KR20230005404A - 선택적 에스트로겐 수용체 분해제 - Google Patents

선택적 에스트로겐 수용체 분해제 Download PDF

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대니얼 존 솔
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Abstract

하기 화학식에 따른 신규 선택적 에스트로겐 수용체 분해제 (SERD):
Figure pat00069
,
그의 제약상 허용되는 염, 및 그의 제약 조성물 (여기서 R1 또는 R2 중 어느 하나는 Cl, F, -CF3, 또는 -CH3으로부터 독립적으로 선택되고, 다른 하나는 수소이다), 및 그의 사용 방법이 제공된다.

Description

선택적 에스트로겐 수용체 분해제 {SELECTIVE ESTROGEN RECEPTOR DEGRADERS}
선택적 에스트로겐 수용체 분해제 (SERD)는 에스트로겐 수용체 (ER)에 결합하여 ER-매개 전사 활성을 하향조절한다. SERD에 기인한 이러한 분해 및 하향조절은 암과 같은 세포 증식 장애의 치료에서 유용할 수 있다. SERD의 일부 소분자 예가 문헌에 개시되어 있다 (예를 들어, WO2005073204, WO2014205136, 및 WO2016097071 참조). 그러나, 공지된 SERD는 암을 효과적으로 치료하는 데 필요한 바와 같이 아직 유용하지 않았다. 예를 들어, 더 양호한 약물동태학 (PK) 및 약력학 (PD) 특성, 임상에서 더 높은 효율성, 및 양호한 경구 생체이용률을 가진 SERD를 찾는 것은 암 치료에서 매우 도움이 될 것이다. ER-매개 전사의 강력한 억제를 가진 순수한 길항제 SERD는 암 치료에서 분명히 유익할 것이다. 암 예컨대 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 및 폐암 뿐만 아니라 신생 내성으로 인한 돌연변이를 치료하기 위한 신규 SERD가 필요하다. 특히 ER-양성 유방암, 위암, 및/또는 폐암을 치료하기 위한 신규 SERD가 필요하다.
본 발명의 배경기술의 앞선 논의는 단지 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위한 것이다. 이러한 논의는 언급된 자료 중 임의의 것이 본 출원의 우선일에 통상의 일반적인 지식의 일부였다는 것을 인정하거나 시인하는 것이 아님을 인지하여야 한다. 유사하게, 본 명세서 전반에 걸쳐, 선행 특허 공보 및 비-특허 간행물을 비롯한 임의의 선행 간행물에 대한 임의의 언급은 언급된 선행 간행물 내에 함유된 자료 중 임의의 것이 본 출원의 우선일에 통상의 일반적인 지식의 일부였다는 것을 인정하거나 시인하는 것이 아님을 인지하여야 한다.
하기 화학식의 화합물:
Figure pat00001
,
및 그의 제약상 허용되는 염, 및 그의 제약 조성물이 본원에 제공된다. 이 화학식에서 R1 또는 R2 중 어느 하나는 Cl, F, -CF3, 또는 -CH3으로부터 독립적으로 선택되고, 다른 하나는 수소이다.
유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암을 치료하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 그의 제약상 허용되는 염, 및 그의 제약 조성물을 사용하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을, 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
요법에서 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염이 추가로 제공된다. 본원에 기재된 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염은, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암의 치료에서 사용될 수 있다.
유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염의 용도가 추가로 제공된다.
한 실시양태에서, 본원의 개시내용은 화학식 I, 또는 화학식 II, 또는 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM), 아로마타제 억제제, CDK4 억제제, CDK6 억제제, PI3K 억제제, mTOR 억제제 및 PI3K/mTOR 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다:
Figure pat00002
여기서 R1 또는 R2 중 어느 하나는 Cl, F, -CF3, 또는 -CH3으로부터 독립적으로 선택되고, 다른 하나는 수소이다.
한 실시양태에서, 본원의 개시내용은
Figure pat00003
로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 SERM, 아로마타제 억제제, CDK4 억제제, CDK6 억제제, PI3K 억제제, mTOR 억제제 및 PI3K/mTOR 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
SERD로서 작용하는 신규 테트라시클릭 화합물 및 그의 제약 염이 본원에 개시되어 있다. 본원에 기재된 신규 발명된 SERD는 암 예컨대 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 및 폐암 뿐만 아니라 신생 내성으로 인한 돌연변이를 치료하는 데 유용할 ER-매개 전사의 억제를 제공한다. 이들 SERD는 단일 작용제로서 또는 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM), 아로마타제 억제제, CDK4 억제제, CDK6 억제제, PI3K 억제제, 및 mTOR 억제제를 포함한 다른 부류의 약물과 조합하여 사용되어 호르몬 수용체-양성 암 예컨대 유방암, 위암, 및/또는 폐암을 치료할 수 있다.
본원에 기재된 신규 화합물은 화학식 I:
Figure pat00004
,
및 그의 제약상 허용되는 염으로 나타내어지며, 여기서 R1 또는 R2 중 어느 하나는 Cl, F, -CF3, 또는 -CH3으로부터 독립적으로 선택되고, 다른 하나는 수소이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 화학식 I로 기재된 바와 같은 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염이 상기 *로 표시되는 위치인 키랄 중심을 함유한다는 것을 인식할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 키랄 중심에 대한 칸-인골드-프렐로그(Cahn-Ingold-Prelog) (R) 또는 (S) 지정이 키랄 중심 주변의 치환 패턴에 따라 달라질 것임을 인식할 것이다. 화학식 I의 화합물의 키랄 중심은 화학식 II로 나타내어지는 R-거울상이성질체 형태:
Figure pat00005
및 화학식 III으로 나타내어지는 S-거울상이성질체 형태를 제공한다:
Figure pat00006
.
화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III에 따른 화합물의 모든 개별 입체이성질체, 거울상이성질체, 및 부분입체이성질체, 뿐만 아니라 거울상이성질체와 부분입체이성질체의 혼합물 (라세미체 포함)은 본원에 기재된 화합물의 범위 내에 포함된다. 키랄 중심을 함유하는 제약 용도를 위한 화합물은 종종 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체로서 단리되고, 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 이러한 단리된 화합물은 본원에 개시된 화합물의 범위 내에 포함된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 본원에 기재된 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염이 중수소화될 수 있고 (수소가 중수소에 의해 대체될 수 있는 경우) 이러한 분자가 본원에 개시된 화합물의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다는 것을 인식할 것이다.
화학식 I의 화합물 (IUPAC 명명법 명칭 포함)의 구체적인 예는 여기에 나타냈다:
Figure pat00007
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올;
Figure pat00008
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-7-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올;
Figure pat00009
8-클로로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올;
Figure pat00010
7-클로로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올;
Figure pat00011
8-플루오로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올;
Figure pat00012
7-플루오로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올;
Figure pat00013
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-메틸-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올; 및
Figure pat00014
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-7-메틸-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올.
상기 언급된 키랄 중심으로 인해, 상기에 나타낸 화학식 I의 화합물의 이들 구체적인 예 각각은 표 1에 나타낸 바와 같은 R- 및 S-거울상이성질체 형태 (즉, 화학식 II의 R-거울상이성질체 화합물 및 화학식 III의 S-거울상이성질체 화합물)를 갖는다.
<표 1>
화학식 I의 화합물의 거울상이성질체 형태
Figure pat00015
Figure pat00016
또한, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을, 제약상 허용되는 부형제, 담체, 또는 희석제와 조합하여 포함하는 제약 조성물이 본원에 기재된다. 본원에 기재된 제약 조성물은 제약상 허용되는 첨가제를 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는 첨가제(들)"는 조성물 또는 제제의 다른 첨가제와 상용성이고 환자에게 해롭지 않은 1종 이상의 담체, 희석제, 및 부형제를 지칭한다. 본원에 기재된 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 여러 가지의 경로, 예컨대 경구 또는 IV에 투여되는 제약 조성물로서 제제화될 수 있다. 생체이용률은 종종 암 치료의 요인이며 활성 성분의 생체이용률을 제어하거나 최적화하기 위해 투여 방법 및 제약 조성물을 선택하는 능력이 유용하다. 예를 들어, 경구로 생체이용가능한 SERD 조성물이 특히 유용할 것이다. 본원에 기재된 바와 같은, 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은 경구 생체이용률을 갖는 것으로 여겨진다. 제약 조성물 및 그의 제조 방법의 예는 문헌 ["Remington: The Science and Practice of Pharmacy", L. V. Allen Jr, Editor, 22nd Ed., Mack Publishing Co., 2012]에서 찾을 수 있다. 제약상 허용되는 담체, 희석제, 및 부형제의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 식염수, 물, 전분, 당류, 만니톨, 및 실리카 유도체; 결합제 예컨대 카르복시메틸 셀룰로스 및 기타 셀룰로스 유도체, 알기네이트, 젤라틴, 및 폴리비닐-피롤리돈; 카올린 및 벤토나이트; 및 폴리에틸 글리콜.
암을 치료하는 방법이 본원에 추가로 설명된다. 본원에 기재된 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 투여 방법은, 경구 투여일 수 있다. 암은 에스트로겐 반응성 암일 수 있다. 게다가, 암은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암일 수 있다. 예를 들어, 암은 ER-양성 유방암, ER-양성 위암, 또는 ER-양성 폐암일 수 있다.
또한, 요법에서 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염이 본원에 기재된다. 또한, 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암의 치료에서 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염이 본원에 제공된다. 특히 유방암은 ER-양성 유방암, ER-양성 위암, 또는 ER-양성 폐암일 수 있다. 예를 들어, 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 경구 투여될 수 있다.
게다가, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 암 치료를 위한 의약의 제조에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 의약은 경구 투여될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 의약이 치료에 사용될 수 있는 암의 유형은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암을 포함한다. 특히 암은 ER-양성 유방암, ER-양성 위암, 또는 ER-양성 폐암일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염은, 암 예컨대 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암의 치료를 위한, 단일 작용제로서 또는 1종 이상의 다른 치료제 (예를 들어, 항암제)와 조합하여 임상적 유용성을 가질 수 있다. 다른 치료제 (예컨대 항암제)와 조합하여 사용되는 경우, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은 다른 치료제와 동시에, 순차적으로, 또는 별도로 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염이 조합될 수 있는 약물의 부류의 예는 호르몬 수용체-양성 유방암을 치료하기 위한, SERM, 아로마타제 억제제, CDK4 억제제, CDK6 억제제, PI3K 억제제, 및 mTOR 억제제를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염이 조합될 수 있는 약물의 보다 구체적인 예는 아베마시클립 (CDK4/6 억제제), 에버롤리무스 (mTOR 억제제), 알펠리십 (PIK3CA 억제제), 및 8-[5-(1-히드록시-1-메틸에틸)피리딘-3-일]-1-[(2S)-2-메톡시프로필]-3-메틸-1,3-디히드로-2H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-온 (PI3K/mTOR 억제제)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은, 환자에게 단일 또는 다수회 용량 투여 직후, 진단 또는 치료 중인 환자에서 원하는 효과를 제공하는, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 용량을 지칭한다. 바람직하게는, 원하는 효과는 종양 세포 증식, 종양 세포 사멸, 또는 둘 다의 억제이다. 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은, 일반적으로 광범위한 투여량 범위에서 효과적이다. 예를 들어, 일일 투여량은 통상 약 100 mg 내지 약 2000 mg의 일일 범위에 속한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다" 또는 변형, 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수의 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수의 군을 배제하지 않는다는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 기존 증상 또는 장애의 진행 또는 중증도를 규제, 둔화, 중지, 또는 반전시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "환자"는 특정한 질환, 장애, 또는 병태를 앓고 있는 인간을 지칭한다.
본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염은 관련 기술분야에 공지된 여러 가지의 절차에 의해 제조될 수 있으며, 이들 중 일부는 하기 제조예 및 실시예에 예시되어 있다. 기재된 경로 각각에 대한 구체적 합성 단계는 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제조하기 위해, 상이한 방식으로, 또는 상이한 절차로부터의 단계와 함께 조합될 수 있다. 생성물은 추출, 증발, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연화처리, 및 결정화를 포함한 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 회수될 수 있다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 쉽게 이용할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물의 합성에 유용한 중간체 및 공정은 이 설명에 포함되도록 의도된다. 게다가, 본원에 기재된 특정 중간체는 1종 이상의 보호기를 함유할 수 있다. 가변 보호기는 수행될 특정한 반응 조건 및 특정한 변환에 따라 각각의 발생에서 동일하거나 상이할 수 있다. 보호 및 탈보호 조건은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007] 참조).
개별 이성질체, 거울상이성질체, 및 부분입체이성질체는 선택적 결정화 기술 또는 키랄 크로마토그래피와 같은 방법에 의해, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물의 합성에서 임의의 편리한 시점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 분리되거나 분해될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981], 및 [E.L. Eliel and S.H. Wilen, "Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994] 참조). 개별 이성질체, 거울상이성질체, 및 부분입체이성질체가 언급된 바와 같이 분리되거나 분해될 수 있지만, 키랄 중심에 대한 그의 칸-인골드-프렐로그 (R) 또는 (S) 지정은 아직 결정되지 않았을 수 있다. 칸-인골드-프렐로그 (R) 또는 (S) 지정을 이용할 수 없는 경우, 식별자 "이성질체 1" 및 "이성질체 2"가 사용되고 칸-인골드-프렐로그 입체화학 지정 없이 IUPAC 명칭과 조합된다. 본원에서 "이성질체 1" 또는 "이성질체 2"로서 확인되는 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물은 하기 구체적 실험 기재에서 정의된 바와 같이 단리된다. 이성질체가 "1" 또는 "2"인지 여부는 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물이 열거된 조건 하에 키랄 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리되는 순서를 지칭하며, 즉 "이성질체 1"이 언급된 조건 하에 컬럼으로부터 용리되는 최초의 것이다. 키랄 크로마토그래피가 합성 초기에 시작되는 경우, 동일한 지정이 후속 중간체 및 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물에 적용된다.
구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 약어는 문헌 [Aldrichimica Acta, Vol. 17, No. 1, 1984]에 따라 정의된다. 기타 약어는 다음과 같이 정의된다: "ACN"은 아세토니트릴을 지칭하고; "BSA"는 소 혈청 알부민을 지칭하고; "cataCXium® A Pd G3"은 [(디(1-아다만틸)-부틸포스핀)-2-(2'-아미노-1,1'-비페닐)]팔라듐(II) 메탄술포네이트를 지칭하고; "DCM"은 디클로로메탄 또는 메틸렌 클로라이드를 지칭하고; "DMA"는 디메틸아세트아미드를 지칭하고; "DMEA"는 디메틸에틸아민을 지칭하고; "DMEM"은 둘베코 변형 이글 배지를 지칭하고; "DMF"는 N,N-디메틸포름아미드를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 지칭하고; "DNA"는 데옥시리보핵산을 지칭하고; "cDNA"는 상보적 DNA를 지칭하고; "DNase"는 데옥시리보뉴클레아제를 지칭하고; "DTT"는 디티오트레이톨을 지칭하고; "EC50"은 미리 정의된 양성 대조군 화합물과 비교하여 표적 활성의 50% 반응을 생성하는 작용제의 농도 (절대 EC50)를 지칭하고; "EDTA"는 에틸렌디아민테트라아세트산을 지칭하고; "ee"는 거울상이성질체 과잉률을 지칭하고; "ERα"는 에스트로겐 수용체 알파를 지칭하고; "ERβ"는 에스트로겐 수용체 베타를 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "EtOH"는 에탄올 또는 에틸 알콜을 지칭하고; "FBS"는 소 태아 혈청을 지칭하고; "HBSS"는 행크 평형 염(Hank's Balanced Salt) 용액을 지칭하고; "HEC"는 히드록시 에틸 셀룰로스를 지칭하고; "HEPES"는 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산을 지칭하고; "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 지칭하고; "IC50"은 작용제에 대해 가능한 최대 억제 반응의 50%를 생성하는 그 작용제의 농도, (상대 IC50), 또는 위약 대조군과 비교하여 표적 효소 활성의 50% 억제를 생성하는 작용제의 농도 (절대 IC50)를 지칭하고; "IPA"는 이소프로필아민을 지칭하고; "iPrOH"는 이소프로판올 또는 이소프로필 알콜을 지칭하고; "IV"는 정맥내 투여를 지칭하고; "Ki"는 억제 상수를 지칭하고; "MEK"는 메틸 에틸 케톤을 지칭하고; "MeOH"는 메틸 알콜 또는 메탄올을 지칭하고; "MTBE"는 메틸 t-부틸 에테르를 지칭하고; "PBS"는 인산염 완충 식염수를 지칭하고; "PO"는 경구 투여를 지칭하고; "PRα"는 프로게스테론 수용체 알파를 지칭하고; "QD"는 1일 1회 투여를 지칭하고; "RNA"는 리보핵산을 지칭하고; "RNase"는 리보뉴클레아제를 지칭하고; "RT-PCR"은 역전사 폴리머라제 연쇄 반응을 지칭하고; "RT-qPCR"은 역전사 정량적 폴리머라제 연쇄 반응을 지칭하고; "SFC"는 초임계 유체 크로마토그래피를 지칭하고; "TED50"은 종양에서 표적의 50% 억제를 달성하는 유효 용량을 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭하고; "t(R)"은 체류 시간을 지칭하고; "XantPhos Pd G2"는 클로로[(4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸크산텐)-2-(2'-아미노-1,1'-비페닐)]팔라듐(II)을 지칭하고; "XPhos Pd G2"는 클로로(2-디시클로헥실포스피노-2',4',6'-트리이소프로필-1,1'-비페닐)[2-(2'-아미노-1,1'-비페닐)]팔라듐(II)을 지칭한다.
하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 추가로 설명한다.
제조예 및 실시예
<반응식 1>
Figure pat00017
반응식 1은 화학식 I의 화합물의 합성을 도시한다.
단계 A에서, 그리냐르(Grignard) 반응이 완수된다. 그리냐르 반응은 탄소-탄소 결합의 형성을 위한 반응으로서 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 반응은 아릴 마그네슘 할라이드, 그리냐르 시약이 화합물 2의 산 클로라이드와 같은 카르보닐 기에 첨가되어 단계 A의 화합물을 제공하는 유기금속 반응을 수반한다. 예를 들어, 4-클로로-치환된 퀴놀론, 화합물 1이, 그리냐르 시약 예컨대 이소프로필마그네슘 클로라이드로 처리되어 그리냐르 중간체를 형성한 후 THF와 같은 용매에 산 클로라이드, 4-플루오로벤조일 클로라이드, 화합물 2를 첨가한다. 완료시, 반응물을 물로 켄칭하여 화합물 3을 수득할 수 있다.
단계 B에서, 화합물 3의 아릴 메틸 에테르는 삼브로민화붕소 처리와 같이 통상의 기술자가 인식할 수 있는 여러 가지의 조건 하에 탈메틸화될 수 있다. 예를 들어, 화합물 3은 DCM과 같은 용매에서 약 0℃의 온도에서 삼브로민화붕소로 서서히 처리된다. 혼합물을 실온에서 교반하고 이염기성 인산칼륨으로 켄칭하여 화합물 4를 수득한다.
단계 C에서, 아제티딘 에테르 6은 상응하는 p-플루오로페닐 케톤 4 및 아제티딘 알콜 염 5, 또는 상응하는 유리 염기를 적합한 염기, 예를 들어 수소화나트륨, 소듐 t-부톡시드 또는 포타슘 t-부톡시드로, 적절한 극성 비양성자성 용매 예컨대 DMF 또는 THF 중에서 처리하여 에테르 화합물 6을 수득함으로써 형성될 수 있다.
이어서 화합물 6을 스즈키(Suzuki) 교차 커플링 반응에서 적절한 치환된 아릴 보론산, 화합물 7로 알킬화시켜, 단계 D에서 화합물 8을 수득한다. 통상의 기술자는 이러한 교차-커플링 반응을 용이하게 하는 데 유용할 수 있는 여러 가지의 조건이 있음을 인식할 것이다. 적합한 팔라듐 시약은 XantPhos Pd G2, cataCXium® A Pd G3, 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드, 트리시클로헥실포스핀을 가진 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐 (0), (1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센)팔라듐(II) 클로라이드, 팔라듐 테트라키스트리페닐포스핀, 또는 팔라듐(II) 아세테이트를 포함할 수 있다. 적합한 염기는 플루오르화칼륨, 탄산세슘, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 리튬 t-부톡시드, 또는 인산칼륨 삼염기성 일수화물을 포함할 수 있다. 화합물 6을, 예를 들어, 용매 예컨대 2-메틸-2-부탄올 중 적절한 보론산, 화합물 7, 예컨대 2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐보론산과 염기 예컨대 탄산칼륨 및 촉매 예컨대 XPhos Pd G2와 함께 반응시킬 수 있으며 마이크로파 조건 하에 약 80℃로 가열하여 화합물 8을 수득한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 단계 D, 스즈키 교차 커플링 반응이 단계 C의 아제티딘 에테르 형성 전에 완료될 수 있음을 인식할 것이다.
단계 E에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 화합물 8이 케톤의 초기 환원에 의해 고리화될 수 있음을 인식할 것이다. 이는 용매 예컨대 1,4-디옥산 및 THF 중에서 및 약 0℃ 내지 실온의 온도에서 환원제, 예컨대 리튬 트리에틸 보로히드리드를 사용하여 완수되어 상응하는 2급 알콜을 제공할 수 있다. 이 중간 알콜은 조물질로 운반될 수 있으며 용매 예컨대 THF, DMSO, 또는 DMF 중에서 적합한 염기 예컨대 탄산세슘, 수소화나트륨, 소듐 t-부톡시드 또는 포타슘 t-부톡시드로 탈양성자화될 수 있다. 생성된 알콕시드는 실온에서, 환류로 가열과 함께, 또는 약 60℃의 온도에서 아릴 플루오라이드로 고리화될 수 있다. 이어서 플루오라이드의 치환 직후 형성된 치환된 시클릭 에테르가 수득되어 화학식 I의 화합물을 제공할 수 있다.
대안적으로, 케톤 8은 알콜로 환원되고 단계 F에서 키랄적으로 정제되어 키랄 알콜 9를 제공한 다음에, 단계 E에 대해 상기 기재된 바와 같이 단계 G에서 고리화되어 화학식 I의 화합물을 제공할 수 있다.
또 다른 대안적인 반응에서, 케톤은 키랄 시약 예컨대 (R)-(+)-α,α-디페닐-2-피롤리딘메탄올을 트리메틸 보레이트 및 보란-디메틸 술피드와 함께 사용하여 환원되어 원하는 키랄 알콜, 화합물 9를 직접 제공할 수 있고 이는 이어서 단계 E에 대해 상기 기재된 바와 같이 단계 G에서 고리화되어 화학식 I의 화합물을 제공할 수 있다.
임의적 단계에서, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물의 제약상 허용되는 염은 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물의 적절한 유리 염기를 표준 조건 하에 적합한 용매에서 적절한 제약상 허용되는 산과 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 게다가, 이러한 염의 형성은 질소-보호기의 탈보호 직후 동시에 발생할 수 있다. 제약상 허용되는 염의 가능한 형성은 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986)]; [ Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000)]; 및 [Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)]을 참조한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물이 제약상 허용되는 염으로서 용이하게 전환되고 단리될 수 있음을 인식할 것이다. 유용한 염의 예는 벤젠술폰산 염 및 4-메틸벤젠술폰산 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 4-메틸벤젠술폰산 염은 또한 토실레이트 염으로서 공지되어 있다.
제조예 1
2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에탄-1-올
Figure pat00018
소듐 트리아세톡시보로히드리드 (405 g, 1.91 mol)를 N2 하에 DCM (2.4 L) 중 3-(플루오로메틸)아제티딘 히드로클로라이드 (160 g, 1.28 mol)의 교반된 0℃ 용액에 15분의 기간에 걸쳐 나누어 첨가하고 0℃에서 10분 동안 교반하였다. 1,4-디옥산-2,5-디올 (99 g, 0.83 mol)을 0℃에서 1시간의 기간에 걸쳐 6회 분량으로 첨가한 다음에 0-5℃에서 15분 동안 교반하였다. 반응물을 실온으로 가온하고 N2 하에 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 20분의 기간에 걸쳐 10-15℃로 냉각한 다음에, 25-30℃로 가온하고 이 온도에서 2시간 동안 유지하였다. 10-15℃에서 25-30분의 기간에 걸쳐 물 (800 mL)을 첨가하고, 5-10분 동안 실온으로 가온한 다음에 층을 분리하였다. 수성 층을 DCM (800 mL)으로 세척하고, 층을 분리한 다음에 합한 수성 층을 10-15℃로 냉각하고 50% 수산화나트륨 용액 (~540 mL)을 사용하여 pH를 13-14로 조정하였다. 수성 층을 실온으로 가온하고, DCM (4 X 800 mL)으로 추출하고, 황산나트륨 (80 g)으로 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켜 표제 화합물 (139 g, 82%)을 농후한 황색 오일로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 134.1(M+H).
제조예 2
2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에탄-1-올 히드로클로라이드
Figure pat00019
2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에탄-1-올 (529 g, 4 mol)을 MTBE (2.6 L)에 용해시키고 0℃로 냉각하였다. HCl/EtOH 용액 (492 mL, 30 wt%)을 30분에 걸쳐 적가한 다음에 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 고체를 여과하고 여과 케이크를 MTBE (2 X 200 mL)로 세척하였다. N2 하에 8시간 동안 건조시켜 표제 화합물 (580 g, 86%)을 백색 고체로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 134.0 (M+H).
제조예 3
(3-클로로-7-메톡시퀴놀린-4-일)-(4-플루오로페닐)메탄온
Figure pat00020
4-브로모-3-클로로-7-메톡시퀴놀린 (70 g, 254 mmol)과 THF (1 L)의 혼합물을 N2 하에 -40℃로 냉각하여 물질의 침전을 발생시켰다. 이소프로필마그네슘 클로라이드 (THF 중 2 M, 254 mL, 509 mmol)를 20분에 걸쳐 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서 THF (140 mL) 중 4-플루오로벤조일 클로라이드 (66 mL, 559 mmol)의 용액을 적가하고 실온으로 가온하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액 (300 mL) 및 물 (200 mL)로 켄칭하고 층을 분리하였다. 유기 층을 포화 NH4Cl 용액 (300 mL)으로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 오일상 잔류물을 제공하였다. MTBE/헥산 (1:1)의 혼합물로 용리하면서 조 갈색 오일을 실리카겔을 통해 여과하여 조 생성물을 황색 고체 (84 g)로서 수득하였다. 고체를 10% 메틸아세테이트/헵탄 (800 mL)으로 처리하고 실온에서 밤새 교반하였다. 여과하여 고체를 수집하고 따로 남겨두었다. 여액을 농축하고 10-40% EtOAc/헥산으로 용리하면서 실리카겔 상에서 정제한 다음에 생성물을 10% 메틸아세테이트/헵탄 (200 mL)으로 처리하고 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 여과하고, 이전 여과로부터 수득한 고체와 합하고 밤새 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (31 g, 38%)을 황색 고체로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 316.0 (M+H).
제조예 4
(3-클로로-7-히드록시퀴놀린-4-일)-(4-플루오로페닐)메탄온
Figure pat00021
삼브로민화붕소 (DCM 중 1 M, 295 mL, 295 mmol)를 DCM (217 ml) 중 (3-클로로-7-메톡시퀴놀린-4-일)-(4-플루오로페닐)메탄온 (31 g, 98 mmol)의 혼합물에 첨가하고 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 혼합물을 이염기성 인산칼륨 (물 중 2 M, 700 mL) 및 물 (200 mL)의 0℃ 용액 내로 서서히 부었다. 혼합물을 실온으로 가온하고 1시간 동안 교반하였다. 용액을 진공 중에 농축하여 유기 용매를 제거하고, 여과하고, 여액을 수집하고 여액을 진공 하에 45℃에서 밤새 건조시켰다. 고체를 DCM/헵탄 (1:1, 450 mL)으로 처리하고 밤새 교반하였다. 고체를 수집하고 진공 하에 밤새 건조시켜 표제 화합물 (32 g, 정량적 수율)을 담갈색 고체로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 302.0 (M+H).
제조예 5
(3-클로로-7-히드록시퀴놀린-4-일)-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)메탄온
Figure pat00022
2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에탄-1-올 히드로클로라이드 (3.90 g, 23.0 mmol)를 DMF (75 ml) 중 (3-클로로-7-히드록시퀴놀린-4-일)-(4-플루오로페닐)메탄온 (5.00 g, 15.3 mmol)의 교반된 용액에 이어서 수소화나트륨 (광유 중 60%, 3.02 g, 76.8 mmol)에 첨가하였다. N2 하에 교반하고 45분 동안 40℃로 가온하였다. 용액을 물로 켄칭하고 농축하였다. 잔류물을 20% iPrOH/CHCl3와 포화 중탄산나트륨 수용액에 분배하고 분리하고, 상기 수용액을 2 x 20% iPrOH/CHCl3으로 추출하고, 유기 추출물을 합하고, 합한 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 여액을 농축하여 조 생성물을 암적색 오일로서 수득하였다. 조 물질을 MeOH/DCM 중 5-10% 7 N NH3의 구배로 용리하면서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (5.31 g, 84%)을 황색 고체로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 415.0 (M+H).
제조예 6
(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐){3-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-7-히드록시퀴놀린-4-일}메탄온
Figure pat00023
혼합물 (3-클로로-7-히드록시퀴놀린-4-일)-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)메탄온 (200 mg, 0.48 mmol), 2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐보론산 (158 mg, 0.72 mmol), 탄산칼륨 (202 mg, 1.45 mmol), 2-메틸-2-부탄올 (3 ml), 및 물 (1 ml)을 마이크로파 바이알에서 N2 (5x)로 탈기하였다. XPhos Pd G2 (12 mg, 0.015 mmol)를 첨가하고, 밀봉하고 80℃에서 2시간 동안 마이크로파처리하였다. 잔류물을 MTBE와 포화 NH4Cl 용액에 분배하였다. 층을 분리하고 수성 층을 MTBE로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 농축하여 오렌지색 잔류물을 수득하였다. 조 물질을 5% MeOH/DCM으로 용리하면서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (205 mg, 78%)을 황색 고체로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 543.2 (M+H).
하기 화합물을 제조예 6의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로, 절차를 하기와 같이, 1 내지 2시간의 가열 시간, MTBE 또는 EtOAc로 추출, 및 황산마그네슘 또는 황산나트륨상 상에서 유기 층의 건조로 변형시켜 제조하였다. DCM 중 최대 10% (MeOH 또는 7 M 암모니아화 MeOH) (제조예 10: 구배 DCM 중 3-8% 7 M 암모니아화 MeOH; 제조예 9 및 11: 구배 DCM 중 4 내지 10% 7 M 암모니아화 MeOH)를 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 및/또는 언급된 바와 같은 고 pH 역상 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
<표 2>
제조예 6에 따라 제조된 화합물
Figure pat00024
Figure pat00025
a고 pH 역상 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (레디셉(RediSep) Rf 골드® 고성능 C18 컬럼, 5% MeOH를 가진 10 mM 수성 중탄산암모늄 중에서 35-45% ACN으로 용리).
bDCM 중 4-10% 7 M 암모니아화 MeOH로 용리하면서 실리카 상에서 정제 후, 고 pH 역상 플래시 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다 (레디셉 Rf 골드® 고성능 C18 컬럼, 5% MeOH를 가진 10 mM 수성 중탄산암모늄 중에서 30-44% ACN으로 용리).
제조예 14
라세미 4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)(히드록시)메틸]-3-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]퀴놀린-7-올
Figure pat00026
(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐){3-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-7-히드록시퀴놀린-4-일}메탄온 (305 g, 562.2 mmol) 및 THF (1.5 L)를 N2 하에 함께 첨가하고 용액을 0-5℃로 냉각하였다. 리튬 트리에틸보로히드리드 (THF 중 1 M, 1.5 L, 1.5 mol)를 적가하였다. 혼합물을 0-5℃에서 1시간 동안 교반하였다. 물 (300 mL) 및 포화 NH4Cl (1 L)을 적가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하였다. EtOAc (2 L)를 첨가하고 유기 층을 수집하였다. 유기 층을 염수 (500 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켰다. 잔류물을 MeOH 중 아세톤과 2 M 암모니아의 95:5 혼합물에 용해시키고 실리카겔을 통해 여과하여 표제 화합물 (264 g, 86.2%)을 오렌지색 고체로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 545.2 (M+H).
제조예 15
4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)(히드록시)메틸]-3-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]퀴놀린-7-올, 이성질체 1
Figure pat00027
라세미 4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)(히드록시)메틸]-3-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]퀴놀린-7-올 (354 g, 0.62 mol)을 하기 조건 (컬럼 키랄팩(Chiralpak) AD-H, 150 x 50 mm, 유량 300 g/분, UV 350 nm, 0.5% DMEA/CO2를 가진 이동상 35% iPrOH, 컬럼 온도 40℃) 하에 키랄 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 제1 용리 이성질체의 표제 화합물 (171.4 g, 48%)을 수득하였다. 키랄 분석 SFC, >98% ee, t(R) =0.79분, 컬럼: 4.6 × 150 mm 키랄팩 AD-H, CO2 중 0.5% DMEA를 가진 35% iPrOH의 이동상으로 용리, 0.6 mL/분의 유량, 350 nm의 UV 검출에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다.
대안적 제조예 15
트리메틸 보레이트 (65 mg, 0.62 mmol)를 THF (20 mL) 중 (R)-(+)-α,α-디페닐-2-피롤리딘메탄올 (132 mg, 0.52 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 N2 하에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 보란-디메틸 술피드 (THF 중 2.0 M, 2.6 mL, 5.2 mmol)에 이어서 (4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐){3-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-7-히드록시퀴놀린-4-일}메탄온 (1.0 g, 1.73 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 45℃에서 가열하였다. 추가의 보란-디메틸 술피드 (THF 중 2.0 M, 2.6 mL, 5.2 mmol)를 첨가하고 5시간 동안 45℃에서 교반하였다. 포화 NH4Cl 용액 (25 mL)을 서서히 첨가하고 유기 상을 단리하였다. 수성 추출물을 20% iPrOH/CHCl3로 재-추출하였다. 유기 추출물을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 보란 착물 중간체 (1.2 g)를 수득하였다. 1,4-디옥산 (4 mL) 및 에탄올아민 (0.3 mL, 5 mmol)에 보란 착물 중간체 (0.4 g, 0.6 mmol)의 삼분의 일을 용해시키고 반응물을 3시간 동안 70℃로 가열하였다. 반응물을 포화 NH4Cl 용액 (25 mL)으로 켄칭하고 유기 상을 단리하였다. 수성 추출물을 20% iPrOH/CHCl3 (4 x 25 mL)으로 재-추출하였다. 유기 추출물을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축 건조시켜 표제 화합물을 오렌지색 고체 (0.33 g, 0.57 mmol, 100% 수율)로서 수득하였다. LC/MS (m/z): [M+H]+ 545. 키랄 분석 SFC, 96% ee, t(R) =0.79분, 컬럼: 4.6 × 150 mm 키랄팩 AD-H, CO2 중 0.5% DMEA를 가진 35% iPrOH의 이동상으로 용리, 0.6 mL/분의 유량, 350 nm의 UV 검출에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다.
실시예 1
라세미 5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올
Figure pat00028
1,4-디옥산 (100 mL) 중 (4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐){3-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]-7-히드록시퀴놀린-4-일}메탄온 (5.27 g, 9.71 mmol)의 용액을 5℃로 냉각하였다. 리튬 트리에틸보로히드리드 (THF 중 1 M, 30.0 mL, 30.0 mmol)를 첨가하였다. 냉각 조를 제거하고 1.5시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 물로 켄칭하였다. 포화 NH4Cl 용액 및 EtOAc를 첨가하였다. 층을 분리하고 수성 층을 EtOAc로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 농축하였다. 조 잔류물을 THF (100 mL)에 용해시켰다. 수소화나트륨 (광유 중 60%, 1.94 g, 48.5 mmol)을 첨가하였다. 용액을 1.5시간 동안 환류시켰다. 추가의 수소화나트륨 (광유 중 60%, 1.94 g, 48.5 mmol)을 첨가한 다음에, 추가 30분 동안 환류시켰다. 용액을 실온으로 냉각하고 물로 켄칭하였다. EtOAc 및 포화 NH4Cl 용액을 첨가하였다. 층을 분리하고 수성 층을 EtOAc로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 여액을 농축하였다. DCM 중 5-7% MeOH의 구배로 용리하면서 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (3.70 g, 72%)을 담황색 발포체로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 525.2 (M+H).
실시예 1의 방법과 본질적으로 유사한 방식으로 절차를 하기와 같이 변형시켜 하기 화합물을 제조하였다. 환원을 위해, 3 내지 5 당량의 리튬 트리에틸보로히드리드를 사용하고 반응 시간은 30분 내지 1시간이고 유기 층을 황산마그네슘 또는 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 조 잔류물을 직접 사용하거나 고리화 전에 DCM 중 0-5-7.5-10% MeOH의 구배로 용리하면서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. THF 중에서 최대 16시간 동안, 또는 DMF 중에서, 실시예 2의 경우 실온에서 2시간부터, 실시예 8의 경우 85℃에서 2시간으로 환류시킴으로써 고리화를 완료하였다. DCM 또는 EtOAc로 추출하고 유기 층을 황산마그네슘 또는 황산나트륨으로 건조시켰다. DCM 중 최대 10% (MeOH 또는 7 M 암모니아화 MeOH) (실시예 2: 구배 DCM 중 0-10% MeOH; 실시예 5: 구배 DCM 중 4-10% 7 M 암모니아화 MeOH; 실시예 8: 구배 DCM 중 5-7.5% 7 M 암모니아화 MeOH)를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 또는 언급된 바와 같은 고 pH 역상 HPLC에 의해 정제하였다.
<표 3>
실시예 1에 따라 제조된 실시예 화합물
Figure pat00029
Figure pat00030
a고 pH 역상 HPLC에 의해 정제하였다 (키네텍스(KINETEX)® C18, 5 μm, 30 × 250 mm 컬럼, 5% MeOH를 가진 10 mM 수성 중탄산암모늄 중에서 35-50% ACN으로 용리).
b고 pH 역상 HPLC에 의해 정제하였다 (키네텍스® C18, 5 μm, 30 × 250 mm 컬럼, 5% MeOH를 가진 10 mM 수성 중탄산암모늄 중에서 35-43% ACN으로 용리)
cDCM 중 4-10% 7 M 암모니아화 MeOH로 용리하면서 실리카 상에서 정제 후, 고 pH 역상 HPLC에 의해 추가로 정제하였다 (키네텍스® C18, 5 μm, 30 × 250 mm 컬럼, 5% MeOH를 가진 10 mM 수성 중탄산암모늄 중에서 30-44% ACN으로 용리).
d고 pH 역상 HPLC에 의해 정제하였다 (엑스브릿지(XBRIDGE)® C18 5 μm OBD, 30 × 75 mm 컬럼, 5% MeOH를 가진 10 mM 수성 중탄산암모늄 중에서 10-75% ACN으로 용리).
e고 pH 역상 HPLC에 의해 정제하였다 (엑스브릿지® C18 5 μm OBD, 30 × 75 mm 컬럼, 5% MeOH를 가진 10 mM 수성 중탄산암모늄 중에서 10-60% ACN으로 용리).
실시예 1A
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 1
및
실시예 1B
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 2
Figure pat00031
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올의 2개의 거울상이성질체를 하기 조건 (컬럼: 룩스(LUX)® 셀룰로스-1, 5 × 25 cm; CO2 중 30% iPrOH (0.5% DMEA를 가짐)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 300 g/분; UV 검출 파장: 270 nm)으로 키랄 SFC에 의해 분리하여 실시예 1A를 제1 용리 거울상이성질체 (이성질체 1)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 525.2 (M+H). 키랄 분석 SFC, >99% ee, t (R): 1.30분; 컬럼: 키랄셀(CHIRALCEL)® OD-H, 4.6 × 150 mm; CO2 중 30% MeOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다. 실시예 1B의 표제 화합물을 단리하여 제2 용리 거울상이성질체 (이성질체 2)를 수득하였다. ES/MS (m/z): 525.2 (M+H). 키랄 분석 SFC, 98% ee, t (R): 2.03분; 컬럼: 키랄셀® OD-H, 4.6 × 150 mm; CO2 중 30% MeOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다.
대안적 제법 실시예 1B
결정질 5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 2
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 4-메틸벤젠술폰산, 이성질체 2 (23.8 g, 0.034 mol)를 물 (250 mL)에서 1000 rpm으로 교반하였다. NaOH (76 μL)를 첨가하고 용액을 2시간 동안 교반하였다. DCM (600 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 분리하고, DCM 추출물을 황산마그네슘으로 건조시키고, 물질을 시린지 필터 (0.45 μm)를 통해 여과하고, 농축 건조시켰다. 물질을 주말 동안 N2 스트림 하에 놓았다. 1:1 EtOH/물 (80 mL)을 첨가하고 혼합물을 초음파처리와 함께 교반하였다. 나일론 막 상에 여과에 의해 황갈색 고체를 수집하여 표제 화합물 (10.47 g, 0.02 mol, 59%)을 수득하였다.
X-선 분말 회절 (XRD)
결정질 고체의 XRPD 패턴은 35 kV 및 50 mA에서 작동하는, 반텍(Vantec) 검출기 및 CuKα 공급원이 장착된, 브루커(Bruker) D4 엔데버(Endeavor) X-선 분말 회절계에서 수득하였다. 샘플은 0.008 2θ °의 스텝 크기 및 0.5 초/스텝의 스캔 속도로, 그리고 1.0 mm 발산, 6.6 mm 고정 항-산란, 및 11.3 mm 검출기 슬릿을 사용하여 4 내지 40 2θ °에서 스캔하였다. 건조 분말은 석영 샘플 홀더에 패킹하고 유리 슬라이드를 사용하여 평활한 표면을 수득하였다. 결정 형태 회절 패턴은 주위 온도와 상대 습도에서 수집하였다. 결정 피크 위치는 8.853 및 26.774 2θ°에서 피크를 가진 내부 NIST 675 표준을 기준으로 하여 전체 패턴 이동 후 MDI-제이드(Jade)에서 결정하였다. 임의의 주어진 결정 형태에 대해, 회절 피크의 상대 강도가 결정 형태 및 습성과 같은 요인으로부터 생긴 선호 배향으로 인해 달라질 수 있다는 것은 결정학 분야에서 널리 공지되어 있다. 선호 배향의 효과가 존재하는 경우, 피크 강도는 변경되나, 다형체의 특징적인 피크 위치는 변경되지 않는다. 예를 들어 문헌 [The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995]을 참조한다. 더욱이, 임의의 주어진 결정 형태에 대해 각 피크 위치가 약간 다를 수 있다는 것이 결정학 분야에 또한 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 피크 위치는 샘플이 분석되는 온도의 변화, 샘플 변위, 또는 내부 표준의 존재 또는 부재로 인해 이동할 수 있다. 본 경우에서, ± 0.2 2θ°의 피크 위치 가변성은 표시된 결정 형태의 명확한 식별을 방해하지 않고 이들 잠재적 변화를 고려하는 것으로 추정된다. 결정 형태의 확인은 구별되는 피크의 임의의 특유한 조합을 기반으로 이루어질 수 있다.
결정질 5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 2의 제조된 샘플을 하기 표 3에 기재된 바와 같이 회절 피크 (2-쎄타 값)를 갖고, 특히 6.8, 16.0, 및 22.1로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 하나 이상과 조합하여 19.8에서 피크를 갖는 것으로서 CuKa 방사선을 사용한 XRD 패턴에 의해; 0.2도의 회절 각도에 대한 허용오차로 특성화하였다.
<표 4>
결정질 실시예 1B의 X-선 분말 회절 피크
Figure pat00032
대안적 제법 실시예 1B
4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)(히드록시)메틸]-3-[2-플루오로-4-(트리플루오로메틸)페닐]퀴놀린-7-올, 이성질체 1 (63.05 g, 104.7 mmol)을 DMSO (1.3 L)에 실온에서 N2 하에 용해시켰다. 탄산세슘 (108 g, 331 mmol)을 5분에 걸쳐 나누어 첨가하였다. 혼합물을 15시간 동안 60℃로 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 물 (2.1 L) 및 EtOAc (1.3 L)로 희석하였다. 혼합물을 5분 동안 교반하고 분리하였다. 수성 물질을 EtOAc (1.3 L)로 재-추출하고 5분 동안 교반하였다. 분리하고 유기 추출물을 합하고, 염수, 물, 및 EtOAc로 세척하였다. 유기 추출물을 MgSO4로 건조시키고, 농축하고, 고 진공 하에 밤새 실온에서 건조시켜 표제 화합물을 갈색 고체 (52.69 g, 95.9%)로서 수득하였다. 키랄 분석 SFC, 98.1% ee, t (R): 2.03분; 컬럼: 키랄셀® OD-H, 4.6 × 150 mm; CO2 중 30% MeOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 실시예 1B의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다.
실시예 2A
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-7-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 1
및
실시예 2B
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-7-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 2
Figure pat00033
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-7-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올의 2개의 거울상이성질체를 하기 조건 (컬럼: 키랄팩® IC, 21 × 250 cm; CO2 중 30% iPrOH (0.2% IPA를 가짐)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 70 g/분; UV 검출 파장: 225 nm)으로 키랄 SFC에 의해 분리하여 실시예 2A를 제1 용리 거울상이성질체 (이성질체 1)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 525.1 (M+H). 키랄 분석 SFC, >99% ee, t (R): 1.56분; 컬럼: 키랄팩® IC, 4.6 × 150 mm; CO2 중 30% iPrOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다. 실시예 2B의 표제 화합물을 단리하여 제2 용리 거울상이성질체 (이성질체 2)를 수득하였다. ES/MS (m/z): 525.2 (M+H). 키랄 분석 SFC, 98% ee, t (R): 2.33분; 컬럼: 키랄팩® IC, 4.6 × 150 mm; CO2 중 30% iPrOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다.
실시예 3A
8-클로로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 1
및
실시예 3B
8-클로로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 2
Figure pat00034
8-클로로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올의 2개의 거울상이성질체를 하기 조건 (컬럼: 키랄셀® OD-H, 21 × 250 cm; CO2 중 35% MeOH (0.2% IPA를 가짐)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 80 g/분; UV 검출 파장: 225 nm)으로 키랄 SFC에 의해 분리하여 실시예 3A를 제1 용리 거울상이성질체 (이성질체 1)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 491.0 (M+H). 키랄 분석 SFC, >99% ee, t (R): 1.55분; 컬럼: 키랄셀® OD-H, 4.6 × 150 mm; CO2 중 35% MeOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다. 실시예 3B의 표제 화합물을 단리하여 제2 용리 거울상이성질체 (이성질체 2)를 수득하였다. ES/MS (m/z): 491.0 (M+H). 키랄 분석 SFC, >99% ee, t (R): 2.26분; 컬럼: 키랄셀® OD-H, 4.6 × 150 mm; CO2 중 35% MeOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다.
실시예 4A
7-클로로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 1
및
실시예 4B
7-클로로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 2
Figure pat00035
7-클로로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올의 2개의 거울상이성질체를 하기 조건 (컬럼: 키랄셀® OD-H, 21 × 250 cm; CO2 중 35% MeOH (0.2% IPA를 가짐)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 80 g/분; UV 검출 파장: 225 nm)으로 키랄 SFC에 의해 분리하여 실시예 4A를 제1 용리 거울상이성질체 (이성질체 1)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 491.0 (M+H). 키랄 분석 SFC, >99% ee, t (R): 1.71분; 컬럼: 키랄셀® OD-H, 4.6 × 150 mm; CO2 중 35% MeOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다. 실시예 4B의 표제 화합물을 단리하여 제2 용리 거울상이성질체 (이성질체 2)를 수득하였다. ES/MS (m/z): 491.0 (M+H). 키랄 분석 SFC, >99% ee, t (R): 2.38분; 컬럼: 키랄셀® OD-H, 4.6 × 150 mm; CO2 중 35% MeOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다.
실시예 5A
8-플루오로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 1
및
실시예 5B
8-플루오로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 2
Figure pat00036
8-플루오로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올의 2개의 거울상이성질체를 하기 조건 (컬럼: 키랄셀® OD-H, 21 × 250 cm; CO2 중 30% MeOH (0.2% IPA를 가짐)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 80 g/분; UV 검출 파장: 225 nm)으로 키랄 SFC에 의해 분리하여 실시예 5A를 제1 용리 거울상이성질체 (이성질체 1)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 475.0 (M+H). 키랄 분석 SFC, >99% ee, t (R): 1.56분; 컬럼: 키랄셀® OD-H, 4.6 × 150 mm; CO2 중 30% MeOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다. 실시예 5B의 표제 화합물을 제2 용리 거울상이성질체 (이성질체 2)로서 단리하였다. ES/MS (m/z): 475.0 (M+H). 키랄 분석 SFC, >99% ee, t (R): 2.29분; 컬럼: 키랄셀® OD-H, 4.6 × 150 mm; CO2 중 30% MeOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다.
실시예 6A
7-플루오로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 1
및
실시예 6B
7-플루오로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 2
Figure pat00037
7-플루오로-5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올의 2개의 거울상이성질체를 하기 조건 (컬럼: 키랄셀® OD-H, 21 × 250 cm; CO2 중 35% MeOH (0.2% IPA를 가짐)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 80 g/분; UV 검출 파장: 225 nm)으로 키랄 SFC에 의해 분리하여 실시예 6A를 제1 용리 거울상이성질체 (이성질체 1)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 475.0 (M+H). 키랄 분석 SFC, >99% ee, t (R): 1.32분; 컬럼: 키랄셀® OD-H, 4.6 × 150 mm; CO2 중 35% MeOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다. 실시예 6B의 표제 화합물을 단리하여 제2 용리 거울상이성질체 (이성질체 2)를 수득하였다. ES/MS (m/z): 475.0 (M+H). 키랄 분석 SFC, >99% ee, t (R): 1.95분; 컬럼: 키랄셀® OD-H, 4.6 × 150 mm; CO2 중 35% MeOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다.
실시예 8A
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-7-메틸-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 1
및
실시예 8B
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-7-메틸-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 2
Figure pat00038
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-7-메틸-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올의 2개의 거울상이성질체를 하기 조건 (컬럼: 키랄셀® OD-H, 21 × 250 cm; CO2 중 30% iPrOH (0.2% IPA를 가짐)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 80 g/분; UV 검출 파장: 265 nm)으로 키랄 SFC에 의해 분리하여 실시예 8A를 제1 용리 거울상이성질체 (이성질체 1)로서 수득하였다. ES/MS (m/z): 471.2 (M+H). 키랄 분석 SFC, >99% ee, t (R): 1.47분; 컬럼: 키랄셀® OD-H, 4.6 × 150 mm; CO2 중 30% iPrOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 이성질체 1의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다. 실시예 8B의 표제 화합물을 단리하여 제2 용리 거울상이성질체 (이성질체 2)를 수득하였다. ES/MS (m/z): 471.2 (M+H). 키랄 분석 SFC, >99% ee, t (R): 2.05분; 컬럼: 키랄셀® OD-H, 4.6 × 150 mm; CO2 중 30% iPrOH (0.2% IPA)의 이동상으로 용리; 컬럼 온도: 40℃; 유량: 5 mL/분; UV 검출 파장: 225 nm에 의해 이성질체 2의 거울상이성질체 풍부화를 확인하였다.
실시예 9
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 2, 벤젠술폰산
Figure pat00039
ACN (3 mL) 중 5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 2 (실시예 1B) (100 mg, 0.19 mmol)의 슬러리를 50℃에서 가열하였다. ACN (1 mL) 중 벤젠술폰산 일수화물 (40 mg, 0.23 mmol)의 용액을 첨가하였다. 투명한 황색 용액을 50℃에서 10분 동안 가열하였다. 가열을 중단하고, 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 톨루엔 (2 mL)을 첨가하고 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 용액을 여과하고 생성된 고체를 수집하고 고체를 ACN (1 mL)으로 세척하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (74 mg, 55%)을 수득하였다.
대안적 제법 실시예 9
MEK (4 mL) 중 5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 2 (실시예 1B) (124.1 mg, 0.24 mmol)의 슬러리를 50℃에서 가열하였다. MEK (1 mL)에 용해된 벤젠술폰산 일수화물 (50 mg, 0.28 mmol)의 용액을 첨가하였다. 가열을 중단하고, 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 혼합물을 주말에 걸쳐 교반하였다. N2 스트림 하에 농축하였다. MEK (1 mL)를 첨가하고 슬러리화하여 황색 결정질 고체를 수득하였다. 고체를 수집하고, MEK로 세척하고, 실온 진공 하에 건조시켜 표제 화합물 (78.8 mg, 48%)을 수득하였다.
XRD, 실시예 9
실시예 1B에 기재된 바와 같이 XRD를 완료하였다. -(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 2, 벤젠술폰산의 제조된 샘플을 하기 표 4에 기재된 바와 같이 회절 피크 (2-쎄타 값)를 갖고, 특히 12.3, 22.2, 및 23.1로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 하나 이상과 조합하여 20.5에서 피크를 갖는 것으로서 CuKa 방사선을 사용한 XRD 패턴에 의해; 0.2도의 회절 각도에 대한 허용오차로 특성화하였다.
<표 5>
결정질 실시예 9의 X-선 분말 회절 피크
Figure pat00040
실시예 10
결정질 5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 4-메틸벤젠술폰산, 이성질체 2
Figure pat00041
5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 이성질체 2 (실시예 1B) (204.2 g, 389 mmol) 및 EtOAc (5 L)를 함께 첨가하고 60℃에서 교반한 후 60℃에서 MeOH (200 mL)를 첨가하여 투명한 갈색 용액을 수득하였다. 표제 생성물 (11.48 g)을 첨가하여 용액을 시딩한 후 EtOAc (800 mL) 중 4-메틸벤젠술폰산; 수화물 (81.4 g, 428 mmol)의 미리 혼합된 용액을 첨가하여 황색 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 30분 동안 50℃에서 교반하였다. 현탁액을 ½ 부피로 냉각하였다. 용액을 실온에서 1시간 동안 냉각하고, 여과하고, 고체를 수집하고, 고체를 EtOAc로 세척하였다. 고체를 진공 하에 30℃에서 주말에 걸쳐 건조시켜 표제 화합물 (239 g, 343 mmol)을 수득하였다. 물질을 추가로 정제하기 위해, 표제 화합물 (229 g, 328.7 mmol) 및 2-프로판올 (4.6 L)을 함께 첨가하고 2시간 동안 60℃로 가열하였다. 30분 동안 실온으로 냉각하였다. 고체를 여과하고 iPrOH (100 mL)로 세척하였다. 고체를 N2의 스트림 하에 밤새 건조시켜 표제 화합물 (174.4 g, 76.2%)을 수득하였다. 본질적으로 동일한 방식으로 제조된 다양한 로트의 표제 화합물을 합하고 헵탄 (2 L)을 첨가하였다. 현탁액을 30분 동안 교반하고, 고체를 여과하고, 헵탄 (300 mL)으로 세척하였다. 수집된 고체를 N2의 스트림 하에 밤새 건조시켜 표제 화합물 (199.7 g, 99.5%)을 수득하였다.
XRD, 실시예 10
실시예 1B에 기재된 바와 같이 XRD를 완료하였다. 5-(4-{2-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]에톡시}페닐)-8-(트리플루오로메틸)-5H-[1]벤조피라노[4,3-c]퀴놀린-2-올, 4-메틸벤젠술폰산, 이성질체 2 (실시예 10)의 제조된 샘플은 하기 표 5에 기재된 바와 같이 회절 피크 (2-쎄타 값)를 갖고, 특히 12.8, 19.5, 및 22.8로 이루어진 군으로부터 선택된 피크 중 하나 이상과 조합하여 20.1에서 피크를 갖는 것으로서 CuKa 방사선을 사용한 XRD 패턴을; 0.2도의 회절 각도에 대한 허용오차로 특징으로 한다.
<표 6>
결정질 실시예 10의 X-선 분말 회절 피크
Figure pat00042
생물학적 검정
ER 발현과 특정 암과의 관계에 대한 증거는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
하기 검정의 결과는 실시예의 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물이 활성 SERD이고 암 치료에서 유용한 것으로 여겨진다는 점을 입증한다.
ERα (야생형), ERα (Y537S 돌연변이체) 및 ERβ 경쟁 결합 검정
하기 ER 경쟁 결합 검정의 목적은 ERα (야생형), ERα (Y537S 돌연변이체), 및 ERβ에 대한 시험 화합물의 친화도를 결정하는 것이다.
웰당 0.025 μCi 3H-에스트라디올 (118 Ci/mmol, 1 mCi/mL), 7.2 ng/웰 ERα (야생형), 또는 7.2 ng/웰 ERα (Y537S 돌연변이체) 또는 7.7 ng/웰 ERβ 수용체를 사용하여, 50 mM HEPES, pH 7.5, 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1 mg/mL 오브알부민, 및 5 mM DTT를 함유하는 완충제 중에서 경쟁 결합 검정을 시행하였다. 시험 화합물을 10,000 nM 내지 0.5 nM 범위의 10 가지 상이한 농도로 첨가하고, 1 μM의 17-β 에스트라디올의 존재 하에 비특이적 결합을 결정하였다. 결합 반응 (140 μL)을 실온에서 4시간 동안 인큐베이션한 다음에, 차가운 덱스트란-목탄 완충제 (70 μL) (50 mL의 검정 완충제당, 0.75 g의 목탄 및 0.25 g의 덱스트란함유)를 각각의 반응물에 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 오비탈 진탕기에서 8분 동안 혼합한 다음에 3000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 혼합물의 분취액 (120 μL)을 또 다른 96-웰, 백색 평저 플레이트 (코스타르(Costar))로 옮기고 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 옵티상 슈퍼믹스(Optiphase Supermix) 섬광 유체 (175 μL)를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 오비탈 진탕기에서 격렬하게 진탕시켰다. 2.5시간의 인큐베이션 후, 플레이트를 왈락 마이크로베타(Wallac Microbeta) 카운터에서 판독하였다. 4-파라미터 로지스틱 곡선 피트를 사용하여 IC50을 계산하고 10 μM에서 % 억제를 계산하였다. 쳉-프루소프(Cheng-Prusoff) 식을 사용하여 화합물의 IC50 값을 Ki로 전환시켰다. 이 검정의 결과는 실시예 1, 실시예 1A 및 실시예 1B (및 기타)가 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 재조합 ERα 야생형 및 ERα 돌연변이체 (Y537S)에 결합하고 실시예 1B는 또한 0.11 + 0.07, n=3의 Ki (nM) ERβ 경쟁으로 ERβ에 결합하는 것으로 결정되었음을 입증한다.
<표 7>
ERα (야생형), ERα (Y537S 돌연변이체) 및 ERβ 경쟁 결합 결과
Figure pat00043
시험된 예시 화합물 중에서, ERα 야생형에 대한 Ki는 약 0.300 nM 내지 약 65 nM 범위였다. ERα Y537S 돌연변이체에 대한 Ki는 약 2 nM 내지 300 nM 범위였다. 이 검정의 결과는 ERα 야생형, 돌연변이체 (ESR1 Y537S) 및 ERβ 단백질에 대한 예시된 화합물의 결합 친화도 및 효능을 입증한다.
MCF7 세포에서의 ERα 분해 검정
하기 ERα 분해 검정의 목적은 MCF7과 같은 ERα 양성 유방암 세포주에서의 시험 화합물에 의한 ERα의 분해를 측정하는 것이다.
10% FBS, 0.01 mg/mL 인간 인슐린 1 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 보충된 DMEM 배지에서 MCF7 (ATCC HTB-22로부터 구입) 세포를 배양하고 10% 목탄 스트립핑된 FBS를 함유하는 페놀 레드 미함유 DMEM 배지 (20 μL)에서 웰당 4,000개 세포의 밀도로 384-웰 평저 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 세포 배양 인큐베이터 (5% CO2, 95% 상대 습도 및 37℃)에서 밤새 인큐베이션하고 세포가 플레이트에 부착되도록 하였다. 다음 날 세포에 시험 화합물을 투여하였다. 에코(Echo) 555 어쿠스틱 디스펜서를 사용하여 6 μM 내지 0.0003 μM 범위의 시험 화합물 연속 희석액 (1:3)을 제조하였다. 연속 희석액 플레이트로부터 5 μL를 세포 플레이트에 첨가하여 세포에 투여하여, 2 내지 0.0001 μM의 최종 시험 화합물 농도 용량 범위와 0.2%의 최종 DMSO 농도를 생성하였다. 최대 지점의 경우, 0.2%의 DMSO를 함유하는 배지를 사용하고 최소 지점의 경우, 0.2% DMSO를 함유하는 성장 배지 중 2 μM 최종 농도로 희석된 풀베스트란트를 사용하였다. 시험 화합물을 투여한 후, 세포 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 실온에서 30분 동안 14% 파라-포름알데히드 (10 μL)를 첨가함으로써 세포를 고정하였다. 세포를 PBS (20 μL)로 1회 세척하고 0.5% (v/v) 트윈(TWEEN)® 20을 함유하는 PBS (20 μL)로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 0.05% 트윈® 20을 함유하는 PBS로 세척하고 (2×) 실온에서 1시간 동안 0.05% 트윈® 20 및 0.1% 트리톤(TRITON)™ X-100 (20 μL/웰)을 함유하는 PBS 중 3% BSA로 차단하였다. 웰당 0.05% 트윈® 20을 함유하는 PBS 중 1% BSA에 1:500 1차 항체 (20 μL) (ERα (클론 SP1) 모노클로날 토끼 항체 #RM-9101-S, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 희석액을 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날 세포를 0.05% 트윈® 20을 함유하는 PBS로 세척하고 (2×) PBS 1% BSA 중에서 2차 항체 (20 μL/웰) (1:1000 희석액, 염소 항-토끼 IgM 알렉사 플루오르(ALEXA FLUOR)™ 488)와 함께 실온에서 105분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS (2×20 μL)로 세척한 후, RNase (시그마(Sigma)) (50 μg/mL의 20 μL) 및 웰당 PBS 중 1:1000 프로피듐 아이오다이드 희석액 (20 μL)을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 벤치 상에서 실온에서 1시간 인큐베이션하였다 (빛으로부터 보존). 플레이트를 아큐멘 익스플로러(ACUMEN EXPLORER)™ [티티피 랩테크 리미티드(TTP LABTECH LTD)에 의해 제조된 레이저-스캐닝 형광 마이크로플레이트 세포측정기]로 스캔하여 ERα를 측정하였다. 영상 분석은 양성 세포를 식별하기 위한 세포 형광 신호를 기반으로 하였다. 평균 강도에 의해 ER 양성 세포를 식별하였다. 프로피듐 아이오다이드/DNA로부터 575-640 nm의 총 강도를 사용하여 개별 세포를 식별하였다. 검정 결과는 % ER 양성 세포였다. 진 데이터(GENE DATA)™를 사용하여 각각의 결과에 대해 4 파라미터 로지스틱에 곡선 피팅함으로써 IC50을 결정하였다. 이 검정의 결과는 MCF7 유방암 세포에서 본원에 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II, 및 화학식 III의 화합물에 의해 유도된 ERα의 강력한 분해를 입증한다. 실시예 1, 실시예 1A, 및 실시예 1B에 대한 상대 IC50 값은 표 8에 나타냈다.
<표 8>
MCF7 세포에서의 ERα 분해 검정
Figure pat00044
구체적으로, 표 7의 결과는 MCF7 유방암 세포에서 실시예 1의 화합물에 의한 ERα의 강력한 분해를 나타낸다. 시험된 예시된 화합물 중에서, 상대 IC50은 0.003 내지 >2 μM 범위였는데, 이는 실시예 2B를 제외한 모든 것이 시험된 농도에서 활성을 나타냈음을 나타낸다. 이 검정의 결과는 화학식 (I)의 화합물이 세포에서 강력한 ERα 분해 활성을 가진 SERD임을 입증한다.
MCF7 세포에서 PRα 유도 검정
하기 PRα 유도 검정의 목적은 시험 화합물이 ERα 수용체에 대해 효능작용 활성을 갖는지 여부를 결정하는 것이다 (효능제가 수용체를 활성화할 것으로 예상될 것이다).
10% FBS, 0.01 mg/mL 인간 인슐린 1 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 보충된 DMEM 배지에서 MCF7 (ATCC HTB-22로부터 구입)를 배양하고 세포 (70% 전면생장되기 전에)를 10% (목탄 스트립핑된) FBS를 함유하는 DMEM 페놀 레드 미함유 배지의 20 μL 부피에서 웰당 4,000개 세포의 밀도로 384-웰 평저 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 세포 배양 인큐베이터 (5% CO2, 37℃에서 95% 상대 습도)에서 밤새 인큐베이션하고 세포가 플레이트에 부착되도록 하였다. 다음 날, 세포에 시험 화합물을 투여하였다. 에코 555 어쿠스틱 디스펜서를 사용하여 6 μM 내지 0.0003 μM 범위의 화합물 연속 희석액 (1:3)을 제조하였다. 연속 희석액 플레이트로부터 시험 화합물 (5 μL)을 세포 플레이트에 첨가하여 세포에 투여하여, 2 내지 0.0001 μM의 시험 화합물 용량 범위의 최종 농도와 0.2%의 최종 DMSO 농도를 생성하였다. 최대 지점의 경우, 0.2%의 DMSO를 함유하는 배지를 사용하고 최소 지점의 경우, 0.2% DMSO를 함유하는 성장 배지 중 2 μM 최종 농도로 희석된 풀베스트란트를 사용하였다. 시험 화합물을 투여한 후, 세포 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 실온에서 30분 동안 14% 파라-포름알데히드 (10 μL)를 첨가함으로써 세포를 고정하였다. 세포를 PBS (20 μL)로 1회 세척하고 0.5% (v/v) 트윈® 20을 함유하는 PBS (20 μL)로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 0.05% 트윈® 20을 함유하는 PBS (20 μL)로 2회 세척하고 실온에서 1시간 동안 0.05% 트윈® 20 및 0.1% 트리톤™ X-100 (20 μL/웰)을 함유하는 PBS 중 3% BSA로 차단하였다. 웰당 0.05% 트윈® 20을 가진 1% BSA/PBS 중 1:500 1차 항체 (20 μL) (PR 모노클로날 마우스 항-인간 항체, 클론 PgR 636 다코(Dako), M3569) 희석액을 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
다음 날, 세포를 PBS 0.05% 트윈® 20 (2×20 μL)으로 세척하고 PBS 1% BSA 중에서 2차 항체 (20 μL/웰) (1:1000 희석액, 염소 항-토끼 IgM 알렉사 플루오르™ 488)와 함께 실온에서 105분 동안 인큐베이션하였다. PBS (2×20 μL)로 세척한 후, RNase (50 μg/mL의 20 μL) (시그마) 및 웰당 PBS 중 1:1000 프로피듐 아이오다이드 희석액을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 벤치 상에서 실온에서 1시간 인큐베이션하였다 (빛으로부터 보존). 플레이트를 아큐멘 익스플로러™ [티티피 랩테크 리미티드에 의해 제조된 레이저-스캐닝 형광 마이크로플레이트 세포측정기]로 스캔하여 PRα를 측정하였다. 영상 분석은 양성 세포를 식별하기 위한 세포 형광 신호를 기반으로 하였다. 평균 강도에 의해 PR 양성 세포를 식별하였다. 프로피듐 아이오다이드/DNA로부터 575-640 nm의 총 강도를 사용하여 개별 세포를 식별하였다. 검정 결과는 % PR 양성 세포였다. 진 데이터™를 사용하여 각각의 결과에 대해 4 파라미터 로지스틱에 곡선 피팅함으로써 IC50을 결정하였다. 이 검정의 결과는 MCF7 유방암 세포에서 실시예 1, 실시예 1A 및 실시예 1B의 어떤 유의한 효능작용 활성도 입증하지 않는다. 시험된 화합물의 경우, 이 검정에서의 상대 IC50은 > 2 μM이었다. 이 검정의 결과는 MCF7 유방암 세포에서 시험된 예시된 화합물의 어떤 유의한 효능작용 활성도 입증하지 않는다. 이들 결과는 또한 시험된 예시된 화합물이 MCF7 유방암 세포에서 ERα의 길항제임 (즉, 이들이 SERD 활성을 가짐)을 입증한다.
MCF7-ESR1 Y537N 682 CRISPR 세포에서의 PRα 억제 (ERα 기능적 길항작용) 세포 검정
하기 PRα 억제 (ERα 기능적 길항작용) 세포 검정의 목적은 Y537N 돌연변이체 ERα 수용체에 대한 시험 화합물의 길항작용 활성을 결정하는 것이다. 이 검정에서의 길항제는 ERα 수용체의 기능을 차단할 것으로 예상된다. PRα는 ERα의 하류 전사 표적이므로 ERα의 길항제는 PRα의 발현을 억제할 것으로 예상된다.
10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 보충된 DMEM 배지에서 MCF7-ESR1 Y537N-682 (MCF7 세포에서 ESR1 유전자의 CRISPR/Cas9 유전자 편집에 의해 생성됨, 클론#682)를 배양하고 세포 (70% 전면생장되기 전에)를 DMEM 페놀 레드 미함유 배지 10% FBS (20 μL 부피) (목탄 스트립핑된)에서 웰당 4,000개 세포의 밀도로 384-웰 평저 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 세포 배양 인큐베이터 (5% CO2, 95% 상대 습도 및 37℃)에서 밤새 인큐베이션하고 세포가 플레이트에 부착되도록 하였다. 다음 날 세포에 시험 화합물을 투여하였다. 에코 555 어쿠스틱 디스펜서를 사용하여 6 μM 내지 0.0003 μM 범위의 화합물 연속 희석액 (1:3)을 제조하였다. 연속 희석액 플레이트로부터의 5 μL를 세포 플레이트에 첨가하여 세포에 투여하여, 2 내지 0.0001 μM의 최종 시험 화합물 농도 용량 범위와 0.2%의 최종 DMSO 농도를 생성하였다. 최대 지점의 경우, 0.2%의 DMSO를 함유하는 배지를 사용하고 최소 지점의 경우, 0.2% DMSO를 함유하는 성장 배지 중 2 μM 최종 농도로 희석된 풀베스트란트를 사용하였다. 시험 화합물을 투여한 후, 세포 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 실온에서 30분 동안 14% 파라-포름알데히드 (10 μL)를 첨가함으로써 세포를 고정하였다. 세포를 PBS (1×20 μL)로 세척하고 0.5% (v/v) 트윈® 20을 함유하는 PBS (20 μL)로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS (2×20 μL), 0.05% 트윈® 20으로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 3% BSA/PBS 0.05% 트윈® 20, 0.1% 트리톤™ X-100 (20 μL/웰)로 차단하였다. 웰당 1% BSA/PBS 0.05 트윈® 20 중 1:500 1차 항체 (20 μL) (PR 모노클로날 마우스 항-인간 항체, 클론 PgR 636 다코, M3569) 희석액을 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
다음 날, 세포를 PBS 0.05% ® (2×20 μL)로 세척하고 PBS 1% BSA 중에서 2차 항체 (20 μL/웰) (1:1000 희석액, 염소 항-토끼 IgM 알렉사 플루오르™ 488)와 함께 실온에서 105분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS (2×20 μL)로 세척한 후, RNase (50 μg/mL의 20 μL) (시그마) 및 웰당 PBS 중 1:1000 프로피듐 아이오다이드 희석액을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 벤치 상에서 실온에서 1시간 인큐베이션하였다 (빛으로부터 보존). 플레이트를 아큐멘 익스플로러™ [티티피 랩테크 리미티드에 의해 제조된 레이저-스캐닝 형광 마이크로플레이트 세포측정기]로 스캔하여 PRα를 측정하였다. 영상 분석은 양성 세포를 식별하기 위한 세포 형광 신호를 기반으로 하였다. 평균 강도에 의해 PR 양성 세포를 식별하였다. 프로피듐 아이오다이드/DNA로부터 575-640 nm의 총 강도를 사용하여 개별 세포를 식별하였다. 검정 결과는 % PR 양성 세포였다. 진 데이터™를 사용하여 각각의 결과에 대해 4 파라미터 로지스틱에 곡선 피팅함으로써 IC50을 결정하였다.
이 검정의 결과는 MCF7 (ESR1 Y537N, 이형접합 돌연변이체) 유방암 세포에서 실시예 1, 실시예 1A, 및 실시예 1B에 의한 기능적 길항작용 및 PRα의 강력한 억제를 입증한다. 이 검정에서 실시예 1, 실시예 1A, 및 실시예 1B (및 기타)의 상대 IC50은 하기 표 9에 나타냈다. 시험된 예시된 화합물의 상대 IC50은 약 0.0118 내지 > 1.6 μM 범위이며, 이는 예시된 화합물이 실시예 2B 1.6 μM)를 제외한 ERα 매개 전사의 강력한 억제제 및 ERα 돌연변이체 (Y537N)의 강력한 길항제임을 나타낸다. PRα (PGR)는 또한 ERα의 전사 표적이며 이 검정으로부터의 결과는 PRα의 ERα-매개 전사의 강력한 억제를 입증한다.
<표 9>
MCF7 Y537N 682 CRISPR 세포에서의 PRα 억제 (ERα 기능적 길항작용) 세포 검정
Figure pat00045
MCF7 세포에서의 PRα 억제 (ERα 기능적 길항작용) 세포 검정
하기 PRα 억제 (ERα 기능적 길항작용) 세포 검정의 목적은 ERα 수용체에 대한 시험 화합물의 길항작용 활성을 결정하는 것이다. 이 검정에서의 길항제는 ERα 수용체의 기능을 차단할 것으로 예상된다. PRα는 ERα의 하류 전사 표적이므로 ERα의 길항제는 PRα의 발현을 억제할 것으로 예상된다.
시험 화합물 분배 전에, 세포 플레이트로부터 배지를 제거하고 음성 대조군 웰 (플레이트의 컬럼 24)을 제외한 모든 웰을 30분 동안 0.47 nM 에스트라디올을 함유하는 검정 배지로 전처리하는 것을 제외하고는, MCF7 세포주를 사용하여, 상기 ERα 분해 세포 기반 아큐멘 검정에서 상세히 설명된 바와 같은 검정 조건을 수행하였다. 이 검정에서, PRα의 검출을 위한 면역염색을 수행하고 플레이트를 아큐멘 익스플로러™ [티티피 랩테크 리미티드에 의해 제조된 레이저-스캐닝 형광 마이크로플레이트 세포측정기]로 스캔하여 PRα를 측정하였다. 영상 분석은 양성 세포를 식별하기 위한 세포 형광 신호를 기반으로 하였다. 평균 강도에 의해 PRα 양성 세포를 식별하였다. 프로피듐 아이오다이드/DNA로부터 575-640 nm의 총 강도를 사용하여 개별 세포를 식별하였다. 검정 결과는 % PRα 양성 세포였다. 진 데이터™를 사용하여 각각의 결과에 대해 4 파라미터 로지스틱에 곡선 피팅함으로써 IC50을 결정하였다. 이 검정의 결과는 MCF7 유방암 세포에서에서 실시예 1, 실시예 1A, 및 실시예 1B에 의한 기능적 길항작용 및 PRα의 강력한 억제를 입증한다. 이 검정에서 실시예 1, 실시예 1A, 및 실시예 1B의 상대 IC50은 하기 표 10에 나타냈다. 예시된 화합물의 상대 IC50은 약 0.029 내지 >2 μM 범위이며, 이는 1A 및 2B를 제외한 시험된 모든 예시된 화합물이 ERα 야생형 단백질의 강력한 길항제 및 ERα 매개 전사의 강력한 억제제임을 나타낸다. PRα (PGR)는 또한 ERα의 전사 표적이며 이 검정으로부터의 결과는 시험된 농도에서 PRα의 ERα-매개 전사의 강력한 억제를 입증한다.
<표 10>
MCF7 세포에서의 PRα 억제 (ERα 기능적 길항작용) 세포 검정
Figure pat00046
MCF7 및 MCF7-ESR1 Y537N-682에서의 세포 증식 검정
하기 세포 증식 검정의 목적은 일반적으로 시험 화합물이 세포 증식에 영향을 미치는지 여부를 검출하는 것이다.
MCF7 (ATCC HTB-22로부터 구입) 세포를 DMEM 페놀 레드 미함유 배지 10% FBS (20 μL 부피) (목탄 스트립핑된)에서 웰당 2,000개 세포의 밀도로 투명 바닥 384-웰 세포 배양 플레이트로 시딩하였다. 10% FBS, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제가 보충된 DMEM 배지에서 MCF7-ESRY537N-682 (MCF7 세포에서 ESr1 유전자의 CRISPR/Cas9 유전자 편집에 의해 생성됨, 클론#682)를 웰당 1000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 다음 날 세포에 시험 화합물을 투여하였다. 에코 555 어쿠스틱 디스펜서를 사용하여 60 μM 내지 0.003 μM 범위의 시험 화합물 연속 희석액 (1:3)을 제조하였다. 연속 희석액 플레이트로부터의 5 μL를 세포 플레이트에 첨가하여 세포에 투여하여, 20 내지 0.001 μM의 최종 시험 화합물 농도 용량 범위와 0.2%의 최종 DMSO 농도를 생성하였다. 최대 지점의 경우, 0.2%의 DMSO를 함유하는 배지를 사용하고 최소 지점의 경우, 0.2% DMSO를 함유하는 성장 배지 중 2 μM 최종 농도로 희석된 풀베스트란트를 사용하였다. 시험 화합물을 투여한 후, 세포 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 시험 화합물 첨가 7일 후, 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고 차가운 EtOH 96% (65 μL)를 각각의 웰에 첨가하였다. 30분 후, 배지를 제거하고 RNase (50 μg/mL의 20 μL) (시그마) 및 웰당 PBS 중 1:1000 프로피듐 아이오다이드 희석액을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 벤치 상에서 실온에서 1시간 인큐베이션하였다 (빛으로부터 보존). 플레이트를 아큐멘 익스플로러™ [티티피 랩테크 리미티드에 의해 제조된 레이저-스캐닝 형광 마이크로플레이트 세포측정기]로 스캔하였다. MCF-7 세포주는 성장하여 응집체를 형성하며, 개체 수로서의 세포 수는 판독치로서 사용가능하지 않을 수 있으며; 따라서 세포 수는 추산된 세포 수를 통해 평가될 수 있다 (면적 파라미터 (전체 세포 집단의 총 면적 (FL-1의 피크 강도 (PI)의 지정된 범위 및 단일 세포 집단의 평균 면적 (둘레에 의해 정의됨)의 비)를 통해 계산된다). 진 데이터™를 사용하여 각각의 결과에 대해 4 파라미터 로지스틱에 곡선 피팅함으로써 IC50을 결정하였다. MCF7 ESR1 야생형 및 MCF7-ESR1 Y537N 돌연변이체 세포에서 실시예 1, 실시예 1A, 및 실시예 1B (및 기타)의 상대 IC50은 하기 표 10에 나타냈다. 이 검정의 결과는 MCF7 (ESR1 야생형) 및 MCF7 (ESR1 Y537N 돌연변이체) 유방암 세포에서 실시예 1, 실시예 1A, 및 실시예 1B (및 기타)에 의한 강력한 항증식 활성 및 세포 성장 억제를 입증한다. 예시된 화합물의 상대 IC50은 MCF7 ESR1 야생형에서 약 0.0035 내지 1.176 μM 범위이고 MCF7 (ESR1 Y537N 돌연변이체) 유방암 세포에서 0.014 내지 1.86 μM 범위이며, 이는 시험된 모든 예시된 화합물이 MCF7 (ESR1 야생형) 및 MCF7 (ESR1 Y537N 돌연변이체) 유방암 세포에서 강력한 항증식 활성 및 세포 성장 억제를 입증함을 나타낸다.
<표 11>
MCF7 및 MCF7-ESR1Y537N-682에서의 세포 증식 검정
Figure pat00047
MCF7 종양에서 생체내 표적 억제 (IVTI) 검정 (PGR RT-qPCR 검정)
이 IVTI 검정의 목적은 마우스에서 이식된 이종이식 종양에서 ERα의 하류의 PRα 유전자 발현 (전사)을 억제하는 시험 화합물 (SERD)의 능력을 측정하는 것이다.
엔비고 알엠에스, 인크.(Envigo RMS, Inc.) (위스콘신주 메디슨)로부터의 암컷 NOD SCID 마우스 (22-25 g)에 1:1 HBSS + 매트리겔(MATRIGEL)™ 용액 (200 μL) 중 5×10e6 MCF7 ER-양성 유방암 세포 (ATCC, # HTB-22)를 우측 옆구리 영역에 피하로 이식하였다. 종양 세포 이식 1일 전에 17-β 에스트라디올 펠릿 (0.18 mg/펠릿, 90일 방출, 이노베이티브 리서치(Innovative research)로부터)을 피하로 이식하였다. 이식 후 제7일부터 시작하여 주 2회 종양 성장 및 체중을 측정하였다. 종양 크기가 250-350 mm3에 도달한 경우, 동물을 무작위화하고 5 마리의 동물 군으로 그룹화하였다. 시험 화합물을 시험 화합물 특이적 비히클 중 (1% 히드록시에틸셀룰로스/0.25% 트윈® 80/0.05% 소포제, 정제수 중) 다수회 용량으로 또는 비히클 단독을 3일 동안 경구로 동물에게 투여하고 마지막 용량 후 원하는 시간 간격으로 종양과 혈액을 수집하였다. 이소플루란 마취에 더하여 경추 탈구를 사용하여 동물을 희생시켰다. 종양을 플래시 동결시키고 RNA 단리 및 RT-qPCR 검정을 위해 프로세싱 때까지 -80℃에서 보관하였다. EDTA 튜브에 혈액을 수집하고, 혈장을 위해 스핀다운하고, 96-웰 플레이트에서 -80℃에서 동결시켰다. 시험 화합물 노출을 질량 분석법을 사용하여 결정하였다.
패스트프렙(FASTPREP)-24™ 세포 파쇄기(Cell Disrupter machine) (엠피 바이오메디컬(MP Biomedical))에서 매트릭스 D 비드 (엠피 바이오메디컬, #6913-500)를 사용하여, 액체 질소 중에서 종양을 분쇄하고 1×RNA 용해 완충제 (RNA 단리 키트로부터)에서 용해시켰다. 4℃에서 20분 동안 14000 rpm으로 회전시킨 후 종양 용해물을 새로운 튜브로 옮겼다. 퓨어링크(PURELINK)® RNA 미니 키트 (인비트로겐(Invitrogen) #12183018A) 또는 RNeasy 미니 키트 (퀴아젠(Qiagen) #74104 및 #74106)를 사용하여 종양 용해물로부터 RNA를 단리하였다. 퓨어링크® DNase 세트(Set) (인비트로겐 #12185010) 또는 RNase-미함유 DNase 세트 (퀴아젠 #79254)를 사용하여 DNA 오염물질을 제거하였다. 샘플을 RNase 미함유 물에 희석하고 플레이트 판독기 (스펙트라맥스(SpectraMax)190) 상에서 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 단리된 RNA 농도를 측정하였다. 모든 다른 RNA 샘플의 260 nm 측정치로부터 블랭크 (단지 RNase 미함유 물)의 평균 260 nm 흡광도 측정치를 감산하였다. RNase 미함유 물에서 동일한 농도로 RNA 샘플을 희석하였다. RT-PCR용 퍼스트-스트랜드 신테시스 시스템(First-Strand Synthesis System) (인비트로겐, #18080-051)을 사용하여 희석된 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. RT-qPCR을 수행하기 위해, 먼저 RNase 미함유 물에 cDNA를 희석하였다. 2× 무수(Absolute) 블루 qPCR ROX 믹스 (써모, #AB-4139/A), PGR 프라이머 (써모, Hs01556702_m1), 및 PCR 플레이트 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), #4309849)에서의 각각 반응에 대해 희석된 cDNA를 조합하였다. 써모사이클러 (ABI 프리즘(Prism) 7900HT 시퀀스 검출 시스템)에서 샘플을 50℃에서 2분 동안에 이어서 95℃에서 15분 인큐베이션함으로써 cDNA를 증폭시켰다. 95℃에서 15초 동안에 이어서 50℃에서 60초 동안 총 40 사이클 동안 인큐베이션을 계속하였다. 사이클은 하우스키핑 유전자로 정규화되고 비히클 단독과 비교하여 % PGR 억제를 계산하는 데 사용된다. 각각의 샘플을 이중으로 분석하고 평균 수치를 사용하여 계산하였다. 엑셀(Excel) 및 XL 피트(Fit)를 사용하여 퍼센트 표적 (PGR) 억제를 계산하였다.
이 검정의 결과는 실시예 1B가 종양 이종이식 모델에서 PRα (PGR) 발현을 억제함을 입증한다. 실시예 1B는 경구 투여시 30 mg/kg 용량으로 24시간 동안 종양 이종이식 모델에서 ~78%까지 PRα (PGR) 발현을 억제하였다. 이들 결과는 종양 이종이식 모델에서 생체내에서 ERα 길항작용 활성 및 ERα-매개 전사 활성의 유의하고 지속된 억제를 입증한다.
마우스에서 이식된 ER-양성 (ESR1 야생형) 유방암 이종이식 종양 모델에서의 생체내 종양 성장 억제 연구
하기 이종이식 종양 억제 검정의 목적은 시험 화합물 투여에 대한 반응으로 종양 부피의 감소를 측정하는 것이다.
인간 유방암 세포 MCF7 (ATCC # HTB-22) 및 HCC1428 (ATCC # CRL-2327)을 배양액에서 확장시키고, 수확하고 1:1 HBSS+매트리겔™ 용액 (200 μL) 중 5×10e6 세포를 암컷 NOD SCID 마우스 (22-25 g, 엔비고 알엠에스, 인크)의 뒤쪽 우측 옆구리로 피하 주사하였다. 세포 이식 24시간 전에, 에스트로겐 펠릿 (0.18 mg/펠릿, 17β 에스트라디올, 90일 방출, 이노베이티브 리서치)을 피하로 이식하였다. 인간 유방암 세포 T47D (ATCC # HTB-22)를 배양액에서 확장시키고, 수확하고 1:1 HBSS+매트리겔™ 용액 (200 μL) 중 5×10e6 세포를 암컷 NOD SCID 마우스 (22-25 g, 엔비고 알엠에스, 인크)의 뒤쪽 우측 옆구리로 피하 주사하였다. 세포 이식 24시간 전에, 에스트로겐 펠릿 (0.38 mg/펠릿, 17β 에스트라디올, 90일 방출, 이노베이티브 리서치)을 피하로 이식하였다. 인간 유방암 세포 ZR-75-1 (ATCC # CRL-1500)을 배양액에서 확장시키고, 수확하고 1:1 HBSS+매트리겔™ 용액 (200 μL) 중 5×10e6 세포를 암컷 NOD SCID 마우스 (22-25 g, 엔비고 알엠에스, 인크)의 뒤쪽 우측 옆구리로 피하 주사하였다. 세포 이식 24시간 전에, 동물에게 50 μl의 에스트라디올 발레레이트 (델레스트로겐(Delestrogen)®) 근육내 주사 (10 mg/mL)로 투여한 다음에 연구 지속기간 동안 14일마다 1회 투여하였다. 이식 후 제7일부터 시작하여 주 2회 종양 성장 및 체중을 측정하였다. 종양 크기가 250-350 mm3에 도달한 경우, 동물을 무작위화하고 5 마리의 동물 군으로 그룹화하였다. 시험 화합물, 실시예 1B를 적절한 비히클 (1% 히드록시에틸셀룰로스/0.25% 트윈® 80/0.05% 소포제, 정제수 중) 중에서 제조하고 28일 동안 (QD) 경구 위관영양법으로 투여하였다. 치료 과정 동안에 1주 2회 수행된 종양 부피 측정에 의해 종양 반응을 결정하였다. 종양 부피를 측정할 때마다 체중을 독성의 일반적인 척도로서 취하였다.
실시예 1B의 화합물은 하기 표 12에 제공된 바와 같은 델타 T/C% 값을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 실시예 1B의 화합물이 마우스에서 양호한 경구 생체이용률 및 ER-양성 (ESR1 야생형) 인간 유방암 이종이식 모델에서 유의한 항종양 활성 또는 종양 퇴행을 입증함을 나타낸다.
<표 12>
마우스에서 이식된 ER-양성 유방암 이종이식 종양 모델에서의 생체내 종양 성장 억제 연구
Figure pat00048
종양 부피 분석은 Log 10 및 공간적파워(SpatialPower) 공분산 구조를 기반으로 하였다.
*: 비히클 대조군과 비교하여 유의하다 (p<0.05).
델타 T/C%는 처리군에서의 종점 종양 부피가 기준선 종양 부피 이상일 때 계산하였다. 식은 100*(T-T0)/(C-C0)이며, 여기서 T 및 C는 각각 처리군 또는 대조군에서의 평균 종점 종양 부피이다. T0 및 C0은 그러한 군에서의 평균 기준선 종양 부피이다.
퇴행%는 종점 부피가 기준선 미만일 때 계산하였다. 식은 100*(T-T0)/T0이며, 여기서 T0은 처리군에 대한 평균 기준선 종양 부피이다.
제32일에 기준선 (무작위화)으로부터의 모든 군의 전체 평균을 사용하여 T/C의 % 변화를 계산하였다.
마우스에서 이식된 ESR1 돌연변이체 (Y537S) 유방암 PDX 종양 모델 (ST941/HI)에서의 생체내 종양 성장 억제 연구
하기 이종이식 종양 억제 검정의 목적은 ESR1 돌연변이체 및 호르몬-독립성 (HI) 유방암 환자-유래 이종이식 (PDX) 모델에서 시험 화합물 투여에 대한 반응으로 종양 부피의 감소를 측정하는 것이다.
ST941/HI PDX 모델은 사우스 텍사스 엑셀러레이티드 리서치 쎄라퓨틱스(South Texas Accelerated Research Therapeutics) (텍사스주 샌안토니오)에서 유래되어 시행하였다. 종양 단편을 숙주 동물로부터 수확하고 면역-결핍 마우스 (더 잭슨 래보러토리(The Jackson Laboratory))에 이식하고 연구는 대략 125-250 mm3의 평균 종양 부피에서 시작되었다. 시험 화합물, 실시예 1B를 적절한 비히클 (1% 히드록시에틸셀룰로스/0.25% 트윈® 80/0.05% 소포제, 정제수 중) 중에서 제조하고 28일 동안 경구 위관영양법으로 투여하였다. 치료 과정 동안에 1주 2회 수행된 종양 부피 측정에 의해 종양 반응을 결정하였다. 종양 부피를 측정할 때마다 체중을 독성의 일반적인 척도로서 취하였다.
실시예 1B의 화합물은 하기 표 13에 제공된 바와 같은 델타 T/C% 값을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 실시예 1B의 화합물이 마우스에서 양호한 경구 생체이용률 및 ESR1 돌연변이체 (Y537S) 인간 유방암 PDX 모델에서 유의한 항종양 활성 또는 종양 퇴행을 입증함을 나타낸다.
<표 13>
마우스에서 이식된 ESR1 돌연변이체 유방암 PDX 종양 모델에서의 생체내 종양 성장 억제 연구
Figure pat00049
종양 부피 분석은 Log 10 및 공간적파워 공분산 구조를 기반으로 하였다.
*: 비히클 대조군과 비교하여 유의하다 (p<0.05).
델타 T/C%는 처리군에서의 종점 종양 부피가 기준선 종양 부피 이상일 때 계산하였다. 식은 100*(T-T0)/(C-C0)이며, 여기서 T 및 C는 각각 처리군 또는 대조군에서의 평균 종점 종양 부피이다. T0 및 C0은 그러한 군에서의 평균 기준선 종양 부피이다.
퇴행%는 종점 부피가 기준선 미만일 때 계산하였다. 식은 100*(T-T0)/T0이며, 여기서 T0은 처리군에 대한 평균 기준선 종양 부피이다.
제32일에 기준선 (무작위화)으로부터의 모든 군의 전체 평균을 사용하여 T/C의 % 변화를 계산하였다.
조합 연구
종양 이질성과 내분비 요법에 대한 후천적 내성으로 인해, 조합 요법은 효과적인 요법을 위해 또는 후천적 내성을 극복하기 위해 ER-양성 및 진행성/전이성 유방암 치료에서 필수적이 되었다. 본 발명자들은 실시예 1B와 CDK4/6 억제제 아베마시클립, mTOR 억제제 에버롤리무스, PIK3CA 억제제 알펠리십 및 PI3K/mTOR 억제제 8-[5-(1-히드록시-1-메틸에틸)피리딘-3-일]-1-[(2S)-2-메톡시프로필]-3-메틸-1,3-디히드로-2H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-온 ("화합물 A")의 조합 효과를 시험관내에서 5개의 ER-양성 유방암 세포주에서 시험하였다.
조합 연구를 위한 세포 생존력 검정
하기 표 14에 기재된 배지의 20 μL 부피 중 상기 표에 나타낸 밀도로 세포를 투명 바닥 384-웰 세포 배양 플레이트로 시딩하였다.
<표 14>
세포 생존력 검정 세포주 정보
Figure pat00050
플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 다음 날 세포에 시험 화합물, 실시예 1B를 투여하였다.
10 mM DMSO 스톡 용액으로서 화합물을 준비하고 고정된 비로 함께 시험된 두 화합물을 10 또는 1 μM에서 시작하는 최고 농도로 용량 반응 연구에 사용한 다음에, 제조된 1:3 연속 희석액 연속 희석액뿐만 아니라 화합물 단독을 20 μM의 시작 농도로 IC50 결정을 위해 사용하였다. 연속 희석액 플레이트로부터의 5 μL를 세포 플레이트에 첨가하여 세포에 투여하여, 단일 처리의 경우 20 내지 0.001 μM의 최종 시험 화합물 농도 용량 범위 또는 조합의 경우 더 낮은 범위와 0.2%의 최종 DMSO 농도를 생성하였다. 최대 지점의 경우, 0.2%의 DMSO를 함유하는 배지를 사용하고 최소 지점의 경우, 0.2% DMSO를 함유하는 성장 배지 중 2 μM 최종 농도로 희석된 스타우로스포린을 사용하였다. 시험 화합물을 투여한 후, 세포 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 화합물과 함께 2회 이중으로 인큐베이션한 후, 인큐베이터로부터 플레이트를 제거하고 각각의 웰에 차가운 EtOH 96% (65 μL)를 첨가하였다. 30분 후, 배지를 제거하고, RNase (50 μg/mL의 20 μL) (시그마) 및 웰당 PBS 중 1:1000 프로피듐 아이오다이드 희석액을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1시간 인큐베이션하였다 (빛으로부터 보존). 플레이트를 아큐멘 익스플로러™ [티티피 랩테크 리미티드에 의해 제조된 레이저-스캐닝 형광 마이크로플레이트 세포측정기]로 스캔하였다. 일부 세포주가 성장하여 응집체를 형성함에 따라, 개체 수로서의 세포 수를 판독치로서 사용가능하지 않을 수 있으며; 따라서 총 면적 집단 (FL-1의 피크 강도 (PI)의 지정된 범위) 또는 PI의 총 강도를 사용하여 세포 수를 평가한다.
시험관내 조합 데이터는 표 15에 나타낸 바와 같이 5개의 ER-양성 유방암 세포주 중 5개에서 실시예 1B와 아베마시클립, 또는 에버롤리무스의 조합에 의한 상승작용 (하기 정의된 바와 같음)을 시사한다. 실시예 1B와 화합물 A의 조합은 시험된 4개의 ER-양성 유방암 세포주 중 4개에서 상승작용적이다. 실시예 1B와 알펠리십의 조합 효과는 4개의 ER-양성 유방암 세포주 중 2개에서 상가적이고 4개의 ER-양성 유방암 세포주 중 2개에서 상승작용적이다.
<표 15>
ER-양성 유방암 세포주에서 다른 표적화제와 실시예 1B의 시험관내 조합
Figure pat00051
데이터 분석 및 조합 효과의 해석
문헌에 공개된 방법을 사용하여 시험관내 조합 효과를 계산하였다 ([L. Zhao, et al, Front Biosci, 2010, 2:241-249] 및 [L. Zhao, et al, Clin Cancer Res, 2004, 10(23):7994-8004]). 두 약물 간의 상승작용적 또는 길항작용적 상호작용을 식별하기 위해, XL피트 5 애드 인을 가진 맞춤형 XL 템플릿을 사용하여 곡선 이동 분석을 수행하였다. 단일 작용제의 곡선은 4 파라미터 로지스틱 퇴행을 사용하여 조정하였다. 피팅에 사용되는 기준 및 제한은 (i) 하단 < (-20)은 0으로 고정되고 (ii) 상단 >120은 100으로 고정하였다. 모든 관측치가 사용자가 설정한 임계값보다 더 낮으면, 힐(hill) = 0을 가진 상수 피트가 수행되고 IC50은 최대 포함 농도보다 더 높은 것으로 간주되었다. 일단 각각의 단일 작용제의 절대 IC50이 수득되면, 단일 및 조합에 대해 50%의 활성의 등가 농도를 계산하였다. 측정된 활성과 함께 이들 등가 농도를 사용하여 본 발명자들은 절대 IC50을 재계산하며, 단일 작용제에 대한 곡선은 1과 동일한 등가 농도 값에서 50% 활성에 도달할 것이며, 한편 상승작용적 조합은 더 낮은 값에서 50%에 도달하여 좌측방향 이동을 발생시키고, 길항작용적 조합은 우측방향 이동을 나타낼 것이다. 등가 농도는 CI50 (활성의 50%에서의 조합 인덱스)을 계산하는데 또한 사용되며, 여기서 CI50은 조합 곡선의 절대 IC50과 같다. CI50과 함께 활성의 상이한 백분율에서 다른 CI (조합 인덱스)를 계산할 수 있다 (CI10, CI20, CI30, CI40, CI60, CI70, CI80. CI90). CInn을 계산하기 위해, 상이한 활성 백분율에서 등가 농도를 계산하였다. 각각의 활성 백분율에 대해 본 발명자들은 95%의 신뢰 구간인 오차 한계를 계산하고 이 신뢰 구간을 사용하여 CI에 오차 한계를 더한 상한치를 계산하고 CI에 오차 한계를 뺀 하한치를 계산하였다. 상한치 = CI+신뢰 구간 95% 및 하한치 = CI-신뢰 구간 95%. 이어서 이들 제한치를 결과를 해석하는 데 사용하였다.
각각의 활성 백분율의 통계적 해석은 다음과 같다:
Figure pat00052
각각의 활성 백분율에서의 생물학적 해석은 다음과 같다:
Figure pat00053
생체내 조합 연구
종양 이질성과 내분비 요법에 대한 후천적 내성으로 인해, 조합 요법은 효과적인 요법을 위해 또는 후천적 내성을 극복하기 위해 ER-양성 및 진행성/전이성 유방암 치료에서 필수적이 되었다. 표적화 요법의 조합이 ER-양성 유방암을 둔화시키거나 심지어 중단시키는 데 더 효과적일 가능성을 갖는다는 가설이 세워졌다. CDK4/6 억제제와 풀베스트란트의 조합은 ER-양성 전이성 유방암 치료용으로 승인되었으나 ESR1 또는 PIK3CA의 후천성 돌연변이로 인해 높은 백분율의 환자에게 내성이 발생한다. ERα의 강력한 분해제 및 길항제로서, 실시예 1B와 같은 경구 SERD는 단일 작용제로서 또는 CDK4/6 억제제 예컨대 아베마시클립 또는 PI3K/mTOR 억제제 예컨대 화합물 A와 조합하여 ESR1 돌연변이체 또는 PIK3CA 돌연변이체 유방암을 둔화시키거나 중단시키는 데 더 효과적일 가능성을 갖는다. 그 맥락에서, 실시예 1B의 화합물은 아베마시클립 (특허 참조) 또는 화합물 A (특허 참조)와 조합하여 종양 성장 억제에 대해 시험하였다. 보다 구체적으로 실시예 1B의 화합물은 ESR1 야생형 및 PIK3Ca 돌연변이체 MCF7 유방암 이종이식 모델에서 아베마시클립 또는 화합물 A와 조합하여 시험하였다.
인간 유방암 세포 MCF7 (ATCC # HTB-22)을 배양액에서 확장시키고, 수확하고 1:1 HBSS+매트리겔™ 용액 (200 μL) 중 5×10e6 세포를 암컷 NOD SCID 마우스 (22-25 g, 엔비고 알엠에스, 인크)의 뒤쪽 우측 옆구리로 피하 주사하였다. 세포 이식 24시간 전에, 에스트로겐 펠릿 (0.18 mg/펠릿, 17β 에스트라디올, 90일 방출, 이노베이티브 리서치)을 피하로 이식하였다. 이식 후 제7일부터 시작하여 주 2회 종양 성장 및 체중을 측정하였다. 종양 크기가 250-350 mm3에 도달한 경우, 동물을 무작위화하고 5 마리의 동물 군으로 그룹화하였다. 시험 화합물 실시예 1B를 적절한 비히클 (1% 히드록시에틸셀룰로스/0.25% 트윈® 80/0.05% 소포제, 정제수 중) 중에서 제조하고 42일 동안 경구 위관영양법에 의해 투여하였다. CDK4/6 억제제 (아베마시클립)는 25 mM 인산나트륨 완충제, pH 2.0 중 1% HEC에서 제제화되었다. PI3K/mTOR 억제제 (화합물 A)는 정제수 중 1% 히드록시에틸셀룰로스/0.25% 트윈® 80/0.05% 소포제에서 제제화되었다. 치료 과정 동안에 1주 2회 수행된 종양 부피 측정에 의해 종양 반응을 결정하였다. 종양 부피를 측정할 때마다 체중을 독성의 일반적인 척도로서 취하였다. 종양 부피는 식 v = l x w2 x 0.535를 사용함으로써 추산되며 여기서 l = 측정된 직경보다 더 크고 w = 수직 직경보다 더 작다.
통계 분석
종양 부피 데이터의 통계 분석은 시간 및 처리군 간의 분산을 동일하게 하기 위해 로그 척도로의 데이터 변환으로 시작되었다. 로그 부피 데이터는 SAS 소프트웨어 (버전 9.3)의 MIXED 절차를 사용하여 시간 및 처리에 따른 분산의 이원 반복 측정 분석으로 분석하였다. 반복 측정에 대한 상관 모델은 공간적 파워이다. 처리군은 각각의 시점에서 대조군과 비교되었다. MIXED 절차는 또한 각각의 처리군에 대해 개별적으로 사용되어 각각의 시점에서 조정된 평균 및 표준 오차를 계산하였다. 두 분석 모두 각각의 동물 내의 자기상관 및 큰 종양을 가진 동물이 연구로부터 조기에 제거되는 경우 발생하는 데이터의 손실을 설명한다. 조정된 평균 및 표준 오차 (s.e.)는 각각의 처리군 대 시간에 대해 플로팅하였다. 종양 부피에 대한 분석은 log10 및 공간적 파워 공분산 구조를 기반으로 하였다. P 값은 두 구체적 군 간의 비교를 기반으로 하였다.
조합 분석 방법 (IVEF 연구에 대한 블리스(Bliss) 독립성)
첫째, 통상적인 반복 측정 모델은 로그 부피 대 군 및 시간에 적합하다. 이어서 대비 설명(contrast statement)을 사용하여 조합된 2개의 구체적 처리를 사용하여 각각의 시점에서 상호작용 효과를 시험하였다. 이것은 블리스 독립성 방법에 상당하며 이론적으로 종양 부피가 제로, 즉 완전 퇴행에 도달할 수 있다고 가정한다. 조합에 대한 예상 상가적 반응 (EAR)은 종양 부피 척도에서 다음과 같이 계산되었다: 반응 (EAR) EAR 부피 = V1 * V2/V0이며, 여기서 V0, V1, 및 V2는 각각 비히클 대조군, 처리 1 단독, 및 처리 2 단독에 대한 추산된 평균 종양 부피이다. 상호작용 시험이 유의한 경우, 조합 효과는 관찰된 조합 평균 부피가 각각 EAR 부피보다 작거나 많음에 따라 조합 효과가 통계적으로 상가성 초과이거나 상가성 미만인 것으로 선언된다. 그렇지 않으면, 통계적 결론은 상가적이다. 게다가, 생물학적으로 관련된 상가성 범위는 EAR 부피 초과 및 미만 X%로서 정의할 수 있다. 전형적으로, X는 25 내지 40%일 것이다. 이어서 관찰된 조합 평균 부피가 상가성의 간격 미만, 내에, 또는 초과에 있는 경우, 조합에 대한 생물학적 결론을 상가성 초과, 상가성, 또는 상가성 미만으로 내릴 수 있다.
정체가 최선의 예상되는 반응인 상황이 있을 수 있다. 그러한 상황에서, 블리스 방법은 %델타 T/C 값에 직접 적용하여 EAR 퍼센트 반응을 수득할 수 있다: EAR % 델타 T/C = Y1 * Y2/100이며, 여기서 Y1 및 Y2는 단일-작용제 처리의 경우 퍼센트 델타 T/C 값이다. 현재, 조합 군에서 관찰된 %델타 T/C와 EAR를 비교하는 어떤 통계적 시험도 없으나, 상기에 기재된 생물학적 기준을 적용할 수 있다.
표 15 및 표 16에 나타낸 바와 같이, 단일 작용제로서 실시예 1B 또는 아베마시클립 단독 처리는 각각 32% (%dT/C = -32) 및 52% (%dT/C = -52) 종양 퇴행을 발생시켰고, 둘 다 비히클 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하였다 (p <0.001). 실시예 1B와 아베마시클립의 조합 효능은 "상가성 미만"이었으나, 실시예 1B에 더하여 아베마시클립의 조합 효능은 실시예 1B 단독보다 유의하게 더 양호하였다 (p <0.001). 그러나, 단일 작용제 아베마시클립 효능은 조합으로부터 통계적으로 유의하지 않았다 (P=0.055). 상기 조합은 유의한 체중 감소 없이 동물에서 허용되었다.
<표 15>
MCF7 ER-양성 유방암 모델에서의 실시예 1B와 아베마시클립의 조합 효능
Figure pat00054
b 차이=처리 1 - 처리 2; *p-값: 유의하다 (p < 0.05)
SE - 표준 오차
<표 16>
MCF7 ER-양성 유방암 모델에서의 실시예 1B와 아베마시클립의 조합 효능
Figure pat00055
종양 부피 분석은 Log10 및 공간적 파워 공분산 구조를 기반으로 하였다.
*p-값: 유의하다 (p < 0.05); NA: 적용가능하지 않음
델타 T/C%는 처리군에서의 종점 종양 부피가 기준선 종양 부피 이상일 때 계산되며; 퇴행 %는 기준선 미만의 종양 부피에 대해 계산되었다. 식은 100*(T-T0)/(C-C0)이며, 여기서 T 및 C는 각각 처리군 또는 대조군에서의 평균 종점 종양 부피이다. T0 및 C0은 그러한 군에서의 평균 기준선 종양 부피이다.
표 17 및 표 18에 나타낸 바와 같이, 단일 작용제로서 실시예 1B 또는 화합물 A 단독 처리는 각각 32% (%dT/C = -32) 및 36% (%dT/C = -36) 종양 퇴행을 발생시켰고, 둘 다 비히클 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하였다 (p <0.001). 실시예 1B와 화합물 A의 조합 효능은 "상가성 미만"이었으나, 실시예 1B에 더하여 화합물 A의 조합 효능은 실시예 1B 단독 (p <0.001) 또는 화합물 A 단독 (p=0.002*)보다 유의하게 더 양호하였다. 상기 조합은 유의한 체중 감소 없이 동물에서 허용되었다.
<표 17>
MCF7 ER-양성 유방암 모델에서의 실시예 1B와 화합물 A의 조합 효능
Figure pat00056
b 차이=처리 1 - 처리 2; *p-값: 유의하다 (p < 0.05)
SE - 표준 오차
<표 18>
MCF7 ER-양성 유방암 모델에서의 실시예 1B와 아베마시클립의 조합 효능
Figure pat00057
종양 부피 분석은 Log10 및 공간적 파워 공분산 구조를 기반으로 하였다.
*p-값: 유의하다 (p < 0.05); NA: 적용가능하지 않음
델타 T/C%는 처리군에서의 종점 종양 부피가 기준선 종양 부피 이상일 때 계산되며; 퇴행 %는 기준선 미만의 종양 부피에 대해 계산되었다. 식은 100*(T-T0)/(C-C0)이며, 여기서 T 및 C는 각각 처리군 또는 대조군에서의 평균 종점 종양 부피이다. T0 및 C0은 그러한 군에서의 평균 기준선 종양 부피이다.
표 19 및 표 20에 나타낸 바와 같이, 단일 작용제로서 실시예 10 또는 아베마시클립 단독 처리는 각각 51% (%dT/C = -51) 및 70% (%dT/C = -70) 종양 퇴행을 발생시켰고, 둘 다 비히클 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하였다 (p <0.001). 실시예 10과 아베마시클립의 조합 효능은 "상가성 미만"이었으나, 실시예 10에 더하여 아베마시클립의 조합 효능은 실시예 10 단독 (p =0.039) 보다 유의하게 더 양호하였다. 그러나, 실시예 10에 더하여 아베마시클립의 조합 효능은 아베마시클립 단독과 유의하게 상이하지 않았다 (p=0.905). 상기 조합은 유의한 체중 감소 없이 동물에서 허용되었다.
<표 19>
MCF7 ER-양성 유방암 모델에서의 실시예 10과 아베마시클립의 조합 효능
Figure pat00058
b 차이=처리 1 - 처리 2; *p-값: 유의하다 (p < 0.05)
SE - 표준 오차
<표 20>
MCF7 ER-양성 유방암 모델에서의 실시예 10과 아베마시클립의 조합 효능
Figure pat00059
종양 부피 분석은 Log10 및 공간적 파워 공분산 구조를 기반으로 하였다.
*p-값: 유의하다 (p < 0.05); NA: 적용가능하지 않음
델타 T/C%는 처리군에서의 종점 종양 부피가 기준선 종양 부피 이상일 때 계산되며; 퇴행 %는 기준선 미만의 종양 부피에 대해 계산되었다. 식은 100*(T-T0)/(C-C0)이며, 여기서 T 및 C는 각각 처리군 또는 대조군에서의 평균 종점 종양 부피이다. T0 및 C0은 그러한 군에서의 평균 기준선 종양 부피이다.
표 21 및 표 22에 나타낸 바와 같이, 단일 작용제로서 실시예 10 또는 알펠리십 단독 처리는 각각 51% (%dT/C = -51) 및 21% (%dT/C = -21) 종양 퇴행을 발생시켰고, 둘 다 비히클 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하였다 (p <0.001 및 p = 0.013). 실시예 10과 알펠리십의 조합 효능은 "상가적"이었고 실시예 10에 더하여 알펠리십의 조합 효능은 실시예 10 단독보다 유의하게 더 양호하였다 (p = 0.009). 실시예 10에 더하여 알펠리십의 조합 효능은 또한 알펠리십 단독보다 유의하게 더 양호하였다 (p= <0.001). 상기 조합은 유의한 체중 감소 없이 동물에서 허용되었다.
<표 21>
MCF7 ER-양성 유방암 모델에서의 실시예 10과 알펠리십의 조합 효능
Figure pat00060
b 차이=처리 1 - 처리 2; *p-값: 유의하다 (p < 0.05)
SE - 표준 오차
<표 22>
MCF7 ER-양성 유방암 모델에서의 실시예 10과 알펠리십의 조합 효능
Figure pat00061
종양 부피 분석은 Log10 및 공간적 파워 공분산 구조를 기반으로 하였다.
*p-값: 유의하다 (p < 0.05); NA: 적용가능하지 않음
델타 T/C%는 처리군에서의 종점 종양 부피가 기준선 종양 부피 이상일 때 계산되며; 퇴행 %는 기준선 미만의 종양 부피에 대해 계산되었다. 식은 100*(T-T0)/(C-C0)이며, 여기서 T 및 C는 각각 처리군 또는 대조군에서의 평균 종점 종양 부피이다. T0 및 C0은 그러한 군에서의 평균 기준선 종양 부피이다.
표 23 및 표 24에 나타낸 바와 같이, 단일 작용제로서 실시예 10 또는 에버롤리무스 단독 처리는 각각 51% (%dT/C = -51) 및 50% (%dT/C = -50) 종양 퇴행을 발생시켰고, 둘 다 비히클 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하였다 (p <0.001 및 p<0.001). 실시예 10과 에버롤리무스의 조합 효능은 "상가적"이었고 실시예 10에 더하여 에버롤리무스의 조합 효능은 실시예 10 단독보다 유의하게 더 양호하였다 (p = 0.004). 실시예 10에 더하여 알펠리십의 조합 효능은 또한 에버롤리무스 단독보다 유의하게 더 양호하였다 (p=0.04). 상기 조합은 유의한 체중 감소 없이 동물에서 허용되었다.
<표 23>
MCF7 ER-양성 유방암 모델에서의 실시예 10과 에버롤리무스의 조합 효능
Figure pat00062
b 차이=처리 1 - 처리 2; *p-값: 유의하다 (p < 0.05)
SE - 표준 오차
<표 24>
MCF7 ER-양성 유방암 모델에서의 실시예 10과 에버롤리무스의 조합 효능
Figure pat00063
종양 부피 분석은 Log10 및 공간적 파워 공분산 구조를 기반으로 하였다.
*p-값: 유의하다 (p < 0.05); NA: 적용가능하지 않음
델타 T/C%는 처리군에서의 종점 종양 부피가 기준선 종양 부피 이상일 때 계산되며; 퇴행 %는 기준선 미만의 종양 부피에 대해 계산되었다. 식은 100*(T-T0)/(C-C0)이며, 여기서 T 및 C는 각각 처리군 또는 대조군에서의 평균 종점 종양 부피이다. T0 및 C0은 그러한 군에서의 평균 기준선 종양 부피이다.
래트 경구 생체이용률 검정
하기 검정의 목적은 시험 화합물이 경구로 생체이용가능한지 여부를 입증하는 것이다.
시험 화합물을 스프라그-다우리(Sprague-Dawley) 래트에 1 mg/kg으로 IV (25 mM 인산나트륨 완충제 중 20% 캡티솔(CAPTISOL)®, pH2 적당량; 또는 25% DMA, 15% EtOH, 10% 프로필렌 글리콜, 25% 2-피롤리돈, 및 25% 정제수의 비히클 사용) 그리고 10 mg/kg으로 PO (1% 히드록시에틸 셀룰로스, 0.25% 폴리소르베이트 80, 0.05% 소포제 1510-US, 및 정제수 적당량의 비히클 사용) 투여하였다. 연속 혈액 샘플을 IV 볼루스의 경우에는 투여 후 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 및 12시간에 및 경구 투여 후에는 투여 후 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 및 12시간에 수집하였다. EDTA 응고제로 처리한 후, 원심분리에 의해 혈장을 수득하고 LC-MS/MS에 의한 분석 때까지 -70℃에서 보관하였다. 혈장 중 시험 화합물 농도를 결정하고 IV 및 PO 아암 둘 다에 대한 곡선 아래 면적 (AUC)을 계산하는 데 비구획 분석이 사용되는 왓슨(Watson) LIMS™ 시스템에 업로드하였다. 하기 식을 통해 경구 생체이용률 (%F)을 계산하였다,
%F = (AUC PO X 용량IV)/(AUC IV X 용량PO) X 100.
실시예 1B의 화합물은 상기-언급된 검정에서 ~50%의 %F 값을 나타냈다. 이 검정은 실시예 1B가 양호한 경구 생체이용률을 가짐을 입증한다.

Claims (20)

  1. 화학식 I, 또는 화학식 II, 또는 화학식 III의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 암을 치료하기 위한 제약 조성물이며, 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM), 아로마타제 억제제, CDK4 억제제, CDK6 억제제, PI3K 억제제, mTOR 억제제 및 PI3K/mTOR 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 치료제와 조합으로 사용되는 제약 조성물:
    Figure pat00064

    여기서 R1 또는 R2 중 어느 하나는 Cl, F, -CF3, 또는 -CH3으로부터 독립적으로 선택되고, 다른 하나는 수소이다.
  2. 제1항에 있어서, 제2 치료제는 SERM인 제약 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 제2 치료제는 아로마타제 억제제인 제약 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 제2 치료제는 CDK4 억제제인 제약 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 제2 치료제는 CDK6 억제제인 제약 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 제2 치료제는 아베마시클립인 제약 조성물.
  7. 제1항에 있어서, mTOR 억제제는 에버롤리무스인 제약 조성물.
  8. 제1항에 있어서, PI3K 억제제는 PIK3CA 억제제 알펠리십인 제약 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 제약상 허용되는 염이 벤젠술폰산 염 또는 4-메틸벤젠술폰산 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 화학식 I의 화합물 또는 제약상 허용되는 염이
    Figure pat00065

    또는 그의 제약상 허용되는 염이거나; 또는
    화학식 II의 화합물 또는 제약상 허용되는 염이
    Figure pat00066

    또는 그의 제약상 허용되는 염이거나; 또는
    화학식 III의 화합물 또는 제약상 허용되는 염이
    Figure pat00067

    또는 그의 제약상 허용되는 염인 제약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 제약상 허용되는 염이 벤젠술폰산 염이거나; 또는 제약상 허용되는 염이 4-메틸벤젠술폰산 염인 제약 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 투여되며, 여기서 상기 환자는 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 또는 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 갖는 것으로 확인되거나 진단된 것인 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 유방암이 ER-양성 유방암인 제약 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 위암이 ER-양성 위암인 제약 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 폐암이 ER-양성 폐암인 제약 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 제2 치료제가 아베마시클립, 에버롤리무스, 또는 알펠리십을 포함하는 것인 제약 조성물.
  17. Figure pat00068

    로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 암을 치료하기 위한 제약 조성물이며, SERM, 아로마타제 억제제, CDK4 억제제, CDK6 억제제, PI3K 억제제, mTOR 억제제 및 PI3K/mTOR 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 치료제와 조합으로 사용되는 제약 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 제2 치료제가 아베마시클립, 에버롤리무스, 또는 알펠리십을 포함하고; 제약상 허용되는 염이 벤젠술폰산 염 또는 4-메틸벤젠술폰산 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 암이 유방암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 자궁암, 위암, 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 유방암이 ER-양성 유방암이거나, 또는 위암이 ER-양성 위암이거나, 또는 폐암이 ER-양성 폐암인 제약 조성물.
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