EA045961B1 - Селективные супрессоры рецептора эстрогена - Google Patents
Селективные супрессоры рецептора эстрогена Download PDFInfo
- Publication number
- EA045961B1 EA045961B1 EA202291144 EA045961B1 EA 045961 B1 EA045961 B1 EA 045961B1 EA 202291144 EA202291144 EA 202291144 EA 045961 B1 EA045961 B1 EA 045961B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cancer
- compound
- formula
- pharmaceutically acceptable
- breast cancer
- Prior art date
Links
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 title description 39
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 title 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 167
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 118
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 73
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 71
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 69
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 48
- 229950001573 abemaciclib Drugs 0.000 claims description 43
- UZWDCWONPYILKI-UHFFFAOYSA-N n-[5-[(4-ethylpiperazin-1-yl)methyl]pyridin-2-yl]-5-fluoro-4-(7-fluoro-2-methyl-3-propan-2-ylbenzimidazol-5-yl)pyrimidin-2-amine Chemical group C1CN(CC)CCN1CC(C=N1)=CC=C1NC1=NC=C(F)C(C=2C=C3N(C(C)C)C(C)=NC3=C(F)C=2)=N1 UZWDCWONPYILKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 26
- 229960005167 everolimus Drugs 0.000 claims description 25
- HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N Everolimus Chemical compound C1C[C@@H](OCCO)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N 0.000 claims description 24
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 23
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 23
- 229950010482 alpelisib Drugs 0.000 claims description 23
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 23
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 23
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 23
- STUWGJZDJHPWGZ-LBPRGKRZSA-N (2S)-N1-[4-methyl-5-[2-(1,1,1-trifluoro-2-methylpropan-2-yl)-4-pyridinyl]-2-thiazolyl]pyrrolidine-1,2-dicarboxamide Chemical group S1C(C=2C=C(N=CC=2)C(C)(C)C(F)(F)F)=C(C)N=C1NC(=O)N1CCC[C@H]1C(N)=O STUWGJZDJHPWGZ-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 22
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 22
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 16
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 13
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 12
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 12
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 238000000634 powder X-ray diffraction Methods 0.000 claims description 9
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000333 selective estrogen receptor modulator Substances 0.000 claims description 8
- 229940095743 selective estrogen receptor modulator Drugs 0.000 claims description 8
- 229940124302 mTOR inhibitor Drugs 0.000 claims description 7
- 239000003628 mammalian target of rapamycin inhibitor Substances 0.000 claims description 7
- 108010025468 Cyclin-Dependent Kinase 6 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100026804 Cyclin-dependent kinase 6 Human genes 0.000 claims description 5
- 239000012828 PI3K inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 239000012823 PI3K/mTOR inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 239000003886 aromatase inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 5
- 229940043441 phosphoinositide 3-kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100036252 Cyclin-dependent kinase 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 229940046844 aromatase inhibitors Drugs 0.000 claims description 4
- 150000008107 benzenesulfonic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical group OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 claims description 2
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 claims 2
- 229940122815 Aromatase inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 229940083347 Cyclin-dependent kinase 4 inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 126
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 122
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 60
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 36
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 35
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 35
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 32
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 31
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 30
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 29
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 29
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 28
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical class O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 23
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 22
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-2-ol Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1 LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 101000882584 Homo sapiens Estrogen receptor Proteins 0.000 description 21
- 101150006605 rpa gene Proteins 0.000 description 21
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 21
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 19
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- -1 azetidine ester Chemical class 0.000 description 16
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 16
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 16
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 16
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 13
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 11
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 11
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 11
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 9
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 102000003998 progesterone receptors Human genes 0.000 description 9
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 description 9
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 9
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UVBQMXOKKDCBJN-UHFFFAOYSA-N 5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-8-(trifluoromethyl)-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound FCC1CN(C1)CCOC1=CC=C(C=C1)C1OC2=C(C=CC(=C2)C(F)(F)F)C=2C=NC=3C=C(C=CC=3C=21)O UVBQMXOKKDCBJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 8
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 8
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 8
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 7
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 7
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 7
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 7
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 7
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 7
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 7
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N palladium Substances [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-2-ol Chemical compound CCC(C)(C)O MSXVEPNJUHWQHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 6
- ILAHWRKJUDSMFH-UHFFFAOYSA-N boron tribromide Chemical compound BrB(Br)Br ILAHWRKJUDSMFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 6
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 6
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 6
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 229940124297 CDK 4/6 inhibitor Drugs 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VWUXBMIQPBEWFH-WCCTWKNTSA-N Fulvestrant Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3[C@H](CCCCCCCCCS(=O)CCCC(F)(F)C(F)(F)F)CC2=C1 VWUXBMIQPBEWFH-WCCTWKNTSA-N 0.000 description 5
- UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N N-dimethylaminoethanol Chemical compound CN(C)CCO UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011789 NOD SCID mouse Methods 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 5
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 239000012972 dimethylethanolamine Substances 0.000 description 5
- 229960002258 fulvestrant Drugs 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 5
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 5
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 5
- CXNIUSPIQKWYAI-UHFFFAOYSA-N xantphos Chemical compound C=12OC3=C(P(C=4C=CC=CC=4)C=4C=CC=CC=4)C=CC=C3C(C)(C)C2=CC=CC=1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXNIUSPIQKWYAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WPFXKSQRNMAJGV-UHFFFAOYSA-N 7-chloro-5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound ClC1=CC=CC2=C1OC(C1=C2C=NC=2C=C(C=CC1=2)O)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF WPFXKSQRNMAJGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UQBGEQPSMYFQHH-UHFFFAOYSA-N 7-fluoro-5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound FC1=CC=CC2=C1OC(C1=C2C=NC=2C=C(C=CC1=2)O)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF UQBGEQPSMYFQHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HPRZXPUOMAQVBB-UHFFFAOYSA-N 8-chloro-5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound ClC1=CC2=C(C=C1)C=1C=NC=3C=C(C=CC=3C=1C(O2)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF)O HPRZXPUOMAQVBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OGEAHDJGRDNLQY-UHFFFAOYSA-N 8-fluoro-5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound FC1=CC2=C(C=C1)C=1C=NC=3C=C(C=CC=3C=1C(O2)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF)O OGEAHDJGRDNLQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 4
- 229910016523 CuKa Inorganic materials 0.000 description 4
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 101000605639 Homo sapiens Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Proteins 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100038332 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Human genes 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000012391 XPhos Pd G2 Substances 0.000 description 4
- PUEXHTAHEBAFQR-UHFFFAOYSA-N [4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-[3-[2-fluoro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-7-hydroxyquinolin-4-yl]methanone Chemical compound FCC1CN(C1)CCOC1=CC=C(C=C1)C(=O)C1=C(C=NC2=CC(=CC=C12)O)C1=C(C=C(C=C1)C(F)(F)F)F PUEXHTAHEBAFQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N borane Chemical compound B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- RSLSVURFMXHEEU-UHFFFAOYSA-M chloropalladium(1+);dicyclohexyl-[3-[2,4,6-tri(propan-2-yl)phenyl]phenyl]phosphane;2-phenylaniline Chemical compound [Pd+]Cl.NC1=CC=CC=C1C1=CC=CC=[C-]1.CC(C)C1=CC(C(C)C)=CC(C(C)C)=C1C1=CC=CC(P(C2CCCCC2)C2CCCCC2)=C1 RSLSVURFMXHEEU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003821 enantio-separation Methods 0.000 description 4
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 4
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 4
- 238000013100 final test Methods 0.000 description 4
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 4
- IUYHWZFSGMZEOG-UHFFFAOYSA-M magnesium;propane;chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].C[CH-]C IUYHWZFSGMZEOG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical class CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 4
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- MFRIHAYPQRLWNB-UHFFFAOYSA-N sodium tert-butoxide Chemical compound [Na+].CC(C)(C)[O-] MFRIHAYPQRLWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 3
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L caesium carbonate Chemical compound [Cs+].[Cs+].[O-]C([O-])=O FJDQFPXHSGXQBY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000024 caesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 3
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 3
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- CYPYTURSJDMMMP-WVCUSYJESA-N (1e,4e)-1,5-diphenylpenta-1,4-dien-3-one;palladium Chemical compound [Pd].[Pd].C=1C=CC=CC=1\C=C\C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1.C=1C=CC=CC=1\C=C\C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1.C=1C=CC=CC=1\C=C\C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 CYPYTURSJDMMMP-WVCUSYJESA-N 0.000 description 2
- NXBLTKBZGUXELX-UHFFFAOYSA-N (3-chloro-7-hydroxyquinolin-4-yl)-(4-fluorophenyl)methanone Chemical compound ClC=1C=NC2=CC(=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(C=C1)F)O NXBLTKBZGUXELX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRYYUNFOMSNJET-UHFFFAOYSA-N (3-chloro-7-hydroxyquinolin-4-yl)-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]methanone Chemical compound ClC=1C=NC2=CC(=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF)O HRYYUNFOMSNJET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OCOWSFIETXPYNS-UHFFFAOYSA-N (3-chloro-7-methoxyquinolin-4-yl)-(4-fluorophenyl)methanone Chemical compound ClC=1C=NC2=CC(=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(C=C1)F)OC OCOWSFIETXPYNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWUTXBIONAXKAK-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethanol Chemical compound OCCN1CC(CF)C1 OWUTXBIONAXKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VJIJKIDPCAHSMJ-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethanol hydrochloride Chemical compound Cl.OCCN1CC(CF)C1 VJIJKIDPCAHSMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZKLEJHVLCMVQR-UHFFFAOYSA-N 4-fluorobenzoyl chloride Chemical compound FC1=CC=C(C(Cl)=O)C=C1 CZKLEJHVLCMVQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 2
- MKEHACYTGGCYPQ-UHFFFAOYSA-N 5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-7-methyl-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound FCC1CN(C1)CCOC1=CC=C(C=C1)C1OC2=C(C=CC=C2C)C=2C=NC=3C=C(C=CC=3C=21)O MKEHACYTGGCYPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 238000003747 Grignard reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007818 Grignard reagent Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- SSFSVKVWAURAAM-UHFFFAOYSA-N [2-fluoro-4-(trifluoromethyl)phenyl]boronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1F SSFSVKVWAURAAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 2
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 2
- MVIOINXPSFUJEN-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid;hydrate Chemical compound O.OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 MVIOINXPSFUJEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 2
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 description 2
- MCQRPQCQMGVWIQ-UHFFFAOYSA-N boron;methylsulfanylmethane Chemical compound [B].CSC MCQRPQCQMGVWIQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 2
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 2
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940111685 dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000009261 endocrine therapy Methods 0.000 description 2
- 229940034984 endocrine therapy antineoplastic and immunomodulating agent Drugs 0.000 description 2
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 2
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 150000004795 grignard reagents Chemical class 0.000 description 2
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- IBIKHMZPHNKTHM-RDTXWAMCSA-N merck compound 25 Chemical compound C1C[C@@H](C(O)=O)[C@H](O)CN1C(C1=C(F)C=CC=C11)=NN1C(=O)C1=C(Cl)C=CC=C1C1CC1 IBIKHMZPHNKTHM-RDTXWAMCSA-N 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 2
- MUJIDPITZJWBSW-UHFFFAOYSA-N palladium(2+) Chemical compound [Pd+2] MUJIDPITZJWBSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M potassium fluoride Chemical compound [F-].[K+] NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- LPNYRYFBWFDTMA-UHFFFAOYSA-N potassium tert-butoxide Chemical compound [K+].CC(C)(C)[O-] LPNYRYFBWFDTMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- IZJIGPRJUJLLTJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-7-ol Chemical compound Oc1ccc2cccnc2c1.Oc1ccc2cccnc2c1 IZJIGPRJUJLLTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- WRECIMRULFAWHA-UHFFFAOYSA-N trimethyl borate Chemical compound COB(OC)OC WRECIMRULFAWHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KYBBNISHBZGENY-UHFFFAOYSA-N 3-(fluoromethyl)azetidine;hydrochloride Chemical compound Cl.FCC1CNC1 KYBBNISHBZGENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003349 3-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- AXUVEBXTLZJXMK-UHFFFAOYSA-N 4-bromo-3-chloro-7-methoxyquinoline Chemical compound BrC1=C(Cl)C=NC2=CC(OC)=CC=C21 AXUVEBXTLZJXMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YJXTZWWKNXVRHA-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-1h-quinolin-2-one Chemical compound C1=CC=CC2=NC(O)=CC(Cl)=C21 YJXTZWWKNXVRHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGOOMSGEXIBXHQ-UHFFFAOYSA-N 5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-7-(trifluoromethyl)-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound FCC1CN(C1)CCOC1=CC=C(C=C1)C1OC2=C(C=CC=C2C(F)(F)F)C=2C=NC=3C=C(C=CC=3C=21)O BGOOMSGEXIBXHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRPASBVXQUEVRW-UHFFFAOYSA-N 5-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-8-methyl-5H-chromeno[4,3-c]quinolin-2-ol Chemical compound FCC1CN(C1)CCOC1=CC=C(C=C1)C1OC2=C(C=CC(=C2)C)C=2C=NC=3C=C(C=CC=3C=21)O DRPASBVXQUEVRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ACCFLVVUVBJNGT-AWEZNQCLSA-N 8-[5-(2-hydroxypropan-2-yl)pyridin-3-yl]-1-[(2s)-2-methoxypropyl]-3-methylimidazo[4,5-c]quinolin-2-one Chemical compound CN1C(=O)N(C[C@H](C)OC)C(C2=C3)=C1C=NC2=CC=C3C1=CN=CC(C(C)(C)O)=C1 ACCFLVVUVBJNGT-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical class OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101150064205 ESR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- RSEPBGGWRJCQGY-RBRWEJTLSA-N Estradiol valerate Chemical compound C1CC2=CC(O)=CC=C2[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](OC(=O)CCCC)[C@@]1(C)CC2 RSEPBGGWRJCQGY-RBRWEJTLSA-N 0.000 description 1
- 108010007005 Estrogen Receptor alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010041356 Estrogen Receptor beta Proteins 0.000 description 1
- 102100029951 Estrogen receptor beta Human genes 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- ATFVTAOSZBVGHC-UHFFFAOYSA-N Glycolaldehyde dimer Chemical compound OC1COC(O)CO1 ATFVTAOSZBVGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Chemical class 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100023085 Serine/threonine-protein kinase mTOR Human genes 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Chemical class 0.000 description 1
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- REJAZCJIAVRTRR-UHFFFAOYSA-N [3-(2,3-difluorophenyl)-7-hydroxyquinolin-4-yl]-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]methanone Chemical compound FC1=C(C=CC=C1F)C=1C=NC2=CC(=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF)O REJAZCJIAVRTRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMCAZRSOQKPNCT-UHFFFAOYSA-N [3-(2,4-difluorophenyl)-7-hydroxyquinolin-4-yl]-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]methanone Chemical compound FC1=C(C=CC(=C1)F)C=1C=NC2=CC(=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF)O NMCAZRSOQKPNCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJPFRLHLKYUUKB-UHFFFAOYSA-N [3-(3-chloro-2-fluorophenyl)-7-hydroxyquinolin-4-yl]-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]methanone Chemical compound ClC=1C(=C(C=CC=1)C=1C=NC2=CC(=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF)O)F AJPFRLHLKYUUKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISXGRDNBTQZMMG-UHFFFAOYSA-N [3-(4-chloro-2-fluorophenyl)-7-hydroxyquinolin-4-yl]-[4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]methanone Chemical compound ClC1=CC(=C(C=C1)C=1C=NC2=CC(=CC=C2C=1C(=O)C1=CC=C(C=C1)OCCN1CC(C1)CF)O)F ISXGRDNBTQZMMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTWFHFPWSPQDDZ-UHFFFAOYSA-N [4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-[3-(2-fluoro-3-methylphenyl)-7-hydroxyquinolin-4-yl]methanone Chemical compound FCC1CN(C1)CCOC1=CC=C(C=C1)C(=O)C1=C(C=NC2=CC(=CC=C12)O)C1=C(C(=CC=C1)C)F XTWFHFPWSPQDDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VNLZCYHLHXNHNN-UHFFFAOYSA-N [4-[2-[3-(fluoromethyl)azetidin-1-yl]ethoxy]phenyl]-[3-(2-fluoro-4-methylphenyl)-7-hydroxyquinolin-4-yl]methanone Chemical compound FCC1CN(C1)CCOC1=CC=C(C=C1)C(=O)C1=C(C=NC2=CC(=CC=C12)O)C1=C(C=C(C=C1)C)F VNLZCYHLHXNHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 150000004703 alkoxides Chemical class 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001543 aryl boronic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001501 aryl fluorides Chemical class 0.000 description 1
- 150000004792 aryl magnesium halides Chemical class 0.000 description 1
- 125000005002 aryl methyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 125000004566 azetidin-1-yl group Chemical group N1(CCC1)* 0.000 description 1
- HONIICLYMWZJFZ-UHFFFAOYSA-N azetidine Chemical compound C1CNC1 HONIICLYMWZJFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000003353 bioavailability assay Methods 0.000 description 1
- YNHIGQDRGKUECZ-UHFFFAOYSA-L bis(triphenylphosphine)palladium(ii) dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Pd+2].C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 YNHIGQDRGKUECZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N boronic acid Chemical compound OBO ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000012069 chiral reagent Substances 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- NXQGGXCHGDYOHB-UHFFFAOYSA-L cyclopenta-1,4-dien-1-yl(diphenyl)phosphane;dichloropalladium;iron(2+) Chemical compound [Fe+2].Cl[Pd]Cl.[CH-]1C=CC(P(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1.[CH-]1C=CC(P(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=C1 NXQGGXCHGDYOHB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 229940005558 delestrogen Drugs 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000002027 dichloromethane extract Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N ent-staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229960004766 estradiol valerate Drugs 0.000 description 1
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- LZWQNOHZMQIFBX-UHFFFAOYSA-N lithium;2-methylpropan-2-olate Chemical compound [Li+].CC(C)(C)[O-] LZWQNOHZMQIFBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Chemical class 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- DAZXVJBJRMWXJP-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylethylamine Chemical compound CCN(C)C DAZXVJBJRMWXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010653 organometallic reaction Methods 0.000 description 1
- LXNAVEXFUKBNMK-UHFFFAOYSA-N palladium(II) acetate Substances [Pd].CC(O)=O.CC(O)=O LXNAVEXFUKBNMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YJVFFLUZDVXJQI-UHFFFAOYSA-L palladium(ii) acetate Chemical compound [Pd+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O YJVFFLUZDVXJQI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000003880 polar aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Chemical class 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000011698 potassium fluoride Substances 0.000 description 1
- 235000003270 potassium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CCCN1 HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 150000003333 secondary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000010956 selective crystallization Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012321 sodium triacetoxyborohydride Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Chemical class 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 description 1
- CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(OC)O1 CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000011885 synergistic combination Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- WLPUWLXVBWGYMZ-UHFFFAOYSA-N tricyclohexylphosphine Chemical compound C1CCCCC1P(C1CCCCC1)C1CCCCC1 WLPUWLXVBWGYMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RMNIZOOYFMNEJJ-UHFFFAOYSA-K tripotassium;phosphate;hydrate Chemical compound O.[K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O RMNIZOOYFMNEJJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
Description
Уровень техники
Селективные супрессоры рецептора эстрогена (ССРЭ) связываются с рецептором эстрогена (РЭ) и подавляют опосредованную РЭ транскрипционную активность. Это разрушение и даунгрегуляция, вызванная ССРЭ, может быть полезно при лечении нарушений пролиферации клеток, таких как рак. Некоторые примеры низкомолекулярных ССРЭ описаны в литературе (см., например, WO 2005073204, WO 2014205136 и WO 2016097071). Однако известные ССРЭ пока не так полезны, как это необходимо для эффективного лечения рака. Например, обнаружение ССРЭ с лучшими фармакокинетическими (ФК) и фармакодинамическими (ФД) свойствами, более высокой эффективностью при клиническом применении и хорошей биодоступностью при пероральном введении было бы очень полезным при лечении рака. Чистый антагонист ССРЭ с сильным ингибированием опосредованной РЭ транскрипции был бы особенно полезен при лечении рака. Существует потребность в новых ССРЭ для лечения таких видов рака, как рак груди, рак яичников, рак эндометрия, рак простаты, рак матки, рак желудка и рак легких, а также мутации из-за возникающей резистентности. В частности, существует потребность в новых ССРЭ для лечения РЭ-позитивного рака груди, рака желудка и/или рака легких.
Суть изобретения
Соединения формулы:
и их фармацевтически приемлемые соли и их фармацевтические композиции представлены в данном документе. В этой формуле или R1, или R2 независимо выбирают из Cl, F, -CF3 или -СН3, а другой представляет собой водород.
Также предусмотрены способы применения описанных в данном документе соединений, их фармацевтически приемлемых солей и фармацевтических композиций для лечения рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака простаты, рака матки, рака желудка или рака легких. Способы включают введение терапевтически эффективного количества соединения, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли, нуждающемуся пациенту.
Кроме того, предлагается соединение, описанное в данном документе, и его фармацевтически приемлемые соли для применения в терапии. Описанные в данном документе соединения и их фармацевтически приемлемые соли можно использовать в лечении рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака простаты, рака матки, рака желудка или рака легких.
Также предлагается применение описанных в данном документе соединений и их фармацевтически приемлемых солей для производства лекарственного средства для лечения рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака простаты, рака матки, рака желудка или рака легких.
Подробное описание сути изобретения
В данном документе описаны новые тетрациклические соединения и их фармацевтические соли, которые действуют как ССРЭ. Недавно открытые ССРЭ, которые описаны в данном документе, обеспечивают ингибирование опосредованной РЭ транскрипции, что будет полезно при лечении таких видов рака, как рак груди, рак яичников, рак эндометрия, рак простаты, рак матки, рак желудка и рак легких, а также мутации из-за возникающей резистентности. Эти ССРЭ могут использоваться либо в качестве отдельных агентов, либо в комбинации с другими классами лекарственных средств, включая селективные модуляторы рецептора эстрогена (СМРЭ), ингибиторы ароматазы, ингибиторы CDK4, ингибиторы CDK6, ингибиторы PI3K и ингибиторы mTOR для лечения рака, позитивного по рецептору гормонов, таких как рак груди, рак желудка и/или рак легких.
Описанные в данном документе новые соединения представлены формулой I:
I и их фармацевтически приемлемыми солями, где или R1, или R2 независимо выбирают из Cl, F, -CF3 или -СН3, а другой представляет собой водород. Специалист в данной области поймет, что соединения, описанные формулой I, или их фармацевтически приемлемые соли содержат хиральный центр, положение которого обозначено * выше. Специалист в данной области техники также поймет, что обозначения по Кану-Ингольду-Прелогу (R) или (S) для хиральных центров будут варьироваться в зависимости от схем замещения вокруг хирального центра. Хиральный центр в соединении формулы I обеспечивает Rэнантиомерную форму, представленную формулой II:
- 1 045961
А S-энантиомерная форма, представленная формулой III:
Все индивидуальные стереоизомеры, энантиомеры и диастереомеры, а также смеси энантиомеров и диастереомеров соединений формулы I, формулы II и формулы III, включая рацематы, включены в объем описанных в данном документе соединений. Соединения для фармацевтического применения, которые содержат хиральные центры, часто выделены в виде отдельных энантиомеров или диастереомеров, и такие выделенные соединения формулы I, формулы II и формулы III включены в объем соединений, описанных в данном документе. Специалист в данной области также поймет, что соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, и их фармацевтически приемлемые соли могут быть дейтерированы (где водород может быть заменен дейтерием), и считается, что такие молекулы должны быть включены в объем описанных в данном документе соединений.
Конкретные примеры соединений формулы I (включая номенклатурные названия IUPAC) показаны в данном документе:
5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси} фенил)-8-(трифторметил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3с]хинолин-2-ол;
5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси} фенил) -7-(трифторметил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3с]хинолин-2-ол;
8-хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол;
7-хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол;
8-фтор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол;
7-фтор-5-(4-{2-[3 -(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси}фенил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3-с]хинолин-2-ол;
- 2 045961
5-(4-{2-[3 -(фторметил)азетидин-1 -ил]этокси} фенил)-8-метил-5Н- [ 1]бензопирано [4,3 -с]хинолин-2-ол; и
5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-7-метил-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол.
Из-за хирального центра, указанного выше, каждый из этих конкретных примеров соединений формулы I, показанных выше, имеет R- и S-энантиомерные формы (то есть, R-энантиомерные соединения формулы II и S-энантиомерные соединения формулы III), как показано в табл. 1.
Таблица 1
Энантиомерные формы соединений формулы I
| Химическое название | R-энантиомер (Формула II) | S-энантиомер (Формула III) |
| 5-(4-{2-[3(фторметил)азетидин1 -ил]этокси} фенил)8-(трифторметил)5Н[1]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол | ь X ? о о у) Z 2—( м. ° | Jb о о I 1 LI- |
| 5-(4-{2-[3- (фторметил)азетидин- 1 -ил]этокси} фенил)- 7-(трифторметил)- 5Н- [1]бензопирано[4,3- с]хинолин-2-ол | n F V4! F-HF UL о T | г* 0Q О о LL. |
| 8-хлор-5-(4-{2-[3(фторметил)азетидин1 -ил]этокси} фенил)5Н- [1]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол | Q tk 0 0 О о ? 1 з | ω 0 0 о о |
- 3 045961
| 7-хлор-5-(4- {2-[3(фторметил)азетидин1-ил]этокси}фенил)- 5Н- [1]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол | Cl Q О A | CI _ xij ΗΟ^'^Ν^ |
| 8-фтор-5-(4-{2-[3(фторметил)азетидин1-ил]этокси}фенил)- 5Н- [1]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол | λα ΛΑ О о 1 ‘ | ΛΑ °Ζλ^ Sζ 0 0 ο ο ζ-^ |
| 7-фтор-5-(4-{2-[3(фторметил)азетидин1-ил]этокси}фенил)- 5Н- [1]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол | Z ? о о | h ο ο 0 0 Нч ΥΛΗ |
| 5-(4-{2-[3- (фторметил)азетидин1-ил]этокси}фенил)8-метил-5Н[1]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол | ΛΑ )—\ ζ ΛΑ Λ0 о о { 1 | ΛΑ °0> 0 0 ο ο |
| 5-(4-{2-[3- (фторметил)азетидин1-ил]этокси}фенил)7-метил-5Н[1]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол | З-о ΛΑ ΛΑ ο ο ? 1 ζ^ | ηο^^ίΛ |
В данном документе также описаны фармацевтические композиции, включающие соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем, носителем или разбавителем. Описанные в данном документе фармацевтические композиции могут быть получены с использованием фармацевтически приемлемых добавок. Используемый в данном документе термин фармацевтически приемлемая добавка(и) относится к одному или нескольким носителям, разбавителям и наполнителям, которые совместимы с другими добавками композиции или состава и не вредны для пациента. Соединения формулы I, формулы II и формулы III или их фармацевтически приемлемые соли, описанные в данном документе, могут быть составлены в виде фармацевтических композиций, вводимых различными путями, такими как перорально или внутривенно. Биодоступность часто является фактором лечения рака, и полезна возможность выбора способов введения и фармацевтических композиций для контроля или оптимизации биодоступности активного ингредиента. Например, пероральная биодоступная композиция ССРЭ будет особенно полезной. Считается, что соединения формулы I, формулы II и формулы III или их фармацевтически приемлемые соли, описанные в данном документе, обладают пероральной биодоступностью. Примеры фармацевтических композиций и способов их получения можно найти в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen Jr, Editor, 22nd Ed., Mack Publishing Co., 2012. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и эксципиентов включают следующее: физиологический раствор, вода, крахмал, сахара, маннит и производные силикона; связы
- 4 045961 вающие агенты, такие как карбоксиметилцеллюлоза и другие производные целлюлозы, альгинаты, желатин и поливинилпирролидон; каолин и бентонит; и полиэтилгликоли.
Далее в данном документе описаны способы лечения рака. Описанные в данном документе способы включают введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемой соли. Например, способ введения эффективного количества соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемой соли, может представлять собой пероральное введение. Рак может быть раком, чувствительным к эстрогену. Кроме того, раком может представлять собой рак груди, рак яичников, рак эндометрия, рак простаты, рак матки, рак желудка или рак легких. Например, рак может быть РЭ-позитивным раком груди, РЭ-позитивным раком желудка или РЭ-позитивным раком легких.
В данном документе также описаны соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли для применения в терапии. Также в данном документе представлены соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли для применения при лечении рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака простаты, рака матки, рака желудка, или рак легких. В частности, рак может быть РЭ-позитивным раком груди, РЭ-позитивным раком желудка или РЭ-позитивным раком легких. Например, соединение формулы I, формулы II и формулы III или их фармацевтически приемлемую соль можно вводить перорально.
Кроме того, соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли можно использовать в производстве лекарственного средства для лечения рака. Например, лекарство можно вводить перорально. Типы рака, для лечения которых могут быть использованы описанные в данном документе лекарственные средства, включают рак груди, рак яичников, рак эндометрия, рак простаты, рак матки, рак желудка или рак легких. В частности, рак может быть РЭ-позитивным раком груди, РЭ-позитивным раком желудка или РЭ-позитивным раком легких.
Соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, и их фармацевтически приемлемые соли могут иметь клиническое применение в качестве единственного агента или в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими агентами (например, противораковыми агентами) для лечение рака, такого как рак груди, рак яичников, рак эндометрия, рак простаты, рак матки, рак желудка или рак легких. При использовании в комбинации с другими терапевтическими агентами (такими как противораковые агенты) соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли можно использовать одновременно, последовательно или отдельно с другими лечебными средствами. Примеры классов лекарств, с которыми соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли могут быть скомбинированы, включают СМРЭ, ингибиторы ароматазы, ингибиторы CDK4, ингибиторы CDK6, ингибиторы PI3K и ингибиторы mTOR для лечения рака груди, позитивного по рецептору гормонов. Более конкретные примеры лекарственных средств, с которыми можно комбинировать соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли, включают абемациклиб (ингибитор CDK4/6), эверолимус (ингибитор mTOR), алпелисиб (ингибитор PIK3CA) и 8-[5-(1-гидрокси-1-метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[^)-2метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2-он (ингибитор PI3K/mTOR).
Используемый в данном документе термин эффективное количество относится к количеству или дозе соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанного в данном документе, или его фармацевтически приемлемой соли, которое при однократном или многократном введении пациенту обеспечивает требуемый эффект у пациента, подлежащего диагностике или лечению. Предпочтительно желаемый эффект представляет собой ингибирование пролиферации опухолевых клеток, гибель опухолевых клеток или оба. Соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли обычно эффективны в широком диапазоне доз. Например, дневные дозировки обычно находятся в дневном диапазоне от около 100 мг до около 2000 мг.
Используемый в данном документе термин лечить, лечащий или лечение относится к ограничению, замедлению, остановке или реверсированию прогрессирования или тяжести существующего симптома или расстройства.
Используемый в данном документе термин пациент относится к человеку, который поражен определенным заболеванием, расстройством или состоянием.
Соединения формулы I, формулы II и формулы III, описанные в данном документе, или их фармацевтически приемлемые соли можно получать различными способами, известными в данной области техники, некоторые из которых проиллюстрированы ниже на схемах и в примерах получения и примерах. Конкретные стадии синтеза для каждого из описанных способов можно комбинировать по-разному или в сочетании со стадиями из разных методик, с получением соединений формулы I, формулы II и формулы III, описанных в данном документе, или их фармацевтически приемлемых солей. Продукты стадий синтеза можно выделять стандартными способами, хорошо известными в данной области техники, включая экстракцию, выпаривание, осаждение, хроматографию, фильтрацию, растирание и кристал
- 5 045961 лизацию. Указанные реагенты и исходные материалы легко доступны специалистам в данной области техники.
Промежуточные соединения и способы, используемые для синтеза соединений формулы I, формулы II и формулы III, описанных в данном документе, предназначены для включения в это описание. Кроме того, определенные промежуточные соединения, описанные в данном документе, могут содержать одну или несколько защитных групп. Вариабельная защитная группа может быть в каждом случае одинаковой или различной, в зависимости от конкретных условий реакции и конкретных проводимых превращений. Условия защиты и снятия защиты хорошо известны специалистам в данной области техники и описаны в литературе (см., например, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007).
Отдельные изомеры, энантиомеры и диастереомеры могут быть отделены или разделены специалистом в данной области в любой удобный момент синтеза соединений формулы I, формулы II и формулы III, описанных в данном документе, такими способами, как способ селективной кристаллизации или хиральная хроматография (см., например, J. Jacques, et al., Enantiomers, Racemates, and Resolutions, John Wiley and Sons, Inc., 1981, и E.L. Eliel and S.H. Wilen, Stereochemistry of Organic Compounds, WileyInterscience, 1994). Хотя отдельные изомеры, энантиомеры и диастереомеры могут быть отделены или разделены, как указано, их обозначения по Кану-Ингольду-Прелогу (R) или (S) для хиральных центров, возможно, еще не определены. Если обозначения по Кану-Ингольду-Прелогу (R) или (S) недоступны, используются идентификаторы изомер 1 и изомер 2, которые комбинируются с названием по IUPAC без обозначения стереохимии по Кану-Ингольду-Прелогу. Соединения формулы I, формулы II и формулы III, обозначенные в данном документе как изомер 1 или изомер 2, выделены, как определено в конкретных описаниях экспериментов ниже. Независимо от того в каком порядке изомеры 1 или 2 формулы I, формулы II и формулы III элюируются из колонки для хиральной хроматографии в указанных условиях, изомер 1 элюируется из колонки первым при указанных условиях. Если хиральная хроматография инициируется на ранней стадии синтеза, то же обозначение применяется к последующим промежуточным продуктам и соединениям формулы I, формулы II и формулы III.
Если не указано иное, используемые в данном документе сокращения определены в соответствии с Aldrichimica Ada, Vol. 17, No. 1, 1984. Другие сокращения определены следующим образом: ACN относится к ацетонитрилу; BSA относится к альбумину бычьей сыворотки; cataCXium® APd G3 относится к [(ди(1-адамантил)бутилфосфин)-2-(2'-амино-1,1'-бифенил)]метансульфонату палладия (II); DCM относится к дихлорметану или метиленхлориду; DMA относится к диметилацетамиду; DMEA относится к диметилэтиламину; DMEM относится к среде Игла, модифицированной Дульбекко; DMF относится к КН-диметилформамиду; DMSO относится к диметилсульфоксиду; ДНК относится к дезоксирибонуклеиновой кислоте; кДНК относится к комплементарной ДНК; ДНКаза относится к дезоксирибонуклеазе; DTT относится к дитиотреитолу; ЕС50относится к концентрации агента, которая вызывает 50% ответ целевой активности по сравнению с заранее определенным позитивным контрольным соединением (абсолютноеЕС50); EDTA относится к этилендиаминтетрауксусной кислоте; ее относится к энантиомерному избытку; РЭа относится к альфа-рецептору эстрогена; РЭв относится к бета-рецептору эстрогена; EtOAc относится к этилацетату; EtOH относится к этанолу или этиловому спирту; FBS относится к фетальной бычьей сыворотке; HBSS относится к сбалансированному солевому раствору Хэнка; НЕС относится к гидроксиэтилцеллюлозе; HEPES относится к 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоте; ВЭЖХ относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии; IC50 относится к концентрации агента, которая вызывает 50% максимальной ингибирующей реакции, возможной для этого агента, (относительная IC50) или концентрации агента, которая вызывает 50% ингибирование активности целевого фермента по сравнению с контролем плацебо (абсолютное IC50); IPA относится к изопропиламину; iPrOH относится к изопропанолу или изопропиловому спирту; ВВ относится к внутривенному введению; Ki относится к константе ингибирования; МЕК относится к метилэтилкетону; МеОН относится к метиловому спирту или метанолу; МТВЕ относится к метил-тирети-бутиловому эфиру; PBS относится к физиологическому раствору с фосфатным буфером; ПО относится к пероральному введению; РПа относится к альфа-рецептору прогестерона; QD относится к дозировке один раз в день; РНК относится к рибонуклеиновой кислоте; РНКаза относится к рибонуклеазе; ОТ-ПЦР относится к полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией; ОТ-кПЦР относится к количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскприцией; СЖХ относится к сверхкритической жидкостной хроматографии; TED50 относится к эффективной дозе для достижения 50% ингибирования мишени в опухолях; THF относится к тетрагидрофурану; ”t(R) относится ко времени удерживания; XantPhos Pd G2 относится к хлор[(4,5бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен)-2-(2'-амино-1,1'-бифенил)]палладию (II); и XPhos Pd G2 относится к хлор(2-дициклогексилфосфино-2',4',6'-триизопропил-1,1'-бифенил)[2-(2'-амино-1,1'бифенил)]палладию (II).
Следующие способы получения и примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение.
- 6 045961
Схема 1.
Получение и примеры
I
На схеме 1 показан синтез соединений формулы I.
На стадии А осуществляется реакция Гриньяра. Реакция Гриньяра хорошо известна в данной области как реакция образования углерод-углеродных связей. Реакция включает металлоорганическую реакцию, в которой арилмагнийгалогенид, реактив Гриньяра, присоединяется к карбонильной группе, такой как хлорангидрид соединения 2, с получением соединения стадии А. Например, 4-хлорзамещенный хинолон, соединение 1, обрабатывают реактивом Гриньяра, таким как изопропилмагнийхлорид, с образованием промежуточного продукта Гриньяра с последующим добавлением хлорангидрида, 4фторбензоилхлорида, соединения 2, в растворителе, таком как THF. По завершении реакцию можно погасить водой с получением соединения 3.
На стадии В арилметиловый эфир соединения 3 может быть деметилирован в различных условиях, известных специалисту в данной области, таких как обработка трибромидом бора. Например, соединение 3 медленно обрабатывают трибромидом бора при температуре около 0°С в растворителе, таком как DCM. Смесь перемешивают при комнатной температуре и гасят двухосновным фосфатом калия с получением соединения 4.
На стадии С, азетидиновый эфир 6 может быть образован обработкой соответствующего пфторфенилкетона 4 и спиртовой соли азетидина 5 или соответствующего свободного основания подходящим основанием, например, гидридом натрия, трет-бутоксидом натрия или трет-бутоксидом калия в подходящем полярном апротонном растворителе, таком как DMF или THF, с получением эфира 6.
Затем соединение 6 алкилируют соответствующей замещенной арилбороновой кислотой, соединением 7, в реакции конденсации Сузуки с получением соединения 8 на стадии D. Специалист в данной области поймет, что существует множество условий, которые могут быть полезны для облегчения таких реакций конденсации. Подходящие палладиевые реагенты могут включать XantPhos Pd G2, cataCXium® A Pd G3, хлорид бис(трифенилфосфин)палладия (II), трис(дибензилиденацетон)дипалладий (0) с трициклогексилфосфином, хлорид (1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен)палладия (II), тетракистрифенилфосфин палладия или ацетат палладия (II). Подходящие основания могут включать фторид калия, карбонат цезия, карбонат натрия, карбонат калия, трет-бутоксид лития или трехосновный моногидрат фосфата калия. Соединение 6, например, может реагировать с соответствующей бороновой кислотой, соединением 7, таким как 2-фтор-4-(трифторметил)фенилбороновая кислота в растворителе, таком как 2-метил-2бутанол, с основанием, таким как карбонат калия, и катализатором, таким как XPhos Pd G2, и нагрета до около 80°С в условиях микроволнового облучения, с получением соединения 8.
Специалист в данной области поймет, что стадия D, реакция конденсации Сузуки, может быть завершена до образования азетидинового эфира на стадии С.
Специалист в данной области поймет, что на стадии Е соединение 8 можно циклизовать путем начального восстановления кетона. Это может быть выполнено с использованием восстанавливающего агента, такого как триэтилборогидрид лития, в таких растворителях, как 1,4-диоксан и THF, и при температуре от около 0°С до комнатной температуры, с получением соответствующего вторичного спирта.
- 7 045961
Этот промежуточный спирт можно использовать неочищенным и депротонировать при помощи подходящего основания, такого как карбонат цезия, гидрид натрия, трет-бутоксид натрия или трет-бутоксид калия, в растворителе, таком как THF, DMSO или DMF. Полученный алкоксид может циклизоваться в арилфторид при комнатной температуре, при нагревании до кипения или при температуре около 60°С. Замещенный циклический эфир, образующийся при замещении фторида, затем может быть получен с образованием соединений формулы I.
Альтернативно, кетон 8 можно восстановить до спирта и хирально очистить на стадии F с получением хирального спирта 9, и затем циклизовать на стадии G, как описано выше для стадии Е, с получением соединений формулы I.
В другой альтернативной реакции кетон может быть восстановлен с использованием хирального реагента, такого как ^)-(+)-а.а-дифенил-2-пирролидинметанол вместе с триметилборатом и борандиметилсульфидом, непосредственно с получением желаемого хирального спирта, соединения 9, который затем можно циклизовать на стадии G, как описано выше для стадии Е, с получением соединений формулы I.
На необязательной стадии может быть получена фармацевтически приемлемая соль соединения формулы I, формулы II и формулы III, как описано в данном документе, посредством взаимодействия соответствующего свободного основания формулы I, формулы II и формулы III, описанных в данном документе, с подходящей фармацевтически приемлемой кислотой в подходящем растворителем в стандартных условиях. Кроме того, указанные соли можно получать одновременно с удалением азотзащитных групп. Возможное образование фармацевтически приемлемых солей хорошо известно. См., например, Gould, P.L., Salt selection for basic drugs, International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.I, et al. Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities, Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); и Berge, S.M., et al., Pharmaceutical Salts, Journal oj Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977). Специалистам в данной области техники будет понятно, что соединение формулы I, формулы II и формулы III, описанное в данном документе, может быть легко превращено и выделено в виде фармацевтически приемлемой соли. Примеры полезных солей включают, но не ограничиваются ими, соли бензолсульфоновой кислоты и соли 4метилбензолсульфоновой кислоты. Соли 4-метилбензолсульфоновой кислоты также известны как тозилатные соли.
Синтез 1. 2-[3-(Фторметил)азетидин-1-ил]этан-1-ол.
Добавляют триацетоксиборгидрид натрия (405 г, 1,91 моль) порциями в течение 15 мин к перемешиваемому раствору 3-(фторметил)азетидина гидрохлорида (160 г, 1,28 моль) в DCM (2,4 л) в атмосфере N2 при 0°С и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Добавляют 1,4-диоксан-2,5-диол (99 г, 0,83 моль) при 0°С, 6 порций в течение 1 ч, затем перемешивают при 0-5°С в течение 15 мин. Позволяют реакционной смеси нагреваться до комнатной температуры и перемешивают в течение 2 ч в атмосфере N2. Реакционную смесь охлаждают до 10-15°С в течение 20 мин, затем нагревают до 25-30°С и выдерживают при этой температуре в течение 2 ч. Добавляют воду (800 мл) в течение 25-30 мин при 10-15°С, позволяют нагреться до комнатной температуры в течение 5-10 мин, и затем разделяют слои. Водный слой промывают DCM (800 мл), разделяют слои, затем охлаждают объединенные водные слои до 10-15°С и доводят рН до 13-14, используя 50% раствор гидроксида натрия (~540 мл). Позволяют водному слою нагреться до комнатной температуры, экстрагируют DCM (4 х 800 мл), сушат сульфатом натрия (80 г), фильтруют и концентрируют досуха с получением указанного в заголовке соединения (139 г, 82%) в виде густого желтого масла. ЭС/МС (m/z): 134,1 (M+H).
Синтез 2. 2-[3-(Фторметил)азетидин-1-ил]этан-1-ол гидрохлорид.
F'Xk/--.0H
HCI
Растворяют 2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этан-1-ол (529 г, 4 моль) в МТВЕ (2,6 л) и охлаждают до 0°С. Добавляют раствор HCl/EtOH (492 мл, 30 мас.%) по каплям в течение 30 мин, затем перемешивают при 0°С в течение 30 мин. Фильтруют твердые частицы и промывают осадок на фильтре МТВЕ (2x200 мл). Сушат в атмосфере N2 в течение 8 ч с получением указанного в заголовке соединения (580 г, 86%) в виде белого твердого вещества. ЭС/МС (m/z): 134,0 (М+Н).
Синтез 3. (3-Хлор-7-метоксихинолин-4-ил)-(4-фторфенил)метанон.
Охлаждают смесь 4-бром-3-хлор-7-метоксихинолина (70 г, 254 ммоль) в THF (1 л) до -40°С в атмосфере N2, что приводит к осаждению материала. Добавляют изопропилмагнийхлорид (2M в THF, 254 мл,
- 8 045961
509 ммоль) в течение 20 мин и перемешивают смесь в течение 1 ч. Добавляют раствор 4фторбензоилхлорида (66 мл, 559 ммоль) в THF (140 мл) по каплям, затем позволяют раствору нагреться до комнатной температуры. Гасят реакцию насыщенным раствором NH4Cl (300 мл) и водой (200 мл) и разделяют слои. Органический слой промывают насыщенным раствором NH4Cl (300 мл), сушат над MgSO4, фильтруют и концентрируют, с получением маслянистого остатка. Сырое коричневое масло фильтруют через силикагель, элюируют смесью МТВЕ/гексаны (1:1), с получением сырого продукта в виде желтого твердого вещества (84 г). Обрабатывают твердое вещество 10% смесью метилацетат/гептан (800 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Фильтруют для сбора твердых частиц и запаса. Концентрируют фильтрат и очищают на силикагеле, элюируют смесью 10-40% EtOAc/гексаны, затем обрабатывают продукт 10% метилацетатом/гептаном (200 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов. Полученные твердые вещества фильтруют, объединяют с твердыми веществами от предыдущей фильтрации и сушат в вакууме в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (31 г, 38%) в виде желтого твердого вещества. ЭС/МС (m/z): 316,0 (М+Н).
Синтез 4. (3-Хлор-7-гидроксихинолин-4-ил)-(4-фторфенил)метанон.
Добавляют трибромид бора (1M в DCM, 295 мл, 295 ммоль) к смеси (3-хлор-7-метоксихинолин-4ил)-(4-фторфенил)метанона (31 г, 98 ммоль) в DCM (217 мл) и перемешивают смесь при комнатной температуре в течение 3 дней. Медленно выливают смесь в раствор двухосновного фосфата калия (2M в воде, 700 мл) и воды (200 мл) при 0°С. Смесь оставляют нагреться до комнатной температуры и перемешивают в течение 1 ч. Раствор концентрируют в вакууме для удаления органических растворителей, фильтруют, собирают фильтрат и сушат фильтрат в вакууме при 45°С в течение ночи. Обрабатывают твердые вещества смесью DCM/гептан (1:1, 450 мл) и перемешивают в течение ночи. Собирают твердые вещества и сушат в вакууме в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (32 г, количественный выход) в виде светло-коричневого твердого вещества. ЭС/МС (m/z): 302,0 (М+Н).
Синтез 5. (3 -Хлор-7-гидроксихинолин-4-ил)-(4- {2-[3 -(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси}фенил)метанон.
Добавляют 2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этан-1-ол гидрохлорид (3,90 г, 23,0 ммоль) к перемешиваемому раствору (3-хлор-7-гидроксихинолин-4-ил)-(4-фторфенил)метанона (5,00 г, 15,3 ммоль) в DMF (75 мл) с последующим добавлением гидрида натрия (60% в минеральном масле, 3,02 г, 76,8 ммоль). Перемешивают в атмосфере N2 и нагревают до 40°С в течение 45 мин. Гасят раствор водой и концентрируют. Разделяют остаток между 20% iPrOH/CHCl3 и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и разделяют, водный раствор экстрагируют 2x20% iPrOH/CHCl3, объединяют органические экстракты, сушат объединенные органические слои над сульфатом магния, фильтруют и концентрируют фильтрат с получением сырого продукта в виде темно-красного масла. Сырой материал очищают хроматографией на колонке с силикагелем, элюируют градиентом 5-10% 7 N NH3 в MeOH/DCM, с получением указанного в заголовке соединения (5,31 г, 84%) в виде желтого твердого вещества. ЭС/МС (m/z): 415,0 (М+Н).
Синтез 6. (4-{2-[3-(Фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил){3-[2-фтор-4-(трифторметил)фенил]-7гидроксихинолин-4-ил } метанон.
Дегазируют N2 (5x) смесь (3-хлор-7-гидроксихинолин-4-ил)-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1ил]этокси}фенил)метанона (200 мг, 0,48 ммоль), 2-фтор-4-(трифторметил)фенилбороновой кислоты (158 мг, 0,72 ммоль), карбоната калия (202 мг, 1,45 ммоль), 2-метил-2-бутанола (3 мл) и воды (1 мл) в сосуде для микроволновой обработки. Добавляют XPhos Pd G2 (12 мг, 0,015 ммоль), герметизируют и помещают в микроволновую печь при 80°С на 2 ч. Разделяют остаток между МТВЕ и насыщенным раствором NH4Cl. Разделяют слои и экстрагируют водную фазу МТВЕ. Объединяют органические экстракты, сушат сульфатом магния, фильтруют и концентрируют фильтрат с получением оранжевого остатка. Сырой материал очищают колоночной хроматографией на силикагеле, элюируют 5% MeOH/DCM, с получением указанного в заголовке соединения (205 мг, 78%) в виде желтого твердого вещества. ЭС/МС (m/z): 543,2
- 9 045961 (М+Н).
Получают следующие соединения способом, по сути аналогичным способу Синтеза 6, со следующими вариантами способа, продолжительностью нагревания 1 -2 ч, экстракцией МТВЕ или EtOAc и сушкой органических слоев сульфатом магния или сульфатом натрия. Очищают колоночной хроматографией на силикагеле, используя до 10% (МеОН или 7 М аммиак в МеОН) в DCM (Синтез 10: градиент 3-8% 7 М аммиак в МеОН в DCM; Синтез 9 и 11: градиент от 4 до 10% 7 М аммиак в МеОН в DCM) и/или обращенно-фазовой хроматографией при высоком рН, как указано.
Таблица 2
Соединения, полученные согласно синтезу 6
| Синтез № | Химическое название | Структура | ЭС/МС (m/z) (М+Н) |
| 7 | (4-{2-[3- (Фторметил)азетидин-1 ил]этокси} фенил) {3 - [2фтор-3- (трифторметил)фенил] -7гидроксихинолин-4- ил} метанон | Ххтт/ f HO N | 543,0 |
| 8а | [3 -(4-Хлор-2-фторфенил)7-гидроксихинолин-4ил](4-{2-[3- (фторметил)азетидин-1 ил]этокси} фенил)метанон | υ PQ | 509,0 |
| 9ь | [3 -(3 -Хлор-2-фторфенил)7-гидроксихинолин-4ил](4-{2-[3- (фторметил)азетидин-1 ил]этокси} фенил)метанон | η ^z о о Ъ 0 Ώ-Γ о | 509,0 |
| 10 | [3-(2,4-Дифторфенил)-7гидроксихинолин-4ил](4-{2-[3- (фторметил)азетидин-1 ил]этокси} фенил)метанон | LL Р Q О о | 493,0 |
| И | [3 -(2,3 -Дифторфенил)-7гидроксихинолин-4ил](4-{2-[3- (фторметил)азетидин-1 ил]этокси} фенил)метанон | ,---. л- Ύί Til ХХТТ'F | 493,0 |
- 10 045961
| 12 | (4-{2-[3- (Фторметил)азетидин-1 ил]этокси} фенил) [3 -(2фтор-4-метилфенил)-7гидроксихинолин-4ил] метанон | -п ь о о | 489,2 |
| 13 | (4-{2-[3- (Фторметил)азетидин-1 ил]этокси} фенил) [3 -(2фтор-3 -метилфенил)-7гидроксихинолин-4ил] метанон | θ-u. QQ о о ί 3 | 489,2 |
а Очищают обращенно-фазовой флэш-хроматографией при высоком рН (колонка RediSep Rf GOLD® High Performance C18, элюируют 35-45% ACN в 10 мМ водном бикарбонате аммония с 5% МеОН).
b После очистки на силикагеле, элюируют 4-10% 7 М аммик в МеОН в DCM, дополнительно очищали обращенно-фазовой флэш-хроматографией при высоком рН (колонка RediSep Rf
GOLD® High Performance C18, элюируют 30-44% ACN в 10 мМ водном бикарбонате аммония с 5% МеОН).
Синтез 14. Рацемический 4-{2-[3-(Фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)(гидрокси)метил]-3-[2фтор-4-(трифторметил)фенил]хинолин-7-ол.
ОН^ X,jOlTf
Добавляют (4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил){3-[2-фтор-4-(трифторметил)фенил]7-гидроксихинолин-4-ил}метанон (305 г, 562,2 ммоль) и THF (1,5 л) вместе в атмосфере N2 и охлаждают раствор до 0-5°С. По каплям добавляют триэтилборгидрид лития (1M в THF, 1,5 л, 1,5 моль). Перемешивают при 0-5°С в течение 1 ч. По каплям добавляют воду (300 мл) и насыщенный NH4Cl (1 л). Смесь нагревают до комнатной температуры. Добавляют EtOAc (2 л) и собирают органический слой. Органический слой промывают рассолом (500 мл), сушат над MgSO4, фильтруют и концентрируют досуха. Остаток растворяют в смеси 95:5 ацетона и 2 М аммиака в МеОН и фильтруют через силикагель, с получением указанного в заголовке соединения (264 г, 86,2%) в виде оранжевого твердого вещества. ЭС/МС (m/z): 545,2 (М+Н).
Синтез 15. 4-{2-[3 -(Фторметил)азетидин-1 -ил]этокси}фенил)(гидрокси)метил] -3 - [2-фтор-4(трифторметил)фенил]хинолин-7-ол, изомер 1.
Очищают рацемический 4-{2-[3 - (фторметил)азетидин-1 -ил]этокси} фенил)(гидрокси)метил] -3-[2фтор-4-(трифторметил)фенил]хинолин-7-ол (354 г, 0,62 моль) хиральной хроматографией в следующих условиях: колонка Chiralpak AD-H, 150х 50 мм, скорость потока 300 г/мин, УФ 350 нм, подвижная фаза 35% iPrOH с 0,5% DMEA/CO2, температура колонки 40°С с получением указанного в заголовке соединения (171,4 г, 48%) первого элюируемого изомера. Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >98% ее, t(R) = 0,79 минуты, колонка: 4,6x150 мм Chiralpak AD-H, элюируют подвижной фазой 35% iPrOH с 0,5% DMEA в СО2, скорость потока 0,6 мл/мин, УФдетектирование 350 нм.
Альтернативный синтез 15.
Добавляют триметилборат (65 мг, 0,62 ммоль) к раствору ^)-(+)-а.а-дифенил-2-пирролидинметанола (132 мг, 0,52 ммоль) в THF (20 мл). Смесь перемешивают в атмосфере N2 при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляют боран-диметилсульфид (2,0 М в THF, 2,6 мл, 5,2 ммоль), а затем (4-{2-[3(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси} фенил) { 3 - [2-фтор-4-(трифторметил)фенил] -7 -гидроксихинолин-4ил}метанон (1,0 г, 1,73 ммоль). Нагревают реакционную смесь в течение ночи при 45°С. Добавляют дополнительно боран-диметилсульфид (2,0 М в THF, 2,6 мл, 5,2 ммоль) и перемешивают в течение 5 часов при
- 11 045961
45°С. Медленно добавляют насыщенный раствор NH4Cl (25 мл) и выделяют органическую фазу. Повторно экстрагируют водный экстракт 20% iPrOH/CHCl3. Органические экстракты объединяют, сушат над Na2SO4, фильтруют и упаривают, с получением промежуточного боранового комплекса (1,2 г). Растворяют одну треть промежуточного боранового комплекса (0,4 г, 0,6 ммоль) в 1,4-диоксане (4 мл) и этаноламине (0,3 мл, 5 ммоль) и нагревают реакционную смесь до 70°С в течение 3 часов. Гасят реакцию насыщенным раствором NH4Cl (25 мл) и выделяют органическую фазу. Повторно экстрагируют водный экстракт 20% iPrOH/CHCl3 (4x25 мл). Объединяют органические экстракты, сушат над Na2SO4, фильтруют и концентрируют досуха с получением указанного в заголовке соединения в виде оранжевого твердого вещества (0,33 г, 0,57 ммоль, выход 100%). ЖХ/МС (m/z): [М+Н]+ 545. Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, 96% ее, t(R) = 0,79 минуты, колонка: 4,6x150 мм Chiralpak AD-H, элюирование подвижной фазой 35% iPrOH с 0,5% DMEA в СО2, скорость потока 0,6 мл/мин, УФ-детектирование 350 нм.
Пример 1.
Рацемический 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н-[1] бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол.
Охлаждают раствор (4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси} фенил) {3-[2-фтор-4(трифторметил)фенил]-7-гидроксихинолин-4-ил}метанона (5,27 г, 9,71 ммоль) в 1,4-диоксане (100 мл) до 5°С. Добавляют триэтилборгидрид лития (1M в THF, 30,0 мл, 30,0 ммоль). Убирают охлаждающую баню и перемешивают 1 ч при комнатной температуре. Смесь гасят водой. Добавляют насыщенный раствор NH4Cl и EtOAc. Разделяют слои и экстрагируют водный слой EtOAc. Органические экстракты объединяют, сушат над безводным MgSO4, фильтруют и концентрируют фильтрат. Растворяют неочищенный остаток в THF (100 мл). Добавляют гидрид натрия (60% в минеральном масле, 1,94 г, 48,5 ммоль). Раствор кипятят с обратным холодильником 1 ч. Добавляют дополнительно гидрид натрия (60% в минеральном масле, 1,94 г, 48,5 ммоль), затем кипятят с обратным холодильником еще 30 мин. Охлаждают раствор до комнатной температуры и гасят водой. Добавляют EtOAc и насыщенный раствор NH4Cl. Разделяют слои и экстрагируют водный слой EtOAc. Органический экстракт объединяют, сушат над безводным MgSO4, фильтруют и концентрируют фильтрат. Очищают остаток колоночной хроматографией на силикагеле, элюируют градиентом 5-7%МеОН в DCM, с получением указанного в заголовке соединения (3,70 г, выход 72%) в виде желтого пенистого вещества. ЭС/МС (m/z): 525,2 (М+Н).
Следующие соединения получают способом, практически аналогичным способу примера 1, со следующими вариантами методики. Для восстановления используют от 3 до 5 эквивалентов триэтилборгидрида лития со временем реакции от 30 мин до одного часа и сушат органические слои над сульфатом магния или сульфатом натрия. Неочищенный остаток используют непосредственно или очищают колоночной хроматографией на силикагеле, элюируют градиентом 0-5-7,5-10% МеОН в DCM перед циклизацией. Проводят циклизацию при нагревании с обратным холодильником в THF в течение 16 ч или в DMF, от 2 ч при комнатной температуре для примера 2, до 2 ч при 85°С для примера 8. Экстрагируют DCM или EtOAc и сушат органические слои над сульфатом магния или сульфатом натрия. Очищают колоночной хроматографией на силикагеле, используя до 10% (МеОН или 7 М аммиак в МеОН) в DCM (пример 2: градиент 0-10% МеОН в DCM; пример 5: градиент 4-10% 7 М аммиак в МеОН в DCM; пример 8: градиент 5-7,5% 7 М аммиак в МеОН в DCM) или при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ при высоком рН, как указано.
- 12 045961
Таблица 3
Примеры соединений, полученных согласно примеру 1
| Пример № | Химическое название | Структура | ЭС/МС (m/z) (М+Н) |
| 2 | Рацемический 5-(4-{2[3(фторметил)азетидин1 -ил]этокси} фенил)-7(трифторметил)-5Н[ 1 ] бензопирано [4,3 с]хинолин-2-ол | о F Γ~Ν F—|—F LA.,0. J. | 525,2 |
| За | Рацемический 8-хлор5-(4-{2-[3(фторметил)азетидин1 -ил]этокси} фенил)5Н[ 1 ] бензопирано [4,3 с]хинолин-2-ол | jCCj HO N | 491,0 |
| 4Ь | Рацемический 7-хлор5-(4-{2-[3(фторметил)азетидин1 -ил]этокси} фенил)5Н[ 1 ] бензопирано [4,3 с]хинолин-2-ол | I О О у} yz Уч | 491,0 |
| 5е | Рацемический 8-фтор5-(4-{2-[3(фторметил)азетидин1 -ил]этокси} фенил)5Н[ 1 ] бензопирано [4,3 с]хинолин-2-ол | Ь I о о yj О | 475,0 |
| 6d | Рацемический 7-фтор5-(4-{2-[3(фторметил)азетидин1 -ил]этокси} фенил)5Н[ 1 ] бензопирано [4,3 с]хинолин-2-ол | 3-Q о о т | 475,0 |
- 13 045961
Рацемический 5-(4-{2[3(фторметил)азетидин1 -ил]этокси} фенил)-8метил-5Н
[1 ]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол
Рацемический 5-(4-{2[з(фторметил)азетидин1 -ил]этокси} фенил)-7метил-5Н
[1 ]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол
а Очистка при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ с высоким рН (KINETEX® С18, 5 мкм, колонка 30x250 мм, элюируют 35-50% ACN в 10 мМ водном бикарбонате аммония с 5% МеОН) b Очистка при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ с высоким рН (KINETEX® С18, 5 мкм, колонка 30x250 мм, элюируют 35-43% ACN в 10 мМ водном бикарбонате аммония с 5% МеОН)
После очистки на силикагеле, элюируют 4-10% 7М аммиак в МеОН в DCM, проводят дополни тельную очистку при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ при высоком рН (KINETEX® C18, 5 мкм, колонка 30x250 мм, элюируют 30-44% ACN в 10 мМ водном бикарбонате аммония с 5% МеОН) d Очистка при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ при высоком рН (XBRIDGE® C18 5 мкм OBD, колонка 30x75 мм, элюируют 10-75% ACN в 10 мМ водном бикарбонате аммония с 5% МеОН) е Очистка при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ с высоким рН (XBRIDGE® С18 5 мкм OBD, колонка 30x75 мм, элюируют 10-60% ACN в 10 мМ водном бикарбонате аммония с 5% МеОН)
Пример 1А.
5-(4-{2-[3-(Фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н-[1]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол, изомер 1.
Пример 1В.
5-(4-{2-[3-(Фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н-[1]бензопирано[4,3с]хинолин-2-ол, изомер 2.
Разделяют два энантиомера 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол при помощи хиральной СЖХ в следующих условиях: колонка: LUX® Cellulose-1, 5x25 см; элюируют подвижной фазой 30% iPrOH (с 0,5% DMEA) в СО2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 300 г/мин; длина волны УФ-детектирования: 270 нм с получением Примера 1А в качестве первого элюируемого энантиомера (изомер 1). ЭС/МС (m/z): 525,2 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 1,30 мины; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% МеОН (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм. Выделяют указанное в заголовке соединение Примера 1В, с получением второго элюируемого энантиомера (Изомер 2). ЭС/МС (m/z): 525,2 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 2 при помощи хиральной аналитической СЖХ, 98% ее, r(R): 2,03 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% МеОН (0,2% IPA) в СО2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.
Альтернативный синтез примера 1В.
Кристаллический 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, Изомер 2 Перемешивают 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, 4-метилбензолсульфоновую
- 14 045961 кислоту, Изомер 2 (23,8 г, 0,034 моль) в воде (250 мл) при 1000 об/мин. Добавляют NaOH (76 мкл) и перемешивают раствор в течение 2 ч. Добавляют DCM (600 мл). Разделяют смесь, сушат экстракт DCM сульфатом магния, фильтруют материал через шприцевой фильтр (0,45 мкм) и концентрируют досуха. Оставляют материал в потоке N2 в течение выходных. Добавляют 1: 1 EtOH/вода (80 мл) и перемешивают смесь ультразвуком. Собирают рыжевато-коричневое твердое вещество фильтрованием на нейлоновой мембране с получением указанного в заголовке соединения (10,47 г, 0,02 моль, 59%).
Рентгеновская порошковая дифрактометрия (РПД).
Рентгенограммы кристаллических твердых веществ получены на рентгеновском порошковом дифрактометре Bruker D4 Endeavour, оснащенном источником CuKa и детектором Vantec, работающем при 35 кВ и 50 мА. Образец сканировали в диапазоне от 4 до 40 2θ°, с шагом 0,008 2θ°, и скоростью сканирования 0,5 секунд/шаг, и используя дивергенцию 1,0 мм, неподвижную отсеивающую решетку 6,6 мм и щель детектора 11,3 мм. Сухой порошок упаковывают в кварцевую кювету и гладкую поверхность получают при помощи предметного стекла. Дифрактограммы кристаллической формы снимали при температуре окружающей среды и относительной влажности. Положения пиков кристаллов определяют в MDIJade после полного сдвига дифрактограмм на основе внутреннего стандарта NIST 675 с пиками при 8,853 и 26,774 2θ°. В области кристаллографии хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы относительные интенсивности дифракционных пиков могут варьироваться вследствие предпочтительной ориентации, обусловленной такими факторами, как морфология и структура кристалла. Если присутствует влияние предпочтительной ориентации, интенсивности пиков изменяются, но характерные положения пиков полиморфа остаются неизменными. См., например, The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995. Дополнительно, в области кристаллографии также хорошо известно, что для любой данной формы кристалла угловые положения пиков могут незначительно изменяться. Например, положения пиков могут смещаться из-за изменения температуры, при которой анализируется образец, смещения образца или наличия или отсутствия внутреннего стандарта. В данном случае изменчивость положения пика в ± 0,2 2θ° учитывает эти потенциальные изменения, не мешая однозначной идентификации указанной кристаллической формы. Подтверждение кристаллической формы может быть сделано на основе любой уникальной комбинации отличительных пиков.
Полученный образец кристаллического 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8(трифторметил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола, изомер 2, характеризовали по рентгенограмме с использованием излучения CuKa, имеющего дифракционные пики (значения 2-тета), как описано в табл. 3 ниже, и, в частности, имеющего пики при 19,8 в комбинации с одним или несколькими из пиков, выбранных из группы, состоящей из 6,8, 16,0 и 22,1; с допуском на углы дифракции 0,2 градуса.
Таблица 4
Пики рентгеновской порошковой дифрактометрии кристаллического примера 1В
| Пик | Угол (°2-тета) +/- 0,2° | Относительная интенсивность (% от наиболее интенсивного пика) |
| 1 | 6,8 | 29,40 |
| 2 | 15,3 | 8,30 |
| 3 | 16,0 | 20,10 |
| 4 | 17,4 | 7,60 |
| 5 | 18,1 | 16,00 |
| 6 | 19,8 | 100,00 |
| 7 | 21,1 | 14,60 |
| 8 | 22,1 | 28,90 |
| 9 | 24,9 | 16,40 |
| 10 | 25,4 | 21,90 |
Альтернативный синтез примера 1В.
Растворяют 4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)(гидрокси)метил]-3-[2-фтор-4(трифторметил)фенил]хинолин-7-ол, изомер 1(63,05 г, 104,7 ммоль) в DMSO (1,3 л) в атмосфере N2 при комнатной температуре. Добавляют порциями карбонат цезия (108 г, 331 ммоль) в течение 5 мин. Нагревают смесь до 60°С в течение 15 ч. Смесь охлаждают до комнатной температуры и разбавляют водой (2,1 л) и EtOAc (1,3 л). Смесь перемешивают 5 мин и разделяют. Повторно экстрагируют водный материал EtOAc (1,3 л) и перемешивают в течение 5 мин. Разделяют и объединяют органические экстракты, промывают рассолом, водой и EtOAc. Органические экстракты сушат над MgSO4, концентрируют и су
- 15 045961 шат в вакууме в течение ночи при комнатной температуре с получением указанного в заголовке соединения в виде коричневого твердого вещества (52,69 г, 95,9%).
Подтверждают энантиомерное обогащение примера 1В при помощи хиральной аналитической СЖХ, 98,1% ее, 1^:2,03 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% МеОН (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.
Пример 2А.
5-(4-{2-[3 -(Фторметил)азетидин-1 -ил]этокси} фенил)-7-(трифторметил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3с]хинолин-2-ол, изомер 1.
Пример 2В.
5-(4-{2-[3 -(Фторметил)азетидин-1 -ил]этокси} фенил)-7-(трифторметил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3с]хинолин-2-ол, изомер 2.
Разделяют два энантиомера 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-7-(трифторметил)5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола хиральной СЖХ в следующих условиях: колонка: CHIRALPAK® IC, 21x250 см; элюируют подвижной фазой 30% iPrOH (с 0,2% IPA) в СО2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 70 г/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм с получением Примера 2А в качестве первого элюируемого энантиомера (изомер 1). ЭС/МС (m/z): 525,1 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t-Ry 1,56 минуты; колонка: CHIRALPAK® IC, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% iPrOH (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм. Выделяют указанное в заголовке соединение Примера 2В с получением второго элюируемого энантиомера (Изомер 2). ЭС/МС (m/z): 525,2 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 2 при помощи хиральной аналитической СЖХ, 98% ее, t (R): 2,33 минуты; колонка: CHIRALPAK® IC, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% iPrOH (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.
Пример 3А.
8-Хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, изомер 1.
Пример 3В.
8-Хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, изомер 2.
Разделяют два энантиомера 8-хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола при помощи хиральной СЖХ в следующих условиях: колонка: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 см; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (с 0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 80 г/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм, с получением Примера 3А в качестве первого элюируемого энантиомера (изомер 1). ЭС/МС (m/z): 491,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 1,55 мины; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (0,2% IPA) в СО2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм. Выделяют указанное в заголовке соединение Примера 3В с получением второго элюируемого энантиомера (Изомер 2). ЭС/МС (m/z): 491,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 2 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 2,26 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (0,2% IPA) в СО2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.
Пример 4А.
7-Хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, изомер 1.
Пример 4В.
7-Хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, изомер 2.
- 16 045961
Разделяют два энантиомера 7-хлор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола при помощи хиральной СЖХ в следующих условиях: колонка: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 см; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (с 0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 80 г/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм, с получением Примера 4А в качестве первого элюируемого энантиомера (изомер 1). ЭС/МС (m/z): 491,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 1,71 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (0,2% IPA) в СО2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм. Выделяют указанное в заголовке соединение Примера 4В с получением второго элюируемого энантиомера (Изомер 2). ЭС/МС (m/z): 491,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 2 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 2,38 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.
Пример 5А.
8-Фтор-5-(4-{2-[3 -(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси}фенил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3-с]хинолин-2-ол, изомер 1.
Пример 5В.
8-Фтор-5-(4-{2-[3 -(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси}фенил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3-с]хинолин-2-ол, изомер 2.
F 0 Х/Хх/ F
TTJT XXX
Разделяют два энантиомера 8-фтор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола при помощи хиральной СЖХ в следующих условиях: колонка: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 см; элюируют подвижной фазой 30% МеОН (с 0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 80 г/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм, с получением Примера 5А в качестве первого элюируемого энантиомера (изомер 1). ЭС/МС (m/z): 475,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R):1,56 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% МеОН (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФдетектирования: 225 нм. Выделяют указанное в заголовке соединение Примера 5В с получением второго элюируемого энантиомера (Изомер 2). ЭС/МС (m/z): 475,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 2 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 2,29 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% МеОН (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.
Пример 6А.
7-Фтор-5-(4-{2-[3 -(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси}фенил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3-с] хинолин-2ол, изомер 1.
Пример 6В.
7-Фтор-5-(4-{2-[3 -(фторметил)азетидин-1 -ил] этокси}фенил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3-с]хинолин-2-ол, изомер 2.
Т Т J н о hr
Разделяют два энантиомера 7-фтор-5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола при помощи хиральной СЖХ в следующих условиях: колонка: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 см; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (с 0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 80 г/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм, с получением Примера 6А в качестве первого элюируемого энантиомера (изомер 1). ЭС/МС (m/z): 475,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 1,32 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ
- 17 045961 детектирования: 225 нм. Выделяют указанное в заголовке соединение примера 6В с получением второго элюируемого энантиомера (изомер 2). ЭС/МС (m/z): 475,0 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение изомера 2 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, r(R>: 1,95 мины; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 35% МеОН (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.
Пример 8А.
-(4-{2-[3-(Фторметил)азетидин-1 -ил] этокси} фенил)-7-метил-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3-с]хинолин-2ол, изомер 1.
Пример 8В.
-(4-{2-[3-(Фторметил)азетидин-1 -ил] этокси} фенил)-7-метил-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3-с]хинолин-2ол, изомер 2.
Разделяют два энантиомера 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-7-метил-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола при помощи хиральной СЖХ в следующих условиях: колонка: CHIRALCEL® OD-H, 21x250 см; элюируют подвижной фазой 30% iPrOH (с 0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 80 г/мин; длина волны УФ-детектирования: 265 нм, с получением Примера 8А в качестве первого элюируемого энантиомера (изомер 1). ЭС/МС (m/z): 471,2 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 1 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 1,47 минуты; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% iPrOH (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФдетектирования: 225 нм. Выделяют указанное в заголовке соединение Примера 8В с получением второго элюируемого энантиомера (Изомер 2). ЭС/МС (m/z): 471,2 (М+Н). Подтверждают энантиомерное обогащение Изомера 2 при помощи хиральной аналитической СЖХ, >99% ее, t(R): 2,05 мины; колонка: CHIRALCEL® OD-H, 4,6x150 мм; элюируют подвижной фазой 30% iPrOH (0,2% IPA) в CO2; температура колонки: 40°С; скорость потока: 5 мл/мин; длина волны УФ-детектирования: 225 нм.
Пример 9.
-(4-{2-[3-(Фторметил)азетидин-1 -ил] этокси} фенил)-8-(трифторметил)-5Н- [ 1 ] бензопирано [4,3с]хинолин-2-ол, Изомер 2, бензолсульфоновая кислота.
Нагревают суспензию 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола, Изомер 2 (Пример 1В) (100 мг, 0,19 ммоль) в ACN (3 мл) при 50°С. Добавляют раствор моногидрата бензолсульфоновой кислоты (40 мг, 0,23 ммоль) в ACN (1 мл). Нагревают прозрачный желтый раствор в течение 10 мин при 50°С. Прекращают нагревание, позволяют реакционной смеси остыть до комнатной температуры и перемешивают смесь в течение ночи. Добавляют толуол (2 мл) и перемешивают реакционную смесь 2 ч. Раствор фильтруют, собирают образовавшееся твердое вещество и промывают твердое вещество ACN (1 мл). Сушат твердое вещество в вакууме, с получением указанного в заголовке соединения (74 мг, 55%).
Альтернативный синтез примера 9.
Нагревают суспензию 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола, Изомер 2 (Пример 1В) (124,1 мг, 0,24 ммоль) в MEK (4 мл) при 50°С. Добавляют раствор моногидрата бензолсульфоновой кислоты (50 мг, 0,28 ммоль), растворенный в MEK (1 мл). Прекращают нагревание, позволяют реакционной смеси остыть до комнатной температуры и перемешивают смесь в течение выходных. Концентрируют в потоке N2. Добавляют MEK (1 мл) и суспендируют с получением желтого кристаллического твердого вещества. Собирают твердое вещество, промывают MEK и сушат в вакууме при комнатной температуре с получением указанного в заголовке соединения (78,8 мг, 48%).
РД, пример 9.
Выполняют РД, как описано для примера 1В. Характеризуют полученный образец (4-{2-[3(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола, изомер 2, бензолсульфоновой кислоты по рентгенограмме с использованием излучения CuKa, имеющего дифракционные пики (значения 2-тета), как описано в табл. 4 ниже, и, в частности, имеющего пики при 20,5 в комбинации с одним или несколькими пиками, выбранными из группы, состоящей из 12,3, 22,2 и 23,1; с допуском на углы дифракции 0,2 градуса.
- 18 045961
Таблица 5
Пики рентгеновской порошковой дифракции кристаллического примера 9
| Пик | Угол (°2-тета) +/- 0,2° | Относительная интенсивность (% от наиболее интенсивного пика) |
| 1 | 7,6 | 27,10 |
| 2 | 10,6 | 34,50 |
| 3 | 12,3 | 42,10 |
| 4 | 12,6 | 32,30 |
| 5 | 17,7 | 32,80 |
| 6 | 19,2 | 26,70 |
| 7 | 20,5 | 100,00 |
| 8 | 22,2 | 45,50 |
| 9 | 23,1 | 36,30 |
| 10 | 24,2 | 29,80 |
Пример 10.
Кристаллический 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, 4-метилбензолсульфоновая кислота, изомер 2.
Объединяют вместе 5-(4-{2-[3-(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ол, Изомер 2 (Пример 1В) (204,2 г, 389 ммоль) и EtOAc (5 л) и переме шивают при 60°С с последующим добавлением МеОН (200 мл) при 60°С с получением прозрачного коричневого раствора. Добавляют указанный в заголовке продукт (11,48 г) для затравки раствора с последующим добавлением предварительно смешанного раствора 4-метилбензолсульфоновой кислоты; гидратируют (81,4 г, 428 ммоль) в EtOAc (800 мл) с получением желтой суспензии. Перемешивают суспензию 30 мин при 50°С. Концентрируют суспензию до 1/2 объема. Раствор охлаждают при комнатной температуре в течение 1 ч, фильтруют, собирают твердое вещество и промывают твердое вещество EtOAc. Сушат твердое вещество в вакууме при 30°С в течение выходных с получением указанного в заголовке соединения (239 г, 343 ммоль). Для дополнительной очистки материала добавляют указанное в заголовке соединение (229 г, 328,7 ммоль) и 2-пропанол (4,6 л) вместе и нагревают до 60°С в течение 2 ч. Охлаждают до комнатной температуры в течение 30 мин. Фильтруют твердое вещество и промывают водой (100 мл). Сушат твердое вещество в потоке N2 в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (174,4 г, 76,2%). Объединяют различные партии указанного в заголовке соединения, полученного по сути таким же образом, и добавляют гептан (2 л). Суспензию перемешивают в течение 30 мин, твердое вещество фильтруют и промывают гептаном (300 мл). Сушат собранное твердое вещество в потоке N2 в течение ночи с получением указанного в заголовке соединения (199,7 г, 99,5%).
РД, пример 10.
Выполняют РД, как описано для примера 1В. Характеризуют полученный образец 5-(4-{2-[3(фторметил)азетидин-1-ил]этокси}фенил)-8-(трифторметил)-5Н-[1]бензопирано[4,3-с]хинолин-2-ола, 4метилбензолсульфоновой кислоты, изомер 2 (пример 10) по рентгенограмме с использованием излучения CuKa, имеющего дифракционные пики (значения 2-тета), как описано в табл. 5 ниже, и, в частности, имеющего пики при 20,1 в комбинации с одним или несколькими пиками, выбранными из группы, состоящей из 12,8, 19,5 и 22,8; с допуском на углы дифракции 0,2 градуса.
- 19 045961
Таблица 6
Пики рентгеновской порошковой дифракции кристаллического примера 10
| Пик | Угол (°2-тета) +/- 0,2° | Относительная интенсивность (% от наиболее интенсивного пика) |
| 1 | 7,6 | 25,70 |
| 2 | 12,4 | 27,90 |
| 3 | 12,8 | 36,80 |
| 4 | 18,9 | 26,50 |
| 5 | 19,5 | 56,90 |
| 6 | 20,1 | 100,00 |
| 7 | 20,9 | 41,50 |
| 8 | 21,8 | 40,90 |
| 9 | 22,8 | 39,40 |
| 10 | 25,4 | 29,70 |
Биологические анализы.
Доказательства взаимосвязи между экспрессией РЭ и некоторыми видами рака хорошо известны в данной области.
Результаты следующих анализов демонстрируют, что соединения формулы I, формулы II и формулы III примеров представляют собой активные ССРЭ и считаются полезными при лечении рака.
Анализ конкурентного связывания РЭа (дикий тип), РЭа (мутант Y537S) и РЭв.
Целью следующих анализов конкурентного связывания РЭ является определение аффинности тестируемого соединения к РЭа (дикий тип), РЭа (мутант Y537S) и РЭв.
Запускают анализ конкурентного связывания в буфере, содержащем 50 мМ HEPES, pH 7,5, 1,5 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 1 мг/мл яичного альбумина и 5 мМ DTT, используя 0,025 мкКи на лунку 3Н-эстрадиола (118 Ки/ммоль, 1 мКи/мл), 7,2 нг/лунку РЭа (дикий тип), или 7,2 нг/лунка РЭа (Y537S мутант) или 7,7 нг/лунку РЭв . Добавляют тестируемое соединение в 10 различных концентрациях в диапазоне от 10000 нМ до 0,5 нМ и определяют неспецифическое связывание в присутствии 1 мкМ 17-в эстрадиола. Инкубируют реакцию связывания (140 мкл) в течение 4 часов при комнатной температуре, и затем добавляют холодный декстран-угольный буфер (70 мкл) (содержащий на 50 мл аналитического буфера 0,75 г древесного угля и 0,25 г декстрана) к каждой реакции. Перемешивают планшеты в течение 8 минут на орбитальном шейкере при 4°С, и затем центрифугируют при 3000 об/мин при 4°С в течение 10 мин. Переносят аликвоту (120 мкл) смеси в другой 96-луночный белый планшет с плоским дном (Costar) и добавляют сцинтилляционную жидкость Perkin Elmer Optiphase Supermix (175 мкл) в каждую лунку. Герметизируют планшеты и энергично встряхивают на орбитальном шейкере. После инкубации в течение 2,5 часов считывают данные планшетов на счетчике Wallac Microbeta. Рассчитывают IC50 с использованием 4-параметрической логистической кривой и рассчитывают % ингибирования при 10 мкМ. Преобразовывают значения IC50 для соединения в Ki, используя уравнение Ченга-Прусоффа. Результаты этого анализа демонстрируют, что Примеры 1, 1А и 1В (и другие) связываются с рекомбинантным РЭа дикого типа и мутантом РЭа (Y537S), как показано в табл. 7 ниже, и также было определено, что Пример 1В связывается с РЭв конкурируя с Ki (нМ) РЭв 0,11±0,07, n=3.
- 20 045961
Таблица 7 Результаты конкурентного связывания РЭа (дикий тип), РЭа (мутант Y537S) и РЭв
| № примера | К(нМ) РЭа (дикий тип) | К (нМ) РЭа (мутант Y537S) |
| 1 | 0,87 | 5,80 |
| 1А | 12,45 ±9,32, п=3 | 57,18 ± 39,13, п=3 |
| 1В | 0,31 ±0,38, п=5 | 2,79 ± 3,00, п=5 |
| 2 | 2,17 | 6,78 |
| 2А | 0,65 | 7,92 |
| 2В | 60,4 | 293,6 |
| 3 | 2,36 | 6,69 |
| ЗА | 8,И | 27,23 |
| ЗВ | 0,59 | 2,79 |
| 4 | 0,64 | 12,11 |
| 4А | 16,78 | 54,97 |
| 4В | 0,34 | 2,34 |
| 5 | 2,82 | 19,47 |
| 5А | 12,54 | 81,15 |
| 5В | 1,30 | 6,56 |
| 6 | 4,14 | 15,77 |
| 6А | 8,53 | 45,99 |
| 6В | 1,13 | 5,71 |
| 7 | 1,55 | 8,55 |
| 8 | 3,20 | П,4 |
| 8А | 9,33 | 66,94 |
| 8В | 0,94 | 5,44 |
Из приведенных в качестве примеров протестированных соединений, Ki для РЭа дикого типа находится в диапазоне от около 0,300 нМ до около 65 нМ. Ki для мутанта РЭа Y537S находится в диапазоне от около 2 до 300 нМ. Результаты этого анализа демонстрируют аффинность связывания и эффективность приведенных в качестве примеров соединений к белкам РЭа дикого типа, мутантам (ESR1 Y537S) и белкам РЭв.
Анализ разрушения РЭа в клетках MCF7.
Целью следующего анализа разрушаемости РЭа является измерение разрушаемости РЭа тестируемым соединением в РЭа-позитивной клеточной линии рака груди, такой как MCF7.
Культивируют клетки MCF7 (приобретенные у АТСС НТВ-22) в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 0,01 мг/мл человеческого инсулина 1 и 1% антибиотиков пенициллина/стрептомицина и помещают в 384-луночные планшеты с плоским дном при плотности 4000 клеток на лунку в среде DMEM (20 мкл) без фенолового красного, содержащей 10% очищенную от угля FBS. Клетки инкубируют в течение ночи в инкубаторе для культивирования клеток (5% CO2, относительная влажность 95% и 37°С) и позволяют клеткам прикрепится к планшету. На следующий день вводят в клетки тестируемое соединение. Используют акустический дозатор Echo 555 для получения серийных разведений тестируемого соединения (1:3) в диапазоне от 6 мкМ до 0,0003 мкМ. Дозируют клетки, добавляя 5 мкл из планшета для серийного разведения в планшет для клеток, получая конечную концентрацию DMSO 0,2% с диапазоном доз конечной концентрации тестируемого соединения от 2 до 0,0001 мкМ. Для максимальной точки используют среду, содержащую 0,2% DMSO, и для минимальной точки используют фулвестрант, разведенный до конечных концентраций 2 мкМ в среде для выращивания, содержащей 0,2% DMSO. После дозирования тестируе
- 21 045961 мого соединения инкубируют планшеты с клетками при 37°С и 5% CO2 в течение 24 ч. Фиксируют клетки, добавляя 14% параформальдегид (10 мкл) в течение 30 мин при комнатной температуре. Промывают клетки один раз PBS (20 мкл) и инкубируют с PBS (20 мкл), содержащим 0,5% (об./об.) TWEEN® 20, в течение 1 ч. Промывают клетки PBS, содержащим 0,05% TWEEN® 20 (2х), и блокируют 3% BSA в PBS, содержащем 0,05% TWEEN® 20 и 0,1% TRITON™ Х-100 (20 мкл/лунку), в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавляют 1:500 первичное антитело (20 мкл) (РЭа (Клон SP1) моноклональное антитело кролика №RM-9101-S, Thermo Scientific) в разведении 1% BSA в PBS, содержащем 0,05% TWEEN® 20 на лунку, закрывают планшеты и инкубируют в течение ночи при 4°С. На следующий день промывают клетки PBS, содержащим 0,05% TWEEN® 20 (2х), и инкубируют с вторичным антителом (20 мкл/лунку) (разведение 1:1000, козий антикроличий IgM ALEXA FLUOR™ 488) в PBS 1% BSA в течение 105 мин при комнатной температуре. После промывания планшетов PBS (2х20 мкл) добавляют РНКазу (Sigma) (20 мкл, 50 мкг/мл) и раствор йодида пропидия в PBS 1:1000 на лунку (20 мкл). Закрывают чашки и инкубируют 1 час при комнатной температуре на столе (в защищенном от света месте). Сканируют планшеты при помощи ACUMEN EXPLORER™ [лазерно-сканирующий флуоресцентный цитометр для планшетов, производимый ТТР LABTECH LTD] для измерения РЭа. Анализ изображений основан на клеточных флуоресцентных сигналах для идентификации позитивных клеток. Определяют РЭпозитивные клетки по средней интенсивности. Используют общую интенсивность 575-640 нм от йодида пропидия/ДНК для идентификации отдельных клеток. Результат анализа составляет % позитивных клеток РЭ. IC50 определяют путем аппроксимации кривой для логистического уравнения с четырьмя параметрами для каждого вывода с использованием GENE DATA™. Результаты этого анализа демонстрируют сильную разрушаемость РЭа, индуцированную соединениями формулы I, формулы II и формулы III, описанными в данном документе, в клетках MCF7 рака груди. Относительные значения IC50 для примеров 1, 1А и 1В показаны в табл. 8.
Таблица 8
Анализ разрушения РЭа в клетках MCF7
| Пример № | Относительная ICso (мкМ) |
| 1 | 0,003405 + 0,001086, п=3 |
| 1А | 0,3940 +0,1941, п=4 |
| 1В | 0,003088 + 0,001523, п=19 |
| 2 | 0,05220 + 0,006508, п=2 |
| 2А | 0,05125 + 0,01626, п=2 |
| 2В | >2 |
| 3 | 0,03347 + 0,007830, п=3 |
| ЗА | 0,3905 |
| ЗВ | 0,008664 |
| 4 | 0,02241 ±0,0003553, п=3 |
| 4А | 0,4998 |
| 4В | 0,006892 |
| 5 | 0,03653 + 0,03738, п=2 |
| 5А | 0,5221 |
| 5В | 0,009493 +0,001103, п=2 |
| 6 | 0,05086 + 0,006889, п=3 |
| 6А | 0,1753 |
| 6В | 0,009132 |
| 7 | 0,07879 + 0,007379, п=2 |
| 8 | 0,01738 + 0,008752, п=2 |
| 8А | 0,2341 |
| 8В | 0,009617 + 0,005198, п=2 |
| 10 | 0,004216 + 0,001619, п=2 |
- 22 045961
В частности, результаты в табл. 7 показывают сильное разрушение РЭа соединением примера 1 в клетках MCF7 рака груди. Для приведенных в качестве примеров протестированных соединений, относительная IC50 варьируется от 0,003 до >2 мкМ, что указывает на то, что все, кроме примера 2В, проявляли активность при тестируемой концентрации. Результаты этого анализа демонстрируют, что соединение формулы (I) представляет собой ССРЭ с сильной активностью разрушения РЭа в клетках.
Индукционный анализ РПа в клетках MCF7.
Цель следующего индукционного анализа РПа предназначена для определения, обладает ли тестируемое соединение агонистической активностью против рецептора РЭа (ожидается, что агонист активирует рецептор).
Культивируют MCF7 (приобретенные у АТСС НТВ-22) в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 0,01 мг/мл человеческого инсулина 1 и 1% антибиотиков пенициллина/стрептомицина и помещают клетки (до слияния на 70%) в 384-луночные планшеты с плоским дном с плотностью 4000 клеток на лунку в объеме 20 мкл в среде DMEM без фенолового красного, содержащей 10% FBS (очищенный от угля). Клетки инкубируют в течение ночи в инкубаторе для культивирования клеток (5% СО2, относительная влажность 95% и 37°С) и позволяют клеткам прикрепится к планшету. На следующий день вводят в клетки тестируемое соединение. Используют акустический дозатор Echo 555 для получения серийных разведений соединения (1:3) в диапазоне от 6 мкМ до 0,0003 мкМ. Дозируют клетки с добавлением тестируемого соединения (5 мкл) из планшета для серийного разведения в планшет с клетками, получая конечную концентрацию DMSO 0,2% с конечной концентрацией в диапазоне доз тестируемого соединения от 2 до 0,0001 мкМ. Для максимальной точки используют среду, содержащую 0,2% DMSO, а для минимальной точки используют фулвестрант, разведенный до конечных концентраций 2 мкМ в среде для выращивания, содержащей 0,2% DMSO. После дозирования тестируемого соединения инкубируют планшеты с клетками при 37°С и 5% CO2 в течение 24 ч. Фиксируют клетки, добавляя 14% параформальдегид (10 мкл) в течение 30 мин при комнатной температуре. Промывают клетки один раз PBS (20 мкл) и инкубируют с PBS (20 мкл), содержащим 0,5% (об./об.) TWEEN® 20, в течение 1 ч. Дважды промывают клетки PBS (20 мкл), содержащим 0,05% TWEEN® 20, и блокируют 3% BSA в PBS, содержащем 0,05% TWEEN® 20 и 0,1% TRITON™ Х-100 (20 мкл/лунку), в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавляют 1:500 первичных антител (20 мкл) (моноклональные антитела РП мыши к человеку, клон PgR 636 Dako, M3569) в разведении 1% BSA/PBS с 0,05 TWEEN® 20 на лунку, закрывают планшеты и инкубируют в течение ночи при 4°С.
На следующий день промывают клетки при помощи PBS 0,05% TWEEN® 20 (2x20 мкл) и инкубируют со вторичным антителом (20 мкл/лунку) (разведение 1:1000, козий антикроличий IgM ALEXA FLUOR™ 488) в PBS 1% BSA в течение 105 мин при комнатной температуре. После промывания PBS (2x20 мкл) добавляют РНКазу (20 мкл, 50 мкг/мл) (Sigma) и разводят йодидом пропидия 1:1000 в PBS на лунку. Герметизируют планшеты и инкубируют 1 час при комнатной температуре на столе (в защищенном от света месте). Сканируют планшеты при помощи ACUMEN EXPLORER™ [лазерный сканирующий флуоресцентный цитометр для микропланшетов, производимый ТТР LABTECH LTD] для измерения РПа. Анализ изображений основан на клеточных флуоресцентных сигналах для идентификации позитивных клеток. Определяют РП-позитивные клетки по средней интенсивности. Используют общую интенсивность 575-640 нм от йодида пропидия/ДНК для идентификации отдельных клеток. Результат анализа составляет % позитивных клеток РП. IC50 определяли путем аппроксимации кривой для логистического уравнения с четырьмя параметрами для каждого вывода с использованием GENE DATA™. Результаты этого анализа не демонстрируют значительной агонистической активности Примеров 1, 1А и 1В в отношении клеток MCF7 рака груди. Для тестируемых соединений относительные IC50 в этом анализе составляют >2 мкМ. Результаты этого анализа демонстрируют отсутствие значительной агонистической активности приведенных в качестве примеров соединений, тестируемых в отношении клеток MCF7 рака груди. Эти результаты также демонстрируют, что приведенные в качестве примера тестируемые соединения являются антагонистами РЭа в клетках MCF7 рака груди (т.е. они обладают активностью ССРЭ).
Анализ ингибирования РПа (функциональный антагонизм РЭа) в клетках MCF7-ESR1 Y537N 682 CRISPR.
Цель следующего анализа ингибирования РПа (функциональный антагонизм РЭа) в клетках предназначен для определения антагонистической активности тестируемого соединения против мутантного рецептора РЭа Y537N. Ожидается, что антагонист в этом анализе блокирует функцию РЭа рецептора. РПа является нижестоящей транскрипционной мишенью РЭа, и, следовательно, ожидается, что антагонист РЭа будет ингибировать экспрессию РПа.
Культивируют MCF7-ESR1 Y537N-682 (сгенерированная редактированием гена CRISPR/Cas9 гена ESR1 в клетках MCF7, клон № 682) в среде DMEM с добавлением 10%
FBS и 1% антибиотиков пенициллина/стрептомицина и помещают клетки (до достижения 70% конфлюэнтности) в 384-луночные планшеты с плоским дном при плотности 4000 клеток на лунку в среде
- 23 045961
DMEM, не содержащей фенолового красного, 10% FBS (объем 20 мкл) (очищенный уголь). Клетки инкубируют в течение ночи в инкубаторе для культивирования клеток (5% СО2, относительная влажность 95% и 37°С) и позволяют клеткам прикрепится к планшету. На следующий день вводят в клетки тестируемое соединение. Используют акустический дозатор Echo 555 для получения серийных разведений соединения (1:3) в диапазоне от 6 мкМ до 0,0003 мкМ. Дозируют клетки, добавляя 5 мкл из планшета для серийного разведения в планшет для клеток, с получением конечной концентрации DMSO 0,2% с диапазоном доз конечной концентрации тестируемого соединения от 2 до 0,0001 мкМ. Для максимальной точки используют среду, содержащую 0,2% DMSO, и для минимальной точки используют фулвестрант, разведенный до конечных концентраций 2 мкМ в среде для выращивания, содержащей 0,2% DMSO. После дозирования тестируемого соединения инкубируют планшеты с клетками при 37°С и 5% CO2 в течение 72 ч. Фиксируют клетки, добавляя 14% параформальдегид (10 мкл) в течение 30 мин при комнатной температуре. Промыть клетки PBS (1x20 мкл) и инкубируют с PBS (20 мкл), содержащим 0,5% (об./об.) TWEEN® 20 в течение 1 ч. Промывают клетки PBS (2x20 мкл), 0,05% TWEEN® 20 и блокируют 3% BSA/PBS 0,05% TWEEN® 20, 0,1% TRITON™ X-100 (20 мкл/лунку) в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавляют 1:500 первичных антител (20 мкл) (моноклональные антитела РП мыши к человеку, клон PgR 636 Dako, М3569) в разведении 1% BSA/PBS с 0,05 TWEEN® 20 на лунку, герметизируют планшеты и инкубируют в течение ночи при 4°С.
На следующий день промывают клетки PBS 0,05% ® (2x20 мкл) и инкубируют со вторичным антителом (20 мкл/лунку) (разведение 1: 1000, козий антикроличий IgM ALEXA FLUOR™ 488) в PBS 1% BSA в течение 105 мин при комнатной температуре. После промывания PBS (2x20 мкл) добавляют РНКазу (20 мкл, 50 мкг/мл) (Sigma) и разводят йодидом пропидия 1:1000 в PBS на лунку. Герметизируют чашки и инкубируют 1 час при комнатной температуре на столе (в защищенном от света месте). Сканируют планшеты при помощи ACUMEN EXPLORER™ (лазерный сканирующий флуоресцентный цитометр для планшетов, производимый ТТР LABTECH LTD) для измерения РПа. Анализ изображений основан на клеточных флуоресцентных сигналах для идентификации позитивных клеток. Определяют ПРпозитивные клетки по средней интенсивности. Используют общую интенсивность 575-640 нм от йодида пропидия/ДНК для идентификации отдельных клеток. Результат анализа составляет % позитивных клеток РП. IC50 определяют путем аппроксимации кривой для логистического уравнения с четырьмя параметрами для каждого вывода с использованием GENE DATA™.
Результаты этого анализа демонстрируют сильное ингибирование РПа и функциональный антагонизм примеров 1, 1А и 1В в клетках MCF7 (ESR1 Y537N, гетерозиготный мутант) рака груди. Относительные значения IC50 примеров 1, 1А и 1В (и других) в этом анализе показаны в табл. 9 ниже. Относительные IC50 тестируемых примеров соединений находятся в диапазоне от около 0,0118 до >1,6 мкМ, что указывает на то, что приведенные в качестве примеров соединения являются сильными антагонистами мутанта РЭа (Y537N) и сильными ингибиторами транскрипции, опосредованной РЭа, за исключением примера 2В 1,6 мкМ). РПа (PGR) также является мишенью транскрипции РЭа, и результаты этого анализа демонстрируют сильное ингибирование опосредованной РЭа транскрипции РПа.
- 24 045961
Таблица 9
Анализ ингибирования РПа (функциональный антагонизм РЭа) в клетках MCF7 Y537N 682 CRISPR
| Пример № | Относительная 1С50 (мкМ) |
| 1 | 0,01679 ± 0,00003, п=2 |
| 1А | 1,20 + 0,29, п=2 |
| 1В | 0,0130 ± 0,0059, п=14 |
| 2 | 0,01451 ±0,002619, п=2 |
| 2А | 0,02494 ±0,007386, п=3 |
| 2В | 1,639 +0,2228, п=3 |
| 3 | 0,07717 ±0,01154, п=2 |
| ЗА | 0,6117 |
| ЗВ | 0,016 |
| 4 | 0,03854 + 0,003865, п=2 |
| 4А | 0,5052 |
| 4В | 0,01181 |
| 5 | 0,06614 + 0,01551, п=2 |
| 5А | 0,3945 |
| 5В | 0,01822 + 0,009815, п=2 |
| 6 | 0,06319 ±0,01609, п=2 |
| 6А | 0,2364 |
| 6В | 0,0136 |
| 7 | 0,1271 |
| 8 | 0,04124 + 0,006572, п=2 |
| 8А | 0,4335 + 0,1946, п=3 |
| 8В | 0,008926 ± 0,003828, п=3 |
| 10 | 0,007936 ±0,003163, п=3 |
Анализ ингибирования РПа (функциональный антагонизм РЭа) в клетках MCF7.
Цель следующего анализа ингибирования РПа (функциональный антагонизм РЭа) в клетках предназначен для определения антагонистической активности тестируемого соединения против рецептора РЭа. Ожидается, что антагонист в этом анализе блокирует функцию рецептора РЭа. РПа является нижестоящей транскрипционной мишенью РЭа, и, следовательно, ожидается, что антагонист РЭа будет ингибировать экспрессию РПа.
Выполняют условия анализа, как подробно описано в анализе Acumen основанном на клеточном разрушении РЭа выше, используя линию клеток MCF7, за исключением того, что перед распределением тестируемого соединения удаляют среду с планшета и предварительно обрабатывают все лунки, кроме лунок с отрицательным контролем (столбец 24 планшета), аналитической средой, содержащей 0,47 нМ эстрадиола, в течение 30 мин. В этом анализе проводят иммуноокрашивание для обнаружения РПа и сканируют планшеты при помощи ACUMEN EXPLORER™ [лазерный сканирующий флуоресцентный цитометр для микропланшетов, производимый ТТР LABTECH LTD] для измерения РПа. Анализ изображений основан на клеточных флуоресцентных сигналах для идентификации позитивных клеток. Определяют РПа-позитивные клетки по средней интенсивности. Используют общую интенсивность 575640 нм от йодида пропидия/ДНК для идентификации отдельных клеток. Результат анализа составляет % РПа-позитивных клеток. IC50 определяют путем аппроксимации кривой для логистического уравнения с четырьмя параметрами для каждого вывода с использованием GENE DATA™. Результаты этого анализа демонстрируют сильное ингибирование РПа и функциональный антагонизм Примеров 1, 1А и 1В в клетках MCF7 рака груди. Относительные IC50 Примеров 1, 1А и 1В в этом анализе показаны в Таблице 10 ниже. Относительные IC50 приведенных в качестве примеров соединений находится в диапазоне от
- 25 045961 около 0,029 до >2 мкМ, что указывает на то, что все приведенные в качестве примеров соединения, за исключением 1А и 2В, являются сильными антагонистами белка дикого типа РЭа и сильными ингибитором транскрипции, опосредованной РЭа. РПа (PGR) также является мишенью транскрипции РЭа, и результаты этого анализа демонстрируют сильное ингибирование опосредованной РЭа транскрипции РПа в тестируемой концентрации.
Таблица 10
Анализ ингибирования РПа (функциональный антагонизм РЭа) в клетках MCF7
| Пример № | Относительная 1Сэо (мкМ) |
| 1 | 0,1283 ±0,0226, п=3 |
| 1А | >2,000 |
| 1В | 0,04129 + 0,03370, п=16 |
| 2 | 0,1634 |
| 2А | 0,1215 + 0,05368, п=2 |
| 2В | >2,000 |
| 3 | 0,07666 ±0,02101, п=3 |
| ЗА | 0,9274 |
| ЗВ | 0,03435 |
| 4 | 0,07626 ±0,1676, п=3 |
| 4А | 0,8465 |
| 4В | 0,02866 |
| 5 | 0,1180 + 0,01230, п=2 |
| 5А | 0,6002 |
| 5В | 0,03203 + 0,005306, п=2 |
| 6 | 0,08258 + 0,005682, п=3 |
| 6А | 0,2528 |
| 6В | 0,02835 |
| 7 | 0,1134 + 0,02087, п=2 |
| 8 | 0,06835 ±0,02273, п=2 |
| 8А | 0,2058 |
| 8В | 0,04848 ± 0,02944, п=2 |
| 10 | 0,02633 + 0,004459, п=3 |
Анализ пролиферации клеток в MCF7 и MCF7-ESR1 Y537N-682.
Целью следующих анализов пролиферации клеток обычно является определение того, оказывает ли тестируемое соединение влияние на пролиферацию клеток.
Высевают клетки MCF7 (приобретенные у АТСС НТВ-22) с плотностью 2000 клеток на лунку в среде DMEM, свободной от фенолового красного, 10% FBS (объем 20 мкл) (очищенный от угля) в 384луночный планшет для культивирования клеток с прозрачным дном. Помещают MCF7-ESRY537N -682 (сгенерированные посредством редактирования гена CRISPR/Cas9 гена ESr1 в клетках MCF7, клон №682) в среду DMEM с добавлением 10% FBS и 1% антибиотиков пенициллина/стрептомицина при плотности 1000 клеток на лунку. Инкубируют планшеты при 37°С и 5% CO2. На следующий день вводят в клетки тестируемое соединение. Используют акустический дозатор Echo 555 для получения серийных разведений тестируемого соединения (1:3) в диапазоне от 60 мкМ до 0,003 мкМ. Дозируют клетки, добавляя 5 мкл из планшета для серийного разведения в планшет для клеток с получением конечной концентрации DMSO 0,2% с диапазоном доз конечной концентрации тестируемого соединения от 20 до 0,001 мкМ. Для максимальной точки используют среду, содержащую 0,2% DMSO, и для минимальной точки используют фулвестрант, разбавленный до конечных концентраций 2 мкМ в среде для выращивания, содержащей 0,2% DMSO. После дозирования тестируемого соединения инкубируют планшеты с
- 26 045961 клетками при 37°С и 5% СО2. Через семь дней после добавления тестируемого соединения вынимают планшеты из инкубатора и добавляют 96% холодного EtOH (65 мкл) в каждую лунку. Через 30 мин удаляют среду и добавляют РНКазу (20 мкл, 50 мкг/мл) (Sigma) и раствор йодида пропидия 1:1000 в PBS на лунку. Герметизируют планшеты и инкубируют 1 час при комнатной температуре на столе (в защищенном от света месте). Сканируют планшеты при помощи ACUMEN EXPLORER™ [лазерный сканирующий флуоресцентный цитометр для планшетов, производимый ТТР LABTECH LTD]. Клеточная линия MCF-7 растет, образуя агрегаты, количество клеток как количество объектов не может быть использовано для считывания; таким образом, количество клеток может быть оценено при помощи предполагаемого количества клеток (рассчитывается при помощи параметра площади (отношение общей площади к общей популяции клеток (заданный диапазон пиковой интенсивности FL-1 (ПИ) и средней площади популяции отдельных клеток (определяется по периметру)). IC50 определяют путем аппроксимации кривой для логистического уравнения с четырьмя параметрами для каждого вывода с использованием GENE DATA™. Относительные IC50 Примеров 1, 1А и 1B (и других) в клетках MCF7 ESR1 дикого типа и мутантных клетках MCF7-ESR1 Y537N показаны в табл. 10 ниже. Результаты этого анализа демонстрируют сильную антипролиферативную активность и ингибирование роста клеток при помощи примеров 1, 1А и 1В (и других) в клетках MCF7 (ESR1 дикого типа) и MCF7 (мутант ESR1 Y537N) рака груди. Относительные IC50 приведенных в качестве примеров соединений находятся в диапазоне от около 0,0035 до 1,176 мкМ в MCF7 ESR1 дикого типа и от 0,014 до 1,86 мкМ в клетках MCF7 (мутант ESR1 Y537N) рака груди, что указывает на то, что все приведенные в качестве примера соединения демонстрируют сильную антипролиферативную активность и ингибирование роста клеток MCF7 (ESR1 дикого типа) и MCF7 (мутант ESR1 Y537N) рака груди.
- 27 045961
Таблица 11
Анализ пролиферации клеток в MCF7 и MCF7-ESR1Y537N-682
| Пример № | Относительная 1Сэо (мкМ) MCF7 ESR1 дикого типа | Относительная 1Сэо (мкМ) мутантных клеток MCF7 ESR1 Y537N |
| 1 | 0,00768 +0,01263, п=3 | 0,0321 + 0,0068, п=2 |
| 1А | 1,18 + 0,68, п=4 | 1,86 + 1,03, п=4 |
| 1В | 0,00349 + 0,00225, п=11 | 0,0167 ±0,0091, п=12 |
| 2 | 0,00425 | 0,05113 |
| 2А | 0,00612 | 0,04284 + 0,002666, п=2 |
| 2В | 0,4053 | 0,7777 |
| 3 | 0,3287 | 0,02394 |
| ЗА | 0,303 | 0,6169 ±0,1735, п=3 |
| ЗВ | 0,008785 | 0,02144 ±0,008938, п=3 |
| 4 | 0,02861 | 0,02664 |
| 4А | 0,2862 | 0,5442 ±0,2181, п=3 |
| 4В | 0,003496 | 0,01433 ±0,004925, п=3 |
| 5 | 0,08009 | 0,07252 + 0,02632, п=2 |
| 5А | 0,4095 | 0,5167 + 0,09497, п=3 |
| 5В | 0,007666 | 0,02131 +0,01300, п=3 |
| 6 | 0,05128 | 0,02362 |
| 6А | 0,0759 | 0,3234 ±0,1758, п=3 |
| 6В | 0,01539 | |
| 7 | 0,01902 | 0,04479 ± 0,01188, п=2 |
| 8 | 0,04157 | 0,03290 ± 0,003002, п=2 |
| 8А | 0,1743 | 0,6621 ±0,1173, п=2 |
| 8В | 0,005083 | 0,01419 ±0,01108, п=2 |
| 10 | 0,004379 | 0,01059 |
Анализ целевого ингибирования In Vivo (ЦИ IV) (анализ PGR RT-qPCR) в опухолях MCF7.
Целью этого анализа ЦИ IV является измерение способности тестируемого соединения (ССРЭ) ингибировать экспрессию (транскрипцию) гена РПа ниже РЭа в ксенотрансплантированных опухолях, имплантированных мышам.
Имплантируют самкам мышей NOD SCID (22-25 г) от Envigo RMS, Inc., Мэдисон, Висконсин подкожно 5х10е6 РЭ-позитивные клетки MCF7 рака груди (АТСС, № НТВ-22) в область правого фланга в 1:1 раствор HBSS+MATRIGEL™ (200 мкл). Имплантируют гранулы 17-β эстрадиола (0,18 мг/гранула, высвобождение 90 дней, от Innovative Research) подкожно за 1 день до имплантации опухолевых клеток. Измеряют рост опухоли и массу тела дважды в неделю, начиная с седьмого дня после имплантации. Когда размер опухоли достигнет 250-350 мм3, рандомизируют животных и группируют их в группы по пять животных. Вводят животным несколько доз тестируемого соединения в специфическом для тестируемого соединения носителе (1% гидроксиэтилцеллюлоза/0,25% TWEEN® 80/0,05% пеногаситель в очищенной воде) или только носителем перорально в течение 3 дней и собирают опухоли и кровь через желаемые интервалы времени после последней дозы. Умерщвляют животных используя анестезию изофлураном и вывих шейных позвонков. Быстро замораживают опухоли и хранят при -80°С до обработки для выделения РНК и анализа РВ-кПЦР. Собирают кровь в пробирки с EDTA, замедляют вращение для сбора плазмы и замораживают при -80°С в 96-луночном планшете. Определяют воздействие тестируемого соединения при помощи масс-спектрометрии.
Измельчают опухоли в жидком азоте и лизируют в буфере для лизиса 1 хРНК (из наборов для выде
- 28 045961 ления РНК) с использованием шариков Matrix D (MP Biomedical, № 6913-500) в машине FASTPREP-24™ Cell Disrupter (MP Biomedical). Переносят лизаты опухолей в свежие пробирки после вращения при 14000 об/мин в течение 20 мин при 4°С. Выделяют РНК из опухолевых лизатов при помощи набора PURELINK® RNA Mini (Invitrogen № 12183018А) или RNeasy Mini Kit (Qiagen № 74104 и № 74106). Удаляют загрязнения ДНК при помощи набора PURELINK® DNase (Invitrogen № 12185010) или набора RNase-Free DNase (Qiagen № 79254). Измеряют концентрацию выделенной РНК, разбавив образцы водой, свободной от РНКазы, и измеряют поглощение при 260 нм на считывателе для планшетов (SpectraMax190). Вычитают среднее измерение поглощения при 260 нм пустого опыта (только вода, не содержащая РНКазу) из измерений при 260 нм всех других образцов РНК. Разводят образцы РНК до равных концентраций в воде, свободной от РНКазы. Синтезируют кДНК из разбавленной РНК, используя систему синтеза первой цепи для РВ-ПЦР (Invitrogen, № 18080-051). Для проведения РВ-кПЦР, сначала разбавляют кДНК в воде, свободной от РНКазы. Объединяют 2х Absolute Blue qPCR ROX Mix (Thermo, № AB-4139/A), праймер PGR (Thermo, Hs01556702_m1) и разведенную кДНК для каждой реакции в планшете для PCR (Applied Biosystems, № 4309849). Амплифицируют кДНК, инкубируя образцы в течение 2 минут при 50°С, а затем 15 мин при 95°С в термоциклере (севентатор ABI Prism 7900НТ). Продолжают инкубировать при 95°С в течение 15 секунд, а затем при 50°С в течение 60 секунд, всего 40 циклов. Циклы нормализованы по домашнему гену и используются для расчета % ингибирования PGR по сравнению с одним носителем. Анализируют каждый образец в двух экземплярах и используют средние числа для расчетов. Рассчитывают целевой процент ингибирования (PGR) при помощи Excel и XL Fit.
Результаты этого анализа демонстрируют, что Пример 1В ингибирует экспрессию РПа (PGR) в модели ксенотрансплантированной опухоли. Пример 1В ингибирует экспрессию РПа (PGR) на ~78% в модели ксенотрансплантированной опухоли в течение 24 ч с дозой 30 мг/кг при пероральном введении. Эти результаты демонстрируют значительное и устойчивое ингибирование антагонистической активности РЭа и опосредованной РЭа транскрипционной активности in vivo на модели ксенотрансплантированной опухоли.
Исследование ингибирования роста опухоли in vivo на РЭ-позитивных (ESR1 дикого типа) моделях ксенотрансплантированной опухоли рака груди, имплантированной мышам.
Целью следующего анализа ингибирования ксенотрансплантированной опухоли является измерение уменьшения объема опухоли в ответ на введение тестируемого соединения.
Размножают клетки MCF7 рака груди человека (АТсС № НТВ-22) и НСС1428 (АТСС № CRL-2327) в культуре, собирают и вводят 5х10е6 клеток в растворе HBSS+MATRIGEL™ 1:1 (200 мкл) подкожно на задний правый бок самок мышей NOD SCID (22-25 г, Envigo RMS, Inc). За двадцать четыре часа до имплантации клеток имплантируют гранулы эстрогена (0,18 мг/гранулу, 17β эстрадиол, высвобождение 90 дней, Innovative Research) подкожно. Размножают клетки T47D рака груди человека (АТСС № НТВ22) в культуре, собирают и вводят 5х10е6 клеток в растворе HBSS+MATRIGEL™ 1:1 (200 мкл) подкожно на задний правый бок самок мышей NOD SCID (22-25 г, Envigo RMS, Inc). За 24 часа до имплантации клеток имплантируют гранулы эстрогена (0,38 мг/гранулу, 17β эстрадиол, высвобождение 90 дней, Innovative Research) подкожно. Размножают клетки ZR-75-1 рака груди человека (АТСС № CRL-1500) в культуре, собирают и вводят 5х10е6 клеток в растворе HBSS+MATRIGEL™ 1:1 (200 мкл) подкожно на задний правый бок самок мышей NOD SCID (22-25 г, Envigo RMS, Inc). За двадцать четыре часа до имплантации клеток животным вводят внутримышечно (10 мг/мл) 50 мкл эстрадиола валерата (Delestrogen®), и затем один раз каждые 14 дней в течение всего исследования. Измеряют рост опухоли и массу тела дважды в неделю, начиная с седьмого дня после имплантации. Когда размеры опухоли достигают 250-350 мм3, животных рандомизируют и группируют в группы по 5 животных. Готовят тестируемое соединение, пример 1В в подходящем носителе (1% гидроксиэтилцеллюлоза/0,25% TWEEN® 80/0,05% пеногаситель в очищенной воде) и вводят через желудочный зонд в течение 28 дней, QD. Определяют ответ опухоли путем измерения объема опухоли два раза в неделю в течение курса лечения. При измерении объема опухоли в качестве общей меры токсичности принимают массу тела.
Было обнаружено, что соединение примера 1В имеет значения дельта Т/С%, как показано в табл. 12 ниже. Эти результаты показывают, что соединение примера 1В демонстрирует хорошую пероральную биодоступность у мышей и значительную противоопухолевую активность или регрессию опухоли на РЭпозитивных (ESR1 дикого типа) ксенотрансплантированных моделях рака груди человека.
- 29 045961
Таблица 12
Исследование ингибирования роста опухоли in vivo на ксенотрансплантированных моделях РЭ-позитивного рака груди, имплантированного мышам
| Модель опухоли | Доза (мг/кг) | Дельта Т/С% или % регрессии | р-значение |
| MCF7 (Ксенотрансплантат рака груди) | 3 | -26 | 0,001* |
| 10 | -46 | <0,001* | |
| 30 | -36 | <0,001* | |
| T47D (Ксенотрансплантат рака груди) | 3 | 30 | 0,008* |
| 10 | -И | <0,001* | |
| 30 | -28 | <0,001* | |
| ZR-75-1 (Ксенотрансплантат рака груди) | 3 | 4 | <0,001* |
| 10 | 0 | <0,001* | |
| 30 | 19 | <0,001* | |
| НСС1428 (Ксенотрансплантат рака груди) | 10 | -45 | <0,001* |
| 30 | -22 | <0,001* |
Анализ объема опухоли основан на ковариационной структуре Log 10 и SpatialPower.
*: значительно (р<0,05) по сравнению с растворителем контролем
Дельта Т/С% рассчитывают, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли. Формула 100*(Т-Т0)/(С-С0), в которой Т и С являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. Т0 и С0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах.
% регрессии рассчитывают, когда конечный объем ниже исходного. Формула 100*(Т-Т0)/Т0, в которой Т0 - средний исходный объем опухоли для обработанной группы.
Общее среднее значение всех групп от исходного уровня (рандомизация) на 32 день используется для вычисления % изменения Т/С.
Исследование ингибирования роста опухоли in vivo на модели опухоли (ST941/HI) в мутантной ESR1 (Y537S) рака груди PDX, имплантированной мышам.
Целью следующего анализа ингибирования ксенотрансплантированной опухоли является измерение уменьшения объема опухоли в ответ на введение тестируемого соединения в мутантный ESR1 и независимую от гормонов (HI) ксенотрансплантированную (PDX) модель рака груди, полученную от пациента.
Модель ST941/HI PDX была разработана и выпущена South Texas Accelerated Research Therapeutics (Сан-Антонио, Техас). Фрагменты опухоли собирали у животных-хозяев и имплантировали мышам с иммунодефицитом (лаборатория Джексона), и исследование начинали при среднем объеме опухоли около 125-250 мм3. Получают тестируемое соединение, пример 1В в подходящем носителе (1% гидроксиэтилцеллюлоза/0,25% TWEEN® 80/0,05% пеногасителя в очищенной воде) и вводят через желудочный зонд в течение 28 дней. Определяют ответ опухоли путем измерения объема опухоли два раза в неделю в течение курса лечения. При измерении объема опухоли в качестве общей меры токсичности принимают массу тела.
Было обнаружено, что соединение примера 1В имеет значения дельта Т/С%, как показано в табл. 13 ниже. Эти результаты показывают, что соединение Примера 1В демонстрирует хорошую пероральную биодоступность у мышей и значительную противоопухолевую активность или регрессию опухоли в модели PDX рака груди человека с мутантным ESR1 (Y537S).
- 30 045961
Таблица 13
Исследование ингибирования роста опухоли in vivo на модели опухоли PDX мутантного ESR1 рака груди, имплантированной мышам
| Модель опухоли | Доза (мг/кг) | График | Дельта Т/С% или % регрессии | р-значение |
| ST941C/HI (модель PDX мутантного ESR1 рака груди) | 3 | QD | 66 | 0,213 |
| 10 | QD | 15 | <0,001* | |
| 30 | QD | 6 | <0,001* |
Анализ объема опухоли основан на ковариационной структуре Log 10 и SpatialPower.
*: значительно (р<0,05) по сравнению с растворителем контролем
Дельта Т/С% рассчитывали, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли. Формула 1ОО*(Т-То)/(С-Со), в которой Т и С являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. Т0 и С0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах.
% регрессии рассчитывается, когда конечный объем ниже исходного. Формула 1ОО*(То)/То, в которой Т0 - средний исходный объем опухоли для обработанной группы.
Общее среднее значение всех групп от исходного уровня (рандомизация) на 32 день используется для вычисления % изменения Т/С.
Комбинированные исследования
Из-за неоднородности опухоли и приобретенной устойчивости к эндокринной терапии, комбинированная терапия стала незаменимой при лечении РЭ-позитивного и распространенного/метастатического рака груди для эффективной терапии или преодоления приобретенной устойчивости. Мы протестировали комбинированный эффект Примера 1В с ингибитором CDK4/6 - абемациклибом, ингибитором mTOR - эверолимусом, ингибитором PIK3CA - алпелисибом и ингибитором PI3K/mTOR - 8-[5-(1-гидрокси-1метилэтил)пиридин-3-ил]-1-[(2S)-2-метоксипропил]-3-метил-1,3-дигидро-2Н-имидазо[4,5-с]хинолин-2оном (Соединение А) в пяти РЭ-позитивных линиях клеток рака груди in vitro. Анализ жизнеспособности клеток для комбинированных исследований Высевают клетки с плотностью, указанной в табл. 14 ниже, в объеме среды 20 мкл, описанной в таблице, в 384-луночный планшет с прозрачным дном для культивирования клеток.
Таблица 14
Информация о клеточной линии для анализа жизнеспособности клеток
| Клеточная линия | Плотность высевания | Коммерческая ссылка | Среда | Время фиксации (часы) |
| T-47D | 1000 | ATCC НТВ-133 | RMPI 10% FBS 1% П/С, 0,008 мг/мл бычьего инсулина | 72 |
| MCF-7 | 1000 | ATCC НТВ-22 | DMEM 10% FBS 1% П/С 0,01 мг/мл человеческого инсулина | 96 |
| EFM-19 | 3000 | АСС 231 | RMPI 10% FBS 1% П/С | 144 |
| ZR-75-1 | 1000 | ATCC CRL-1500 | RMPI10% FBS 1% П/С | 144 |
| ВТ-474 | 1000 | ATCC НТВ-20 | HYBRI-CARE (1 л Н2О, 1,5 г/л бикарбоната натрия, 10% FBS, 1% П/С) | 144 |
| ZR-75-30 | 1000 | ATCC CRL-1504 | RMPI 10% FBS 1% П/С | 240 |
Инкубируют планшеты при 37°С и 5% CO2. На следующий день вводят в клетки тестируемое со- 31 045961 единение, пример 1В.
Получают соединения в виде 10 мМ исходных растворов DMSO и используют для исследования ответа на дозу с максимальной концентрацией, начиная с 10 или 1 мкМ, два соединения, тестируемых вместе при фиксированном соотношении, и затем полученные серийные разведения 1:3, а также соединения по отдельности для определение IC50 с начальной концентрацией 20 мкМ. Дозируют клетки путем добавления 5 мкл из планшета для серийного разведения в планшет для клеток, получая конечную концентрацию DMSO 0,2% с диапазоном конечной дозы тестируемого соединения от 20 до 0,001 мкМ для однократной обработки или меньшего диапазона для комбинаций. Для максимальной точки используют среду, содержащую 0,2% DMSO, и для минимальной точки используют стауроспорин, разведенный до конечных концентраций 2 мкМ в среде для выращивания, содержащей 0,2% DMSO. После дозирования тестируемого соединения инкубируют планшеты с клетками при 37°С и 5% CO2. После двукратной инкубации с соединениями вынимают планшеты из инкубатора и добавляют 96% холодный EtOH (65 мкл) в каждую лунку. Через 30 мин удаляют среду и добавляют РНКазу (20 мкл, 50 мкг/мл) (Sigma) и раствор йодида пропидия 1:1000 в PBS на лунку. Герметизируют планшеты и инкубируют 1 час при комнатной температуре (в защищенном от света месте). Сканируют планшеты при помощи ACUMEN EXPLORER™ [лазерный сканирующий флуоресцентный цитометр для планшетов, производимый ТТР LABTECH LTD]. Поскольку некоторые клеточные линии растут, образуя агрегаты, число клеток как число объектов может не использоваться для считывания; поэтому для оценки количества клеток используется общая популяция площади (обозначенный диапазон пиковой интенсивности FL-1 (ПИ)) или общая интенсивность ПИ.
Данные комбинации in vitro предполагают синергизм (как определено ниже) с комбинацией примера 1В с абемациклибом или эверолимусом в 5 из 5 РЭ-позитивных клеточных линий рака груди, как показано в табл. 15. Комбинация примера 1В с соединением А синергична в 4 из 4 испытанных линий РЭпозитивных клеток рака груди. Комбинированный эффект примера 1В с алпелисибом является аддитивным в 2 из 4 РЭ-позитивных клеточных линиях рака груди и синергичным в 2 из 4 РЭ-позитивных клеточных линиях рака груди.
- 32 045961
Таблица 15
Комбинация in vitro примера 1B с другими целевыми агентами в РЭ-позитивных клеточных линиях рака груди
| Клеточн ая линия рака груди | Обработ ка 1 | Обработка 2 | Индекс комбиниро вания (CI50) | Статистическая интерпретация | Биологическая интерпретация |
| MCF7 | Пример 1В | Абемациклиб | 0,2675 | Синергический | Аддитивный |
| Эверолимус | 0,0389 | Синергический | Синергический | ||
| T47D | Пример 1В | Абемациклиб | 0,2693 | Синергический | Синергический |
| Эверолимус | 0,0609 | Синергический | Синергический | ||
| Алпелисиб | 0,0818 | Синергический | Синергический | ||
| Соединение А | 0,2401 | Синергический | Синергический | ||
| ZR-75-1 | Пример 1В | Абемациклиб | 0,2067 | Синергический | Синергический |
| Эверолимус | 0,1853 | Синергический | Синергический | ||
| Алпелисиб | 1,3717 | Аддитивный | Аддитивный | ||
| Соединение А | 0,3768 | Синергический | Синергический | ||
| ZR-75-30 | Пример 1В | Абемациклиб | 0,3960 | Синергический | Синергический |
| Эверолимус | 0,1248 | Синергический | Синергический | ||
| Алпелисиб | 0,4149 | Аддитивный | Аддитивный | ||
| Соединение А | 0,7098 | Синергический | Синергический | ||
| EFM-19 | Пример 1В | Абемациклиб | 0,3455 | Синергический | Синергический |
| Эверолимус | 0,5033 | Синергический | Аддитивный | ||
| Алпелисиб | 0,2963 | Синергический | Синергический | ||
| Соединение А | 0,4326 | Синергический | Синергический |
Анализ данных и интерпретация комбинированного эффекта
Используют методы, опубликованные в литературе, для расчета комбинированного эффекта in vitro (L. Zhao, et al, Front Biosci, 2010, 2:241-249 и L. Zhao, et al, Clin Cancer Res, 2004, 10 (23):7994-8004). Для выявления синергетических или антагонистических взаимодействий между двумя лекарствами был проведен анализ сдвига кривой с использованием настроенного шаблона XL с надстройками XLFit 5. Кривые одного агента корректируются с использованием 4 параметров логистической регрессии. Критерии и ограничения, используемые для подгонки: (i) нижняя часть <(-20) фиксируется на 0 и (ii) верхняя часть >120 фиксируется на 100. Если все наблюдения ниже порога, установленного пользователем, то выполняется постоянная аппроксимация с холмом = 0, и IC50 считается выше, чем максимальная включенная концентрация. После получения абсолютного значения IC50 для каждого отдельного агента рассчитывают эквивалентную концентрацию при 50% активности для отдельных агентов и комбинации. Используя эти эквивалентные концентрации вместе с измеренными активностями, мы пересчитываем абсолютную IC50, кривая для отдельных агентов достигнет активности 50% при значениях эквивалентных концентраций, равных 1, в то время как синергетические комбинации достигнут 50% при более низких значениях, что приведет к отклонению сдвига влево, и антагонистическая комбинация покажет сдвиг вправо. Эквивалентные концентрации также используются для расчета CI50 (индекс комбинирования при 50% активности), где CI50 равен абсолютному IC50 кривой комбинации. Вместе с CI50 могут быть рассчитаны другие CI (индексы комбинирования) при различных процентах активности (CI10, CI20, CI30, CI40, CI60, CI70, CI80, CI90). Для расчета CInn рассчитываются эквивалентные концентрации при различных процентах активности. Для каждого процента активности мы вычисляем предел погрешности, который представляет собой доверительный интервал при 95%, и, используя этот доверительный интервал, мы рассчитываем верхний предел как добавление допустимой погрешности к CI и нижний предел как вычитание допустимой погрешности к CI. Верхний предел = CI + доверительный интервал 95% и Нижний предел = CI - доверительный интервал 95%. Эти пределы затем используются для интерпретации результатов.
Статистическая интерпретация для каждого процента активности выглядит следующим образом:
- 33 045961
| Нижний предел <1 и верхний предел >1 | Аддитивный |
| Верхний предел <1 | Синергический |
| Нижний предел >1 | Антагонист |
Биологическая интерпретация для каждого процента активности выглядит следующим образом:
| CInn <0,5 | Синергический |
| CInn > 0,5 и CInn < 2 | Аддитивный |
| CInn > 2 | Антагонист |
Комбинированные исследования in vivo
Из-за неоднородности опухоли и приобретенной устойчивости к эндокринной терапии, комбинированная терапия стала незаменимой при лечении РЭ-позитивного и распространенного/метастатического рака груди для эффективной терапии или преодоления приобретенной устойчивости. Предполагается, что комбинация целевой терапии может быть более эффективной в замедлении или даже прекращении РЭ-позитивного рака груди. Комбинация ингибиторов CDK4/6 и фулвестранта была одобрена для лечения РЭ-позитивного метастатического рака груди, но у большого процента пациентов развивается резистентность из-за приобретенных мутаций в ESR1 или PIK3CA. В качестве сильного супрессора и антагониста РЭа пероральный ССРЭ, такой как пример 1В, может быть более эффективным в замедлении или остановке мутантного ESR1 или мутантного PIK3CA рака груди в качестве единственного агента или в комбинации с ингибитором CDK4/6, таким как абемациклиб или ингибитором PI3K/mTOR, таким как соединение А. В этом контексте соединение Примера 1В тестируется на ингибирование роста опухоли в комбинации с абемациклибом (патентная ссылка) или соединением А (патентная ссылка). Более конкретно, соединение Примера 1В тестируют в комбинации с абемациклибом или соединением А на ксенотрансплантированной модели рака груди дикого типа ESR1 и мутантного PIK3Са MCF7.
Размножают клетки рака груди человека MCF7 (АТСС № НТВ-22) в культуре, собирают и вводят 5х10е6 клеток в растворе HBSS+MATRIGEL™ 1:1 (200 мкл) подкожно на задний правый бок самок мышей NOD SCID (22-25 г, Envigo RMS, Inc). За двадцать четыре часа до имплантации клеток, подкожно имплантируют гранулы эстрогена (0,18 мг/гранулу, 17β эстрадиол, высвобождение 90 дней, Innovative Research). Измеряют рост опухоли и массу тела дважды в неделю, начиная с седьмого дня после имплантации. Когда размеры опухоли достигают 250-350 мм3, животных рандомизируют и группируют в группы по 5 животных. Получают тестируемое соединение, Пример 1В в подходящем носителе (1% гидроксиэтилцеллюлоза/0,25% TWEEN® 80/0,05% пеногасителя в очищенной воде) и вводят через желудочный зонд в течение 42 дней. Ингибитор CDK4/6 (абемациклиб) получают из 1% НЕС в 25 мМ натрийфосфатном буфере, рН 2,0. Ингибитор PI3K/mTOR (Соединение А) получают из 1% гидроксиэтилцеллюлозы/0,25% TWEEN® 80/0,05% пеногасителя в очищенной воде. Определяют ответ опухоли путем измерения объема опухоли два раза в неделю в течение курса лечения. При измерении объема опухоли в качестве общей меры токсичности принимают массу тела. Объем опухоли оценивают по формуле v = 1 х w2 x 0,535, где 1 - больше измеренного диаметра, a w- меньше перпендикулярного диаметра.
Статистический анализ.
Статистический анализ данных объема опухоли начинается с преобразования данных в логарифмическую шкалу для выравнивания дисперсии по времени и группам лечения. Данные об объеме опухли анализируют при помощи двухстороннего дисперсионного анализа с повторными измерениями по времени и лечению с использованием методик MIXED в программном обеспечении SAS (Версия 9.3). Модель корреляции для повторных измерений представляет собой Spatial Power. Обработанные группы сравнивают с контрольной группой в каждый момент времени. Методика MIXED также используется отдельно для каждой группы лечения для расчета скорректированных средних и стандартных ошибок в каждый момент времени. Оба анализа учитывают автокорреляцию внутри каждого животного и потерю данных, которая происходит, когда животные с большими опухолями удаляются из исследования на раннем этапе. Скорректированные средние и стандартные ошибки (с.о.) нанесены на график для каждой экспериментальной группы в зависимости от времени. Анализ объема опухоли основан на log10 и пространственной ковариационной структуре мощности. Значение Р основано на сравнении двух конкретных групп.
Способ комбинированного анализа (независимый анализ по Блиссу для исследований IVEF).
Во-первых, обычная модель повторных измерений подходит для регистрации объема в зависимости от группы и времени. Затем показатели контраста используют для проверки эффекта взаимодействия в каждый момент времени с использованием двух комбинированных способов лечения. Это эквивалентно способу независимого анализа Блисса и предполагает, что объем опухоли теоретически может достигнуть нуля, то есть полной регрессии. Ожидаемый аддитивный ответ (EAR) для комбинации рассчитывают по шкале объема опухоли как: ответ (EAR) объем EAR= V1 * V2/V0, где V0, V1 и V2 - расчетные
- 34 045961 средние объемы опухоли для контроля носителя, только обработка 1 и только обработка 2 соответственно. Если тест взаимодействия является значимым, комбинированный эффект объявляется статистически большим, чем аддитивный, или меньшим, чем аддитивный, в зависимости от наблюдаемого среднего объема комбинации, который меньше или больше, чем объем EAR, соответственно. В противном случае статистический вывод является аддитивным. Кроме того, биологически значимый диапазон аддитивности может быть определен как % X выше и ниже объема EAR. Обычно X составляет от 25 до 40%. Затем биологический вывод может быть сделан для комбинации как больше, чем аддитивный, аддитивный или меньше, чем аддитивный, если наблюдаемый средний объем комбинации ниже, в или выше интервала аддитивности.
Могут быть ситуации, когда стазис - лучший ожидаемый ответ. В таких ситуациях способ Блисса может быть применен непосредственно к значениям % дельта Т/С для получения процентного отклика EAR: % EAR дельта Т/С = Y1 * Y2/100, где Y1 и Y2 -процент значения дельта Т/С для лечения одним агентом. В настоящее время не существует статистического теста для сравнения наблюдаемого % дельта Т/С в комбинированной группе с EAR, но можно применить биологический критерий, описанный выше.
Как показано в таблицах 15 и 16, лечение препаратом примера 1В или абемациклибом в качестве единственного агента приводило к 32% (%dT/C = -32) и 52% (%dT/C = -52) регрессии опухоли соответственно, и оба они статистически значимы (р <0,001) по сравнению с растворителем контролем. Эффективность комбинации Примера 1В с абемациклибом была меньше, чем аддитивная, но эффективность комбинации Примера 1В плюс абемациклиб была значительно выше, чем эффективность комбинации Примера 1В отдельно (р <0,001). Однако эффективность абемациклиба в качестве единственного агента не была статистически значимой в сравнении с комбинацией (Р = 0,055). Комбинация переносится животными без значительной потери массы тела.
- 35 045961
Таблица 15
Эффективность комбинации примера 1В с абемациклибом в MCF7 РЭ-позитивной модели рака груди
| Лечение 1 | Лечение 2 | Разницаь | СО | р-значение |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Пример 1Б, 10 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,628 | 0,0658 | <0,001* |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Абемациклиб, 50 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,479 | 0,0658 | <0,001* |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Пример 1В, 10 мг/кг, QD х 42, ПО /Абемациклиб, 50 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,756 | 0,0658 | <0,001* |
| Пример 1В, 10 мг/кг, QD х 42, ПО | Пример 1В, 10 мг/кг, QD х 42, ПО /Абемациклиб, 50 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,128 | 0,0658 | 0,055 |
| Абемациклиб, 50 мг/кг, QD х 42, ПО | Пример 1В, 10 мг/кг, QD х 42, ПО /Абемациклиб, 50 мг/кг, QD х 42, ПО РО | 0,278 | 0,0658 | <0,001* |
Разница = лечение 1 - лечение 2 * р-значение: значительно (р <0,05) СО - Стандартная ошибка
- 36 045961
Таблица 16
Эффективность комбинации примера 1В с абемациклибом в MCF7 РЭ-позитивной модели рака груди
| Лечение | % дельта Т/С или % регрессии | р-значение | Комбинированный эффект | Масса тела |
| Растворитель | н.с. | н.с. | ||
| Пример 1В | -32 | <0,001* | ||
| Абемациклиб | -52 | <0,001* | ||
| Пример 1В/ Абемациклиб/ (Комбинация) | -64 | <0,001* | Меньше, чем аддитивный | Без значительных изменений |
Анализ объема опухоли основан на Log10 и Spatial Power ковариационной структуры.
* р-значение: значительно (р<0,05); н.с: не соответствует % дельта Т/С рассчитывают, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли; и % регрессии рассчитывают для объема опухоли ниже исходного значения. Формула 100*(Т-Т0)/(С-С0), в которой Т и С являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. Т0 и С0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах.
Как показано в таблицах 17 и 18, лечение примером 1В или только соединением А приводило к 32% (%dT/C = -32) и 36% (%dT/C = -36) регрессии опухоли соответственно, и оба являются статистически значимыми (р<0,001) по сравнению с растворителем контролем. Эффективность комбинации примера 1В с соединением А была меньше, чем аддитивной, но эффективность комбинации примера 1В плюс соединение А была значительно лучше, чем эффективность только соединения примера 1B (p<0,001) или только соединения А (р=0,002*). Комбинация переносится животными без значительной потери массы тела.
- 37 045961
Таблица 17
Эффективность комбинации примера 1В с соединением А в
MCF7 модели РЭ-позитивного рака груди
| Лечение 1 | Лечение 2 | Разницаь | СО | р-значение |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Пример 1В, 10 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,479 | 0,0759 | <0,001* |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Соединение А, 7,5 мг/кг, BID х 42, ПО | 0,504 | 0,0759 | <0,001* |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Пример 1В, 10 мг/кг, QD х 42, ПО/Соединение А, 7,5 мг/кг, BID х 42, ПО | 0,761 | 0,0791 | <0,001* |
| Пример 1В, 10 мг/кг, QD х 42, ПО | Пример 1В, 10 мг/кг, QD х 42, ПО/Соединение А, 7,5 мг/кг, ВШ х 42, ПО | 0,282 | 0,0791 | <0,001* |
| Соединение А, 7,5 мг/кг, BID х 42, ПО | Пример 1В, 10 мг/кг, QD х 42, ПО/Соединение А, 7,5 мг/кг, BID х 42, ПО РО | 0,257 | 0,0791 | 0,002 * |
Разница = лечение 1 - лечение 2 *р-значение: значительно (р<0,05)
СО - Стандартная ошибка
Таблица 18
Эффективность комбинации примера 1В с абемациклибом в
MCF7 РЭ-позитивной модели рака груди
| Лечение | % дельта Т/С или % регрессии | р-значение | Комбинированный эффект | Масса тела |
| Растворитель | н.с. | н.с. | ||
| Пример 1В | -32 | <0,001* | ||
| Соединение А | -36 | <0,001* | ||
| Пример 1В /Соединение А / (Комбинация) | -65 | <0,001* | Меньше, чем аддитивный | Без значительных изменений |
Анализ объема опухоли основан на Log10 и Spatial Power ковариационной структуры.
* р-значение: значительно (р<0,05); н.с: не соответствует % дельта Т/С рассчитывают, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли; и % регрессии рассчитывают для объема опухоли ниже исходного значения. Формула 100*(Т-Т0)/(С-С0), в которой Т и С являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. Т0 и С0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах.
- 38 045961
Как показано в таблицах 19 и 20, лечение препаратом примера 10 или абемациклибом в качестве единственного агента приводило к 51% (%dT/C = -51) и 70% (%dT/C = -70) регрессии опухоли соответственно, и оба они статистически значимы (р<0,001) по сравнению с растворителем контролем. Эффективность комбинации примера 10 с абемациклибом была меньше, чем аддитивная, но эффективность комбинации примера 10 плюс абемациклиб была значительно выше, чем эффективность комбинации примера 10 отдельно (р=0,039). Однако эффективность комбинации примера 10 плюс абемациклиб существенно не отличалась от эффективности только абемациклиба (р=0,905). Комбинация переносится животными без значительной потери массы тела.
Таблица 19
Эффективность комбинации примера 10 с абемациклибом в MCF7 РЭ-позитивной модели рака груди
| Лечение 1 | Лечение 2 | Разницаь | СО | р-значение |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,659 | 0,113 | <0,001* |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Абемациклиб 50 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,445 | 0,1054 | <0,001* |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО/абемациклиб, 50 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,672 | 0,1054 | <0,001* |
| Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО | Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО/абемациклиб, 50 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,013 | 0,1103 | 0,905 |
| Абемациклиб, 50 мг/кг, QD х 42, ПО | Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО/абемациклиб, 50 мг/кг, QD х 42, ПО РО | 0,227 | 0,1054 | 0,039* |
Разница = лечение 1 - лечение 2 *р-значение: значительно (р<0,05) СО - Стандартная ошибка
- 39 045961
Таблица 20
Эффективность комбинации примера 10 с абемациклибом в MCF7 РЭ-позитивной модели рака груди
| Лечение | % дельта Т/С или % регрессии | р-значение | Комбинированный эффект | Масса тела |
| Растворитель | н.с. | н.с. | ||
| Пример 10 | -51 | <0,001* | ||
| Абемациклиб | -70 | <0,001* | ||
| Пример 10 /Абемациклиб / (Комбинация) | -71 | <0,001* | Меньше, чем аддитивный | Без значительных изменений |
Анализ объема опухоли основан на Log10 и Spatial Power ковариационной структуры.
* р-значение: значительно (р<0,05); н.с: не соответствует % дельта Т/С рассчитывают, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли; и % регрессии рассчитывают для объема опухоли ниже исходного значения. Формула 100*(Т-Т0)/(С-С0), в которой Т и С являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. Т0 и С0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах.
Как показано в таблицах 21 и 22, лечение препаратом примера 10 или алпелисибом в качестве единственного агента приводило к 51% (%dT/C = -51) и 21% (%dT/C = -21) регрессии опухоли соответственно, и оба они статистически значимы (р<0,001 и р=0,013) по сравнению с растворителем контролем. Эффективность комбинации примера 10 с алпелисибом была аддитивная, и эффективность комбинации примера 10 плюс алпелисиб была значительно выше, чем эффективность только примера 10 (р=0,009). Эффективность комбинации примера 10 и алпелисиба также была значительно выше, чем эффективность только алпелисиба (р = <0,001). Комбинация переносится животными без значительной потери массы тела.
- 40 045961
Таблица 21
Эффективность комбинации примера 10 с алпелисибом на модели MCF7 РЭ-позитивного рака груди
| Лечение 1 | Лечение 2 | Разницаь | СО | р-значение |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,241 | 0,1121 | <0,039* |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Алпелисиб 15 мг/кг (dl-d7,), 10 мг/кг (d8-42), мг/кг, QD х 42, ПО | 0,445 | 0,1121 | <0,001* |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО/алпелисиб 15 мг/кг (dl-d7,), 10 мг/кг (d8-42), мг/кг, QD х 42, ПО | 0,755 | 0,1121 | <0,001* |
| Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО | Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО/алпелисиб 15 мг/кг (dl-d7,), 10 мг/кг (d8-42), мг/кг, QD х 42, ПО | 0,514 | 0,1121 | <0,001 |
| Алпелисиб 15 мг/кг (dl-d7,), 10 мг/кг (d842), МПК, QD х 42, ПО | Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО/алпелисиб 15 мг/кг (dl-d7,), 10 мг/кг (d8-42), мг/кг, QD х 42, ПО | 0,310 | 0,1121 | 0,009* |
Разница = лечение 1 - лечение 2 *р-значение: значительно (р<0,05) СО - Стандартная ошибка
- 41 045961
Таблица 22
Эффективность комбинации примера 10 с алпелисибом на модели MCF7 РЭ-позитивного рака груди
| Лечение | % дельта Т/С или % регрессии | р-значение | Комбинированный эффект | Масса тела |
| Растворитель | н.с. | н.с. | ||
| Пример 10 | -51 | <0,001* | ||
| алпелисиб | -21 | <0,013* | ||
| Пример 10 /алпелисиб (Комбинация) | -76 | <0,001* | Аддитивный | Без значительных изменений |
Анализ объема опухоли основан на Log10 и Spatial Power ковариационной структуры.
* р-значение: значительно (р<0,05); н.с: не соответствует % дельта Т/С рассчитывают, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли; и % регрессии рассчитывают для объема опухоли ниже исходного значения. Формула 100*(Т-Т0)/(С-С0), в которой Т и С являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. Т0 и С0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах.
Как показано в таблицах 23 и 24, лечение препаратом примера 10 или эверолимусом в качестве единственного агента приводит к 51% (%dT/C = -51) и 50% (%dT/C = -50) регрессии опухоли соответственно, и оба они статистически значимы (р<0,001 и р<0,001) по сравнению с растворителем контролем. Эффективность комбинации Примера 10 с эверолимусом была аддитивной, и эффективность комбинации примера 10 плюс эверолимус была значительно выше, чем эффективность только примера 10 (р=0,004). Эффективность комбинации примера 10 плюс эверолимус также была значительно выше, чем эффективность только эверолимуса (р=0,04). Комбинация переносится животными без значительной потери массы тела.
- 42 045961
Таблица 23
Эффективность комбинации примера 10 с эверолимусом на модели MCF7 РЭ-позитивного рака груди
| Лечение 1 | Лечение 2 | Разницаь | СО | р-значение |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,445 | 0,0999 | <0,001* |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Эверолимус, 5 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,433 | 0,1038 | <0,001* |
| Растворитель, QD х 42, ПО | Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО/Эверолимус, 5 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,748 | 0,0999 | <0,001* |
| Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО | Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО/Эверолимус, 5 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,303 | 0,0999 | 0,004* |
| Эверолимус, 5 мг/кг, QD х 42, ПО | Пример 10, 15 мг/кг, QD х 42, ПО/Эверолимус, 5 мг/кг, QD х 42, ПО | 0,315 | 0,138 | 0,004* |
Разница = лечение 1 - лечение 2 *р-значение: значительно (р<0,05)
СО - Стандартная ошибка
Таблица 24
Эффективность комбинации примера 10 с эверолимусом на модели MCF7 РЭ-позитивного рака груди
| Лечение | % дельта Т/С или % регрессии | р-значение | Комбинированный эффект | Масса тела |
| Растворитель | н.с. | н.с. | ||
| Пример 10 | -51 | <0,001* | ||
| Эверолимус | -50 | <0,001* | ||
| Пример 10 /Эверолимус (Комбинация) | -76 | <0,001* | Аддитивный | Без значительных изменений |
Анализ объема опухоли основан на Log10 и Spatial Power ковариационной структуры.
* р-значение: значительно (р<0,05); н.с: не соответствует % дельта Т/С рассчитывают, когда конечный объем опухоли в обработанной группе находился на уровне или выше исходного объема опухоли; и % регрессии рассчитывают для объема опухоли ниже исходного значения. Формула 100*(Т-Т0)/(С-С0), в которой Т и С являются средними конечными объемами опухоли в обработанной или контрольной группе соответственно. Т0 и С0 - средние исходные объемы опухолей в данных группах.
- 43 045961
Анализ пероральной биодоступности у крыс.
Цель следующего анализа - продемонстрировать, является ли тестируемое соединение биодоступным при пероральном введении.
Испытываемое соединение вводят крысам линии Спрега-Доули внутривенно (ВВ) в количестве 1 мг/кг (с применением растворителей: 20% CAPTISOL® в 25 мМ натрий-фосфатном буфере, достаточное количество для рН 2; или 25% DMA, 15% EtOH, 10% пропиленгликоля, 25% 2-пирролидона и 25% очищенной воды) и перорально (ПО) в количестве 10 мг/кг (с применением растворителя: 1% гидроксиэтилцеллюлозы, 0,25% полисорбата 80, 0,05% пеногасителя 1510-US и достаточное количество очищенной воды). Серийные образцы крови отбирали через 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 и 12 ч после ВВ болюсного введения дозы и через 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 и 12 ч после перорального введения дозы. После обработки коагулянтом EDTA, плазму получали путем центрифугирования и хранили при -70°С до анализа путем ЖХМС/МС. Определяли концентрацию тестируемого соединения в плазме и загружали в систему Watson LIMS™, где для расчета площади под кривой (ППК) для ВВ и ПО ветвей применяли некомпартментный анализ. Рассчитывают пероральную биодоступность (% F) при помощи следующего уравнения:
%F = (ППКпо X дозавв)/(Я77Лвв X дозапо) X 100.
Соединения примера 1В показывают значение % F ~ 50% в вышеупомянутом анализе. Этот анализ показывает, что пример 1В имеет хорошую биодоступность при пероральном введении.
Claims (36)
1. Кристаллическая форма соединения формулы
в котором или R1, или R2 независимо выбирают из Cl, F, -CF3 или -СН3, а другой представляет собой водород, или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Кристаллическая форма по п.1, отличающаяся тем, что соединение представляет собой
или его фармацевтически приемлемую соль.
3. Кристаллическая форма по п.2, отличающаяся тем, что она имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму (РПД), содержащую пик при 2Θ (°) 19,8±0,2 в сочетании с одним или несколькими пиками, выбранными из группы, состоящей из 6,8±0,2, 16,0±0,2 и 22,1±0,2.
4. Кристаллическая форма по п.2, отличающаяся тем, что она имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму (РПД), содержащую пики при 2θ (°) ±0,2°, имеющие следующие процентные интенсивности по отношению к наиболее интенсивному пику:
5. Кристаллическая форма по п.2, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль бензолсульфоновой кислоты.
6. Кристаллическая форма по п.5, отличающаяся тем, что она имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму (РПД), содержащую пик при 2θ (°) 20,5±0,2 в сочетании с одним или несколькими пиками, выбранными из группы, состоящей из 12,3±0,2, 22,2±0,2 и 23,1±0,2.
7. Кристаллическая форма по п.5, отличающаяся тем, что она имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму (РПД), содержащую пики при 2θ (°) ±0,2°, имеющие следующие процентные интенсив-
- 44 045961 ности по отношению к наиболее интенсивному пику:
1
7,6
27,10
2
10,6
34,50
3
12,3
42,10
4
12,6
32,30
5
17,7
32,80
6
19,2
26,70
7
20,5
100,00
8
22,2
45,50
9
23,1
36,30
10
24,2
29,80
8. Кристаллическая форма по п.2, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль 4-метилбензолсульфоновой кислоты.
9. Кристаллическая форма по п.8, отличающаяся тем, что она имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму (РПД), содержащую пик при 2Θ (°) 20,1 ±0,2 в сочетании с одним или несколькими пиками, выбранными из группы, состоящей из 12,9±0,2, 19,5±0,2 и 22,8±0,2.
10. Кристаллическая форма по п.8, отличающаяся тем, что она имеет рентгеновскую порошковую дифрактограмму (РПД), содержащую пики при 2θ (°) ±0,2°, имеющие следующие процентные интенсивности по отношению к наиболее интенсивному пику:
1
7,6
25,70
2
12,4
27,90
3
12,8
36,80
4
18,9
26,50
5
19,5
56,90
6
20,1
100,00
7
20,9
41,50
8
21,8
40,90
9
22,8
39,40
10
25,4
29,70
11. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль по п.1 в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем, носителем или разбавителем.
12. Фармацевтическая композиция по п.11, содержащая один или несколько других терапевтических агентов.
13. Способ лечения рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака простаты, рака матки, рака желудка или рака легких, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что рак груди представляет собой РЭ-позитивный рак груди.
15. Способ по п.13, отличающийся тем, что рак желудка представляет собой РЭ-позитивный рак желудка.
16. Способ по п.13, отличающийся тем, что рак легких представляет собой РЭ-позитивный рак легких.
17. Применение терапевтического агента, содержащего соединение формул I, II или III:
- 45 045961
в котором или R1, или R2 независимо выбирают из Cl, F, -CF3 или -СН3, а другой представляет собой водород;
или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из группы, состоящей из селективных модуляторов рецепторов эстрогена (СМРЭ), ингибиторов ароматазы, ингибиторов CDK4, ингибиторов CDK6, ингибиторов PI3K, ингибиторов mTOR и ингибитора PI3K/mTOR, для лечения рака у пациента,
18. Применение по п.17, отличающееся тем, что второй терапевтический агент представляет собой СМРЭ.
19. Применение по п.17, отличающееся тем, что второй терапевтический агент представляет собой ингибитор ароматазы.
20. Применение по п.17, отличающееся тем, что второй терапевтический агент представляет собой ингибитор CDK4.
21. Применение по п.17, отличающееся тем, что второй терапевтический агент представляет собой ингибитор CDK6.
22. Применение по п.17, отличающееся тем, что второй терапевтический агент представляет собой абемациклиб.
23. Применение по п.17, отличающееся тем, что ингибитор mTOR представляет собой эверолимус.
24. Применение по п.17, отличающееся тем, что второй терапевтический агент представляет собой алпелисиб.
25. Применение по п.17, отличающееся тем, что фармацевтически приемлемая соль выбрана из группы, состоящей из соли бензолсульфоновой кислоты и соли 4-метил бензолсульфоновой кислоты.
26. Применение по п.17, отличающееся тем, что соединение формулы 1 представляет собой
соединение формулы II представляет собой
и соединение формулы III представляет собой
27. Применение по п.26, отличающееся тем, что фармацевтически приемлемая соль выбрана из группы, состоящей из соли бензолсульфоновой кислоты и соли 4-метил бензолсульфоновой кислоты.
28. Применение по п.26, отличающееся тем, что у пациента идентифицирован или диагностирован рак, выбранный из группы, состоящей из рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака простаты, рака матки, рака желудка и рака легких.
- 46 045961
29. Применение по п.28, отличающееся тем, что рак груди представляет собой РЭ-позитивный рак груди.
30. Применение по п.28, отличающееся тем, что рак желудка представляет собой РЭ-позитивный рак желудка,
31. Применение по п.28, отличающееся тем, что рак легких представляет собой РЭ-позитивный рак легких,
32. Применение по п.28, отличающееся тем, что второй терапевтический агент содержит абемациклиб, эверолимус или алпелисиб.
33. Применение терапевтического агента, содержащего соединение формулы I: или соединение формулы III:
XF
F соединение формулы II:
или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации со вторым терапевтическим агентом, выбранным из группы, состоящей из селективных модуляторов рецепторов эстрогена (СМРЭ), ингибиторов ароматазы, ингибиторов CDK4, ингибиторов CDK6, ингибиторов PI3K, ингибиторов mTOR и ингибитора PI3K/mTOR, для лечения рака.
34. Применение по п.33, отличающееся тем, что второй терапевтический агент содержит абемациклиб, эверолимус или адпелисиб; и отличающееся тем, что фармацевтически приемлемая соль выбрана из группы, состоящей из соли бензолсульфоновой кислоты и соли 4-метил бензолсульфоновой кислоты.
35. Применение по п.34, отличающееся тем, что рак выбран из группы, состоящей из рака груди, рака яичников, рака эндометрия, рака простаты, рака матки, рака желудка и рака легких.
36. Применение по п.35, отличающееся тем, что рак груди представляет собой РЭ-позитивный рак груди; рак желудка представляет собой РЭ-позитивный рак желудка; и рак легких представляет собой РЭ-позитивный рак легких.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/697,100 | 2018-07-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045961B1 true EA045961B1 (ru) | 2024-01-23 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7557564B2 (ja) | 選択的エストロゲン受容体分解剤 | |
| AU2019299952B2 (en) | Selective estrogen receptor degraders | |
| EA045961B1 (ru) | Селективные супрессоры рецептора эстрогена | |
| EA040517B1 (ru) | Селективные супрессоры рецептора эстрогена | |
| EA041610B1 (ru) | Селективные супрессоры рецептора эстрогена |