JP2021530484A - 選択的エストロゲン受容体分解剤 - Google Patents

Abstract

式（式中、Ｒ１またはＲ２のいずれかは、独立して、Ｃｌ、Ｆ、−ＣＦ３、または−ＣＨ３から選択され、他方は、水素である）による新規の選択的エストロゲン受容体分解物（ＳＥＲＤ）、その薬学的に許容される塩、およびその薬学的組成物、ならびにそれらの使用方法が提供される。【化１】

Description

選択的エストロゲン受容体分解剤（ＳＥＲＤ）は、エストロゲン受容体（ＥＲ）に結合し、ＥＲ媒介転写活性を下方制御する。ＳＥＲＤによって引き起こされるこの分解と下方制御は、がんなどの細胞増殖障害の治療に役立つ可能性がある。ＳＥＲＤのいくつかの小分子の例が文献に開示されている（例えば、ＷＯ２００５０７３２０４、ＷＯ２０１４２０５１３６、およびＷＯ２０１６０９７０７１を参照されたい）。しかしながら、既知のＳＥＲＤは、がんを効果的に治療するために必要なほど有用ではない。例えば、薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）の特性が高く、診療所での効率が高く、経口バイオアベイラビリティが良好なＳＥＲＤを見つけることは、がんの治療に非常に役立つ。ＥＲ媒介転写を強力に阻害する純粋なアンタゴニストＳＥＲＤは、がんの治療に明らかに有益である。乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、および肺癌などのがん、ならびに、新たな耐性による変異を治療するための新しいＳＥＲＤが必要である。特に、ＥＲ陽性乳癌、胃癌、および／または肺癌を治療するための新しいＳＥＲＤが必要である。

式：

の化合物、およびその薬学的に許容される塩、ならびにその薬学的組成物が本明細書に提供される。この式のＲ^１またはＲ^２のいずれかは独立して、Ｃｌ、Ｆ、−ＣＦ_３、または−ＣＨ_３から選択され、他方は水素である。

乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌を治療するために、本明細書に記載の化合物、その薬学的に許容される塩、およびその薬学的組成物を使用する方法も提供される。この方法は、治療有効量の本明細書に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、必要とする患者に投与することを含む。

治療に使用するための、本明細書に記載の化合物、およびその薬学的に許容される塩がさらに提供される。本明細書に記載の化合物、およびその薬学的に許容される塩は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌の治療に使用することができる。

乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌を治療するための医薬の製造のための、本明細書に記載の化合物およびその薬学的に許容される塩の使用がさらに提供される。

ＳＥＲＤとして作用する新規な四環式化合物およびその医薬塩が本明細書に開示されている。本明細書に記載の新たに発明されたＳＥＲＤはＥＲ媒介転写の阻害を提供し、これは、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、および肺癌などのがん、ならびに新たな耐性による変異の治療に有用である。これらのＳＥＲＤは、乳癌、胃癌、および／または肺癌などのホルモン受容体陽性がんを治療するために、単剤として、または選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、アロマターゼ阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、およびｍＴＯＲ阻害剤などの他のクラスの薬剤と組み合わせて使用できる。

本明細書に記載の新規化合物は、式Ｉ：

によって表されるか、またはその薬学的に許容される塩であり、式中、Ｒ^１またはＲ^２のいずれかは独立してＣｌ、Ｆ、−ＣＦ_３、または−ＣＨ_３から選択され、他方が水素である。当業者は、式Ｉによって記載されるような化合物、またはその薬学的に許容される塩がキラル中心を含み、その位置が上述の＊で示されることを理解するであろう。当業者はまた、キラル中心のカーン・インゴルド・プレローグ順位則（Ｒ）または（Ｓ）指定が、キラル中心の周りの置換パターンに応じて変化することを理解するであろう。式Ｉの化合物のキラル中心は、式ＩＩによって示されるＲ−エナンチオマー形態：

、および式ＩＩＩによって示されるＳ−エナンチオマー形態：

を提供する。ラセミ体を含む式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩによる化合物の、全ての個々の立体異性体、エナンチオマー、およびジアステレオマー、ならびにそのエナンチオマーおよびジアステレオマーの混合物は、本明細書に記載の化合物の範囲内に含まれる。キラル中心を含む医薬用途の化合物は、しばしば単一のエナンチオマーまたはジアステレオマーとして単離され、式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩのそのような単離された化合物は、本明細書に開示される化合物の範囲内に含まれる。当業者はまた、本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、およびそれらの薬学的に許容される塩を重水素化することができ（水素を重水素で置き換えることができる）、そのような分子が本明細書に開示される化合物の範囲内に含まれると考えられることを理解するであろう。

式Ｉの化合物の具体例（ＩＵＰＡＣ命名法名を含む）を以下に示す。

５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール；

５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−７−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール；

８−クロロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール；

７−クロロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール；

８−フルオロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール；

７−フルオロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール；

５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−メチル−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール；

５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−７−メチル−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール。

上述のキラル中心のために、上述の式Ｉの化合物のこれらの具体例のそれぞれは、表１に示すように、Ｒ−およびＳ−エナンチオマー形態（すなわち、式ＩＩのＲ−エナンチオマー化合物および式ＩＩＩのＳ−エナンチオマー化合物）を有する。

また、本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と組み合わせて含む薬学的組成物も本明細書に記載される。本明細書に記載の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加剤を使用して調製することができる。本明細書において使用されるとき、「薬学的に許容される添加剤」という用語は、組成物または製剤の他の成分と互換性があり、患者に有害でない１つ以上の担体、希釈剤、および賦形剤を指す。本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩は、経口またはＩＶなどの様々な経路によって投与される薬学的組成物として製剤化することができる。バイオアベイラビリティはしばしばがん治療における因子であり、有効成分のバイオアベイラビリティを制御または最適化するための投与方法および薬学的組成物を選択する能力は有用である。例えば、経口で生物学的に利用可能なＳＥＲＤ組成物は特に有用であろう。本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩は、経口バイオアベイラビリティを有すると考えられている。薬学的組成物およびそれらの調製のためのプロセスの例は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，Ｌ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ Ｊｒ，Ｅｄｉｔｏｒ，２２ｎｄ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，２０１２に見出され得る。薬学的に許容される担体、希釈剤、および賦形剤の非限定的な例には、以下のものが挙げられる：生理的食塩水、水、デンプン、糖、マンニトール、およびシリカ誘導体、カルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、ならびにポリビニルピロリドンなどの結合剤、カオリンおよびベントナイト、ならびにポリエチルグリコール。

本明細書でさらに説明されるのは、がんを治療する方法である。本明細書に記載の方法は、そのような治療を必要とする患者に、有効量の本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。例えば、有効量の本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を投与する方法は、経口投与であり得る。がんは、エストロゲン応答性のがんであり得る。さらに、がんは、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌であり得る。例えば、がんは、ＥＲ陽性乳癌、ＥＲ陽性胃癌、またはＥＲ陽性肺癌であり得る。

また、治療に使用するための本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩も記載されている。乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌または肺癌の治療に使用するための、本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩も本明細書で提供される。特に、乳癌は、ＥＲ陽性乳癌、ＥＲ陽性胃癌、またはＥＲ陽性肺癌であり得る。例えば、式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩は、経口投与することができる。

さらに、本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩は、がんの治療のための医薬の製造に使用することができる。例えば、医薬は経口投与することができる。本明細書に記載の医薬を治療に使用できる癌のタイプには、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌が含まれる。特に、がんは、ＥＲ陽性乳癌、ＥＲ陽性胃癌、またはＥＲ陽性肺癌であり得る。

本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、ならびにそれらの薬学的に許容される塩は、単剤として、または乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、肺癌などのがんの治療のための１つ以上の他の治療薬剤（例えば、抗がん剤）と組み合わせて、臨床的有用性を有し得る。他の治療薬剤（抗がん剤など）と組み合わせて使用する場合、本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩は、他の治療薬剤と同時に、逐次的に、または別々に使用することができる。本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩と組み合わせることができる薬物のクラスの例には、ＳＥＲＭ、アロマターゼ阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、およびホルモン受容体陽性乳がんの治療のためのｍＴＯＲ阻害剤が含まれる。本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を組み合わせることができる薬物のより具体的な例には、アベマシクリブ（ＣＤＫ４／６阻害剤）、エベロリムス（ｍＴＯＲ阻害剤）、アルペリシブ（ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤）、および８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン（ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤）が含まれる。

本明細書で使用されるとき、「有効量」という用語は、単回または複数回用量の患者への投与の際に、診断または治療下にある患者に所望の効果を提供する、本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容可能な塩の量または用量を指す。好ましくは、所望の効果は、腫瘍細胞増殖の阻害、腫瘍細胞死、またはその両方である。本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩は、一般に、広い投与量範囲にわたって有効である。例えば、１日あたりの投与量は、通常、約１００ｍｇから約２０００ｍｇの１日の範囲内にある。

本明細書中で使用する場合、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、存在する症状または障害の進行または重症度を抑制、減速、停止、または反転させることを指す。

本明細書で使用されるとき、「患者」という用語は、特定の疾患、障害、または状態に苦しんでいるヒトを指す。

本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩は、当該技術分野において既知の様々な手順によって調製することができ、それらのうちのいくつかを、以下の調製物および実施例において示す。記載される各経路の具体的な合成ステップは、本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩を調製するために、様々な方法と、または異なる手順からのステップと共に組み合わされてもよい。生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、磨砕、および結晶化を含む、当該技術分野で周知の従来の方法によって回収することできる。試薬および出発材料は、当業者にとって容易に入手可能である。

本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物の合成に有用な中間体およびプロセスは、この説明に含まれることが意図されている。さらに、本明細書に記載の特定の中間体は、１つ以上の保護基を含み得る。可変保護基は、実施される特定の反応条件および特定の変換に応じて、出現ごとに同じでも異なっていてもよい。保護および脱保護条件は、当業者に周知であり、文献（例えば、”Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００７を参照のこと）に記載されている。

個々の異性体、エナンチオマー、およびジアステレオマーは、本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物の合成における任意の都合のよい時点において、選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィー等の方法を用いて当業者によって分離または分解され得る（例えば、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８１，ａｎｄ Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ ａｎｄ Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，“Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４を参照されたい）。個々の異性体、エナンチオマー、およびジアステレオマーは、前述のように分離または分離できるが、キラル中心のカーン・インゴルド・プレローグ順位則（Ｒ）または（Ｓ）の指定はまだ決定されていない可能性がある。カーン・インゴルド・プレローグ順位則（Ｒ）または（Ｓ）の指定が利用できない場合、識別子「異性体１」および「異性体２」が使用され、カーン・インゴルド・プレローグ順位則立体化学指定を伴わずにＩＵＰＡＣ名と組み合わされる。本明細書で「異性体１」または「異性体２」として識別される式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物は、以下の特定の実験の説明で定義されるように単離される。異性体が「１」であるか「２」であるかは、記載された条件下で、式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物がキラルクロマトグラフィーカラムから溶出する順序、すなわち「異性体１」が上記の条件下でカラムから溶出される最初のものである。キラルクロマトグラフィーが合成の初期に開始される場合、同じ指定が、式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの後続の中間体および化合物に適用される。

本明細書で使用される略語は、Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．１，１９８４に従って定義される。その他の略語は次のように定義される。「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指す。「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを指す。「ｃａｔａＣＸｉｕｍ（登録商標）Ａ Ｐｄ Ｇ３」は、［（ジ（１−アダマンチル）−ブチルホスフィン）−２−（２’−アミノ−１，１’−ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）メタンスルホン酸を指す。「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンまたは塩化メチレンを指す。「ＤＭＡ」はジメチルアセトアミドを指す。「ＤＭＥＡ」はジメチルエチルアミンを指す。「ＤＭＥＭ」とは、ダルベッコ改変イーグル培地を指す。「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを指す。「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指す。「ＤＮＡ」はデオキシリボ核酸を指す。「ｃＤＮＡ」は相補的ＤＮＡを指す。「ＤＮａｓｅ」はデオキシリボヌクレアーゼを指す。「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを指す。「ＥＣ_５０」は、事前定義された陽性対照化合物（絶対ＥＣ_５０）と比較して、標的活性の５０％の応答を生じる薬剤の濃度を指す。「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸を指す。「ｅｅ」は鏡像体過剰率を指す。「ＥＲα」はエストロゲン受容体アルファを指す。「ＥＲβ」はエストロゲン受容体ベータを指す。「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指す。「ＥｔＯＨ」はエタノールまたはエチルアルコールを指す。「ＦＢＳ」はウシ胎児血清を指す。「ＨＢＳＳ」はハンクス平衡塩類溶液を指す。「ＨＥＣ」はヒドロキシエチルセルロースを指す。「ＨＥＰＥＳ」は、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸を指す。「ＨＰＬＣ」とは、高速液体クロマトグラフィーを指す。「ＩＣ_５０」は、その薬剤で可能な最大阻害応答の５０％を生成する薬剤の濃度（相対ＩＣ_５０）、またはプラセボ対照と比較して標的酵素活性の５０％阻害を生成する薬剤の濃度（絶対ＩＣ_５０）を指す。「ＩＰＡ」はイソプロピルアミンを指す。「ｉＰｒＯＨ」は、イソプロパノールまたはイソプロピルアルコールを指す。「ＩＶ」は静脈内投与を指す。「ｋ_ｉ」は阻害定数を指す。「ＭＥＫ」はメチルエチルケトンを指す。「ＭｅＯＨ」は、メチルアルコールまたはメタノールを指す。「ＭＴＢＥ」はメチルｔ−ブチルエーテルを指す。「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を指す。「ＰＯ」は経口投与を指す。「ＰＲα」はプロゲステロン受容体アルファを指す。「ＱＤ」とは、１日１回の投与を指す。「ＲＮＡ」はリボ核酸を指す。「ＲＮａｓｅ」はリボヌクレアーゼを指す。「ＲＴ−ＰＣＲ」は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を指す。「ＲＴ−ｑＰＣＲ」は、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指す。「ＳＦＣ」は超臨界流体クロマトグラフィーを指す。「ＴＥＤ_５０」は、腫瘍中の標的の５０％阻害を達成するのに有効な用量を指す。「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指す。「ｔ_（Ｒ）」は保持時間を指す。「ＸａｎｔＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２」は、クロロ［（４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテン）−２−（２’−アミノ−１，１’−ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）を指す。「ＸＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２」は、クロロ（２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピル−１，１’−ビフェニル）［２−（２’−アミノ−１，１’−ビフェニル）］パラジウム（ＩＩ）を指す。

以下の調製物および実施例は、本発明をさらに例示する。

調製物および実施例

ステップＡでは、グリニャール反応が達成される。グリニャール反応は、炭素−炭素結合の形成のための反応として当該技術分野で周知である。この反応は、グリニャール試薬であるアリールマグネシウムハライドが化合物２の酸塩化物などのカルボニル基に付加して、工程Ａの化合物をもたらす有機金属反応を伴う。例えば、４−クロロ置換キノロン、化合物１は、イソプロピルマグネシウムクロリドなどのグリニャール試薬で処理してグリニャール中間体を形成し、続いて、ＴＨＦなどの溶媒中で酸塩化物、４−フルオロベンゾイルクロリド、化合物２を添加する。完了したら、反応を水でクエンチして化合物３を得ることができる。

ステップＢにおいて、化合物３のアリールメチルエーテルは、三臭化ホウ素での処理など、当業者が認識できる様々な条件下で脱メチル化することができる。例えば、化合物３は、ＤＣＭなどの溶媒中で約０℃の温度で三臭化ホウ素でゆっくりと処理される。混合物を室温で撹拌し、二塩基性リン酸カリウムでクエンチして、化合物４を得る。

ステップＣにおいて、アゼチジンエーテル６は、ＤＭＦまたはＴＨＦなどの適切な極性非プロトン性溶媒中で、対応するｐ−フルオロフェニルケトン４およびアゼチジンアルコール塩５、または対応する遊離塩基を適切な塩基、例えば水素化ナトリウム、ｔ−ブトキシドナトリウムまたはカリウムｔ−ブトキシドで処理してエーテル化合物６を生成することによって形成され得る。

次いで、化合物６を、鈴木クロスカップリング反応において適切な置換アリールボロン酸、化合物７でアルキル化して、ステップＤで化合物８を得る。当業者は、そのようなクロス−カップリング反応を促進するのに有用であり得る様々な条件があることを認識するであろう。適切なパラジウム試薬には、ＸａｎｔＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２、ｃａｔａＣＸｉｕｍ（登録商標）ＡＰｄ Ｇ３、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド、トリシクロヘキシルホスフィンを含むトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）、（１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）塩化物、パラジウムテトラキストリフェニルホスフィン、またはパラジウム（ＩＩ）アセテートが含まれ得る。適切な塩基には、フッ化カリウム、炭酸セシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リチウムｔ−ブトキシド、またはリン酸カリウム三塩基性一水和物が含まれ得る。例えば、化合物６は、炭酸カリウムなどの塩基およびＸＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２などの触媒を含む２−メチル−２−ブタノールなどの溶媒中で、適切なボロン酸、化合物７、例えば、２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸と反応させ、マイクロ波条件下で約８０℃に加熱して、化合物８を得ることができる。

当業者は、ステップＣのアゼチジンエーテル形成の前に、ステップＤ、スズキクロスカップリング反応が完了し得ることを認識するであろう。

ステップＥにおいて、当業者は、化合物８がケトンの最初の還元によって環化され得ることを認識するであろう。これは、１，４−ジオキサンおよびＴＨＦなどの溶媒中の水素化トリエチルホウ素リチウムなどの還元剤を使用して、約０℃から室温の温度で達成して、対応する第二級アルコールを得ることができる。この中間アルコールは、粗製で進められ、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ、またはＤＭＦなどの溶媒中で炭酸セシウム、水素化ナトリウム、ナトリウムｔ−ブトキシドまたはカリウムｔ−ブトキシドなどの適切な塩基で脱プロトン化することができる。得られたアルコキシドは、室温で、加熱して還流するか、または約６０℃の温度で、フッ化アリールに環化することができる。次に、フッ化物の置換時に形成される置換環状エーテルを得て、式Ｉの化合物を得ることができる。

あるいは、ケトン８をアルコールに還元し、ステップＦでキラル精製してキラルアルコール９を得、次いで、ステップＥについて上述したようにステップＧで環化して、式Ｉの化合物を得ることができる。

別の代替反応では、（Ｒ）−（＋）−α．α−ジフェニル−２−ピロリジンメタノールなどのキラル試薬をホウ酸トリメチルおよびボラン−ジメチルスルフィドとともに使用してケトンを還元し、目的のキラルアルコール、化合物９を直接得ることができる。次いで、これをステップＥについて上述したようにステップＧで環化して、式Ｉの化合物を得ることができる。

任意のステップにおいて、本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物の化合物の薬学的に許容される塩は、標準条件下で、適切な溶媒中で、本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物の適切な遊離塩基との適切な薬学的に許容される酸との反応によって形成され得る。さらに、そのような塩の形成は、窒素保護基の脱保護時に同時に起こり得る。薬学的に許容される塩の形成の可能性は周知である。例えば、Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．，“Ｓａｌｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｂａｓｉｃ ｄｒｕｇｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１−２１７（１９８６）、Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓａｌｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎｅｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｔｉｔｉｅｓ，”Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７−４３５（２０００）、およびＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１−１９，（１９７７）を参照されたい。本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物は、薬学的に許容される塩に容易に変換され、薬学的に許容される塩として分離され得ることを当業者は理解するであろう。有用な塩の例には、ベンゼンスルホン酸塩および４−メチルベンゼンスルホン酸塩が含まれるが、これらに限定されない。４−メチルベンゼンスルホン酸塩はトシレート塩としても知られる。

調製物１
２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エタン−１−オール

トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（４０５ｇ、１．９１ｍｏｌ）を、Ｎ_２下で１５分間かけて少しずつ、ＤＣＭ（２．４Ｌ）中の３−（フルオロメチル）アゼチジン塩酸塩（１６０ｇ、１．２８ｍｏｌ）の撹拌０℃溶液に加え、０℃で１０分間攪拌する。１，４−ジオキサン−２，５−ジオール（９９ｇ、０．８３ｍｏｌ）を０℃で１時間かけて６回に分けて加え、０〜５℃で１５分間撹拌する。反応物を室温に温め、Ｎ_２下で２時間撹拌する。反応物を２０分間かけて１０〜１５℃に冷却し、次いで２５〜３０℃に温め、この温度で２時間維持する。１０〜１５℃で２５〜３０分間かけて水（８００ｍＬ）を加え、５〜１０分間室温まで温めてから、層を分離する。水層をＤＣＭ（８００ｍＬ）で洗浄し、層を分離してから、合わせた水層を１０〜１５℃に冷却し、５０％水酸化ナトリウム溶液（約５４０ｍＬ）を使用してｐＨを１３〜１４に調整する。水層を室温まで温め、ＤＣＭ（４×８００ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウム（８０ｇ）で乾燥し、濾過し、濃縮乾固して、表題化合物（１３９ｇ、８２％）を濃い黄色の油状物として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１３４．１（Ｍ＋Ｈ）。

調製物２
２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エタン−１−オール塩酸塩

２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エタン−１−オール（５２９ｇ、４ｍｏｌ）をＭＴＢＥ（２．６Ｌ）に溶解し、０℃に冷却する。ＨＣｌ／ＥｔＯＨ溶液（４９２ｍＬ、３０ｗｔ％）を３０分かけて滴下し、０℃で３０分間撹拌する。固体を濾過し、濾過ケークをＭＴＢＥ（２×２００ｍＬ）で洗浄する。Ｎ_２下で８時間乾燥して、表題化合物（５８０ｇ、８６％）を白色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１３４．０（Ｍ＋Ｈ）。

調製物３
（３−クロロ−７−メトキシキノリン−４−イル）−（４−フルオロフェニル）メタノン

４−ブロモ−３−クロロ−７−メトキシキノリン（７０ｇ、２５４ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（１Ｌ）の混合物をＮ_２下で−４０℃に冷却し、材料を沈殿させる。イソプロピルマグネシウムクロリド（ＴＨＦ中２Ｍ、２５４ｍＬ、５０９ｍｍｏｌ）を２０分かけて加え、混合物を１時間撹拌する。ＴＨＦ（１４０ｍＬ）中の４−フルオロベンゾイルクロリド（６６ｍＬ、５５９ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加え、次いで室温まで温める。飽和ＮＨ_４Ｃｌ溶液（３００ｍＬ）および水（２００ｍＬ）で反応をクエンチし、層を分離する。飽和ＮＨ_４Ｃｌ溶液（３００ｍＬ）で有機層を洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮して油状残渣をもたらす。ＭＴＢＥ／ヘキサン（１：１）の混合物で溶出するシリカゲルで粗褐色油を濾過して、粗生成物を黄色の固体（８４ｇ）として得る。固体を１０％酢酸メチル／ヘプタン（８００ｍＬ）で処理し、室温で一晩撹拌する。固体を集めるために濾過し、保存する。濾液を濃縮し、１０〜４０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルで精製し、次いで生成物を１０％の酢酸メチル／ヘプタン（２００ｍＬ）で処理し、室温で３時間撹拌する。得られた固体を濾過し、前の濾過からの固体と合わせ、真空下で一晩乾燥させて、表題化合物（３１ｇ、３８％）を黄色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３１６．０（Ｍ＋Ｈ）。

調製物４
（３−クロロ−７−ヒドロキシキノリン−４−イル）−（４−フルオロフェニル）メタノン

三臭化ホウ素（ＤＣＭ中１Ｍ、２９５ｍＬ、２９５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２１７ｍｌ）中の（３−クロロ−７−メトキシキノリン−４−イル）−（４−フルオロフェニル）メタノン（３１ｇ、９８ｍｍｏｌ）の混合物に加え、混合物を室温で３日間撹拌する。混合物を二塩基性リン酸カリウム（水中２Ｍ、７００ｍＬ）と水（２００ｍＬ）の０℃溶液にゆっくりと注ぐ。混合物を室温に温め、１時間撹拌する。溶液を真空で濃縮して有機溶媒を除去し、濾過し、濾液を収集し、４５℃で一晩真空下で濾液を乾燥させる。固体をＤＣＭ／ヘプタン（１：１、４５０ｍＬ）で処理し、一晩撹拌する。固体を収集し、真空下で一晩乾燥させて、表題化合物（３２ｇ、定量的収率）を薄茶色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０２．０（Ｍ＋Ｈ）。

調製物５
（３−クロロ−７−ヒドロキシキノリン−４−イル）−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）メタノン

ＤＭＦ（７５ｍｌ）中の（３−クロロ−７−ヒドロキシキノリン−４−イル）−（４−フルオロフェニル）メタノン（５．００ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エタン−１−オール塩酸塩（３．９０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を加え、続いて水素化ナトリウム（鉱油中６０％、３．０２ｇ、７６．８ｍｍｏｌ）を加える。Ｎ_２下で攪拌し、４０℃で４５分間温める。水で溶液をクエンチし、濃縮する。残渣を２０％ｉＰｒＯＨ／ＣＨＣｌ_３と飽和重炭酸ナトリウム水溶液に分配し、分離し、２×２０％ｉＰｒＯＨ／ＣＨＣｌ_３で水層を抽出し、有機抽出物を合わせ、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮して、粗生成物を暗赤色の油状物として得る。ＭｅＯＨ／ＤＣＭ中の５〜１０％の７ＮのＮＨ_３の勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって粗物質を精製して、表題化合物（５．３１ｇ、８４％）を黄色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１５．０（Ｍ＋Ｈ）。

調製物６
（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）｛３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−ヒドロキシキノリン−４−イル｝メタノン

マイクロ波バイアル中の混合物（３−クロロ−７−ヒドロキシキノリン−４−イル）−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）メタノン（２００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸（１５８ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２０２ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）、２−メチル−２−ブタノール（３ｍｌ）、および水（１ｍｌ）をＮ_２（５×）で脱気する。ＸＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ２（１２ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を加え、密封し、８０℃で２時間マイクロ波をかける。ＭＴＢＥと飽和ＮＨ_４Ｃｌ溶液の間で残渣を分配する。層を分離し、水層をＭＴＢＥ抽出する。有機抽出物を合わせ、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮してオレンジ色の残渣を得る。５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより粗物質を精製して、表題化合物（２０５ｍｇ、７８％）を黄色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５４３．２（Ｍ＋Ｈ）。

以下の化合物を、１〜２時間の加熱時間、ＭＴＢＥまたはＥｔＯＡｃでの抽出、および硫酸マグネシウムまたは硫酸ナトリウム上での有機層の乾燥という手順のバリエーションを有するが、調製物６の方法と本質的に類似する方法で調製する。ＤＣＭ中の最大１０％の（ＭｅＯＨまたは７Ｍアンモニア化ＭｅＯＨ）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィー（調製１０：ＤＣＭ中の勾配３〜８％７Ｍアンモニア化ＭｅＯＨ；調製９および１１：ＤＣＭ中の勾配４〜１０％７Ｍアンモニア化ＭｅＯＨ）によって、および／または上記の高ｐＨ逆相クロマトグラフィーによって精製する。

調製物１４
ラセミ体４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）（ヒドロキシ）メチル］−３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］キノリン−７−オール

Ｎ_２下で（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）｛３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−ヒドロキシキノリン−４−イル｝メタノン（３０５ｇ、５６２．２ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（１．５Ｌ）を一緒に加え、溶液を０〜５℃に冷却する。水素化トリエチルホウ素リチウム（ＴＨＦ中１Ｍ、１．５Ｌ、１．５ｍｏｌ）を滴下する。混合物を０〜５℃で１時間撹拌する。水（３００ｍＬ）を滴下し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ（１Ｌ）を加える。混合物を室温に冷却する。ＥｔＯＡｃ（２Ｌ）を加え、有機層を集める。有機層をブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固する。残渣をＭｅＯＨ中のアセトンと２Ｍアンモニアの９５：５混合物に溶解し、シリカゲルで濾過して、表題化合物（２６４ｇ、８６．２％）をオレンジ色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５４５．２（Ｍ＋Ｈ）。

調製物１５
４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）（ヒドロキシ）メチル］−３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］キノリン−７−オール、異性体１

カラムＣｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈ、１５０×５０ｍｍ、流速３００ｇ／分、ＵＶ３５０ｎｍ、移動相０．５％ＤＭＥＡ／ＣＯ_２を含む３５％ｉＰｒＯＨ、カラム温度４０℃の条件下でキラルクロマトグラフィーを使用してラセミ体の４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）（ヒドロキシ）メチル］−３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］キノリン−７−オール（３５４ｇ、０．６２ｍｏｌ）を精製し、最初に溶出する異性体の表題化合物（１７１．４ｇ、４８％）を得る。ｔ_（Ｒ）＝０．７９分、カラム：４．６×１５０ｍｍ Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈ、ＣＯ_２中０．５％ＤＭＥＡを含む３５％ｉＰｒＯＨの移動相で溶出、０．６ｍＬ／分の流速、３５０ｎｍでのＵＶ検出でのキラル分析ＳＦＣによって９８％ｅｅを超える異性体１のエナンチオマー濃縮を確認する。

代替的な調製物１５
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の（Ｒ）−（＋）−α．α−ジフェニル−２−ピロリジンメタノール（１３２ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）の溶液にホウ酸トリメチル（６５ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を加える。Ｎ_２下で１時間、室温で混合物を撹拌した。ボラン−ジメチルスルフィド（ＴＨＦ中２．０Ｍ、２．６ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ）を加え、続いて（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）｛３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−ヒドロキシキノリン−４−イル｝メタノン（１．０ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を加える。反応物を４５℃で一晩加熱する。追加のボラン−ジメチルスルフィド（ＴＨＦ中２．０Ｍ、２．６ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で５時間撹拌する。ゆっくりと飽和ＮＨ_４Ｃｌ溶液（２５ｍＬ）を加え、有機相を単離する。２０％のｉＰｒＯＨ／ＣＨＣｌ_３で水性抽出物を再抽出する。有機抽出物を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、ボラン錯体中間体（１．２ｇ）を得る。ボラン錯体中間体（０．４ｇ、０．６ｍｍｏｌ）の３分の１を１，４−ジオキサン（４ｍＬ）とエタノールアミン（０．３ｍＬ、５ｍｍｏｌ）に溶解し、反応物を７０℃で３時間加熱する。飽和ＮＨ_４Ｃｌ溶液（２５ｍＬ）で反応をクエンチし、有機相を単離する。水性抽出物を２０％ｉＰｒＯＨ／ＣＨＣｌ_３（４×２５ｍＬ）で再抽出する。有機抽出物を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固して、表題化合物をオレンジ色の固体として得る（０．３３ｇ、０．５７ｍｍｏｌ、１００％収率）。ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］^＋ ５４５。ｔ_（Ｒ）＝０．７９分、カラム：４．６×１５０ｍｍ Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈ、ＣＯ_２中０．５％ＤＭＥＡを含む３５％ｉＰｒＯＨの移動相で溶出、０．６ｍＬ／分の流速、３５０ｎｍでのＵＶ検出でのキラル分析ＳＦＣによって９６％ｅｅの異性体１のエナンチオマー濃縮を確認する。

実施例１
ラセミ体の５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール

１，４−ジオキサン（１００ｍＬ）中の（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）｛３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−７−ヒドロキシキノリン−４−イル｝メタノン（５．２７ｇ、９．７１ｍｍｏｌ）の溶液を５℃まで冷却する。水素化トリエチルホウ素水素化リチウム（ＴＨＦ中１Ｍ、３０．０ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ）を加える。冷却浴を取り外し、室温で１．５時間撹拌する。混合物を水でクエンチする。飽和ＮＨ_４Ｃｌ溶液とＥｔＯＡｃを加える。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を合わせ、無水ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮する。粗残渣をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解する。水素化ナトリウム（鉱油中６０％溶液、１．９４ｇ、４８．５ｍｍｏｌ）を加える。溶液を１．５時間還流する。追加の水素化ナトリウム（鉱油中６０％、１．９４ｇ、４８．５ｍｍｏｌ）を加え、次いでさらに３０分間還流する。溶液を室温まで冷却し、水でクエンチする。ＥｔＯＡｃと飽和ＮＨ_４Ｃｌ溶液を加える。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を合わせ、無水ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮する。ＤＣＭ中の５〜７％ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製して、表題化合物（３．７０ｇ、７２％）を淡黄色の泡状物質として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５２５．２（Ｍ＋Ｈ）。

以下の手順のバリエーションを有するが、実施例１の方法に本質的に類似する方法で、以下の化合物を調製する。還元について、３〜５当量の水素化トリエチルホウ素リチウムを使用し、反応時間は３０分〜１時間で、有機層を硫酸マグネシウムまたは硫酸ナトリウム上で乾燥させる。粗残渣を直接使用するか、環化の前にＤＣＭ中の０−５−７．５−１０％ＭｅＯＨの勾配で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。ＴＨＦで最大１６時間、またはＤＭＦで、実施例２の場合の室温で２時間から実施例８の場合の８５℃で２時間まで還流することによって、環化を完了する。ＤＣＭまたはＥｔＯＡｃで抽出し、硫酸マグネシウムまたは硫酸ナトリウム上で有機層を乾燥させる。ＤＣＭ中の最大１０％の（ＭｅＯＨもしくは７Ｍアンモニア化ＭｅＯＨ）（実施例２：ＤＣＭ中の勾配０〜１０％ＭｅＯＨ；実施例５：ＤＣＭ中の勾配４〜１０％７Ｍアンモニア化ＭｅＯＨ；実施例８：ＤＣＭ中の勾配５〜７．５％７Ｍアンモニア化ＭｅＯＨ）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、または前記の高ｐＨ逆相ＨＰＬＣによって、静止する。

実施例１Ａ
５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体１
および
実施例１Ｂ
５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体２

５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールの２つのエナンチオマーを以下の条件でのキラルＳＦＣによって分離する：カラム：ＬＵＸ（登録商標）セルロース−１、５×２５ｃｍ；ＣＯ_２中の３０％ｉＰｒＯＨ（０．５％ＤＭＥＡを含む）の移動相で溶出する；カラム温度：４０℃；流速：３００ｇ／分；ＵＶ検出波長：２７０ｎｍ。最初の溶出エナンチオマー（異性体１）として実施例１Ａを得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５２５．２（Ｍ＋Ｈ）。ｔ_（Ｒ）＝１．３０分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３０％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９９％ｅｅを超える異性体１のエナンチオマー濃縮を確認する。実施例１Ｂの表題化合物を単離して、第２の溶出エナンチオマー（異性体２）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５２５．２（Ｍ＋Ｈ）。ｔ_（Ｒ）＝２．０３分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３０％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９８％ｅｅの異性体２のエナンチオマー濃縮を確認する。

代替的な調製物の実施例１Ｂ
結晶性の５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体２
水（２５０ｍＬ）中の、５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、４−メチルベンゼンスルホン酸、異性体２（２３．８ｇ、０．０３４ｍｏｌ）を１０００ｒｐｍで攪拌する。ＮａＯＨ（７６μＬ）を加え、溶液を２時間攪拌する。ＤＣＭ（６００ｍＬ）を加える。混合物を分離し、ＤＣＭ抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、シリンジフィルター（０．４５μｍ）で材料を濾過し、濃縮乾固する。材料を週末の間中、Ｎ_２気流下で静置する。１：１のＥｔＯＨ／水（８０ｍＬ）を加え、超音波処理しながら混合物を攪拌する。ナイロン膜で濾過することにより黄褐色の固体を収集し、表題化合物（１０．４７ｇ、０．０２ｍｏｌ、５９％）を得る。

Ｘ線粉末回折（ＸＲＤ）
結晶性固体のＸＲＰＤパターンは、ＣｕＫα源およびＶａｎｔｅｃ検出器を備えた、３５ｋＶおよび５０ｍＡで動作しているＢｒｕｋｅｒ Ｄ４ Ｅｎｄｅａｖｏｒ Ｘ線粉末回折計で得られる。試料は、０．００８ ２θ°のステップサイズおよび０．５秒／ステップの走査速度で、１．０ｍｍの発散スリット、６．６ｍｍの固定散乱防止スリット、および１１．３ｍｍ検出スリットを用いて、４〜４０ ２θ°で走査される。乾燥粉末を石英試料ホルダーに充填し、ガラススライドを使用して滑らかな表面を得る。結晶形態の回折パターンを周囲温度および相対湿度で収集する。８．８５３および２６．７７４ ２θ°でピークを有する内部ＮＩＳＴ６７５標準に基づいて、パターン全体をシフトした後、ＭＤＩ−Ｊａｄｅの結晶ピーク位置を決定する。結晶学の分野において、任意の所与の結晶形態に関して、結晶形態および晶癖などの要因から生じる好ましい配向に起因して、回折ピークの相対強度が変化し得ることが周知されている。好ましい配向の効果が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形体の特徴的なピーク位置は変化しない。例えば、Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ＃２３，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ＃１８，ｐａｇｅｓ １８４３−１８４４，１９９５を参照されたい。さらに、所与の任意の結晶形態について、角ピーク位置がわずかに変化し得ることも、結晶学の分野において周知である。例えば、ピーク位置は、試料が分析される温度の変動、試料の変位、または内部標準の有無に起因して変動し得る。本発明の場合、０．２ ２θ°のピーク位置の変動は、示された結晶形態の明確な同定を妨げることなくこれらの潜在的な変動を考慮すると推定される。結晶形態の確認は、顕著なピークの任意の固有の組み合わせに基づいて行うことができる。

調製された結晶性の５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体２の試料を、以下の表３に記載されるように、回折ピーク（２シータ値）、特に６．８、１６．０、および２２．１からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と組み合わせて１９．８でピークを有し、回折角の許容誤差が０．２度であるような、ＣｕＫａ方射線を使用したＸＲＤパターンによって特性評価する。

代替的な調製物の実施例１Ｂ
４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）（ヒドロキシ）メチル］−３−［２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］キノリン−７−オール、異性体１（６３．０５ｇ、１０４．７ｍｍｏｌ）を室温でＮ_２下で、ＤＭＳＯ（１．３Ｌ）中に溶解する。炭酸セシウム（１０８ｇ、３３１ｍｍｏｌ）を５分かけて少しずつ加える。混合物を６０℃に１５時間加熱する。混合物を室温まで冷却し、水（２．１Ｌ）およびＥｔＯＡｃ（１．３Ｌ）で希釈する。混合物を５分間攪拌し、分離する。水性材料をＥｔＯＡｃ（１．３Ｌ）で再抽出し、５分間撹拌する。分離して有機抽出物を合わせ、ブライン、水、およびＥｔＯＡｃで洗浄する。ＭｇＳＯ_４で有機抽出物を乾燥させ、濃縮し、室温で高真空下で一晩乾燥して表題化合物（５２．６９グラム、９５．９パーセント）を褐色の固体として得る。ｔ_（Ｒ）＝２．０３分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３０％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９８．１％ｅｅの実施例１Ｂのエナンチオマー濃縮を確認する。

実施例２Ａ
５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−７−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体１
および
実施例２Ｂ
５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−７−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体２

５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−７−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールの２つのエナンチオマーを以下の条件でのキラルＳＦＣによって分離する：カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＣ、２１×２５０ｃｍ；ＣＯ_２中の３０％ｉＰｒＯＨ（０．２％ＩＰＡを含む）の移動相で溶出する；カラム温度：４０℃；流速：７０ｇ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍ。最初の溶出エナンチオマー（異性体１）として実施例２Ａを得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５２５．１（Ｍ＋Ｈ）。ｔ_（Ｒ）＝１．５６分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＣ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３０％ｉＰｒＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９９％ｅｅを超える異性体１のエナンチオマー濃縮を確認する。実施例２Ｂの表題化合物を単離して、第２の溶出エナンチオマー（異性体２）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５２５．２（Ｍ＋Ｈ）。ｔ_（Ｒ）＝２．３３分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＩＣ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３０％ｉＰｒＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９８％ｅｅの異性体２のエナンチオマー濃縮を確認する。

実施例３Ａ
８−クロロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体１
および
実施例３Ｂ
８−クロロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体２

８−クロロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールの２つのエナンチオマーを以下の条件でのキラルＳＦＣによって分離する：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、２１×２５０ｃｍ；ＣＯ_２中の３５％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡを含む）の移動相で溶出する；カラム温度：４０℃；流速：８０ｇ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍ。最初の溶出エナンチオマー（異性体１）として実施例３Ａを得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４９１．０（Ｍ＋Ｈ）。ｔ_（Ｒ）＝１．５５分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３５％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９９％ｅｅを超える異性体１のエナンチオマー濃縮を確認する。実施例３Ｂの表題化合物を単離して、第２の溶出エナンチオマー（異性体２）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４９１．０（Ｍ＋Ｈ）。ｔ_（Ｒ）＝２．２６分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３５％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９９％ｅｅを超える異性体２のエナンチオマー濃縮を確認する。

実施例４Ａ
７−クロロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体１
および
実施例４Ｂ
７−クロロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体２

７−クロロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールの２つのエナンチオマーを以下の条件でのキラルＳＦＣによって分離する：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、２１×２５０ｃｍ；ＣＯ_２中の３５％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡを含む）の移動相で溶出する；カラム温度：４０℃；流速：８０ｇ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍ。最初の溶出エナンチオマー（異性体１）として実施例４Ａを得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４９１．０（Ｍ＋Ｈ）。ｔ_（Ｒ）＝１．７１分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３５％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９９％ｅｅを超える異性体１のエナンチオマー濃縮を確認する。実施例４Ｂの表題化合物を単離して、第２の溶出エナンチオマー（異性体２）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４９１．０（Ｍ＋Ｈ）。ｔ_（Ｒ）＝２．３８分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３５％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９９％ｅｅを超える異性体２のエナンチオマー濃縮を確認する。

実施例５Ａ
８−フルオロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体１
および
実施例５Ｂ
８−フルオロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体２

８−フルオロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールの２つのエナンチオマーを以下の条件でのキラルＳＦＣによって分離する：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、２１×２５０ｃｍ；ＣＯ_２中の３０％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡを含む）の移動相で溶出する；カラム温度：４０℃；流速：８０ｇ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍ。最初の溶出エナンチオマー（異性体１）として実施例５Ａを得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７５．０（Ｍ＋Ｈ）。ｔ_（Ｒ）＝１．５６分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３０％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９９％ｅｅを超える異性体１のエナンチオマー濃縮を確認する。実施例５Ｂの表題化合物を単離して、第２の溶出エナンチオマー（異性体２）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７５．０（Ｍ＋Ｈ）。ｔ_（Ｒ）＝２．２９分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３０％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９９％ｅｅを超える異性体２のエナンチオマー濃縮を確認する。

実施例６Ａ
７−フルオロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体１
および
実施例６Ｂ
７−フルオロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体２

７−フルオロ−５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールの２つのエナンチオマーを以下の条件でのキラルＳＦＣによって分離する：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、２１×２５０ｃｍ；ＣＯ_２中の３５％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡを含む）の移動相で溶出する；カラム温度：４０℃；流速：８０ｇ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍ。最初の溶出エナンチオマー（異性体１）として実施例６Ａを得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７５．０（Ｍ＋Ｈ）。ｔ_（Ｒ）＝１．３２分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３５％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９９％ｅｅを超える異性体１のエナンチオマー濃縮を確認する。実施例６Ｂの表題化合物を単離して、第２の溶出エナンチオマー（異性体２）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７５．０（Ｍ＋Ｈ）。ｔ_（Ｒ）＝１．９５分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３５％ＭｅＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９９％ｅｅを超える異性体２のエナンチオマー濃縮を確認する。

実施例８Ａ
５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−７−メチル−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体１
および
実施例８Ｂ
５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−７−メチル−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体２

５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−７−メチル−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オールの２つのエナンチオマーを以下の条件でのキラルＳＦＣによって分離する：カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、２１×２５０ｃｍ；ＣＯ_２中の３０％ｉＰｒＯＨ（０．２％ＩＰＡを含む）の移動相で溶出する；カラム温度：４０℃；流速：８０ｇ／分；ＵＶ検出波長：２６５ｎｍ。最初の溶出エナンチオマー（異性体１）として実施例８Ａを得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７１．２（Ｍ＋Ｈ）。ｔ_（Ｒ）＝１．４７分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３０％ｉＰｒＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９９％ｅｅを超える異性体１のエナンチオマー濃縮を確認する。実施例８Ｂの表題化合物を単離して、第２の溶出エナンチオマー（異性体２）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７１．２（Ｍ＋Ｈ）。ｔ_（Ｒ）＝２．０５分、カラム：ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−Ｈ、４．６×１５０ｍｍ；ＣＯ_２中の３０％ｉＰｒＯＨ（０．２％ＩＰＡ）の移動相で溶出、カラム温度：４０℃；流速：５ｍＬ／分；ＵＶ検出波長：２２５ｎｍでのキラル分析ＳＦＣによって９９％ｅｅを超える異性体２のエナンチオマー濃縮を確認する。

実施例９
５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体２、ベンゼンスルホン酸

ＡＣＮ（３ｍＬ）中の５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体２（実施例１Ｂ）（１００ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）のスラリーを５０℃で加熱する。ＡＣＮ（１ｍＬ）中のベンゼンスルホン酸一水和物（４０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液を加える。透明な黄色の溶液を５０℃で１０分間加熱する。加熱を中止し、反応混合物を室温まで冷却し、混合物を一晩撹拌する。トルエン（２ｍＬ）を加え、反応混合物を２時間撹拌する。溶液を濾過し、得られた固体を収集し、固体をＡＣＮ（１ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下で乾燥させて、表題化合物を得る（７４ｍｇ、５５％）。

代替的な調製物の実施例９
ＭＥＫ（４ｍＬ）中の５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体２（実施例１Ｂ）（１２４．１ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）のスラリーを５０℃で加熱する。ＭＥＫ（１ｍＬ）中に溶解したベンゼンスルホン酸一水和物（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の溶液を加える。加熱を中止し、反応混合物を室温まで冷却し、混合物を週末の間中撹拌する。Ｎ_２気流下で濃縮する。ＭＥＫ（１ｍＬ）とスラリーを加えて、黄色の結晶性の固体を得る。固体を収集し、ＭＥＫで洗浄し、室温の真空下で乾燥させて、表題化合物（７８．８ｍｇ、４８％）を得る。

ＸＲＤ、実施例９
実施例１Ｂの説明に従ってＸＲＤを完成させる。調製された−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体２、ベンゼンスルホン酸の試料を、以下の表４に記載されるように、回折ピーク（２シータ値）、特に１２．３、２２．２、および２３．１からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と組み合わせて２０．５でピークを有し、回折角の許容誤差が０．２度であるような、ＣｕＫａ方射線を使用したＸＲＤパターンによって特性評価する。

実施例１０
結晶性の５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、４−メチルベンゼンスルホン酸、異性体２

５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、異性体２（実施例１Ｂ）（２０４．２ｇ、３８９ｍｍｏｌ）とＥｔＯＡｃ（５Ｌ）を一緒に加え、６０℃で撹拌した後、６０℃でＭｅＯＨ（２００ｍＬ）を加えて、透明な褐色の溶液を得る。表題の成物（１１．４８ｇ）を加えて溶液をシードとし、続いてＥｔＯＡｃ（８００ｍＬ）中の４−メチルベンゼンスルホン酸、水和物（８１．４ｇ、４２８ｍｍｏｌ）の予め混合した溶液を加え、黄色の懸濁液を得る。懸濁液を５０℃で３０分間撹拌する。懸濁液を１／２容量に濃縮する。溶液を室温で１時間冷却し、濾過し、固体を収集し、そして固体をＥｔＯＡｃで洗浄する。固体を真空下、３０℃で週末の間中乾燥させて、表題化合物（２３９ｇ、３４３ｍｍｏｌ）を得た。材料をさらに精製するために、表題化合物（２２９ｇ、３２８．７ｍｍｏｌ）と２−プロパノール（４．６Ｌ）を一緒に加え、６０℃で２時間加熱する。室温まで３０分間冷却する。固体を濾過し、ｉＰｒＯＨ（１００ｍＬ）で洗浄する。Ｎ_２気流下で固体を一晩乾燥させて、表題化合物（１７４．４ｇ、７６．２％）を得た。本質的に同じ方法で調製した表題化合物の様々なロットを合わせ、ヘプタン（２Ｌ）を加える。懸濁液を３０分間撹拌し、固体を濾過し、ヘプタン（３００ｍＬ）で洗浄する。Ｎ_２気流下で固体を一晩乾燥させて回収し、表題化合物（１９９．７ｇ、９９．５％）を得た。

ＸＲＤ、実施例１０
実施例１Ｂの説明に従ってＸＲＤを完成させる。調製された結晶性の５−（４−｛２−［３−（フルオロメチル）アゼチジン−１−イル］エトキシ｝フェニル）−８−（トリフルオロメチル）−５Ｈ−［１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］キノリン−２−オール、４−メチルベンゼンスルホン酸、異性体２（実施例１０）の試料を、以下の表５に記載されるように、回折ピーク（２シータ値）、特に１２．８、１９．５、および２２．８からなる群から選択されるピークのうちの１つ以上と組み合わせて２０．１でピークを有し、回折角の許容誤差が０．２度であるような、ＣｕＫａ方射線を使用したＸＲＤパターンによって特性評価する。

生物学的アッセイ
ＥＲ発現と特定のがんとの間の関係の証拠は、当該技術分野で周知である。

以下のアッセイの結果は、実施例の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物が活性ＳＥＲＤであり、がんの治療に有用であると考えられていることを示している。

ＥＲα（野生型）、ＥＲα（Ｙ５３７Ｓ変異体）、およびＥＲβの競合結合アッセイ
以下のＥＲ競合結合アッセイの目的は、ＥＲα（野生型）、ＥＲα（Ｙ５３７Ｓ変異体）、およびＥＲβに対する試験化合物の親和性を決定することである。

５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１．５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍｇ／ｍＬオボアルブミン、および５ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液中で、ウェルあたり０．０２５μＣｉの^３Ｈ−エストラジオール（１１８Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１ｍＣｉ／ｍＬ）、７．２ｎｇ／ウェルのＥＲα（野生型）、または７．２ｎｇ／ウェルのＥＲα（Ｙ５３７Ｓ変異体）または７．７ｎｇ／ウェルのＥＲβ受容体を使用して競合結合アッセイを実行する。１０，０００ｎＭ〜０．５ｎＭの範囲の１０種類の濃度で試験化合物を加え、１μＭの１７−βエストラジオールの存在下で非特異的結合を決定する。結合反応液（１４０μＬ）を室温で４時間インキュベートした後、冷デキストラン−チャコール緩衝液（７０μＬ）（５０ｍＬのアッセイ緩衝液あたり０．７５ｇのチャコールと０．２５ｇのデキストランを含む）を各反応液に加える。プレートを４℃の軌道式振盪機で８分間混合し、３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離する。混合物のアリコート（１２０μＬ）を別の９６ウェルの白い平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に移し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘシンチレーション液（１７５μＬ）を各ウェルに加える。プレートを密封し、軌道式振盪機で激しく振とうする。２．５時間のインキュベーション後、ＷａｌｌａｃＭｉｃｒｏｂｅｔａカウンターでプレートを読み取る。４パラメーターロジスティックカーブフィットを使用してＩＣ_５０を計算し、１０μＭでの阻害％を計算する。化合物のＩＣ_５０値は、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式を用いて、Ｋ_ｉに変換する。このアッセイの結果は、以下の表７に示すように、実施例１、１Ａ、および１Ｂ（およびその他）が組換えＥＲα野生型およびＥＲα変異体（Ｙ５３７Ｓ）に結合することを示し、実施例１Ｂも０．１１±０．０７のＫ_ｉ（ｎＭ）のＥＲβ競合でＥＲβに結合する、ｎ＝３。

試験した例示的な化合物のうち、ＥＲα野生型のＫｉは約０．３００ｎＭから約６５ｎＭの範囲であった。ＥＲαＹ５３７Ｓ変異体のＫｉは、約２ｎＭから３００ｎＭの範囲であった。このアッセイの結果は、ＥＲα野生型、変異体（ＥＳＲ１ Ｙ５３７Ｓ）、およびＥＲβタンパク質に対する例示された化合物の結合親和性および効力を示している。

ＭＣＦ７細胞におけるＥＲα分解アッセイ
以下のＥＲα分解アッセイの目的は、ＭＣＦ７などのＥＲα陽性乳癌細胞株における試験化合物によるＥＲαの分解を測定することである。

１０％ＦＢＳ、０．０１ｍｇ／ｍＬヒトインスリン１、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を補充したＤＭＥＭ培地でＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２から購入）細胞を培養し、１０％チャコール処理ＦＢＳを含むフェノールレッドフリーＤＭＥＭ培地（２０μＬ）中でウェルあたり４，０００細胞の密度で３８４ウェル平底プレートに播種する。細胞培養インキュベーター（５％ＣＯ_２、９５％相対湿度、３７℃）で一晩細胞をインキュベートし、細胞をプレートに付着させる。翌日、細胞に試験化合物を投与する。Ｅｃｈｏ５５５音響ディスペンサーを使用して、６μＭから０．０００３μＭの範囲の試験化合物段階希釈液（１：３）を調製する。連続希釈プレートから細胞プレートに５μＬを加えることによって細胞に投与し、最終ＤＭＳＯ濃度が０．２％になり、最終試験化合物濃度が２〜０．０００１μＭの用量範囲になる。最大点には、０．２％のＤＭＳＯを含む培地を使用し、最小点には、０．２％ＤＭＳＯを含む増殖培地で２μＭの最終濃度に希釈したフルベストラントを使用する。試験化合物を投与後、２４時間３７℃、５％ＣＯ_２で細胞プレートをインキュベートする。１４％パラホルムアルデヒド（１０μＬ）を室温で３０分間加えることによって、細胞を固定する。細胞をＰＢＳ（２０μＬ）で１回洗浄し、０．５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（２０μＬ）で１時間インキュベートする。０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（２×）を含むＰＢＳで細胞を洗浄し、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０および０．１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を含むＰＢＳ中の３％ＢＳＡ（２０μＬ／ウェル）で室温で１時間ブロッキングする。ウェルあたり０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ中の１％ＢＳＡで希釈した１：５００一次抗体（２０μＬ）（ＥＲα（クローンＳＰ１）モノクローナルウサギ抗体＃ＲＭ−９１０１−Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、プレートを密封して４℃で一晩インキュベートする。翌日、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（２×）を含むＰＢＳで細胞を洗浄し、ＰＢＳ１％ＢＳＡ中の二次抗体（２０μＬ／ウェル）（１：１０００希釈、ヤギ抗ウサギＩｇＭ ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（商標）４８８）と室温で１０５分間インキュベートする。プレートをＰＢＳ（２×２０μＬ）で洗浄した後、ＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）（５０μｇ／ｍＬを２０μＬ）およびウェルあたり（２０μＬ）のＰＢＳ中の１：１０００のヨウ化プロピジウム希釈液を加える。プレートを密封し、ベンチで室温で１時間インキュベートする（光から保護する）。ＡＣＵＭＥＮ ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［ＴＴＰＬＡＢＴＥＣＨ ＬＴＤ製のレーザースキャン蛍光マイクロプレートサイトメーター］でプレートをスキャンして、ＥＲαを測定する。画像解析は、陽性細胞を識別するための細胞蛍光シグナルに基づく。平均強度によってＥＲ陽性細胞を識別する。ヨウ化プロピジウム／ＤＮＡからの５７５〜６４０ｎｍでの総強度を使用して、個々の細胞を識別する。アッセイのアウトプットはＥＲ陽性細胞％である。ＧＥＮＥ ＤＡＴＡ（商標）を使用して、各アウトプットの４つのパラメーターロジスティックにカーブフィッティングすることにより、ＩＣ_５０を決定する。このアッセイの結果は、ＭＣＦ７乳癌細胞において本明細書に記載の式Ｉ、式ＩＩ、および式ＩＩＩの化合物によって誘導されるＥＲαの強力な分解を示している。実施例１、１Ａ、および１Ｂの相対ＩＣ_５０値を表８に示す。

具体的には、表７の結果は、ＭＣＦ７乳癌細胞における実施例１の化合物によるＥＲαの強力な分解を示している。試験した例示的な化合物のうち、相対的ＩＣ_５０は０．００３から＞２μＭの範囲であり、実施例２Ｂを除く全てが試験した濃度で活性を示したことを示している。このアッセイの結果は、式（Ｉ）の化合物が、細胞において強力なＥＲα分解活性を有するＳＥＲＤであることを示している。

ＭＣＦ７細胞におけるＰＲα誘導アッセイ
以下のＰＲα誘導アッセイの目的は、試験化合物がＥＲα受容体に対してアゴニスト活性を有するかどうかを判定することである（アゴニストは受容体を活性化すると予想される）。

１０％ＦＢＳ、０．０１ｍｇ／ｍＬヒトインスリン１、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を補充したＤＭＥＭ培地でＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２から購入）を培養し、細胞（７０％コンフルエントになる前）を、１０％ＦＢＳ（チャコール処理）を含むＤＭＥＭフェノールレッドフリー培地中２０μＬ体積でウェルあたり４，０００細胞の密度で３８４ウェル平底プレートに播種する。細胞培養インキュベーター（５％ＣＯ_２、９５％相対湿度、３７℃）で一晩細胞をインキュベートし、細胞をプレートに付着させる。翌日、細胞に試験化合物を投与する。Ｅｃｈｏ５５５音響ディスペンサーを使用して、６μＭから０．０００３μＭの範囲の化合物段階希釈液（１：３）を調製する。連続希釈プレートから細胞プレートに試験化合物（５μＬ）を加えることによって細胞に投与し、０．２％の最終ＤＭＳＯ濃度を生成し、試験化合物の最終濃度は２〜０．０００１μＭの用量範囲である。最大点には、０．２％のＤＭＳＯを含む培地を使用し、最小点には、０．２％ＤＭＳＯを含む増殖培地で２μＭの最終濃度に希釈したフルベストラントを使用する。試験化合物を投与後、２４時間３７℃、５％ＣＯ_２で細胞プレートをインキュベートする。１４％パラホルムアルデヒド（１０μＬ）を室温で３０分間加えることによって、細胞を固定する。細胞をＰＢＳ（２０μＬ）で１回洗浄し、０．５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（２０μＬ）で１時間インキュベートする。０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（２０μＬ）で細胞を２回洗浄し、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０および０．１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を含むＰＢＳ中の３％ＢＳＡ（２０μＬ／ウェル）で室温で１時間ブロッキングする。ウェルあたり０．０５ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した１：５００一次抗体（２０μＬ）（ＰＲモノクローナルマウス抗ヒト抗体、クローンＰｇＲ ６３６ Ｄａｋｏ、Ｍ３５６９）を加え、プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートする。

翌日、ＰＢＳ ０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（２×２０μＬ）で細胞を洗浄し、ＰＢＳ１％ＢＳＡ中の二次抗体（２０μＬ／ウェル）（１：１０００希釈、ヤギ抗ウサギＩｇＭ ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（商標）４８８）と室温で１０５分間インキュベートする。ＰＢＳ（２×２０μＬ）で洗浄した後、ＲＮａｓｅ（５０μｇ／ｍＬを２０μＬ）（Ｓｉｇｍａ）およびウェルあたりでＰＢＳで１：１０００のヨウ化プロピジウム希釈液を加える。プレートを密封し、ベンチで室温で１時間インキュベートする（光から保護する）。ＡＣＵＭＥＮ ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［ＴＴＰＬＡＢＴＥＣＨ ＬＴＤ製のレーザースキャン蛍光マイクロプレートサイトメーター］でプレートをスキャンして、ＰＲαを測定する。画像解析は、陽性細胞を識別するための細胞蛍光シグナルに基づく。平均強度によってＰＲ陽性細胞を識別する。ヨウ化プロピジウム／ＤＮＡからの５７５〜６４０ｎｍでの総強度を使用して、個々の細胞を識別する。アッセイのアウトプットはＰＲ陽性細胞％である。ＧＥＮＥ ＤＡＴＡ（商標）を使用して、各アウトプットの４つのパラメーターロジスティックにカーブフィッティングすることにより、ＩＣ_５０を決定する。このアッセイの結果は、ＭＣＦ７乳癌細胞における実施例１、１Ａ、および１Ｂの有意なアゴニスト活性を示さない。試験した化合物について、このアッセイにおける相対ＩＣ_５０は＞２μＭである。このアッセイの結果は、ＭＣＦ７乳癌細胞で試験された例示された化合物の有意なアゴニスト活性を示さない。これらの結果はまた、試験された例示された化合物が、ＭＣＦ７乳癌細胞におけるＥＲαのアンタゴニストであることを示している（すなわち、それらはＳＥＲＤ活性を有する）。

ＭＣＦ７−ＥＳＲ１ Ｙ５３７Ｎ ６８２ ＣＲＩＳＰＲ細胞におけるＰＲα阻害（ＥＲα機能的拮抗作用）細胞アッセイ
以下のＰＲα阻害（ＥＲα機能的拮抗作用）細胞アッセイの目的は、Ｙ５３７Ｎ変異体ＥＲα受容体に対する試験化合物のアンタゴニスト活性を決定することである。このアッセイのアンタゴニストは、ＥＲα受容体の機能をブロックすると予想される。ＰＲαはＥＲαの下流の転写標的であるため、ＥＲαのアンタゴニストはＰＲαの発現を阻害すると予想される。

１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を補充したＤＭＥＭ培地でＭＣＦ７−ＥＳＲ１ Ｙ５３７Ｎ−６８２（ＭＣＦ７細胞のＥＳＲ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集により生成、クローン＃６８２）を培養し、細胞（７０％コンフルエントになる前）を、ＤＭＥＭフェノールレッドフリー培地、１０％ＦＢＳ（２０μＬ体積）（チャコール処理）中でウェルあたり４，０００細胞の密度で３８４ウェル平底プレートに播種する。細胞培養インキュベーター（５％ＣＯ_２、９５％相対湿度、３７℃）で一晩細胞をインキュベートし、細胞をプレートに付着させる。翌日、細胞に試験化合物を投与する。Ｅｃｈｏ５５５音響ディスペンサーを使用して、６μＭから０．０００３μＭの範囲の化合物段階希釈液（１：３）を調製する。連続希釈プレートから細胞プレートに５μＬを加えることによって細胞に投与し、最終ＤＭＳＯ濃度が０．２％になり、最終試験化合物濃度が２〜０．０００１μＭの用量範囲になる。最大点には、０．２％のＤＭＳＯを含む培地を使用し、最小点には、０．２％ＤＭＳＯを含む増殖培地で２μＭの最終濃度に希釈したフルベストラントを使用する。試験化合物を投与後、７２時間３７℃、５％ＣＯ_２で細胞プレートをインキュベートする。１４％パラホルムアルデヒド（１０μＬ）を室温で３０分間加えることによって、細胞を固定する。細胞をＰＢＳ（１×２０μＬ）で１回洗浄し、０．５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（２０μＬ）で１時間インキュベートする。０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（２×２０μＬ）で細胞を洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ ０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、０．１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００（２０μＬ／ウェル）で室温で１時間ブロッキングする。ウェルあたり１％ＢＳＡ／ＰＢＳ ０．０５ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で希釈した１：５００一次抗体（２０μＬ）（ＰＲモノクローナルマウス抗ヒト抗体、クローンＰｇＲ ６３６ Ｄａｋｏ、Ｍ３５６９）を加え、プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートする。

翌日、ＰＢＳ ０．０５％（登録商標）（２×２０μＬ）で細胞を洗浄し、ＰＢＳ１％ＢＳＡ中の二次抗体（２０μＬ／ウェル）（１：１０００希釈、ヤギ抗ウサギＩｇＭ ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ（商標）４８８）と室温で１０５分間インキュベートする。ＰＢＳ（２×２０μＬ）で洗浄した後、ＲＮａｓｅ（５０μｇ／ｍＬを２０μＬ）（Ｓｉｇｍａ）およびウェルあたりＰＢＳ中１：１０００のヨウ化プロピジウム希釈液を加える。プレートを密封し、ベンチで室温で１時間インキュベートする（光から保護する）。ＡＣＵＭＥＮ ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［ＴＴＰＬＡＢＴＥＣＨ ＬＴＤ製のレーザースキャン蛍光マイクロプレートサイトメーター］でプレートをスキャンして、ＰＲαを測定する。画像解析は、陽性細胞を識別するための細胞蛍光シグナルに基づく。平均強度によってＰＲ陽性細胞を識別する。ヨウ化プロピジウム／ＤＮＡからの５７５〜６４０ｎｍでの総強度を使用して、個々の細胞を識別する。アッセイのアウトプットはＰＲ陽性細胞％である。ＧＥＮＥ ＤＡＴＡ（商標）を使用して、各アウトプットの４つのパラメーターロジスティックにカーブフィッティングすることにより、ＩＣ_５０を決定する。

このアッセイの結果は、ＭＣＦ７（ＥＳＲ１ Ｙ５３７Ｎ、ヘテロ接合変異体）乳癌細胞における実施例１、１Ａ、および１ＢによるＰＲαの強力な阻害および機能的拮抗作用を示している。このアッセイにおける実施例１、１Ａ、および１Ｂ（およびその他）の相対ＩＣ_５０を以下の表９に示す。試験した例示的な化合物の相対ＩＣ_５０は、約０．０１１８から＞１．６μＭの範囲であり、例示した化合物が、例２Ｂ １．６μＭを除いて、ＥＲα変異体（Ｙ５３７Ｎ）の強力なアンタゴニストおよびＥＲα媒介転写の強力な阻害剤であることを示す。ＰＲα（ＰＧＲ）もＥＲαの転写標的であり、このアッセイの結果は、ＰＲαのＥＲα媒介転写の強力な阻害を示す。

ＭＣＦ７細胞におけるＰＲα阻害（ＥＲα機能的拮抗作用）細胞アッセイ
以下のＰＲα阻害（ＥＲα機能的拮抗作用）細胞アッセイの目的は、ＥＲα受容体に対する試験化合物のアンタゴニスト活性を決定することである。このアッセイのアンタゴニストは、ＥＲα受容体の機能をブロックすると予想される。ＰＲαはＥＲαの下流の転写標的であるため、ＥＲαのアンタゴニストはＰＲαの発現を阻害すると予想される。

ＭＣＦ７細胞株を使用して、上述のＥＲα分解細胞ベースＡｃｕｍｅｎアッセイで詳述されているアッセイ条件を実行するが、ただし、試験化合物を分注する前に、細胞プレートから培地を除去し、陰性対照ウェル（プレートの列２４）を除く全てのウェルを０．４７ｎＭエストラジオールを含むアッセイ培地で３０分間前処理する。このアッセイでは、ＰＲαを検出するための免疫染色を行い、プレートをＡＣＵＭＥＮ ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［ＴＴＰ ＬＡＢＴＥＣＨ ＬＴＤ製のレーザースキャン蛍光マイクロプレートサイトメーター］でスキャンしてＰＲαを測定する。画像解析は、陽性細胞を識別するための細胞蛍光シグナルに基づく。平均強度によってＰＲα陽性細胞を識別する。ヨウ化プロピジウム／ＤＮＡからの５７５〜６４０での総強度を使用して、個々の細胞を識別する。アッセイのアウトプットはＰＲα陽性細胞％である。ＧＥＮＥ ＤＡＴＡ（商標）を使用して、各アウトプットの４つのパラメーターロジスティックにカーブフィッティングすることにより、ＩＣ_５０を決定する。このアッセイの結果は、ＭＣＦ７乳癌細胞における実施例１、１Ａ、および１ＢによるＰＲαの強力な阻害および機能的拮抗作用を示している。このアッセイにおける実施例１、１Ａ、および１Ｂの相対ＩＣ_５０を以下の表１０に示す。例示的な化合物の相対ＩＣ_５０は、約０．０２９から＞２μＭの範囲であり、１Ａおよび２Ｂを除く試験された全ての例示的な化合物が、ＥＲα野生型タンパク質の強力なアンタゴニストであり、ＥＲα媒介転写の強力な阻害剤であることを示す。ＰＲα（ＰＧＲ）もＥＲαの転写標的であり、このアッセイの結果は、試験した濃度でのＰＲαのＥＲα媒介転写の強力な阻害を示す。

ＭＣＦ７およびＭＣＦ７−ＥＳＲ１ Ｙ５３７Ｎ−６８２の細胞増殖アッセイ
以下の細胞増殖アッセイの目的は、概して、試験化合物が細胞増殖に影響を与えるかどうかを検出することである。

ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２から購入）細胞を、ＤＭＥＭフェノールレッドフリー培地１０％ＦＢＳ（２０μＬ体積）（チャコール処理）でウェルあたり２，０００細胞の密度で、透明な底の３８４ウェル細胞培養プレートに播種する。１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を補充したＤＭＥＭ培地中のＭＣＦ７−ＥＳＲＹ５３７Ｎ−６８２（ＭＣＦ７細胞のＥＳｒ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によって生成、クローン＃６８２）を、ウェルあたり１０００細胞の密度で播種する。３７℃および５％ＣＯ_２でプレートをインキュベートする。翌日、細胞に試験化合物を投与する。Ｅｃｈｏ５５５音響ディスペンサーを使用して、６０μＭから０．００３μＭの範囲の試験化合物段階希釈液（１：３）を調製する。連続希釈プレートから細胞プレートに５μＬを加えることによって細胞に投与し、最終ＤＭＳＯ濃度が０．２％になり、最終試験化合物濃度が２０〜０．００１μＭの用量範囲になる。最大点には、０．２％のＤＭＳＯを含む培地を使用し、最小点には、０．２％ＤＭＳＯを含む増殖培地で２μＭの最終濃度に希釈したフルベストラントを使用する。試験化合物を投与後、３７℃、５％ＣＯ_２で細胞プレートをインキュベートする。試験化合物の添加から７日後、インキュベーターからプレートを取り出し、各ウェルに冷ＥｔＯＨ９６％（６５μＬ）を加える。３０分後、培地を除去し、ＲＮａｓｅ（５０μｇ／ｍＬを２０μＬ）（Ｓｉｇｍａ）およびウェルあたりＰＢＳ中１：１０００ヨウ化プロピジウム希釈液を添加する。プレートを密封し、ベンチで室温で１時間インキュベートする（光から保護する）。ＡＣＵＭＥＮ ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［ＴＴＰＬＡＢＴＥＣＨ ＬＴＤ製のレーザースキャン蛍光マイクロプレートサイトメーター］でプレートをスキャンする。ＭＣＦ−７細胞株は増殖して凝集体を形成し、対象の数としての細胞数は読み出しとして使用できない可能性があり、したがって、細胞数は、推定細胞数（面積パラメーター（総細胞集団の総面積の比率（ＦＬ−１（ＰＩ）のピーク強度の指定範囲および単一細胞集団の平均面積（周囲長で定義））によって計算される）によって評価できる。ＧＥＮＥ ＤＡＴＡ（商標）を使用して、各アウトプットの４つのパラメーターロジスティックにカーブフィッティングすることにより、ＩＣ_５０を決定する。ＭＣＦ７ ＥＳＲ１野生型およびＭＣＦ７−ＥＳＲ１ Ｙ５３７Ｎ変異細胞における実施例１、１Ａ、および１Ｂ（およびその他）の相対ＩＣ_５０を以下の表１０に示す。このアッセイの結果は、ＭＣＦ７（ＥＳＲ１野生型）およびＭＣＦ７（ＥＳＲ１ Ｙ５３７Ｎ変異体）乳癌細胞における実施例１、１Ａ、および１Ｂ（およびその他）による強力な抗増殖活性および細胞増殖阻害を示す。例示的な化合物の相対ＩＣ_５０は、ＭＣＦ７ ＥＳＲ１野生型において約０．００３５から１．１７６μＭ、ＭＣＦ７（ＥＳＲ１ Ｙ５３７Ｎ変異体）乳癌細胞で０．０１４から１．８６μＭの範囲であり、試験された全ての例示的な化合物は、ＭＣＦ７（ＥＳＲ１野生型）およびＭＣＦ７（ＥＳＲ１ Ｙ５３７Ｎ変異体）乳癌細胞において、強力な抗増殖活性および細胞増殖阻害を実証することを示す。

ＭＣＦ７腫瘍におけるｉｎ ｖｉｖｏ標的阻害（ＩＶＴＩ）アッセイ（ＰＧＲ ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ）
このＩＶＴＩアッセイの目的は、マウスに移植された異種移植腫瘍において、ＥＲαの下流でＰＲα遺伝子発現（転写）を阻害する試験化合物（ＳＥＲＤ）の能力を測定することである。

Ｅｎｖｉｇｏ ＲＭＳ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓｃｏｎｓｉｎのメスのＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（２２〜２５ｇ）に、５×１０ｅ^６のＭＣＦ７ ＥＲ陽性乳癌細胞（ＡＴＣＣ、＃ＨＴＢ−２２）を右脇腹領域に１：１ ＨＢＳＳ＋ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）溶液（２００μＬ）で皮下移植する。腫瘍細胞移植の１日前に、１７−βエストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｒｅｓｅａｒｃｈからの０．１８ｍｇ／ペレット、９０日放出）を皮下に移植する。移植の７日後に開始して１週間に２回、腫瘍成長および体重を測定する。腫瘍の大きさが１５０〜３００ｍｍ^３に達する時、動物を無作為化し、５匹の動物の群に分ける。試験化合物特異的ビヒクル（精製水中の１％ヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０／０．０５％消泡剤）中の複数回投与の試験化合物またはビヒクル単独のいずれかを３日間、動物に経口投与し、最後の投与後に所望の時間間隔で腫瘍および血液を採取する。イソフルラン麻酔と頸椎脱臼を使用して動物を屠殺する。腫瘍を瞬間冷凍し、ＲＮＡ分離およびＲＴ−ｑＰＣＲアッセイのために処理するまで−８０℃で保存する。ＥＤＴＡチューブに血液を採取し、血漿のためにスピンダウンし、９６ウェルプレートで−８０℃で凍結する。質量分析を使用して、試験化合物の曝露を決定する。

ＦＡＳＴＰＲＥＰ−２４（商標）Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒマシン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）でＭａｔｒｉｘ Ｄビーズ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、＃６９１３−５００）を使用して、液体窒素で腫瘍を粉砕し、１×ＲＮＡ溶解緩衝液（ＲＮＡ単離キットから）で溶解する。１４０００ｒｐｍで２０分間、４℃で回転させた後、腫瘍溶解物を新しいチューブに移す。ＰＵＲＥＬＩＮＫ（登録商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１２１８３０１８Ａ）またはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ＃７４１０４および＃７４１０６）を使用して、腫瘍溶解物からＲＮＡを単離する。ＰＵＲＥＬＩＮＫ（登録商標）ＤＮａｓｅセット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１２１８５０１０）またはＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ＃７９２５４）を使用してＤＮＡ混入物を除去する。ＲＮａｓｅフリー水で試料を希釈し、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０）で２６０ｎｍの吸光度を測定することにより、単離されたＲＮＡ濃度を測定する。他の全てのＲＮＡ試料の２６０ｎｍ測定値から、ブランク（ＲＮａｓｅフリー水のみ）の平均２６０ｎｍ吸光度測定値を差し引く。ＲＮＡ試料をＲＮａｓｅフリー水で等濃度に希釈する。ＲＴ−ＰＣＲ用のＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１８０８０−０５１）を使用して、希釈したＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。ＲＴ−ｑＰＣＲを実行するために、最初にＲＮａｓｅフリー水でｃＤＮＡを希釈する。２×Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｂｌｕｅ ｑＰＣＲ ＲＯＸ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ、＃ＡＢ−４１３９／Ａ）、ＰＧＲプライマー（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｈｓ０１５５６７０２＿ｍ１）、および各反応の希釈ｃＤＮＡをＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４３０９８４９）で合わせる。サーモサイクラー（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ配列検出システム）で試料を５０℃で２分間、続いて９５℃で１５分間インキュベートすることにより、ｃＤＮＡを増幅する。９５℃で１５秒間、続いて５０℃で６０秒間を、合計４０サイクルインキュベートし続ける。サイクルはハウスキーピング遺伝子に対して正規化され、ビヒクル単独と比較したＰＧＲ阻害％を計算するために使用される。各試料を重複して分析し、計算に平均数を使用する。ＥｘｃｅｌとＸＬ Ｆｉｔを使用して、標的（ＰＧＲ）阻害パーセントを計算する。

このアッセイの結果は、実施例１Ｂが腫瘍異種移植モデルにおいてＰＲα（ＰＧＲ）発現を阻害することを実証している。実施例１Ｂは、経口投与された場合、３０ｍｇ／ｋｇの用量で２４時間、腫瘍異種移植モデルにおいてＰＲα（ＰＧＲ）発現を約７８％阻害する。これらの結果は、腫瘍異種移植モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでのＥＲα拮抗活性およびＥＲα媒介転写活性の有意かつ持続的な阻害を示している。

マウスに移植されたＥＲ陽性（ＥＳＲ１野生型）乳癌異種移植腫瘍モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖阻害研究
以下の異種移植腫瘍阻害アッセイの目的は、試験化合物投与に応答する移植腫瘍体積の減少を測定することである。

培養中のヒト乳癌細胞ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２２）およびＨＣＣ１４２８（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２３２７）を増殖させ、採取して５×１０ｅ^６細胞を１：１ ＨＢＳＳ＋ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）溶液（２００μＬ）でメスのＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（２２〜２５ｇ、Ｅｎｖｉｇｏ ＲＭＳ，Ｉｎｃ）の右後部側面に皮下に注入する。細胞移植の２４時間前に、エストロゲンペレット（０．１８ｍｇ／ペレット、１７βエストラジオール、９０日放出、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を皮下に移植する。培養中のヒト乳癌細胞Ｔ４７Ｄ（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２２）を増殖させ、採取して５×１０ｅ^６細胞を１：１ ＨＢＳＳ＋ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）溶液（２００μＬ）でメスのＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（２２〜２５ｇ、Ｅｎｖｉｇｏ ＲＭＳ，Ｉｎｃ）の右後部側面に皮下に注入する。細胞移植の２４時間前に、エストロゲンペレット（０．３８ｍｇ／ペレット、１７βエストラジオール、９０日放出、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を皮下に移植する。培養中のヒト乳癌細胞ＺＲ−７５−１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５００）を増殖させ、採取して５×１０ｅ^６細胞を１：１ ＨＢＳＳ＋ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）溶液（２００μＬ）でメスのＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（２２〜２５ｇ、Ｅｎｖｉｇｏ ＲＭＳ，Ｉｎｃ）の右後部側面に皮下に注入する。細胞移植の２４時間前に、動物に５０μｌの吉草酸エストラジオール（Ｄｅｌｅｓｔｒｏｇｅｎ（登録商標））の筋肉内注射（１０ｍｇ／ｍＬ）を投与し、その後、研究期間中１４日に１回投与する。移植の７日後に開始して１週間に２回、腫瘍成長および体重を測定する。腫瘍の大きさが２５０〜３５０ｍｍ^３に達する時、動物を無作為化し、５匹の動物の群に分ける。適切なビヒクル（精製水中の１％ヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０／０．０５％消泡剤）で試験化合物、実施例１Ｂを調製し、２８日間、１日１回（ＱＤ）強制経口投与する。腫瘍応答は、処理過程中に週に２回行われる腫瘍体積測定によって決定される。腫瘍体積が測定されるときはいつでも、毒性の一般的な尺度として体重を取得する。

実施例１Ｂの化合物は、以下の表１２に提供されるように、デルタＴ／Ｃ％値を有することが見出されている。これらの結果は、実施例１Ｂの化合物が、マウスにおいて良好な経口バイオアベイラビリティを示し、ＥＲ陽性（ＥＳＲ１野生型）ヒト乳癌異種移植モデルにおいて有意な抗腫瘍活性または腫瘍退縮を実証することを示している。

退縮％は、エンドポイント体積がベースラインを下回る場合に算出する。式は、１００＊（Ｔ−Ｔ_０）／Ｔ_０であり、式中、Ｔ_０は、処理群の平均ベースライン腫瘍体積である。

３２日目のベースライン（無作為化）からの全ての群の総平均を使用して、Ｔ／Ｃの変化％をコンピュータにより計算する。

マウスに移植されたＥＳＲ１変異体（Ｙ５３７Ｓ）乳癌ＰＤＸ腫瘍モデル（ＳＴ９４１／ＨＩ）におけるｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖阻害研究
以下の異種移植腫瘍阻害アッセイの目的は、ＥＳＲ１変異体およびホルモン非依存性（ＨＩ）乳癌患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデルにおいて、試験化合物投与に応答する移植腫瘍体積の減少を測定することである。

ＳＴ９４１／ＨＩ ＰＤＸモデルは、Ｓｏｕｔｈ Ｔｅｘａｓ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）で導出され、実行された。腫瘍断片は、宿主動物から採取し、免疫不全マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に移植し、研究は約１２５〜２５０ｍｍ^３の平均腫瘍体積で開始された。適切なビヒクル（精製水中の１％ヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０／０．０５％消泡剤）で試験化合物、実施例１Ｂを調製し、２８日間強制経口投与する。腫瘍応答は、処理過程中に週に２回行われる腫瘍体積測定によって決定される。腫瘍体積が測定されるときはいつでも、毒性の一般的な尺度として体重を取得する。

実施例１Ｂの化合物は、以下の表１３に提供されるように、デルタＴ／Ｃ％値を有することが見出されている。これらの結果は、実施例１Ｂの化合物が、マウスにおいて良好な経口バイオアベイラビリティを示し、ＥＳＲ１変異体（Ｙ５３７Ｓ）ヒト乳癌ＰＤＸモデルにおいて有意な抗腫瘍活性または腫瘍退縮を実証することを示している。

退縮％は、エンドポイント体積がベースラインを下回る場合に算出する。式は、１００＊（Ｔ−Ｔ_０）／Ｔ_０であり、式中、Ｔ_０は、処理群の平均ベースライン腫瘍体積である。

３２日目のベースライン（無作為化）からの全ての群の総平均を使用して、Ｔ／Ｃの変化％をコンピュータにより計算する。

組み合わせ研究
腫瘍の不均一性と内分泌療法に対する後天的な耐性のために、組み合わせ療法は、効果的な治療のため、または後天的な耐性を克服するために、ＥＲ陽性および進行／転移性乳癌治療に不可欠になっている。実施例１ＢとＣＤＫ４／６阻害剤アベマシクリブ、ｍＴＯＲ阻害剤エベロリムス、ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤アルペリシブ、およびＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン（「化合物Ａ」）との組み合わせ効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで５つのＥＲ陽性乳癌細胞株において試験した。

組み合わせ研究のための細胞生存率アッセイ
透明な底の３８４ウェル細胞培養プレートに、表に記載されている培地の２０μＬ体積で、以下の表１４に示されている密度の細胞を播種する。

３７℃および５％ＣＯ_２でプレートをインキュベートする。翌日、細胞に試験化合物、実施例１Ｂを投与する。

化合物を１０ｍＭ ＤＭＳＯストック溶液として調製し、最高濃度を１０または１μＭから開始して用量反応研究に使用する。２つの化合物を一定の比率で一緒に試験し、１：３段階希釈段階希釈を調製する。ＩＣ_５０決定のための化合物単独は、２０μＭの濃度から開始する。連続希釈プレートから細胞プレートに５μＬを加えることによって細胞に投与し、最終ＤＭＳＯ濃度が０．２％になり、最終試験化合物濃度は、単一処理の場合は２０〜０．００１μＭの用量範囲になり、組み合わせの場合はそれより低い範囲になる。最大点には、０．２％のＤＭＳＯを含む培地を使用し、最小点には、０．２％ＤＭＳＯを含む増殖培地で２μＭの最終濃度に希釈したスタウロスポリンを使用する。試験化合物を投与後、３７℃、５％ＣＯ_２で細胞プレートをインキュベートする。化合物との２倍加時間のインキュベーション後、インキュベーターからプレートを取り出し、各ウェルに冷エタノール９６％（６５μＬ）を加える。３０分後、培地を除去し、ＲＮａｓｅ（５０μｇ／ｍＬを２０μＬ）（Ｓｉｇｍａ）およびウェルあたりＰＢＳ中１：１０００ヨウ化プロピジウム希釈液を添加する。プレートを密封し、室温で１時間インキュベートする（光から保護する）。ＡＣＵＭＥＮ ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）［ＴＴＰＬＡＢＴＥＣＨ ＬＴＤ製のレーザースキャン蛍光マイクロプレートサイトメーター］でプレートをスキャンする。一部の細胞株が増殖して凝集体を形成し、対象の数としての細胞数は読み出しとして使用できない可能性がある。したがって、総面積集団（ＦＬ−１（ＰＩ）のピーク強度の指定範囲）またはＰＩの総強度を使用して、細胞数を評価する。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏの組み合わせデータは、表１５に示すように、５つのＥＲ陽性乳癌細胞株のうち５つにおいて、実施例１Ｂとアベマシクリブまたはエベロリムスとの組み合わせによる相乗的（以下に定義）を示唆している。実施例１Ｂと化合物Ａの組み合わせは、試験した４つのＥＲ陽性乳癌細胞株のうち４つで相乗的である。実施例１Ｂとアルペリシブとの組み合わせ効果は、４つのＥＲ陽性乳癌細胞株のうちの２つにおいて相加的であり、４つのＥＲ陽性乳癌細胞株のうち２つにおいて相乗的である。

組み合わせ効果のデータ分析と解釈
文献に公開されている方法を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏの組み合わせ効果を計算する（Ｌ．Ｚｈａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ，２０１０，２：２４１−２４９ ａｎｄ Ｌ．Ｚｈａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００４，１０（２３）：７９９４−８００４）。２つの薬物間の相乗的または拮抗的な相互作用を識別するために、ＸＬＦｉｔ５アドインを備えたカスタマイズされたＸＬテンプレートを使用して曲線シフト分析が実行された。単一薬剤の曲線は、４つのパラメーターのロジスティック回帰を使用して調整される。フィッティングに使用される基準と制限は、（ｉ）ボトム＜（−２０）が０に固定され、（ｉｉ）トップ＞１２０が１００に固定されることである。全ての観測値がユーザーが設定したしきい値よりも低い場合、ｈｉｌｌ＝０で一定のフィットが実行され、ＩＣ_５０は含まれる最大濃度よりも高いとみなされる。各単剤の絶対ＩＣ_５０が得られたら、活性の５０％での当量濃度を単剤および組み合わせについて計算する。これらの当量濃度を測定された活性と一緒に使用して、絶対ＩＣ_５０を再計算する。単剤の曲線は、１に等しい当量濃度の値で５０％の活性に達するが、相乗的な組み合わせは、より低い値で５０％に達し、左向きにシフトし、拮抗的な組み合わせは右方向のシフトを示す。当量濃度はまた、ＣＩ_５０が組み合わせ曲線の絶対ＩＣ_５０に等しい、ＣＩ_５０（活性の５０％での組み合わせ指数）を計算するために使用される。ＣＩ_５０と一緒に、活性の様々なパーセンテージでの他のＣＩ（組み合わせインデックス）を計算できる（ＣＩ１０、ＣＩ２０、ＣＩ３０、ＣＩ４０、ＣＩ６０、ＣＩ７０、ＣＩ８０、ＣＩ９０）。ＣＩｎｎを計算するために、様々な活性パーセンテージでの当量濃度が計算される。各活性パーセンテージについて、９５％の信頼区間である許容誤差を計算し、この信頼区間を使用して、ＣＩへの許容誤差の加算として上限を計算し、ＣＩへの許容誤差の減算として下限を計算する。上限＝ＣＩ＋信頼区間９５％および下限＝ＣＩ−信頼区間９５％。これらの限度は、結果を解釈するために使用される。

各活性パーセンテージでの統計的解釈は次のとおりである。

各活性パーセンテージでの生物学的解釈は次のとおりである。

Ｉｎ ｖｉｖｏ組み合わせ研究
腫瘍の不均一性と内分泌療法に対する後天的な耐性のために、組み合わせ療法は、効果的な治療のため、または後天的な耐性を克服するために、ＥＲ陽性および進行／転移性乳癌治療に不可欠になっている。標的療法の組み合わせは、ＥＲ陽性乳癌を緩徐化する、あるいは停止させるのにより効果的である可能性があるとの仮説が立てられている。ＣＤＫ４／６阻害剤とフルベストラントの組み合わせは、ＥＲ陽性転移性乳癌の治療に承認されているが、ＥＳＲ１またはＰＩＫ３ＣＡの獲得変異により、高いパーセンテージの患者が耐性を発達させる。ＥＲαの強力な分解剤およびアンタゴニストとして、実施例１Ｂなどの経口ＳＥＲＤは、ＥＳＲ１変異体またはＰＩＫ３ＣＡ変異体の乳癌を単剤として、またはアベマシクリブなどのＣＤＫ４／６阻害剤、または化合物ＡなどのＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて緩徐化または停止させるのにより効果的である可能性がある。その文脈において、実施例１Ｂの化合物は、アベマシクリブ（特許参照）または化合物Ａ（特許参照）と組み合わせて腫瘍増殖阻害について試験される。より具体的には、実施例１Ｂの化合物は、ＥＳＲ１野生型およびＰＩＫ３Ｃａ変異体ＭＣＦ７乳癌異種移植モデルにおいて、アベマシクリブまたは化合物Ａと組み合わせて試験される。

培養中のヒト乳癌細胞ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２２）を増殖させ、採取して５×１０ｅ^６細胞を１：１ ＨＢＳＳ＋ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）溶液（２００μＬ）でメスのＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（２２〜２５ｇ、Ｅｎｖｉｇｏ ＲＭＳ，Ｉｎｃ）の右後部側面に皮下に注入する。細胞移植の２４時間前に、エストロゲンペレット（０．１８ｍｇ／ペレット、１７βエストラジオール、９０日放出、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を皮下に移植する。移植の７日後に開始して１週間に２回、腫瘍成長および体重を測定する。腫瘍の大きさが２５０〜３５０ｍｍ^３に達する時、動物を無作為化し、５匹の動物の群に分ける。適切なビヒクル（精製水中の１％ヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０／０．０５％消泡剤）で試験化合物、実施例１Ｂを調製し、４２日間強制経口投与する。ＣＤＫ４／６阻害剤（アベマシクリブ）は、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ２．０中の１％ＨＥＣで製剤化される。ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤（化合物Ａ）は、精製水中の１％ヒドロキシエチルセルロース／０．２５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０／０．０５％消泡剤で製剤化された。腫瘍応答は、処理過程中に週に２回行われる腫瘍体積測定によって決定される。腫瘍体積が測定されるときはいつでも、毒性の一般的な尺度として体重を取得する。腫瘍体積は、式：ｖ＝ｌｘｗ２ｘ０．５３５（式中、ｌ＝より大きい測定直径、ｗ＝より小さい垂直直径）を使用することで推定される。

統計分析
時間および処置群にわたる分散を等しくするために対数スケールにデータを変換して、腫瘍体積データの統計分析を始める。ＳＡＳソフトウェア（バージョン９．３）のＭＩＸＥＤ手順を用い、時間および処置による反復のある二元配置分散分析を用いて、対数体積データを分析する。反復測定の相関モデルはＳｐａｔｉａｌ Ｐｏｗｅｒである。各時点で処置群を対照群と比較する。各処置群について別々にＭＩＸＥＤ手順を使用して、各時点での調整された平均および標準誤差を計算する。両方の分析は、各動物内の自己相関、および大きな腫瘍を有する動物が早期に研究から除外されたときに生じたデータの消失を説明する。調整された平均および標準誤差（ｓ．ｅ．）は、各処置群について時間に対してプロットされる。腫瘍体積についての分析は、ｌｏｇ_１０およびｓｐａｔｉａｌ ｐｏｗｅｒ共分散構造に基づく。Ｐ値は、２つの特定の群間の比較に基づく。

併用分析方法（Ｂｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ＩＶＥＦ Ｓｔｕｄｉｅｓ）
第１に、通常の反復測定モデルは、群対時間に対する対数体積に適合する。次いで、コントラストステートメントを使用して、組み合わせられた２つの特定の処置を使用して、各時点での相互作用効果を試験する。これは、Ｂｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ法と同等であり、理論的には腫瘍体積がゼロに達する、すなわち完全に退縮することができると仮定する。併用について予想される付加応答（ＥＡＲ）は、ＥＡＲ体積＝Ｖ１＊Ｖ２／Ｖ０（式中、Ｖ０、Ｖ１、およびＶ２は、それぞれビヒクル対照、処置１単独、および処置２単独についての推定平均腫瘍体積である）として腫瘍体積スケールに基づいて計算される。相互作用試験が有意である場合、併用効果は、観察された併用の平均体積がＥＡＲ体積よりも小さいことに依存して統計的に付加を上回るか、または大きいことに依存して付加を下回ると宣言される。それ以外の場合、統計的結論は付加である。さらに、生物学的に関連性のある付加の範囲は、ＥＡＲ体積の上下Ｘ％として定義することができる。通常、Ｘは、２５〜４０％であろう。次いで、生物学的結論を、観察された併用の平均体積が、付加間隔の下、中、または上である場合に、付加を上回る、付加、または付加を下回る併用として行うことができる。

停滞が最も期待される応答である状況があってもよい。これらの状況では、Ｂｌｉｓｓ法を％デルタＴ／Ｃ値に直接適用してＥＡＲ％応答を得ることができ：ＥＡＲ％デルタＴ／Ｃ＝Ｙ１＊Ｙ２／１００、式中、Ｙ１およびＹ２は、単一薬剤処置についての％デルタＴ／Ｃ値である。現在、併用群における観察された％デルタＴ／ＣとＥＡＲとを比較するための統計的試験はないが、上記の生物学的基準を適用することができる。

表１５および１６に示されるように、実施例１Ｂまたはアベマシクリブ単独での単剤としての処理は、それぞれ３２％（％ｄＴ／Ｃ＝−３２）および５２％（％ｄＴ／Ｃ＝−５２）の腫瘍退縮をもたらし、両方ともビヒクル対照と比較して統計的に有意（ｐ＜０．００１）である。実施例１Ｂとアベマシクリブとの組み合わせ効果は「相加的未満」であるが、実施例１Ｂとアベマシクリブとの組み合わせ効果は、実施例１Ｂ単独よりも有意に優れていた（ｐ＜０．００１）。しかしながら、単剤アベマシクリブの有効性は、組み合わせから統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．０５５）。併用は、有意な体重損失のない動物において、許容される。

表１７および１８に示されるように、実施例１Ｂまたは化合物Ａ単独での単剤としての処理は、それぞれ３２％（％ｄＴ／Ｃ＝−３２）および３６％（％ｄＴ／Ｃ＝−３６）の腫瘍退縮をもたらし、両方ともビヒクル対照と比較して統計的に有意（ｐ＜０．００１）である。実施例１Ｂと化合物Ａとの組み合わせ効果は「相加的未満」であるが、実施例１Ｂと化合物Ａとの組み合わせ効果は、実施例１Ｂ単独（ｐ＜０．００１）または化合物Ａ単独（ｐ＝０．００２＊）よりも有意に優れていた。併用は、有意な体重損失のない動物において、許容される。

表１９および２０に示されるように、実施例１０またはアベマシクリブ単独での単剤としての処理は、それぞれ５１％（％ｄＴ／Ｃ＝−５１）および７０％（％ｄＴ／Ｃ＝−７０）の腫瘍退縮をもたらし、両方ともビヒクル対照と比較して統計的に有意（ｐ＜０．００１）である。実施例１０とアベマシクリブとの組み合わせ効果は「相加的未満」であるが、実施例１０とアベマシクリブとの組み合わせ効果は、実施例１０単独よりも有意に優れていた（ｐ＝０．０３９）。しかしながら、実施例１０とアベマシクリブとの組み合わせ効果は、アベマシクリブ単独と有意に異ならなかった（ｐ＝０．９０５）。併用は、有意な体重損失のない動物において、許容される。

表２１および２２に示されるように、実施例１０またはアルペリシブ単独での単剤としての処理は、それぞれ５１％（％ｄＴ／Ｃ＝−５１）および２１％（％ｄＴ／Ｃ＝−２１）の腫瘍退縮をもたらし、両方ともビヒクル対照と比較して統計的に有意（ｐ＜０．００１およびｐ＝０．０１３）である。実施例１０とアルペリシブとの組み合わせ効果は「相加的」であり、実施例１０とアルペリシブとの組み合わせ効果は、実施例１０単独よりも有意に優れていた（ｐ＝０．００９）。実施例１０とアルペリシブとの組み合わせ効果もまた、アルペリシブ単独よりも有意に優れていた（ｐ＝＜０．００１）。併用は、有意な体重損失のない動物において、許容される。

表２３および２４に示されるように、実施例１０またはエベロリムス単独での単剤としての処理は、それぞれ５１％（％ｄＴ／Ｃ＝−５１）および５０％（％ｄＴ／Ｃ＝−５０）の腫瘍退縮をもたらし、両方ともビヒクル対照と比較して統計的に有意（ｐ＜０．００１およびｐ＜０．００１）である。実施例１０とエベロリムスとの組み合わせ効果は「相加的」であり、実施例１０とエベロリムスとの組み合わせ効果は、実施例１０単独よりも有意に優れていた（ｐ＝０．００４）。実施例１０とアルペリシブとの組み合わせ効果もまた、エベロリムス単独よりも有意に優れていた（ｐ＝０．０４）。併用は、有意な体重損失のない動物において、許容される。

ラット経口バイオアベイラビリティ
以下のアッセイの目的は、試験化合物が経口で生物学的に利用可能かどうかを実証することである。

試験化合物をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、１ｍｇ／ｋｇ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液中の２０％ＣＡＰＴＩＳＯＬ（登録商標）、ｐＨ２適量、または２５％のＤＭＡ、１５％のＥｔＯＨ、１０％のプロピレングリコール、２５％の２−ピロリドン、および２５％の精製水のいずれかのビヒクルを使用）でＩＶで、３ｍｇ／ｋｇ（１％のヒドロキシエチルセルロース、０．２５％のポリソルベート８０、０．０５％の消泡剤１５１０−ＵＳ、および適量の精製水のビヒクルを使用）をＰＯで投与する。一連の血液試料を、ＩＶボーラス投与後０．０８、０．２５、０．５、１、２、４、８、および１２時間、ならびに経口投与後０．２５、０．５、１、２、４、８、および１２時間で採取する。ＥＤＴＡ凝固剤で処理した後、血漿を遠心分離により取得し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析するまで−７０℃で保存する。試験物質の濃度は、血漿中で決定し、非コンパートメント分析を使用して、ＩＶ群とＰＯ群の両方の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算するＷａｔｓｏｎ ＬＩＭＳ（商標）システムにアップロードする。次の式を使用して経口バイオアベイラビリティ（Ｆ％）を計算する。

実施例１Ｂの化合物は、上述のアッセイにおいて約５０％のＦ％値を示す。このアッセイは、実施例１Ｂが良好な経口バイオアベイラビリティを有することを実証している。

Claims (22)

1. 以下の式の化合物
   

   

   （式中、Ｒ^１またはＲ^２のいずれかは、独立して、Ｃｌ、Ｆ、−ＣＦ_３、または−ＣＨ_３から選択され、他方は、水素である）、
   またはその薬学的に許容される塩。
2. 前記化合物が、
   

   

   である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
3. 前記化合物が、
   

   

   である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
4. 前記化合物が、
   

   

   である、請求項２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
5. 前記薬学的に許容される塩が、ベンゼンスルホン酸塩である、請求項４に記載の化合物。
6. 前記薬学的に許容される塩が、４−メチルベンゼンスルホン酸塩である、請求項４に記載の化合物。
7. 前記化合物が、
   

   

   である、請求項４に記載の化合物。
8. 前記化合物が、
   

   

   である、請求項３に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
9. 前記薬学的に許容される塩が、ベンゼンスルホン酸塩である、請求項８に記載の化合物。
10. 前記薬学的に許容される塩が、４−メチルベンゼンスルホン酸塩である、請求項８に記載の化合物。
11. 前記化合物が、
    

    

    である、請求項８に記載の化合物。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と組み合わせて含む、薬学的組成物。
13. １つ以上の他の治療薬剤を含む、請求項１２に記載の薬学的組成物。
14. 乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、有効量の請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、または請求項１２〜１３のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
15. 前記乳癌が、ＥＲ陽性乳癌である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記胃癌が、ＥＲ陽性胃癌である、請求項１４に記載の方法。
17. 前記肺癌が、ＥＲ陽性肺癌である、請求項１４に記載の方法。
18. 治療における使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物もしくはその薬学的に許容可能な塩、または薬学的組成物。
19. 乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、子宮癌、胃癌、または肺癌の治療における使用のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
20. ＥＲ陽性乳癌の治療における、請求項１９に記載の使用のための化合物またはその塩。
21. ＥＲ陽性胃癌の治療における、請求項１９に記載の使用のための化合物またはその塩。
22. ＥＲ陽性肺癌の治療における、請求項１９に記載の使用のための化合物またはその塩。