_image009
， I及其醫藥上可接受之鹽，其中R 1或R 2係獨立地選自Cl、F、-CF 3或-CH 3，及另一者係氫。熟習此項技術者當明瞭，如以式I描述的化合物或其醫藥上可接受之鹽包含對掌性中心，其位置由上面的*表示。熟習此項技術者亦應明瞭，對掌性中心之Cahn-Ingold-Prelog (R)或(S)名稱將根據對掌性中心周圍的取代模式而變化。式I化合物中之對掌性中心提供由式II表示之R-對映異構形式：
Figure 02_image011
及由式III表示之S-對映異構形式：
Figure 02_image013
所有個別立體異構體、對映異構體及非對映異構體、以及根據式I、式II及式III之化合物之對映異構體及非對映異構體(包括外消旋異構體)之混合物均包括在本文所述化合物之範圍內。包含對掌性中心之醫藥用化合物通常作為單一對映異構體或非對映異構體分離及此種分離的式I、式II及式III化合物包括在本文所揭示化合物之範圍內。熟習此項技術者亦應明瞭，本文所述的式I、式II及式III之化合物及其醫藥上可接受之鹽可係氘代的(其中氫可經氘取代)及此種分子被認為係包括在本文揭示的化合物之範圍內。
式I化合物之特定實例(包括IUPAC命名法名稱)如下所示：
Figure 02_image015
5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇；
Figure 02_image017
5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-7-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇；
Figure 02_image019
8-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇；
Figure 02_image021
7-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇；
Figure 02_image023
8-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇；
Figure 02_image025
7-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇；
Figure 02_image027
5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-甲基-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇；及
Figure 02_image029
5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-7-甲基-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇。
由於上述對掌性中心，以上所示式I化合物之此等特定實例中之各者具有R-及S-對映異構形式(亦即，式II之R-對映異構化合物及式III之S-對映異構化合物)，如表1所示。 表 1 ：式 I 化合物之對映異構形式
化學名稱 R-對映異構體(式II) S-對映異構體(式III)
5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image031
Figure 02_image033
5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-7-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image035
Figure 02_image037
8-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image039
Figure 02_image041
7-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image043
Figure 02_image045
8-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image047
Figure 02_image049
7-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image051
Figure 02_image053
5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-甲基-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image055
Figure 02_image057
5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-7-甲基-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image059
Figure 02_image061
本文亦描述醫藥組合物，其包含如本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽與醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑之組合。本文所述醫藥組合物可使用醫藥上可接受之添加劑製備。如本文所用術語「醫藥上可接受之添加劑」係指一或多種載劑、稀釋劑及賦形劑，其與組合物或調配物之其他添加劑相容且對患者無害。本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽可調配成藉由各種途徑(諸如口服或IV)投與之醫藥組合物。生物可利用性通常係癌症治療中之一個因素且選擇投與方法及醫藥組合物以控制或最佳化活性成分之生物可利用性之能力係有用的。例如，口服生物可利用之SERD組合物將特別有用。據信如本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽具有口服生物可利用性。醫藥組合物之實例及其製備方法可參見「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」，L. V. Allen Jr編，第22版，Mack Publishing Co.，2012。醫藥上可接受之載劑、稀釋劑及賦形劑之非限制性實例包括以下：鹽水、水、澱粉、糖、甘露醇及二氧化矽衍生物；黏合劑，諸如羧甲基纖維素及其他纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠及聚乙烯吡咯啶酮；高嶺土及膨潤土；及聚乙二醇。
本文進一步描述治療癌症之方法。本文所述的方法包括對需要此種治療之患者投與有效量之如本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽。例如，投與有效量之如本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽之方法可係口服投與。癌症可係雌激素反應性癌症。另外，癌症可係乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌、子宮癌、胃癌或肺癌。例如，癌症可係ER陽性乳癌、ER陽性胃癌或ER陽性肺癌。
本文亦描述用於療法中之如本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽。本文亦提供如本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌、子宮癌、胃癌或肺癌。特定言之，乳癌可係ER陽性乳癌、ER陽性胃癌或ER陽性肺癌。例如，可口服投與式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽。
另外，如本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽可用於製備用於治療癌症之藥物。例如，藥物可口服投與。如本文所述的藥物可用於治療的癌症類型包括乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌、子宮癌、胃癌或肺癌。特定言之，癌症可係ER陽性乳癌、ER陽性胃癌或ER陽性肺癌。
如本文所述的式I、式II及式III之化合物及其醫藥上可接受之鹽可具有作為單一藥劑或與一或多種其他治療劑(例如，抗癌劑)組合之臨床效用，用於治療癌症，諸如乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌、子宮癌、胃癌或肺癌。當與其他治療劑(諸如抗癌劑)組合使用時，如本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽可與其他治療劑同時、依序或分開使用。如本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽可與之組合的藥物類別之實例包括SERM、芳香酶抑制劑、CDK4抑制劑、CDK6抑制劑、PI3K抑制劑及mTOR抑制劑，用於治療激素受體陽性乳癌。可與如本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽組合的藥物之更特定實例包括阿貝西尼(abemaciclib)(CDK4/6抑制劑)、依維莫司(everolimus)(mTOR抑制劑)、阿培里斯(alpelisib)(PIK3CA抑制劑)及8-[5-(1-羥基-1-甲基乙基)吡啶-3-基]-1-[(2S)-2-甲氧基丙基]-3-甲基-1,3-二氫-2H-咪唑幷[4,5-c]喹啉-2-酮(PI3K/mTOR抑制劑)。
如本文所用，術語「有效量」係指如本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽的量或劑量，其在對患者單劑量或多劑量投與時，在診斷或治療中為患者提供所需效果。較佳地，所需效果係抑制腫瘤細胞增殖、腫瘤細胞死亡或二者。如本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽一般在寬劑量範圍內有效。例如，每天的劑量通常落在約100 mg至約2000 mg之每日範圍內。
如本文所用，「治療(treat)」、「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指抑制、減緩、停止或逆轉現有症狀或病症之進展或嚴重度。
如本文所用，術語「患者」係指罹患特定疾病、病症或病情的人。
如本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽可藉由此項技術中已知的各種程序製備，其中一些方法在下面的製備及實例中加以說明。所述的每種途徑之特定合成步驟可以不同方式組合，或與不同程序之步驟組合，以製備如本文所述的式I、式II及式III之化合物或其醫藥上可接受之鹽。產物可藉由此項技術中熟知的習知方法(包括萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、研磨及結晶)回收。一般技術者很容易獲得試劑及起始物質。
可用於合成如本文所述的式I、式II及式III之化合物之中間物及程序意欲包括在本說明書中。另外，本文所述的某些中間物可包含一或多個保護基。可變保護基在每次出現時可相同或不同，此取決於特定反應條件及要進行的特定轉化。保護及去保護條件係熟習此項技術者熟知並描述在文獻(參見(例如)「Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis」，第四版，Peter G.M. Wuts及Theodora W. Greene，John Wiley and Sons, Inc. 2007)中。
個別異構體、對映異構體及非對映異構體可由一般技術者在合成如本文所述的式I、式II及式III之化合物中的任何方便點，藉由諸如選擇性結晶技術或對掌性層析之方法(參見(例如)，J. Jacques等人，「Enantiomers, Racemates, and Resolutions」，John Wiley and Sons, Inc.，1981、及E.L.Eliel及S.H.Wilen，「Stereochemistry of Organic Compounds」，Wiley-Interscience，1994)分離或解析。雖然可如所示分離或解析個別異構體、對映異構體及非對映異構體，但其對掌性中心之Cahn-Ingold-Prelog (R)或(S)名稱可能尚未確定。在沒有Cahn-Ingold-Prelog (R)或(S)名稱的情況下，使用標識符「異構體1」及「異構體2」並與IUPAC名稱組合而沒有Cahn-Ingold-Prelog立體化學名稱。本文中標識為「異構體1」或「異構體2」的式I、式II及式III之化合物如以下特定實驗描述中所定義進行分離。不論異構體係「1」或「2」，均係指式I、式II及式III之化合物在所列條件下從對掌性層析管柱中溶析之順序，亦即，「異構體1」係第一個在所述條件下從管柱中溶析出來。若在合成早期開始對掌性層析，則將相同的名稱應用於式I、式II及式III之隨後的中間物及化合物。
除非具體地指出，否則本文所用的縮寫根據Aldrichimica Acta，第17卷，第1期，1984定義。其他縮寫定義如下：「ACN」係指乙腈；「BSA」係指牛血清白蛋白；「cataCXium® A Pd G3」係指[(二(1-金剛烷基)-丁基膦)-2-(2′-胺基-1,1′-聯苯)]鈀(II)甲磺酸鹽；「DCM」係指二氯甲烷；「DMA」係指二甲基乙醯胺；「DMEA」係指二甲基乙胺；「DMEM」係指杜貝卡氏改良伊格培養基；「DMF」係指N,N-二甲基甲醯胺；「DMSO」係指二甲基亞碸；「DNA」係指脫氧核糖核酸；「cDNA」係指互補DNA；「DNA酶」係指脫氧核糖核酸酶；「DTT」係指二硫蘇糖醇；「EC 50」係指與預定義的陽性對照化合物(絕對EC 50)相比產生50%靶活性反應之試劑濃度；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「ee」係指對映異構過量；「ERα」係指雌激素受體α；「ERβ」係指雌激素受體β；「EtOAc」係指乙酸乙酯；「EtOH」係指乙醇；「FBS」係指胎牛血清；「HBSS」係指漢克氏平衡鹽溶液(Hank’s Balanced Salt Solution)；「HEC」係指羥乙基纖維素；「HEPES」係指4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸；「HPLC」係指高效液相層析；「IC 50」係指產生該藥劑可能的最大抑制反應之50%之藥劑濃度(相對IC 50)、或與安慰劑對照對比產生50%抑制靶酵素活性之藥劑濃度(絕對IC 50)；「IPA」係指異丙胺；「iPrOH」係指異丙醇；「IV」指靜脈內投與；「K i」係指抑制常數；「MEK」係指甲基乙基酮；「MeOH」係指甲醇；「MTBE」係指甲基第三丁基醚；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「PO」指口服投與；「PRα」係指黃體酮受體α；「QD」係指每天一次給藥；「RNA」係指核糖核酸；「RNA酶」指核糖核酸酶；「RT-PCR」係指逆轉錄聚合酶鏈反應；「RT-qPCR」係指逆轉錄定量聚合酶鏈反應；「SFC」係指超臨界流體層析；「TED 50」係指在腫瘤中達成50%抑制靶標之有效劑量；「THF」係指四氫呋喃；「t (R)」係指保留時間；「XantPhos Pd G2」係指氯[(4,5-雙(二苯基膦基)-9,9-二甲基氧雜蒽)-2-(2′-胺基-1,1′-聯苯)]鈀(II)；及「XPhos Pd G2」係指氯(2-二環己基膦基-2',4',6'-三異丙基-1,1'-聯苯)[2-(2'-胺基-1,1'-聯苯)]鈀(II)。
以下製備及實例進一步說明本發明。 製備及實例 方案 1
Figure 02_image063
方案1描述式I化合物之合成。
在步驟A中，完成格利雅(Grignard)反應。格利雅反應在此項技術中係熟知的，作為形成碳-碳鍵之反應。該反應涉及有機金屬反應，其中芳基鹵化鎂(格利雅試劑)加成至羰基(諸如化合物2之醯氯)，以得到步驟A之化合物。例如，4-氯取代之喹諾酮(化合物1)經格利雅試劑(諸如異丙基氯化鎂)處理以形成格利雅中間物，接著在溶劑(諸如THF)中添加醯氯、4-氟苯甲醯氯、化合物2。完成後，可用水淬滅反應，以得到化合物3。
在步驟B中，化合物3之芳基甲基醚可在熟習此項技術者可識別的各種條件下去甲基化，諸如用三溴化硼處理。例如，化合物3在約0℃之溫度下在溶劑(諸如DCM)中用三溴化硼緩慢處理。將混合物在室溫下攪拌並用磷酸氫二鉀淬滅，以得到化合物4。
在步驟C中，可藉由在適宜之極性非質子溶劑(諸如DMF或THF)中處理對應之對氟苯基酮4及氮雜環丁烷醇鹽5或用適宜鹼(例如氫化鈉、第三丁醇鈉或第三丁醇鉀)處理對應游離鹼以得到醚化合物6來形成氮雜環丁烷醚6。
然後在鈴木(Suzuki)交叉偶聯反應中，用適宜之經取代之芳基硼酸(化合物7)將化合物6烷基化，在步驟D中得到化合物8。熟習此項技術者將認識到存在多種條件可用於促進此種交叉偶聯反應。適宜之鈀試劑可包括XantPhos Pd G2、cataCXium® A Pd G3、氯化雙(三苯基膦)鈀(II)、參(二亞芐基丙酮)二鈀(0)與三環己基膦、氯化(1,1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵)鈀(II)、肆(三苯基膦)鈀或乙酸鈀(II)。適宜之鹼可包括氟化鉀、碳酸銫、碳酸鈉、碳酸鉀、第三丁醇鋰或單水合磷酸三鉀。化合物 6例如可與適宜之硼酸化合物7(諸如2-氟-4-(三氟甲基)苯基硼酸)在具有鹼(諸如碳酸鉀)及觸媒(諸如XPhos Pd G2)之溶劑(諸如2-甲基-2-丁醇)中反應並在微波條件下加熱至約80℃以得到化合物8。
熟習此項技術者將認識到步驟D(鈴木交叉偶聯反應)可在步驟C之氮雜環丁烷醚形成之前完成。
在步驟E中，熟習此項技術者將認識到化合物8可藉由酮之初始還原而環化。此可使用還原劑(諸如三乙基硼氫化鋰)在溶劑(諸如1,4-二噁烷及THF)中並在約0℃至室溫之溫度下完成以得到對應之二級醇。該中間物醇可攜帶於粗料上並用適宜之鹼(諸如碳酸銫、氫化鈉、第三丁醇鈉或第三丁醇鉀)在溶劑(諸如THF、DMSO或DMF)中去質子化。所得的烷氧化物可在室溫下同時加熱至回流或在約60℃之溫度下環化成芳基氟化物。然後可獲得在氟化物置換時形成的經取代之環醚，以得到式 I化合物。
或者，可將酮8還原成醇並在步驟F中對掌性純化以得到對掌性醇9，及然後如以上針對於步驟E所述在步驟G中環化以得到式I化合物。
在另一個替代反應中，可使用對掌性試劑(諸如(R)-(+)-α.α-二苯基-2-吡咯啶甲醇)以及硼酸三甲酯及硼烷-二甲基硫直接得到所需對掌性醇化合物9來還原酮，然後可如以上針對於步驟E所述在步驟G中環化以得到式I化合物。
在一個可選步驟中，如本文所述的式I、式II及式III之化合物之醫藥上可接受之鹽可藉由使如本文所述的式I、式II及式I之化合物之適宜游離鹼與適宜之醫藥上可接受之酸在適宜溶劑中於標準條件下反應形成。另外，此類鹽之形成可在氮保護基脫保護時同時發生。熟知可能形成醫藥上可接受之鹽。參見，例如，Gould, P.L.，「Salt selection for basic drugs」，International Journal of Pharmaceutics，33: 201-217 (1986)；Bastin, R.J.等人「Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities」，Organic Process Research and Development，4: 427-435 (2000)；及Berge, S.M.等人，「Pharmaceutical Salts」，Journal of Pharmaceutical Sciences，66: 1-19，(1977)。一般技術者當明瞭，如本文所述的式I、式II及式III之化合物易於轉化成醫藥上可接受之鹽並可作為醫藥上可接受之鹽分離。有用之鹽之實例包括(但不限於)苯磺酸鹽及4-甲基苯磺酸鹽。4-甲基苯磺酸鹽亦稱為甲苯磺酸鹽。 製備1 2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙-1-醇
Figure 02_image065
於N 2下在15分鐘的時間內將三乙醯氧基硼氫化鈉(405 g，1.91 mol)逐份地添加至3-(氟甲基)氮雜環丁烷鹽酸鹽(160 g，1.28 mol)含在DCM(2.4 L)中之0℃攪拌溶液並在0℃下攪拌10分鐘。於0℃下在1小時的時間內分6份添加1,4-二噁烷-2,5-二醇(99 g，0.83 mol)，然後在0至5℃下攪拌15分鐘。使反應升溫至室溫並在N 2下攪拌2小時。在20分鐘的時間內使反應冷卻至10至15℃，然後升溫至25至30℃並在該溫度下保持2小時。在10至15℃下在25至30分鐘的時間內添加水(800 mL)，歷時5至10分鐘使其升溫至室溫及然後分離各層。用DCM(800 mL)洗滌水層，分離各層，然後使已合併的水層冷卻至10至15℃並使用50%氫氧化鈉溶液(~540 mL)將pH調節至13至14。使水層升溫至室溫，用DCM(4 X 800 mL)萃取，用硫酸鈉(80 g)乾燥，過濾，並濃縮至乾燥，以得到呈稠黃色油之標題化合物(139 g，82%)。ES/MS (m/z)：134.1(M+H)。 製備2 2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙-1-醇鹽酸鹽
Figure 02_image067
將2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙-1-醇(529 g，4 mol)溶解於MTBE(2.6 L)中並冷卻至0℃。在30分鐘內逐滴添加HCl/EtOH溶液(492 mL，30重量%)，然後在0℃下攪拌30分鐘。過濾固體並用MTBE(2 X 200 mL)洗滌濾餅。在N 2下乾燥8小時，以得到呈白色固體之標題化合物(580 g，86%)。ES/MS (m/z)：134.0 (M+H)。 製備3 (3-氯-7-甲氧基喹啉-4-基)-(4-氟苯基)甲酮
Figure 02_image069
在N 2下使4-溴-3-氯-7-甲氧基喹啉(70 g，254 mmol)及THF(1 L)之混合物冷卻至-40℃而導致材料沈澱。在20分鐘內添加異丙基氯化鎂(2 M含在THF中，254 mL，509 mmol)並攪拌混合物1小時。逐滴添加4-氟苯甲醯氯(66 mL，559 mmol)含在THF(140 mL)中之溶液，然後允許升溫至室溫。用飽和NH 4Cl溶液(300 mL)及水(200 mL)淬滅反應並分離各層。用飽和NH 4Cl溶液(300 mL)洗滌有機層，經過MgSO 4乾燥，過濾，並濃縮，以得到油狀殘餘物。藉由矽膠利用MTBE/己烷(1:1)之混合物溶析過濾粗棕色油以得到呈黃色固體之粗產物(84 g)。用10%乙酸甲酯/庚烷(800 mL)處理固體並在室溫下攪拌過夜。過濾以收集固體並保留。濃縮濾液並在矽膠上利用10-40% EtOAc/己烷溶析純化，然後用10%乙酸甲酯/庚烷(200 mL)處理產物並在室溫下攪拌3小時。過濾所得固體，與來自先前過濾之固體合併，並在真空下乾燥過夜，以得到呈黃色固體之標題化合物(31 g，38%)。ES/MS (m/z)：316.0 (M+H)。 製備4 (3-氯-7-羥基喹啉-4-基)-(4-氟苯基)甲酮
Figure 02_image071
將三溴化硼(1 M含在DCM中，295 mL，295 mmol)添加至(3-氯-7-甲氧基喹啉-4-基)-(4-氟苯基)甲酮(31 g，98 mmol)含在DCM(217 ml)中之混合物並在室溫下攪拌混合物3天。將混合物緩慢倒入至磷酸氫二鉀(2 M含在水中，700 mL)及水(200 mL)之0℃溶液中。使混合物升溫至室溫並攪拌1小時。在真空中濃縮溶液以除去有機溶劑，過濾，收集濾液並於真空下在45℃下乾燥濾液過夜。用DCM/庚烷(1:1，450 mL)處理固體並攪拌過夜。收集固體並在真空下乾燥過夜以得到呈淺棕色固體之標題化合物(32 g，定量產率)。ES/MS (m/z)：302.0 (M+H)。 製備5 (3-氯-7-羥基喹啉-4-基)-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)甲酮
Figure 02_image073
將2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙-1-醇鹽酸鹽(3.90 g，23.0 mmol)添加至(3-氯-7-羥基喹啉-4-基)-(4-氟苯基)甲酮(5.00 g，15.3 mmol)含在DMF(75 ml)中之攪拌溶液，接著添加氫化鈉(60%含在礦物油中，3.02 g，76.8 mmol)。在N 2下攪拌並升溫至40℃，歷時45分鐘。用水淬滅溶液並濃縮。使殘餘物分配在20% iPrOH/CHCl 3與飽和碳酸氫鈉水溶液之間並分離，用2 x 20% iPrOH/CHCl 3萃取水相，合併有機萃取物，經過硫酸鎂乾燥已合併的有機層，過濾並濃縮濾液，以得到呈深紅色油之粗產物。藉由矽膠柱層析利用5-10% 7 N NH 3之MeOH/DCM梯度溶析純化粗物質，以得到呈黃色固體之標題化合物(5.31 g，84%)。ES/MS (m/z)：415.0 (M+H)。 製備6 (4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基){3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]-7-羥基喹啉-4-基}甲酮
Figure 02_image075
用N 2(5x)對混合物(3-氯-7-羥基喹啉-4-基)-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)甲酮(200 mg，0.48 mmol)、2-氟-4-(三氟甲基)苯基硼酸(158 mg，0.72 mmol)、碳酸鉀(202 mg，1.45 mmol)、2-甲基-2-丁醇(3 ml)及水(1 ml)在微波小瓶中脫氣。添加XPhos Pd G2 (12 mg，0.015 mmol)，密封並在80℃下微波2小時。使殘餘物分配在MTBE與飽和NH 4Cl溶液之間。分離各層並用MTBE萃取水。合併有機萃取物，經過硫酸鎂乾燥，過濾，並濃縮濾液，以得到橙色殘餘物。藉由矽膠柱層析利用5% MeOH/DCM溶析純化粗物質，以得到呈黃色固體之標題化合物(205 mg，78%)。ES/MS (m/z)：543.2 (M+H)。
以基本上類似於製備6之方法的方式製備以下化合物，程序具有以下變化，加熱時間在1至2小時之間，用MTBE或EtOAc萃取，及經過硫酸鎂或硫酸鈉乾燥有機層。藉由矽膠管柱層析使用多至10% (MeOH或7 M氨化MeOH)於DCM中(製備10：梯度3-8% 7 M氨化MeOH於DCM中；製備9及11：梯度4至10% 7 M氨化MeOH於DCM中)及/或如所示藉由高pH反相層析純化。 表 2 ：根據製備 6 製備的化合物
製劑編號 化學名稱 結構 ES/MS (m/z) (M+H)
7 (4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基){3-[2-氟-3-(三氟甲基)苯基]-7-羥基喹啉-4-基}甲酮
Figure 02_image077
 543.0
8 a [3-(4-氯-2-氟苯基)-7-羥基喹啉-4-基](4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)甲酮
Figure 02_image079
 509.0
9 b [3-(3-氯-2-氟苯基)-7-羥基喹啉-4-基](4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)甲酮
Figure 02_image081
 509.0
10 [3-(2,4-二氟苯基)-7-羥基喹啉-4-基](4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)甲酮
Figure 02_image083
 493.0
11 [3-(2,3-二氟苯基)-7-羥基喹啉-4-基](4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)甲酮
Figure 02_image085
 493.0
12 (4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)[3-(2-氟-4-甲基苯基)-7-羥基喹啉-4-基]甲酮
Figure 02_image087
 489.2
13 (4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)[3-(2-氟-3-甲基苯基)-7-羥基喹啉-4-基]甲酮
Figure 02_image089
 489.2
a藉由高pH反相快速層析(RediSep Rf GOLD®高效C18管柱，利用與5% MeOH含在10 mM碳酸氫銨水溶液中之35至45% ACN溶析)純化。 b在二氧化矽上純化後，利用含在DCM中之4-10% 7 M氨化MeOH溶析，藉由高pH反相快速層析(RediSep Rf GOLD®高效C18管柱，利用與5% MeOH含在10 mM碳酸氫銨水溶液中之30-44% ACN溶析)進一步純化。 製備14 外消旋4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)(羥基)甲基]-3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]喹啉-7-醇
Figure 02_image091
在N 2下將(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基){3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]-7-羥基喹啉-4-基}甲酮(305 g，562.2 mmol)及THF(1.5 L)一起添加並使溶液冷卻至0至5℃。逐滴添加三乙基硼氫化鋰(1 M含在THF溶液中，1.5 L，1.5 mol)。在0至5℃下攪拌混合物1小時。逐滴添加水(300 mL)及飽和NH 4Cl(1 L)。使混合物升溫至室溫。添加EtOAc(2 L)並收集有機層。用鹽水(500 mL)洗滌有機層，經過MgSO 4乾燥，過濾，並濃縮至乾燥。將殘餘物溶解於丙酮及2 M氨含在MeOH中之95:5混合物中並透過矽膠過濾以得到呈橙色固體之標題化合物(264 g，86.2%)。ES/MS (m/z)：545.2 (M+H)。 製備15 4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)(羥基)甲基]-3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]喹啉-7-醇，異構體1
Figure 02_image093
在下列條件下使用對掌性層析純化外消旋4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)(羥基)甲基]-3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]喹啉-7-醇(354 g，0.62 mol)：管柱Chiralpak AD-H，150 x 50 mm，流速300 g/分鐘，UV 350 nm，流動相35% iPrOH與0.5% DMEA/CO 2，管柱溫度40℃，以得到第一溶析異構體之標題化合物(171.4 g，48%)。藉由對掌性分析SFC確認異構體1之對映異構體富集，＞98% ee，t (R)= 0.79分鐘，管柱：4.6 × 150 mm Chiralpak AD-H，利用35% iPrOH與0.5% DMEA/CO 2之流動相、0.6 mL/分鐘之流速，350 nm之UV檢測溶析。 替代製備15
將硼酸三甲酯(65 mg，0.62 mmol)添加至(R)-(+)-α.α-二苯基-2-吡咯啶甲醇(132 mg，0.52 mmol)於THF(20 mL)中之溶液中。在室溫於N 2下攪拌混合物1小時。添加硼烷-二甲基硫醚(2.0 M於THF中，2.6 mL，5.2 mmol)，接著添加(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基) {3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]-7-羥基喹啉-4-基}甲酮(1.0 g，1.73 mmol)。在45℃加熱反應物過夜。添加另外的硼烷-二甲基硫醚(2.0 M於THF中，2.6 mL，5.2 mmol)並在45℃攪拌5小時。緩慢添加飽和NH 4Cl溶液(25 mL)並分離有機相。用20% iPrOH/CHCl 3再萃取水性萃取物。合併有機萃取物，經Na 2SO 4乾燥，過濾，並蒸發，得到硼烷錯合物中間物(1.2 g)。將三分之一的硼烷錯合物中間物(0.4 g，0.6 mmol)溶解於1,4-二噁烷(4 mL)及乙醇胺(0.3 mL，5 mmol)中並將反應物加熱至70℃歷時3小時。用飽和NH 4Cl溶液(25 mL)淬滅反應並分離有機相。用20% iPrOH/CHCl 3(4 x 25 mL)再萃取水性萃取物。合併有機萃取物，經Na 2SO 4乾燥，過濾，並濃縮至乾燥，得到呈橙色固體之標題化合物(0.33 g，0.57 mmol，100%產率)。LC/MS (m/z)：[M+H] +545。藉由對掌性分析SFC確認異構體1之對映異構體富集，96% ee，t (R)= 0.79分鐘，管柱：4.6 × 150 mm Chiralpak AD-H，利用35% iPrOH與0.5% DMEA於CO 2中之流動相、0.6 mL/分鐘之流速溶析，350 nm之UV檢測。 實例1 外消旋5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image094
使(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基){3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]-7-羥基喹啉-4-基}甲酮(5.27 g，9.71 mmol)於1,4-二噁烷(100 mL)中之溶液冷卻至5℃。添加三乙基硼氫化鋰(1 M於THF中，30.0 mL，30.0 mmol)。移除冷卻浴並在室溫攪拌1.5小時。用水淬滅混合物。添加飽和NH 4Cl溶液及EtOAc。分離各層並用EtOAc萃取水層。合併有機萃取物，經無水MgSO 4乾燥，過濾，並濃縮濾液。將粗殘餘物溶解於THF(100 mL)中。添加氫化鈉(60%於礦物油中，1.94 g，48.5 mmol)。將溶液回流1.5小時。添加另外氫化鈉(60%於礦物油中，1.94 g，48.5 mmol)，然後再回流30分鐘。使溶液冷卻至室溫並用水淬滅。添加EtOAc及飽和NH 4Cl溶液 。分離各層並用EtOAc萃取水層。合併有機萃取物，經無水MgSO 4乾燥，過濾，並濃縮濾液。藉由矽膠管柱層析利用5-7% MeOH於DCM中之梯度溶析純化殘餘物，得到呈淡黃色泡沫之標題化合物(3.70 g，72%)。ES/MS (m/z)：525.2 (M+H)。
以基本上類似於實例1之方法之方式製備以下化合物，程式具有以下變化。為還原，使用3至5當量之三乙基硼氫化鋰，反應時間為30分鐘至1小時，並將有機層經過硫酸鎂或硫酸鈉乾燥。直接使用粗殘餘物或藉由矽膠柱層析利用0-5-7.5-10% MeOH之DCM梯度溶析然後環化來純化。藉由在THF中回流至多16小時，或在DMF中，從實例2在室溫下回流2小時至實例8在85℃下回流2小時，完成環化。用DCM或EtOAc萃取並經過硫酸鎂或硫酸鈉乾燥有機層。藉由矽膠柱層析如所示使用至多10%(MeOH或7 M氨化MeOH)之DCM(實例2：梯度0-10% MeOH/DCM；實例5：梯度4-10% 7 M氨化MeOH/DCM；實例8：梯度5-7.5% 7 M氨化MeOH/DCM)或藉由高pH反相HPLC純化。 表 3 ：根據實例 1 製備的實例化合物
實例編號 化學名稱 結構 ES/MS (m/z) (M+H)
2 外消旋5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-7-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image096
 525.2
3 a 外消旋8-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image098
 491.0
4 b 外消旋7-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image100
 491.0
5 c 外消旋8-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image102
 475.0
6 d 外消旋7-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image104
 475.0
7 e 外消旋5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-甲基-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image106
 471.2
8 外消旋5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-7-甲基-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇
Figure 02_image108
 471.2
a藉由高pH反相HPLC純化(KINETEX® C18, 5 µm，30 × 250 mm柱，利用35-50% ACN之10 mM碳酸氫銨水溶液及5% MeOH溶析)。 b藉由高pH反相HPLC純化(KINETEX® C18, 5 µm，30 × 250 mm柱，利用35-43% ACN/具有5% MeOH之10 mM碳酸氫銨水溶液溶析) c在二氧化矽上利用4-10% 7M氨化MeOH之DCM溶析純化後，藉由高pH反相HPLC(KINETEX® C18，5 µm，30 × 250 mm柱，利用30-44% ACN之10 mM碳酸氫銨水溶液及5% MeOH溶析)進一步純化。 d藉由高pH反相HPLC純化(XBRIDGE® C18 5 µm OBD，30 × 75 mm柱，利用10-75% ACN/具有5% MeOH之10 mM碳酸氫銨水溶液溶析)。 e藉由高pH反相HPLC純化(XBRIDGE® C18 5 µm OBD，30 × 75 mm柱，利用10-60% ACN/具有5% MeOH之10 mM碳酸氫銨水溶液溶析)。 實例1A 5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體1 及 實例1B 5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體2
Figure 02_image110
利用下列條件藉由對掌性SFC分離5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇之兩種對映異構體：管柱：LUX®纖維素-1，5 × 25 cm；利用30% iPrOH(含0.5% DMEA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：300 g/分鐘；UV偵測波長：270 nm，以得到呈第一溶析對映異構體(異構體1)之實例1A。ES/MS (m/z)：525.2 (M+H)。藉由對掌性分析SFC確認異構體1之對映異構體富集，＞99% ee，t (R)：1.30分鐘；管柱：CHIRALCEL® OD-H，4.6 × 150 mm；利用30% MeOH (0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。分離實例1B之標題化合物，以得到第二溶析對映異構體(異構體2)。ES/MS (m/z)：525.2 (M+H)。藉由對掌性分析SFC確認異構體2之對映異構體富集，98% ee，t (R)：2.03分鐘；管柱：CHIRALCEL® OD-H，4.6 × 150 mm；利用30% MeOH(0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。 替代製備實例1B
結晶5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體2
在1000 rpm下攪拌含在水(250 mL)中之5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，4-甲基苯磺酸，異構體2(23.8 g，0.034 mol)。添加NaOH(76 µL)並攪拌溶液2小時。添加DCM(600 mL)。分離混合物，用硫酸鎂乾燥DCM萃取物，透過注射器過濾器(0.45 µm)過濾材料，並濃縮至乾燥。在周末使材料在N 2流下靜置。添加1:1 EtOH/水(80 mL)並利用超音波攪拌混合物。藉由在尼龍膜上過濾收集棕褐色固體，以得到標題化合物(10.47 g，0.02 mol，59%)。 X射線粉末繞射(XRD)
在Bruker D4 Endeavor X射線粉末繞射儀上獲得結晶固體之XRPD圖案，該繞射儀配備有CuKα源及Vantec偵測器，在35 kV及50 mA下操作。樣本在4 2θ°與40 2θ°之間掃描，步長為0.008 2θ°，及掃描速率為0.5秒/步，並使用1.0 mm發散、6.6 mm固定防散射及11.3 mm偵測器狹縫。將乾粉填充在石英樣本架上並使用載玻片獲得光滑表面。在環境溫度及相對濕度下收集晶體繞射圖案。在基於內部NIST 675標準之整個圖案移位之後在MDI-Jade中確定晶體峰位置，峰在8.853及26.774 2θ°。在結晶學技術中熟知，對於任何給定的晶型，繞射峰之相對強度可能由於諸如晶體形態及習性之因素導致的較佳定向而變化。在存在較佳定向之效應之情況下，峰強度改變，但多晶型物之特徵峰位置不變。參見，例如，The United States Pharmacopeia #23，National Formulary #18，第1843-1844頁，1995。此外，在結晶學技術中亦熟知，對於任何給定的晶型，角峰位置可略微變化。例如，峰位置可由於分析樣本的溫度變化、樣本置換或內標之存在或不存在而位移。在本情況下，推測峰位置變化為± 0.2 2θ°，考慮此等潛在的變化而不妨礙所示晶形之明確鑑定。可基於區別峰之任何獨特組合來確認晶型。
藉由XRD圖案使用CuKa輻射作為具有如下表4中所述的繞射峰(2-θ值)，及特定言之具有在19.8處的峰與選自由6.8、16.0及22.1組成之群之峰中之一或多者之組合；繞射角公差為0.2度，表徵結晶5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇(異構體2)之製備樣本。 表 4 ：結晶實例 1B 之 X 射線粉末繞射峰
峰 角度(°2-θ) +/- 0.2° 相對強度(最強峰之%)
1 6.8 29.40
2 15.3 8.30
3 16.0 20.10
4 17.4 7.60
5 18.1 16.00
6 19.8 100.00
7 21.1 14.60
8 22.1 28.90
9 24.9 16.40
10 25.4 21.90
替代製備實例1B
在室溫於N 2下將4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)(羥基)甲基]-3-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]喹啉-7-醇(異構體1)(63.05 g，104.7 mmol)溶解於DMSO(1.3 L)中。在5分鐘內逐份地添加碳酸銫(108 g，331 mmol)。將混合物加熱至60℃，歷時15小時。使混合物冷卻至室溫並用水(2.1 L)及EtOAc(1.3 L)稀釋。攪拌混合物5分鐘並分離。用EtOAc(1.3 L)再萃取水性物質並攪拌5分鐘。分離並合併有機萃取物，用鹽水、水及EtOAc洗滌。用MgSO 4乾燥有機萃取物，濃縮，並在高真空於室溫下乾燥過夜，以得到呈棕色固體之標題化合物(52.69 g，95.9%)。藉由對掌性分析SFC確認實例1B之對映異構體富集，98.1% ee，t (R)：2.03分鐘；管柱：CHIRALCEL® OD-H，4.6 × 150 mm；利用30% MeOH(0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。 實例2A 5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-7-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體1 及 實例2B 5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-7-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體2
Figure 02_image111
利用下列條件藉由對掌性SFC分離5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-7-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇之兩種對映異構體：管柱：CHIRALPAK® IC，21 × 250 cm；利用30% iPrOH(含0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：70 g/分鐘；UV偵測波長：225 nm，以得到呈第一溶析對映異構體(異構體1)之實例2A。ES/MS (m/z)：525.1 (M+H)。藉由對掌性分析SFC確認異構體1之對映異構體富集，＞99% ee，t (R)：1.56分鐘；管柱：CHIRALPAK® IC，4.6 × 150 mm；利用30% iPrOH(0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。分離實例2B之標題化合物以得到第二溶析對映異構體(異構體2)。ES/MS (m/z)：525.2 (M+H)。藉由對掌性分析SFC確認異構體2之對映異構體富集，98% ee，t (R)：2.33分鐘；管柱：CHIRALPAK® IC，4.6 × 150 mm；利用30% iPrOH(0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。 實例3A 8-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體1 及 實例3B 8-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體2
Figure 02_image113
利用下列條件藉由對掌性SFC分離8-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇之兩種對映異構體：管柱：CHIRALCEL® OD-H，21 × 250 cm；利用35% MeOH(含0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：80 g/分鐘；UV偵測波長：225 nm，以得到呈第一溶析對映異構體(異構體1)之實例3A。ES/MS (m/z)：491.0 (M+H)。藉由對掌性分析SFC確認異構體1之對映異構體富集，＞99% ee，t (R)：1.55分鐘；管柱：CHIRALCEL® OD-H，4.6 × 150 mm；利用35% MeOH(0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。分離實例3B之標題化合物以得到第二溶析對映異構體(異構體2)。ES/MS (m/z)：491.0 (M+H)。藉由對掌性分析SFC確認異構體2之對映異構體富集，＞99% ee，t (R)：2.26分鐘；管柱：CHIRALCEL® OD-H，4.6 × 150 mm；利用35% MeOH(0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。 實例4A 7-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體1 及 實例4B 7-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體2
Figure 02_image115
利用下列條件藉由對掌性SFC分離7-氯-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇之兩種對映異構體：管柱：CHIRALCEL® OD-H，21 × 250 cm；利用35% MeOH(含0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：80 g/分鐘；UV偵測波長：225 nm，以得到呈第一溶析對映異構體(異構體1)之實例4A。ES/MS (m/z)：491.0 (M+H)。藉由對掌性分析SFC確認異構體1之對映異構體富集，＞99% ee，t (R)：1.71分鐘；管柱：CHIRALCEL® OD-H，4.6 × 150 mm；利用35% MeOH(0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。分離實例4B之標題化合物以得到第二溶析對映異構體(異構體2)。ES/MS (m/z)：491.0 (M+H)。藉由對掌性分析SFC確認異構體2之對映異構體富集，＞99% ee，t (R)：2.38分鐘；管柱：CHIRALCEL® OD-H，4.6 × 150 mm；利用35% MeOH(0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。 實例5A 8-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體1 及 實例5B 8-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體2
Figure 02_image117
利用下列條件藉由對掌性SFC分離8-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇之兩種對映異構體：管柱：CHIRALCEL® OD-H，21 × 250 cm；利用30% MeOH(含0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：80 g/分鐘；UV偵測波長：225 nm，以得到呈第一溶析對映異構體(異構體1)之實例5A。ES/MS (m/z)：475.0 (M+H)。藉由對掌性分析SFC確認異構體1之對映異構體富集，＞99% ee，t (R)：1.56分鐘；管柱：CHIRALCEL® OD-H，4.6 × 150 mm；利用30% MeOH(0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。分離實例5B之標題化合物以得到第二溶析對映異構體(異構體2)。ES/MS (m/z)：475.0 (M+H)。藉由對掌性分析SFC確認異構體2之對映異構體富集，＞99% ee，t (R)：2.29分鐘；管柱：CHIRALCEL® OD-H，4.6 × 150 mm；利用30% MeOH(0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。 實例6A 7-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體1 及 實例6B 7-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體2
Figure 02_image119
利用下列條件藉由對掌性SFC分離7-氟-5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇之兩種對映異構體：管柱：CHIRALCEL® OD-H，21 × 250 cm；利用35% MeOH(含0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：80 g/分鐘；UV偵測波長：225 nm，以得到呈第一溶析對映異構體(異構體1)之實例6A。ES/MS (m/z)：475.0 (M+H)。藉由對掌性分析SFC確認異構體1之對映異構體富集，＞99% ee，t (R)：1.32分鐘；管柱：CHIRALCEL® OD-H，4.6 × 150 mm；利用35% MeOH(0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。分離實例6B之標題化合物以得到第二溶析對映異構體(異構體2)。ES/MS (m/z)：475.0 (M+H)。藉由對掌性分析SFC確認異構體2之對映異構體富集，＞99% ee，t (R)：1.95分鐘；管柱：CHIRALCEL® OD-H，4.6 × 150 mm；利用35% MeOH(0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。 實例8A 5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-7-甲基-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體1 及 實例8B 5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-7-甲基-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體2
Figure 02_image121
利用下列條件藉由對掌性SFC分離5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-7-甲基-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇之兩種對映異構體：管柱：CHIRALCEL® OD-H，21 × 250 cm；利用30% iPrOH(含0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：80 g/分鐘；UV偵測波長：265 nm，以得到呈第一溶析對映異構體(異構體1)之實例8A。ES/MS (m/z)：471.2 (M+H)。藉由對掌性分析SFC確認異構體1之對映異構體富集，＞99% ee，t (R)：1.47分鐘；管柱：CHIRALCEL® OD-H，4.6 × 150 mm；利用30% iPrOH(0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。分離實例8B之標題化合物以得到第二溶析對映異構體(異構體2)。ES/MS (m/z)：471.2 (M+H)。藉由對掌性分析SFC確認異構體2之對映異構體富集，＞99% ee，t (R)：2.05分鐘；管柱：CHIRALCEL® OD-H，4.6 × 150 mm；利用30% iPrOH(0.2% IPA)/CO 2之流動相溶析；管柱溫度：40℃；流速：5 mL/分鐘；UV偵測波長：225 nm。 實例9 5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，異構體2，苯磺酸
Figure 02_image123
在50℃下加熱5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇(異構體2)(實例1B)(100 mg，0.19 mmol)含在ACN(3 mL)中之漿液。添加單水合苯磺酸(40 mg，0.23 mmol)含在ACN(1 mL)中之溶液。在50°C下加熱澄清的黃色溶液10分鐘。停止加熱，使反應混合物冷卻至室溫，並攪拌混合物過夜。添加甲苯(2 mL)並攪拌反應混合物2小時。過濾溶液，收集所得固體並用ACN(1 mL)洗滌固體。在真空下乾燥固體以得到標題化合物(74 mg，55 %)。 替代製備實例9
在50℃下加熱5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇(異構體2)(實例1B)(124.1 mg，0.24 mmol)含在MEK(4 mL)中之漿液。添加單水合苯磺酸(50 mg，0.28 mmol)溶解在MEK(1 mL)中之溶液。停止加熱，使反應混合物冷卻至室溫，並在一個週末攪拌混合物 。在N 2流下濃縮。添加MEK(1 mL)及漿液以得到黃色結晶固體。收集固體，用MEK洗滌，並在室溫下真空乾燥，以得到標題化合物(78.8 mg，48%)。 XRD，實例9
如實例1B所述完成XRD。藉由XRD圖案使用CuKa輻射表徵5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇(異構體2，苯磺酸)之製備樣本為具有如下表5中所述的繞射峰(2-θ值)，及特定言之具有在20.5處的峰與選自由12.3、22.2及23.1組成之群之峰中之一或多者之組合；繞射角公差為0.2度。 表 5 ：結晶實例 9 之 X 射線粉末繞射峰
峰 角度(°2-θ) +/- 0.2° 相對強度(最強峰之%)
1 7.6 27.10
2 10.6 34.50
3 12.3 42.10
4 12.6 32.30
5 17.7 32.80
6 19.2 26.70
7 20.5 100.00
8 22.2 45.50
9 23.1 36.30
10 24.2 29.80
實例10 結晶5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，4-甲基苯磺酸，異構體2
Figure 02_image125
將5-(4-{2-[3-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇(異構體2)(實例1B)(204.2 g，389 mmol)及EtOAc(5 L)一起添加並在60℃下攪拌，接著在60℃下添加MeOH(200 mL)，以得到澄清的棕色溶液。添加標題產物(11.48 g)使溶液接種，接著添加預先混合的4-甲基苯磺酸；水合物(81.4 g，428 mmol)含在EtOAc(800 mL)中之預混合溶液，以得到黃色懸浮液。在50℃下攪拌懸浮液30分鐘。濃縮懸浮液至½體積。在室溫下使溶液冷卻1小時，過濾，收集固體，並用EtOAc洗滌固體。在30℃於真空下乾燥固體一個週末以得到標題化合物(239 g，343 mmol)。為進一步純化該物質，將標題化合物(229 g，328.7 mmol)及2-丙醇(4.6 L)一起添加並加熱至60℃，歷時2小時。冷卻至室溫，歷時30分鐘。過濾固體並用iPrOH(100 mL)洗滌。在N 2流下乾燥固體過夜以得到標題化合物(174.4 g，76.2%)。將基本上以相同方式製備的各批標題化合物合併並添加庚烷(2 L)。將懸浮液攪拌30分鐘，過濾固體，並用庚烷(300mL)洗滌。在N 2流下乾燥所收集的固體過夜以得到標題化合物(199.7 g，99.5%)。 XRD，實例10
如針對於實例1B所述完成XRD。藉由XRD圖案使用CuKa輻射表徵5-(4-{2-[5-(氟甲基)吖丁啶-1-基]乙氧基}苯基)-8-(三氟甲基)-5H-[1]苯并哌喃并[4,3-c]喹啉-2-醇，4-甲基苯磺酸，異構體2(實例10)之製備樣本為具有如下表6中所述的繞射峰(2-θ值)，及特定言之具有在20.1處的峰與選自由12.8、19.5及22.8組成之群之峰中之一或多者之組合；繞射角公差為0.2度。 表 6 ：結晶實例 10 之 X 射線粉末繞射峰
峰 角度(°2-θ) +/- 0.2° 相對強度(最強峰之%)
1 7.6 25.70
2 12.4 27.90
3 12.8 36.80
4 18.9 26.50
5 19.5 56.90
6 20.1 100.00
7 20.9 41.50
8 21.8 40.90
9 22.8 39.40
10 25.4 29.70
生物分析
此項技術中熟知ER表現與某些癌症之間關係的證據。
以下分析之結果證實，實例之式I、式II及式III之化合物係活性SERD並被認為可用於治療癌症。 ERα( 野生型 ) 、 ERα(Y537S 突變體 ) 及 ERβ 競爭結合分析
以下ER競爭結合分析之目的係欲確定測試化合物對ERα(野生型)、ERα(Y537S突變體)及ERβ之親和力。
使用0.025 μCi/孔 3H-雌二醇(118 Ci/mmol，1 mCi/mL)、7.2 ng/孔 Erα(野生型)或7.2 ng/孔 Erα(Y537S突變體)或7.7 ng/孔 Erβ受體，在包含50 mM HEPES(pH 7.5)、1.5 mM EDTA、150 mM NaCl、10%甘油、1 mg/mL卵白蛋白及5 mM DTT之緩衝液中進行競爭結合分析。以10,000 nM至0.5 nM之10種不同濃度添加測試化合物，並在1 μM 17-β雌二醇存在下測定非特異性結合。在室溫下培養結合反應(140 μL) 4小時，及然後將冷的葡聚糖-木炭緩衝液(70 μL)(每50 mL分析緩衝液包含0.75 g活性炭及0.25 g葡聚糖)添加至每個反應。將板在4°C的軌道振盪器上混合8分鐘及然後在4°C下以3000 rpm離心10分鐘。將混合物之等分試樣(120 μL)轉移至另一個96孔白色平底板(Costar)並將Perkin Elmer Optiphase Supermix超音波流體(175 μL)添加至每個孔。密封板並在軌道振盪器上劇烈搖晃。培養2.5小時後，在Wallac Microbeta計數器中讀取板。使用4參數邏輯曲線擬合計算IC 50並計算10 μM時之抑制%。使用Cheng-Prusoff方程將化合物之IC 50值轉換為K i。該分析之結果證實，實例1、1A及1B(及其他)結合至如下表7所示的重組ERα野生型及ERα突變體(Y537S)及實例1B亦被確定結合至ERβ，K i(nM) ERβ競爭為0.11 +0.07，n=3。 表 7 ： ERα( 野生型 ) 、 ERα(Y537S 突變體 ) 及 ERβ 競爭結合結果
實例編號 K i(nM) ERα( 野生型 ) K i(nM) Er α (Y537S 突變體 )
1 0.87 5.80
1A 12.45 ± 9.32，n=3 57.18 ± 39.13，n=3
1B 0.31 ± 0.38，n=5 2.79 ± 3.00，n=5
2 2.17 6.78
2A 0.65 7.92
2B 60.4 293.6
3 2.36 6.69
3A 8.11 27.23
3B 0.59 2.79
4 0.64 12.11
4A 16.78 54.97
4B 0.34 2.34
5 2.82 19.47
5A 12.54 81.15
5B 1.30 6.56
6 4.14 15.77
6A 8.53 45.99
6B 1.13 5.71
7 1.55 8.55
8 3.20 11.4
8A 9.33 66.94
8B 0.94 5.44
在所測試的示例性化合物中，ERα野生型之Ki之範圍為約0.300 nM至約65 nM。Erα Y537S突變體之Ki之範圍為約2 nM至300 nM。該分析的結果證實示例化合物對ERα野生型突變體(ESR1 Y537S)及ERβ蛋白之結合親和力及效力。 MCF7 細胞中之 ER α 降解分析
以下ERα降解分析之目的係欲測量測試化合物對ERα陽性乳癌細胞系(諸如MCF7)中之ERα之降解。
在補充有10% FBS、0.01 mg/mL人胰島素1及1%青黴素/鏈黴素抗生素之DMEM培養基中培養MCF7(購自ATCC HTB-22)細胞並在384孔平底板中以4,000個細胞/孔之密度在包含10% 剝離木炭的FBS之DMEM無酚紅培養基(20 μL)中接種。將細胞在細胞培養箱(5% CO 2，95%相對濕度及37℃)中培養過夜並使細胞附著至板。第二天對細胞投與測試化合物。使用Echo 555聲學分配器製備在6 μM至0.0003 μM範圍內之測試化合物系列稀釋液(1:3)。藉由從連續稀釋液板取5μL添加至細胞板進行細胞之給藥，產生最終DMSO濃度為0.2%，最終測試化合物濃度劑量範圍為2至0.0001 μM。對於最大點，使用包含0.2% DMSO之培養基及對於最小點，使用在包含0.2% DMSO之生長培養基中稀釋為2 μM最終濃度之氟維司群。在投與測試化合物後，將細胞板在37℃及5% CO 2下培養24小時。在室溫下藉由添加14%對甲醛(10 μL)固定細胞30分鐘。用PBS(20 µL)洗滌細胞一次並用包含0.5% (v/v) TWEEN® 20之PBS(20 µL)培養1小時。用包含0.05% TWEEN® 20之PBS洗滌細胞(2×)並在室溫下用含在包含0.05% TWEEN® 20及0.1% TRITON™ X-100 (20 μL/孔)之PBS中之3% BSA阻斷1小時。每孔添加含在包含0.05% TWEEN® 20之PBS 1% BSA中之1:500初級抗體(20 μL)(ERα(純系SP1)單株兔抗體#RM-9101-S，Thermo Scientific)稀釋液，密封板並在4℃下培養過夜。第二天用包含0.05% TWEEN® 20之PBS洗滌細胞(2×)並在室溫下與含在PBS 1% BSA中之二級抗體(20 μL/孔)(1:1000稀釋液，山羊抗兔IgM ALEXA FLUOR™ 488)一起培養105分鐘。用PBS(2×20 µL)洗滌板後，每孔(20 µL)添加含在PBS中之RNA酶(Sigma)(20 μL 50 μg/mL)及1:1000碘化丙啶稀釋液。密封板並在室溫下在工作臺上培養1小時(避光)。用ACUMEN EXPLORER™[雷射掃描螢光微板細胞計數儀，由TTP LABTECH LTD製造]掃描板以測量ERα。圖像分析係基於用於識別陽性細胞之細胞螢光信號。藉由平均強度識別ER陽性細胞。使用碘化丙啶/DNA在575至640 nm下的總強度以識別個別細胞。分析輸出為ER陽性細胞%。每個輸出使用GENE DATA™藉由曲線擬合至四參數邏輯測定IC 50。該分析的結果證實在MCF7乳癌細胞中由如本文所述的式I、式II及式III之化合物誘導的ERα之有效降解。實例1、1A及1B之相對IC 50值示於表8中。 表 8 ： MCF7 細胞中之 ERα 降解分析
實例編號 相對 IC 50(μM)
1 0.003405 ± 0.001086，n=3
1A 0.3940 ± 0.1941，n=4
1B 0.003088 ± 0.001523，n=19
2 0.05220 ± 0.006508，n=2
2A 0.05125 ± 0.01626，n=2
2B ＞2
3 0.03347 ± 0.007830，n=3
3A 0.3905
3B 0.008664
4 0.02241 ± 0.0003553，n=3
4A 0.4998
4B 0.006892
5 0.03653 + 0.03738，n=2
5A 0.5221
5B 0.009493 ± 0.001103，n=2
6 0.05086 + 0.006889，n=3
6A 0.1753
6B 0.009132
7 0.07879 ± 0.007379，n=2
8 0.01738 ± 0.008752，n=2
8A 0.2341
8B 0.009617 ± 0.005198，n=2
10 0.004216 ± 0.001619，n=5
具體而言，表8中的結果顯示實例1之化合物對MCF7乳癌細胞中之ERα之有效降解。在所測試的示例性化合物中，相對IC 50之範圍為0.003至＞2 μM，指示除實例2B之外的所有化合物在所測試的濃度下顯示活性。該分析的結果證實式(I)化合物係在細胞中具有有效ERα降解活性之SERD。 MCF7 細胞中之 PRα 誘導分析
以下PRα誘導分析之目的係欲確定測試化合物是否具有針對ERα受體之激動活性(預期激動劑會活化受體)。
在補充有10% FBS、0.01 mg/mL人胰島素1及1%青黴素/鏈黴素抗生素之DMEM培養基中培養MCF7(購自ATCC HTB-22)並在384孔平底板中以4,000個細胞/孔之密度以20 μL體積含在包含10% FBS(剝離木炭的)之DMEM無酚紅培養基中來接種細胞(在變為70%匯合之前)。在細胞培養培養箱(5% CO 2，95%相對濕度，在37℃下)中培養細胞過夜並允許細胞附著至板。第二天，對細胞進行測試化合物之給藥。使用Echo 555聲學分配器以製備6 μM至0.0003 μM之化合物連續稀釋液(1:3)。藉由從連續稀釋板將測試化合物(5 μL)添加至細胞板產生0.2%之最終DMSO濃度對細胞給藥，最終測試化合物濃度劑量之範圍在2 μM與0.0001 μM之間。對於最大點，使用包含0.2% DMSO之培養基及對於最小點，使用在包含0.2% DMSO之生長培養基中稀釋為2 μM最終濃度之氟維司群(fulvestrant)。在測試化合物之給藥後，在37℃及5% CO 2下培養細胞板24小時。在室溫下藉由添加14%對甲醛(10 μL)固定細胞30分鐘。用PBS (20 µL)洗滌細胞一次並用包含0.5% (v/v) TWEEN® 20之PBS (20 µL)培養1小時。用包含0.05% TWEEN® 20之PBS (20 µL)洗滌細胞兩次並在室溫下用含在包含0.05% TWEEN® 20及0.1% TRITON™ X-100 (20 μL/孔)之PBS中之3% BSA阻斷1小時。每孔添加與0.05 TWEEN® 20含在1% BSA/PBS中之1:500初級抗體(20 μL)(PR單株小鼠抗人抗體，純系PgR 636 Dako，M3569)稀釋液，密封板並在4℃下培養過夜。
第二天，用PBS 0.05% TWEEN® 20 (2×20 µL)洗滌細胞並在室溫下與含在PBS 1% BSA中之二級抗體(20 μL/孔)(1:1000稀釋液，山羊抗兔IgM ALEXA FLUOR™ 488)培養105分鐘。用PBS(2×20 µL)洗滌後，每孔添加含在PBS中之RNA酶(20 μL 50 μg/mL)(Sigma)及1:1000碘化丙啶稀釋液。密封板並在室溫下在工作臺上培養1小時(避光)。用ACUMEN EXPLORER™[雷射掃描螢光微板細胞計數儀，由TTP LABTECH LTD製造]掃描板以測定PRα。圖像分析係基於用於識別陽性細胞之細胞螢光信號。藉由平均強度識別PR陽性細胞。使用碘化丙啶/DNA在575至640 nm下的總強度以識別個別細胞。分析輸出為PR陽性細胞%。每個輸出使用GENE DATA™藉由曲線擬合至四參數邏輯測定IC 50。該分析的結果證實實例1、1A及1B在MCF7乳癌細胞中沒有顯著的激動活性。對於所測試的化合物，該分析中之相對IC 50s＞2 µM。該分析的結果證實在MCF7乳癌細胞中測試的示例性化合物沒有顯著的激動活性。此等結果亦證實，所測試的示例性化合物係MCF7乳癌細胞中ERα之拮抗劑(亦即，其等具有SERD活性)。 MCF7-ESR1 Y537N 682 CRISPR 細胞中之 PRα 抑制 (ERα 功能拮抗作用 ) 細胞分析
以下PRα抑制(ERα功能拮抗作用)細胞分析之目的係欲確定測試化合物對Y537N突變ERα受體之拮抗活性。預計該分析中之拮抗劑會阻斷ERα受體之功能。PRα係ERα之下游轉錄靶標及因此預期ERα之拮抗劑會抑制PRα之表現。
在補充有10% FBS及1%青黴素/鏈黴素抗生素之DMEM培養基中培養MCF7-ESR1 Y537N-682(藉由MCF7細胞中之ESR1基因之CRISPR/Cas9基因編輯產生，純系＃682)，並將細胞(在變為70%滿度之前)接種在384孔平底板中，以4,000個細胞/孔之密度於DMEM無酚紅培養基10% FBS(20 μL體積)(木炭脫除處理)中。在細胞培養培養箱(5% CO 2，95%相對濕度，及37℃)中培養細胞過夜並允許細胞附著至板。第二天，對細胞進行測試化合物之給藥。使用Echo 555聲學分配器以製備6 μM至0.0003 μM之化合物連續稀釋液(1:3)。藉由取5 μL從連續稀釋板添加至細胞板產生0.2%之最終DMSO濃度對細胞給藥，最終測試化合物濃度劑量之範圍在2 μM與0.0001 μM之間。對於最大點，使用包含0.2% DMSO之培養基，及對於最小點，使用在包含0.2% DMSO之生長培養基中稀釋為2 μM最終濃度之氟維司群。在測試化合物之給藥後，在37℃及5% CO 2下培養細胞板72小時。在室溫下藉由添加14%對甲醛(10 μL)固定細胞30分鐘。用PBS(1×20 µL)洗滌細胞並用包含0.5% (v/v) TWEEN® 20之PBS(20 µL)培養1小時。用PBS(2×20 µL)、0.05% TWEEN® 20洗滌細胞並在室溫下用3% BSA/PBS 0.05% TWEEN® 20、0.1% TRITON™ X-100(20 μL/孔)阻斷1小時。每孔添加含在1% BSA/PBS 0.05 TWEEN® 20中之1:500初級抗體(20 μL)(PR單株小鼠抗人抗體，純系PgR 636 Dako，M3569)稀釋液，密封板並在4℃下培養過夜。
第二天，用PBS 0.05% ®(2×20 µL)洗滌細胞並在室溫下與含在PBS 1% BSA中之二級抗體(20 μL/孔)(1:1000稀釋液，山羊抗兔IgM ALEXA FLUOR™ 488)培養105分鐘。用PBS(2×20 µL)洗滌後，每孔添加含在PBS中之RNA酶(20 μL 50 μg/mL)(Sigma)及1:1000碘化丙啶稀釋液。密封板並在室溫下在工作臺上培養1小時(避光)。用ACUMEN EXPLORER™[雷射掃描螢光微板細胞計數儀，由TTP LABTECH LTD製造]掃描板以測定PRα。圖像分析係基於用於識別陽性細胞之細胞螢光信號。藉由平均強度識別PR陽性細胞。使用碘化丙啶/DNA在575至640 nm下的總強度以識別個別細胞。分析輸出為PR陽性細胞%。每個輸出使用GENE DATA™藉由曲線擬合至四參數邏輯測定IC 50。
該分析的結果證實實例1、1A及1B在MCF7(ESR1 Y537N，雜合突變體)乳癌細胞中對PRα及功能性拮抗作用之有效抑制。該分析中實例1、1A及1B(及其他)之相對IC 50s顯示於下表9中。所測試的示例性化合物之相對IC 50s之範圍為約0.0118至＞1.6 μM，指示該等示例性化合物係ERα突變體(Y537N)之有效拮抗劑及ERα介導之轉錄之有效抑制劑，除了實例2B(1.6 μM)之外。PRα(PGR)亦係ERα之轉錄靶標及該分析之結果證實由ERα介導之PRα轉錄之有效抑制。 表 9 ： MCF7 Y537N 682 CRISPR 細胞中之 PRα 抑制 (ERα 功能拮抗作用 ) 細胞分析
實例編號 相對 IC 50(µM)
1 0.01679 ± 0.00003，n=2
1A 1.20 ± 0.29，n=2
1B 0.0130 ± 0.0059，n=14
2 0.01451 ± 0.002619，n=2
2A 0.02494 ± 0.007386，n=3
2B 1.639 ± 0.2228，n=3
3 0.07717 ± 0.01154，n =2
3A 0.6117
3B 0.016
4 0.03854 + 0.003865，n=2
4A 0.5052
4B 0.01181
5 0.06614 ± 0.01551，n=2
5A 0.3945
5B 0.01822 + 0.009815，n=2
6 0.06319 ± 0.01609，n=2
6A 0.2364
6B 0.0136
7 0.1271
8 0.04124 + 0.006572，n=2
8A 0.4335 ± 0.1946，n=3
8B 0.008926 ± 0.003828，n=3
10 0.007936 ± 0.003163，n=3
MCF7 細胞中之 PRα 抑制 (ERα 功能拮抗作用 ) 細胞分析
以下PRα抑制(ERα功能拮抗作用)細胞分析之目的係欲確定測試化合物對ERα受體之拮抗活性。預計該分析中之拮抗劑會阻斷ERα受體之功能。PRα係ERα之下游轉錄靶標及因此預期ERα之拮抗劑會抑制PRα之表現。
使用MCF7細胞系進行如上述ERα降解細胞基礎Acumen分析中詳述的分析條件，除了在測試化合物分配之前，從細胞板除去培養基並用包含0.47 nM雌二醇之分析培養基預處理除陰性對照孔(板的列24)外的所有孔30分鐘。在該分析中，進行免疫染色以偵測PRα並用ACUMEN EXPLORER™[雷射掃描螢光微板細胞計數儀，由TTP LABTECH LTD製造]掃描板以測量PRα。圖像分析係基於用於識別陽性細胞之細胞螢光信號。藉由平均強度識別PRα陽性細胞。使用碘化丙啶/DNA在575-640下的總強度以識別個別細胞。分析輸出為PRα陽性細胞%。每個輸出使用GENE DATA™藉由曲線擬合至四參數邏輯測定IC 50。該分析的結果證實實例1、1A及1B在MCF7乳癌細胞中有效抑制PRα及功能拮抗作用。該分析中實例1、1A及1B之相對IC 50顯示於下表10中。示例性化合物之相對IC 50之範圍為約0.029至＞2 μM，指示除1A及2B外測試的所有示例性化合物均係ERα野生型蛋白之有效拮抗劑及由ERα介導之轉錄之有效抑制劑。PRα(PGR)亦係ERα之轉錄標靶及該分析的結果證實PRα之由ERα介導之轉錄在所測試濃度下之有效抑制作用。 表 10 ： MCF7 細胞中之 PRα 抑制 (ERα 功能拮抗作用 ) 細胞分析
實例編號 相對 IC 50(µM)
1 0.1283 ± 0.0226，n=3
1A ＞2.000
1B 0.04129 ± 0.03370，n=16
2 0.1634
2A 0.1215 ± 0.05368，n=2
2B ＞2.000
3 0.07666 ± 0.02101，n=3
3A 0.9274
3B 0.03435
4 0.07626 ± 0.1676，n=3
4A 0.8465
4B 0.02866
5 0.1180 ± 0.01230，n=2
5A 0.6002
5B 0.03203 ± 0.005306，n=2
6 0.08258 + 0.005682，n=3
6A 0.2528
6B 0.02835
7 0.1134 ± 0.02087，n=2
8 0.06835 ± 0.02273，n=2
8A 0.2058
8B 0.04848 ± 0.02944，n=2
10 0.02633 + 0.004459，n=3
MCF7 及 MCF7-ESR1 Y537N-682 中之細胞增殖分析
以下細胞增殖分析之目的一般係欲偵測測試化合物是否對細胞增殖具有影響。
將MCF7(購自ATCC HTB-22)細胞以2,000個細胞/孔之密度接種於透明底部384孔細胞培養板中之DMEM無酚紅培養基10% FBS(20 μL體積)(剝離木炭的)中。在補充有10% FBS及1%青黴素/鏈黴素抗生素之DMEM培養基中以1000個細胞/孔之密度接種MCF7-ESRY537N-682(藉由MCF7細胞中之ESr1基因之CRISPR/Cas9編輯產生，純系＃682產生)。在37℃及5% CO 2下培養板。第二天，對細胞進行測試化合物之給藥。使用Echo 555聲學分配器以製備60 μM至0.003 μM之測試化合物連續稀釋液(1:3)。藉由取5 μL從連續稀釋板添加至細胞板產生0.2%之最終DMSO濃度對細胞給藥，最終測試化合物濃度劑量之範圍在20 μM與0.001 μM之間。對於最大點，使用包含0.2% DMSO之培養基及對於最小點，使用在包含0.2% DMSO之生長培養基中稀釋為2 μM最終濃度之氟維司群。在測試化合物之給藥後，在37℃及5% CO 2下培養細胞板。添加測試化合物後7天，從培養箱取出板並將96%(65 μL)冷EtOH添加至每個孔。30分鐘後，取出培養基並每孔添加含在PBS中之RNA酶(20 μL 50 μg/mL)(Sigma)及1:1000碘化丙啶稀釋液。密封板並在室溫下在工作臺上培養1小時(避光)。用ACUMEN EXPLORER™[雷射掃描螢光微板細胞計數儀，由TTP LABTECH LTD製造]掃描板。MCF-7細胞系生長形成聚集物，作為物體數量之細胞數可能無法用作讀數；因此可藉由估計的細胞數來評估細胞數(藉由面積參數計算(總細胞群之總面積比率)(FL-1(PI)之峰強度之指定範圍及單細胞群之平均面積(由周長定義))。每個輸出使用GENE DATA™藉由曲線擬合至四參數邏輯測定IC 50。MCF7 ESR1野生型及MCF7-ESR1 Y537N突變細胞中之實例1、1A及1B(及其他)之相對IC 50顯示於下表11中。該分析的結果證實實例1、1A及1B(及其他)在MCF7(ESR1野生型)及MCF7(ESR1 Y537N突變體)乳癌細胞中之有效抗增殖活性及細胞生長抑制。示例性化合物之相對IC 50在MCF7 ESR1野生型中為約0.0035至1.176 μM及在MCF7(ESR1 Y537N突變體)乳癌細胞中為0.014至1.86 μM，指示所有測試的示例性化合物均證實有效的抗增殖活性及MCF7(ESR1野生型)及MCF7(ESR1 Y537N突變體)乳癌細胞中之細胞生長抑制。 表 11 ： MCF7 及 MCF7-ESR1Y537N-682 中之細胞增殖分析
實例編號 相對 IC 50(µM) MCF7 ESR1 野生型 相對 IC 50(µM) MCF7 ESR1 Y537N 突變細胞
1 0.00768 ± 0.01263，n=3 0.0321 ± 0.0068，n=2
1A 1.18 ± 0.68，n=4 1.86 ± 1.03，n=4
1B 0.00349 ± 0.00225，n=11 0.0167 ± 0.0091，n=12
2 0.00425 0.05113
2A 0.00612 0.04284 ± 0.002666，n=2
2B 0.4053 0.7777
3 0.3287 0.02394
3A 0.303 0.6169 ± 0.1735，n=3
3B 0.008785 0.02144 ± 0.008938，n=3
4 0.02861 0.02664
4A 0.2862 0.5442 ± 0.2181，n=3
4B 0.003496 0.01433 ± 0.004925，n=3
5 0.08009 0.07252 + 0.02632，n=2
5A 0.4095 0.5167 + 0.09497，n=3
5B 0.007666 0.02131 + 0.01300，n=3
6 0.05128 0.02362
6A 0.0759 0.3234 ± 0.1758，n=3
6B    0.01539
7 0.01902 0.04479 ± 0.01188，n=2
8 0.04157 0.03290 ± 0.003002，n=2
8A 0.1743 0.6621 ± 0.1173，n=2
8B 0.005083 0.01419 ± 0.01108，n=2
10 0.004379 0.01059
MCF7 腫瘤中之體內靶抑制 (IVTI) 分析 (PGR RT-qPCR 分析 )
該IVTI分析之目的係欲測量測試化合物(SERD)在植入小鼠中之異種移植腫瘤中抑制ERα下游PRα基因表現(轉錄)之能力。
在來自Envigo RMS, Inc., Madison, Wisconsin之雌性NOD SCID小鼠(22至25 g)之右脇區中皮下植入於1:1 HBSS ± MATRIGEL™溶液(200 µL)中之5×10e 6個MCF7 ER陽性乳癌細胞(ATCC，# HTB-22)。在腫瘤細胞植入前1天皮下植入17-β雌二醇丸粒(0.18 mg/丸粒，90天釋放，Innovative research)。植入後第7天開始每週兩次測量腫瘤生長及體重。當腫瘤大小達到250至350 mm 3時，將動物隨機分成五隻動物的組。對動物口服投與多劑量測試化合物在測試化合物特異性媒劑(1%羥乙基纖維素/0.25% TWEEN® 80/0.05%消泡劑在純水中)中或單獨媒劑3天並在最後一劑後以所需時間間隔收集腫瘤及血液。使用異氟烷(isoflurane)麻醉加頸椎脫位來犧牲動物。快速冷凍腫瘤並儲存在-80℃直至進行RNA分離及RT-qPCR分析。將血液收集在EDTA管中，離心血漿，並在96孔板中在-80℃冷凍。使用質譜法確定測試化合物暴露。
在FASTPREP-24 TM細胞破碎機(MP Biomedical)中使用Matrix D珠(MP Biomedical，#6913-500)在液氮中粉碎腫瘤並在1×RNA溶解緩衝液(來自RNA分離套組)中溶解。在4℃以14000 rpm離心20分鐘後，將腫瘤溶解物轉移至新管。使用PURELINK® RNA迷你套組(Invitrogen #12183018A)或RNeasy迷你套組(Qiagen #74104及#74106)從腫瘤溶解物分離RNA。使用PURELINK® DNA酶組(Invitrogen #12185010)或無RNA酶之DNA酶組(Qiagen #79254)去除DNA污染物。藉由在無RNA酶之水中稀釋樣本並在板讀取器(SpectraMax190)上測量260 nm的吸光度來測量分離的RNA濃度。從所有其他RNA樣本之260 nm測量值減去空白(僅無RNA酶之水)之平均260 nm吸光度測量值。在無RNA酶之水中將RNA樣本稀釋至相等濃度。使用用於RT-PCR之第一股合成系統(Invitrogen，#18080-051)從稀釋之RNA合成cDNA。為進行RT-qPCR，首先在無RNA酶之水中稀釋cDNA。在PCR板(Applied Biosystems，#4309849)中組合2×絕對藍qPCR ROX混合物(Thermo，#AB-4139/A)、PGR引物(Thermo，Hs01556702_m1)及稀釋之cDNA用於各反應。藉由在50℃培育樣本2分鐘，接著在熱循環儀(ABI Prism 7900HT Sequence Detection System)中在95℃培育15分鐘，來擴增cDNA。在95℃繼續培育15秒，接著在50℃培育60秒，總共進行40個循環。將循環標準化為管家基因並用於計算與單獨媒劑相比之PGR抑制%。分析每個樣本一式兩份並使用平均數計算。使用Excel及XL Fit計算標靶百分比(PGR)抑制。
該分析的結果證實實例1B抑制腫瘤異種移植模型中之PRα(PGR)表現。當口服投與時，實例1B在24小時腫瘤異種移植模型中以30 mg/kg劑量抑制PRα(PGR)表現~78%。此等結果證實在腫瘤異種移植模型中ERα拮抗活性及由ERα介導之體內轉錄活性之顯著且持續之抑制。 植入小鼠中之 ER 陽性 (ESR1 野生型 ) 乳癌異種移植腫瘤模型之體內腫瘤生長抑制研究
以下異種移植腫瘤抑制分析之目的係欲測量應測試化合物投與之腫瘤體積之減少。
在培養中擴增人乳癌細胞MCF7(ATCC # HTB-22)及HCC1428(ATCC # CRL-2327)，收穫並皮下注射呈1:1 HBSS±MATRIGEL™溶液(200 µL)之5×10e 6個細胞至雌性NOD SCID小鼠(22-25 g，Envigo RMS, Inc)之右後右脇上。在植入細胞前24小時，皮下植入雌激素丸粒(0.18 mg/丸粒、17β雌二醇，90天釋放，Innovative Research)。在培養中擴增人乳癌細胞T47D(ATCC # HTB-22)，收穫並皮下注射呈1:1 HBSS±MATRIGEL™溶液(200 µL)之5×10e 6個細胞至雌性NOD SCID小鼠(22-25 g，Envigo RMS, Inc)之右後右脇上。在植入細胞前24小時，皮下植入雌激素丸粒(0.38 mg/丸粒、17β雌二醇，90天之釋放，Innovative Research)。在培養中擴增人乳癌細胞ZR-75-1(ATCC # CRL-1500)，收穫並皮下注射呈1:1 HBSS±MATRIGEL™溶液(200 µL)之5×10e 6個細胞至雌性NOD SCID小鼠(22-25 g，Envigo RMS, Inc)之右後右脇上。在植入細胞前24小時，對動物投與50 μl戊酸雌二醇(Delestrogen®)肌內註射液(10 mg/mL)及然後在研究期間每14天投與一次。植入後第7天開始每週兩次測量腫瘤生長及體重。當腫瘤大小達到250至350 mm 3時，將動物及組隨機分成5隻動物的組。在適宜媒劑(含在純水中之1%羥乙基纖維素/0.25% TWEEN® 80/0.05%消泡劑)中製備測試化合物實例1B並藉由口服強飼投與28天，QD。藉由在治療過程中每週兩次進行腫瘤體積測量來確定腫瘤反應。每當測量腫瘤體積時，將體重作為毒性之一般測量值。
發現實例1B之化合物具有如下表12中提供的ΔT/C%值。此等結果指示實例1B之化合物在小鼠中證實良好的口服生物可利用性並在ER陽性(ESR1野生型)人乳癌異種移植模型中證實顯著的抗腫瘤活性或腫瘤消退。 表 12 ：植入小鼠中之 ER 陽性乳癌異種移植腫瘤模型之體內腫瘤生長抑制研究
腫瘤模型 劑量(mg/kg) ΔT/C%或消退% p值
MCF7(乳癌異種移植) 3 -26 0.001*
10 -46 ＜0.001*
30 -36 ＜0.001*
T47D(乳癌異種移植) 3 30 0.008*
10 -11 ＜0.001*
30 -28 ＜0.001*
ZR-75-1(乳癌異種移植) 3 4 ＜0.001*
10 0 ＜0.001*
30 19 ＜0.001*
HCC1428(乳癌異種移植) 10 -45 ＜0.001*
30 -22 ＜0.001*
腫瘤體積之分析基於Log 10及SpatialPower協方差結構。 *：與媒劑對照相比顯著(p＜0.05)。
當治療組中之終點腫瘤體積等於或高於基線腫瘤體積時，計算ΔT/C%。該公式為100*(T-T 0)/(C-C 0)，其中T及C分別係治療組或對照組中之平均終點腫瘤體積。T 0及C 0係彼等組中之平均基線腫瘤體積。
當終點體積低於基線時計算消退%。該公式係100*(T-T 0)/T 0，其中T 0係治療組之平均基線腫瘤體積。
在第32天從基線(隨機分組)開始的所有組之總平均值用於計算T/C變化%。 植入小鼠中之 ESR1 突變體 (Y537S) 乳癌 PDX 腫瘤模型 (ST941/HI) 之體內腫瘤生長抑制研究
以下異種移植腫瘤抑制分析之目的係欲測量應ESR1突變體及激素非依賴性(HI)乳癌患者衍生的異種移植(PDX)模型中之測試化合物投與之腫瘤體積之減少。
ST941/HI PDX模型衍生於South Texas Accelerated Research Therapeutics (San Antonio，TX)並在其下運行。從宿主動物收穫腫瘤片段並植入至免疫缺陷小鼠(The Jackson Laboratory)中並以約125至250 mm 3之平均腫瘤體積開始研究。在適宜媒劑(含在純水中之1%羥乙基纖維素/0.25% TWEEN® 80/0.05%消泡劑)中製備測試化合物實例1B並藉由口服強飼投與28天。藉由在治療過程中每週兩次進行腫瘤體積測量來確定腫瘤反應。每當測量腫瘤體積時，將體重作為毒性之一般測量值。
發現實例1B之化合物具有如下表13中提供的ΔT/C%值。此等結果指示實例1B之化合物在小鼠中證實良好的口服生物可利用性並在ESR1突變體(Y537S)人乳癌PDX模型中證實顯著的抗腫瘤活性或腫瘤消退。 表 13 ：植入小鼠中之 ESR1 突變體乳癌 PDX 腫瘤模型之體內腫瘤生長抑制研究
腫瘤模型 劑量(mg/kg) 時間表 ΔT/C%或消退% p值
ST941C / HI(ESR1突變體乳癌PDX模型) 3 QD 66 0.213
10 QD 15 ＜0.001*
30 QD 6 ＜0.001*
腫瘤體積之分析基於Log 10及SpatialPower協方差結構。 *：與媒劑對照相比顯著(p＜0.05)。
當治療組中之終點腫瘤體積等於或高於基線腫瘤體積時，計算ΔT/C%。該公式為100*(T-T 0)/(C-C 0)，其中T及C分別係治療組或對照組中之平均終點腫瘤體積。T 0及C 0係彼等組中之平均基線腫瘤體積。
當終點體積低於基線時計算消退%。該公式係100*(T-T 0)/T 0，其中T 0係治療組之平均基線腫瘤體積。
在第32天從基線(隨機分組)開始的所有組之總平均值用於計算T/C變化%。 組合研究
由於腫瘤異質性及對內分泌療法之獲得性抗性，組合療法已成為ER陽性及晚期/轉移性乳癌治療中有效療法或克服獲得性耐藥之必要條件。吾人已測試實例1B與CDK4/6抑制劑阿貝西尼、mTOR抑制劑依維莫司、PIK3CA抑制劑阿培里斯及PI3K/mTOR抑制劑8-[5-(1-羥基-1-甲基乙基)吡啶-3-基]-1-[(2S)-2-甲氧基丙基]-3-甲基-1,3-二氫-2H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(「化合物A」)在五種ER陽性乳癌細胞系中之體外組合效應。 用於組合研究之細胞活力分析
將細胞以顯示於下表14中之密度接種於透明底384孔細胞培養板之描述於表中之20 μL體積培養基中。 表 14 ：細胞活力分析細胞系資訊
細胞系 接種密度 商業參考 培養基 固定時間(小時)
T-47D 1000 ATCC HTB-133 RMPI 10% FBS 1% P/S、0.008 mg/mL牛胰島素 72
MCF-7 1000 ATCC HTB-22 DMEM 10% FBS 1% P/S 0.01 mg/mL人胰島素 96
EFM-19 3000 ACC 231 RMPI 10% FBS 1% P/S 144
ZR-75-1 1000 ATCC CRL-1500 RMPI 10% FBS 1% P/S 144
BT-474 1000 ATCC HTB-20 HYBRI-CARE(1 L H2O、1.5 g/L碳酸氫鈉、10% FBS、1% P/S) 144
ZR-75-30 1000 ATCC CRL-1504 RMPI 10% FBS 1% P/S 240
在37℃及5% CO 2下培養板。第二天對細胞進行測試化合物實例1B之給藥。
將化合物製備成10 mM DMSO儲備溶液並用於劑量反應研究，最高濃度從10或1 μM開始，兩種化合物以固定比率一起測試，及然後製備1:3連續稀釋的連續稀釋液以及單獨化合物以進行IC 50測定，起始濃度為20 μM。藉由從連續稀釋板取5 μL添加至細胞板產生0.2%之最終DMSO濃度對細胞給藥，對於單次治療最終測試化合物濃度劑量範圍在20 μM與0.001 μM之間或對於組合在更低的範圍。對於最大點，使用包含0.2% DMSO之培養基及對於最小點，使用在包含0.2% DMSO之生長培養基中稀釋為2 μM最終濃度之星形孢菌素(staurosporine)。在測試化合物之給藥後，在37℃及5% CO 2下培養細胞板。在與化合物培養兩次後，從培養箱取出板並每孔添加冷EtOH 96%(65 μL)。30分鐘後，取出培養基並每孔添加含在PBS中之RNA酶(20 μL 50 μg/mL)(Sigma)及1:1000碘化丙啶稀釋液。密封板並在室溫下培養1小時(避光)。用ACUMEN EXPLORER™[雷射掃描螢光微板細胞計數儀，由TTP LABTECH LTD製造]掃描板。當一些細胞系生長形成聚集物時，作為物件數量之細胞數可能不能用作讀數；因此，使用總面積群體(指定的FL-1(PI)峰強度範圍)或總PI強度來評估細胞數量。
體外組合數據表明，如表15中所顯示，在5個ER陽性乳癌細胞系中的5個中，實例1B與阿貝西尼或依維莫司之組合具有協同作用(如下所定義)。實例1B與化合物A協同作用之組合在所測試的4種ER陽性乳癌細胞系中的4種中具有協同作用。實例1B與阿培里斯之組合效應在4種ER陽性乳癌細胞系中的2種中係累加的及在4種ER陽性乳癌細胞系中的2種中係協同的。 表 15 ：實例 1B 與其他靶向劑在 ER 陽性乳癌細胞系中之體外組合
乳癌細胞系 治療1 治療2 組合指數(CI50) 統計學解釋 生物學解釋
MCF7 實例1B 阿貝西尼 0.2675 協同 累加
依維莫司 0.0389 協同 協同
T47D 實例1B 阿貝西尼 0.2693 協同 協同
依維莫司 0.0609 協同 協同
阿培里斯 0.0818 協同 協同
化合物A 0.2401 協同 協同
ZR-75-1 實例1B 阿貝西尼 0.2067 協同 協同
依維莫司 0.1853 協同 協同
阿培里斯 1.3717 累加 累加
化合物A 0.3768 協同 協同
ZR-75-30 實例1B 阿貝西尼 0.3960 協同 協同
依維莫司 0.1248 協同 協同
阿培里斯 0.4149 累加 累加
化合物A 0.7098 協同 協同
EFM-19 實例1B 阿貝西尼 0.3455 協同 協同
依維莫司 0.5033 協同 累加
阿培里斯 0.2963 協同 協同
化合物A 0.4326 協同 協同
組合效應之數據分析及解釋
使用文獻中公開的方法計算體外組合效應(L. Zhao等人，Front Biosci，2010，2:241-249及L. Zhao等人，Clin Cancer Res，2004，10(23):7994-8004)。為識別兩種藥物之間的協同或拮抗相互作用，使用具有XLFit 5 add ins之定制XL模板進行曲線移位分析。使用4參數邏輯回歸調整單一藥劑曲線。用於擬合之標準及限制係(i)底部＜(-20)固定為0及(ii)頂部＞120固定為100。若所有觀察結果均低於使用者設定的臨限值，則執行與hill = 0之恆定擬合並認為IC 50高於最大包含濃度。一旦已獲得每種單一藥劑之絕對IC 50，則計算單個及組合之50%活性之當量濃度。使用此等等效濃度及測得的活性，吾人重新計算絕對IC 50，單一藥劑之曲線在eq濃度值等於1時將達到50%活性，而協同組合在較低值時將達到50%，導致向左移動，及拮抗組合將顯示向右移動。等效濃度亦用於計算CI 50(50%活性時之組合指數)，其中CI 50等於組合曲線之絕對IC 50。連同CI 50可計算不同活性百分比之其他CI(組合指數)(CI10、CI20、CI30、CI40、CI60、CI70、CI80、CI90)。為計算CInn，計算不同活性百分比之等效濃度。對於每個活性百分比，吾人計算誤差幅度(誤差幅度係95%之置信區間)並使用該置信區間吾人將計算上限作為CI加上誤差幅度及計算下限作為CI減去誤差幅度。上限=CI±置信區間95%及下限=CI-置信區間95%。然後使用此等限制來解釋結果。
每個活性百分比之統計學解釋如下：
下限＜1及上限＞1 累加
上限＜1 協同
下限＞1 對抗
每個活性百分比之生物學解釋如下：
CInn ＜ 0.5 協同
CInn ＞ 0.5及CInn ＜ 2 累加
CInn ＞ 2 對抗
體內組合研究
由於腫瘤異質性及對內分泌療法之獲得性抗性，組合療法已成為ER陽性及晚期/轉移性乳癌治療中有效療法或克服獲得性耐藥之必要條件。據推測靶向療法之組合有可能更有效地減緩或甚至停止ER陽性乳癌。已批准CDK4/6抑制劑及氟維司群之組合用於治療ER陽性轉移性乳癌但高比例之患者由於ESR1或PIK3CA之獲得性突變而產生抗性。關於ERα之有效降解物及拮抗劑，口服SERD(諸如實例1B)呈單一藥劑或與CDK4/6抑制劑(諸如阿貝西尼)或PI3K/mTOR抑制劑(諸如化合物A)組合可能更有效地減緩或停止ESR1突變體或PIK3CA突變體乳癌。在該上下文中，將實例1B之化合物與阿貝西尼(專利參考文獻)或化合物A(專利參考文獻)組合以進行腫瘤生長抑制之測試。更具體言之，在ESR1野生型及PIK3Ca突變體MCF7乳癌異種移植模型中，實例1B之化合物係與阿貝西尼或化合物A組合進行測試。
在培養中擴增人乳癌細胞MCF7(ATCC # HTB-22)，收穫並皮下注射呈1:1 HBSS±MATRIGEL™溶液(200 µL)之5×10e 6個細胞至雌性NOD SCID小鼠(22-25 g，Envigo RMS, Inc)之右後右脇上。在植入細胞前24小時，皮下植入雌激素丸粒(0.18 mg/丸粒、17β雌二醇，90天之釋放，Innovative Research)。植入後第7天開始每週兩次測量腫瘤生長及體重。當腫瘤大小達到250至350 mm 3時，將動物及組隨機分成5隻動物的組。在適宜媒劑(含在純水中之1%羥乙基纖維素/0.25% TWEEN® 80/0.05%消泡劑)中製備測試化合物實例1B並藉由口服強飼投與42天。在含在25 mM磷酸鈉緩衝液中之1% HEC(pH 2.0)中調配CDK4/6抑制劑(阿貝西尼)。在含在純水中之1%羥乙基纖維素/0.25% TWEEN® 80/0.05%消泡劑中調配PI3K/mTOR抑制劑(化合物A)。藉由在治療過程中每週兩次進行腫瘤體積測量來確定腫瘤反應。每當測量腫瘤體積時，將體重作為毒性之一般測量值。藉由使用公式v = l x w2 x 0.535估計腫瘤體積，其中l = 測量直徑之較大值及w =垂直直徑之較小值。 統計學分析
腫瘤體積數據之統計學分析從數據轉換至對數標度開始，以均衡跨時間及治療組之方差。使用SAS軟體(版本9.3)中之MIXED程式，藉由時間及治療之方差之雙向重複測量分析來分析對數體積數據。重複測量之相關模型係Spatial Power。在每個時間點將治療組與對照組進行比較。MIXED程式亦分別用於每個治療組，以計算每個時間點之調整平均值及標準誤差。兩種分析均解釋每隻動物之自相關性及早期從研究中移除具有大腫瘤之動物時發生的數據丟失。針對每個治療組對時間繪製調整平均值及標準誤差(s.e.)。腫瘤體積之分析基於log 10及spatial power協方差結構。P值基於兩個特定組之間的比較。 組合分析方法 (IVEF 研究之 Bliss Independence)
首先，常用的重複測量模型適合於對數體積對組及時間。然後使用對比語句來使用組合的2種特定治療在每個時間點測試相互作用效應。此相當於Bliss Independence方法並假設腫瘤體積理論上可達到零，亦即，完全消退。組合之累加反應預期值(EAR)在腫瘤體積標度上計算為：反應(EAR) EAR體積=V1 * V2/V0，其中V0、V1及V2係媒劑對照(分別地，僅治療1、僅治療2)之平均腫瘤體積估計值。若相互作用測試係顯著的，則根據觀察到的組合平均體積分別小於或大於EAR體積，在統計學上聲明組合效應大於累加或小於累加。否則，統計結論係累加的。此外，生物學相關累加範圍可定義為EAR體積上下X%。通常，X為25%至40%。然後，若觀察到的組合平均體積低於、在或高於加性區間，則可對該組合進行超過累加、累加或低於累加之生物學結論。
可能有情況係停滯係最佳預期反應。在彼等情況中，Bliss方法可直接應用於ΔT/C%值以獲得EAR百分比反應：EAR ΔT/C%=Y1 * Y2/100，其中Y1及Y2係單藥劑處理之ΔT/C值百分比。目前，沒有統計學測試來比較組合組中觀察到的ΔT/C%對EAR，但可應用上述生物學標準。
如表15及16中所顯示，僅實例1B或阿貝西尼作為單一藥劑之治療分別導致32%(dT/C%=-32)及52%(dT/C%=-52)腫瘤消退及兩者均為與媒劑對照相比係統計學上顯著的(p＜0.001)。實例1B與阿貝西尼之組合效力「小於累加」，但實例1B加阿貝西尼之組合效力明顯優於僅實例1B(p＜0.001)。然而，單一藥劑阿貝西尼效力在組合中不係統計學顯著的(P=0.055)。該組合在動物中係耐受的，沒有顯著的體重減輕。 表15：實例1B與阿貝西尼在MCF7 ER陽性乳癌模型中之組合效力
治療1 治療2 差異 b SE p值
媒劑，QD x 42，PO 實例1B，10 mpk，QD x 42, PO 0.628 0.0658 ＜0.001*
媒劑，QD x 42，PO 阿貝西尼，50 mpk，QD x 42，PO 0.479 0.0658 ＜0.001*
媒劑，QD x 42，PO 實例1B，10 mpk，QD x 42，PO/阿貝西尼，50 mpk，QD x 42，PO 0.756 0.0658 ＜0.001*
實例1B，10 mpk，QD x 42，PO 實例1B，10 mpk，QD x 42，PO/阿貝西尼，50 mpk，QD x 42，PO 0.128 0.0658 0.055
阿貝西尼，50 mpk，QD x 42，PO 實例1B，10 mpk，QD x 42，PO/阿貝西尼，50 mpk，QD x 42，PO PO 0.278 0.0658 ＜0.001*
b差異=治療1-治療2；*p值：顯著(p＜0.05) SE-標準誤差 表16：實例1B與阿貝西尼在MCF7 ER陽性乳癌模型中之組合效力
治療 ΔT/C%或消退% p值 組合效應 體重
媒劑 NA NA      
實例1B -32 ＜0.001*      
阿貝西尼 -52 ＜0.001*      
實例1B/阿貝西尼/ (組合) -64 ＜0.001* 少於累加 沒有顯著變化
腫瘤體積之分析基於Log 10及Spatial Power協方差結構。 *p值：顯著(p＜0.05)；NA：不適用
當治療組中的終點腫瘤體積等於或高於基線腫瘤體積時，計算ΔT/C%；並針對低於基線之腫瘤體積計算回歸%。該公式為100*(T-T 0)/(C-C 0)，其中T及C分別係治療組或對照組中之平均終點腫瘤體積。T 0及C 0係彼等組中之平均基線腫瘤體積。
如表17及18中所顯示，僅實例1B或化合物A作為單一藥劑之治療分別導致32%(dT/C%=-32)及36%(dT/C%=-36)腫瘤消退及兩者均為與媒劑對照相比係統計學上顯著的(p＜0.001)。實例1B與化合物A之組合效力「小於累加」，但實例1B加化合物A之組合效力明顯優於僅實例1B(p＜0.001)或僅化合物A(p=0.002*)。該組合在動物中係耐受的，沒有顯著的體重減輕。 表17：實例1B與化合物A在MCF7 ER陽性乳癌模型中之組合效力
治療組1 治療組2 差異 b SE p值
媒劑，QD x 42，PO 實例1B，10 mpk，QD x 42，PO 0.479 0.0759 ＜0.001*
媒劑，QD x 42，PO 化合物A，7.5 mpk，BID x 42，PO 0.504 0.0759 ＜0.001*
媒劑，QD x 42，PO 實例1B，10 mpk，QD x 42，PO/化合物A，7.5 mpk，BID x 42，PO 0.761 0.0791 ＜0.001*
實例1B，10 mpk，QD x 42，PO 實例1B，10 mpk，QD x 42，PO/化合物A，7.5mpk，BID x 42，PO 0.282 0.0791 ＜0.001*
化合物A，7.5 mpk，BID x 42，PO 實例1B，10 mpk，QD x 42，PO/化合物A，7.5 mpk，BID x 42，PO PO 0.257 0.0791 0.002*
b差異=治療組1–治療組2；*p值：顯著(p＜0.05) SE–標準誤差 表18：實例1B與阿貝西尼在MCF7 ER陽性乳癌模型中之組合效力
治療組 ΔT/C%或消退% p值 組合效應 體重
媒劑 NA NA      
實例1B -32 ＜0.001*      
化合物A -36 ＜0.001*      
實例1B/化合物A/ (組合) -65 ＜0.001* 小於累加 無顯著變化
腫瘤體積之分析基於Log 10及Spatial Power協方差結構。 *p值：顯著(p＜0.05)；NA：不適用
當治療組中之終點腫瘤體積等於或高於基線腫瘤體積時，計算ΔT/C%；並計算低於基線之腫瘤體積之消退%。該公式為100*(T-T 0)/(C-C 0)，其中T及C分別係治療組或對照組中之平均終點腫瘤體積。T 0及C 0係彼等組中之平均基線腫瘤體積。
如表19及20中所顯示，僅實例10或阿貝西尼作為單一藥劑之治療分別導致51%(dT/C%=-51)及70%(dT/C%=-70)腫瘤消退及兩者均為與媒劑對照相比係統計學上顯著的(p＜0.001)。實例10與阿貝西尼之組合效力「小於累加」，但實例10加阿貝西尼之組合效力明顯優於僅實例10(p=0.039)。然而，實例10加阿貝西尼之組合效力與僅阿貝西尼沒有顯著差異(p=0.905)。該組合在動物中係耐受的，沒有顯著的體重減輕。 表19：實例10與阿貝西尼在MCF7 ER陽性乳癌模型中之組合效力
治療組1 治療組2 差異 b SE p值
媒劑，QD x 42，PO 實例10，15 mpk，QD x 42，PO 0.659 0.113 ＜0.001*
媒劑，QD x 42，PO 阿貝西尼50 mpk，QD x 42，PO 0.445 0.1054 ＜0.001*
媒劑，QD x 42，PO 實例10，15 mpk，QD x 42，PO/阿貝西尼，50 mpk，QD x 42，PO 0.672 o.1054 ＜0.001*
實例10，15 mpk，QD x 42，PO 實例10，15 mpk，QD x 42，PO/阿貝西尼，50 mpk，QD x 42，PO 0.013 0.1103 0.905
阿貝西尼，50 mpk，QD x 42，PO 實例10，15 mpk，QD x 42，PO/阿貝西尼，50 mpk，QD x 42，PO PO 0.227 0.1054 0.039*
b差異=治療組1–治療組2；*p值：顯著(p＜0.05) SE–標準誤差 表20：實例10與阿貝西尼在MCF7 ER陽性乳癌模型之組合效力
治療組 ΔT/C%或消退% p值 組合效應 體重
媒劑 NA NA      
實例10 -51 ＜0.001*      
阿貝西尼 -70 ＜0.001*      
實例10/阿貝西尼/ (組合) -71 ＜0.001* 小於累加 無顯著變化
腫瘤體積之分析基於Log 10及Spatial Power協方差結構。 *p值：顯著(p＜0.05)；NA：不適用
當治療組中之終點腫瘤體積等於或高於基線腫瘤體積時，計算ΔT/C%；並計算低於基線之腫瘤體積之消退%。該公式為100*(T-T 0)/(C-C 0)，其中T及C分別係治療組或對照組中之平均終點腫瘤體積。T 0及C 0係彼等組中之平均基線腫瘤體積。
如表21及22中所顯示，僅實例10或阿培里斯作為單一藥劑之治療分別導致51% (dT/C%=-51)及21% (dT/C%=-21)腫瘤消退及兩者均為與媒劑對照相比係統計學上顯著的(p＜0.001及p=0.013)。實例10與阿培里斯之組合效力係「累加的」及實例10加阿培里斯之組合效力明顯優於僅實例10(p=0.009)。實例10加阿培里斯之組合效力亦顯著優於僅阿培里斯(p= ＜0.001)。該組合在動物中係耐受的，沒有顯著的體重減輕。 表21：實例10與阿培里斯在MCF7 ER陽性乳癌模型中之組合效力
治療組1 治療組2 差異 b SE p值
媒劑，QD x 42，PO 實例10，15 mpk，QD x 42，PO 0.241 0.1121 ＜0.039*
媒劑，QD x 42，PO 阿培里斯15 mpk (d1-d7)，10 mpk (d8-42)，mpk，QD x 42，PO 0.445 0.1121 ＜0.001*
媒劑，QD x 42，PO 實例10，15 mpk，QD x 42，PO/阿培里斯15 mpk (d1-d7)，10 mpk (d8-42)，mpk，QD x 42，PO 0.755 0.1121 ＜0.001*
實例10，15 mpk，QD x 42，PO 實例10，15 mpk，QD x 42，PO/阿培里斯15 mpk (d1-d7)，10 mpk (d8-42)，mpk，QD x 42，PO 0.514 0.1121 ＜0.001
阿培里斯15 mpk (d1-d7)，10 mpk (d8-42)，mpk，QD x 42，PO 實例10，15 mpk，QD x 42，PO/阿培里斯15 mpk (d1-d7)，10 mpk (d8-42)，mpk，QD x 42，PO 0.310 0.1121 0.009*
b差異=治療組1–治療組2；*p值：顯著(p＜0.05) SE–標準誤差 表22：實例10與阿培里斯在MCF7 ER陽性乳癌模型中之組合效力
治療組 ΔT/C%或消退% p值 組合效應 體重
媒劑 NA NA      
實例10 -51 ＜0.001*      
阿培里斯 -21 ＜0.013*      
實例10/阿培里斯 (組合) -76 ＜0.001* 累加 無顯著變化
腫瘤體積之分析基於Log 10及Spatial Power協方差結構。 *p值：顯著(p＜0.05)；NA：不適用
當治療組中之終點腫瘤體積等於或高於基線腫瘤體積時，計算ΔT/C%；並計算低於基線之腫瘤體積之消退%。該公式為100*(T-T 0)/(C-C 0)，其中T及C分別係治療組或對照組中之平均終點腫瘤體積。T 0及C 0係彼等組中之平均基線腫瘤體積。
如表23及24中所顯示，僅實例10或依維莫司作為單一藥劑之治療分別導致51% (dT/C%=-51)及50% (dT/C%=-50)腫瘤消退及兩者均為與媒劑對照相比係統計學上顯著的(p＜0.001及p＜0.001)。實例10與依維莫司之組合效力係「累加的」及實例10加依維莫司之組合效力明顯優於僅實例10(p=0.004)。實例10加阿培里斯之組合效力亦顯著優於僅依維莫司(p=0.04)。該組合在動物中係耐受的，沒有顯著的體重減輕。 表23：實例10與依維莫司在MCF7 ER陽性乳癌模型中之組合效力
治療組1 治療組2 差異 b SE p值
媒劑，QD x 42，PO 實例10，15 mpk，QD x 42，PO 0.445 0.0999 ＜0.001*
媒劑，QD x 42，PO 依維莫司，5 mpk，QD x 42，PO 0.433 0.1038 ＜0.001*
媒劑QD x 42，PO 實例10，15 mpk，QD x 42，PO/依維莫司，5 mpk，QD x 42，PO 0.748 0.0999 ＜0.001*
實例10，15 mpk，QD x 42，PO 實例10，15 mpk，QD x 42，PO/依維莫司，5 mpk，QD x 42，PO 0.303 0.0999 0.004*
依維莫司，5 mpk，QD x 42，PO 實例10，15 mpk，QD x 42，PO/依維莫司，5 mpk，QD x 42，PO 0.315 0.138 0.004*
b差異=治療組1–治療組2；*p值：顯著(p＜0.05) SE–標準誤差 表24：實例10與依維莫司在MCF7 ER陽性乳癌模型中之組合效力
治療組 ΔT/C%或消退% p值 組合效應 體重
媒劑 NA NA      
實例10 -51 ＜0.001*      
依維莫司 -50 ＜0.001*      
實例10/依維莫司 (組合) -76 ＜0.001* 累加 無顯著變化
腫瘤體積之分析基於Log 10及Spatial Power協方差結構。 *p值：顯著(p＜0.05)；NA：不適用
當治療組中之終點腫瘤體積等於或高於基線腫瘤體積時，計算ΔT/C%；並計算低於基線之腫瘤體積之消退%。該公式為100*(T-T 0)/(C-C 0)，其中T及C分別係治療組或對照組中之平均終點腫瘤體積。T 0及C 0係彼等組中之平均基線腫瘤體積。 大鼠口服生物可利用性分析
以下分析之目的係欲證實測試化合物是否係口服生物可利用的。
將測試化合物以1 mg/kg IV (使用以下任一種載劑：含在25 mM磷酸鈉緩衝液中之20% CAPTISOL ®，pH2適量；或25% DMA、15% EtOH、10%丙二醇、25% 2-吡咯啶酮及25%純水)及10 mg/kg PO(使用1%羥乙基纖維素媒劑、0.25%聚山梨醇酯80、0.05%消泡劑1510-US及純水，適量)投與斯潑雷格-多雷(Sprague-Dawley)大鼠。在給藥後0.08、0.25、0.5、1、2、4、8及12小時收集連續血液樣本用於IV推注及在口服給藥後0.25、0.5、1、2、4、8及12小時收集連續血液樣本。用EDTA凝結劑處理後，藉由離心獲得血漿並儲存在-70℃下直至藉由LC-MS/MS分析。確定血漿中之測試化合物濃度並上傳至Watson LIMS TM系統中，其中使用非房室分析來計算IV及PO组之曲線下面積(AUC)。藉由以下等式計算口服生物可利用性(F%)， F% = (AUC POX 劑量 IV) / (AUC IVX 劑量 PO) X 100。
在上述分析中，實例1B之化合物展示~50%之%F值。該分析證實實例1B具有良好的口服生物可利用性。
Figure 01_image005

Claims (17)

  1. 一種下式之化合物：
    Figure 03_image127
    其中R 1或R 2係獨立地選自Cl、F、-CF 3或-CH 3，及另一者係氫， 或其醫藥上可接受之鹽。
  2. 如請求項1之化合物，其中該化合物係
    Figure 03_image129
    或其醫藥上可接受之鹽。
  3. 如請求項1之化合物，其中該化合物係
    Figure 03_image131
    或其醫藥上可接受之鹽。
  4. 如請求項2之化合物，其中該化合物係
    Figure 03_image133
    或其醫藥上可接受之鹽。
  5. 如請求項4之化合物，其中該醫藥上可接受之鹽係苯磺酸鹽。
  6. 如請求項4之化合物，其中該醫藥上可接受之鹽係4-甲基苯磺酸鹽。
  7. 如請求項4之化合物，其中該化合物係
    Figure 03_image135
    。
  8. 如請求項3之化合物，其中該化合物係
    Figure 03_image137
    或其醫藥上可接受之鹽。
  9. 如請求項8之化合物，其中該醫藥上可接受之鹽係苯磺酸鹽。
  10. 如請求項8之化合物，其中該醫藥上可接受之鹽係4-甲基苯磺酸鹽。
  11. 如請求項8之化合物，其中該化合物係
    Figure 03_image139
    。
  12. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至11中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽與醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑組合。
  13. 如請求項12之醫藥組合物，其包含一或多種其他治療劑。
  14. 一種以如請求項1至11中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽或如請求項12至13中任一項之醫藥組合物製造用於治療乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、前列腺癌、子宮癌、胃癌或肺癌的藥物之用途。
  15. 如請求項14之用途，其中該乳癌係ER陽性乳癌。
  16. 如請求項14之用途，其中該胃癌係ER陽性胃癌。
  17. 如請求項14之用途，其中該肺癌係ER陽性肺癌。
TW108123257A 2018-07-12 2019-07-02 選擇性雌激素受體降解劑 TWI702219B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862697100P 2018-07-12 2018-07-12
US62/697,100 2018-07-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202019935A TW202019935A (zh) 2020-06-01
TWI702219B true TWI702219B (zh) 2020-08-21

Family

ID=67470734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108123257A TWI702219B (zh) 2018-07-12 2019-07-02 選擇性雌激素受體降解劑

Country Status (37)

Country Link
US (4) US10654866B2 (zh)
EP (2) EP4155310A1 (zh)
JP (4) JP6995241B2 (zh)
KR (3) KR102550538B1 (zh)
CN (2) CN117379428A (zh)
AR (1) AR115694A1 (zh)
AU (2) AU2019299947B2 (zh)
BR (2) BR122023025061A2 (zh)
CA (1) CA3105501C (zh)
CL (1) CL2021000045A1 (zh)
CO (1) CO2021000043A2 (zh)
CR (1) CR20210007A (zh)
DK (1) DK3820873T3 (zh)
EA (1) EA202092975A1 (zh)
EC (1) ECSP21001770A (zh)
ES (1) ES2933980T3 (zh)
FI (1) FI3820873T3 (zh)
HR (1) HRP20230009T1 (zh)
HU (1) HUE060963T2 (zh)
IL (3) IL280065B (zh)
JO (1) JOP20210005A1 (zh)
LT (1) LT3820873T (zh)
MA (2) MA53126B1 (zh)
MD (1) MD3820873T2 (zh)
MX (2) MX2021000375A (zh)
NZ (1) NZ771718A (zh)
PE (1) PE20210400A1 (zh)
PH (1) PH12021550049A1 (zh)
PL (1) PL3820873T3 (zh)
PT (1) PT3820873T (zh)
RS (1) RS63809B1 (zh)
SA (1) SA521421008B1 (zh)
SG (1) SG11202100148TA (zh)
SI (1) SI3820873T1 (zh)
TW (1) TWI702219B (zh)
UA (1) UA127507C2 (zh)
WO (1) WO2020014435A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA122346C2 (uk) 2015-10-01 2020-10-26 Олема Фармасьютикалз, Інк. ТЕТРАГІДРО-1H-ПІРИДО[3,4-b]ІНДОЛЬНІ АНТИЕСТРОГЕННІ ЛІКАРСЬКІ ПРЕПАРАТИ
TWI702219B (zh) * 2018-07-12 2020-08-21 美商美國禮來大藥廠 選擇性雌激素受體降解劑
SG11202100145YA (en) * 2018-07-12 2021-02-25 Lilly Co Eli Selective estrogen receptor degraders
CN114957114A (zh) * 2021-02-26 2022-08-30 冷志 一种4-溴-3-氯-7-甲氧基喹啉的合成方法
TWI837605B (zh) 2021-03-09 2024-04-01 美商美國禮來大藥廠 使用serd組合給藥方案治療癌症之方法
TW202300492A (zh) * 2021-03-16 2023-01-01 美商美國禮來大藥廠 選擇性雌激素受體降解劑
AU2023216654A1 (en) * 2022-02-01 2024-07-11 Eli Lilly And Company Processes for the preparation of selective estrogen receptor degraders
WO2024083716A1 (en) 2022-10-17 2024-04-25 Astrazeneca Ab Combinations of a serd for the treatment of cancer
JP2024067010A (ja) 2022-11-02 2024-05-16 ペトラ・ファーマ・コーポレイション 疾患の治療用のホスホイノシチド３－キナーゼ（ｐｉ３ｋ）のアロステリッククロメノン阻害剤
WO2024100236A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 Astrazeneca Ab Combination therapies for the treatment of cancer
US20240180893A1 (en) 2022-11-17 2024-06-06 Astrazeneca Ab Methods of treatment of breast cancer

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102250042A (zh) * 2004-01-22 2011-11-23 伊莱利利公司 用于治疗血管舒缩症状的选择性雌激素受体调节剂

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1395563B1 (en) * 2001-05-22 2006-03-29 Eli Lilly And Company 2-substituted 1,2,3,4-tetrahydroquinolines and derivatives thereof, compositions and methods
US7329654B2 (en) * 2001-12-19 2008-02-12 Janssen Pharmaceutica N.V. Heteroatom containing tetracyclic derivatives as selective estrogen receptor modulators
NZ536291A (en) * 2002-04-19 2006-09-29 Signal Pharm Inc Benzopyranone compounds, compositions thereof, and methods of treatment therewith
US20080221163A1 (en) * 2005-01-18 2008-09-11 Jeffrey Alan Dodge Selective Estrogen Receptor Modulators
RU2015152171A (ru) * 2013-06-19 2017-07-25 Серагон Фармасьютикалз, Инк. Азетидиновые модуляторы эстрогеновых рецепторов и их применения
BR112017007662B1 (pt) 2014-12-18 2021-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Composto, composição farmacêutica e uso de um composto
JP6807841B2 (ja) 2014-12-18 2021-01-06 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト エストロゲン受容体モジュレーター及びその使用
WO2018108954A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for the preparation of 2-(3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl)ethan-1-ol
TWI702219B (zh) * 2018-07-12 2020-08-21 美商美國禮來大藥廠 選擇性雌激素受體降解劑
SG11202100145YA (en) * 2018-07-12 2021-02-25 Lilly Co Eli Selective estrogen receptor degraders

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102250042A (zh) * 2004-01-22 2011-11-23 伊莱利利公司 用于治疗血管舒缩症状的选择性雌激素受体调节剂

Also Published As

Publication number Publication date
MD3820873T2 (ro) 2023-05-31
EP3820873B1 (en) 2022-11-23
PL3820873T3 (pl) 2023-02-13
CN117379428A (zh) 2024-01-12
US20230234960A1 (en) 2023-07-27
BR122023025061A2 (pt) 2024-02-20
IL295598A (en) 2022-10-01
MA53126B1 (fr) 2023-02-28
CR20210007A (es) 2021-02-08
EA202092975A1 (ru) 2021-04-14
SG11202100148TA (en) 2021-02-25
IL289871A (en) 2022-03-01
WO2020014435A1 (en) 2020-01-16
PE20210400A1 (es) 2021-03-02
JP7241211B2 (ja) 2023-03-16
PH12021550049A1 (en) 2021-09-20
KR102589886B1 (ko) 2023-10-17
MA53126A (fr) 2021-05-19
US10654866B2 (en) 2020-05-19
KR20210019065A (ko) 2021-02-19
IL280065B (en) 2022-04-01
IL280065A (en) 2021-03-01
BR112020025654A2 (pt) 2021-04-06
AU2019299947A1 (en) 2021-01-07
CA3105501C (en) 2023-10-31
MA53124B1 (fr) 2023-02-28
HRP20230009T1 (hr) 2023-02-17
CL2021000045A1 (es) 2021-07-19
MA53124A (fr) 2021-05-19
CN112638916A (zh) 2021-04-09
ES2933980T3 (es) 2023-02-15
CO2021000043A2 (es) 2021-01-18
CA3105501A1 (en) 2020-01-16
JP2022050591A (ja) 2022-03-30
KR20230005404A (ko) 2023-01-09
JP6995241B2 (ja) 2022-01-14
US11117902B2 (en) 2021-09-14
JP2022037102A (ja) 2022-03-08
AR115694A1 (es) 2021-02-17
AU2022203969B2 (en) 2024-02-15
JP7009672B1 (ja) 2022-01-25
SA521421008B1 (ar) 2022-10-30
IL295598B2 (en) 2023-09-01
EP4155310A1 (en) 2023-03-29
AU2019299947B2 (en) 2022-03-17
JP2023081954A (ja) 2023-06-13
TW202019935A (zh) 2020-06-01
IL289871B (en) 2022-10-01
LT3820873T (lt) 2023-01-10
ECSP21001770A (es) 2021-02-26
KR20230148386A (ko) 2023-10-24
AU2022203969A1 (en) 2022-06-30
PT3820873T (pt) 2022-12-23
EP3820873A1 (en) 2021-05-19
SI3820873T1 (sl) 2023-02-28
JOP20210005A1 (ar) 2021-01-10
JP7557564B2 (ja) 2024-09-27
FI3820873T3 (fi) 2023-03-02
US20210403480A1 (en) 2021-12-30
US20200017516A1 (en) 2020-01-16
NZ771718A (en) 2024-05-31
US11634426B2 (en) 2023-04-25
CN112638916B (zh) 2023-09-12
RS63809B1 (sr) 2023-01-31
IL295598B1 (en) 2023-05-01
MX2021000375A (es) 2021-05-27
KR102550538B1 (ko) 2023-07-04
MX2023006047A (es) 2023-06-02
US11993608B2 (en) 2024-05-28
US20200347073A1 (en) 2020-11-05
DK3820873T3 (da) 2022-12-12
IL289871B2 (en) 2023-02-01
UA127507C2 (uk) 2023-09-13
JP2021530484A (ja) 2021-11-11
HUE060963T2 (hu) 2023-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI702219B (zh) 選擇性雌激素受體降解劑
CN112424205A (zh) 选择性的雌激素受体降解剂
AU2022240454B2 (en) Selective estrogen receptor degraders
EA040517B1 (ru) Селективные супрессоры рецептора эстрогена
EA045961B1 (ru) Селективные супрессоры рецептора эстрогена