本說明書中，所謂「胺基酸殘基」意指構成蛋白質之20種胺基酸殘基，即，丙胺酸(Ala或A)、精胺酸(Arg或R)、天冬醯胺(Asn或N)、天冬胺酸(Asp或D)、半胱胺酸(Cys或C)、麩醯胺(Gln或Q)、麩胺酸(Glu或E)、甘胺酸(Gly或G)、組胺酸(His或H)、異白胺酸(Ile或I)、白胺酸(Leu或L)、離胺酸(Lys或K)、甲硫胺酸(Met或M)、苯丙胺酸(Phe或F)、脯胺酸(Pro或P)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、色胺酸(Trp或W)、酪胺酸(Tyr或Y)及纈胺酸(Val或V)。 本說明書中，核苷酸序列或胺基酸序列間之同一性可藉由Lipman-Pearson法(Science, 1985, 227：1435-41)進行計算。具體而言，可藉由如下方式算出：使用遺傳資訊處理軟體Genetyx-Win(Ver.5.1.1；軟體開發)之同源性解析(Search homology)程式，將對照用單元大小(Unit size to compare)(ktup)設為2進行解析。 本說明書中，作為「1或複數個胺基酸缺失、經插入、置換或附加之胺基酸序列」，可列舉1個以上20個以下、較佳為1個以上10個以下、更佳為1個以上5個以下、進而較佳為1個以上3個以下之胺基酸缺失、經插入、置換或附加之胺基酸序列。又，本說明書中，作為「1或複數個核苷酸缺失、經插入、置換或附加之核苷酸序列」，可列舉1個以上60個以下、較佳為1個以上30個以下、更佳為1個以上15個以下、進而較佳為1個以上10個以下之核苷酸缺失、經插入、置換或附加之核苷酸序列。又，本說明書中，胺基酸或核苷酸之「附加」包括向序列之一末端及兩末端的1或複數個胺基酸或核苷酸之附加。 本說明書中，胺基酸序列或核苷酸序列上之「相當位置」可藉由使目標序列與參照序列(例如序列編號2所表示之胺基酸序列)以對各胺基酸序列或核苷酸序列中所存在之保守胺基酸殘基或核苷酸賦予最大之同源性之方式對準(alignment)而確定。對準可使用公知之演算法執行，其流程為業者公知。例如對準可基於上述Lipman-Pearson法等以人工作業進行，亦可藉由於缺省設定下採用Clustal W多重對準程式(Thompson, J.D.et al, 1994, Nucleic Acids Res, 22：4673-4680)進行。或者亦可使用作為Clustal W修訂版之Clustal W2或Clustal omega。Clustal W、Clustal W2及Clustal omega可利用例如歐洲生物資訊學研究所(European Bioinformatics Institute：EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])、或國立遺傳學研究所運營之日本DNA資料庫(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])之網站上之資源。 業者可進而對上述獲得之胺基酸序列之對準進行微調整以使之最佳化。此種最佳對準宜考慮到胺基酸序列之類似性或所插入間隙之頻度等而決定。此處，所謂胺基酸序列之類似性係指將2個胺基酸序列對準時該兩序列中存在同一或類似之胺基酸殘基之位置數相對於全長胺基酸殘基數的比率(%)。所謂類似之胺基酸殘基意指構成蛋白質之20種胺基酸中之如於極性或電荷方面具有相互類似之性質而會產生所謂保守性置換的胺基酸殘基。包含此種類似之胺基酸殘基之群組為業者周知，例如可列舉：精胺酸與離胺酸或麩醯胺、麩胺酸與天冬胺酸或麩醯胺、絲胺酸與蘇胺酸或丙胺酸、麩醯胺與天冬醯胺或精胺酸、白胺酸與異白胺酸等，但並不限定於該等。 藉由上述對準而和與參照序列之任意位置對應之位置對準的目標胺基酸序列之胺基酸殘基之位置被視為「相當於該任意位置之位置」，該胺基酸殘基被稱為「相當位置之胺基酸殘基」。 本說明書中，所謂突變聚核苷酸或多肽之「母」聚核苷酸或多肽係指藉由對該核苷酸或胺基酸殘基施加特定突變而會變為該突變聚核苷酸或多肽之聚核苷酸或多肽。 又，本說明書中，所謂控制區與基因之「能夠作動之連結」係指基因與控制區被以該基因能夠於該控制區之控制下進行表現之方式連結。基因與控制區之「能夠作動之連結」之流程為業者周知。 本說明書中，只要無特別限定，則有關基因之所謂「上游」及「下游」係指該基因之轉錄方向之上游及下游。 本說明書中，所謂「螯合劑」係指可與金屬離子配位鍵結之化合物。洗劑組合物中添加之螯合劑具有對洗滌用水或污漬中之鈣離子、鎂離子等會對清潔產生不良影響之金屬離子進行封阻的作用。作為添加於洗劑組合物中之螯合劑之例，可列舉：氮基三乙酸、亞胺基二乙酸、乙二胺乙酸、二伸乙基三胺五乙酸、二醇醚二胺四乙酸、羥乙基亞胺基二乙酸、三伸乙基四胺六乙酸、金龜胺酸等胺基聚乙酸或該等之鹽，二甘醇酸、氧二琥珀酸、羧基甲氧基琥珀酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、草酸、蘋果酸、氧二琥珀酸、葡萄糖酸、羧甲基琥珀酸、羧甲基酒石酸等有機酸或該等之鹽，胺基三(亞甲基膦酸)、1-羥基亞乙基-1,1-二膦酸、乙二胺四(亞甲基膦酸)、二伸乙基三胺五(亞甲基膦酸)、及該等之鹼金屬或低級胺鹽等。 本發明提供一種突變鹼性蛋白酶。本發明之突變鹼性蛋白酶相對於包含序列編號2所表示之胺基酸序列或與其具有至少95%之同一性之胺基酸序列的鹼性蛋白酶，包含相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之294位的位置之胺基酸殘基經置換之胺基酸序列。 作為本發明之突變鹼性蛋白酶之母鹼性蛋白酶，可列舉包含序列編號2所表示之胺基酸序列、或包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少95%之同一性之胺基酸序列，且相當於294位之位置之胺基酸殘基並非蘇胺酸的鹼性蛋白酶。作為包含序列編號2所表示之胺基酸序列的鹼性蛋白酶之例，可列舉源自KP43[桿菌屬(Bacillus sp.)KSM-KP43(FERM BP-6532)]之鹼性蛋白酶(參照專利文獻1)。 作為包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少95%之同一性之胺基酸序列的鹼性蛋白酶之例，可列舉與序列編號2所表示之胺基酸序列具有95%以上之同一性、較佳為96%以上之同一性、更佳為97%以上之同一性、進而較佳為98%以上之同一性、進而更佳為99%以上之同一性的鹼性蛋白酶。作為包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少95%之同一性之胺基酸序列的鹼性蛋白酶之另一例，可列舉包含相對於序列編號2所表示之胺基酸序列而有1或複數個胺基酸缺失、經插入、置換或附加之胺基酸序列的鹼性蛋白酶。 作為包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少95%之同一性之胺基酸序列的鹼性蛋白酶之另一例，可列舉：蛋白酶KP9860[源自桿菌屬KSM-KP9860(FERM BP-6534)，WO99/18218，GenBank accession no.AB046403]、及蛋白酶9865[源自桿菌屬KSM-9865(FERM P-18566)，GenBank accession no.AB084155]。 本發明中，用作母鹼性蛋白酶之包含與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少95%之同一性之胺基酸序列的鹼性蛋白酶亦可為源自包含序列編號2所表示之胺基酸序列的鹼性蛋白酶之突變鹼性蛋白酶。作為該突變鹼性蛋白酶之例，可列舉對源自上述KP-43株之鹼性蛋白酶施加日本專利5202690號公報、日本專利特開2002-218989號公報、日本專利特開2002-306176號公報、日本專利特開2004-000122號公報、日本專利特開2004-305176號公報、日本專利特開2006-129865號公報、日本專利特開2007-061101號公報、日本專利特開2008-212084號公報、日本專利特開2009-034062號公報、日本專利特開2010-273672號公報、日本專利特開2010-273673號公報、日本專利特開2012-228216號公報及日本專利特開2013-233141號公報所記載之突變中之1種以上所得的突變鹼性蛋白酶。 作為上述本發明中用作母鹼性蛋白酶之突變鹼性蛋白酶之較佳例，可列舉相對於序列編號2所表示之胺基酸序列而具有選自由以下之(a)～(ds)所組成之群中之1種以上之突變的突變鹼性蛋白酶， (a)將6位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、R、K、H、A、V、L、I、M、W或F； (b)將9位或相當於其之位置上之K置換為Q； (c)將11位或相當於其之位置上之D置換為G、S或N； (d)將15位或相當於其之位置上之S置換為H、C、Q、D、E、R、A、V、M、W或F； (e)將16位或相當於其之位置上之S置換為T、Q、V、C、Y、D、E、R、K、H、L、I、M、W或F； (f)將20位或相當於其之位置上之Y置換為F或A； (g)將22位或相當於其之位置上之Q置換為W； (h)將23位或相當於其之位置上之G置換為N； (i)將37位或相當於其之位置上之R置換為T； (j)將40位或相當於其之位置上之S置換為V、L、I、W或F； (k)將41位或相當於其之位置上之S置換為I； (l)將46位或相當於其之位置上之F置換為S、T、C、N、Q、Y、E、K、H、A、V、L、I、M或W； (m)將49位或相當於其之位置上之K置換為Q； (n)將52位或相當於其之位置上之A置換為G或S； (o)將53位或相當於其之位置上之L置換為A、V或I； (p)將54位或相當於其之位置上之Y置換為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、H、A、V、M、W、F或P； (q)將56位或相當於其之位置上之L置換為V； (r)將57位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P； (s)將59位或相當於其之位置上之T置換為V、L、I、M、W或F； (t)將60位或相當於其之位置上之N置換為V、L、I、W或F； (u)將63位或相當於其之位置上之N置換為S、D或L； (v)將65位或相當於其之位置上之T置換為W或P； (w)將66位或相當於其之位置上之N置換為G、S、T、C、Q、D、E、H、A、V、L、I、M或W； (x)將80位或相當於其之位置上之G置換為H或A； (y)將81位或相當於其之位置上之S置換為Q、Y、L、I、W或F； (z)將82位或相當於其之位置上之T置換為G、S、C、Q、D、E、R、K、H、A或M； (aa)將83位或相當於其之位置上之N置換為S、C或A； (ab)將84位或相當於其之位置上之K置換為R； (ac)將89位或相當於其之位置上之Q置換為H； (ad)將91位或相當於其之位置上之N置換為C； (ae)將100位或相當於其之位置上之S置換為L、I、W或F； (af)將101位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、N、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P； (ag)將102位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P； (ah)將103位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P； (ai)將104位或相當於其之位置上之L置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P； (aj)將105位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P； (ak)將106位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P； (al)將107位或相當於其之位置上之L置換為S、R、K或A； (am)將109位或相當於其之位置上之S置換為L、I或F； (an)將113位或相當於其之位置上之T置換為L或W； (ao)將119位或相當於其之位置上之Y置換為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、M、W、F或P； (ap)將120位或相當於其之位置上之S置換為Y、R、I、W或F； (aq)將124位或相當於其之位置上之R置換為K或A； (ar)將132位或相當於其之位置上之A置換為S、T、N、Q、D、I或M； (as)將133位或相當於其之位置上之A置換為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W、F或P； (at)將134位或相當於其之位置上之V置換為G、S、T或A； (au)向133位或相當於其之位置與134位或相當於其之位置之間插入G、S、T、N、Q、Y、R、K、H、A、L、I、M或W； (av)將135位或相當於其之位置上之N置換為R、A、L或M； (aw)將136位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P； (ax)將138位或相當於其之位置上之Y置換為G、S、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、M、W、F或P； (ay)將140位或相當於其之位置上之T置換為L、W或F； (az)將148位或相當於其之位置上之Y置換為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、M、W、F或P； (ba)將151位或相當於其之位置上之K置換為F； (bb)將163位或相當於其之位置上之E置換為S、T、N、Q、D、K、H、V、L、I或F； (bc)將166位或相當於其之位置上之N置換為G、V、L、I、W或F； (bd)將167位或相當於其之位置上之G置換為V； (be)將170位或相當於其之位置上之I置換為V或L； (bf)將171位或相當於其之位置上之S置換為G、T、E或A； (bg)將187位或相當於其之位置上之N置換為S； (bh)將191位或相當於其之位置上之S置換為V、L、I、W或F； (bi)將193位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P； (bj)將194位或相當於其之位置上之S置換為Y、R或K； (bk)將195位或相當於其之位置上之Y置換為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P； (bl)將200位或相當於其之位置上之N置換為W； (bm)將204位或相當於其之位置上之Q置換為S、T、C、N、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W或P； (bn)將205位或相當於其之位置上之F置換為S、T、C、N、Q、Y、E、K、H、A、V、L、I、M或W； (bo)將212位或相當於其之位置上之K置換為N、Q、R、V、L或W； (bp)將226位或相當於其之位置上之F置換為Y； (bq)將233位或相當於其之位置上之S置換為L、I或W； (br)將237位或相當於其之位置上之D置換為N； (bs)將238位或相當於其之位置上之S置換為L； (bt)將243位或相當於其之位置上之N置換為Y、L或I； (bu)將245位或相當於其之位置上之D置換為N； (bv)將246位或相當於其之位置上之S置換為Y、V、L、W或F； (bw)將247位或相當於其之位置上之K置換為S、T、C、N、Q、E、H、A、V、L、I、M、W或F； (bx)將248位或相當於其之位置上之Y置換為F； (by)將250位或相當於其之位置上之Y置換為F； (bz)將251位或相當於其之位置上之M置換為G、T、N、Q、D、A、V、L或I； (ca)將256位或相當於其之位置上之M置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、W、F或P； (cb)將257位或相當於其之位置上之A置換為V或I； (cc)將264位或相當於其之位置上之N置換為G、S、T、C、Q、D、E、A、V、L、I或M； (cd)將273位或相當於其之位置上之V置換為G、T或I； (ce)將275位或相當於其之位置上之N置換為L、W或F； (cf)將277位或相當於其之位置上之G置換為V、L、I或F； (cg)將281位或相當於其之位置上之K置換為R； (ch)將296位或相當於其之位置上之I置換為V； (ci)將297位或相當於其之位置上之G置換為L、W或F； (cj)將304位或相當於其之位置上之N置換為S； (ck)將313位或相當於其之位置上之D置換為N； (cl)將319位或相當於其之位置上之A置換為S、T、C、N、Q、Y、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W、F或P； (cm)將320位或相當於其之位置上之Y置換為G、T、V、L、I或F； (cn)將326位或相當於其之位置上之S置換為W； (co)將330位或相當於其之位置上之S置換為M、W或F； (cp)將332位或相當於其之位置上之K置換為G、T或V； (cq)將334位或相當於其之位置上之T置換為L； (cr)將335位或相當於其之位置上之Y置換為F； (cs)將337位或相當於其之位置上之F置換為G、S、T、C、Q、R、K、H、A或V； (ct)將342位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P； (cu)將343位或相當於其之位置上之K置換為T； (cv)將346位或相當於其之位置上之K置換為R； (cw)將357位或相當於其之位置上之S置換為L； (cx)將359位或相當於其之位置上之T置換為G、S、Q、V、L、I或F； (cy)將361位或相當於其之位置上之S置換為V、I或W； (cz)將369位或相當於其之位置上之D置換為N； (da)將376位或相當於其之位置上之N置換為W； (db)將378位或相當於其之位置上之T置換為L或W； (dc)將379位或相當於其之位置上之Q置換為D、E、R或K； (dd)將380位或相當於其之位置上之Y置換為F； (de)將385位或相當於其之位置上之F置換為Y、M或P； (df)將386位或相當於其之位置上之T置換為A、L、I或M； (dg)將387位或相當於其之位置上之S置換為G、較佳為Q、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W或F； (dh)將390位或相當於其之位置上之N置換為G、S、T、Y或F； (di)將393位或相當於其之位置上之W置換為Q； (dj)將396位或相當於其之位置上之R置換為G； (dk)將403位或相當於其之位置上之F置換為T或K； (dl)將405位或相當於其之位置上之N置換為D、V、L、I、W、F或P； (dm)將406位或相當於其之位置上之A置換為V、W或F； (dn)將407位或相當於其之位置上之P置換為G或C； (do)將408位或相當於其之位置上之Q置換為N、Y、I或W； (dp)將409位或相當於其之位置上之S置換為Y或W； (dq)將411位或相當於其之位置上之T置換為A、V、L或P； (dr)將427位或相當於其之位置上之T置換為R或V； (ds)將433位或相當於其之位置上之V置換為L。 上述(a)～(ds)之突變可單獨應用任一種，亦可將任兩種以上加以組合。作為較佳例，可列舉：該(ar)；該(as)、(at)及(au)之組合；該(bk)；該(cz)；該(v)、(cd)、(cx)及(dg)之組合；該(bc)及(bd)之組合；該(e)及(aa)之組合；該(j)、(s)、(y)、(bh)及(dl)之組合；該(e)、(v)、(aa)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)之組合；該(e)、(v)、(aa)、(ar)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)之組合；該(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)之組合；該(j)、(s)、(v)、(y)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bh)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)、(dg)及(dl)之組合；該(v)、(aa)、(ar)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)之組合；該(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)之組合；該(e)、(v)、(aa)、(bc)、(bd)、(bk)、(bm)、(cd)、(cl)、(cx)、(cz)及(dg)之組合；以及該(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bj)、(bk)、(bo)(cd)、(cx)、(cz)、(dc)及(dg)之組合。 較佳為於該本發明之突變體之母鹼性蛋白酶之胺基酸序列中，相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之30位的位置之胺基酸殘基為天冬胺酸，相當於68位的位置之胺基酸殘基為組胺酸，且相當於255位的位置之胺基酸殘基為絲胺酸。更佳為該本發明之突變體之母鹼性蛋白酶在相當於序列編號2所表示之胺基酸序列中之下述表1(i)所記載之各位置的位置具有表1(ii)所記載之胺基酸殘基。表1所示之胺基酸殘基為於上述例示之母鹼性蛋白酶間經高度保留之胺基酸殘基(Saeki等人, Journal of bioscience and Bioengineering, 2007, 103：501-508)。 [表1]
較佳為該本發明之突變體之母鹼性蛋白酶具有包含序列編號2所表示之胺基酸序列的鹼性蛋白酶(專利文獻1)所具有之下述酶學性質中之任一者：1)具有耐氧化劑性，於鹼性側(pH值8以上)作用，且較穩定。此處，所謂具有耐氧化劑性係指將該鹼性蛋白酶於50 mM過氧化氫(含5 mM氯化鈣)溶液中(20 mM伯瑞坦-羅比森(Britton-Robinson)緩衝液，pH值10)、於20℃下放置20分鐘後之殘存活性(合成基質法)為至少50%以上；2)於50℃、pH值10之條件下經10分鐘處理時表現出80%以上之殘存活性；3)可被二異丙基氟磷酸(DFP)及苯基甲烷磺醯氟(PMSF)抑制；4)基於SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)之分子量為43,000±2,000。更佳為該母鹼性蛋白酶具有上述1)～4)之各項酶學性質。 較佳為本發明之突變鹼性蛋白酶之母鹼性蛋白酶在相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之294位的位置具有丙胺酸。 作為該本發明之突變體之母鹼性蛋白酶之較佳例，可列舉包含序列編號2～11中之任一者所表示之胺基酸序列的鹼性蛋白酶。序列編號3、4、5、6、7、8、9、10及11所表示之胺基酸序列相對於序列編號2所表示之胺基酸序列而分別具有99.8%、97.7%、97.5%、97.5%、96.3%、97.7%、97.5%、97.2%及96.8%之同一性。再者，序列編號3～11所表示之胺基酸序列中之相當於序列編號2之294位丙胺酸的胺基酸殘基為294位丙胺酸(序列編號3～5、8、10)及295位丙胺酸(序列編號6～7、9、11)。 本發明之突變鹼性蛋白酶可藉由將上述母鹼性蛋白酶之胺基酸序列中相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之294位的位置之胺基酸殘基置換為蘇胺酸而製造。因此，於本發明之突變鹼性蛋白酶中，相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之294位的位置之胺基酸殘基為蘇胺酸。本發明之突變鹼性蛋白酶與其母鹼性蛋白酶相比，對螯合劑之穩定性得以提昇。因此，本發明之突變鹼性蛋白酶與其母鹼性蛋白酶相比，於含有螯合劑之液體、例如洗劑液中更穩定，其結果，可於該含有螯合劑之液體中保持更高之鹼性蛋白酶活性。 本發明之突變鹼性蛋白酶較佳為相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之294位的位置之胺基酸殘基為蘇胺酸，且與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少95%之序列同一性。本發明之突變鹼性蛋白酶更佳為與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少95%之序列同一性，相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之294位的位置之胺基酸殘基為蘇胺酸，相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之30位的位置之胺基酸殘基為天冬胺酸，相當於68位的位置之胺基酸殘基為組胺酸，且相當於255位的位置之胺基酸殘基為絲胺酸。 認為於上述母鹼性蛋白酶之間，相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之294位的位置之胺基酸殘基於該等蛋白質之三維結構中存在於與序列編號2所表示之鹼性蛋白酶之294位丙胺酸同等之位置。因此，推測母鹼性蛋白酶中之相當於該294位之位置上存在之胺基酸殘基之突變對該等之特異性功能產生相互類似之效果。 再者，於如上述(au)般對母鹼性蛋白酶插入有1個胺基酸殘基之情形時，該母鹼性蛋白酶之相當於序列編號2之134位以後之位置的位置位於與序列編號2相差1個殘基之下游。 本發明之突變鹼性蛋白酶除了相當於上述294位之位置上之突變以外，只要無損其於含有螯合劑之溶液中之穩定性提昇效果，則亦可相對於母鹼性蛋白酶而於其他之任意位置上具有突變(例如缺失、置換、附加、插入)。該突變可為天然產生者，亦可為人工導入者。 例如本發明之突變鹼性蛋白酶亦可具有選自由上述(a)～(ds)所示之置換後之胺基酸殘基所組成之群中之1種以上。例如本發明之突變鹼性蛋白酶可具有以下之胺基酸殘基：該(ar)所示之置換後之胺基酸殘基；該(as)、(at)及(au)所示之置換後之胺基酸殘基；該(bk)所示之置換後之胺基酸殘基；該(cz)所示之置換後之胺基酸殘基；該(v)、(cd)、(cx)及(dg)所示之置換後之胺基酸殘基；該(bc)及(bd)所示之置換後之胺基酸殘基；該(e)及(aa)所示之置換後之胺基酸殘基；該(j)、(s)、(y)、(bh)及(dl)所示之置換後之胺基酸殘基；該(e)、(v)、(aa)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)所示之置換後之胺基酸殘基；該(e)、(v)、(aa)、(ar)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)所示之置換後之胺基酸殘基；該(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)所示之置換後之胺基酸殘基；該(j)、(s)、(v)、(y)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bh)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)、(dg)及(dl)所示之置換後之胺基酸殘基；該(v)、(aa)、(ar)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)所示之置換後之胺基酸殘基；該(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)所示之置換後之胺基酸殘基；該(e)、(v)、(aa)、(bc)、(bd)、(bk)、(bm)、(cd)、(cl)、(cx)、(cz)及(dg)所示之置換後之胺基酸殘基；或該(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bj)、(bk)、(bo)(cd)、(cx)、(cz)、(dc)及(dg)所示之置換後之胺基酸殘基。該等突變鹼性蛋白酶可藉由於具有該(a)～(ds)所示之突變中之任一種以上的母鹼性蛋白酶中，將其相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之294位的位置之丙胺酸置換為蘇胺酸而獲得，或亦可藉由於序列編號2所表示之胺基酸序列之母鹼性蛋白酶中，導入A294T突變、以及該(a)～(ds)所示之突變中之任一種以上而獲得。 例如作為本發明之突變鹼性蛋白酶，可列舉：包含序列編號2～5、8、10中之任一者所表示之胺基酸序列的鹼性蛋白酶之A294T突變體、及包含序列編號6～7、9、11中之任一者所表示之胺基酸序列的鹼性蛋白酶之A295T突變體。 本發明中，作為使母鹼性蛋白酶之胺基酸殘基突變之方法，可採用該技術領域中公知之各種突變導入技術。例如於編碼母鹼性蛋白酶之胺基酸序列的聚核苷酸(以下亦稱為母基因)中，使編碼應突變之胺基酸殘基的核苷酸序列突變為編碼突變後之胺基酸殘基的核苷酸序列，進而由該突變基因表現蛋白質，藉此可獲得目標突變鹼性蛋白酶。 對母基因之目標突變之導入基本上例如可基於使用母基因作為模板DNA之PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)擴增或各種利用DNA聚合酶之複製反應，使用業者周知之各種定點突變導入法而進行。定點突變導入法可藉由例如反向PCR法或退火法等(村松等編，「修訂第4版 新基因工學手冊」，羊土社，p82-88)任意方法進行。亦可使用Stratagene公司之QuickChange II定點突變套組(Site-Directed Mutagenesis Kit)、或QuickChange多點突變套組(Multi Site-Directed Mutagenesis Kit)等各種市售之定點突變導入用套組。 對母基因之定點突變導入最為普遍的是可使用包含應導入之核苷酸突變之突變用引子而進行。該突變用引子只要以如下方式設計即可：於母基因中之包含編碼應突變之胺基酸殘基之核苷酸序列的區域進行退火，且包含具有編碼突變後之胺基酸殘基之核苷酸序列(密碼子)代替該編碼應突變之胺基酸殘基之核苷酸序列(密碼子)的核苷酸序列。編碼突變前及突變後之胺基酸殘基之核苷酸序列(密碼子)可由業者根據通常之教科書等適當辨識選擇。又，定點突變導入亦可採用如下方法：藉由SOE(splicing by overlap extension，重疊延伸拼接)-PCR(Horton et al, Gene, 1989, 77(1)：p61-68)，將分開使用包含應導入之核苷酸突變之2個互補引子而分別使突變部位之上游側及下游側得到擴增的DNA片段連結為一整體。 包含母基因之模板DNA可藉由如下方式製備：自上述桿菌屬KSM-KP43(FERM BP-6532)、桿菌屬KSM-KP9860(FERM BP-6534)、桿菌屬KSM-9865(FERM P-18566)等菌、或該等之突變株，利用常規方法萃取基因組DNA，或者萃取RNA並利用逆轉錄合成cDNA。或可基於母鹼性蛋白酶之胺基酸序列，化學合成與之對應的核苷酸序列而用作模板DNA。 自該桿菌屬菌株之基因組DNA之製備可採用例如Pitcher et al, Lett Appl Microbiol, 1989, 8：151-156所記載之方法等進行。包含母基因之模板DNA可以於任意載體中插入有所製備之cDNA、或自基因組DNA切出之包含母基因之DNA片段的形式製備。 突變用引子可藉由亞磷醯胺法(Nucleic Acids Research, 1989, 17：7059-7071)等周知之寡核苷酸合成法製作。此種引子合成亦可使用例如市售之寡核苷酸合成裝置(ABI公司製造等)實施。使用包含該突變用引子之引物盒，以母基因作為模板DNA進行如上所述之定點突變導入，藉此可獲得導入有目標突變之突變鹼性蛋白酶基因。 因此，本發明亦提供一種突變鹼性蛋白酶基因。本發明之突變鹼性蛋白酶基因係編碼該本發明之突變鹼性蛋白酶之聚核苷酸。該本發明之聚核苷酸可能包含單鏈或雙鏈之DNA、cDNA、RNA或其他人工核酸。該DNA、cDNA及RNA可化學合成。又，該本發明之聚核苷酸可包含開放閱讀框架(ORF)、以及非轉譯區(UTR)之核苷酸序列。 本發明亦提供一種含有編碼該本發明之突變鹼性蛋白酶之聚核苷酸的載體。該載體可藉由將該本發明之聚核苷酸以常規方法插入連結至任意載體中而製作。該載體之種類並無特別限定，可為質體、噬菌體、噬菌體質體(phagemid)、黏接質體、病毒、YAC(Yeast artificial chromosomes，酵母人工染色體)載體、穿梭載體等任意載體。又，該載體雖無限定，但較佳為能夠於細菌內、尤其是桿菌屬細菌內擴增之載體，更佳為能夠於桿菌屬細菌內誘導表現所導入基因之表現載體。其中，作為於桿菌屬細菌與其他生物中均能夠複製之載體的穿梭載體可較佳地用於本發明之突變鹼性蛋白酶之重組生產。較佳載體之例並無限定，可列舉：pHA3040SP64、pHSP64R或pASP64(日本專利第3492935號)、pHY300PLK(能夠將大腸菌與枯草菌兩者進行轉形之表現載體；Ishikawa and Shibahara, Jpn J Genet, 1985, 60：235-243)、pAC3(Moriyama et al, Nucleic Acids Res, 1988, 16：8732)等穿梭載體；pUB110(Gryczan et al, J Bacteriol, 1978, 134：318-329)、pTA10607(Bron et al, Plasmid, 1987, 18：8-15)等能夠用於桿菌屬細菌之轉形的質體；能夠對重組蛋白質賦予分泌訊號之分泌載體(山根等人，「基於枯草菌分泌載體之融合蛋白質」澱粉科學，34.(1987)，163-170)等。又，亦可使用源自大腸菌之質體(例如pET22b(＋)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)。 於重組生產本發明之突變鹼性蛋白酶之情形時，該載體較佳為表現載體。表現載體視需要可包含轉錄啟動子、終止子、核糖體結合部位等於宿主生物中進行表現所必須之各種元件(element)；多酶切點接頭、促進子等順式元件；聚A附加訊號；核糖體結合序列(SD序列)；藥劑(例如安比西林、新黴素、康黴素、四環素、氯黴素等)耐性基因等選擇標記基因等有用之序列。 本發明亦提供一種包含編碼本發明之突變鹼性蛋白酶之聚核苷酸或含有其之載體的轉形體。該轉形體可藉由對宿主導入編碼本發明之突變鹼性蛋白酶之聚核苷酸、或含有其之載體(較佳為重組表現載體)而製造。 作為該轉形體之宿主，可列舉：以大腸菌或枯草菌等細菌、酵母細胞為代表之微生物、以及昆蟲細胞、動物細胞(例如哺乳動物細胞)、植物細胞等任意細胞。該宿主較佳為桿菌屬細菌，更佳為枯草菌或其突變株。因此，本發明之轉形體為重組桿菌屬細菌，更佳為枯草菌或其突變株之重組體。 宿主之轉形可應用例如磷酸鈣法、電穿孔法、脂轉染法、基因槍法、PEG(polyethylene glycol，聚乙二醇)法等周知之轉形技術。例如作為可應用於桿菌屬細菌之轉形法，可列舉：勝任細胞轉形法(J Bacteriol, 1967, 93：1925-1937)、電穿孔法(Brigidi et al, FEMS Microbiol Lett, 1990, 55：135-138)、原生質體轉形法(Chang and Cohen, Mol Gen Genet, 1979, 168：111-115)、Tris-PEG法(Takahashi et al, J Bacteriol, 1983, 156：1130-1134)等。 藉由培養該本發明之轉形體而可製造本發明之突變鹼性蛋白酶。因此，本發明亦提供一種使用本發明之轉形體的突變鹼性蛋白酶之製造方法。用於突變鹼性蛋白酶製造之該轉形體之培養可依據業者常見之方法進行。例如作為對基於大腸菌或酵母細胞等微生物宿主之轉形體進行培養的培養基，只要含有該微生物宿主能夠合成代謝之碳源、氮源、無機鹽類等，而有效率地進行轉形體之培養的培養基即可。該培養基可使用天然培養基及合成培養基之任意者。例如用以生產重組蛋白質之枯草菌轉形體之培養可使用LB(Lysogeny broth，溶菌肉湯)培養基、2×YT(Yeast Extract Tryptone，酵母抽提物胰化蛋白腖)培養基、2×L-麥芽糖培養基、或CSL(corn steep liquor，玉米漿)醱酵培養基等。亦可對該培養基添加與轉形體中所導入之薬劑耐性基因(選擇標記基因)之種類對應的薬劑。又，於對已藉由使用誘導性啟動子之表現載體而實現轉形之微生物進行培養之情形時，視需要可於培養基中添加誘導體。例如於對已藉由使用Lac啟動子之表現載體而實現轉形之微生物進行培養時，可於培養基中添加異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)等，於對已藉由使用trp啟動子之表現載體而實現轉形之微生物進行培養時，可於培養基中添加吲哚乙酸(IAA)等。 本發明之突變鹼性蛋白酶或可使用無細胞轉譯系統，由編碼本發明之突變鹼性蛋白酶之聚核苷酸或其轉錄產物進行表現。所謂「無細胞轉譯系統」係指對機械地破壞成為宿主之細胞而得之懸浮液添加蛋白質之轉譯所需之胺基酸等試劑，而構成體外(in vitro)轉錄轉譯系統或體外轉譯系統。 利用該轉形體或無細胞轉譯系統所製造之本發明之突變鹼性蛋白酶可藉由單獨地或適當組合使用常用之蛋白質純化方法，例如離心分離、硫酸銨沈澱、凝膠層析法、離子交換層析法、親和層析法等，自培養液、細胞破碎液、無細胞轉譯系統之反應液等取得。或可將使用離心分離或超濾型過濾器等而經分離或濃縮之培養上清液或溶菌液上清液等溶液直接以粗酶液之形式使用。於所表現出之突變鹼性蛋白酶並非自細胞內分泌之情形時，將該細胞破碎後進行蛋白質之分離純化即可。 本發明中所用之mRNA之製備、cDNA之製作、PCR、RT-PCR、基因庫之製作、向載體中之接合、細胞之轉形、DNA之鹼基序列之確定、核酸化學合成、蛋白質之N末端側之胺基酸序列確定、突變誘發、蛋白質之萃取等實驗可藉由通常之實驗書中記載之方法進行。作為此種實驗書，例如可列舉Sambrook等人之Molecular Cloning, A laboratory manual, 2001, 3rd Ed., Sambrook, J.＆ Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Press。進而，關於枯草菌之基因重組實驗，可參照有關枯草菌之基因操作之常用實驗書，例如吉川博文 著“7.2 枯草菌系”「續生化學實驗講座1.基因研究法II」，1986，東京化學同人社(東京)，p150-169等。 藉由本發明之製造方法所獲得之突變鹼性蛋白酶與母鹼性蛋白酶相比，對螯合劑之穩定性得以提昇，可更具穩定性地存在於含有螯合劑之液體、較佳為液體洗劑中，因此，本發明之另一態樣可為一種鹼性蛋白酶之對螯合劑之穩定性提昇方法，其包括對上述母鹼性蛋白酶之胺基酸序列中相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之294位的位置之胺基酸殘基進行置換。 本發明之突變鹼性蛋白酶由於對螯合劑之穩定性較高，故而可用作洗劑調配用酶。含有本發明之突變鹼性蛋白酶之洗劑能夠維持較先前更高之蛋白酶活性，結果可發揮更強力之酶清潔力。因此，本發明亦提供一種含有本發明之突變鹼性蛋白酶之洗劑組合物。該洗劑組合物可為粉末洗劑組合物，但較佳為液體洗劑組合物。 本發明之洗劑組合物含有螯合劑。本發明之洗劑組合物可含有之螯合劑之例參照上文所列舉者。本發明之洗劑組合物中之螯合劑之含量較佳為0.1～5質量%、更佳為0.1～4質量%。 本發明之洗劑組合物中之本發明之突變鹼性蛋白酶之含量只要為鹼性蛋白酶顯示活性之量，則並無特別限制，相對於每1 kg洗劑組合物，較佳為0.1～25000 U，更佳為0.1～5000 U，進而較佳為0.1～2500 U。再者，鹼性蛋白酶之活性(U)係藉由以下方法測定：取1/15 M磷酸緩衝液(pH值7.4)0.9 mL、40 mM Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-對硝基醯替苯胺/二甲基亞碸溶液0.05 mL置於試驗管內，於30℃下保溫5分鐘。於其中添加酶液0.05 mL，於30℃下進行10分鐘之反應後，添加5%(w/v)檸檬酸水溶液2.0 mL而停止反應，使用分光光度計測定420 nm下之吸光度。此處，酶1單位(U)係設為於上述反應中1分鐘內能夠生成1 μmol對硝基苯胺之量。 本發明之洗劑組合物中除本發明之突變鹼性蛋白酶以外亦含有界面活性劑及水。作為界面活性劑，可單獨使用陰離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑、兩性界面活性劑、及陽離子性界面活性劑等任意之界面活性劑中之1種或將2種以上組合使用。本發明之洗劑組合物中之該界面活性劑之含量較佳為10～80質量%、更佳為30～70質量%。 作為非離子性界面活性劑，只要為液體洗劑中通常所調配之具有C8～C22之烴基、且加成有數莫耳以上之C2氧伸烷基的非離子性界面活性劑即可，例如可列舉以下者： R
1
O-(AO)m-H(R
1
＝C8-C22烴、AO＝C2-C5氧伸烷基、m＝16～35)[日本專利特開2010-275468號公報]； R
1
O-(EO)l-(AO)m-(EO)n-H(R
1
＝C8-C18烴、EO＝C2氧伸烷基、AO＝C3-C5氧伸烷基、l＝3～30、m＝1～5、l＋n＝14～50)[日本專利特開2010-265445號公報、日本專利特開2011-63784號公報]； R
1
O-(EO)m/(AO)n-H(R
1
＝C8-C22烴、EO＝C2氧伸烷基、AO＝C3-C5氧伸烷基、m＝10～30、n＝0～5、EO與AO為無規或嵌段鍵結)[日本專利特開2010-189551號公報]； R
1
(CO)lO-(EO)m/(AO)n-R
2
(R
1
＝C8-C22烴、EO＝C2氧伸烷基、AO＝C3-C5氧伸烷基、l＝0～1、m＝14～50、n＝1～5、R
2
＝氫(l＝0)或C1-C3烷基、EO與AO為無規或嵌段鍵結)[日本專利特開2010-229385號公報]； R
1
O-(EO)m-(AO)n-H(R
1
＝C8-C22烴、EO＝C2氧伸烷基、AO＝C3-C5氧伸烷基、m＝15～30、n＝1～5)[日本專利特開2010-229387號公報]； R
1
O-(AO)m/(Gly)n-H及/或R
2
-COO-(AO)p/(Gly)q-H(R
1
＝C8-C22烴基、R
2
＝C7-C21烴基、AO＝C2-C3氧伸烷基、Gly＝甘油基、m＝0～5、n＝2～10、p＝0～5、q＝2～10、AO與Gly為無規或嵌段鍵結)[日本專利特開2010-254881號公報]； R
1
-COO-(PO)m/(EO)n-R
2
(R
1
＝C7-C21烴基、COO＝羰氧基、R
2
＝C1-C3烷基、PO＝氧丙烯基、EO＝氧乙烯基、m＝0.3～5、n＝8～25、PO與EO為無規或嵌段鍵結)[日本專利特開2010-265333號公報]； R
1
O-(EO)l-(PO)m-(EO)n-H(R
1
＝C8-C20烴、EO＝C2氧伸烷基、PO＝氧丙烯基、l＞＝1、n＞＝1、0＜m＜l＋n、EO與PO為嵌段鍵結)[WO98/24865]； R
1
O-(EO)m-(PO)n-H(R
1
＝C10-C16之烷基或烯基、EO＝環氧乙烷基、PO＝環氧丙烷基、m＝5～15、n＝1～3)[日本專利特開平8-157867號公報]； R
1
(CO)-(EO)m-OR
2
(R
1
＝C11-C13直鏈或支鏈狀烷基或烯基、R
2
＝C1-C3烷基、EO＝環氧乙烷基、m＝10～20)[日本專利特開2008-7706號公報、日本專利特開2009-7451號公報、日本專利特開2009-155594號公報、日本專利特開2009-155606號公報]； R
1
(CO)-(AO)m-OR
2
(R
1
＝C9-C13直鏈或支鏈狀烷基或烯基、AO＝C2-C4氧伸烷基、R
2
＝C1-C3烷基、m＝5～30)[日本專利特開2009-144002號公報、日本專利特開2009-173858號公報、日本專利特開2010-189612號公報]；以及 脂肪酸烷醇醯胺、脂肪酸烷醇葡糖醯胺、烷基聚葡糖苷等。 作為陰離子界面活性劑，例如可列舉：羧酸酯型陰離子界面活性劑、磺酸型或硫酸酯型陰離子界面活性劑、非皂系陰離子界面活性劑、直鏈烷基苯磺酸、苯磺酸或其鹽、聚氧苯磺酸或其鹽、聚氧乙烯烷基硫酸酯鹽、聚氧伸烷基烷基醚硫酸酯鹽、α-烯烴磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽、α-磺基脂肪酸鹽、脂肪酸皂、磷酸酯鹽系界面活性劑、醯基丙胺酸鹽、醯基牛磺酸鹽、烷基醚羧酸、醇硫酸酯等。 作為陽離子界面活性劑，例如可列舉：具有長鏈烷基之四級銨鹽、具有1個長鏈烷基之三級胺、烷基三甲基銨鹽、二烷基二甲基銨鹽、烷基吡啶鎓鹽等。可較佳地列舉：具有1個碳數8～22之長鏈烷基之四級銨型界面活性劑、具有1個碳數8～22之長鏈烷基之三級胺。 作為兩性離子活性劑，例如可列舉：烷基乙酸甜菜鹼、烷醇醯胺丙基乙酸甜菜鹼、烷基咪唑啉、烷基丙胺酸等烷基甜菜鹼型、烷基醯胺甜菜鹼型、咪唑啉型、烷基胺基碸型、烷基胺基羧酸型、烷基醯胺羧酸型、醯胺胺基酸型或磷酸型之兩性界面活性劑等。可較佳地列舉具有碳數10～18之烷基之磺基甜菜鹼或羰基甜菜鹼。 本發明之洗劑組合物中可進而含有洗劑組合物通常使用之成分，例如水溶性聚合物、水混合性有機溶劑、鹼劑、有機酸或其鹽、本發明之突變鹼性蛋白酶以外之其他酶、酶穩定劑、螢光劑、防再污染劑、分散劑、防移染劑、整理劑、過氧化氫等漂白劑、抗氧化劑、助溶劑、pH調整劑、緩衝劑、防腐劑、香料、鹽、醇、糖類等。 作為水溶性聚合物，例如可列舉：具有(i)包含源自碳數2～5之環氧化物之聚合單元而構成之聚醚鏈部分與(ii)包含源自選自丙烯酸、甲基丙烯酸及順丁烯二酸中之一種以上之不飽和羧酸單體的聚合單元而構成之聚合物鏈部分，(i)或(ii)之任一者為主幹鏈、另一者為分支鏈之具有接枝結構之高分子化合物(日本專利特開2010-275468號公報、日本專利特開平10-060496號公報)；具有伸烷基對苯二甲酸酯單元及/或伸烷基間苯二甲酸酯單元、與氧伸烷基單元及/或聚氧伸烷基單元之水溶性聚合物(日本專利特開2009-155606號公報)等。本發明之洗劑組合物中之該水溶性聚合物之含量較佳為0.2～10質量%、更佳為0.4～5質量%。 作為水混合性有機溶劑，例如可列舉：烷醇類之伸烷基二醇類或甘油、聚伸烷基二醇類、(聚)伸烷基二醇(單或二)烷基醚類、烷基甘油醚類、(聚)伸烷基二醇之芳香族醚類。較佳為乙二醇、丙二醇、丁二醇、或己二醇等碳數2～6之伸烷基二醇類或甘油、或聚乙二醇單苯醚、乙二醇單苄醚、二乙二醇單苄醚等。本發明之洗劑組合物中之該水混合性有機溶劑之含量較佳為1～40質量%、更佳為1～35質量%。 作為鹼劑，例如作為具有1～3個C2-C4之烷醇之烷醇胺，可列舉：單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、聚氧伸烷基胺、二甲胺基丙基胺等。較佳為單乙醇胺、三乙醇胺。本發明之洗劑組合物中之該鹼劑之含量較佳為0～20質量%、更佳為0～10質量%。 作為有機酸或其鹽，例如可列舉：飽和脂肪酸、琥珀酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、或該等之鹽等多元羧酸類，檸檬酸、蘋果酸、乙醇酸、對羥基苯甲酸、苯甲酸、或該等之鹽等羥基羧酸類等；其中，較佳為檸檬酸或其鹽。本發明之洗劑組合物中之該有機酸或其鹽之含量較佳為0～5質量%、更佳為0～3質量%。 作為防再污染劑及分散劑，例如可列舉：聚丙烯酸、聚順丁烯二酸、羧甲基纖維素、重量平均分子量5000以上之聚乙二醇、順丁烯二酸酐-二異丁烯共聚物、順丁烯二酸酐-甲基乙烯醚共聚物、順丁烯二酸酐-乙酸乙烯酯共聚物、萘磺酸鹽福馬林縮合物、及日本專利特開昭59-62614號公報之技術方案1～21(第1頁第3欄第5行～第3頁第4欄第14行)記載之聚合物等防再污染劑及分散劑，但不適於調配之情形時可除外。 作為防移染劑，例如可列舉聚乙烯吡咯啶酮，含量較佳為0.01～10質量%。 作為漂白劑，較佳為使該洗劑組合物中含有1～10質量%之例如過氧化氫、過碳酸鹽、過硼酸鹽等漂白劑。於使用漂白劑時，可使該洗劑組合物中含有0.01～10質量%之四乙醯乙二胺(TAED)或日本專利特開平6-316700號公報記載等漂白活化劑(activator)。 作為螢光劑，例如可列舉聯苯型螢光劑(Tinopal CBS-X等)或茋型螢光劑(DM型螢光染料等)。本發明之洗劑組合物中之該螢光劑之含量較佳為0.001～2質量。 作為本發明之突變鹼性蛋白酶以外之其他酶，例如可列舉：其他蛋白酶、纖維素酶、β-葡聚醣酶、半纖維素酶、脂肪酶、過氧化酶、蟲漆酶、α-澱粉酶、葡糖澱粉酶、角質酶(cutinase)、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質素酶、聚三葡萄糖酶、果膠酸酶、木葡聚糖酶(Xyloglucanase)、木聚糖酶、果膠乙醯酯酶、聚半乳醣醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果膠解離酶、甘露醇分解酶、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶(Cellobiohydrolase)、及轉麩胺醯胺酶等水解酶、以及該等之2種以上之混合物。 作為酶穩定劑，例如可列舉：硼化合物、鈣離子源(供給鈣離子之化合物)、羥基化合物、甲酸等，作為抗氧化劑，可列舉：丁基羥基甲苯、二苯乙烯化甲酚、亞硫酸鈉及亞硫酸氫鈉等，作為助溶劑，可列舉：對甲苯磺酸、異丙苯磺酸、間二甲苯磺酸、苯甲酸鹽(亦具有作為防腐劑之效果)等。進而，本發明之洗劑組合物中亦可含有辛烷、癸烷、十二烷、十三烷等石蠟類、癸烯、十二烯等烯烴類、二氯甲烷、1,1,1-三氯乙烷等鹵化烷基類、D-檸檬烯等萜烯類等之水非混合性有機溶劑、色素、香料、抗菌防腐劑、矽酮等消泡劑等。 作為可調配本發明之突變鹼性蛋白酶之洗劑組合物之較佳例，可列舉：日本專利特開2010-265333號公報、日本專利特開2014-141662號公報、日本專利特開2009-191128號公報、日本專利特開2012-224652號公報、日本專利特表2013-503950號公報、日本專利特表平11-512768號公報之實施例中記載之液體洗劑組合物。例如藉由對日本專利特開2014-141662號公報之實施例4所記載之液體洗劑組合物[調配有界面活性劑30%(陰離子界面活性劑20%、非離子界面活性劑10%)、檸檬酸3%、具有羥基之有機溶劑(二乙二醇單丁醚)18%、使組合物之pH值成為8.0所需之鹼劑(單乙醇胺)、離子交換水、及香料等的組合物]調配本發明之突變鹼性蛋白酶而可製備本發明之洗劑組合物。 本發明之洗劑組合物之用途並無限定，較佳為衣物或布製品(床單、窗簾、地毯、壁紙等)之清潔用。本發明之洗劑組合物由於可穩定地保持本發明之突變鹼性蛋白酶，故而可發揮較高之酶清潔力。 本發明之例示之實施形態亦包括以下之物質、製造方法、用途、方法等。但本發明並不限定於該等實施形態。 [1]一種突變鹼性蛋白酶，其包含如下胺基酸序列，該胺基酸序列係於序列編號2所表示之胺基酸序列或與其具有至少95%之同一性之胺基酸序列中，相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之294位的位置之胺基酸殘基被置換為蘇胺酸者。 [2]如[1]記載之突變鹼性蛋白酶，其較佳為上述序列編號2所表示之胺基酸序列或與其具有至少95%之同一性之胺基酸序列在相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之294位的位置具有丙胺酸。 [3]如[1]或[2]記載之突變鹼性蛋白酶，其較佳為上述與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少95%之同一性之胺基酸序列為蛋白酶KP9860或蛋白酶9865之胺基酸序列。 [4]如[1]至[3]中任一項記載之突變鹼性蛋白酶，其中上述與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少95%之同一性之胺基酸序列 (i)較佳為具有選自由以下之(a')～(ds')所組成之群中之1種以上之胺基酸殘基： (a')序列編號2所表示之胺基酸序列之6位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、Q、Y、R、K、H、A、V、L、I、M、W或F， (b')序列編號2所表示之胺基酸序列之9位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為Q， (c')序列編號2所表示之胺基酸序列之11位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、S或N， (d')序列編號2所表示之胺基酸序列之15位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為H、C、Q、D、E、R、A、V、M、W或F， (e')序列編號2所表示之胺基酸序列之16位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為T、Q、V、C、Y、D、E、R、K、H、L、I、M、W或F， (f')序列編號2所表示之胺基酸序列之20位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為F或A， (g')序列編號2所表示之胺基酸序列之22位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為W， (h')序列編號2所表示之胺基酸序列之23位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為N， (i')序列編號2所表示之胺基酸序列之37位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為T， (j')序列編號2所表示之胺基酸序列之40位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為V、L、I、W或F， (k')序列編號2所表示之胺基酸序列之41位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為I， (l')序列編號2所表示之胺基酸序列之46位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、N、Q、Y、E、K、H、A、V、L、I、M或W， (m')序列編號2所表示之胺基酸序列之49位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為Q， (n')序列編號2所表示之胺基酸序列之52位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G或S， (o')序列編號2所表示之胺基酸序列之53位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為A、V或I， (p')序列編號2所表示之胺基酸序列之54位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、H、A、V、M、W、F或P， (q')序列編號2所表示之胺基酸序列之56位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為V， (r')序列編號2所表示之胺基酸序列之57位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、Q、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (s')序列編號2所表示之胺基酸序列之59位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為V、L、I、M、W或F， (t')序列編號2所表示之胺基酸序列之60位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為V、L、I、W或F， (u')序列編號2所表示之胺基酸序列之63位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、D或L， (v')序列編號2所表示之胺基酸序列之65位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為W或P， (w')序列編號2所表示之胺基酸序列之66位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、S、T、C、Q、D、E、H、A、V、L、I、M或W， (x')序列編號2所表示之胺基酸序列之80位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為H或A， (y')序列編號2所表示之胺基酸序列之81位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為Q、Y、L、I、W或F， (z')序列編號2所表示之胺基酸序列之82位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、S、C、Q、D、E、R、K、H、A或M， (aa')序列編號2所表示之胺基酸序列之83位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、C或A， (ab')序列編號2所表示之胺基酸序列之84位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為R， (ac')序列編號2所表示之胺基酸序列之89位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為H， (ad')序列編號2所表示之胺基酸序列之91位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為C， (ae')序列編號2所表示之胺基酸序列之100位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為L、I、W或F， (af')序列編號2所表示之胺基酸序列之101位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、N、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (ag')序列編號2所表示之胺基酸序列之102位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (ah')序列編號2所表示之胺基酸序列之103位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (ai')序列編號2所表示之胺基酸序列之104位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (aj')序列編號2所表示之胺基酸序列之105位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (ak')序列編號2所表示之胺基酸序列之106位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (al')序列編號2所表示之胺基酸序列之107位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、R、K或A， (am')序列編號2所表示之胺基酸序列之109位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為L、I或F， (an')序列編號2所表示之胺基酸序列之113位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為L或W， (ao')序列編號2所表示之胺基酸序列之119位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、M、W、F或P， (ap')序列編號2所表示之胺基酸序列之120位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為Y、R、I、W或F， (aq')序列編號2所表示之胺基酸序列之124位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為K或A， (ar')序列編號2所表示之胺基酸序列之132位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、N、Q、D、I或M， (as')序列編號2所表示之胺基酸序列之133位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W、F或P， (at')序列編號2所表示之胺基酸序列之134位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、S、T或A， (au')序列編號2所表示之胺基酸序列之133位或相當於其之位置與134位或相當於其之位置之間的胺基酸殘基為G、S、T、N、Q、Y、R、K、H、A、L、I、M或W， (av')序列編號2所表示之胺基酸序列之135位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為R、A、L或M， (aw')序列編號2所表示之胺基酸序列之136位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (ax')序列編號2所表示之胺基酸序列之138位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、S、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、M、W、F或， (ay')序列編號2所表示之胺基酸序列之140位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為L、W或F， (az')序列編號2所表示之胺基酸序列之148位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、M、W、F或P， (ba')序列編號2所表示之胺基酸序列之151位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為F， (bb')序列編號2所表示之胺基酸序列之163位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、N、Q、D、K、H、V、L、I或F， (bc')序列編號2所表示之胺基酸序列之166位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、V、L、I、W或F， (bd')序列編號2所表示之胺基酸序列之167位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為V， (be')序列編號2所表示之胺基酸序列之170位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為V或L， (bf')序列編號2所表示之胺基酸序列之171位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、T、E或A， (bg')序列編號2所表示之胺基酸序列之187位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S， (bh')序列編號2所表示之胺基酸序列之191位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為V、L、I、W或F， (bi')序列編號2所表示之胺基酸序列之193位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (bj')序列編號2所表示之胺基酸序列之194位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為Y、R或K， (bk')序列編號2所表示之胺基酸序列之195位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (bl')序列編號2所表示之胺基酸序列之200位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為W， (bm')序列編號2所表示之胺基酸序列之204位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、N、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W或P， (bn')序列編號2所表示之胺基酸序列之205位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、N、Q、Y、E、K、H、A、V、L、I、M或W， (bo')序列編號2所表示之胺基酸序列之212位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為N、Q、R、V、L或W， (bp')序列編號2所表示之胺基酸序列之226位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為Y， (bq')序列編號2所表示之胺基酸序列之233位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為L、I或W， (br')序列編號2所表示之胺基酸序列之237位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為N， (bs')序列編號2所表示之胺基酸序列之238位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為L， (bt')序列編號2所表示之胺基酸序列之243位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為Y、L或I， (bu')序列編號2所表示之胺基酸序列之245位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為N， (bv')序列編號2所表示之胺基酸序列之246位或相當於其之位置上之Y胺基酸殘基為、V、L、W或F， (bw')序列編號2所表示之胺基酸序列之247位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、N、Q、E、H、A、V、L、I、M、W或F， (bx')序列編號2所表示之胺基酸序列之248位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為F， (by')序列編號2所表示之胺基酸序列之250位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為F， (bz')序列編號2所表示之胺基酸序列之251位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、T、N、Q、D、A、V、L或I， (ca')序列編號2所表示之胺基酸序列之256位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、W、F或P， (cb')序列編號2所表示之胺基酸序列之257位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為V或I， (cc')序列編號2所表示之胺基酸序列之264位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、S、T、C、Q、D、E、A、V、L、I或M， (cd')序列編號2所表示之胺基酸序列之273位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、T或I， (ce')序列編號2所表示之胺基酸序列之275位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為L、W或F， (cf')序列編號2所表示之胺基酸序列之277位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為V、L、I或F， (cg')序列編號2所表示之胺基酸序列之281位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為R， (ch')序列編號2所表示之胺基酸序列之296位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為V， (ci')序列編號2所表示之胺基酸序列之297位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為L、W或F， (cj')序列編號2所表示之胺基酸序列之304位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S， (ck')序列編號2所表示之胺基酸序列之313位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為N， (cl')序列編號2所表示之胺基酸序列之319位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、N、Q、Y、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W、F或P， (cm')序列編號2所表示之胺基酸序列之320位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、T、V、L、I或F， (cn')序列編號2所表示之胺基酸序列之326位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為W， (co')序列編號2所表示之胺基酸序列之330位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為M、W或F， (cp')序列編號2所表示之胺基酸序列之332位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、T或V， (cq')序列編號2所表示之胺基酸序列之334位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為L， (cr')序列編號2所表示之胺基酸序列之335位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為F， (cs')序列編號2所表示之胺基酸序列之337位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、S、T、C、Q、R、K、H、A或V， (ct')序列編號2所表示之胺基酸序列之342位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (cu')序列編號2所表示之胺基酸序列之343位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為T， (cv')序列編號2所表示之胺基酸序列之346位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為R， (cw')序列編號2所表示之胺基酸序列之357位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為L， (cx')序列編號2所表示之胺基酸序列之359位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、S、Q、V、L、I或F， (cy')序列編號2所表示之胺基酸序列之361位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為V、I或W， (cz')序列編號2所表示之胺基酸序列之369位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為N， (da')序列編號2所表示之胺基酸序列之376位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為W， (db')序列編號2所表示之胺基酸序列之378位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為L或W， (dc')序列編號2所表示之胺基酸序列之379位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為D、E、R或K， (dd')序列編號2所表示之胺基酸序列之380位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為F， (de')序列編號2所表示之胺基酸序列之385位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為Y、M或P， (df')序列編號2所表示之胺基酸序列之386位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為A、L、I或M， (dg')序列編號2所表示之胺基酸序列之387位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、Q、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W或F， (dh')序列編號2所表示之胺基酸序列之390位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G、S、T、Y或F， (di')序列編號2所表示之胺基酸序列之393位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為Q， (dj')序列編號2所表示之胺基酸序列之396位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G， (dk')序列編號2所表示之胺基酸序列之403位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為T或K， (dl')序列編號2所表示之胺基酸序列之405位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為D、V、L、I、W、F或P， (dm')序列編號2所表示之胺基酸序列之406位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為V、W或F， (dn')序列編號2所表示之胺基酸序列之407位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為G或C， (do')序列編號2所表示之胺基酸序列之408位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為N、Y、I或W， (dp')序列編號2所表示之胺基酸序列之409位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為Y或W， (dq')序列編號2所表示之胺基酸序列之411位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為A、V、L或P， (dr')序列編號2所表示之胺基酸序列之427位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為R或V， (ds')序列編號2所表示之胺基酸序列之433位或相當於其之位置上之胺基酸殘基為L； (ii)更佳為具有以下之任一者： (ar')所示之胺基酸殘基， (as')、(at')及(au')所示之胺基酸殘基， (bk')所示之胺基酸殘基， (cz')所示之胺基酸殘基， (v')、(cd')、(cx')及(dg')所示之胺基酸殘基， (bc')及(bd')所示之胺基酸殘基， (e')及(aa')所示之胺基酸殘基， (j')、(s')、(y')、(bh')及(dl')所示之胺基酸殘基， (e')、(v')、(aa')、(bc')、(bd')、(bk')、(cd')、(cx')、(cz')及(dg')所示之胺基酸殘基， (e')、(v')、(aa')、(ar')、(bc')、(bd')、(bk')、(cd')、(cx')、(cz')及(dg')所示之胺基酸殘基， (v')、(as')、(at')、(au')、(bc')、(bd')、(bk')、(cd')、(cx')、(cz')及(dg')所示之胺基酸殘基， (j')、(s')、(v')、(y')、(as')、(at')、(au')、(bc')、(bd')、(bh')、(bk')、(cd')、(cx')、(cz')、(dg')及(dl')所示之胺基酸殘基， (v')、(aa')、(ar')、(bc')、(bd')、(bk')、(cd')、(cx')、(cz')及(dg')所示之胺基酸殘基， (v')、(as')、(at')、(au')、(bc')、(bd')、(bk')、(cd')、(cx')、(cz')及(dg')所示之胺基酸殘基， (e')、(v')、(aa')、(bc')、(bd')、(bk')、(bm')、(cd')、(cl')、(cx')、(cz')及(dg')所示之胺基酸殘基，及 (v')、(as')、(at')、(au')、(bc')、(bd')、(bj')、(bk')、(bo')(cd')、(cx')、(cz')、(dc')及(dg')所示之胺基酸殘基。 [5]如[1]至[4]中任一項記載之突變鹼性蛋白酶，其中上述與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少95%之同一性之胺基酸序列 較佳為在相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之30位的位置具有天冬胺酸，在相當於68位的位置具有組胺酸，且在相當於255位的位置具有絲胺酸； 更佳為在相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之上述表1(i)記載之位置的位置具有該表1(ii)記載之胺基酸殘基。 [6]如[1]至[5]中任一項記載之突變鹼性蛋白酶，其較佳為包含序列編號2～5、8、10中之任一者所表示之胺基酸序列的突變鹼性蛋白酶之A294T突變體，或包含序列編號6～7、9、11中之任一者所表示之胺基酸序列的突變鹼性蛋白酶之A295T突變體。 [7]一種聚核苷酸，其編碼如[1]至[6]中任一項記載之突變鹼性蛋白酶。 [8]一種載體，其含有如[7]記載之聚核苷酸。 [9]一種轉形體，其包含外來之如[7]記載之聚核苷酸或如[8]記載之載體。 [10]如[8]記載之載體或[9]記載之轉形體，其較佳為上述載體為能夠於桿菌屬細菌內誘導表現所導入基因之表現載體。 [11]如[9]或[10]記載之轉形體，其較佳為重組桿菌屬細菌。 [12]一種突變鹼性蛋白酶之製造方法，其使用如[9]至[11]中任一項記載之轉形體。 [13]一種洗劑組合物，其含有如[1]至[6]中任一項記載之突變鹼性蛋白酶。 [14]如[13]記載之洗劑組合物，其較佳為含有螯合劑。 [15]如[13]或[14]記載之洗劑組合物，其較佳為液體洗劑組合物。 [16]如[15]記載之洗劑組合物，其中界面活性劑之含量較佳為10～80質量%、更佳為30～70質量%。 [17]一種突變鹼性蛋白酶之製造方法，其包括於序列編號2所表示之胺基酸序列或與其具有至少95%之同一性之胺基酸序列中，將相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之294位的位置之胺基酸殘基置換為蘇胺酸。 [18]一種鹼性蛋白酶之對螯合劑之穩定性提昇方法，其包括於序列編號2所表示之胺基酸序列或與其具有至少95%之同一性之胺基酸序列中，將相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之294位的位置之胺基酸殘基置換為蘇胺酸。 [19]如[17]或[18]記載之方法，其較佳為上述與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少95%之同一性之胺基酸序列在相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之294位的位置具有丙胺酸。 [20]如[17]至[19]中任一項記載之方法，其較佳為上述與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少95%之同一性之胺基酸序列為蛋白酶KP9860或蛋白酶9865之胺基酸序列。 [21]如[17]至[19]中任一項記載之方法，其較佳為上述與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少95%之同一性之胺基酸序列為相對於序列編號2所表示之胺基酸序列而具有以下突變之胺基酸序列： (i)較佳為選自由以下之(a)～(ds)所組成之群中之1種以上： (a)將6位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、R、K、H、A、V、L、I、M、W或F， (b)將9位或相當於其之位置上之K置換為Q， (c)將11位或相當於其之位置上之D置換為G、S或N， (d)將15位或相當於其之位置上之S置換為H、C、Q、D、E、R、A、V、M、W或F， (e)將16位或相當於其之位置上之S置換為、T、Q、V、C、Y、D、E、R、K、H、L、I、M、W或F， (f)將20位或相當於其之位置上之Y置換為F或A， (g)將22位或相當於其之位置上之Q置換為W， (h)將23位或相當於其之位置上之G置換為N， (i)將37位或相當於其之位置上之R置換為T， (j)將40位或相當於其之位置上之S置換為V、L、I、W或F， (k)將41位或相當於其之位置上之S置換為I， (l)將46位或相當於其之位置上之F置換為S、T、C、N、Q、Y、E、K、H、A、V、L、I、M或W， (m)將49位或相當於其之位置上之K置換為Q， (n)將52位或相當於其之位置上之A置換為G或S， (o)將53位或相當於其之位置上之L置換為A、V或I， (p)將54位或相當於其之位置上之Y置換為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、H、A、V、M、W、F或P， (q)將56位或相當於其之位置上之L置換為V， (r)將57位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (s)將59位或相當於其之位置上之T置換為V、L、I、M、W或F， (t)將60位或相當於其之位置上之N置換為V、L、I、W或F， (u)將63位或相當於其之位置上之N置換為S、D或L， (v)將65位或相當於其之位置上之T置換為W或P， (w)將66位或相當於其之位置上之N置換為G、S、T、C、Q、D、E、H、A、V、L、I、M或W， (x)將80位或相當於其之位置上之G置換為H或A， (y)將81位或相當於其之位置上之S置換為Q、Y、L、I、W或F， (z)將82位或相當於其之位置上之T置換為G、S、C、Q、D、E、R、K、H、A或M， (aa)將83位或相當於其之位置上之N置換為S、C或A， (ab)將84位或相當於其之位置上之K置換為R， (ac)將89位或相當於其之位置上之Q置換為H， (ad)將91位或相當於其之位置上之N置換為C， (ae)將100位或相當於其之位置上之S置換為L、I、W或F， (af)將101位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、N、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (ag)將102位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (ah)將103位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (ai)將104位或相當於其之位置上之L置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (aj)將105位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (ak)將106位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (al)將107位或相當於其之位置上之L置換為S、R、K或A， (am)將109位或相當於其之位置上之S置換為L、I或F， (an)將113位或相當於其之位置上之T置換為L或W， (ao)將119位或相當於其之位置上之Y置換為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、M、W、F或P， (ap)將120位或相當於其之位置上之S置換為Y、R、I、W或F， (aq)將124位或相當於其之位置上之R置換為K或A， (ar)將132位或相當於其之位置上之A置換為S、T、N、Q、D、I或M， (as)將133位或相當於其之位置上之A置換為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W、F或P， (at)將134位或相當於其之位置上之V置換為G、S、T或A， (au)向133位或相當於其之位置與134位或相當於其之位置之間插入G、S、T、N、Q、Y、R、K、H、A、L、I、M或W， (av)將135位或相當於其之位置上之N置換為R、A、L或M， (aw)將136位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (ax)將138位或相當於其之位置上之Y置換為G、S、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、M、W、F或P， (ay)將140位或相當於其之位置上之T置換為L、W或F， (az)將148位或相當於其之位置上之Y置換為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、M、W、F或P， (ba)將151位或相當於其之位置上之K置換為F， (bb)將163位或相當於其之位置上之E置換為S、T、N、Q、D、K、H、V、L、I或F， (bc)將166位或相當於其之位置上之N置換為G、V、L、I、W或F， (bd)將167位或相當於其之位置上之G置換為V， (be)將170位或相當於其之位置上之I置換為V或L， (bf)將171位或相當於其之位置上之S置換為G、T、E或A， (bg)將187位或相當於其之位置上之N置換為S， (bh)將191位或相當於其之位置上之S置換為V、L、I、W或F， (bi)將193位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (bj)將194位或相當於其之位置上之S置換為Y、R或K， (bk)將195位或相當於其之位置上之Y置換為G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (bl)將200位或相當於其之位置上之N置換為W， (bm)將204位或相當於其之位置上之Q置換為S、T、C、N、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W或P， (bn)將205位或相當於其之位置上之F置換為S、T、C、N、Q、Y、E、K、H、A、V、L、I、M或W， (bo)將212位或相當於其之位置上之K置換為N、Q、R、V、L或W， (bp)將226位或相當於其之位置上之F置換為Y， (bq)將233位或相當於其之位置上之S置換為L、I或W， (br)將237位或相當於其之位置上之D置換為N， (bs)將238位或相當於其之位置上之S置換為L， (bt)將243位或相當於其之位置上之N置換為Y、L或I， (bu)將245位或相當於其之位置上之D置換為N， (bv)將246位或相當於其之位置上之S置換為Y、V、L、W或F， (bw)將247位或相當於其之位置上之K置換為S、T、C、N、Q、E、H、A、V、L、I、M、W或F， (bx)將248位或相當於其之位置上之Y置換為F， (by)將250位或相當於其之位置上之Y置換為F， (bz)將251位或相當於其之位置上之M置換為G、T、N、Q、D、A、V、L或I， (ca)將256位或相當於其之位置上之M置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、W、F或P， (cb)將257位或相當於其之位置上之A置換為V或I， (cc)將264位或相當於其之位置上之N置換為G、S、T、C、Q、D、E、A、V、L、I或M， (cd)將273位或相當於其之位置上之V置換為G、T或I， (ce)將275位或相當於其之位置上之N置換為L、W或F， (cf)將277位或相當於其之位置上之G置換為V、L、I或F， (cg)將281位或相當於其之位置上之K置換為R， (ch)將296位或相當於其之位置上之I置換為V， (ci)將297位或相當於其之位置上之G置換為L、W或F， (cj)將304位或相當於其之位置上之N置換為S， (ck)將313位或相當於其之位置上之D置換為N， (cl)將319位或相當於其之位置上之A置換為S、T、C、N、Q、Y、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W、F或P， (cm)將320位或相當於其之位置上之Y置換為G、T、V、L、I或F， (cn)將326位或相當於其之位置上之S置換為W， (co)將330位或相當於其之位置上之S置換為M、W或F， (cp)將332位或相當於其之位置上之K置換為G、T或V， (cq)將334位或相當於其之位置上之T置換為L， (cr)將335位或相當於其之位置上之Y置換為F， (cs)將337位或相當於其之位置上之F置換為G、S、T、C、Q、R、K、H、A或V， (ct)將342位或相當於其之位置上之G置換為S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P， (cu)將343位或相當於其之位置上之K置換為T， (cv)將346位或相當於其之位置上之K置換為R， (cw)將357位或相當於其之位置上之S置換為L， (cx)將359位或相當於其之位置上之T置換為G、S、Q、V、L、I或F， (cy)將361位或相當於其之位置上之S置換為V、I或W， (cz)將369位或相當於其之位置上之D置換為N， (da)將376位或相當於其之位置上之N置換為W， (db)將378位或相當於其之位置上之T置換為L或W， (dc)將379位或相當於其之位置上之Q置換為D、E、R或K， (dd)將380位或相當於其之位置上之Y置換為F， (de)將385位或相當於其之位置上之F置換為Y、M或P， (df)將386位或相當於其之位置上之T置換為A、L、I或M， (dg)將387位或相當於其之位置上之S置換為G、Q、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W或F， (dh)將390位或相當於其之位置上之N置換為G、S、T、Y或F， (di)將393位或相當於其之位置上之W置換為Q， (dj)將396位或相當於其之位置上之R置換為G， (dk)將403位或相當於其之位置上之F置換為T或K， (dl)將405位或相當於其之位置上之N置換為D、V、L、I、W、F或P， (dm)將406位或相當於其之位置上之A置換為V、W或F， (dn)將407位或相當於其之位置上之P置換為G或C， (do)將408位或相當於其之位置上之Q置換為N、Y、I或W， (dp)將409位或相當於其之位置上之S置換為Y或W， (dq)將411位或相當於其之位置上之T置換為A、V、L或P， (dr)將427位或相當於其之位置上之T置換為R或V， (ds)將433位或相當於其之位置上之V置換為L； (ii)更佳為以下之任一者： (ar)， (as)、(at)及(au)之組合， (bk)， (cz)， (v)、(cd)、(cx)及(dg)之組合， (bc)及(bd)之組合， (e)及(aa)之組合， (j)、(s)、(y)、(bh)及(dl)之組合， (e)、(v)、(aa)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)之組合， (e)、(v)、(aa)、(ar)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)之組合， (v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)之組合， (j)、(s)、(v)、(y)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bh)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)、(dg)及(dl)之組合， (v)、(aa)、(ar)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)之組合， (v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)之組合， (e)、(v)、(aa)、(bc)、(bd)、(bk)、(bm)、(cd)、(cl)、(cx)、(cz)及(dg)之組合，及 (v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bj)、(bk)、(bo)(cd)、(cx)、(cz)、(dc)及(dg)之組合。 [22]如[17]至[21]中任一項記載之方法，其中上述與序列編號2所表示之胺基酸序列具有至少95%之同一性之胺基酸序列 較佳為在相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之30位的位置具有天冬胺酸，在相當於68位的位置具有組胺酸，且在相當於255位的位置具有絲胺酸； 更佳為在相當於序列編號2所表示之胺基酸序列之上述表1(i)記載之位置的位置具有該表1(ii)記載之胺基酸殘基。 [23]如[17]至[22]中任一項記載之方法，其較佳為上述序列編號2所表示之胺基酸序列或與其具有至少95%之同一性之胺基酸序列為序列編號2～11中之任一者所表示之胺基酸序列。 [實施例] 以下，使用實施例而更具體地說明本發明。但本發明之技術範圍並不限定於該等實施例。 實施例1 鹼性蛋白酶突變體之製作 以使野生型KP43蛋白酶成熟酶區域之胺基酸序列(序列編號2)中之294位之丙胺酸(A294)突變為蘇胺酸的「A294T」突變體之製作為例，於以下揭示本發明之鹼性蛋白酶突變體之製作方法。 對於含有源自桿菌屬KSM-KP43株之編碼序列編號2之鹼性蛋白酶之鹼性蛋白酶結構基因(序列編號1)的重組載體，導入將序列編號2之294位之胺基酸殘基置換為蘇胺酸之定點突變。設計突變用引子A294-F(序列編號12：GGTGCAACTGACATCGGCCTTGGCTAC)及A294-R(序列編號13：GATGTCAGTTGCACCGGCAATCAGTGC)。使用該等引子，依據PrimeSTAR突變套組(Mutagenesis Basal Kit)(Takara)之操作說明，取得導入有突變之PCR產物。利用PCR產物純化套組(PCR product purification kit)(Roche)將PCR產物加以純化後，轉形為作為宿主菌之桿菌屬KSM9865株(FERM P-18566)。 使所獲得之轉形體於含脫脂乳之鹼性瓊脂培養基[脫脂乳(Difco)1%(w/v)、胰化蛋白腖(Difco)1%、酵母萃取液(Difco)0.5%、氯化鈉1%、瓊脂1.5%、碳酸鈉0.05%、四環素15 ppm]中生長，根據暈圈之形成狀況，判定是否導入有突變蛋白酶基因。將該轉形體植菌至5 mL之種母培養基[6.0%(w/v)聚蛋白腖S、0.05%酵母萃取液、1.0%麥芽糖、0.02%硫酸鎂七水合物、0.1%磷酸二氫鉀、0.25%碳酸鈉、30 ppm四環素]中，於30℃下進行16小時之振盪培養。繼而，對20 mL之主培養基[8%聚蛋白腖S、0.3%酵母萃取液、10%麥芽糖、0.04%硫酸鎂七水合物、0.2%磷酸二氫鉀、1.5%無水碳酸鈉、30ppm四環素]植菌1%(v/v)之種母培養液，於30℃下進行3天之振盪培養。將所獲得之培養液進行離心分離，取得包含鹼性蛋白酶突變體之培養上清液，使用和光蛋白質快速定量套組(Protein Assay Rapid Kit wako)(和光純藥)測定其蛋白質量。 實施例2 鹼性蛋白酶多重突變體之製作 參考日本專利5202690號公報、日本專利特開2002-218989號公報、日本專利特開2002-306176號公報、日本專利特開2004-000122號公報、日本專利特開2004-305176號公報、日本專利特開2006-129865號公報、日本專利特開2007-061101號公報、日本專利特開2008-212084、日本專利特開2010-273672號公報、日本專利特開2010-273673號公報、及日本專利特開2013-233141號公報之記載，對野生型KP43蛋白酶(序列編號2)導入突變，製作以下之KP43蛋白酶突變體。 (1)1重突變體(序列編號3)： 將132位之丙胺酸置換為蘇胺酸(日本專利5202690號公報)； (2)10重突變體-1(序列編號4)： 將195位之酪胺酸置換為麩醯胺(日本專利特開2002-218989號公報)， 將369位之天冬胺酸置換為天冬醯胺(日本專利特開2002-306176號公報)， 將65位之蘇胺酸置換為脯胺酸、將273位之纈胺酸置換為異白胺酸、將359位之蘇胺酸置換為絲胺酸、及將387位之絲胺酸置換為丙胺酸(日本專利特開2004-000122號公報)， 將166位之天冬醯胺置換為甘胺酸、及將167位之甘胺酸置換為纈胺酸(日本專利特開2004-305176號公報)， 將16位之絲胺酸置換為纈胺酸、及將83位之天冬醯胺置換為丙胺酸(日本專利特開2010-273672號公報、及日本專利特開2010-273673號公報)； (3)11重突變體-1(序列編號5)： 將132位之丙胺酸置換為蘇胺酸(日本專利5202690號公報)， 將195位之酪胺酸置換為麩醯胺(日本專利特開2002-218989號公報)， 將369位之天冬胺酸置換為天冬醯胺(日本專利特開2002-306176號公報)， 將65位之蘇胺酸置換為脯胺酸、將273位之纈胺酸置換為異白胺酸、將359位之蘇胺酸置換為絲胺酸、及將387位之絲胺酸置換為丙胺酸(日本專利特開2004-000122號公報)， 將166位之天冬醯胺置換為甘胺酸、及將167位之甘胺酸置換為纈胺酸(日本專利特開2004-305176號公報)， 將16位之絲胺酸置換為纈胺酸、及將83位之天冬醯胺置換為丙胺酸(日本專利特開2010-273672號公報、及日本專利特開2010-273673號公報)； (4)11重突變體-2(序列編號6)： 將195位之酪胺酸置換為麩醯胺(日本專利特開2002-218989號公報)， 將369位之天冬胺酸置換為天冬醯胺(日本專利特開2002-306176號公報)， 將65位之蘇胺酸置換為脯胺酸、將273位之纈胺酸置換為異白胺酸、將359位之蘇胺酸置換為絲胺酸、及將387位之絲胺酸置換為丙胺酸(日本專利特開2004-000122號公報)， 將166位之天冬醯胺置換為甘胺酸、及將167位之甘胺酸置換為纈胺酸(日本專利特開2004-305176號公報)， 將133位之丙胺酸置換為絲胺酸、將134位之纈胺酸置換為蘇胺酸、及向133位與134位之間插入絲胺酸(日本專利特開2006-129865號公報)； (5)16重突變體(序列編號7)： 將195位之酪胺酸置換為麩醯胺(日本專利特開2002-218989號公報)， 將369位之天冬胺酸置換為天冬醯胺(日本專利特開2002-306176號公報)， 將65位之蘇胺酸置換為脯胺酸、將273位之纈胺酸置換為異白胺酸、將359位之蘇胺酸置換為絲胺酸、及將387位之絲胺酸置換為丙胺酸(日本專利特開2004-000122號公報)， 將166位之天冬醯胺置換為甘胺酸、及將167位之甘胺酸置換為纈胺酸(日本專利特開2004-305176號公報)， 將133位之丙胺酸置換為絲胺酸、將134位之纈胺酸置換為蘇胺酸、及向133位與134位之間插入絲胺酸(日本專利特開2006-129865號公報)， 將40位之絲胺酸置換為異白胺酸、將59位之蘇胺酸置換為纈胺酸、將81位之絲胺酸置換為白胺酸、將191位之絲胺酸置換為白胺酸、及將405位之天冬醯胺置換為白胺酸(日本專利特開2013-233141號公報)。 (6)10重突變體-2(序列編號8)： 將132位之丙胺酸置換為蘇胺酸(日本專利5202690號公報)， 將195位之酪胺酸置換為精胺酸(日本專利特開2002-218989號公報)， 將369位之天冬胺酸置換為天冬醯胺(日本專利特開2002-306176號公報)， 將65位之蘇胺酸置換為脯胺酸、將273位之纈胺酸置換為異白胺酸、將359位之蘇胺酸置換為絲胺酸、及將387位之絲胺酸置換為丙胺酸(日本專利特開2004-000122號公報)， 將166位之天冬醯胺置換為甘胺酸、及將167位之甘胺酸置換為纈胺酸(日本專利特開2004-305176號公報)， 將83位之天冬醯胺置換為丙胺酸(日本專利特開2010-273672號公報)； (7)11重突變體-3(序列編號9)： 將195位之酪胺酸置換為精胺酸(日本專利特開2002-218989號公報)， 將369位之天冬胺酸置換為天冬醯胺(日本專利特開2002-306176號公報)， 將65位之蘇胺酸置換為脯胺酸、將273位之纈胺酸置換為異白胺酸、將359位之蘇胺酸置換為絲胺酸、及將387位之絲胺酸置換為丙胺酸(日本專利特開2004-000122號公報)， 將166位之天冬醯胺置換為甘胺酸、及將167位之甘胺酸置換為纈胺酸(日本專利特開2004-305176號公報)， 將133位之丙胺酸置換為絲胺酸、將134位之纈胺酸置換為蘇胺酸、及向133位與134位之間插入絲胺酸(日本專利特開2006-129865號公報)； (8)12重突變體(序列編號10)： 將195位之酪胺酸置換為麩醯胺(日本專利特開2002-218989號公報)， 將369位之天冬胺酸置換為天冬醯胺(日本專利特開2002-306176號公報)， 將65位之蘇胺酸置換為脯胺酸、將273位之纈胺酸置換為異白胺酸、將359位之蘇胺酸置換為絲胺酸、及將387位之絲胺酸置換為丙胺酸(日本專利特開2004-000122號公報)， 將166位之天冬醯胺置換為甘胺酸、及將167位之甘胺酸置換為纈胺酸(日本專利特開2004-305176號公報)， 將83位之天冬醯胺置換為丙胺酸、及將319位之丙胺酸置換為纈胺酸(日本專利特開2010-273672號公報)， 將16位之絲胺酸置換為纈胺酸、及將204位之麩醯胺置換為天冬胺酸(日本專利特開2010-273673號公報)； (9)14重突變體(序列編號11)： 將195位之酪胺酸置換為精胺酸(日本專利特開2002-218989號公報)， 將369位之天冬胺酸置換為天冬醯胺(日本專利特開2002-306176號公報)， 將65位之蘇胺酸置換為脯胺酸、將273位之纈胺酸置換為異白胺酸、將359位之蘇胺酸置換為絲胺酸、及將387位之絲胺酸置換為丙胺酸(日本專利特開2004-000122號公報)， 將166位之天冬醯胺置換為甘胺酸、及將167位之甘胺酸置換為纈胺酸(日本專利特開2004-305176號公報)， 將133位之丙胺酸置換為絲胺酸、將134位之纈胺酸置換為蘇胺酸、及向133位與134位之間插入絲胺酸(日本專利特開2006-129865號公報)， 將194位之絲胺酸置換為精胺酸、將212位之離胺酸置換為精胺酸、將379位之麩醯胺置換為精胺酸(日本專利特開2008-212084號公報)。 上述1重突變體(序列編號3)、10重突變體-1(序列編號4)、11重突變體-1(序列編號5)、11重突變體-2(序列編號6)、16重突變體(序列編號7)、10重突變體-2(序列編號8)、11重突變體-3(序列編號9)、12重突變體(序列編號10)及14重突變體(序列編號11)相對於野生型KP43蛋白酶(序列編號2)，分別具有99.8%、97.7%、97.5%、97.5%、96.3%、97.7%、97.5%、97.2%、及96.8%之胺基酸序列之同一性。 對編碼上述獲得之各突變體之聚核苷酸，依據與實施例1相同之流程，導入將相當於序列編號2之294位的位置之丙胺酸置換為蘇胺酸之突變(相對於序列編號3～5、8、10之A294T、及相對於序列編號6～7、9、11之A295T)後，轉形為宿主，培養該轉形體，取得包含鹼性蛋白酶突變體之培養上清液，測定其蛋白質量。於以下之實施例中，將實施例1及2中獲得之在相當於序列編號2之294位的位置具有T之鹼性蛋白酶突變體統稱為A294T突變體。 實施例3 鹼性蛋白酶突變體於含有螯合劑之液體中之穩定性評價 (1)於檸檬酸鹽水溶液中之穩定性評價 對包含或不含2 mM檸檬酸三鈉之20 mM Tris-HCl緩衝液(pH值8.0)添加實施例1中獲得之A294T突變體之培養上清液，充分混合而獲得酶溶液(酶終濃度0.017 mg/mL)。將200 μL之該酶溶液分取至96孔分析盤內，於其中添加10 μL之10 mM Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA・H
2
O(Peptide Research Laboratory)，使用微盤讀取器(infinite M200Pro；TECAN)，一面於30℃下振盪15分鐘一面經時測定405 nm之吸光度。將吸光度變化速度(mOD405/min)視為酶活性，獲得初期活性值。將該酶溶液於70℃下加熱10分鐘後，對其藉由與初期活性值之測定相同之方法取得殘存活性值。採用下式，算出鹼性蛋白酶之殘存活性(%)： 殘存活性(%)＝殘存活性值/初期活性值×100 繼而，將母鹼性蛋白酶(野生型KP43蛋白酶；序列編號2)之殘存活性設為100%，求出於該情形時之該A294T突變體之殘存活性之相對值(殘存相對活性(%))。 同樣地算出實施例2中獲得之1重突變體(序列編號3)、11重突變體-2(序列編號6)、14重突變體(序列編號11)、及16重突變體(序列編號7)之A294T突變體之殘存活性(%)，並求出各自相對於母鹼性蛋白酶之殘存相對活性(%)。 (2)於EDTA水溶液中之穩定性評價 對包含或不含1 mM EDTA之20 mM Tris-HCl緩衝液(pH值8.0)添加實施例1中獲得之A294T突變體之培養上清液，充分混合而獲得酶溶液(酶終濃度0.017 mg/mL)。使用該酶溶液，於與上述(1)相同之條件下算出鹼性蛋白酶之殘存活性(%)，並求出相對於母鹼性蛋白酶之殘存相對活性(%)。 同樣地算出實施例2中獲得之1重突變體(序列編號3)、10重突變體-1(序列編號4)、10重突變體-2(序列編號8)、11重突變體-1(序列編號5)、11重突變體-2(序列編號6)、11重突變體-3(序列編號9)、12重突變體(序列編號10)及16重突變體(序列編號7)之A294T突變體之殘存活性(%)，並求出各自相對於母鹼性蛋白酶之殘存相對活性(%)。 (3)結果 圖1及表2揭示上述(1)中測得之A294T突變體於檸檬酸鹽水溶液中之殘存相對活性。圖2～3及表3～4揭示上述(2)中測得之A294T突變體於EDTA水溶液中之殘存相對活性。A294T突變體於不含螯合劑之液體中之殘存活性與該等之母鹼性蛋白酶相比為同等水平，但於含有螯合劑之液體中則具有更高之殘存活性。由此表明與母鹼性蛋白酶相比，該A294T突變體於含有螯合劑之液體中之穩定性得以提昇。 [表2]
[表3]
[表4]
實施例4 鹼性蛋白酶突變體於洗劑組合物中之穩定性評價 將市售之衣物用液體洗劑組合物(Ultra Attack Neo；花王，2015年發售，調配有檸檬酸鹽)於微波爐中加熱而使製品中之酶失活。對其添加1.0%(v/v)之實施例1之A294T突變體或野生型KP43蛋白酶，充分混合而獲得含有酶之洗劑組合物。利用離子交換水將該洗劑組合物稀釋10倍後，充分攪拌。將200 μL之所獲得之洗劑液分取至96孔分析盤內，於其中添加10 μL之10 mM Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA・H
2
O(Peptide Research Laboratory)，使用微盤讀取器(infinite M200Pro；TECAN)，一面於30℃下振盪15分鐘一面經時測定405 nm之吸光度。將吸光度變化速度(mOD405/min)視為酶活性，獲得初期活性值。又，將該洗劑組合物於40℃下保存28天後，藉由與初期活性值之測定相同之方法取得殘存活性值，採用下式，算出鹼性蛋白酶之殘存活性(%)。 殘存活性(%)＝殘存活性值/初期活性值×100 繼而，將野生型KP43蛋白酶之殘存活性設為100%，求出於該情形時之該A294T突變體之殘存相對活性(%)。 結果示於表5。A294T突變體與作為其母鹼性蛋白酶之野生型KP43蛋白酶相比，於洗劑組合物中之保存穩定性提昇了約2倍。 [表5]
參考例1 針對實施例2中用作母鹼性蛋白酶之KP43蛋白酶之1重突變體及多重突變體，於與實施例3及4相同之條件下測定檸檬酸耐性及EDTA耐性。將檸檬酸耐性之結果示於表6，將EDTA耐性之結果示於表7。表6及7之值表示將野生型KP43蛋白酶(序列編號2)之殘存活性設為100%時之各突變體之殘存相對活性(%)。與野生型KP43蛋白酶相比，各母鹼性蛋白酶具有同等以上之螯合劑耐性。該等結果表明，實施例3及4所示之A294T突變體之螯合劑耐性優於母鹼性蛋白酶及野生型任何一者。 [表6] 2 mM檸檬酸三鈉
[表7] 1 mM EDTA
以上說明了本發明之實施形態，但應理解該等並非意在將本發明限定於所說明之特定之實施形態。業者明瞭處於本發明之範圍內之各種其他之變更及修正。 將本說明書所引用之文獻及日本專利申請完整地記載於此，以供參考。