BR112020025654A2 - Degradadores de receptor de estrogênio seletivo - Google Patents
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Abstract
degradadores de receptor de estrogênio seletivo. a presente invenção refere-se a degradadores de receptor de estrogênio seletivos (serds) de acordo com a fórmula: são fornecidos sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, e composições farmacêuticas dos mesmos, em que ou r1 ou r2 é independentemente selecionado de cl, f, -cf3, ou -ch3, e o outro é hidrogênio, e métodos para uso dos mesmos.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DEGRADADORES DE RECEPTOR DE ESTROGÊNIO SELETIVO". Antecedentes
[0001] Degradadores de receptor de estrogênio seletivo (SERDs) se ligam ao receptor de estrogênio (ER) e subregulam a atividade transcricional mediada por ER. Esta degradação e subregulação causadas por SERDs podem ser úteis no tratamento de distúrbios de proliferação celular, tal como câncer. Alguns exemplos de moléculas pequenas de SERDs foram descritos na literatura (veja, por exemplo, WO 2005073204, WO 2014205136, e WO 2016097071). Contudo, SERDs conhecidos não têm sido ainda tão úteis quanto necessário para eficazmente tratar câncer. Por exemplo, encontrar SERDs com melhores propriedades farmacocinéticas (PK) e farmacodinâmicas (PD), maior eficiência na clínica, e uma boa biodisponibilidade oral seria muito útil no tratamento do câncer. Um antagonista SERD puro com inibição potente da transcrição mediada por ER seria expressamente benéfico no tratamento do câncer. Existe uma necessidade de novos SERDs para tratar cânceres tais como câncer de mama, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de próstata, câncer de útero, câncer gástrico, e câncer de pulmão bem como mutações devido à resistência emergente. Em particular existe uma necessidade de novos SERDs para tratar câncer de mama positivo para ER, câncer gástrico, e/ou câncer de pulmão. Sumário Compostos da fórmula: O 1 e LI O o ? R? co”
HO NÃ e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, e composições farmacêuticas dos mesmos, são fornecidos aqui. Nesta fórmula ou R'? ou R? é independentemente selecionado de Cl, F, -CF3, ou -CH3, e o outro é hidrogênio.
[0002] Métodos de usar os compostos como descrito aqui, sais farmaceuticamente — aceitáveis dos mesmos, e composições farmacêuticas dos mesmos, para tratar câncer de mama, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de próstata, câncer de útero, câncer gástrico, ou câncer de pulmão são também fornecidos. Os métodos incluem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto como descrito aqui, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, a um paciente em necessidade.
[0003] São também fornecidos o composto como descrito aqui, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, para uso em terapia. Os compostos descritos aqui, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, podem ser usados no tratamento de câncer de mama, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de próstata, câncer de útero, câncer gástrico, ou câncer de pulmão.
[0004] O uso dos compostos como descrito aqui, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer de mama, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de próstata, câncer de útero, câncer gástrico, ou câncer de pulmão é também fornecido. Descrição Detalhada
[0005] Novos compostos tetracíclicos e sais farmacêuticos dos mesmos que agem como SERDs são descritos aqui. Os recentemente inventados SERDs que são descritos aqui fornecem inibição de transcrição mediada por ER que será útil no tratamento de cânceres tais como câncer de mama, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de próstata, câncer de útero, câncer gástrico, e câncer de pulmão bem como mutações devido à resistência emergente. Estes SERDs podem ser usados ou como agentes únicos ou em combinação com outras classes de fármacos incluindo moduladores de receptor de estrogênio seletivo (SERMs), inibidores de aromatase, Inibidores de CDKA, inibidores de CDKG6, inibidores de PISK, e inibidores de mTOR para tratar cânceres positives para receptor de hormônio, tais como câncer de mama, câncer gástrico, e/ou câncer de pulmão.
[0006] Os novos compostos descritos aqui são representados pela Fórmula |:
NO R FL O O. R? fá
HO , | e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que ou R' ou R? é independentemente selecionado de Cl, F, -CF3, ou -CHs3, e o outro é hidrogênio. Alguém versado na técnica apreciará que compostos como descrito pela Fórmula |, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, contenham um centro quiral, a posição do qual é indicada por um * acima. Alguém versado na técnica também apreciará que as designações Cahn-Ingold-Prelog (R) ou (S) para centros quirais variarão, dependendo dos padrões de substituição em torno de um centro quiral. O centro quiral no composto de Fórmula | fornece uma forma R-enantiomérica mostrada pela Fórmula |l:
NO R FL OQ o. R '
HO É e uma forma S-enantiomérica mostrada pela Fórmula Ill:
LO, O. x R? mM à. HO O Nº
[0007] Todos os estereoisômeros, enantiômeros, e diastereômeros individuais, bem como misturas dos enantiômeros e diastereômeros dos compostos de acordo com a Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula |ll incluindo racematos são incluídos no escopo dos compostos aqui descritos. Compostos para uso farmacêutico que contêm centros quirais são frequentemente isolados como enantiômeros ou diastereômeros únicos e tais compostos isolados de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill são incluídos no escopo dos compostos aqui descritos. Alguém versado na técnica também apreciará que os compostos of Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula III aqui descritos, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, possam ser deuterados (onde um hidrogênio pode ser substituído por um deutério) e tais moléculas sejam consideradas para ser incluídas no escopo dos compostos aqui descritos.
[0008] Exemplos específicos dos compostos de Fórmula | (incluindo nomes de nomenclatura IUPAC) são mostrados aqui: ao
O F Dx HO Q Nº 5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)-8-(trifluorometil)-5H-
[1]benzopirano][4,3-c]quinolin-2-ol; o F O eo
CO Ho O nº 5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)-7 -(trifluorometil)-5H-
[1]benzopirano][4,3-c]quinolin-2-ol;
NO FL O o e O * O Ho nº 8-cloro-5-(4-[2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxilXfenil)-5H-
[1]benzopirano][4,3-c]quinolin-2-ol; NO Cc SST. GC Ds O Ho nº 7-cloro-5-(4-[2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxilXfenil)-5H-
[1]benzopirano [4,3-c]quinolin-2-ol; o
NOSSO el O o F Ay Ho Nº 8-fluoro-5-(4-12-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxilfenil)-5H-
[1]benzopirano [4,3-c]quinolin-2-ol;
NO O F e O o.
CG DS O Ho Nº 7-fluoro-5-(4-12-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxilfenil)-5H-
[1]benzopirano [4,3-c]quinolin-2-ol;
NO FL O o O à (O HO Nº 5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il] etóxilfenil)-8-metil-5H-
[1]benzopirano [4,3-c]quinolin-2-ol; e
NO e Oo (CX y Ho nº 5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)-7-metil-5H-
[1]benzopirano [4,3-c]quinolin-2-ol.
[0009] Devido ao centro quiral notado acima, cada destes exemplos específicos de compostos de Fórmula | mostrados acima tem formas enantioméricas R e S (isto é, compostos enantioméricos R de Fórmula Il e compostos enantioméricos S de Fórmula Ill) como mostrado na Tabela 1. Tabela 1: Formas enantioméricas de compostos de Fórmula | Enantiômero R (Fórmula |!) Enantiômero S (Fórmula Ill) 5-(4-(2-[3-(fluorometil) azetidin-1-i FNOXO F ELMO o xF e FD AoA LITE etóxilfenil)-8- O F O “ “ 2 i il)-5H- Ho N (trifluorometil)-5H-[1] Ho O nº benzopirano[4,3- clquinolin-2-ol 5-(4-(2-[3-(fluorometil) azetidin-1-il] etóxi) fenil)-7-(trifluorometil)- 5H-[1] benzopirano [4,3-c]quinolin-2-ol 8-cloro-5-(4-(2-[3- (fluorometil)azetidin-1- iletóxiXfenil)-5H-
[1]benzopirano[4,3- clquinolin-2-ol 7-cloro-5-(4-(2-[3- (fluorometil)azetidin-1- iletóxiXfenil)-5H-
[1]benzopirano[4,3- clquinolin-2-ol
8-fluoro-5-(4-[2-[3- UNA O ESTO (fluorometil)azetidin-1- | E o. O F ". O. O F iletóxiXfenil)-5H- O à
[1]benzopirano[4,3- Ho Nº no N clquinolin-2-ol 7-fluoro-5-(4-(2-[3- NO F Lo F (fluorometil)azetidin-1- FL OQ o o) O iletóxiXfenil)-5H- N O O à
[1]benzopirano[4,3- Ho o Nº no Nº clquinolin-2-ol 5-(4-(2-[3- o? O US (fluorometil)azetidin-1- F o. O F OQ o. O iletóxilfenil)-8-metil- O s 5H-[1]benzopirano[4,3- Ho Dá Ho Dá clquinolin-2-ol 5-(4-(2-[3- e? O Pra (fluorometil)azetidin-1- F. O. F O. o. O ilJetóxisfenil)-7-metil- O ES O O * 5H-[1]benzopirano[4,3- Ho Nº Ho Nº clquinolin-2-ol
[0010] Também descritos aqui são composições farmacêuticas incluindo os compostos de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em combinação com um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas descritas aqui podem ser preparadas usando aditivos farmaceuticamente aceitáveis. O termo "aditivo (s) farmaceuticamente aceitável (is)" como usado aqui, refere- se a um ou mais veículos, diluentes, e excipientes que são compatíveis com os outros aditivos das composições ou formulações e não prejudiciais ao paciente. Os compostos de Fórmula |, Fórmula |l, e Fórmula |11ll, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, descritos aqui podem ser formulados como composições farmacêuticas administradas por uma variedade de rotinas, tais como oral ou IV. Biodisponibilidade é frequentemente um fator em tratamento de câncer e a capacidade de escolher métodos de administração e composições farmacêuticas para controlar ou otimizar a biodisponibilidade de um ingrediente ativo é útil Por exemplo, uma composição SERD biodisponível oralmente seria particularmente útil. Os compostos de Fórmula |, Fórmula |1l, e Fórmula Ill, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, como descrito aqui são acreditados ter biodisponibilidade oral. Exemplos de composições farmacêuticas e processos para sua preparação podem ser encontrados em "Remington: The Science e Practice of Pharmacy", L. V. Allen Jr, Editor, 22º Ed., Mack Publishing Co., 2012. Exemplos não limitantes de veículos, diluentes e excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem os seguintes: derivados de salina, água, amido, açúcares, manitol, e sílica; agentes de ligação, tais como, carboximetil celulose e outros derivados de celulose, alginatos, gelatina e polivinil-pirrolidona; cáulim e bentonita; e polietil glicóis.
[0011] Outros descritos aqui são métodos de tratar um câncer. Os métodos descritos aqui incluem administrar a um paciente em necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula |, Fórmula 1l e Fórmula Ill como descrito aqui, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Por exemplo, o método de administrar a quantidade eficaz de um composto de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser administração oral. O câncer pode ser um câncer responsivo ao estrogênio. Adicionalmente, o câncer pode ser câncer de mama, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de próstata, câncer de útero, câncer gástrico ou câncer de pulmão. Por exemplo, o câncer pode ser câncer de mama ER-positivo, câncer gástrico ER-positivo ou câncer de pulmão ER-positivo.
[0012] Também descritos aqui são compostos de Fórmula |, Fórmula || e Fórmula Ill como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, para uso em terapia. Também fornecidos aqui são os compostos de Fórmula |, Fórmula Il e Fórmula Ill como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, para uso no tratamento de câncer de mama, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de próstata, câncer de útero, câncer gástrico ou câncer de pulmão. Em particular, o câncer de mama pode ser câncer de mama ER-positivo, câncer gástrico ER-positivo ou câncer de pulmão ER- positivo. Por exemplo, o composto de Fórmula |, Fórmula |1l e Fórmula Ill, ou sal farmaceuticamente aceitável salt do mesmo, pode ser administrado oralmente.
[0013] Adicionalmente, os compostos de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, podem ser usados na fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer. Por exemplo, o medicamento pode ser administrado oralmente. Os tipos de medicamentos para câncer como descrito aqui podem ser usados para tratar câncer de mama, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de próstata, câncer de útero, câncer gástrico ou câncer de pulmão. Em particular, o câncer pode ser câncer de mama ER-positivo, câncer gástrico ER-positivo ou câncer de pulmão ER-positivo.
[0014] Os compostos de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, podem ter utilidade clínica como um agente único ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos (por exemplo, agentes anticâncer), para o tratamento de cânceres, tais como, câncer de mama, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de próstata, câncer de útero, câncer gástrico ou câncer de pulmão. Quando usados em combinação com outros agentes terapêuticos (tais como, agentes anticâncer), os compostos de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, podem ser usados simultaneamente, sequencialmente ou separadamente com outros agentes terapêuticos. Exemplos de classes de fármacos daqueles compostos de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, podem ser combinados com SERMs, inibidores de aromatase, inibidores de CDKA, inibidores de CDKG6, inibidores de PISK, e inibidores de mTOR para tratar câncer de mama positivo de receptor de hormônio. Mais exemplos específicos de fármacos com os quais os compostos de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, podem ser combinados incluem abemaciclibe (inibidor de CDK4/6), everolimus (inibidor de mTOR), alpelisibe e (inibidor de PIK3CA), e 8-[5-(1-hidróxi-1-metiletil)piridin-3-i1]-1-[(28)-2- metoxipropil]-3-metil-1,3-di-hidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona (inibidor de PISK/MTOR).
[0015] Como usado aqui, o termo "quantidade eficaz" refere-se à quantidade ou dose de um composto de Fórmula |, Fórmula |l, e Fórmula Ill como descrito aqui, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, que, após admninistração de dose única ou múltipla ao paciente, fornece o efeito desejado no paciente sob diagnóstico ou tratamento. Preferivelmente, um efeito desejado é inibição de proliferação de célula tumoral, morte de célula tumoral, ou ambas. Os compostos de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, são geralmente eficazes sobre uma ampla faixa de dosagem. Por exemplo, as dosagens por dia ficam normalmente dentro da faixa diária de cerca de 100 mg a cerca de 2000 mg.
[0016] Como usado aqui, "tratar", "tratando" ou "tratamento" refere- se uma restrição, desaceleração, interrupção ou reversão da progressão ou gravidade de um sintoma ou distúrbio existente.
[0017] Como usado aqui, o termo "paciente" refere-se a um humano que é afligido com uma doença, distúrbio, ou condição.
[0018] Os compostos de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, podem ser preparados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, alguns dos quais são ilustrados nas Preparações e Exemplos abaixo. As etapas sintéticas específicas para cada uma das rotinas descritas podem ser combinadas de diferentes maneiras, ou em conjunto com etapas de diferentes procedimentos, para preparar compostos de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Os produtos podem ser recuperados por métodos convencionais bem conhecidos na técnica, incluindo extração, evaporação, precipitação, cromatografia, filtração, trituração, e cristalização. Os reagentes e materiais de partida são facilmente disponíveis para alguém versado na técnica.
[0019] Intermediários e processos úteis para a síntese dos compostos de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui são destinados a ser incluídos nesta descrição. Adicionalmente, certos intermediários aqui descritos podem conter um ou mais grupos de proteção. O grupo de proteção variável pode ser igual ou diferente em cada ocorrência, dependendo das condições de reação particulars e das transformações particulars a ser realizadas. As condições de proteção e desproteção são bem conhecidas pelo técnico versado e são descritas na literature (Veja, por exemplo, "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Quarta Edição, by Peter G.M. Wuts e Theodora W. Greene, John Wiley e Sons, Inc. 2007).
[0020] Isômeros, enantiômeros, e diastereômeros individuais podem ser separados ou resolvidos por alguém versado na técnica em qualquer ponto conveniente na síntese de compostos de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui, por métodos tais como técnicas de cristalização seletiva ou cromatografia quiral (Veja, por exemplo, J. Jacques, et al, "Enantiomers, Racemates, and
Resolutions", John Wiley e Sons, Inc., 1981, e E.L. Eliel e S.H. Wilen, "Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994). Enquanto isômeros, enantiômeros, e diastereômeros individuais podem ser separados ou resolvidos como mencionado, suas designações Cahn-Ingold-Prelog (R) ou (S) para centros quirais podem não ter sido ainda determinadas. Onde as designações Cahn-Ingold-Prelog (R) ou (S) não estão disponíveis, os identificadores "isômero 1" e "isômero 2" são usados e são combinados com o nome IUPAC sem designação de estereoquímica Cahn-Ingold-Prelog. Os compostos de Fórmula |, Fórmula 1l, e Fórmula Ill sendo identificados como "isômero 1" ou "isômero 2" aqui são isolados como definido nas descrições experimentais específicas abaixo. Se um isômero for "1" ou "2" refere- se à ordem na qual os compostos de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill eluem de uma coluna de cromatografia quiral, sob as condições listadas, isto é, um "isômero 1" é o primeiro a eluir da coluna sob as condições mencionadas. Se a cromatografia quiral for iniciada precocemente na síntese, a mesma designação é aplicada aos intermediaries subsequentes e compostos de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill.
[0021] A menos que especificamente mencionado, as abreviações usadas aqui são definidas de acordo com Aldrichimica Acta, Vol. 17, No. 1, 1984. Outras abreviações são definidas como segue: "ACN" refere- se à acetonitrila; "BSA" refere-se a Albumina de Soro Bovino; "cataCXium9O Um Pd G3" refere-se a metanossulfonato de [(di(1- adamantil)-butilfosfina)-2-(2"-amino-1,1"-bifenil)]paládio(!!); "DCM" refere-se a diclorometano ou cloreto de metileno; "DMA" refere-se a dimetilacetamida; "DMEA!" refere-se a dimetiletilamina; "DMEM" refere- se a Dulbecco's Modified Eagle's Medium; "DMF" refere-se a NN- dimetilformamida; "DMSO" refere-se a dimetil sulfóxido; "DNA" refere- se a ácido deoxiribonucleico; "cDNA" refere-se a DNA complementar;
"DNase" refere-se a deoxiribonuclease; "DTT" refere-se a ditiotreitol; "ECs5o" refere-se à concentração de um agente que produz 50% de resposta da atividade alvo comparada a um composto de controle positivo predefinido (ECso absoluto); "EDTA" refere-se a ácido etilenodiaminatetracético; "ee" refere-se a excesso enantiomérico; "ERA" refere-se a receptor alfa de estrogênio; "ERB" refere-se a receptor beta de estrogênio; "EtOAc" refere-se a etil acetato; "EtoOH" refere-se a etanol ou álcool etílico; "FBS" refere-se a Soro Bovino Fetal; "HBSS" refere-se a Hank's Balanced Salt Solution; "HEC" refere-se a hidróxi etil celulose; "HEPES" referese a ácido — 4-(2-hidroxietil)-1- piperazinaetanossulfônico; "HPLC" refere-se à cromatografia líquida de alto desempenho; "ICso" refere-se à concentração de um agente que produz 50% da resposta inibitória máxima possível para esse agente, (IC5o relativa), ou a concentração de um agente que produz 50% de inibição da atividade de enzima alvo em comparação ao controle de placebo (IC5o absoluta); "IPA" refere-se à isopropilamina; "iPrOH" refere- se ao álcool isopropanólico ou isopropílico; "IV" refere-se à administração intravenosa; "Ki" refere-se à constante de inibição; "MEK" refere-se a metil etil cetona; "MeOH" refere-se ao álcool metílico ou metanólico; "MTBE" refere-se a metil t-butil éter; "PBS" refere-se à Salina Tamponada por Fosfato; "PO" refere-se à administração oral; "PRa" refere-se ao receptor alfa de progesterona; "QD" refere-se à dosagem de uma vez ao dia; "RNA" refere-se ao ácido ribonucleico; "RNase" refere-se à ribonuclease; "RT-PCR" refere-se à reação de cadeia de polimerase por transcrição reversa; "RT-gPCR" refere-se à reação de cadeia de polimerase quantitativa por transcrição reversa; "SFC" refere-se à cromatografia de fluido supercrítica; "TEDso" refere- se à dose eficaz para obter 50% de inibição do alvo nos tumores; "THF" refere-se ao tetraidrofurano; "tr" refere-se ao tempo de retenção; "XantPhos Pd G2" refere-se a cloro[(4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-
dimetilxanteno)-2-(2'-amino-1,1"-bifenil)]Jpaládio(ll); e "XPhos Pd G2" refere-se a cloro(2-dicicloexilfosfino-2',4',6'-tri-isopropil-1,1'-bifenil)[2- (2'-amino-1,1'-bifenil)]paládio(!!).
[0022] As seguintes preparações e exemplos também ilustram a invenção. Preparações e Exemplos Esquema 1 | Cc! FONu-on jane Rn R 5 nO o 1 O er o LI ES 2 AD f (DJ Etapa D fe Ho NKy Ne HO Xv 8 fes E HO CG a”
[0023] Esquema 1 retrata a síntese de compostos de Fórmula |.
[0024] Na Etapa A, uma reação Grignard é realizada. Uma reação Grignard é bem conhecida na técnica como uma reação para a formação de ligações carbono-carbono. A reação envolve uma reação organometálica em que um haleto de aril magnésio, o reagente Grignard adiciona a um grupo carbonila, tal como, o cloreto de ácido de composto 2 para fornecer o composto de Etapa A. Por exemplo, uma quinolona substituída por 4-cloro, composto 1, é tratada com um reagente
Grignard, tal como, cloreto de isopropilmagnésio para formar um intermediário Grignard seguido pela adição de um cloreto de ácido, cloreto de 4-fluorobenzoíla, composto 2, em um solvente, tal como, THF. Na conclusão, a reação pode ser interrompida bruscamente com água para fornecer composto 3.
[0025] Na Etapa B, o aril metil éter de composto 3 pode ser desmetilado sob uma variedade de condições reconhecíveis pelo técnico versado, tal como, tratamento com tribrometo de boro. Por exemplo, composto 3 é lentamente tratado com tribrometo de boro em uma temperatura de cerca de 0ºC em um solvente, tal como, DCM. À mistura é agitada em temperatura ambiente e interrompida bruscamente com fosfato de potássio dibásico para fornecer composto 4.
[0026] Na Etapa C, o éter de azetidina 6 pode ser formado por tratamento do correspondente p-fluorofenil cetona 4 e o sal de álcool de azetidina 5, ou a correspondente base livre com uma base adequada, por exemplo, hidreto de sódio, t-butóxido de sódio ou t-butóxido de potássio, no apropriado solvente aprótico polar, tais como, DMF ou THF para fornecer o composto de éter 6.
[0027] Composto 6 é em seguida alquilado com o apropriado ácido aril borônico substituído, composto 7, em uma reação de acoplamento cruzado Suzuki para fornecer composto 8 na Etapa D. O técnico versado reconhecerá que existe uma variedade de condições que podem ser úteis para facilitar tais reações de acoplamento cruzado. Adequados reagentes de paládio podem incluir XantPhos Pd G2, cataCXiumb A Pd G3, cloreto de bis(trifenilfosfina)paládio(II), tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio (0) com triciclo-hexilfosfina, cloreto de (1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno)paládio(Il), paládio tetracistrifenilfosfina, ou acetato de paládio(ll). Adequadas bases podem incluir fluoreto de potássio, carbonato de césio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, t-butóxido de lítio ou mono-hidrato tribásico de fosfato de potássio. Composto 6, por exemplo, pode ser reagido com o apropriado ácido borônico, composto 7, tal como, ácido 2-fluoro-4- (trifluorometil)fenilborônico em um solvente, tal como, 2-metil-2-butanol com uma base, tal como, carbonato de potássio e um catalisador, tal como, XPhos Pd G2 e aquecido para cerca de 80ºC sob condições de micro-ondas para fornecer composto 8.
[0028] Alguém versado na técnica reconhecerá que Etapa D, a reação de acoplamento cruzado Suzuki, pode ser concluída antes da formação de éter de azetidina de Etapa C.
[0029] Na Etapa E, alguém versado na técnica reconhecerá que composto 8 pode ser ciclizado pela redução inicial da cetona. Isto pode ser realizado usando um agente de redução, tal como, boro-hidreto de trietila de lítio em solventes, tal como, 1,4-dioxano e THF e em uma temperatura de cerca de 0 ºC a temperatura ambiente para fornecer o correspondente álcool secundário. Este álcool intermediário pode ser continuado cru e ser desprotonado com uma base adequada, tais como, carbonato de césio, hidreto de sódio, t-butóxido de sódio ou t-butóxido de potássio em um solvente, tais como, THF, DMSO, ou DMF. O resultante alcóxido pode ciclizar-se no fluoreto de arila em temperatura ambiente, com aquecimento ao refluxo, ou em uma temperatura de cerca de 60ºC. O éter cíclico substituído formado após deslocamento do fluoreto pode em seguida ser obtido para fornecer compostos de Fórmula |.
[0030] Alternativamente, a cetona, 8, pode ser reduzida para o álcool e quiralmente purificada na Etapa F para fornecer o álcool quiral 9, e em seguida ciclizada na Etapa G como descrito acima para Etapa E para fornecer compostos de Fórmula |.
[0031] Em outra reação alternativa, a cetona pode ser reduzida usando um reagente quirali, tal como, (R)-(+)-a.a-difenil-2- pirrolidinametanol juntamente com trimetil borato e borano-dimetilsulfeto para diretamente fornecer o desejado álcool quiral, composto 9 que pode em seguida ser ciclizado na Etapa G como descrito acima para Etapa E para fornecer compostos de Fórmula |.
[0032] Em uma etapa opcional, um sal farmaceuticamente aceitável de um composto de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui pode ser formado por reação de uma apropriada base livre de um composto de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui com um apropriado ácido farmaceuticamente aceitável em um solvente adequado sob condições padrão. Adicionalmente, a formação de tais sais pode ocorrer simultaneamente após desproteção de um grupo de proteção de nitrogênio. A possível formação de sais farmaceuticamente aceitáveis é bem conhecida. Veja, por exemplo, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities,' Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); e Berge, S.M,, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977). Alguém versado na técnica apreciará que um composto de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Il! como descrito aqui é prontamente convertido para e pode ser isolado como um sal farmaceuticamente aceitável. Exemplos de sais úteis incluem, porém, não são limitados a, sais de ácido benzenossulfônico e sas de ácido 4 metilbenzenossulfônico. Os sais de ácido 4-metilbenzenossulfônico são também conhecidos como sais de tosilato.
Preparação 1 2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-ilJetan-1-o]
FO NMoH
[0033] Adicionar triacetoxiboro-hidreto de sódio (405 g, 1,91 mol) porção a porção durante um período de 15 minutos a uma solução agitada a O ºC de cloridrato de 3-(fluorometil)azetidina (160 g, 1,28 mol) em DCM (2,4 L) sob N> e agitar a 0ºC durante 10 minutos. Adicionar 1,4-dioxano-2,5-diol (99 g, 0,83 mol) a 0ºC em 6 porções durante um período de 1 hora, em seguida agitar a O a 5ºC durante 15 minutos. Deixar a reação aquecer para a temperatura ambiente e agitar durante 2 horas sob N>. Resfriar a reação para 10 a 15ºC durante um período de 20 minutos, em seguida aquecer para 25 a 30ºC e manter nesta temperatura durante 2 horas. Adicionar água (800 mL) durante um período de 25 a 30 minutos a 10 a 15ºC, permitir aquecer para a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos e em seguida separar as camadas. Lavar a camada aquosa com DCM (800 mL), separar as camadas, em seguida resfriar as camadas aquosas combinadas para a 15ºC e ajustar o pH para 13-14 usando 50% de solução de hidróxido de sódio (-540 mL). Deixar a camada aquosa aquecer para a temperatura ambiente, extrair com DCM (4 X 800 mL), secar com sulfato de sódio (80 g), filtrar e concentrar até a secura para obter o composto do título (139 g, 82%) como um óleo amarelo espesso. ES/MS (m/z): 134,1 (M+H). Preparação 2 Cloridrato de 2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetan-1-o] FO ON“ on Hc!
[0034] Dissolver 2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetan-1-0l (529 g, 4 mol) em MTBE (2,6 L) e resfriar para 0ºC. Adicionar solução de HCIEtoH (492 mL, 30 peso%) gota a gota durante 30 minutos, em seguida agitar a O ºC durante 30 minutos. Filtrar os sólidos e lavar a massa filtrante com MTBE (2 X 200 mL). Secar sob N> durante 8 horas para obter o composto do título (580 g, 86%) como um sólido branco. ES/MS (m/z): 134,0 (M+H). Preparação 3
(3-Cloro-7-metoxiquinolin-4-il)-(4-fluorofenil)metanona
SO “o A nº
[0035] Resfriar uma mistura de 4-bromo-3-cloro-7-metoxiquinolina (70 g, 254 mmol) e THF (1 L) para -40ºC sob N.? resultando em precipitação do material. Adicionar cloreto de isopropilmagnésio (2 M em THF, 254 mL, 509 mmol) durante 20 minutos e agitar a mistura durante 1 hora. Adicionar uma solução de cloreto de 4-fluorobenzoíla (66 mL, 559 mmol) em THF (140 mL) gota a gota, em seguida permitir aquecer para a temperatura ambiente. Saciar a reação com solução de NHACI saturada (300 mL) e água (200 mL) e separar as camadas. Lavar a camada orgânica com solução de NH4CI saturada (300 mL), secar sobre MgSO:, filtrar e concentrar para fornecer um resíduo oleoso. Filtrar o óleo marrom cru através de sílica-gel eluindo com uma mistura de MTBE/hexanos (1:1) para obter o produto cru como um sólido amarelo (84 g). Tratar o sólido com 10% de metilacetato/heptano (800 mL) e agitar em temperatura ambiente durante a noite. Filtrar para coletar os sólidos e reservar. Concentrar o filtrado e purificar sobre sílica-gel eluindo com 10 a 40% de EtOAc/hexanos, em seguida tratar o produto com 10% de metilacetato/heptano (200 mL) e agitar em temperatura ambiente durante 3 horas. Filtrar os sólidos resultantes, combinar com sólidos da filtração anterior e secar sob vácuo durante a noite para obter o composto do título (31 g, 38%) como um sólido amarelo. ES/MS (m/z): 316,0 (M+H). Preparação 4 (3-Cloro-7-hidroxiquinolin-4-il)-(4-fluorofenil)|metanona
E Que “ Cl Ho o nº
[0036] Adicionar tribrometo de boro (1 M em DCM, 295 mL, 295 mmol) a uma mistura de (3-cloro-7-metoxiquinolin-4-il)-(4- fluorofenil)metanona (31 g, 98 mmol) em DCM (217 ml) e agitar a mistura em temperatura ambiente durante 3 dias. Verter a mistura lentamente em uma solução a 0ºC de fosfato de potássio dibásico (2 M em água, 700 mL) e água (200 mL). Deixar a mistura aquecer para a temperatura ambiente e agitar durante 1 hora. Concentrar a solução em vácuo para remover os solventes orgânicos, filtrar, coletar o filtrado e secar o filtrado sob vácuo a 45 ºC durante a noite. Tratar os sólidos com DCM /heptano (1:1, 450 mL) e agitar durante a noite. Coletar os sólidos e secar sob vácuo durante a noite para obter o composto do título (32 g, produção quantitativa) como um sólido marrom claro. ES/MS (m/z): 302,0 (M+H).
Preparação 5 (3-Cloro-7-hidroxiquinolin-4-il)-(4-12-[3-(fluorometil)azetidin-1- ilJetóxiXfenil)|metanona To NC! Ho O nº
[0037] Adicionar cloridrato de 2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetan-1-ol (3,90 g, 23,0 mmol) a uma solução agitada de (3-cloro-7-hidroxiquinolin- 4-il)-(4-fluorofenil)metanona (5,00 g, 15,8 mmol) em DMF (75 ml) seguido por hidreto de sódio (60% em óleo mineral, 3,02 g, 76,8 mmol). Agitar sob N? e aquecer para 40 ºC durante 45 minutos. Saciar a solução com água e concentrar. Dividir o resíduo entre 20% de iPrOH/CHCI;3 e solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada e separar, extrair o aquoso com 2 x 20% de iPrOH/CHCI3, combinar os extratos orgânicos, secar as camadas orgânicas combinadas sobre sulfato de magnésio, filtrar e concentrar o filtrado para obter o produto cru como um óleo vermelho escuro. Purificar o material cru por cromatografia de coluna de sílica-gel eluindo com um gradiente de 5 a 10% de NH; a 7 N em MeOH/DCM para fornecer o composto do título (5,31 g, 84%) como um sólido amarelo. ES/MS (m/z): 415,0 (M+H). Preparação 6 (4-(2-[3-(Fluorometil )azetidin-1-ilJetóxi)fenil)(3-[2-fluoro-4- (trifluorometil)fenil]-7-hidroxiquinolin-4-ilk»metanona LI O o À C
[0038] Desgaseificar com N> (5x) uma mistura de (3-cloro-7- hidroxiquinolin-4-il)-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1- ilJetóxiXfenil)metanona (200 mg, 0,48 mmol), ácido 2-fluoro-4- (trifluorometil)fenilborônico (158 mg, 0,72 mmol), carbonato de potássio (202 mg, 1,45 mmol), 2-metil-2-butanol (3 ml) e água (1 ml) em um frasco de micro-ondas. Adicionar XPhos Pd G2 (12 mg, 0,015 mmol), selar e submeter a microondas a 80ºC durante 2 horas. Dividir o resíduo entre MTBE e solução de NH4CI saturada. Separar as camadas e extrair o aquoso com MTBE. Combinar os extratos orgânicos, secar sobre sulfato de magnésio, filtrar, e concentrar o filtrado para obter um resíduo laranja. Purificar o material cru por cromatografia de coluna de sílica-gel eluindo com 5% de MeOH/DCM para fornecer o composto do título (205 mg, 78%) como um sólido amarelo. ES/MS (m/z): 543,2 (M+H).
[0039] Preparar os seguintes compostos de uma maneira essencialmente análoga ao método de Preparação 6, com as seguintes variações em procedimento, tempos de aquecimento entre 1 a 2 horas, extração com MTBE ou EtOAc, e secagem de camadas orgânicas sobre sulfato de magnésio ou sulfato de sódio.
Purificar por cromatografia de coluna de sílica-gel usando até 10% (MeOH ou MeOH amonizado a 7 M) em DCM (Prep 10: gradiente 3 a 8% de MeOH amonizado a 7 Mem DCM; Preparações 9 e 11: gradiente 4 a 10% de MeOH amonizado a 7 M em DCM) e/ou por cromatografia de fase reversa de pH elevado como notado.
Tabela 2: Compostos preparados de acordo com Preparação 6 Prep ES/MS (m/z) Nome químico Estrutura No. (M+H) (2-B- (Fluorometil)azetidi n-1-ilJetóxi) fenil)(3- LI O o 7 [2-fluoro-3- (CO; 543,0 3 s in ( Da F (trifluorometil)fenil] no O nó FF 7-hidroxiquinolin-4- ilvmetanona [3-(4-Cloro-2- fluorofenil)-7- hidroxiquinolin-4- NO inça-(2-[3- nL! O o O e 509,0 (fluorometil)azetidin O ' 1- Ho né rF ilJetóxiXfenil)metano na [3-(3-Cloro-2- fluorofenil)-7- hidroxiquinolin-4- NO Ia-213- E O O 509,0 (fluorometil)azetidin Cf à cl ' 1- Ho né ilJetóxiXfenil)metano na
[3-(2,4- Difluorofenil)-7- hidroxiquinolin-4- AO i e LI O o F iN(4-(2-[3- 2 O 493,0 (fluorometil)azetidin OC ES -1- Ho né Fr ilJetóxiXfenil)metano na [3-(2,3- Difluorofenil)-7- hidroxiquinolin-4- AO: ; LO iN(4-(2-[3- Oo " O 493,0 (fluorometil)azetidin OC à F 1- HO nó FE ilJetóxiXfenil)metano na
E (Fluorometil)azetidi o s se s NO n-1-ilJetóxiXfenil)[3- e O o 12 (2-fluoro-4- O 489,2 a tilfenil)-7- CX metilfenil). no nº Fr hidroxiquinolin-4- illmetanona
E (Fluorometil)azetidi o | sue s NO n-1-ilJetóxiXfenil)[3- e O o 13 (2-fluoro-3- O 489,2 * tilfenil)-7- CX metilfenil). no nº Fr hidroxiquinolin-4- illmetanona *Purificar por cromatografia rápida de fase reversa de pH elevado (coluna C18 de alta performance RediSep Rf GOLDGO, eluindo com 35 a 45% de ACN em bicarbonato de amônio aquoso a 10 mM com 5% de MeOH). PApós purificação sobre sílica eluir com 4 a 10% de MeOH amonizado a 7 M em DCM, também purificar por cromatografia rápida de fase reversa de pH elevado (coluna C18 de alta performance RediSep Rf GOLDO, eluindo com 30 a 44% de ACN em bicarbonato de amônio aquoso a 10 MM com 5% de MeOH).
Preparação 14 4-(2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)(hidróxi)Metil]-3-[2-fluoro-4- (trifluorometil)fenil]quinolin-7-ol racêmico RIO oh
CG * Ho o Ne F
[0040] Adicionar — (4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]Jetóxilfenil)(3-[2- fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroxiquinolin-4-ilk»metanona — (305 q, 562,2 mmol) e THF (1,5 L) juntos sob N> e resfriar a solução para O a 5ºC. Adicionar trietilboro-hidreto de lítio (1 M em THF, 1,5 L, 1,5 mol) gota a gota. Agitar a mistura a O a 5ºC durante 1 hora. Adicionar água (300 mL) gota a gota e NH.CI saturado (1 L). Aquecer a mistura para a temperatura ambiente. Adicionar EtOAc (2 L) e coletar a camada orgânica. Lavar a camada orgânica com salmoura (500 mL), secar sobre MgSO:, filtrar, e concentrar até a secura. Dissolver o resíduo em mistura de 95:5 de acetona e amônia a 2 M em MeOH e filtrar através de sílica- gel para fornecer o composto do título (264 g, 86,2%) como um sólido laranja. ES/MS (m/z): 545,2 (M+H).
Preparação 15 4-(2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)(hidróxi)Metil]-3-[2-fluoro-4- (trifluorometil)fenil]quinolin-7-ol, Isômero 1
NO F FL É oH F (JF
[0041] Purificar 4-(2-[3-(fluorometi|)azetidin-1- ilJetóxiXfenil)(hidróxi)mMetil]-3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]|quinolin-7-ol racêmico (354 g, 0,62 mol) usando cromatografia quiral sob as seguintes condições: Coluna Chiralpak AD-H, 150 x 50 mm, taxa de vazão 300 g/minuto, UV 350 nm, fase móvel a 35% de iPrOH com 0,5% de DMEA/CO;, temperatura de coluna 40 ºC para fornecer o composto do título (171,4 g, 48%) do primeiro isômero de eluição. Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 1 por SFC analítica quiral, >98% ee, tir) =0,79 minutos, coluna: 4,6 x 150 mm Chiralpak AD-H, eluindo com uma fase móvel de 35% de iPrOH com 0,5% de DMEA em CO:;, taxa de vazão de 0,6 mL/minuto, detecção UV de 350 nm. Preparação Alternada 15
[0042] Adicionar trimetil borato (65 mg, 0,62 mmol) a uma solução de (R)-(+)-a.a-difenil-2-pirrolidinametano! (132 mg, 0,52 mmol) em THF (20 mL). Agitar a mistura sob N2 em temperatura ambiente durante 1 hora. Adicionar borano-dimetilsulfeto (2,0 M em THF, 2,6 mL, 5,2 mmol) seguido por (4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)(3-[2-fluoro-4- (trifluorometil)fenil]-7-hidroxiquinolin-4-il)Ymetanona (1,0 g, 1,73 mmol). Aquecer a reação durante a noite a 45 ºC. Adicionar mais borano- dimetilsulfeto (2,0 M em THF, 2,6 mL, 5,2 mmol) e agitar durante 5 horas a 45 ºC. Lentamente adicionar solução de NH4CI saturada (25 mL) e isolar a fase orgânica. Reextrair o extrato aquoso com 20% de IiPrOH/CHCI3. Combinar os extratos orgânicos, secar sobre Na2SO:., filtrar e evaporar para fornecer um intermediário de complexo de borano (1,2 g). Dissolver um terço do intermediário de complexo de borano (0,4 9, 0,6 mmol) em 1,4-dioxano (4 mL) e etanolamina (0,3 mL, 5 mmol) e aquecer a reação para 70 ºC durante 3 horas. Saciar a reação com solução de NH4CI saturada (25 mL) e isolar a fase orgânica. Reextrair o extrato aquoso com 20% de iPrOH/CHCI3 (4 x 25 mL). Combinar os extratos orgânicos, secar sobre Na2SO:, filtrar e concentrar até a secura para fornecer o composto do título como um sólido laranja (0,33 g, 0,57 mmol, 100% de produção). LC/MS (m/z): [M+H]* 545. Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 1 por SFC analítica quiral, 96% ee, tr) =0,79 minutos, coluna: 4,6 x 150 mm Chiralpak AD-H,
eluindo com uma fase móvel de 35% de iPrOH com 0,5% de DMEA em CO:;, taxa de vazão de 0,6 mL/minuto, detecção UV de 350 nm.
EXEMPLO 1 5-(4-(2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)-8-(trifluorometil)-5H-
[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-o0l racêmico SI O o RF O * Ho O Nº
[0043] Resfriar uma solução de (4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1- ilJetóxi3Xfenil)(3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]-7-hidroxiquinolin-4- ilvmetanona (5,27 g, 9,71 mmol) em 1,4-dioxano (100 mL) para 5ºC. Adicionar trietilboro-hidreto de lítio (1 M em THF, 30,0 mL, 30,0 mmol). Remover o banho de resfriamento e agitar durante 1,5 horas em temperatura ambiente. Saciar a mistura com água. Adicionar solução de NHA4CI saturada e EtOAc. Separar as camadas e extrair a camada aquosa com EtOAc. Combinar os extratos orgânicos, secar sobre MgSO2 anidroso, filtrar e concentrar o filtrado. Dissolver o resíduo cru em THF (100 mL). Adicionar hidreto de sódio (60% em óleo mineral, 1,94 g, 48,5 mmol). Refluxar a solução durante 1,5 horas. Adicionar mais hidreto de sódio (60% em óleo mineral, 1,94 g, 48,5 mmol), em seguida refluxar durante mais 30 minutos. Resfriar a solução para a temperatura ambiente e saciar com água. Adicionar EtOAc e solução de NHA4CI saturada. Separar as camadas e extrair a camada aquosa com EtOAc. Combinar o extrato orgânico, secar sobre MgSO. anidroso, filtrar e concentrar o filtrado. Purificar o resíduo por cromatografia de coluna de sílica-gel eluindo com um gradiente de 5 a 7% de MeOH em DCM para fornecer o composto do título (3,70 g, 72%) como uma espuma amarela clara. ES/MS (m/z): 525,2 (M+H).
[0044] Preparar os seguintes compostos de uma maneira essencialmente análoga ao método de Exemplo 1, com as seguintes variações em procedimento. Para a redução, usar 3 a 5 equivalentes de trietilboro-hidreto de lítio com tempos de reação de 30 minutos a uma hora e secagem das camadas orgânicas sobre sulfato de magnésio ou sulfato de sódio. Usar o resíduo cru diretamente ou purificar por cromatografia de coluna de sílica-gel eluindo com um gradiente de 0-5- 7,5-10% de MeOH em DCM antes da ciclização. Completar a ciclização refluxando em THF durante até 16 horas, ou em DMF, de 2 horas em temperatura ambiente parar Ex 2, a 2 horas a 85ºC para Ex 8. Extrair com DCM ou EtOAc e secar as camadas orgânicas sobre sulfato de magnésio ou sulfato de sódio. Purificar por cromatografia de coluna de sílica-gel usando até 10% (MeOH ou MeOH amonizado a 7 M) em DCM (Ex 2: gradiente de O a 10% de MeOH em DCM; Ex 5: gradiente de 4 a 10% de MeOH amonizado a 7 M em DCM; Ex 8: gradiente de 5 a 7,5% de MeOH amonizado a 7 M em DCM) ou por HPLC de fase reversa de pH elevado como notado. Tabela 3: Compostos de Exemplo preparados de acordo com Exemplo 1 (m/z) (M+H) B5-(4-(2-[3- e | corto ? (trifluorometil)-5H- 525.2
[1]benzopirano[4,3- no N clquinolin-2-o0l racêmico 8-cloro-5-(4-(2-[3-
EEE 3º illetóxilfenil)-5H- 491,0
[1]benzopirano[4,3- no O nê clquinolin-2-o0l racêmico
7-cloro-5-(4-(2-[3- o
O (fluorometil)azetidin-1- e LL O o o 4º ilJetóxilfenil)-5H- O 491,0 Ds
[1]benzopirano[4,3- O > 1 o Ho N clquinolin-2-ol racêmico 8-fluoro-5-(4-(2-[3- o. (fluorometil)azetidin-1- e L NO o TO o. F 5º illetóxilfenil)-sH- O 475,0 *
[1]benzopirano[4,3- Ho C né clquinolin-2-ol racêmico 7-fluoro-5-(4-(2-[3- o : dinda. PNOV F (fluorometil)azetidin-1 FS o ilJetóxilfenil)-5H- O 475,0
[1]benzopirano[4,3- G > 1 o Ho N clquinolin-2-o0l racêmico 5-(4-(2-[3- o. fl til)azetidin-1- [NO (fluorometil)azetidin. e o 7º — | inetóxienil)-B-metil-sH- O 471,2 ás
[1]benzopirano[4,3- ” O nê clquinolin-2-o0l racêmico 5-(4-(2-[3- s dino oO: (fluorometil)azetidin-1 Rd O o ietóxilfenil)-7-metil-5H- O 471,2 *
[1]benzopirano[4,3- no (O né clquinolin-2-o0l racêmico a Purificar por HPLC de fase reversa de pH elevado (KINETEXO C18, 5 um, 30 x 250 mm coluna, eluindo com 35-50% de ACN em bicarbonato de amônio aquoso a 10 mM com 5% de MeOH). b Purificar por HPLC de fase reversa de pH elevado (KINETEXO C18, 5 um, 30 x 250 mm coluna, eluindo com 35-43% de ACN em bicarbonato de amônio aquoso a 10 mM com 5% de MeOH) º Após purificação sobre sílica eluindo com 4-10% de MeOH amoniado a 7 M em DCM, também purificar por HPLC de fase reversa de pH elevado (coluna KINETEXO C18, 5 um, 30 * 250 mm, eluindo com 30-44% de ACN em bicarbonato de amônio aquoso a 10 MM com 5% de MeOH). 4 Purificar por HPLC de fase reversa de pH elevado (coluna XBRIDGEG C18 5 um OBD, 30 x 75 mm, eluindo com 10-75% de ACN em bicarbonato de amônio aquoso a 10 MM com 5%
de MeOH). e Purificar por HPLC de fase reversa de pH elevado (coluna XBRIDGEG C18 5 um OBD, 30 x 75 mm, eluindo com 10-60% de ACN em bicarbonato de amônio aquoso a 10 MM com 5% de MeOH).
EXEMPLO 1A 5-(4-(2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)-8-(trifluorometil)-5H-
[1]benzopirano][4,3-c]quinolin-2-ol, Isômero 1 e EXEMPLO 1B 5-(4-(2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)-8-(trifluorometil)-5H-
[1]benzopirano][4,3-c]quinolin-2-ol, Isômero 2 = oo
O F Dx Ho O Ná
[0045] Separar os dois enantiômeros de 5-(4-(2-[3- (fluorometil)azetidin-1-ilJetóxilfenil)-8-(trifluorometil)-5H-
[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-0l por SFC quiral com as seguintes condições: Coluna: LUXO Celulose-1, 5 x 25 cm; eluindo com uma fase móvel de 30% de iPrOH (com 0,5% de DMEA) em CO»; temperatura de coluna: 40ºC; taxa de vazão: 300 g/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 270 nm para fornecer Exemplo 1A como o primeiro enantiômero de eluição (Isômero 1). ES/MS (m/z): 525,2 (M+H). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 1 por SFC analítica quiral, >99% ee, tr): 1,30 minutos; coluna: CHIRALCELO OD- H, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 30% de MeOH (0,2% de iPA) em CO>; temperatura de coluna: 40ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm. Isolar o composto do título de Exemplo 1B para fornecer o segundo enantiômero de eluição (Isômero 2). ES/MS (m/z): 525,2 (M+H). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 2 por SFC analítica quiral,
98% ee, t6r): 2,03 minutos; coluna: CHIRALCELO OD-H, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 30% de MeOH (0,2% de iPA) em CO;>; temperatura de coluna: 40ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm. EXEMPLO 1B de Preparação Alternada 5-(4-(2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)-8-(trifluorometil)-5H-
[1]benzopirano][4,3-c]quinolin-2-ol cristalino, Is8ômero 2
[0046] Agitar 5-(4-(2-[3-(fluorometil) azetidin-1-ilJetóxilfenil)-8- (trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-o]l, ácido 4- metilbenzenossulfônico, Isômero 2 (23,8 g, 0,034 mol) em água (250 mL) a 1000 rpm. Adicionar NaOH (76 uL) e agitar a solução durante 2 horas. Adicionar DCM (600 mL). Separar a mistura, secar o extrato de DCM com sulfato de magnésio, filtrar o material através de um filtro de seringa (0,45 um) e concentrar até a secura. Deixar o material descansar sob uma corrente de N> durante um fim de semana. Adicionar 1:1 de EtOH/água (80 mL) e agitar a mistura com sonicação. Coletar um sólido castanho por filtração em uma membrana de náilon para fornecer o composto do título (10,47 g, 0,02 mol, 59%). Difração de Pó de Raio X (XRD)
[0047] Os padrões de XRPD de sólidos cristalinos são obtidos sobre um difractômetro de pó de raio X Bruker D4 Endeavor, equipado com uma fonte CuKa e um detector Vantec, operando a 35 kV e 50 mA. À amostra é escaneada entre 4 e 40 20º, com um tamanho de etapa de 0,008 20º e uma taxa de varredura de 0,5 segundos/etapa, e usando divergência a 1,0 mm, antidispersão fixa a 6,6 mm, e fendas de detector de 11,3 mm. O pó seco é embalado em um suporte de amostra de quartzo e uma superfície lisa é obtida usando uma lâmina de vidro. Os padrões de difração de forma de cristal são coletados em temperatura ambiente e umidade relativa. Posições de pico de cristal são determinadas em MDl-Jade após toda mudança de padrão com base em um padrão de NIST 675 interno com picos a 8,853 e 26,774 20º. É bem conhecido na técnica de cristalografia que, para qualquer forma de cristal fornecida, as intensidades relativas dos picos de difração podem variar devido a orientação preferida resultando de fatores, tais como, morfologia de cristal e hábito. Onde os efeitos de orientação preferida estão presentes, as intensidades de pico são alteradas, porém, as posições de pico característico do polimorfo são inalteradas. Veja, por exemplo, The United States Pharmacopeia *%23, National Formulary H18, páginas 1843-1844, 1995. Além disso, é também bem conhecido na técnica de cristalografia que para qualquer forma de cristal fornecida que as posições de pico angular podem variar levemente. Por exemplo, as posições de pico podem mudar devido a uma variação na temperatura em que uma amostra é analisada, deslocamento de amostra ou a presença ou ausência de um padrão interno. No presente caso, uma variabilidade de posição de pico de + 0,2 20º é presumida levar em conta estas variações potenciais sem prejudicar a identificação inequívoca da forma de cristal indicada. Confirmação de uma forma de cristal pode ser feita com base em qualquer combinação única de picos distintos.
[0048] Caracterizar uma amostra preparada de 5-(4-(2-[3- (fluorometil)azetidin-1-ilJetóxilfenil)-8-(trifluorometil)-5H-
[1]benzopirano][4,3-c]quinolin-2-ol cristalino, Is8ômero 2 por um padrão de XRD usando radiação de CuKa como tendo picos de difração (valores 2-teta) como descrito na Tabela 3 abaixo, e em particular tendo picos a 19,8 em combinação com um ou mais dos picos selecionados do grupo consistindo em 6,8, 16,0, e 22,1; com uma tolerância para os ângulos de difração de 0,2 graus. Tabela 4: Picos de Difração de Pó de Raio X do Exemplo 1B Cristalino mais intenso) Es as Ee e E as
EEE EXEMPLO 1B de Preparação Alternada
[0049] Dissolver 4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxilfenil) (hidróxi)Mmetil]-3-[2-fluoro-4-(trifluorometil)fenil]|quinolin-7-01l, Isômero 1 (63,05 g, 104,7 mmol) em DMSO (1,3 L) sob Nº em temperatura ambiente. Adicionar em porções carbonato de césio (108 g, 331 mmol) durante 5 minutos. Aquecer a mistura para 60ºC durante 15 horas. Resfriar a mistura para a temperatura ambiente e diluir com água (2,1 L) e EtOAc (1,3 L). Agitar a mistura durante 5 minutos e separar. Reextrair o material aquoso com EtOAc (1,3 L) e agitar durante 5 minutos. Separar e combinar os extratos orgânicos, lavar com salmoura, água, e EtOAc. Secar os extratos orgânicos com MgSO2, concentrar e secar sob vácuo elevado durante a noite em temperatura ambiente para fornecer o composto do título como um sólido marrom (52,69 g, 95,9%). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Exemplo 1B por SFC analítica quiral, 98,1% ee, tr): 2,03 minutos; coluna: CHIRALCELO OD- H, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 30% de MeOH (0,2% de iPA) em CO>; temperatura de coluna: 40 ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm.
EXEMPLO 2A 5-(4-(2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)-7 -(trifluorometil)-5H-
[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol, Isêômero 1 e EXEMPLO 2B 5-(4-(2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)-7 -(trifluorometil)-5H-
[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol, Isêômero 2 o F E e
CO Ho O Ná
[0050] Separar os dois enantiômeros de 5-(4-(2-[3- (fluorometil)azetidin-1-ilJetóxi)fenil)-7-(trifluorometil)-5H-
[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-0l por SFC quiral com as seguintes condições: Coluna: CHIRALPAKO IC, 21 x 250 cm; eluindo com uma fase móvel de 30% de iPrOH (com 0,2% de iPA) em CO»; temperatura de coluna: 40 ºC; taxa de vazão: 70 g/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm para fornecer Exemplo 2A como o primeiro enantiômero de eluição (Isômero 1). ES/MS (m/z): 525,1 (M+H). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 1 por SFC analítica quiral, >99% ee, tr): 1,56 minutos; coluna: CHIRALPAKO [C, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 30% de iPrOH (0,2% de iPA) em CO;>; temperatura de coluna: 40 ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm. Isolar o composto do título de Exemplo 2B para fornecer o segundo enantiômero de eluição (Isômero 2). ES/MS (m/z): 525,2 (M+H). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 2 por SFC analítica quiral, 98% ee, tr): 2,33 minutos; coluna: CHIRALPAKO IC, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 30% de iPrOH (0,2% de iPA) em CO»; temperatura de coluna: 40ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção
UV: 225 nm.
EXEMPLO 3A 8-Cloro-5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]JetóxilXfenil)-5H-
[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol, Isêômero 1 e EXEMPLO 3B 8-Cloro-5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-il]JetóxilXfenil)-5H-
[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol, Isêômero 2 Seo
CO Ho O nº
[0051] Separar os dois enantiômeros de &8-cloro-5-(4-(2-[3- (fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)- 5SH-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2- ol por SFC quiral com as seguintes condições: Coluna: CHIRALCELO OD-H, 21 x 250 cm; eluindo com uma fase móvel de 35% de MeOH (com 0,2% de iPA) em CO>; temperatura de coluna: 40ºC; taxa de vazão: 80 g/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm para fornecer Exemplo 3A como o primeiro enantiômero de eluição (Isômero 1). ES/MS (m/z): 491,0 (M+H). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 1 por SFC analítica quiral, >99% ee, tt): 1,55 minutos; coluna: CHIRALCELO OD-H, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 35% de MeOH (0,2% de iPA) em CO;>; temperatura de coluna: 40 ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm. Isolar o composto do título de Exemplo 3B para fornecer o segundo enantiômero de eluição (Isômero 2). ES/MS (m/z): 491,0 (M+H). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 2 por SFC analítica quiral, >99% ee, tr): 2,26 minutos; coluna: CHIRALCELO OD-H, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 35% de MeOH (0,2% de iPA) em CO;>; temperatura de coluna: 40 “ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm.
EXEMPLO 4A 7-Cloro-5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxilXfenil)-5H-
[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol, Isêômero 1 e EXEMPLO 4B 7-Cloro-5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxilXfenil)-5H-
[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol, Isêômero 2 F Te
CO Ho O nº
[0052] Separar os dois enantiômeros de 7-cloro-5-(4-(2-[3- (fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)- 5SH-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2- ol por SFC quiral com as seguintes condições: Coluna: CHIRALCELO OD-H, 21 x 250 cm; eluindo com uma fase móvel de 35% de MeOH (com 0,2% de iPA) em CO;>; temperatura de coluna: 40 ºC; taxa de vazão: 80 g/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm para fornecer Exemplo 4A como o primeiro enantiômero de eluição (Isômero 1). ES/MS (m/z): 491,0 (M+H). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 1 por SFC analítica quiral, >99% ee, try: 1,71 minutos; coluna: CHIRALCELO OD-H, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 35% de MeOH (0,2% de iPA) em CO;>; temperatura de coluna: 40 ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm. Isolar o composto do título de Exemplo 4B para fornecer o segundo enantiômero de eluição (Isômero 2). ES/MS (m/z): 491,0 (M+H). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 2 por SFC analítica quiral, >99% ee, tr): 2,38 minutos; coluna: CHIRALCELO OD-H, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 35% de MeOH (0,2% de iPA) em CO;>; temperatura de coluna: 40 “ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm. EXEMPLO 5A
8-Fluoro-5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxilXfenil)-5H-
[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol, Isêômero 1 e EXEMPLO 5B 8-Fluoro-5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxilXfenil)-5H-
[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol, Isêômero 2
CO HO O Nó
[0053] Separar os dois enantiômeros de 8-fluoro-5-(4-(2-[3- (fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)- 5SH-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2- ol por SFC quiral com as seguintes condições: Coluna: CHIRALCELO OD-H, 21 x 250 cm; eluindo com uma fase móvel de 30% de MeOH (com 0,2% de iPA) em CO;>; temperatura de coluna: 40 ºC; taxa de vazão: 80 g/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm para fornecer Exemplo 5A como o primeiro enantiômero de eluição (Isômero 1). ES/MS (m/z): 475,0 (M+H). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 1 por SFC analítica quiral, >99% ee, ttr;: 1,56 minutos; coluna: CHIRALCELO OD-H, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 30% de MeOH (0,2% de iPA) em CO;>; temperatura de coluna: 40 ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm. Isolar o composto do título de Exemplo 5B para fornecer o segundo enantiômero de eluição (Isômero 2). ES/MS (m/z): 475,0 (M+H). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 2 por SFC analítica quiral, >99% ee, tr): 2,29 minutos; coluna: CHIRALCELO OD-H, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 30% de MeOH (0,2% de iPA) em CO;>; temperatura de coluna: 40 “ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm. EXEMPLO 6A 7-Fluoro-5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxilXfenil)-5H-
[1]benzopirano][4,3-c]quinolin-2-ol, Isômero 1 e EXEMPLO 6B 7-Fluoro-5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxilXfenil)-5H-
[1]benzopirano][4,3-c]quinolin-2-ol, Isômero 2
CO HO O Nº
[0054] Separar os dois enantiômeros de 7-fluoro-5-(4-(2-[3- (fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)-5SH-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2- ol por SFC quiral com as seguintes condições: Coluna: CHIRALCELO OD-H, 21 x 250 cm; eluindo com uma fase móvel de 35% de MeOH (com 0,2% de iPA) em CO>; temperatura de coluna: 40ºC; taxa de vazão: 80 g/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm para fornecer Exemplo 6A como o primeiro enantiômero de eluição (Isômero 1). ES/MS (m/z): 475,0 (M+H). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 1 por SFC analítica quiral, >99% ee, tir): 1,32 minutos; coluna: CHIRALCELO OD-H, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 35% de MeOH (0,2% de iPA) em CO;>; temperatura de coluna: 40 ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm. Isolar o composto do título de Exemplo 6B para fornecer o segundo enantiômero de eluição (Isômero 2). ES/MS (m/z): 475,0 (M+H). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 2 por SFC analítica quiral, >99% ee, ttr): 1,95 minutos; coluna: CHIRALCELO OD-H, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 35% de MeOH (0,2% de iPA) em CO;>; temperatura de coluna: 40 “ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm. EXEMPLO 8A
5-(4-(2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)-7-metil-5H-
[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol, Isêômero 1 e EXEMPLO 8B 5-(4-(2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)-7-metil-5H-
[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol, Isêômero 2 es
CO Ho O NÉ
[0055] Separar os dois enantiômeros de 5-(4-(2-[3- (fluorometil)azetidin-1-ilJetóxilfenil)-7-metil-5H-[1]benzopirano[4,3- clquinolin-2-0l por SFC quiral com as seguintes condições: Coluna: CHIRALCELO OD-H, 21 x 250 cm; eluindo com uma fase móvel de 30% de iPrOH (com 0,2% de iPA) em CO»; temperatura de coluna: 40ºC; taxa de vazão: 80 g/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 265 nm para fornecer Exemplo 8A como o primeiro enantiômero de eluição (Isômero 1). ES/MS (m/z): 471,2 (M+H). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 1 por SFC analítica quiral, >99% ee, tir: 1,47 minutos; coluna: CHIRALCELO OD-H, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 30% de iPrOH (0,2% de iPA) em CO;>; temperatura de coluna: 40 ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm. Isolar o composto do título de Exemplo 8B para fornecer o segundo enantiômero de eluição (Isômero 2). ES/MS (m/z): 471,2 (M+H). Confirmar enriquecimento enantiomérico de Isômero 2 por SFC analítica quiral, >99% ee, tfr): 2,05 minutos; coluna: CHIRALCELO OD-H, 4,6 x 150 mm; eluindo com uma fase móvel de 30% de iPrOH (0,2% de iPA) em CO;>; temperatura de coluna: 40 “ºC; taxa de vazão: 5 mL/minuto; Comprimento de onda de detecção UV: 225 nm. EXEMPLO 9
5-(4-(2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)-8-(trifluorometil)-5H-
[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol, Isômero 2, ácido benzenossulfônico S Re oo S O S Cor Ho CG Nº
[0056] Aquecer uma suspensão de 5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin- 1-ilJetóxisfenil)-8-(trifluorometil)-5SH-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-o], Isômero 2 (Exemplo 1B) (100 mg, 0,19 mmol) em ACN (3 mL) a 50ºC. Adicionar uma solução de mono-hidrato de ácido benzenossulfônico (40 mg, 0,23 mmol) em ACN (1 mL). Aquecer a solução amarela clara durante 10 minutos a 50 ºC. Descontinuar o aquecimento, deixar a mistura de reação resfriar para a temperatura ambiente, e agitar a mistura durante a noite. Adicionar tolueno (2 mL) e agitar a mistura de reação 2 horas. Filtrar a solução, coletar o sólido resultante e lavar o sólido com ACN (1 mL). Secar o sólido sob vácuo para fornecer o composto do título (74 mg, 55%). EXEMPLO 9 de Preparação Alternada
[0057] Aquecer uma suspensão de 5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin- 1-ilJetóxisfenil)-8-(trifluorometil)-5SH-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-o], Isômero 2 (Exemplo 1B) (124,1 mg, 0,24 mmol) em MEK (4 mL) a 50ºC. Adicionar uma solução de mono-hidrato de ácido benzenossulfônico (50 mg, 0,28 mmol) dissolvido em MEK (1 mL). Descontinuar o aquecimento, deixar a mistura de reação resfriar para a temperatura ambiente, e agitar a mistura durante um fim de semana. Concentrar sob uma corrente de N2. Adicionar MEK (1 mL) e suspensão para fornecer um sólido cristalino amarelo. Coletar o sólido, lavar com MEK, e secar sob temperatura ambiente em vácuo para fornecer o composto do título (78,8 mg, 48%). XRD, Exemplo 9
[0058] Completar XRD como descrito para exemplo 1B.
Caracterizar uma amostra preparada de -(4-(2-[3-(fluorometil) azetidin- 1-ilJetóxisfenil)-8-(trifluorometil)-5SH-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-o], Isômero 2, ácido benzenossulfônico por um padrão de XRD usando radiação de CuKa como tendo picos de difração (valores 2-teta) como descrito na Tabela 4 abaixo, e em particular tendo picos a 20,5 em combinação com um ou mais dos picos selecionados do grupo consistindo em 12,3, 22,2, e 23,1; com uma tolerância para os ângulos de difração de 0,2 graus. Tabela 5: Picos de Difração de Pó de Raio X do Exemplo 9 Cristalino Ângulo (º2-Teta) +/- | Intensidade relativa (% de pico EP a EP Ds EP ss EXEMPLO 10 5-(4-(2-[3-(Fluorometil)azetidin-1-ilJetóxiXfenil)-8-(trifluorometil)-5H-
[1]benzopirano][4,3-c]quinolin-2-ol cristalino, ácido 4- metilbenzenossulfônico, Isômero 2 as Fo Ds Õ od SO
[0059] Adicionar juntos 5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-
ilJetóxiXfenil)-8-(trifluorometil)-5SH-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-o], Isômero 2 (Exemplo 1B) (204,2 g, 389 mmol) e EtOAc (5 L) e agitar a 60 ºC seguidos pela adição de MeOH (200 mL) a 60 ºC para fornecer uma solução marrom clara. Adicionar o produto título (11,48 g) para semear a solução seguido pela adição de uma solução pré-misturada de ácido 4-metilbenzenossulfônico; hidrato (81,4 g, 428 mmol) em EtOAc (800 mL) para fornecer uma suspensão amarela. Agitar a suspensão durante 30 minutos a 50ºC. Concentrar a suspensão para 4/2 volume. Resfriar a solução em temperatura ambiente durante 1 hora, filtrar, coletar o sólido, e lavar o sólido com EtOAc. Secar o sólido sob vácuo a 30ºC durante um fim de semana para fornecer o composto do título (239 g, 343 mmol). Para também purificar o material, adicionar o composto do título (229 g, 328,7 mmol) e 2-propanol (4,6 L) juntos e aquecer para 60 ºC durante 2 horas. Resfriar para a temperatura ambiente durante 30 minutos. Filtrar o sólido e lavar com iPrOH (100 mL). Secar o sólido sob uma corrente de N> durante a noite para fornecer o composto do título (174,4 g, 76,2%). Combinar vários lotes do composto do título preparados essencialmente da mesma maneira e adicionar heptano (2 L). Agitar a suspensão durante 30 minutos, filtrar o sólido e lavar com heptano (300 mL). Secar o sólido coletado sob uma corrente de N> durante a noite para fornecer o composto do título (199,7 9, 99,5%).
XRD, Exemplo 10
[0060] Completar o XRD como descrito para exemplo 1B. Uma amostra preparada de 5-(4-(2-[3-(fluorometil)azetidin-1-ilJetóxi)fenil)-8- (trifluorometil)-5H-[1]benzopirano[4,3-c]quinolin-2-ol ácido, 4- metilbenzenossulfônico, Isômero 2 (Exemplo 10) é caracterizada por um padrão de XRD usando radiação de CuKa como tendo picos de difração (valores 2-teta) como descrito na Tabela 5 abaixo, e em particular tendo picos a 20,1 em combinação com um ou mais dos picos selecionados do grupo consistindo em 12,8, 19,5, e 22,8; com uma tolerância para os ângulos de difração de 0,2 graus. Tabela 6: Picos de Difração de Pó de Raio X do Ex 10 Cristalino Intensidade relativa (% E om NE A O Ds Ee so Ensaios Biológicos
[0061] A evidência para uma relação entre expressão de ER e certos cânceres é bem conhecida na técnica.
[0062] Os resultados dos seguintes ensaios demonstram que os compostos de Fórmula |, Fórmula Il e Fórmula Ill dos exemplos são SERDs ativos e são concebidos ser úteis no tratamento de câncer. Ensaio de ligação de competição de ERa (tipo selvagem), ERa (Y537S mutante) e ERB
[0063] O objetivo dos seguintes ensaios de ligação de competição de ER é determinar a afinidade de um composto teste contra ERa (tipo selvagem), ERa (Y537S mutante) e ERB.
[0064] Executar o ensaio de ligação de competição em um tampão contendo HEPES a 50 mM, pH 7,5, EDTA a 1,5 mM, NaCl a 150 mM, 10% de glicerol, 1 mg/mL de ovalbumina, e DTT a 5 mM, usando 0,025 pCi por cavidade de º*H-estradiol (118 Ci/mmol, 1 mCi/mL), 7,2 ng/cavidade de ERa (tipo selvagem), ou 7,2 ng/cavidade de ERa Y537S mutant) ou 7,7 ng/cavidade de receptor ERB. Adicionar o composto teste em 10 diferentes concentrações variando de 10,000 nM a 0,5 nM, e determinar ligação não específica na presença de 1 uM de 17-B estradiol. Incubar a reação de ligação (140 uL) durante 4 horas em temperatura ambiente, e em seguida adicionar tampão de carvão vegetal/dextrano frio (70 uL) (contendo 50 mL de tampão de ensaio, 0,75 g de carvão vegetal e 0,25 g de dextrano) a cada reação. Misturar as placas durante 8 minutos em um agitador orbital a 4 ºC e em seguida centrifugar a 3000 rpm a 4 ºC durante 10 minutos. Transferir uma alíquota (120 uL) da mistura para outra placa de base plana branca de 96 cavidades (Costar) e adicionar fluido de cintilação Perkin Elmer Optiphase Supermix (175 uL) a cada cavidade. Selar as placas e agitar vigorosamente em um agitador orbital. Após uma incubação de 2,5 horas, ler as placas em um contador Wallac Microbeta. Calcular o IC5o usando um ajuste de curva logística de 4 parâmetros e calcular % de inibição a 10 uM. Converter os valores IC5o para o composto K; usando equação de Cheng-Prusoff. Os resultados deste ensaio demonstram que Exemplos 1, 1A, e 1B (e outros) ligam-se ao ERa mutante e ERa tipo selvagem recombinantes (Y537S) como mostrado na Tabela 7 abaixo e Exemplo 1B foi também determinado para ligar-se a ERB com uma competição de ERB a K; (nM) de 0,11 + 0,07, n=3.
Tabela 7: Resultados de ligação de competição de ERa (tipo selvagem), ERa (Y537S mutante) e ERB
[Bs o es 8 a BT [Bs as sm LB aa a
[0065] Dos compostos exemplificados testados, o Ki para ERa tipo selvagem variou de cerca de 0,300 nM a cerca de 65 nM. O Ki para ERa Y537S mutante variou de cerca de 2 nM a 300 nM. Os resultados deste ensaio demonstram a afinidade de ligação e potência dos compostos exemplificados contra proteínas ERa de tipo selvagem, mutante (ESR1 Y537S) e ERÊ. Ensaio de degradação de ERa em células MCF7
[0066] O objetivo do seguinte ensaio de degradação de ERa é medir a degradação de ERa por um composto teste em uma linhagem celular de câncer de mama de ERa positivo, tal como, MCF7.
[0067] Cultivar células MCF7 (adquirido de ATCC HTB-22) em meio DMEM suplementado com 10% de FBS, 0,01 mg/mL de insulina humana 1 e 1% de antibióticos penicilina/estreptomicina e plaquear em placas de base plana de 384 cavidades em uma densidade de 4.000 células por cavidade em meio DMEM livre de fenol vermelho (20 uL) contendo 10% de FBS isento de carvão. Incubar as células durante a noite em um incubador de cultura celular (5% de CO», 95% de umidade relativa e 37ºC) e deixar as células se ligarem à placa.
No dia seguinte, dosar as células com o composto teste.
Usar um dispensador acústico Echo 555 para preparar diluições seriais de composto teste (1:3) variando de 6 uM a 0,0003 uM.
Dosar as células com a adição de 5 ul da placa de diluição serial à placa de célula produzindo uma concentração de DMSO final de 0,2% com uma faixa de dose de concentração de composto teste final entre 2 e 0,0001 uM.
Para o ponto máximo, usar o meio contendo 0,2% de DMSO e para o ponto mínimo, usar fulvestrante diluído em 2 uM de concentrações finais no meio de desenvolvimento contendo 0,2% de DMSO.
Após dosagem com o composto teste, incubar a placa de células a 37 ºC e 5% de CO» durante 24 horas.
Fixar as células adicionando 14% de para-formaldeído (10 uL) durante 30 minutos em temperatura ambiente.
Lavar as células uma vez com PBS (20 uL) e incubar com PBS (20 uL) contendo 0,5% (v/v) de TWEENO 20 durante 1 hora.
Lavar as células com PBS contendo 0,05% de TWEENQO 20 (2x) e bloquear com 3% de BSA em PBS contendo 0,05% de TWEENO 20 e 0,1% de TRITONTY X-100 (20 ul/cavidade) durante 1 hora em temperatura ambiente.
Adicionar diluição de 1:500 de anticorpo primário (20 uL) (anticorpo de coelho monoclonal de ERa (Clone SP1) tRM-9101-S, Thermo Scientific) em 1% de BSA em PBS contendo 0,05% de TWEENO 20 por cavidade, selar as placas e incubar durante a noite a 4ºC.
No dia seguinte, lavar as células com PBS contendo 0,05% de TWEENO 20 (2x) e incubar com anticorpo secundário (20 ul/cavidade) (diluição de 1:1000, IgM anticoelho de cabra ALEXA FLUORTY 488) em PBS, 1% de BSA durante 105 minutos em temperatura ambiente.
Após lavar as placas com PBS (2x20 yL), adicionar RNase (Sigma) (20 ul de 50 pug/mL) e diluição de 1:1000 de iodeto de propídio em PBS por cavidade (20 yuL). Selar as placas e incubar 1 hora em temperatura ambiente sobre a bancada (preservado de luz). Escanear as placas com ACUMEN EXPLORER" [Citômetro de microplaca de fluorescência de varreduara a laser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir ERa. A análise de imagem é baseada em sinais fluorescentes celulares para identificar células positivas. Identificar as células de ER positivo por intensidade média. Usar intensidade total a 575-640 nm de iodeto de propídio/DNA para identificar células individuais. A saída do ensaio é % de células de ER positivo. Determinar o IC5o por ajuste de curva a uma logística de quatro parâmetros para cada saída usando GENE DATA'Y. Os resultados deste ensaio demonstram potente degradação de ERa induzida pelos compostos de Fórmula |, Fórmula Il, e Fórmula Ill como descrito aqui em células de câncer de mama MCF7. Os valores de ICrso relativos para exemplos 1, 1A, e 1B são mostrados na Tabela 8.
Tabela 8: Ensaio de degradação de ERa em células MCF7 [E emmessomenass —
[88 anana [E anmeesoneessa —
[0068] Especificamente, os resultados na Tabela 7 mostram potente degradação de ERa pelo composto de Exemplo 1 em células de câncer de mama MCF7. Dos compostos exemplificados testados, o IC5o relativo variou de 0,003 a >2 uM indicando que todos, exceto Exemplo 2B mostraram atividade na concentração testada. Os resultados deste ensaio demonstram que o composto de Fórmula (1) é um SERD com atividade de degradação de ERa potente em células. Ensaio de indução de PRa em células MCF7
[0069] O objetivo do seguinte ensaio de indução de PRa é determinar se um composto teste tem atividade agonística contra receptor de ERa (um agonista seria esperado ativar o receptor).
[0070] Cultivar MCF7 (adquirido de ATCC HTB-22) em meio DMEM suplementado com 10% de FBS, 0,01 mg/mL de insulina humana 1 e 1% de antibióticos penicilina/estreptomicina e plaquear as células (antes de se tornarem 70% confluentes) em placas de base plana de 384 cavidades em uma densidade de 4.000 células por cavidade em volume de 20 ul emmeio livre de fenol vermelho DMEM contendo 10% de FBS (isento de carvão vegetal). Incubar as células durante a noite em um incubador de cultura celular (5% de CO>2, 95% de umidade relativa a 37ºC) e deixar as células se ligarem à placa. No dia seguinte, dosar as células com composto teste. Usar um dispensador acústico Echo 555 para preparar diluições seriais de composto (1:3) variando de 6 UM a 0,0003 uM. Dosar as células com a adição do composto teste (5 uL) da placa de diluição serial à placa de célula produzindo uma concentração de DMSO final de 0,2% com uma concentração final da dose de composto teste variando entre 2 e 0,0001 uM. Para o ponto máximo, usar o meio contendo 0,2% de DMSO e para o ponto mínimo, usar fulvestrante diluído em concentrações finais a 2 uM no meio de desenvolvimento contendo 0,2% de DMSO. Após dosagem com o composto teste, incubar as placas de célula a 37ºC e 5% de CO» durante 24 horas. Fixar as células adicionando 14% de para-formaldeído (10 uL) durante 30 minutos em temperatura ambiente. Lavar as células uma vez com PBS (20 uL) e incubar com PBS (20 uL) contendo 0,5% (v/v) de TWEENO 20 durante 1 hora. Lavar células duas vezes com PBS (20 uL) contendo 0,05% de TWEENO 20 e bloquear com 3% de BSA em PBS contendo 0,05% de TWEENÔO 20 e 0,1% de TRITONTY X-100 (20 ul/cavidade) durante 1 hora em temperatura ambiente. Adicionar diluição de 1:500 de anticorpo primário (20 uL) (Anticorpo anti-humano de camundongo monocional PR, clone PgR 636 Dako, M3569) em 1% de BSA/PBS com 0,05 de TWEENO 20 por cavidade, selar as placas e incubar durante a noite a 4 ºC.
[0071] No dia seguinte, lavar células com PBS 0,05% de TWEENGO (2 x 20 uL) e incubar com anticorpo secundário (20 uL/cavidade) (diluição de 1:1000, IgM anticoelho de cabra ALEXA FLUORTY 488) em PBS 1% de BSA durante 105 minutos em temperatura ambiente. Após lavar com PBS (2 x 20 uL), adicionar RNase (20 ul de 50 ug/mL) (Sigma) e diluição de 1:1000 de iodeto de propídio em PBS por cavidade. Selar as placas e incubar 1 hora em temperatura ambiente sobre a bancada (preservado de luz). Escanear as placas com ACUMEN EXPLORER'Y [Citômetro de microplaca de fluorescência de varreduara a laser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir PRa. A análise de imagem é baseada em sinais fluorescentes celulares para identificar células positivas. Identificar células de PR positivo por intensidade média. Usar intensidade total a 575-640 nm de iodeto de propídio/DNA para identificar células individuais. A saída do ensaio é % de céluals de PR positivo. Determinar o IC5o por ajuste de curva a uma logística de quatro parâmetros para cada saída usando GENE DATATY. Os resultados deste ensaio não demonstram nenhuma significante atividade agonística de Exemplos 1, 1A, e 1B em células de câncer de mama MCF7. Para os compostos testados, os ICrsos relativos neste ensaio são > 2 uM. Os resultados deste ensaio não demonstram nenhuma significante atividade agonística dos compostos exemplificados testados em células de câncer de mama MCF7. Estes resultados também demonstram que os compostos exemplificados testados são antagonistas de ERa em células de câncer de mama MCF7 (isto é, eles têm atividade SERD). Ensaio celular de inibição de PRa (antagonismo funcional de ERa) em células MCF7-ESR1 Y537N 682 CRISPR
[0072] O objetivo do seguinte ensaio celular de inibição de PRa (antagonismo funcional de ERa) é determinar a atividade antagonística de um composto teste contra o receptor de ERa mutante Y537N. Um antagonista neste ensaio é esperado bloquear a função do receptor de ERa. PRa é um alvo transcricional a jusante de ERa e consequentemente um antagonista de ERa é esperado inibir a expressão de PRa.
[0073] Cultivar MCF7-ESR1 Y537N-682 (gerado por edição de gene CRISPR/Cas9 de gene ESR1 em células MCF7, clonet%682) em meio DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de antibióticos penicilina/estreptomicina e plaquear as células (antes de se tornarem 70% confluentes) em placas de base plana de 384 cavidades em uma densidade de 4.000 células por cavidade em meio livre de fenol vermelho DMEM, 10% de FBS (volume de 20 uL) (isento de carvão vegetal). Incubar as células durante a noite em um incubador de cultura celular (5% de CO>, 95% de umidade relativa e 37ºC) e deixar as células se ligarem à placa. No dia seguinte, dosar as células com o composto teste. Usar um dispensador acústico Echo 555 para preparar diluições seriais de composto (1:3) variando de 6 UM a 0,0003 UM. Dosar as células com a adição de 5 ul da placa de diluição serial à placa de célula produzindo uma concentração de DMSO final de 0,2% com uma faixa de dose de concentração de composto teste final entre 2 e 0,0001 UM. Para o ponto máximo, usar o meio contendo 0,2% de DMSO e para o ponto mínimo, usar fulvestrante diluído em concentrações finais a 2 uM no meio de desenvolvimento contendo 0,2% de DMSO. Após dosagem com composto teste, incubar as placas de células a 37 ºC e 5% de CO, durante 72 horas. Fixar as células adicionando 14% de para- formaldeído (10 uL) durante 30 minutos em temperatura ambiente. Lavar as células com PBS (1x20 uL) e incubar com PBS (20 uL) contendo 0,5% (v/v) de TWEENQ 20 durante 1 hora. Lavar as células com PBS (2 x 20 uL), 0,05% de TWEENO 20, e bloquear com 3% de BSA/PBS, 0,05% de TWEENGO 20, 0,1% de TRITONTY X-100 (20 ul/cavidade) durante 1 hora em temperatura ambiente. Adicionar diluição de 1:500 de anticorpo primário (20 uL) (anticorpo anti-humano de camundongo monocional PR, clone PgR 636 Dako, M3569) em 1% de BSA/PBS, 0,05 TWEENO 20 por cavidade, selar as placas e incubar durante a noite a 4 ºC.
[0074] No dia seguinte, lavar as células com PBS a 0,05% & (2 x uL) e incubar com anticorpo secundário (20 uL/cavidade) (diluição de 1:1000, IgM anticoelho de cabra ALEXA FLUOR'Y 488) em PBS a 1% de BSA durante 105 minutos em temperatura ambiente. Após lavar com PBS (2 x 20 uL), adicionar RNase (20 ul de 50 ug/mL) (Sigma) e diluição de 1:1000 de iodeto de propídio em PBS por cavidade. Selar as placas e incubar 1 hora em temperatura ambiente sobre a bancada (preservado de luz). Escanear as placas com ACUMEN EXPLORER TY
[Citômetro de microplaca de fluorescência de varreduara a laser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir PRa. A análise de imagem é baseada em sinais fluorescentes celulares para identificar células positivas. Identificar células de PR positivo por intensidade média. Usar intensidade total a 575-640 nm de iodeto de propídio/DNA para identificar células individuais. A saída do ensaio é % de células de PR positivo. Determinar o IC5o por ajuste de curva a uma logística de quatro parâmetros para cada saída usando GENE DATA'Y.
[0075] Os resultados deste ensaio demonstram inibição potente de PRa e antagonismo funcional por Exemplos 1, 1A, e 18 em células de câncer de mama MCF7 (ESR1 Y537N, mutante heterozigoto). Os ICs5os relativos de Exemplos 1, 1A, e 1B (e outros) neste ensaio são mostrados na Tabela 9 abaixo. Os ICs5os relativos dos compostos exemplificados testados variam de cerca de 0,0118 a > 1,6 uM indicando que os compostos exemplificados são potentes antagonistas de ERa mutante (Y537N) e potentes inibidores de transcrição mediada por ERa exceto exemplo 2B 1,6 uM). PRa (PGR) é também um alvo transcricional de ERa e os resultados deste ensaio demonstram inibição potente de transcrição mediada por ERa de PRa. Tabela 9: Ensaio celular de inibição de PRa (antagonismo funcional de ERa) em células MCF7 Y537N 682 CRISPR
[é osssesamenasa — [ss — oois — E posaronesaaa Ensaio celular de inibição de PRa (antagonismo funcional ERa) em células MCF7
[0076] O objetivo do seguinte ensaio celular de inibição de PRa (antagonismo funcional de ERa) é determinar a atividade antagonística de um composto teste contra o receptor ERa. Um antagonista neste ensaio é esperado bloquear a função do receptor ERa. PRa é um alvo transcricional a jusante de ERa e consequentemente um antagonista de ERa é esperado inibir a expressão de PRa.
[0077] Realizar as condições de ensaio como detalhado no ensaio Acumen de base celular de degradação de ERa acima, usando a linhagem celular MCF7 exceto que, antes do composto teste dispensar, remover o meio da placa de célula e pré-tratar todas as cavidades exceto as cavidades de controle negativo (coluna 24 da placa) com meio de ensaio contendo 0,47 nM de estradiol durante 30 minutos. Neste ensaio, realizar imunocoloração para a detecção de PRa e escanear as placas com ACUMEN EXPLORER'Y [Citômetro de microplaca de fluorescência de varreduara a laser fabricado por TTP LABTECH LTD] para medir PRa.
A análise de imagem é baseada em sinais fluorescentes celulares para identificar células positivas.
Identificar células de PRa positivas por intensidade média.
Usar intensidade total a 575-640 de iodeto de propídio/DNA para identificar células individuais.
A saída do ensaio é % de células de PRa positivas.
Determinar o ICso por ajuste de curva a uma logística de quatro parâmetros para cada saída usando GENE DATA'Y.
Os resultados deste ensaio demonstram inibição potente de PRa e antagonismo funcional POR Exemplos 1, 1A, e 1B em células de câncer de mama MCF7. O ICs5o relativo de Exemplos 1, 1A, e 1B neste ensaio é mostrado na Tabela 10 abaixo.
O IC5o relativo dos compostos exemplificados variam de cerca de 0,029 a >2 uM indicando que todos os compostos exemplificados testados exceto 1A e 2B, são potentes antagonistas de proteína de tipo selvagem ERa e um potente inibidor de transcrição mediada por ERa.
PRa (PGR) é também um alvo transcricional de ERa e os resultados deste ensaio demonstram inibição potente de transcrição mediada por ERa de PRa na concentração testada.
Tabela 10: Ensaio celular de inibição de PRa (antagonismo funcional ERa) em células MCF7
E [sm ones E mas: Ensaio de proliferação celular em MCF7 e MCF7-ESR1 Y537N-682
[0078] O objetivo dos seguintes ensaios de proliferação celular geralmente é detectar se um composto teste tem efeitos sobre proliferação celular.
[0079] Semear células MCF7 (adquirido de ATCC HTB-22) em uma densidade de 2.000 células por cavidade em meio livre de fenol vermelho DMEM, 10% de FBS (volume de 20 uL) (isento de carvão vegetal) em uma placa de cultura celular de 384 cavidades de base clara. Plaguear MCF7-ESRY537N -682 (gerada por edição de gene CRISPR/Cas9 de gene ESri em células MCF7, clone %682) em meio DMEM suplementado com 10% de FBS, e 1% de antibióticos penicilina/estreptomicina em uma densidade de 1000 células por cavidade. Incubar as placas a 37ºC e 5% de CO». No dia seguinte, dosar as células com o composto teste. Usar um dispensador acústico Echo
555 para preparar diluições seriais de composto teste (1:3) variando de 60 uM a 0,003 uM.
Dosar as células com a adição de 5 ul da placa de diluição serial à placa de célula, produzindo uma concentração de DMSO final de 0,2% com uma faixa de dose de concentração de composto teste final entre 20 e 0,001 uM.
Para o ponto máximo, usar o meio contendo 0,2% de DMSO e para o ponto mínimo, usar fulvestrante diluído em concentrações finais a 2 UM no meio de desenvolvimento contendo 0,2% de DMSO.
Após dosagem com o composto teste, incubar as placas de células a 37ºC e 5% de CO». Sete dias após a adição de compsto teste, remover as placas do incubador e adicionar EtOH frio a 96% (65 uL) a cada cavidade.
Após 30 minutos, remover o meio e adicionar RNase (20 ul de 50 pug/mL) (Sigma) e diluição de 1:1000 de iodeto de propídio em PBS por cavidade.
Selar as placas e incubar 1 hora em temperatura ambiente sobre a bancada (preservado de luz). Escanear as placas com ACUMEN EXPLORER" [Citômetro de microplaca de fluorescência de varreduara a laser fabricado por TTP LABTECH LTD]. A linha celular MCF-7 cresce formando agregados, número de células como número de objetos pode não ser capaz de ser usado como leitura; então o número de célula pode ser avaliado através de número estimado de células (calculado através do parâmetro de área (relação de área total da população de células totais (uma faixa designada de intensidade de pico de FL-1 (PI) e a área média da população de células únicas (definido por perímetro)). Determinar o IC5o por ajuste de curva a uma logística de quatro parâmetros para cada saída usando GENE DATATY.
O ICso relativo de Exemplos 1, 14, e 1B (e outros) em células MCF7 ESR1 tipo selvagem e MCF7-ESR1 Y537N mutantes são mostrados na Tabela 10 abaixo.
Os resultados deste ensaio demonstram potente atividade antiproliferativa e inibição de crescimento celular por Exemplos 1, 1A, e 1B (e outros) em células de câncer de mama MCF7 (ESR1 tipo selvagem) e MCF7 (ESR1 Y537N mutant). O ICs5o relativo dos compostos exemplificados variam de cerca de 0,0035 a 1,176 uM em células de câncer de mama MCF7 ESR1 tipo selvagem e 0,014 a 1,86 uM em MCF7 (ESR1 Y537N mutante) indicando que todos os compostos exemplificados testados demonstram potente atividade antiproliferativa e inibição de crescimento celular em células de câncer de mama MCF7 (ESR1 tipo selvagem) e MCF7 (ESR1 Y537N mutante). Tabela 11: Ensaio de proliferação celular em MCF7 e MCF7- ESR1Y537N-682 IC5o Relativo (uM) de ESR1 tipo selvagem mutantes
FETO E A enorme |
Ensaio de inibição alvo in vivo (IVTI) (ensaio PGR RT-GPCR) em tumores MCF7
[0080] O objetivo deste ensaio IVTI é medir a capacidade de um composto teste (SERD) inibir expressão de gene PRa (transcrição) a jusante de ERa em tumores de enxerto implantados em camundongos.
[0081] Implantar células de câncer de mama de ER-positivo MCF7 de camundongos NOD SCID fêmeas (22-25 g) de Envigo RMS, Inc., Madison, Wisconsin com 5x10€8 (ATCC, t% HTB-22) subcutaneamente na região do flanco direito em 1:1 de solução de HBSS + MATRIGELTY (200 uL). Implantar uma pélete de estradiol 17- B (0,18 mg/pélete, liberação de 90 dias, de Innovative research) subcutaneamente 1 dia antes da implantação de célula de tumor. Medir o crescimento de tumor e peso corporal duas vezes por semana iniciando no sétimo dia após a implantação. Quando os tamanhos de tumor atingirem 250-350 mm?, randomizar os animais e agrupar em grupos de cinco animais. Dosar os animais com o composto teste em múltiplas doses em um veículo específico de composto teste (1% de hidroxietilcelulose/0,25% de TWEENÔO 80/0,05% de antiespuma em água purificada) ou veículo sozinho oralmente durante 3 dias e coletar tumores e sangue em intervalos de tempo desejados após a última dose. Sacrificar os animais usando anestesia com isoflurano mais deslocamento cervical. Tumores congelados instantaneamente e armazenados a -80ºC até o processamento para isolamento de RNA e ensaio de RT-gPCR. Coletar sangue em tubos de EDTA, centrifugar para plasma, e congelar a -80ºC em uma placa de 96 cavidades. Determinar exposições de composto teste usando espectrometria de massa.
[0082] Pulverizar os tumores em nitrogênio líquido e lisar em tampão de lise de 1xRNA (de Kkits de isolamento de RNA) usando contas
Matrix D (MP Biomedical, 6913-500) em uma máquina de disruptor de célula FASTPREP-24'Y (MP Biomedical). Transferir lisatos de tumor para tubos novos após centrifugação a 14000 rpm durante 20 minutos a 4 ºC. Isolar RNA de lisatos de tumor usando Mini Kit PURELINKO RNA (Invitrogen H12183018A) ou Mini Kit RNeasy (Qiagen H74104 e 474106). Remover DNA contaminantes usando PURELINKO DNase Set (Invitrogen f12185010) ou RNase-Free DNase Set (Qiagen 79254). Medir concentração de RNA isolado diluindo amostras em água livre de RNase e medindo a absorvência a 260 nm em uma leitora de placa (SpectraMax190). Subtrair a medição de absorvência a 260 nm média do branco (água livre de RNase somente) das medições a 260 nm de todas as outras amostras de RNA. Diluir amostras de RNA em concentrações iguais em água livre de RNase. Sintetizar CDNA de RNA diluído usando sistema de síntese de primeira fita para RT-PCR (Invitrogen, t18080-051). Para realizar RT-9PCR, primeiro diluir CONA em água livre de RNase. Combinar 2x Absolute Blue qPCR ROX Mix (Thermo, t%AB-4139/A), iniciador de PGR (Thermo, Hs01556702 m1i),e diluir CONA para cada reação em uma placa de PCR (Applied Biosystems, tH4309849). Amplificar cDNA incubando as amostras durante 2 minutos a 50ºC seguido por 15 minutos a 95ºC no termociclador (sistema de detecção de sequência ABI Prism 7900HT). Continuar a incubar a 95 ºC durante 15 segundos seguido por 50ºC durante 60 segundos para um total de 40 ciclos. Os ciclos são normalizados para o gene de manutenção e usados para calcular % de inibição de PGR comparado ao veículo sozinho. Analisar cada amostra em duplicato e usar números médios para cálculos. Calcular a inibição de alvo percentual (PGR) usando Excel e XL Fit.
[0083] Os resultados deste ensaio demonstram que Exemplo 1B inibe expressão de PRa (PGR) no modelo de xenoenxerto de tumor. Exemplo 1B inibe expressão de PRa (PGR) por -78% no modelo de xenoenxerto de tumor durante 24 horas com 30 mg/kg de dose quando administrada oralmente. Estes resultados demonstram inibição sustentada e significante de atividade antagonística de ERa e atividade de transcrição mediada por ERa in vivo em um modelo de xenoenxerto de tumor. Estudo de inibição de crescimento de tumor in vivo em modelos de tumor de xenoenxerto de câncer de mama de ER-positivo (ESR1 de tipo selvagem) implantados em camundongos
[0084] O objetivo do seguinte ensaio de inibição de tumor de xenoenxerto é medir a redução em volume de tumor em resposta à administração do composto teste.
[0085] Expandir as células de câncer de mama humanas MCF7 (ATCC tt HTB-22) e HCC1428 (ATCC t CRL-2327) em cultura, colher e injetar 5x10€6 células em 1:1 de solução de HBSS+MATRIGEL TV (200uL) subcutaneamente no flanco direito traseiro de camundongos NOD SCID fêmeas (22-25 g, Envigo RMS, Inc). Vinte e quatro horas antes da implantação de células, implantar péletes de estrogênio (0,18 mg/pélete, 178 estradiol, liberação de 90 dias, Innovative Research) subcutaneamente. Expandir as células de câncer de mama humanas T47D (ATCC tt HTB-22) em cultura, colher e injetar 5x10€6 células em 1:1 de solução de HBSS+MATRIGELY (200 uL) subcutaneamente no flanco direito traseiro de camundongos NOD SCID fêmeas (22-25 9, Envigo RMS, Inc). Vinte e quatro horas antes da implantação de células, implantar péletes de estrogênio (0,38 mg/pélete, 178 estradiol, liberação de 90 dias, Innovative Research) subcutaneamente. Expandir as células de câncer de mama humanas ZR-75-1 (ATCC *% CRL-1500) em cultura, colher e injetar 5x10eº células em 1:1 de solução de HBSS+MATRIGEL'Y (200 uL) subcutaneamente no flanco direito traseiro de camundongos NOD SCID fêmeas (22-25 g, Envigo RMS, Inc). Vinte e quatro horas antes da implantação de células, os animais são administrados com injeção intramuscular de 50 ul de valerato de estradiol (DelestrogenO) (10 mg/mL) e em seguida uma vez a cada 14 dias durante a duração do estudo. Medir o crescimento de tumor e peso corporal duas vezes por semana iniciando no sétimo dia após a implantação. Quando os tamanhos de tumor atingirem 250-350 mm?, randomizar os animais e agrupar em grupos de 5 animais. Preparar o composto teste, Exemplo 1B em um veículo apropriado (1% de hidroxietilcelulose/0,25% de TWEENÔO 80/0,05% de antiespuma em água purificada) e administrar por sonda oral durante 28 dias, QD. Determinar a resposta do tumor por medição de volume de tumor realizada duas vezes por semana durante o curso do tratamento. Tomar o peso corporal como uma medição geral de toxicidade sempre que o volume do tumor for medido.
[0086] O composto de Exemplo 1B é descoberto ter valores delta T/IC% como fornecido na Tabela 12 abaixo. Estes resultados indicam que o composto de Exemplo 1B demonstra boa biodisponibilidade oral em camundongos e significante atividade antitumor ou regressões de tumor em modelos de xenoenxerto de câncer de mama humano de ER- positivo (ESR1 tipo selvagem). Tabela 12: Estudo de inibição de crescimento de tumor in vivo em modelos de tumor de xenoenxerto de câncer de mama de ER-positivo implantados em camundongos Delta T/C% ou Eee de maes câncer de mama) 0,008” câncer de mamas câncer de mama) de câncer de mama usa de câncer de mama)
[0087] Análise para volume de tumor é baseada em Log 10 e Estrutura de covariância de energia espacial. *: significante (p<0,05) comparados ao controle de veículo.
[0088] Delta T/C% é calculado quando o volume de tumor de extremidade em um grupo tratado é em ou acima do volume de tumor de linha de base. A Fórmula é 100*(T-To)/(C-Co), onde T e C são volumes de tumor de extremidade médios no grupo de controle ou tratado, respectivamente. To e Co são volumes de tumor de linha de base médios naqueles grupos.
[0089] Regressão% é calculada quando o volume de extremidade é abaixo da linha de base. A Fórmula é 100*(T-To)/To, onde To é o volume de tumor de linha de base médio para o grupo tratado.
[0090] Grande média de todos os grupos da linha de base (randomização) no dia 32 é usada para computar mudança % de T/C. Estudo de inibição de crescimento de tumor in vivo em modelo tumor PDX de câncer de mama ESR1 mutante (Y537S) (ST941/HI) implantado em camundongos
[0091] O objetivo do seguinte ensaio de inibição de tumor de xenoenxerto é medir a redução em volume de tumor em resposta à administração do composto teste em um modelo de xenoenxerto derivado de paciente de câncer de mama independente de hormônio (HI) e ESR1 mutante (PDX).
[0092] Modelo de PDX de ST941/HI foi derivado e executado em South Texas Accelerated Research Therapeutics (San Antonio, TX). Fragmentos de tumor foram colhidos de animais hospedeiros e implantados em camundongos imunodeficientes (The Jackson Laboratory) e o estudo foi iniciado em um volume de tumor médio de aproximadamente 125-250 mm?º. Preparar o composto teste, Exemplo 1B8 em um veículo apropriado (1% de hidroxietilcelulose/0,25% de
TWEENOQÔ 80/0,05% de antiespuma em água purificada) e administrar por sonda oral durante 28 dias. Determinar a resposta do tumor por medição de volume de tumor realizada duas vezes por semana durante o curso do tratamento. Tomar o peso corporal como uma medição geral de toxicidade sempre que o volume do tumor for medido.
[0093] O composto de Exemplo 1B é descoberto ter valores delta T/IC% como fornecido na Tabela 13 abaixo. Estes resultados indicam que o composto de Exemplo 1B demonstra boa biodisponibilidade oral em camundongos e significante atividade antitumor ou regressões de tumor em um modelo PDX de câncer de mama humano de ESR1 mutante (Y537S). Tabela 13: Estudo de inibição de crescimento de tumor in vivo em modelo de tumor de PDX de câncer de mama de ESR1 mutante implantado em camundongos O eancarde o 19 1 e [= 15 | <ocor| de Câncer de mama de Er Mutante)
[0094] Análise para volume de tumor é baseada em Log 10 e Estrutura de covariância de energia espacial. *: significante (p<0,05) comparado ao controle de veículo.
[0095] Delta T/C% é calculado quando o volume de tumor de extremidade em um grupo tratado é em ou acima do volume de tumor de linha de base. A Fórmula é 100*(T-To)/(C-Co), onde T e C são volumes de tumor de extremidade médios no grupo de controle ou tratado, respectivamente. To e Co são volumes de tumor de linha de base médios naqueles grupos.
[0096] Regressão% é calculada quando o volume de extremidade é abaixo da linha de base. A Fórmula é 100*(T-To)/To, onde To é o volume de tumor de linha de base médio para o grupo tratado.
[0097] Grande média de todos os grupos da linha de base (randomização) no dia 32 é usada para computar mudança % de T/C. Estudos de Combinação
[0098] Devido à heterogeneidade tumoral e resistência adquirida às terapias endócrinas, a terapia de combinação tornaram-se essenciais no tratamento do câncer de mama ER-positivo e avançado / metastático para uma terapia eficaz para superar a resistência adquirida. Testamos o efeito de combinação do Exemplo 1B com inibidor de CDK4/6 abemaciclibe, inibidor de mMTOR everolimus, inibidor de PIK3CA alpelisibe e e e inibidor de PISKIMTOR 8-[5-(1-hidróxi-1- metiletil)piridina-3-i1]-1-[(2S)-2-metoxipropil]-3-metil-1,3-di-hidro-2H- imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona ("Composto A") em cinco linhagens celulares de câncer de mama ER-positivo in vitro. Ensaio de viabilidade celular para estudos de combinação
[0099] Célula semente na densidade mostrada na Tabela 14 abaixo em volume de 20 uL dos meios descritos tabela em uma placa de cultura celular de 384 cavidades de base transparente. Tabela 14: Informações de linhagem celular de ensaio de viabilidade celular Densidade Tempo de Linhagem Referência da Meio de Cultura Fixação Celular Comercial semeadura (horas) RMPI 10% de FBS 1% de T-47D 1000 ATCCHTB-133 |P/S, 0,008 mgml de |72 insulina bovina DMEM 10% de FBS 1% MCF-7 1000 ATCC HTB-22 P/S 0,01 mg/mL de insulina humana RMPI 10% de FBS 1% de EFM-19 3000 ACC 231 144
PIS RMPI 10% de FBS 1% de ZR-75-1 1000 ATCC CRL-1500 144
HYBRI-CARE (1 L HO, sódio, 10% de FBS, 1% PIS)
[00100] Incubar as placas a 37ºC e 5% de CO». No dia seguinte, dosar as células com o composto teste, Exemplo 1B.
[00101] — Preparar compostos as soluções mãe de DMSO a 10 mM e uso para um estudo de resposta de dose com a concentração máxima iniciando a 10 ou 1 UM, dois compostos testados juntos em uma relação fixa, e em seguida diluições seriais de 1:3 preparadas, bem como compostos sozinhos para determinação da ICso com uma concentração de partida de 20 uM. Dosar as células com a adição de 5 uL da placa de diluição serial para a placa celular, produzindo uma concentração de DMSO final de 0,2% com uma faixa de dose de concentração de composto teste final entre 20 e 0,001 uM para único tratamento ou menor faixa para as combinações. Para o ponto máximo usar o meio contendo 0,2% de DMSO e para o ponto mínimo usar estaurosporina diluída em concentrações finais de 2 UM no meio de crescimento contendo 0,2% de DMSO. Após dosagem com o composto teste, incubar as placas celulares a 37ºC e 5% de CO». Após duas incubações de tempos duplicados com os compostos, remover as placas da incubadora e adicionar EtOH frio a 96% (65 uL) a cada cavidade. Após minutos, remover os meios e adicionar RNase (20 uL de 50 ug/mL) (Sigma) e diluição de 1:1000 de iodeto de propídio em PBS por cavidade. Selar as placas e incubar 1 hora em temperatura ambiente (protegido de luz). Escanear as placas com ACUMEN EXPLORER TY [Citômetro de microplaca de fluorescência de varreduara a laser fabricado por TTP LABTECH LTD]. Visto que algumas linhagens celulares formam agregados, o número celular como o número de objetos pode não ser capaz de ser usado como leitura; assim, a população de área total (uma aixa designada de intensidade de pico de FL-1 (PI)) ou intensidade total de PI é usada para avaliar o número celular.
[00102] Os dados de combinação in vitro sugerem sinergia (como abaixo definido) com combinação de Exemplo 1B com abemaciclibe, ou everolimus em 5 de 5 linhagens celulares de câncer de mama ER- positivo como mostrado na Tabela 15. Combinação de Exemplo 1B com Composto A sinérgico em 4 de 4 linhagens celulares de câncer de mama ER-positivo testadas. O efeito de combinação de Exemplo1B com alpelisibe e e é aditivo em 2 de 4 linhagens celulares de câncer de mama ER-positivo e sinérgico e 2 de 4 linhagens celulares de câncer de mama ER-positivo. Tabela 15: Combinação in vitro de Exemplo 1B com outros agentes alvejados em linhagens celulares de câncer de mama ER-positivo Linhagem | Tratamento | Tratamento 2 Índice de Interpretação | Interpretação Celular de 1 Combinação Estatística biológica Câncer de (Clso) Mama MCF7 Exemplo | Abemaciclibe 0,2675 T47D Exemplo | Abemaciclibe 0,2693 ZR-75-1 Exemplo | Abemaciclibe 0,2067 ZR-75-30 Exemplo | Abemaciclibe 0,3960 Ss
" Análise de Dados e Interpretação de Efeito de Combinação
[00103] Uso de métodos que são publicados na literatura para calcular efeito de combinação in vitro (L. Zhao, et al, Front Biosci, 2010, 2:241-249 e L. Zhao, et al, Clin Cancer Res, 2004, 10(23):7994-8004). A fim de identificar interações sinérgicas ou antagonistas entre dois fármacos, uma análise de mudança de curva foi realizada usando um padrão de XL personalizado com XLFit 5 add ins. Curvas de agente único são ajustadas usando regressão logística de 4 parâmetros. Critérios e restrições usados para o ajuste são (i) bases < (-20) são fixadas em O e (ii) topo >120 fixadas em 100. Se todas as observações forem menores do que um limiar fixado pelo usuário, então um ajuste constante com inclinação = O é realizado e a ICso é considerada maior do que a concentração maxima incluída. Uma vez que o ICso absoluto de cada agente único foi obtido, a concentração equivalente a 50% de atividade é calculada para os individuais e combinação. Usando estas concentrações —equivalents junto com as atividades medidas recalculamos uma ICso absoluta, a curva para agentes individuais atingirá 50% de atividade em valores de concentrações eq. iguais a 1, enquanto que combinações sinérgicas atingirão os 50% em valores menores, resultando em um deslocamento para esquerda, e a combinação antagonistic mostrará deslocamento para a direita. Concentrações equivalents são também usadas para calcular a Clso (Índice de Combinação a 50% de atividade), onde Clso iguala-se à ICso absoluta de curva de combinação. Junto com a Clso outros Cl's (Índices de Combinação) em percentagens diferentes de atividade podem ser calculados (CI10, CI20, CI30, CI40, CI60, CI70, CI80. CI90). A fim de calcular Clnn, concentração equivalente em diferente percentage de atividade é calculada. Para cada percentage de atividade calculamos a margem de erro que é o intervalo de confidência a 95% e usando este intervalo de confidência calcularemos o limite superior como a adição de margem de erro ao Cl e o limite inferior como a subtração da margem de erro ao Cl. Limite superior = CI + Intervalo de confidência 95% e Limite inferior = CI - Intervalo de confidência 95%. Estes limites são então usados para interpretar os resultados. Interpretação Estatística em cada percentagem de atividade é como segue: Interpretação biológica em cada percentagem de atividade é como segue: Estudos de Combinação In vivo
[00104] Devido à heterogeneidade de tumor e resistência adquirida à terapias endócrinas, terapia de combinação tornou-se essencial em tratamento de câncer de mama ER-positivo e avançado/metastático para terapia eficaz ou para superar resistência adquirida. É hipotetizado que uma combinação de terapias alvejadas tem o potencial de ser mais eficaz no retardo ou mesmo interrupção de cânceres de mama ER- positivo. Combinação de inibidores de CDK4/6 e fulvestrante foi aprovada para o tratamento de câncer de mama metastático ER-positivo porém uma alta percentagem de pacientes desenvolverá resistência, devido a mutações adquiridas em ESR1 ou PIK3CA. Como um potente degradante e antagonista de ERa, SERD oral tal como o Exemplo 1B tem o potencial de ser mais eficaz no retardo ou interrupção dos cânceres de mama mutantes de ESR1 ou mutantes de PIK3BCA como um agente único ou em combinação com inibidor de CDK4/6 tal como abemaciclibe ou inibidor de PISK/MTOR tal como Composto A. Nesse contexto, o composto de Exemplo 1B é testado quanto à inibição do crescimento do tumor em combinação com abemaciclibe (referência de patente) ou Composto A (referência de patente). Mais especificamente o composto de Exemplo 1B é testado em combinação com abemaciclibe ou Composto A em modelo de xenoenxerto de câncer de mama MCF7 tipo selvagem de ESR1 e mutante de PIK3Ca.
[00105] Expandir as células de câncer de mama humanas MCF7 (ATCC t HTB-22) em cultura, colher e injetar 5x10€6 células em 1:1 solução de HBSS+MATRIGELY (200 uL) subcutaneamente no flanco direito traseiro de camundongos NOD SCID fêmeas (22-25 g, Envigo RMS, Inc). Vinte e quatro horas antes do implante de células, implantar péletes de estrogênio (0,18 mg/pélete, 17B estradiol, 90 dias de liberação, Innovative Research) subcutaneamente. Medir o crescimento do tumor e peso corporal duas vezes por semana iniciando no sétimo dia após o implante. Quando os tamanhos de tumor atingirem 250 a 350 mm?, randomizar os animais e agrupar em grupos de 5 animals. Preparar o composto teste de Exemplo 1B em um veículo apropriado (1% de hidroxietilcelulose / 0,2556 de TWEENGO 80/0,05% de antiespuma em água purificada) e administrar por gavagem oral durante 42 dias. O inibidor de CDK4/6 (abemaciclibe) é formulado em 1% de HEC em tampão de fosfato de sódio a 25 mM, pH 2,0. O inibidor de PISK/MTOR (Composto A) foi formulado em 1% de hidroxietilcelulose / 0,25% de TWEENGO 80/0,05% de antiespuma em água purificada. Determinar a resposta do tumor por medição de volume de tumor realizada duas vezes por semana durante o curso do tratamento. Tomar o peso corporal como uma medição geral de toxicidade sempre que o volume do tumor for medido. O volume de tumor é estimado usando a Fórmula v = 1 x w2 x 0,535 onde 1 = maior diâmetro medido e w = menor diâmetro perpendicular. Análise Estatística
[00106] A análise estatística dos dados de volume de tumor data começa com a transformação dos dados para uma escala log para equalizar a variância ao longo do tempo e grupos de tratamento. Os dados de volume log são analisados como análise bidirecional de medidas de variância por tempo e tratamento usando os procedimentos MIXED em software SAS (Versão 9.3). O modelo de correlação para as medidas repetidas é Spatial Power. Os grupos tratados são comparados ao grupo de controle em cada ponto do tempo. O procedimento MIXED é também usado separadamente para cada grupo de tratamento para calcular as médias ajustadas e erros padrões em cada ponto do tempo. Ambas as análises representam a correlação em cada animal e a perda de dados que ocorre quando animais com tumores grandes são removidos do estudo precocemente. As médias ajustadas e erros padrões (s.e.) são plotados para cada grupo de tratamento versus tempo. Análise para volume de tumor é baseada em log1o e estrutura de covariância de energia espacial. P value é baseado na comparação entre dois grupos específicos. Método de Análise de Combinação (Independência Bliss para Estudos IVEF)
[00107] Primeiramente, o modelo de medidas repetidas usuais é ajustado para volume log versus grupo e tempo. Em seguida declarações de contraste são usadas para testar quanto a um efeito de interação em cada ponto do tempo usando os 2 tratamentos específicos que são combinados. Isto é equivalente ao método de Independência Bliss e assume que o volume de tumores pode, em teoria, atingir zero,
isto é, completa regressão. A resposta aditiva esperada (EAR) para uma combinação é calculada sob a escala de volume de tumor como: volume EAR de resposta (EAR) EAR = V1 * V2/V0, onde VO, V1, e V2 são os volume de tumor médios estimados para o controle de veículo, tratamento 1 sozinho, e tratamento 2 sozinho, respectivamente. Se o teste de interação for significante, o efeito de combinação é declarado estatisticamente maior que o Aditivo ou menor que o Aditivo dependendo do volume médio de combinação observado menor que ou maior que o volume de EAR, respectivamente. De outro modo, a conclusão estatística é o Aditivo. Além disso, uma faixa biologicamente relevante de aditividade pode ser definida como X% acima e abaixo do volume de EAR. Tipicamente, X seria 25 a 40%. Em seguida uma conclusão biológica pode ser feita quanto à combinação como mais do que aditiva, aditiva, ou menos que aditiva se o volume médio de combinação observado for abaixo de, em, ou acima do interval de aditividade.
[00108] Pode haver situações onde a estase é a melhor resposta esperada. Nessas situações, o método Bliss pode ser aplicado diretamente aos valores %delta T/C para obter uma resposta percentual de EAR: EAR % delta T/C = Y1 * Y2/100, onde Y1 e Y2 são os valores delta percentual T/C para os tratamentos de agente único. Atualmente não existe nenhum teste estatístico para comparar o %delta T/C observado em um grupo de combinação versus o EAR, mas o critério biológico descrito acima pode ser aplicado.
[00109] Como mostrado nas Tabelas 15 e 16, tratamento com Exemplo 1B ou abemaciclibe sozinho como um agente único resultou em 32% (%dT/C = -32) e 52% (%dT/C = -52) de regressões de tumor respectivamente e ambos são estatisticamente significantes (p <0,001) comparados ao controle de veículo. Eficácia de combinação de Exemplo 1B com abemaciclibe was "Menos que Aditivo" mas a eficácia de combinação de Exemplo 1B mais abemaciclibe foi significantemente melhor do que Exemplo 1B sozinho (p <0,001). Contudo, a eficácia do agente único abemaciclibe não foi estatisticamente significante de combinação (P=0,055). A combinação é tolerada nos animais sem significante perda de peso corporal. Tabela 15: Eficácia de combinação de Exemplo 1B com abemaciclibe em modelo de câncer de mama de ER-positivo MCF Veículo, QD x Exemplo 1B, 10 mpk, 0,628 0,0658 <0,001* 42, PO QD x 42, PO Veículo, QD x| Abemaciclibe, 50 mpk, 0,479 0,0658 <0,001* 42, PO QD x 42, PO Exemplo 1B, 10 mpk, Veículo, QD x QD x 42, PO / 0,756 0,0658 <0,001* 42, PO Abemaciclibe, 50 mpk, QD x 42, PO Exemplo 1B, 10 mpk, Exemplo 1B, 10 QD x 42, PO / mpk, QD x 42, o 0,128 0,0658 0,055 Abemaciclibe, 50 mpk,
PO QD x 42, PO 1 Exemplo 1B, 10 mpk, Abemaciclibe, QD x 42, PO / 50 mpk, QD x 0,278 0,0658 <0,001* Abemaciclibe, 50 mpk, 42, PO QD x 42, PO PO b Diferença = Tratamento 1 — Tratamento 2; *valor p: significante (p < 0,05) SE — Erro padrão Tabela 16: Eficácia de combinação de Exemplo 1B com abemaciclibe em modelo de câncer de mama de ER-positivo MCF Delta T/C % Efeito de Peso Tratamento ou valor p combinação corporal %Regressão [Les | Nm [|
Exemplo 1B Nenhuma lAbemaciclibe / -64 <0,001* Menos que mudança Em Ss me
[00110] Análise para volume de tumor é baseada em Logw e estrutura de covariância de energia espacial. *valor p: significante (p < 0,05); NA: Não aplicável
[00111] Delta T/C% é calculado quando o volume de tumor de extremidade em um grupo tratado é em ou acima do volume de tumor de linha de base; e regressão % é calculada para volume de tumor abaixo da linha de base. A Fórmula é 100*(T-To)/(C-Co), onde T e C são volumes de tumor de extremidade médios no grupo de controle ou tratado, respectivamente. To e Co são volumes de tumor de linha de base médios naqueles grupos.
[00112] Como mostrado nas Tabelas 17 e 18, tratamento com Exemplo 1B ou Composto A sozinho como um agente único resultou em regressões de 32% (%dT/C = -32) e 36% (%dT/C = -36) de tumor respectivamente e ambas são estatisticamente significantes (p <0,001) comparadas ao controle de veículo. Eficácia de combinação de Exemplo 1B com Composto A foi "Menos que aditivo", porém, a eficácia de combinação de Exemplo 1B mais Composto A foi significantemente melhor do que Exemplo 1B sozinho (p < 0,001) ou Composto A sozinho (p = 0,002*). A combinação é tolerada nos animais sem significante perda de peso corporal. Tabela 17: Eficácia de combinação de Exemplo 1B com Composto A em modelo de câncer de mama de ER-positivo MCF Veículo, QD x 42, Exemplo 1B, 10 Veículo, QD x 42, Composto A, 7,5 mpk, QD x 42, PO / Composto A, 7,5 mpk, BID x 42, PO Exemplo 1B, 10 Exemplo 1B, 10 mpk, QD x 42, PO / 0,282 0,0791 <0,001* mpk, QD x 42, PO Composto A, 7,5 mpk, BID x 42, PO Exemplo 1B, 10 mpk, QD x 42, PO / Composto A, 7,5 Composto A, 7,5 0,257 0,0791 0,002* mpk, BID x 42, PO mpk, BID x 42, PO
PO b Diferença = Tratamento 1 — Tratamento 2; *valor p: significante (p < 0,05) SE — Erro padrão Tabela 18: Eficácia de combinação de Exemplo 1B com abemaciclibe em modelo de câncer de mama de ER-positivo MCF Delta T/C % Efeito de Peso Tratamento ou valor p combinação corporal %Regressão [Les | Nm [| Exemplo 1B Nenhuma Menos que IComposto A / -65 <0,001* a mudança aditivo (Combinação) significante
[00113] Análise para volume de tumor é baseada em Logw e Estrutura de covariância de energia espacial. *valor p: significante (p < 0,05); NA: Não aplicável
[00114] Delta T/C% é calculado quando o volume de tumor de extremidade em um grupo tratado é em ou acima do volume de tumor de linha de base; e regressão % é calculada para volume de tumor abaixo da linha de base. A Fórmula é 100*(T-To)/(C-Co), onde T e C são volumes de tumor de extremidade médios no grupo de controle ou tratado, respectivamente. To e Co são volumes de tumor de linha de base médios naqueles grupos.
[00115] Como mostrado nas Tabelas 19 e 20, tratamento com Exemplo 10 ou abemaciclibe sozinho como um agente único resultou em regressões de 51% (%dT/C = -51) e 70% (%dT/C = -70) de tumor respectivamente e ambas são estatisticamente significantes (p <0,001) comparadas ao controle de veículo. Eficácia de combinação de Exemplo com abemaciclibe foi "menos que aditivo", porém, a eficácia de combinação de Exemplo 10 mais abemaciclibe foi significantemente melhor do que Exemplo 10 sozinho (p = 0,039). Contudo, eficácia de combinação de Exemplo 10 mais abemaciclibe não foi significantemente diferente de abemaciclibe sozinho (p = 0,905). À combinação é tolerada nos animais sem significante perda de peso corporal. Tabela 19: Eficácia de combinação de Exemplo 10 com abemaciclibe em modelo de câncer de mama de ER-positivo MCF , Exemplo 10, 15 mpk, QD x 42, PO Exemplo 10, 15 mpk, QD x 42, PO o Exemplo 10, 15 mpk, QD x 42, PO PO b Diferença = Tratamento 1 — Tratamento 2; *valor p: significante (p < 0,05) SE — Erro padrão Tabela 20: Eficácia de combinação de Exemplo 10 com abemaciclibe em modelo de câncer de mama de ER-positivo MCF Delta TIC % Tratamento ou valor p Efeito e Peso — Eee [ese a a [pero | Ts e | [reemasato | o | sor | Exemplo 10 Nenhuma lAbemaciclibe / -71 <0,001* Menos que mudança E 7 Eco
[00116] Análise para volume de tumor é baseada em Logw e Estrutura de covariância de energia espacial. *valor p: significante (p < 0,05); NA: Não aplicável
[00117] Delta T/C% é calculado quando o volume de tumor de extremidade em um grupo tratado é em ou acima do volume de tumor de linha de base; e regressão % é calculada para volume de tumor abaixo da linha de base. A Fórmula é 100*(T-To)/(C-Co), onde T e C são volumes de tumor de extremidade médios no grupo de controle ou tratado, respectivamente. To e Co são volumes de tumor de linha de base médios naqueles grupos.
[00118] Como mostrado nas Tabelas 21 e 22, tratamento com Exemplo 10 ou alpelisibe e sozinho como um agente único resultou em regressões de 51% (%dT/C = -51) e 21% (%dT/C = -21) de tumor respectivamente e ambas são estatisticamente significantes (p <0,001 e p=0,013) comparadas ao controle de veículo. Eficácia de combinação de Exemplo 10 com alpelisibe e foi "aditivo" e a eficácia de combinação de Exemplo 10 mais alpelisibe e foi significantemente melhor do que Exemplo 10 sozinho (p = 0,009). Eficácia de combinação de Exemplo mais alpelisibe e foi também significantemente melhor do que alpelisibe e sozinho (p = <0,001). A combinação é tolerada nos animais sem significante perda de peso corporal. Tabela 21: Eficácia de combinação de Exemplo 10 com alpelisibe e em modelo de câncer de mama de ER-positivo MCF Veículo, QD x | Exemplo 10, 15 mpk, QD x 0,241 0,1121 <0,039* 42, PO 42, PO alpelisibe e 15 mpk (d1- Veículo, QD x d7), 10 mpk (d8-42), mpk, 0,445 0,1121 <0,001* 42, PO QD x 42, PO Exemplo 10, 15 mpk, QD x Veículo, QD x 42, PO / alpelisibe e 15 0,755 0,1121 <0,001* 42, PO mpk (d1-d7), 10 mpk (d8- 42), mpk, QD x 42, PO Exemplo 10, 15 mpk, QD x Exemplo 10, 15 42, PO / alpelisibe e 15 mpk, QD x 42, 0,514 0,1121 <0,001 Po mpk (d1-d7), 10 mpk (d8- 42), mpk, QD x 42, PO alpelisibe e 15 Exemplo 10, 15 mpk, QD x mpk (d1-d7), 10 42, PO / alpelisibe e 15 mMpk (d8-42), 0,310 0,1121 | 0,009* mpk (d1-d7), 10 mpk (d8- mpk, QD x 42, 42), mpk, QD x 42, PO
PO b Diferença = Tratamento 1 — Tratamento 2; *valor p: significante (p < 0,05) SE — Erro padrão Tabela 22: Eficácia de combinação de Exemplo 10 com alpelisibe e em modelo de câncer de mama de ER-positivo MCF Delta T/C % ou Efeito de Peso Tratamento valor p %Regressão combinação corporal e a a Exemplo 10 Nenhuma lalpelisibe -76 <0,001* Aditivo mudança (Combinação) significante
[00119] Análise para volume de tumor é baseada em Logw e
T7TITO Estrutura de covariância de energia espacial. *valor p: significante (p < 0,05); NA: Não aplicável
[00120] Delta T/C% é calculado quando o volume de tumor de extremidade em um grupo tratado é em ou acima do volume de tumor de linha de base; e regressão % é calculada para volume de tumor abaixo da linha de base. A Fórmula é 100*(T-To)/(C-Co), onde T e C são volumes de tumor de extremidade médios no grupo de controle ou tratado, respectivamente. To e Co são volumes de tumor de linha de base médios naqueles grupos.
[00121] Como mostrado nas Tabelas 23 e 24, tratamento com Exemplo 10 ou everolimus sozinho como um agente único resultou em regressões de 51% (%dT/C = -51) e 50% (%dT/C = -50) de tumor respectivamente e ambas são estatisticamente significantes (p <0,001 e p<0,001) comparadas ao controle de veículo. Eficácia de combinação de Exemplo 10 com everolimus foi "aditivo" e a eficácia de combinação de Exemplo 10 mais everolimusfoi significantemente melhor do que Exemplo 10 sozinho (p = 0,004). Eficácia de combinação de Exemplo mais alpelisibe e foi também significantemente melhor do que everolimus sozinho (p = 0,04). A combinação é tolerada nos animais sem significante perda de peso corporal. Tabela 23: Eficácia de combinação de Exemplo 10 com everolimus em modelo de câncer de mama de ER-positivo MCF Veículo, QD x | Exemplo 10, 15 mpk, QD Veículo, QD x | Everolimus, 5 mpk, QD x ES | imarmoS | oe [om jo 42, PO x 42, PO / Everolimus, 5 0,748 0,0999 <0,001* mpk, QD x 42, PO mpk, QD x x 42, PO / Everolimus, 5 [aro samira Everolimus, 5 Exemplo 10, 15 mpk, QD mpk, QD x 42, x 42, PO / Everolimus, 5 0,315 0,138 0,004* sa a ha alho b Diferença = Tratamento 1 — Tratamento 2; *valor p: significante (p < 0,05) SE — Erro padrão Tabela 24: Eficácia de combinação de Exemplo 10 com everolimus em modelo de câncer de mama de ER-positivo MCF %Regressão combinação corporal e OR ag [eee | so ser | | [peems | so saga | Exemplo 10 Nenhuma lEverolimus -76 <0,001* Aditivo mudança
[00122] Análise para volume de tumor é baseada em Logw e Estrutura de covariância de energia espacial. *valor p: significante (p < 0,05); NA: Não aplicável
[00123] Delta T/C% é calculado quando o volume de tumor de extremidade em um grupo tratado é em ou acima do volume de tumor de linha de base; e regressão % é calculada para volume de tumor abaixo da linha de base. A Fórmula é 100*(T-To)/(C-Co), onde T e C são volumes de tumor de extremidade médios no grupo de controle ou tratado, respectivamente. To e Co são volumes de tumor de linha de base médios naqueles grupos. Ensaio de Biodisponibilidade Oral de Rato
[00124] O objetivo do seguinte ensaio é demonstrar se um composto teste é oralmente biodisponível.
[00125] — Administrar o composto teste a ratos Sprague-Dawley |V a 1 mg/kg (usando veículos de: 20% de CAPTISOLº em tampão de fosfato de sódio a 25 mM, pH2 quantum satis; ou 25% de DMA, 15% de EtOH, 10% de propileno glicol, 25% de 2-pirrolidona e 25% de água purificada) e PO a 10 mg/kg (usando um veículo de 1% de hidroxietil celulose, 0,25% de polissorbato 80, 0,05% de antiespuma 1510-US, e água purificada quantum satis). Coletar amostras de sangue seriais em 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, e 12 horas após a dose para IV bolus e em 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, e 12 horas após a dose após administração oral. Após tratamento com um coagulante EDTA, obter plasma por centrifugação e armazenar a -/70ºC até análise por LC-MS/MS. Determinar a concentração de composto teste em plasma e carregar no sistema Watson LIMS'Y onde análise não compartimental é usada para calcular área sob a curva (AUC) para ambos os braços IV e PO. Calcular biodisponibilidade oral (%F) por meio da seguinte equação: %F = (AUCro X Dosew) / (AUCw X Dosero) X 100.
[00126] Os compostos de Exemplo 1B mostram um valor %F de —-50% no ensaio acima mencionado. Este ensaio demonstra que Exemplo 1B tem boa biodisponibilidade oral.
Claims (22)
1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula: O 1
NO R FE O o R?
CX
HO Ê ou R' ou R? é independentemente selecionado de Cl, F, -CF3, ou -CHsz, e o outro é hidrogênio, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ele é O. 1
ANO R Ft (À o nº Ly
HO Ê ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é: O. 1
NO R E 1, O | R
XL Ho Ê ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é:
To (O F ( * HO Nº ; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável é um sal de ácido benzenossulfônico.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável é um sal do ácido 4-metilbenzenossulfônico.
7. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é O Se () F Ds HO O Nº
8. Composto de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que é: ELMO, o XF “ HO O Nº ; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
9. Composto, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável é um sal de ácido benzenossulfônico.
10. Composto, de acordo com a reivindicação 8,
caracterizado pelo fato de que o sal farmaceuticamente aceitável é um sal de ácido 4-metilbenzenossulfônico.
11. Composto, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é:
NOVO F FL O ont | (O * HO Nº
12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto, ou o sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em combinação com um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
13. Composição — farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais outros agentes terapêuticos.
14. Uso de uma quantidade eficaz de um composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou de uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratar câncer de mama, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de próstata, câncer uterino, câncer gástrico, ou câncer de pulmão, em um paciente em necessidade de tal tratamento.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o câncer de mama é câncer de mama ER-positivo.
16. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o câncer gástrico é câncer gástrico ER-positivo.
17. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o câncer de pulmão é câncer de pulmão ER-positivo.
18. Composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que é para uso em terapia.
19. Composto, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer de mama, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de próstata, câncer uterino, câncer gástrico, ou câncer de pulmão.
20. Composto, ou o sal do mesmo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que é no tratamento de câncer de mama ER-positivo.
21. Composto, ou o sal do mesmo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que é no tratamento de câncer gástrico ER-positivo.
22. Composto, ou o sal do mesmo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que é no tratamento de câncer de pulmão ER-positivo.
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