TWI631138B - 靶向ｂ細胞成熟抗原之嵌合型抗原受體類 - Google Patents

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Abstract

本發明提供特異結合B細胞成熟抗原(BCMA)之嵌合型抗原受體類(CARs)。本發明進一步關於包含該等CAR之經遺傳工程處理的免疫細胞、編碼CAR之核酸及製造該等CAR、經遺傳工程處理之免疫細胞和核酸之方法。本發明進一步關於使用這些CAR及經遺傳工程處理之免疫細胞來治療與表現BCMA之惡性細胞相關的病症(例如癌症)之治療方法。

Description

靶向B細胞成熟抗原之嵌合型抗原受體類 相關申請案之交叉引用
本申請案主張2015年4月13日提交申請之美國臨時申請案第62/146,825號、2016年1月25日提交申請之美國臨時申請案第62/286,473號和2016年2月29日提交申請之美國臨時申請案第62/301,177號的權益，所有該等申請案之內容以引用方式併入本文。
序列表之參考資料
本申請案係經由EFS-Web以電子方式提交申請並包括經電子方式提交之.txt格式的序列表。該.txt檔案含有2016年3月28日創建，標題為“PC72207A_SequenceListing_ST25.txt”之序列表，其大小為365KB。包含在此.txt檔案中之序列表為本專利申請案之一部分且其全部內容以引用方式併入本文。
本發明關於嵌合型抗原受體類(CAR)。CAR能夠利用配體結合結構域性質重新定向免疫細胞之特異性和反應 性朝向選定之靶的。尤其是，本發明關於特異結合B細胞成熟抗原之CAR(BCMA特異性CAR)。本發明進一步關於編碼BCMA特異性CAR之多核苷酸及其表面上表現BCMA特異性CAR之經分離的細胞。本發明進一步關於用於遺傳工程處理其表面表現BCMA特異性CAR之免疫細胞的方法。本發明對治療B細胞淋巴瘤和白血病特別有用。本發明進一步關於包含該BCMA特異性CAR之免疫細胞(BCMA特異性CAR-T細胞)、包含該BCMA特異性CAR-T細胞之組成物及使用該BCMA特異性CAR-T細胞來治療與表現BCMA之惡性細胞相關之病症(例如癌症)之方法。
多發性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)為一種惡性腫瘤疾病，其特徵為同源漿細胞之積累(參見，例如Lonial et al.,Clinical Cancer Res.,77(6)：1264-1277(2011))。目前用於MM的療法往往會引起緩解，但幾乎所有患者最終會復發並死亡(參見，例如Rajkumar,Nature Rev.Clinical Oncol,5(8)：479-491(2011))。
過繼性轉移(adoptive transfer)經遺傳工程修飾以識別與惡性腫瘤相關之抗原的T細胞顯示出可望作為治療癌症的新方法(參見，例如Brenner et al.,Current Opinion in Immunology,22(2)：251-257(2010)；Rosenberg et al.,Nature Reviews Cancer,8(4)：299-308(2008))。T細胞可 經遺傳工程修飾以表現嵌合型抗原受體(CARs)，此為由抗原識別部分及T細胞活化結構域所組成之融合蛋白(參見，例如Eshhar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90(2)：720-724(1993)和Sadelain et al.,Curr.Opin.Immunol,21(2)：215-223(2009))。
B細胞成熟抗原(BCMA、CD269或TNFRSF17)為腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族之成員。BCMA係在含有t(4；16)轉位之人類惡性T細胞淋巴瘤中被鑑定出。該基因係選擇性地表現在B細胞譜系中，其在漿母細胞和漿細胞、抗體分泌細胞中之表現水準最高。BCMA分別以1uM和16nM之親和力結合二種配體，B細胞活化因子(BAFF)(亦稱為B-淋巴細胞刺激因子(BLyS)和APOL相關之白血球表現配體(TALL-1))及增殖誘導配體(APRIL)。APRIL或BAFF與BCMA結合可促進涉及NF-κ B、Elk-1、c-Jun N-端激酶和p38促分裂原活化之蛋白激酶的信號傳導級聯反應，其產生用於細胞存活和增殖之信號。BCMA亦表現在惡性B細胞和數種涉及B淋巴細胞之癌症(包括多發性骨髓瘤、漿細胞瘤、何杰金氏淋巴瘤及慢性淋巴細胞性白血病)上。在其中涉及漿母細胞之自體免疫疾病(諸如系統性紅斑性狼瘡(SLE)和類風濕性關節炎)中，表現BCMA之抗體生成細胞會分泌自體抗體來攻擊自身。
在多發性骨髓瘤的情況中，美國每年約有24000個新診斷之病例，且這個數字代表美國新診斷之血液癌症的 約15%。每年平均有11000人死於多發性骨髓瘤，其5年之平均存活率為約44%，中位數生存期為50至55個月。目前用於多發性骨髓瘤之治療係聚焦在漿細胞細胞凋亡及/或降低破骨細胞活性(例如化療、沙利竇邁(thalidomide)、來那竇胺(lenalidomide)、雙磷酸鹽及/或蛋白酶體抑制劑，諸如硼替佐米(VELCADE®)或卡非佐米(carfilzomib))。然而，多發性骨髓瘤仍為不治之症且幾乎所有患者均已對這些藥劑發展出耐藥性且最終復發。因此，多發性骨髓瘤之替代治療(諸如使用抗BCMA拮抗劑，包括BCMA特異性CAR和BCMA特異性CAR-T細胞)將成為卓越之治療劑。
本發明提供結合BCMA之嵌合型抗原受體類(CARs)。某些BCMA特異性CAR顯示出當表現在T細胞中時，並當其與BCMA接觸時可有效活化T細胞。有利的是，本發明所提供之BCMA特異性CAR結合人類及獼猴BCMA。亦有利的是，本發明所提供之BCMA特異性CAR-T細胞當與表現BCMA之細胞接觸時可展現出脫粒活性、增加干擾素γ之製造及/或細胞毒性活性。
於一態樣中，本發明提供包含胞外配體結合結構域、第一跨膜結構域和胞內信號傳導結構域之BCMA特異性CAR，其中該胞外配體結合結構域包含(a)重鏈可變(VH)區及/或(b)輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含 (i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含序列SYX1MX2(其中X1為A或P；且X2為T、N或S)(SEQ ID NO：301)、GFTFX1SY(其中X1為G或S)(SEQ ID NO：302)、或GFTFX1SYX2MX3(其中X1為G或S，X2為A或P；且X3為T、N或S)(SEQ ID NO：303)；(ii)VH CDR2，其包含序列AX1X2X3X4GX5X6X7X8YADX9X10KG(其中X1為I、V、T、H、L、A或C；X2為S、D、G、T、I、L、F、M或V；X3為G、Y、L、H、D、A、S或M；X4為S、Q、T、A、F或W；X5為G或T；X6為N、S、P、Y、W或F；X7為S、T、I、L、T、A、R、V、K、G或C；X8為F、Y、P、W、H或G；X9為V、R或L；且X10為G或T)(SEQ ID NO：305)或X1X2X3X4X5X6(其中X1為S、V、I、D、G、T、L、F或M；X2為G、Y、L、H、D、A、S或M；X3為S、G、F或W；X4為G或S；X5為G或T；且X6為N、S、P、Y或W)(SEQ ID NO：306)；和iii)VH CDR3，其包含序列VSPIX1X2X3X4(其中X1為A或Y；X2為A或S；且X3為G、Q、L、P或E)(SEQ ID NO：307)或YWPMX1X2(其中X1為D、S、T或A；且X2為I、S、L、P或D)(SEQ ID NO：308)；且該輕鏈可變(VL)區包含(i)VL CDR1，其包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(其中X1為R、G、W、A或C；X2為A、P、G、L、C或S；X3為S、G或R；X4為Q、C、E、V或I；X5為S、L、P、G、A、R或D；X6為V、G或I；X7為S、E、D或P；X8為S、P、F、A、 M、E、V、N、D或Y；X9為I、T、V、E、S、A、M、Q、Y、H或R；X10為Y或F；X11為L、W或P；且X12為A、S或G)(SEQ ID NO：309)；(ii)VL CDR2，其包含序列X1ASX2RAX3(其中X1為G或D；X2為S或I；且X3為T或P)(SEQ ID NO：310)；和(iii)VL CDR3，其包含序列QQYX1X2X3PX4T(其中X1為G、Q、E、L、F、A、S、M、K、R或Y；X2為S、R、T、G、V、F、Y、D、A、H、V、E、K或C；X3為W、F或S；且X4為L或I)(SEQ ID NO：311)或QQYX2X2X3PX4(其中X1為G、Q、E、L、F、A、S、M、R、K或Y；X2為S、R、T、G、R、V、D、A、H、E、K、C、F或Y；X3為W、S或F；且X4為L或I)(SEQ ID NO：312)。
於另一態樣中，本發明提供包含胞外配體結合結構域、第一跨膜結構域和胞內信號傳導結構域之BCMA特異性CAR，其中該胞外結構域包含單鏈Fv片段(scFv)，該單鏈Fv片段(scFv)包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含三個來自VH區之CDR，該VH區包含SEQ ID NO：33、72、39、76、83、92、25或8所示之序列；該輕鏈可變(VL)區包含三個來自VL區之CDR，該VL區包含SEQ ID NO：34、73、40、77、84、93、18或80所示之序列。於一些實施態樣中，該VH區可包含SEQ ID NO：33、72、39、76、83、92、25或8所示之序列或其變體，該變體在不位於CDR內之殘基具有一或數個保守性胺基酸取代及/或該VL區可包含 SEQ ID NO：34、73、40、77、84、93、18或80所示之胺基酸序列或其變體，該變體在不位於CDR內之胺基酸具有一或數個胺基酸取代。
於一些實施態樣中，本發明所提供之BCMA特異性CAR的胞外配體結合結構域包含(2)重鏈可變(VH)區及/或(b)輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含SEQ ID NO：150、151、152、156、157、129、130或131所示之序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO：153、154、187、188、165、166、162、159、190、191、169、154、139、140、132或133所示之序列；和(iii)VH CD3，其包含SEQ ID NO：155、161、134或137所示之序列；且該輕鏈可變(VL)區包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO：209、249、226、251、262、271、217或377所示之序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO：221、252或210所示之序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO：222、225、227、253、263、272、216或214所示之序列。
於一些實施態樣中，本發明所提供之BCMA特異性CAR的胞外配體結合結構域包含(a)重鏈可變(VH)區及/或(b)輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含SEQ ID NO：150、151或152所示之序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO：153或154所示之序列；和(iii)VH CD3，其包含SEQ ID NO：155所示之序列；且該輕鏈可變(VL)區包含(i)VL CDR1， 其包含SEQ ID NO：209所示之序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO：221所示之序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO：222所示之序列。
於一些實施態樣中，本發明所提供之BCMA特異性CAR的胞外配體結合結構域包含(a)重鏈可變(VH)區及/或(b)輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含SEQ ID NO：150、151或152所示之序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO：187或188所示之序列；和(iii)VH CD3，其包含SEQ ID NO：155所示之序列；且該輕鏈可變(VL)區包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO：249所示之序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO：221所示之序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO：225所示之序列。
於一些實施態樣中，本發明所提供之BCMA特異性CAR的胞外配體結合結構域包含(a)重鏈可變(VH)區及/或(b)輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含SEQ ID NO：150、151或152所示之序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO：165或166所示之序列；和(iii)VH CD3，其包含SEQ ID NO：155所示之序列；且該輕鏈可變(VL)區包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO：226所示之序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO：221所示之序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO：227所示之序列。
於一些實施態樣中，本發明所提供之BCMA特異性 CAR的胞外配體結合結構域包含(a)重鏈可變(VH)區及/或(b)輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含SEQ ID NO：156、151或157所示之序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO：162或159所示之序列；和(iii)VH CD3，其包含SEQ ID NO：161所示之序列；且該輕鏈可變(VL)區包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO：251所示之序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO：252所示之序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO：253所示之序列。
於一些實施態樣中，本發明所提供之BCMA特異性CAR的胞外配體結合結構域包含(a)重鏈可變(VH)區及/或(b)輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含SEQ ID NO：156、151或157所示之序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO：190或191所示之序列；和(iii)VH CD3，其包含SEQ ID NO：161所示之序列；且該輕鏈可變(VL)區包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO：262所示之序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO：252所示之序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO：263所示之序列。
於一些實施態樣中，本發明所提供之BCMA特異性CAR的胞外配體結合結構域包含(a)重鏈可變(VH)區及/或(b)輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含SEQ ID NO：150、151或152所示之序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO：169或 154所示之序列；和(iii)VH CD3，其包含SEQ ID NO：155所示之序列；且該輕鏈可變(VL)區包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO：271所示之序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO：221所示之序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO：272所示之序列。
於一些實施態樣中，本發明所提供之BCMA特異性CAR的胞外配體結合結構域包含(a)重鏈可變(VH)區及/或(b)輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含SEQ ID NO：129、130或131所示之序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO：139或140所示之序列；和(iii)VH CD3，其包含SEQ ID NO：134所示之序列；且該輕鏈可變(VL)區包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO：217所示之序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO：210所示之序列；和(iii)VL CDR3，其包含SEQ ID NO：216所示之序列。
於一些實施態樣中，本發明所提供之BCMA特異性CAR的胞外配體結合結構域包含(a)重鏈可變(VH)區及/或(b)輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含SEQ ID NO：129、130或131所示之序列；(ii)VH CDR2，其包含SEQ ID NO：132或133所示之序列；和(iii)VH CD3，其包含SEQ ID NO：137所示之序列；且該輕鏈可變(VL)區包含(i)VL CDR1，其包含SEQ ID NO：377所示之序列；(ii)VL CDR2，其包含SEQ ID NO：210所示之序列；和(iii)VL CDR3，其 包含SEQ ID NO：214所示之序列。
於一些實施態樣中，該胞內信號傳導結構域包含CD3 ζ信號傳導結構域。於一些實施態樣中，該胞內信號傳導結構域包含4-1BB結構域。於一些實施態樣中，該CAR可進一步包含另一胞內信號傳導結構域。於一些實施態樣中，該另外之胞內信號傳導結構域可包含4-1BB結構域。
於一些實施態樣中，該CAR在胞外配體結合結構域和第一跨膜結構域之間可包含莖結構域。於一些實施態樣中，該莖結構域可選自由下列所組成之群組：人CD8 α鉸鏈、lgG1鉸鏈及Fc γ R Ⅲ α鉸鏈。
於一些實施態樣中，該第一跨膜結構域可包含CD8 α鏈跨膜結構域。
於一些實施態樣中，該CAR可包含CD20抗原決定部位。
於一些實施態樣中，該CAR可包含另一非特異於BCMA之胞外配體結合結構域。
於一些實施態樣中，該BCMA特異性CAR可包含SEQ ID NO：396所示之胺基酸序列。
於CAR之一些實施態樣中，該胞外配體結合結構域、第一跨膜結構域和胞內信號傳導結構域係在單一多肽上。
於一些實施態樣中，該CAR可包含第二跨膜結構域，其中該第一跨膜結構域和該胞外配體結合結構域係在 第一多肽上，且其中該第二跨膜結構域和該胞內信號傳導結構域係在第二多肽上，其中該第一跨膜結構域包含來自該高親和性IgE受體(Fc ε RI)之α鏈的跨膜結構域且該第二跨膜結構域包含來自Fc ε RI之γ或β鏈的跨膜結構域。於一些實施態樣中，該CAR可包含第三多肽，該第三多肽包含與來自共刺激分子之胞內信號傳導結構域融合的第三跨膜結構域，其中該第三跨膜結構域包含來自Fc ε RI之γ或β鏈的跨膜結構域。
於另一態樣中，本發明提供經分離之多核苷酸，其包含編碼如本文所描述之BCMA特異性CAR的核酸序列。
於另一態樣中，本發明提供表現載體，其包含編碼如本文所描述之BCMA特異性CAR抗體的核酸序列。
於另一態樣中，本發明提供其細胞膜表面表現如本文所描述之BCMA特異性CAR的經遺傳工程處理之免疫細胞。於一些實施態樣中，該經遺傳工程處理之免疫細胞可包含另一非特異於BCMA之CAR。於一些實施態樣中，該經遺傳工程處理之免疫細胞可包含編碼自殺性多肽之多核苷酸。於一些實施態樣中，該自殺性多肽為RQR8。
於一些實施態樣中，該免疫細胞可源自炎性T淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞、調節性T淋巴細胞或輔助型T淋巴細胞。
於一些實施態樣中，該經遺傳工程處理之免疫細胞 可包含破壞一或多個內源基因，其中該內源基因編碼TCR α、TCR β、CD52、糖皮質激素受體(GR)、脫氧胞苷激酶(DCK)或免疫檢查點蛋白，諸如，例如程序性死亡-1(PD-1)。
於一些實施態樣中，該免疫細胞係從健康供體取得。於一些實施態樣中，該免疫細胞係從患者取得。
於另一態樣中，本發明提供其細胞膜表面表現如本文所描述之BCMA特異性CAR的經遺傳工程處理之免疫細胞來作為藥物。於一些實施態樣中，該藥物係用於治療選自由下列所組成之群組的B細胞相關癌症：多發性骨髓瘤、惡性漿細胞瘤、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、結節性淋巴細胞為主的何杰金氏淋巴瘤、卡勒氏病(Kahler's disease)和骨髓性白血病(Myelomatosis)、漿細胞白血病、漿細胞瘤(plasmacytoma)、B細胞前淋巴細胞性白血病、髮細胞白血病、B細胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性髓細胞性白血病(CML)、濾泡性淋巴瘤、伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤、髓性白血病、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulienemia)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、黏膜相關之淋巴組織淋巴瘤、小細胞淋巴細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、原發性縱隔(胸腺)大B-細胞淋巴 瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、結節性邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、T細胞/組織細胞富集之大B細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性皮膚瀰漫性大B細胞淋巴瘤(腿型)、老年EBV陽性瀰漫性大B細胞淋巴瘤、與發炎相關之瀰漫性大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、起源於HHV8相關之多中心性卡斯爾曼(Castleman)病的大B細胞淋巴瘤、介於瀰漫性大B細胞淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤特徵之間不能分類的B細胞淋巴瘤、介於瀰漫性大B細胞淋巴瘤和經典何杰金氏淋巴瘤特徵之間不能分類的B細胞淋巴瘤及其他B細胞相關之淋巴瘤。
於另一態樣中，本發明提供遺傳工程處理免疫細胞的方法，其包含：提供免疫細胞；及在該細胞之表面表現至少一種如本文所描述之BCMA特異性CAR。
於一些實施態樣中，該方法包含：提供免疫細胞；將至少一個編碼該BCMA特異性CAR之多核苷酸引入該細胞；及表現被引入該細胞之多核苷酸。
於一些實施態樣中，該方法包含提供免疫細胞；將至少一個編碼該BCMA特異性CAR之多核苷酸引入細胞；及引入至少一個非特異於BCMA之其他CAR。
於另一態樣中，本發明提供治療罹患與惡性細胞相關之病症的個體之方法，該方法包含：提供於其表面表現 如本文所描述之BCMA特異性CAR的免疫細胞；及將該免疫細胞投予該患者。
於另一態樣中，本發明提供包含如本文所描述之經遺傳工程處理之免疫細胞的醫藥組成物。
於另一態樣中，本發明提供治療個體之與表現BCMA的惡性細胞相關的病症之方法，該方法包含投予有此需要之個體有效量之醫藥組成物，該醫藥組成物為包含如本文所描述之經遺傳工程處理之免疫細胞的申請專利的醫藥組成物。於一些實施態樣中，該病症為癌症。於一些實施態樣中，該癌症為選自由下列所組成之群組的B細胞相關癌症：多發性骨髓瘤、惡性漿細胞瘤、何杰金氏淋巴瘤、結節性淋巴細胞為主的何杰金氏淋巴瘤、卡勒氏病和骨髓性白血病、漿細胞白血病、漿細胞瘤、B細胞前淋巴細胞性白血病、髮細胞白血病、B細胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性髓細胞性白血病(CML)、濾泡性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤、髓性白血病、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、黏膜相關之淋巴組織淋巴瘤、小細胞淋巴細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、原發性縱隔(胸腺)大B-細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、結節性邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、血 管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、T細胞/組織細胞富集之大B細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性皮膚瀰漫性大B細胞淋巴瘤(腿型)、老年EBV陽性瀰漫性大B細胞淋巴瘤、與發炎相關之瀰漫性大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、起源於HHV8相關之多中心性卡斯爾曼病的大B細胞淋巴瘤、介於瀰漫性大B細胞淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤特徵之間不能分類的B細胞淋巴瘤、介於瀰漫性大B細胞淋巴瘤和經典何杰金氏淋巴瘤特徵之間不能分類的B細胞淋巴瘤及其他B細胞相關之淋巴瘤。
於另一態樣中，本發明提供抑制具有表現BCMA之惡性細胞的個體之腫瘤生長或進展的方法，其包含投予有此需要之個體有效量之包含如本文所描述之經遺傳工程處理的免疫細胞之醫藥組成物。
於另一態樣中，本發明提供抑制個體的表現BCMA之惡性細胞轉移的方法，其包含投予有此需要之個體有效量之包含如本文所描述之經遺傳工程處理之免疫細胞的醫藥組成物。
於另一態樣中，本發明提供誘導具有表現BCMA之惡性細胞的個體之腫瘤消退的方法，其包含投予有此需要之個體有效量之包含如本文所描述之經遺傳工程處理的免疫細胞之醫藥組成物。
於一些實施態樣中，上述之任一方法進一步包含投 予一或多種另外之療法，諸如，例如單株抗體及/或化療劑。於一些實施態樣中，該單株抗體可為，例如結合檢查點抑制劑之抗體，諸如，例如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。於一些實施態樣中，上述之任一方法進一步包含投予個體核苷類似物療法，諸如，例如氟達拉濱(fludarabine)或氯法拉濱(clofarabine)。
詳細說明
本文所揭示之發明提供嵌合型抗原受體類(CARs)和包含特異結合BCMA(例如人BCMA)之CAR的免疫細胞(CAR-T細胞)。本發明亦提供編碼這些CAR之多核苷酸、包含這些CAR-T細胞之組成物及製造和使用這些CAR及CAR-T細胞的方法。本發明亦提供用於治療個體之與惡性BCMA表現相關之病症(諸如癌症)的方法。
通用技術
除非另外指明，本發明之實作將採用本技藝之技術範圍內的習知之分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學技術。該等技術在，諸如下列文獻中有充分解釋：Molecular Cloning：A Laboratory Manual,second edition(Sambrook et al.,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed., 1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths，和D.G.Newell,eds.,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction(Mullis et al.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd和C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)。
定義
如本文所使用之術語“胞外配體結合結構域”係指能夠結合配體之寡肽或多肽。較佳地，該結構域將能與細胞表面分子交互作用。例如，該胞外配體結合結構域可經選擇以識別該作為與特定疾病狀態相關之靶的細胞上的細胞表面標記之配體。
本文中，術語“莖結構域”或“鉸鏈結構域”可互換使用以指任何用於將跨膜結構域與胞外配體結合結構域連接之寡肽或多肽。尤其是，莖結構域係用於提供胞外配體結合結構域更多彈性且更易於接近。
術語“胞內信號傳導結構域”係指轉導該效應子信號功能信號並指導細胞執行專門功能之蛋白質部分。
如本文所使用之“共刺激分子”係指在T細胞上，與共刺激配體特異結合，從而介導該細胞之共刺激反應(諸如，但不限於增殖)的同源結合伴侶。共刺激分子包括，但不限於第I類MHC分子、BTLA和Toll配體受體。共刺激分子之實例包括CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特異結合CD83之配體，等。
“共刺激配體”係指在抗原呈遞細胞上之分子，其特異結合T細胞上之同源共刺激信號分子從而提供除了由例如TCR/CD3複合物與裝載肽之MHC分子結合所提供的主信號外，還有介導T細胞反應(包括，但不限於增殖、 活化、分化，等)之信號。共刺激配體可包括，但不限於CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可誘導之共刺激配體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、結合Toll配體受體之激動劑或抗體及特異結合B7-H3之配體。此外，共刺激配體亦包含特異結合呈現在T細胞上之共刺激分子(諸如，但不限於CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、特異結合CD83之配體)的抗體。
“抗體”為能夠透過至少一個位於免疫球蛋白分子之可變區中的抗原識別位點特異結合靶的(諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽，等)之免疫球蛋白分子。如本文所使用者，該術語不僅包含完整的多株或單株抗體，亦包含其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)和結構域抗體(包括，例如鯊魚和駱駝抗體)及包含抗體之融合蛋白，和包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子的任何其他經修飾之結構。抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA或IgM抗體(或其子類別)，且抗體不必為任何特定類別。根據免疫球蛋白之重鏈恆定區的抗體胺基酸序列，該免疫球蛋白可歸入不同類別。免疫球蛋白有五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有幾種可進一步被分成子類別(同種型)，例如lgG1、lgG2、IgG3、 IgG4、lgA1和lgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定區分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類別之免疫球蛋白的次單位結構和三維構型已為人所熟知。
如本文所使用之術語抗體之“抗原結合片段”或“抗原結合部分”係指保留特異結合指定抗原(例如BCMA)之能力的一或多個完整抗體的片段。抗體之抗原結合功能可由完整抗體之片段執行。包含在術語抗體之“抗原結合片段”內的結合片段之實例包括：Fab；Fab'；F(ab')2；由VH和CH1結構域所組成之Fd片段；由抗體之單臂的VL和VH結構域所組成之Fv片段；單結構域抗體(dAb)片段(Ward et al.,Nature 341：544-546，1989)及分離之互補決定區(CDR)。
“優先結合”或“特異結合”(本文中可互換使用)靶的(例如BCMA蛋白)之抗體、抗體軛合物或多肽為本技藝中所充分理解之術語，且測定該等特異或優先結合之方法亦為本技藝所熟知。若分子與特定細胞或物質之反應或聯結較其與替代之細胞或物質之反應或聯結更頻繁、更迅速、持續時間更長及/或親和性更強，則該分子被稱為顯示出“特異結合”或“優先結合”。若抗體與靶的之結合較其與其他物質結合時親和性更強、活動力更強、更容易及/或持續時間更長，則該抗體係“特異結合”或“優先結合”該靶的。例如，特異或優先結合一BCMA抗原決定部位之抗體為相較於與其他BCMA抗原決定部位或非BCMA抗原決定部位之結合，該抗體以更強之親和性、活 動力、更容易及/或持續時間更長來與該抗原決定部位結合。藉由閱讀此定義，可理解的是，例如特異或優先結合第一靶的之抗體(或部分或抗原決定部位)可能或可能不會特異或優先結合第二靶的。因此，“特異結合”或“優先結合”不一定需要(雖然可包括)專一結合。通常，但不一定地，提及結合時係意指優先結合。
抗體之“可變區”係指抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區(單獨或組合的)。如本技藝所已知者，重鏈和輕鏈之可變區各自由4個藉由3個互補決定區(CDR)(亦稱為高度可變區)連接之框架區(FR)所組成。每一鏈中之CDR藉由FR而保持極為接近，並與來自另一條鏈之CDR一起促成抗體之抗原結合位點形成。有至少二種技術可用於決定CDR：(1)基於跨物種序列變異性之方法(即，Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th ed.,1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))；和(2)基於抗原-抗體複合物之晶體學研究的方法(Al-lazikani et al.,1997,J.Molec.Biol.273：927-948)。如本文所使用者，CDR可指藉由任一方法或藉由二種方法之組合所定義之CDR。
可變結構域之“CDR”為在可變區內，根據Kabat、Chothia之定義、Kabat和Chothia二者之累積、AbM、接觸及/或構形定義或本技藝中熟知之測定CDR之任何方法鑑別的胺基酸殘基。抗體CDR可被看作是最初由Kabat et al.定義之高度可變區。參見，例如Kabat et al., 1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NIH,Washington D.C。CDR之位置亦可被看作是最初由Chothia和其他人描述之結構環結構。參見，例如Chothia et al.,Nature 342：877-883,1989。其他識別CDR之方式包括“AbM定義”(此為Kabat與Chothia之間的折衷定義且係使用Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體(現在為Accelrys®)推衍而來)或基於觀察到之抗原接觸的CDR“接觸定義”(此闡述於MacCallum et al.,J.Mol.Biol.,262：732-745,1996中)。於另一方法中，本文中稱為CDR之“構形定義”，該CDR之位置可被看作是使焓促成抗原結合的殘基。參見，例如Makabe et al.,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166,2008。還有其他CDR邊界定義可能未嚴格遵循上述方式之一，但仍與至少一部分之Kabat CDR重疊，雖然其根據預測或實驗的研究結果可能有縮短或加長，特定殘基或殘基群或甚至整個CDR並不會顯著影響抗原結合。如本文所使用者，CDR可指由本技藝中已知之任何方式(包括方式之組合)定義的CDR。本文所使用之方法可利用根據這些方式中之任一者定義的CDR。對於任何含有一個以上之CDR的指定實施態樣，該CDR可根據Kabat、Chothia、延伸的、AbM，接觸及/或構象定義中之任一者定義。
如本文中所使用之“單株抗體”係指從基本上同質之抗體群取得之抗體，即，包含在群體中之個別抗體為完 全相同，除了可少量存在之可能的天然突變。單株抗體為高度特異性，針對單一抗原位點。此外，與多株抗體製劑相反(其通常包括針對不同決定簇(抗原決定部位)之不同抗體)，每個單株抗體係針對該抗原上之單一決定簇。修飾語“單株”係表示該抗體從基本上同質之抗體群取得的特性，且不應被解釋為需要藉由任何特定方法製造該抗體。例如，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由最先由Kohler和Milstein,Nature 256：495,1975中描述之雜交瘤方法製造或可藉由諸如美國專利案第4,816,567號中描述之重組DNA方法製造。亦可從使用，例如McCafferty et al.,Nature 348：552-554,1990中描述之技術產生的噬菌體庫中分離出該單株抗體。
如本文中所使用之“人化”抗體係指為嵌合型免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其含有源自非人免疫球蛋白之最小序列的片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗體之抗原結合子序列)的非人形式(例如鼠類)抗體。較佳地，人化抗體為人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自該接受者之互補性決定區(CDR)的殘基被來自具有所需之特異性、親和性和能力的非人物種(諸如小鼠、大鼠或兔)之CDR(供體抗體)的殘基所取代。在一些情況下，人免疫球蛋白之Fv框架區(FR)殘基被對應之非人殘基替換。此外，該人化抗體可包含既未在接受者抗體中，亦未在輸入之CDR或框架序列中找到，但可被包含在抗體中以進一步精修和優化抗體性能的殘基。一般而言，該人化抗體將包含基本 上全部之至少一個，通常為二個可變域，其中全部或基本上全部之CDR區對應於非人免疫球蛋白之CDR區且全部或基本上全部之FR區為人免疫球蛋白共有序列之FR區。該人化抗體理想上亦將包含至少一部分之免疫球蛋白恆定區或結構域(Fc)，通常為人免疫球蛋白所具者。較佳為具有依WO99/58572中之描述修飾的Fc區之抗體。人化抗體之其他形式具有一或多個相關於該原始抗體改變之CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDR H3)，其亦稱為“源自”一或多個來自該原始抗體之CDR的一或多個CDR。
如本文中所使用者，“人抗體”意指具有對應於由人製造之抗體的序列及/或使用本技藝之技術熟習人士所已知或本文所揭示之製造人抗體的任何技術製造之抗體的序列的胺基酸序列之抗體。人抗體之定義包括含有至少一個人重鏈多肽或至少一個人輕鏈多肽之抗體。該等實例之一為包含鼠輕鏈和人重鏈多肽之抗體。人抗體可使用本技藝中已知之各種技術製造。於一實施態樣中，該人抗體係選自噬菌體庫，其中該噬菌體庫表現人抗體(Vaughan et al.,Nature Biotechnology,14：309-314,1996；Sheets et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：6157-6162,1998；Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227：381,1991；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222：581,1991)。人抗體亦可藉由將動物免疫化來製造，該動物中已藉由轉基因方式引入人免疫球蛋白基因座來替代內源基因座，例如其中該內源 性免疫球蛋白基因已被部分或完全去活化之小鼠。此方法描述於美國專利第5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016號中。替代地，該人抗體可藉由將產生針對靶抗原之抗體的人B淋巴細胞永生化來製備(該等B淋巴細胞可從個體或從cDNA之單細胞選殖株回收，或可能已經在玻管內被免疫化)。參見，例如Cole et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R,Liss,p.77,1985；Boerner et al.,J.Immunol.,147(1)：86-95,1991；和美國專利案第5,750,373號。
術語“嵌合型抗體”意指其中該可變區序列係源自一個物種，而恆定區序列係源自另一物種的抗體，諸如其中該可變區序列係源自小鼠抗體，而該恆定區序列係源自人抗體的抗體。
本文中，術語“多肽”、“寡肽”、“肽”及“蛋白質”可互換使用以用於指具有任何長度之胺基酸鏈，較佳地，相對短者(例如10至100個胺基酸)。該鏈可為直鏈型或支鏈型，其可包含經修飾之胺基酸及/或可被非胺基酸中斷。該術語亦包含已經天然修飾或藉由干預修飾(例如形成二硫鍵、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，諸如與標記組分軛合)之胺基酸鏈。該定義亦包括，例如含有一或多個胺基酸類似物(包括，例如非天然胺基酸，等)及本技藝中已知之其他修飾的多肽。可理解的是，該多肽可能以單鏈或結合鏈形式發生。
“單價抗體”為每分子包含一個抗原結合位點(例如IgG或Fab)。在一些情況下，單價抗體可具有一個以上之抗原結合位點，但該結合位點係來自不同抗原。
“二價抗體”為每分子包含二個抗原結合位點(例如IgG)。在一些情況下，該二個結合位點具有相同的抗原特異性。然而，二價抗體可為雙特異性的。
“雙特異性”、“雙重特異性”或“雙功能”抗體為具有二個不同抗原結合部位之雜交抗體。雙特異性抗體的二個抗原結合位點結合二個不同抗原決定部位，該二個不同的抗原決定部位可位在相同或不同的蛋白質靶的。
本發明之抗體可使用本技藝中所周知之技術製造，例如重組技術、噬菌體展示技術、合成技術或該等技術之組合或本技藝中可輕易瞭解的其他技術(參見，例如Jayasena,S.D.,Clin.Chem.,45：1628-50,1999和Fellouse,F.A.,et al,J.Mol.Biol.,373(4)：924-40,2007)。
如本技藝中所已知，本文中“多核苷酸”或“核酸”可互換使用，其指為任何長度之核苷酸鏈且包括DNA和RNA。該核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物，或為可藉由DNA或RNA聚合酶併入鏈中的任何受質。多核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化之核苷酸及其類似物。若存在的話，可能在鏈組裝之前或之後賦予對該核苷酸結構之修飾。核苷酸序列可被非核苷酸組分中斷。多核苷酸可在聚合後被進一步修飾，諸如藉由與標記組分軛合。其他 類型之修飾包括，例如“帽(caP)”、以類似物取代一或多個天然存在之核苷酸、間核苷酸修飾，諸如，例如具不帶電荷之鍵聯(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯，等)和帶電荷之鍵聯(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，等)者、含有側基部分，諸如，例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴胺酸，等)者、具嵌人劑(例如吖啶、補骨脂素(psoralen)，等)者、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬，等)者、含有烷化劑者、具有經修飾之鍵聯者(例如α異頭體核酸(anomeric nucleic acid)，等)及未經修飾之多核苷酸形式。此外，通常存在於糖中之任何羥基團可被，例如膦酸基、磷酸基替換、被標準保護基保護、或經活化以製備與另外之核苷酸的另外鍵聯，或可與固體支持物軛合。該5'和3'端OH可被磷酸化或以胺或具有1至20個碳原子之有機加帽基團部分取代。其他羥基亦可被衍生為標準保護基。多核苷酸亦可含有本技藝中一般所知之核糖或脫氧核糖類之類似物形式，包括，例如2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-或β-異頭體糖類、表異構糖類，諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖(lyxose)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose)、無環類似物和無鹼基核苷類似物，諸如甲基核糖核苷。一或多個磷酸二酯鍵聯可被替換之連接基團所取代。這些替代之連接基團包括，但不限於其中磷酸鹽被下列群組替換之實施態樣：P(O)S(“硫代酸鹽”)，P(S)S(“二硫代酸 鹽”)、(O)NR2(“醯胺酸鹽”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲縮醛(formacetal)”)，其中各R或R'係獨立為H或經取代或未經取代之烷基(1-20C)(其可選擇地含有醚(-O-)鍵聯、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基)。多核苷酸中之鍵聯並不需要全部相同。前述內容適用於本文所提及之所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
如本技藝中所已知地，抗體之“恆定區”係指抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區，無論是單獨或組合的。
如本文中所使用者，“基本上純質”係指物質為至少50%純質(即，不含污染物)，較佳為至少90%純質，更佳為至少95%純質，再更佳為至少98%純質，且最佳為至少99%純質。
“宿主細胞”包括可為或已為載體之接受者以納入多核苷酸插入物之個別細胞或細胞培養。宿主細胞包括單一宿主細胞之子代且由於天然、偶然或故意之突變，該子代不一定與原始親本細胞完全相同(在形態學或基因組DNA互補性方面)。宿主細胞包括在體內經本發明之多核苷酸轉染的細胞。
如本文所使用之“免疫細胞”係指功能上涉及起始及/或執行先天性及/或適應性免疫反應之造血起源細胞。
如本技藝中所已知者，術語“Fc區”係用於定義免疫球蛋白重鏈之C-端區。“Fc區”可為天然序列Fc區或變體Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區的邊界可能有變 化，但人IgG重鏈Fc區通常被定義為從位置Cys226或Pro230之胺基酸殘基延伸至其羧基端。Fc區中之殘基編號為如Kabat中之EU索引的編號。Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白之Fc區一般包含兩個恆定區，CH2和CH3。
如本技藝中所使用者，“Fc受體”和“FcR”係描述結合抗體之Fc區的受體。較佳之FcR為天然序列人FcR。再者，較佳之FcR為結合IgG抗體者(γ受體)且包括Fc γ RI、Fc γ R Ⅱ和Fc γ R Ⅲ亞類之受體，包括等位基因變體及這些受體之選擇性剪接(alternatively splicing)形式。Fc γ R Ⅱ受體包括Fc γ R Ⅱ A(“活化受體”)和Fc γ R Ⅱ B(“抑制受體”)，它們具有主要差別在於其胞質結構域的類似胺基酸序列。FcR之檢閱參見Ravetch和Kinet,Ann.Rev.Immunol.,9：457-92,1991；Capel et al.,Immunomethods,4：25-34,1994；及de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.,126：330-41,1995。“FcR”亦包括新生兒受體，FcRn，其負責將母體IgG轉移給胎兒(Guyer et al.,J.Immunol.,117：587,1976；及Kim et al.,J.Immunol.,24：249,1994)。
本文中關於抗體所使用之術語“競爭”意指第一抗體或其抗原結合片段(或部分)以充分類似於第二抗體或其抗原結合部分結合之方式結合抗原決定部位，因而當第二 抗體存在時，第一抗體與其同源抗原決定部位之結合結果將較無第二抗體存在時之第一抗體的結合結果可檢測地降低。替換之情況(其中該第二抗體與其抗原決定部位之結合結果在第一抗體存在時亦為可檢測地降低)亦有可能，但不必然是這種情況。即，第一抗體可抑制第二抗體與其抗原決定部位結合，但第二抗體不會抑制第一抗體與其各別抗原決定部位結合。然而，當各抗體可檢測地抑制另一抗體與其同源抗原決定部位或配體結合時(不論是否以相同、較大或較小之程度)，該抗體被稱為彼此“交叉競爭”與其各別抗原決定部位結合。競爭性和交叉競爭性抗體均包含在本發明中。不論該等競爭或交叉競爭係藉由何種機制發生(例如位阻、構象變化或結合至共同之抗原決定部位或其部分)，本技藝之技術熟習人士基於本文所提供之教示內容將理解該等競爭性及/或交叉競爭性抗體被包含在本發明中且可用於本文所揭示之方法。
如本文所使用之“自體”意指用於治療患者之細胞、細胞系或細胞群係源自該患者或源自人類白血球抗原(HLA)相容供體。
如本文所使用之“同種異體(allogeneic)”係指用於治療患者之細胞或細胞群並非源自該患者，而是來自供體。
如本文所使用之“治療”為用於取得有益或期望之臨床結果的方法。在本發明之目的方面，有益或期望之臨床結果包括，但不限於下列之一或多項：減少腫瘤或癌細胞之增殖(或破壞)、抑制腫瘤細胞之轉移、縮小或降低 BCMA表現腫瘤之大小、BCMA相關疾病(例如癌症)之緩解、減少由BCMA相關疾病導致之症狀(例如癌症)、增加罹患BCMA相關疾病(例如癌症)者之生活品質、減少治療BCMA相關疾病(例如癌症)所需之其他藥物的劑量、延遲BCMA相關疾病(例如癌症)之進展、治癒BCMA相關疾病(例如癌症)及/或延長患有BCMA相關疾病(例如癌症)之患者的生存。
“改善”意指與未投予BCMA抗體或BCMA抗體軛合物相比較，一或多種症狀減輕或改善。“改善”亦包括縮短或減少症狀之持續時間。
如本文所使用之藥物、化合物或醫藥組成物之“有效劑量”或“有效量”為足以使任一或更多有益或期望之結果生效的量。在預防用途方面，有益或期望之結果包括排除或降低風險、減輕嚴重性或延遲疾病開始，包括該疾病之生化學、組織學及/或行為症狀、其併發症和疾病發展期間呈現之中間病理學表型。在治療用途方面，有益或期望之結果包括患者的臨床結果，諸如降低各種BCMA相關疾病或病症(諸如，例如多發性骨髓瘤)之一或多種症狀的發生率或改善該症狀、降低治療該疾病所需之其他藥物的劑量、增強另一種藥物治療之效果及/或延緩該病患之與BCMA相關疾病的進展。有效劑量可在一或多次投予中投予。在本發明之目的方面，藥物、化合物或醫藥組成物之有效劑量為足以直接或間接完成預防性或治療性治療之量。如同在臨床背景下所理解者，藥物、化合物或醫藥 組成物之有效劑量可能是或可能不是連同另一藥物、化合物或醫藥組成物來達到。因此，在投予一或多種治療劑之背景下，可考慮“有效劑量”，而單一藥劑若是連同一或多種其他藥劑投予時可考慮投予有效量以用來或以取得期望之結果。
“個人”或“個體”為哺乳動物，更佳為人。哺乳動物亦包括，但不限於農場動物、運動動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠和大鼠。
如本文所使用者，“載體”意指能夠遞送，且較佳地，在宿主細胞中表現一或多種所欲基因或所欲序列之構建體。載體之實例包括，但不限於病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質粒、黏粒或噬菌體載體、與陽離子縮合劑聯結之DNA或RNA表現載體、包封在脂質體中之DNA或RNA表現載體及某些真核細胞，諸如製造者細胞。
如本文所使用之“表現控制序列”意指指導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子，諸如組成型或誘導型啟動子或增強子。表現控制序列係可操作地連接至欲轉錄之核酸序列。
如本文所使用之“醫藥上可接受之載體”或“醫藥上可接受之賦形劑”包括任何當與活性成分組合時可允許該成分保留生物活性且不與該個體之免疫系統反應的物質。實例包括，但不限於任何標準之藥物載體，諸如磷酸鹽緩衝之鹽水溶液、水、乳劑(諸如油/水乳劑)和各種類型 之潤濕劑。用於氣霧劑或胃腸道外投予之較佳稀釋劑為磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)或生理(0.9%)鹽水。包含該等載體之組成物係藉由為人熟知之習知方法配製(參見，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed.Mack Publishing,2005)。
如本文所使用之術語“kon”係指抗體與抗原結合之速率常數。
如本文所使用之術語“koff”係指抗體從抗體/抗原複合物解離之速率常數。
如本文所使用之術語“KD值”係指抗體-抗原交互作用之平衡解離常數。
本文中當數值或參數提及“約”時包括(且描述)針對該數值或參數本身之實施態樣。例如，關於“約X”之描述包括對“X”之描述。數字範圍包括定義該範圍之數字。
可理解的是，只要是本文中以“包含”描述之實施態樣，亦提供以術語“由...所組成”及/或“基本上由...所組成”描述的其他類似之實施態樣。
當本發明之態樣或實施態樣係就馬庫什群組或其他替代之分組來描述時，本發明不僅涵蓋該整體列出的整個群組，亦包括個別之各群組成員和該主要群組之所有可能次組，但亦包括缺少一或多個群組成員的主要群組。本發 明亦設想本申請專利之發明中的任一群組成員的一或多者之明確排除。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術和科學術語具有與本發明所屬之技藝中的一般技術人士所通常理解者相同的意義。當在有衝突的情況下，將以本專利說明書(包括定義)為主。可理解的是，本專利說明書和申請專利範圍之全文中，“包含(comprise)”此字或諸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”等變化意味包含所陳述之整數或整數群組，但不排除任何其他整數或整數群組。除非上下文另有要求，單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。
本文中描述示例性方法和材料，但類似或等同於本文所描述的那些方法和材料亦可用於實踐或測試本發明。該材料、方法和實例僅用於說明，而非意圖限制。
BCMA特異性CAR及其製備方法
本發明提供結合BCMA(例如人BCMA(例如SEQ ID NO：354或登錄編號：Q02223-2)之CAR。本文提供之BCMA特異性CAR包括單鏈CAR和多鏈CAR。CAR具有以非MHC限制性方式，利用單株抗體之抗原結合性質來重新定向T細胞特異性和反應性朝向BCMA的能力。非MHC限制性抗原識別使表現CAR之T細胞有能力無關抗原處理地識別抗原，從而繞過腫瘤逃逸的主要機制。
於一些實施態樣中，本文提供之CAR包含胞外配體 結合結構域(例如單鏈可變片段(scFv))、跨膜結構域及胞內信號傳導結構域。於一些實施態樣中，該胞外配體結合結構域、跨膜結構域及胞內信號傳導結構域係在一個多肽中，即，在單一鏈中。本文中亦提供多鏈CAR和多肽。於一些實施態樣中，該多鏈CAR包含：第一多肽(其包含跨膜結構域和至少一個胞外配體結合結構域)和第二多肽(其包含跨膜結構域和至少一個胞內信號傳導結構域)，其中該多肽組合在一起以形成多鏈CAR。
於一些實施態樣中，BCMA特異性多鏈CAR係以對IgE之高親和性受體(Fc ε RI)為基礎。該表現在肥大細胞和嗜鹼細胞上之Fc ε RI觸發過敏反應。Fc ε RI為由單一α次單位、單一β次單位和兩個二硫鍵連接之γ次單位所組成的四聚體複合物。該α次單位含有IgE結合結構域。該β次單位和γ次單位含有介導信號轉導之ITAM。於一些實施態樣中，該FcR α鏈之胞外結構域被刪除並被BCMA特異性胞外配體結合結構域取代。於一些實施態樣中，該多鏈BCMA特異性CAR包含特異結合BCMA之scFv、CD8 α鉸鏈和FcR β鏈之ITAM。於一些實施態樣中，該CAR可能或可能不包含FcR γ鏈。
於一些實施態樣中，該胞外配體結合結構域包含scFv，該scFv包含藉由彈性連接子而連接之靶的抗原特異性單株抗體的輕鏈可變(VL)區和重鏈可變(VH)區。單鏈可變區片段係經由使用短鏈接肽連接輕及/或重鏈可變區來製作(Bird et al.,Science 242：423-426,1988)。連接肽之 實例為具有胺基酸序列(GGGGS)3(SEQ ID NO：333)之GS連接子，其橋接介於一個可變區之羧基端和另一可變區之胺基端之間約3.5nm。其他序列之連接子已被設計及使用(Bird et al.，1988，同上)。一般而言，連接子可為短、有彈性之多肽且較佳地，由約20個或更少個胺基酸殘基所組成。接著，連接子可經修飾以具有額外功能，諸如連接藥物或連接固體支持物。該單鏈變體可以重組或合成方法製造。在合成製造scFv方面，可使用自動化合成儀。在重組製造scFv方面，可將含有編碼scFv之多核苷酸的合適質粒引入合適之宿主細胞(無論是真核細胞，諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞或原核細胞，諸如大腸桿菌)中。編碼所欲scFv之多核苷酸可藉由常規操作(諸如接合多核苷酸)來進行。所產生之scFv可使用本技藝已知之標準蛋白質純化技術分離出。
於一些實施態樣中，該胞外配體結合結構域包含(a)VH區，其包含(i)VH互補決定區一(CDR1)，其包含序列SYX1MX2(其中X1為A或P；且X2為T、N或S)(SEQ ID NO：301)、GFTFX1SY(其中X1為G或S)(SEQ ID NO：302)或GFTFX1SYX2MX3(其中X1為G或S，X2為A或P；且X3為T、N或S)(SEQ ID NO：303)；(ii)VH CDR2，其包含序列AX1X2X3X4GX5X6X7X8YADX9X10KG(其中X1為I、V、T、H、L、A或C；X2為S、D、G、T、I、L、F、M或V；X3為G、Y、L、H、D、A、S或M；X4為S、Q、T、A、F或W；X5為G或T；X6為N、S、 P、Y、W或F；X7為S、T、I、L、T、A、R、V、K、G或C；X8為F、Y、P、W、H或G；X9為V、R或L；且X10為G或T)(SEQ ID NO：305)或X1X2X3X4X5X6(其中X1為S、V、I、D、G、T、L、F或M；X2為G、Y、L、H、D、A、S或M；X3為S、G、F或W；X4為G或S；X5為G或T；且X6為N、S、P、Y或W)(SEQ ID NO：306)；和iii)VH CDR3，其包含序列VSPIX1X2X3X4(其中X1為A或Y；X2為A或S；且X3為G、Q、L、P或E)(SEQ ID NO：307)或YWPMX1X2(其中X1為D、S、T或A；且X2為I、S、L、P或D)(SEQ ID NO：308)；和VL區，其包含(i)VL CDR1，其包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(其中X1為R、G、W、A或C；X2為A、P、G、L、C或S；X3為S、G或R；X4為Q、C、E、V或I；X5為S、L、P、G、A、R或D；X6為V、G或I；X7為S、E、D或P；X8為S、P、F、A、M、E、V、N、D或Y；X9為I、T、V、E、S、A、M、Q、Y、H或R；X10為Y或F；X11為L、W或P；且X12為A、S或G)(SEQ ID NO：309)；(ii)VL CDR2，其包含序列X1ASX2RAX3(其中X1為G或D；X2為S或I；且X3為T或P)(SEQ ID NO：310)；和(iii)VL CDR3，其包含序列QQY X1X2X3PX4T(其中X1為G、Q、E、L、F、A、S、M、K、R或Y；X2為S、R、T、G、V、F、Y、D、A、H、V、E、K或C；X3為W、F或S；且X4為L或I)(SEQ ID NO：311)，或QQY X1X2X3PX4(其中X1為G、 Q、E、L、F、A、S、M、R、K或Y；X2為S、R、T、G、R、V、D、A、H、E、K、C、F或Y；X3為W、S或F；且X4為L或I)(SEQ ID NO：312)。於一些實施態樣中，該VH和VL係藉由彈性連接子連接在一起。於一些實施態樣中，該彈性連接子包含SEQ ID NO：333所示之胺基酸序列。
於另一態樣中提供特異結合BCMA之CAR，其中該CAR包含胞外配體結合結構域，此胞外配體結合結構域包含：VH區，其包含具有顯示於下列群組之VH序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3：SEQ ID NO：2、3、7、8、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、37、39、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、83、87、92、78、95、97、99、101、104、106、110、112、114、76、118、120、122、112、125、127、313或314；及/或VL區，其包含具有顯示於下列群組之VL序列的VL CDR1，VL CDR2和VL CDR3：SEQ ID NO：1、4、5、6、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、34、36、38、40、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、317、81、82、84、85、86、88、89、90、91、93、94、96、98、100、102、103,105、107、108、109、111、113、115、116、117、119、121、123、124、126、128、315或316。於一些實施態樣中，該VH和VL係藉由彈性 連接子連接在一起。於一些實施態樣中，該彈性連接子包含SEQ ID NO：333所示之胺基酸序列。
於一些實施態樣中，本發明之CAR包含具有如表1中所列之部分輕鏈序列中之任一者及/或如表1中所列之部分重鏈序列中之任一者的胞外配體結合結構域。表1中，該下方劃線之序列為根據Kabat之CDR序列，而為粗體者係根據Chothia，除了重鏈CDR2序列外(該Chothia CDR序列為下方劃線且Kabat CDR序列係以粗體顯示：P5A2_VHVL、A02_Rd4_0.6nM_C06、A02_Rd4_0.6nM_C09、A02_Rd4_6nM_C16、A02_Rd4_6nM_C03、A02_Rd4_6nM_C01、A02_Rd4_6nM_C26、A02_Rd4_6nM_C25、A02_Rd4_6nM_C22、A02_Rd4_6nM_C19、A02_Rd4_0.6nM_C03、A02_Rd4_6nM_C07、A02_Rd4_6nM_C23、A02_Rd4_0.6nM_C18、A02_Rd4_6nM_C10、A02_Rd4_6nM_C05、A02_Rd4_0.6nM_C10、A02_Rd4_6nM_C04、A02_Rd4_0.6nM_C26、A02_Rd4_0.6nM_C13、A02_Rd4_0.6nM_C01、A02_Rd4_6nM_C08、P5C1_VHVL、C01_Rd4_6nM_C24、C01_Rd4_6nM_C26、C01_Rd4_6nM_C10、C01_Rd4_0.6nM_C27、C01_Rd4_6nM_C20、C01_Rd4_6nM_C12、C01_Rd4_0.6nM_C16、C01_Rd4_0.6nM_C09、C01_Rd4_6nM_C09、C01_Rd4_0.6nM_C03、C01_Rd4_0.6nM_C06、C01_Rd4_6nM_C04、COMBO_Rd4_0.6nM_C22、COMBO_Rd4_6nM_C21、COMBO_Rd4_6nM_C10、COMBO_Rd4_0.6nM_C04、COMBO_Rd4_6nM_C25、COMBO_Rd4_0.6nM_C21、COMBO_Rd4_6nM_C11、COMBO_Rd4_0.6nM_C20、COMBO_Rd4_6nM_C09、COMBO_Rd4_6nM_C08、COMBO_Rd4_0.6nM_C19、COMBO_Rd4_0.6nM_C02、COMBO_Rd4_0.6nM_C23、COMBO_Rd4_0.6nM_C29、COMBO_Rd4_0.6nM_C09、COMBO_Rd4_6nM_C12、COMBO_Rd4_0.6nM_C30、COMBO_Rd4_0.6nM_C14、COMBO_Rd4_6nM_C07、COMBO_Rd4_6nM_C02、COMBO_Rd4_0.6nM_C05、COMBO_Rd4_0.6nM_C17、COMBO_Rd4_6nM_C22以及COMBO_Rd4_0.6nM_C11)。
本發明亦提供針對BCMA之CAR的胞外配體結合結構域之CDR部分(包括Chothia、Kabat CDR及CDR接觸區域)。測定CDR區係在本技藝之技術範圍內。據了解，於一些實施態樣中，CDR可為Kabat與Chothia CDR之組合(亦稱為“組合之CR”或“延伸之CDR”)。於一些實施態樣中，該CDR為Kabat CDR。於其他實施態樣中，該CDR為Chothia CDR。換言之，在具有一個以上之CDR的實施態樣中，該CDR可為Kabat、Chothia、組合CDR或彼等之組合之任意者。表2提供本發明所提供之CDR序列的實例。
本發明包含對表1中所示之本發明變體的CAR和多肽所進行之修飾，包括具有不會顯著影響其性能之修飾的功能上同等CAR及具有增強或降低之活性及/或親和性的變體。例如，該胺基酸序列可經突變以取得具有所期望之對BCMA的結合親和力之抗體。多肽之修飾為本技藝中之常規實作，且無需詳細地描述於本文中。經修飾之多肽的實例包括具有下列修飾之多肽：保守型胺基酸殘基取代、刪除或加入一或多個不會明顯不利地改變該功能活性 的胺基酸、或使多肽對其配體之親和性成熟(增強)、或使用化學類似物。
胺基酸序列插入子包括長度從一個殘基至含有上百或更多個殘基之多肽的胺基及/或羧基端融合物。末端插入子之實例包括具有N端甲硫胺醯殘基之抗體或與抗原決定部位標籤融合之抗體。抗體分子之其他插入變體包括酶或多肽之抗體的N或C端的融合蛋白，其增加該抗體在血液循環中之半衰期。
取代變體在抗體分子中至少使一個胺基酸殘基被移除且在該胺基酸殘基之位置處插入不同的殘基。用於取代誘變之最有利的位點包括該高度可變區，但FR變化亦在考量之內。保守性取代顯示於表2.1中“保守性取代”之標題下。若該等取代導致生物活性改變，則可能引入更多實質變化(表2.1中標為“示例性取代”或如進一步描述於下文中之關於胺基酸類別者)並篩選產物。
於一些實施態樣中，本發明提供結合BCMA並與本文所描述之CAR競爭結合BCMA之包含胞外配體結合結構域的CAR，包括 P6E01/P6E01,P6E01/H3.AQ,L1.LGF/L3.KW/P6E01；L1.LGF/L3.NY/P6E01,L1.GDF/L3.NY/P6E01,L1.LGF/L3.KW/H3.AL,L1.LGF/L3.KW/H3.AP,L1.LGF/L3.KW/H3.AQ,L1.LGF/L3.PY/H3.AP,L1.LGF/L3.PY/H3.AQ,L1.LGF/L3.NY/H3.AL,L1.LGF/L3.NY/H3.AP,L1.LGF/L3.NY/H3.AQ,L1.GDF/L3.KW/H3.AL,L1.GDF/L3.KW/H3.AP,L1.GDF/L3.KW/H3.AQ,L1.GDF/L3.PY/H3.AQ,L1.GDF/L3.NY/H3.AL,L1.GDF/L3.NY/H3.AP,L1.GDF/L3.NY/H3.AQ,L3.KW/P6E01,L3.PY/P6E01,L3.NY/P6E01,L3.PY/L1.PS/P6E01,L3.PY/L1.AH/P6E01,L3.PY/L1.FF/P6E01,L3.PY/L1.PH/P6E01,L3.PY/L3.KY/P6E01,L3.PY/L3.KF/P6E01,L3.PY/H2.QR,L3.PY/H2.DY,L3.PY/H2.YQ,L3.PY/H2.LT,L3.PY/H2.HA,L3.PY/H2.QL,L3.PY/H3.YA,L3.PY/H3.AE,L3.PY/H3.AQ,L3.PY/H3.TAQ,L3.PY/P6E01,L3.PY/L1.PS/H2.QR,L3.PY/L1.PS/H2.DY,L3.PY/L1.PS/H2.YQ,L3.PY/L1.PS/H2.LT,L3.PY/L1.PS/H2.HA,L3.PY/L1.PS/H2.QL,L3.PY/L1.PS/H3.YA,L3.PY/L1.PS/H3.AE,L3.PY/L1.PS/H3.AQ,L3.PY/L1.PS/H3.TAQ,L3.PY/L1.AH/H2.QR,L3.PY/L1.AH/H2.DY,L3.PY/L1.AH/H2.YQ,L3.PY/L1.AH/H2.LT,L3.PY/L1.AH/H2.HA,L3.PY/L1.AH/H2.QL,L3.PY/L1.AH/H3.YA,L3.PY/L1.AH/H3.AE,L3.PY/L1.AH/H3.AQ,L3.PY/L1.AH/H3.TAQ,L3.PY/L1.FF/H2.QR,L3.PY/L1.FF/H2.DY,L3.PY/L1.FF/H2.YQ,L3.PY/L1.FF/H2.LT,L3.PY/L1.FF/H2.HA,L3.PY/L1.FF/H2.QL,L3.PY/L1.FF/H3.YA,L3.PY/L1.FF/H3.AE,L3.PY/L1.FF/H3.AQ,L3.PY/L1.FF/H3.TAQ,L3.PY/L1.PH/H2.QR,L3.PY/L1.PH/H2.HA,L3.PY/L1.PH/H3.AE,L3.PY/L1.PH/H3.AQ,L3.PY/L1.PH/H3.TAQ,L3.PY/L3.KY/H2.QR,L3.PY/L3.KY/H2.DY,L3.PY/L3.KY/H2.YQ L3.PY/L3.KY/H2.LT,L3.PY/L3.KY/H2.HA,L3.PY/L3.KY/H2.QL,L3.PY/L3.KY/H3.YA L3.PY/L3.KY/H3.TAQ,L3.PY/L3.KF/H2.DY,L3.PY/L3.KF/H2.YQ,L3.PY/L3.KF/H2.LT L3.PY/L3.KF/H2.QL,L3.PY/L3.KF/H3.YA,L3.PY/L3.KF/H3.AE,L3.PY/L3.KF/H3.AQ L3.PY/L3.KF/H3.TAQ,P5A2_VHVL,A02_Rd4_0.6nM_C06,A02_Rd4_0.6nM_C09 A02_Rd4_6nM_C16,A02_Rd4_6nM_C03,A02_Rd4_6nM_C01,A02_Rd4_6nM_C26 A02_Rd4_6nM_C25,A02_Rd4_6nM_C22,A02_Rd4_6nM_C19,A02_Rd4_0.6nM_C03 A02_Rd4_6nM_C07,A02_Rd4_6nM_C23,A02_Rd4_0.6nM_C18,A02_Rd4_6nM_C10 A02_Rd4_6nM_C05,A02_Rd4_0.6nM_C10,A02_Rd4_6nM_C04,A02_Rd4_0.6nM_C26 A02_Rd4_0.6nM_C13,A02_Rd4_o.6nM_C01,A02_Rd4_6nM_C08,P5C1_VHVL,C01_Rd4_6nM_C24,C01_Rd4_6nM_C26,C01_Rd4_6nM_C10,C01_Rd4_0.6nM_C27 C01_Rd4_6nM_C20,C01_Rd4_6nM_C12,C01_Rd4_0.6nM_C16,C01_Rd4_0.6nM_C09 C01_Rd4_6nM_C09,C01_Rd4_0.6nM_C03,C01_Rd4_0.6nM_C06,C01_Rd4_6nM_C04 COMBO_Rd4_0.6nM_C22,COMBO_Rd4_6nM_C21,COMBO_Rd4_6nM_C10,COMBO_Rd4_0.6nM_C04,COMBO_Rd4_6nM_C25,COMBO_Rd4_0.6nM_C21,COMBO_Rd4_6nM_C11,COMBO_Rd4_0.6nM_C20,COMBO_Rd4_6nM_C09,COMBO_Rd4_6nM_C08,COMBO_Rd4_0.6nM_C19,COMBO_Rd4_0.6nM_C02,COMBO_Rd4_0.6nM_C23,COMBO_Rd4_0.6nM_C29,COMBO_Rd4_0.6nM_C09,COMBO_Rd4_6nM_C12,COMBO_Rd4_0.6nM_C30,COMBO_Rd4_0.6nM_C14,COMBO_Rd4_6nM_C07,COMBO_Rd4_6nM_C02,COMBO_Rd4_0.6nM_C05,COMBO_Rd4_0.6nM_C17,COMBO_Rd4_6nM_C22,COMBO_Rd4_0.6nM_C11,或COMBO_Rd4_0.6nM_C29。
於一些實施態樣中，本發明提供特異結合BCMA之CAR，其中該CAR包含含有SEQ ID NO：33所示之序列的VH區；及/或含有SEQ ID NO：34所示之序列的VL區。於一些實施態樣中，本發明提供特異結合BCMA之CAR，其中該CAR包含含有SEQ ID NO：33、72、39、76、83、92、25或8所示之序列的VH區；及/或含有SEQ ID NO：34、73、40、77、84、93、18或80所示之序列的VL區。於一些實施態樣中，本發明亦提供包含針對BCMA抗體之抗體的CDR部分(其係以CDR接觸區為基礎)之CAR。CDR接觸區為使抗體對抗原具有特異性之抗體區域。一般而言，CDR接觸區包括CDR和Vernier區中之殘基位置，其受到約束以維持適當之環結構使抗體與特定抗原結合。參見，例如Makabe et al.,J.Biol.Chem.,283：1156-1166,2007。CDR接觸區之測定方法係充分在本技藝之技術範圍內。
如本文所描述之BCMA特異性CAR對BCMA(諸如人BCMA(例如SEQ ID NO：354))的結合親和力(KD)可為約0.002至約6500nM。於一些實施態樣中，該結合親和 力約為下列之任一者：6500nM、6000nM、5986nM、5567nM、5500nM、4500nM、4000nM、3500nM、3000nM、2500nM、2134nM、2000nM、1500nM、1000nM、750nM、500nM、400nM、300nM、250nM、200nM、193nM、100nM、90nM、50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、10nM、8nM、7.5nM、、7nM、6.5nM、、6nM、5.5nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.3nM、0.1nM、0.01nM和0.002nM。於一些實施態樣中，該結合親和力約少於下列之任一者：6500nM、6000nM、5500nM、5000nM、4000nM、3000nM、2000nM、1000nM、900nM、800nM、250nM、200nM、100nM、50nM、30nM、20nM、10nM、7.5nm、7nM、6.5nM、6nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM、3nM、2.5nM、2nM、1.5nM、1nM和0.5nM。
根據本發明之CAR的胞內信號傳導結構域負責在胞外配體結合結構域與靶的結合後之胞內信號傳導，導致免疫細胞活化和免疫反應。該胞內信號傳導結構域具有活化其中表現CAR之免疫細胞之至少一個正常效應子功能的能力。例如，T細胞之效應子功能可為溶胞活性或輔助細胞活性，包括分泌細胞因子。
於一些實施態樣中，用於CAR之胞內信號傳導結構域可為，例如，但不限於T細胞受體及行動一致以在抗原受體接合後啟動信號轉導之共受體的胞質序列，以及這些 序列之任何衍生物或變體和具有相同功能性能力之任何合成的序列。胞內信號傳導結構域包含二種不同類別之胞質信號傳導序列：那些啟動抗原依賴性初級活化者及那些以無關抗原之方式作用以提供二級或共刺激信號者。主要之胞質信號傳導序列可包含被稱為ITAM之基於免疫受體酪胺酸的活化基序之信號傳導基序。ITAM為充分定義之信號傳導基序，其可在各種作為syk/zap70類別酪胺酸激酶之結合位點的受體之胞質內尾部找到。用於本發明之作為非限制性實例之ITAM實例可包括那些源自TCR ζ、FcR γ、FcR β、FcR ε、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d者。於一些實施態樣中，CAR之胞內信號傳導結構域可包含CD3 ζ信號傳導結構域，此CD3 ζ信號傳導結構域具有與SEQ ID NO：324所示之胺基酸序列具有至少約70%，較佳為至少80%，更佳為至少90%、95%、97%或99%之序列同一性的胺基酸序列。於一些實施態樣中，本發明之CAR的胞內信號傳導結構域包含共刺激分子的結構域。
於一些實施態樣中，本發明之CAR的胞內信號傳導結構域包含一部分選自由下列所組成之群組的共刺激分子：41BB(GenBank：AAA53133.)和CD28(NP_006130.1)之片段。於一些實施態樣中，本發明之CAR的胞內信號傳導結構域包含與SEQ ID NO：323和SEQ ID NO：327所示之胺基酸序列具有至少70%，較佳為至少80%，更佳為至少90%、95%、97%或99%之序列同一性的胺基酸序 列。
CAR係表現在細胞表面膜上。因此，CAR可包含跨膜結構域。本發明所揭示之CAR的合適跨膜結構域具有下列能力(a)表現在細胞(較佳為免疫細胞，諸如，例如但不限於淋巴細胞或天然殺手(NK)細胞)表面上，及(b)與配體結合結構域和胞內信號傳導結構域交互作用以指導免疫細胞對抗預限定之靶細胞的細胞反應。跨膜結構域可源自天然或合成來源。該跨膜結構域可源自任何膜結合或跨膜蛋白。一種非限制性之實例為該跨膜多肽可為T細胞受體之次單位(諸如α、β、γ或δ)、構成CD3複合物三多肽、IL-2受體p55(a鏈)、p75(β鏈)或γ鏈、Fc受體之次單位鏈，尤其是Fc γ受體Ⅲ或CD蛋白質。或者，該跨膜結構域可為合成的且可主要包含疏水殘基，諸如亮胺酸和纈胺酸。於一些實施態樣中，該跨膜結構域係源自人CD8 α鏈(例如NP_001139345.1)。該跨膜結構域可進一步包含介於胞外配體結合結構域和該跨膜結構域之間的莖結構域。莖結構域可包含多達300個胺基酸，較佳為10至100個胺基酸，最佳為25至50個胺基酸。莖區可源自全部或一部分之天然存在的分子，諸如來自全部或一部分之CD8、CD4或CD28的胞外區，或來自全部或一部分之抗體恆定區。或者，該莖結構域可為對應於天然存在之莖序列的合成序列，或可為完全合成之莖序列。於一些實施態樣中，該莖結構域為人CD8 α鏈(例如NP_001139345.1)之一部分。於另一特定之實施態樣中，該跨膜和鉸鏈結構域 包含一部分人CD8 α鏈，較佳地，其包含與選自由SEQ ID NO：318所組成之群組的胺基酸序列具有至少70%、較佳為至少80%，更佳為至少90%、95%、97%或99%之序列同一性的胺基酸序列。於一些實施態樣中，本文所揭示之CAR可包含特異結合BCMA之胞外配體結合結構域、CD8 α人鉸鏈和跨膜結構域、CD3 ζ信號傳導結構域及4-1BB信號傳導結構域。
表3提供可用於本文所揭示之CAR中的示例性結構域序列。
癌細胞中可普遍觀察到靶抗原之下調或突變，其創造出抗原損失逃避變種。因此，為了彌補腫瘤逃避並使免疫細胞更特異於靶的，該BCMA特異性CAR可包含一或多個額外之胞外配體結合結構域以同時結合靶的中之不同元件，從而擴大免疫細胞活化和功能。於一實施態樣中，該胞外配體結合結構域可串列位在同一跨膜多肽上，並可選擇地藉由連接子分開。於一些實施態樣中，該不同的胞外配體結合結構域可被置於組成CAR之不同跨膜多肽上。於一些實施態樣中，本發明關於CAR群，各CAR包含不同的胞外配體結合結構域。尤其是，本發明關於遺傳工程處理免疫細胞的方法，其包含提供免疫細胞並於細胞表面表現CAR群，各CAR包含不同之胞外配體結合結構域。於另一特定之實施態樣中，本發明關於遺傳工程處理 免疫細胞的方法，其包含提供免疫細胞並將編碼組成CAR群之多肽的多核苷酸引入該細胞，各CAR包含不同的胞外配體結合結構域。CAR群一詞意指至少二個、三個、四個、五個、六個或更多個CAR，其各CAR包含不同的胞外配體結合結構域。較佳地，根據本發明之不同的胞外配體結合結構域可同時結合靶的中之不同元件，從而擴大免疫細胞活化和功能。本發明亦關於包含CAR群之經分離的免疫細胞，其各CAR包含不同之胞外配體結合結構域。
於另一態樣中，本發明提供編碼本文所描述之任何CAR和多肽的多核苷酸。多核苷酸可藉由本技藝中已知之程序製造和表現。
於另一態樣中，本發明提供包含本發明之任何細胞的組成物(諸如醫藥組成物)。於一些實施態樣中，該組成物包含含有編碼本文所描述之任何CAR的多核苷酸之細胞。再於其他實施態樣中，該組成物包含顯示於下列SEQ ID NO：367和SEQ ID NO：368中之多核苷酸的其中一或兩者：
P5A重鏈可變區
(SEQ ID NO：367)。
P5A輕鏈可變區
(SEQ ID NO：368)。
於其他實施態樣中，該組成物包含顯示於下列SEQ ID NO：369和SEQ ID NO：370中之多核苷酸的其中一或兩者：
P5AC1重鏈可變區
(SEQ ID NO：369)
P5AC1輕鏈可變區
(SEQ ID NO：370)
於其他實施態樣中，該組成物包含顯示於下列SEQ ID NO：371和SEQ ID NO：372中之多核苷酸的其中一或兩者：
PC1重鏈可變區
(SEQ ID NO：371)
PC1輕鏈可變區
(SEQ ID NO：372)。
於其他實施態樣中，該組成物包含顯示於下列SEQ ID NO：373和SEQ ID NO：374中之多核苷酸的其中一或兩者：
PC1C12重鏈可變區
(SEQ ID NO：373)。
PC1C12輕鏈可變區
(SEQ ID NO：374)。
於其他實施態樣中，該組成物包含顯示於下列SEQ ID NO：375和SEQ ID NO：376中之多核苷酸的其中一 或兩者：
COM22重鏈可變區
(SEQ ID NO：375)。
COM22輕鏈可變區
(SEQ ID NO：376)。
本文中進一步描述表現載體和投予多核苷酸組成物。
於另一態樣中，本發明提供製造本文所描述之任何多核苷酸的方法。
與任何該等序列互補之多核苷酸亦包含在本發明中。多核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股，且可為DNA(基因組、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其含有內含子且以一對一之方式對應於DNA分子和mRNA分子(其不含有內含子)。另外之編碼或非編碼序列可，但不必須存在於本發明之多核苷酸內，且多核苷酸可，但不必須，連接其他分子及/或支持物質。
多核苷酸可包含天然序列(即，編碼抗體或其部分之 內源序列)或可包含該等序列之變體。多核苷酸變體含有一或多個取代、加入、缺失及/或插入，從而使所編碼之多肽的免疫反應力相對於天然免疫反應分子而並未被減弱。對所編碼之多肽的免疫反應力之影響通常可依本文之描述評估。較佳地，變體顯現出與編碼天然抗體或其部分之多核苷酸序列至少約70%之同一性，更佳為至少約80%之同一性，再更佳為至少約90%之同一性，且最佳為至少約95%之同一性。
若二個序列中之核苷酸或胺基酸的序列在依下述進行最大對應之比對時是相同的，則該二個多核苷酸或多肽序列被說成是“同一的”。二個序列之間的比較通常係藉由在比較窗口上比較序列來進行以鑑別並比較具序列相似性之局部區域。如本文所使用之“比較窗口”係指具有至少約20(通常為30至約75，或40至約50)個連續位置之節段，其中可將序列與具有相同數目之連續位置的參考序列進行最佳比對後彼此比較。
用於比較之最佳序列比對可使用生物信息學軟體(DNASTAR公司，威斯康辛州麥迪遜市)之Lasergene套件中的Megalign程式，使用預設參數進行。此程式體現描述於下列參考文獻中的數種比對方案：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5：151-153；Myers,E.W.and Muller W.,1988,CABIOS 4：11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11：105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。
較佳地，“序列同一性之百分比”係藉由在具有至少20個位置之比較窗口上比較二個最佳比對序列來測定，其中當與用於該二個序列之最佳比對的參考序列(其不包含加入或缺失)相比較時，在比較窗口中之多核苷酸或多肽序列部分可包含20%或更少(通常為5%至15%，或10%至12%)之加入或缺失(即，間隙)。該百分比之計算係藉由測定在該二個序列中出現之同一核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數，將匹配之位置數除以參考序列中之全部位置數(即，窗口大小)，並將結果乘以100來產生序列同一性之百分比。
或者替代地，變體亦可能與天然基因或其部分或其補體基本上同源。該等多核苷酸變體能夠在中等嚴格之條 件下與編碼天然抗體(或其互補序列)之天然存在的DNA序列雜交。
合適之“中等嚴格的條件”包括在5X SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA之溶液(pH8.0)中預先清洗；在50℃至65℃，5X SSC下雜交過夜；接著在65℃下以含有0.1% SDS之各2X、0.5X和0.2X SSC清洗二次20分鐘。
如本文所使用之“高度嚴格之條件”或“高嚴格性條件”為如下述者：(1)採用低離子強度和高溫來清洗，例如在50℃下，以0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉清洗；(2)在雜交期間採用42℃之變性劑，諸如甲醯胺，例如50%(v/v)甲醯胺與0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/50mM磷酸鈉緩衝液，pH 6.5加750mM之氯化鈉、75mM之檸檬酸鈉；或(3)採用42℃之50%甲醯胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM之磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5×Denhardt氏溶液，經超音波處理之鮭精子DNA(50μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚醣，在42℃下，0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)和55℃下，50%甲醯胺中清洗，接著在55℃下，以含有EDTA之由0.1×SSC所組成的高嚴格性清洗液清洗。熟練之技術人員將可識別如何依需要調節溫度、離子強度，等以遷就諸如探針長度，等因素。
本技藝之一般技術人士將可理解由於遺傳密碼之退化，有許多編碼如本文所描述之多肽的多核苷酸序列。這 些多核苷酸中有些與任一天然基因之核苷酸序列僅具有最小同源性。儘管如此，由於密碼子用途之差異而有所變化之多核苷酸特別在本發明之考量中。此外，包含本文所提供之多核苷酸序列的基因之等位基因係在本發明之範圍內。等位基因為由於核苷酸之一或多個突變(諸如缺失、添加及/或取代)而被改變之內源基因。所產生之mRNA和蛋白質可能，但不必然，具有改變之結構或功能。等位基因可使用標準技術(例如雜交、擴增及/或數據庫序列比較)來鑑定。
本發明之多核苷酸可使用化學合成、重組方法或PCR來取得。化學多核苷酸合成方法為本技藝所周知，且不需要在此詳細地描述。本技藝之技術熟習人士可使用本文所提供之序列和市售之DNA合成儀來製造期望之DNA序列。
為了使用重組方法製備多核苷酸，可將包含所欲序列之多核苷酸插入合適之載體中，然後可將該載體引入如本文進一步討論之用於複製和擴增之合適的宿主細胞中。多核苷酸可藉由本技藝中已知之任何方式插入宿主細胞中。細胞轉化可藉由直接攝入、內吞作用、轉染、F-交配或電穿孔引入外源多核苷酸來進行。一旦引入後，該外源多核苷酸可以非經整合之載體(諸如質粒)形式或被整合入宿主細胞基因組中來保持在細胞內。該以此方式擴增之多核苷酸可藉由本技藝中所熟知之方法從該宿主細胞中分離。參見，例如，Sambrook et al.，1989。
或者，PCR允許DNA序列之複製。PCR技術為本技藝所熟知且描述於美國專利案第4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202號，以及PCR：The Polymerase Chain Reaction,Mullis et al.eds.,Birkauswer Press,Boston,1994中。
RNA可藉由使用在合適之載體中之經分離的DNA並將其插入合適之宿主細胞中來取得。當細胞複製且該DNA被轉錄成RNA時，接著可使用本技藝之技術熟習人士所熟知之方法(例如上文中Sambrook et al.，1989中所提出者)來分離出該RNA。
合適之選殖載體可根據標準技術來構建或可從本技藝中可用之大量選殖載體選擇。雖然所選擇之選殖載體根據所欲使用之宿主細胞可能有所不同，有用之選殖載體將通常具有自我複製之能力、可能擁有用於特定限制性內切酶之單一靶的，及/或可能攜帶用於標記物之基因(該標記物可用於選擇含有該載體之選殖株)。合適之實例包括質粒和細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體，諸如pSA3和pAT28。這些及許多其他選殖載體可從商品供應商，諸如BioRad、Strategene和Invitrogen公司取得。
表現載體通常為含有根據本發明之多核苷酸的可複製之多核苷酸構建體。此暗示表現載體必須可以游離基因(episome)或染色體DNA之組成部分的形式在宿主細胞中 複製。合適之表現載體包括，但不限於質粒、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒)、黏粒和PCT刊物第WO 87/04462號中所揭示之表現載體。載體組分通常可包括，但不限於下列群組之一或多者：信號序列；複製起點；一或多個標記基因；合適之轉錄控制元件(諸如啟動子、增強子和終止子)。為了表現(即轉譯)，通常亦需要一或多個轉譯控制元件，諸如核糖體結合位點、轉譯起始位點及終止密碼子。
含有所欲多核苷酸之載體可藉由多種適當方式之任意者來引入宿主細胞中，該適當方式包括電穿孔、轉染(採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚醣或其他物質)；基因槍(microprojectile bombardment)；脂質體轉染；和感染(例如，其中該載體為傳染劑，諸如牛痘病毒時)。引入載體或多核苷酸之選擇常常取決於該宿主細胞之特性。
編碼本發明所揭示之BCMA特異性CAR的多核苷酸可能存在於表現盒或表現載體(例如用於引入細菌宿主細胞之質粒、或諸如用於轉染昆蟲宿主細胞之桿狀病毒載體的病毒載體、或諸如用於轉染哺乳動物宿主細胞之慢病毒的質粒或病毒載體)。於一些實施態樣中，多核苷酸或載體可包括編碼核糖體跳過序列之核酸序列諸如，例如但不限於，編碼2A肽之序列。2A肽類(其係在細小核糖核酸病毒(picornavirus)之口蹄疫病毒(Aphthovirus)亞群中鑑定出)導致核糖體跳過一個密碼子到下一個密碼子，而沒有 在由該等密碼子編碼的二個胺基酸之間形成肽鍵(參見(Donnelly及Elliott 2001；Atkins,Wills et al.2007；Doronina,Wu et al.2008))。“密碼子”係指在mRNA上(或DNA分子之意義股上)，由核糖體轉譯成一個胺基酸殘基的3個核苷酸。因此，當多肽被框架內之2A寡肽序列分開時可從在imRNA內之單一、連續開讀框合成二個多肽。該等核糖體跳過機制為本技藝所熟知且已知有數種載體使用此機制來表現由單一信使RNA編碼的數種蛋白質。
於一些實施態樣中，為了指導跨膜多肽進入宿主細胞之分泌途徑，在多核苷酸序列或載體序列中提供分泌信號序列(亦稱為前導序列，前原序列(prepro sequence)或前序列)。該分泌信號序列係可操作地連接到跨膜核酸序列，即，該二個序列在正確的讀框內連接並定位以指導新合成的多肽進入宿主細胞之分泌途徑。分泌信號序列通常位於該編碼所欲多肽之核酸序列的5'，儘管某些分泌信號序列可能位在所欲之核酸序列中的其他位置(參見，例如Welch et al.,美國專利案第5,037,743號；Holland et al.,美國專利案第5,143,830號)。於一些實施態樣中，該信號肽包含SEQ ID NO：318或329所示之胺基酸序列。鑑於遺傳密碼之退化性，本技藝之技術熟習人士將認可這些多核苷酸分子中可能有相當多之序列變化。於一些實施態樣中，本發明之核酸序列係經密碼子優化以在哺乳動物細胞中表現，較佳為用於在人細胞中表現。密碼子優化係 指在指定物種之高度表現的基因中通常罕見的密碼子之所欲序列中被該等物種之高度表現的基因中通常頻繁的密碼子交換，該等密碼子如同被交換之密碼子編碼與相同的胺基酸。
於一些實施態樣中，根據本發明之多核苷酸包含選自由SEQ ID NO：1397所組成之群組的核酸序列。本發明關於包含與選自由SEQ ID NO：1397所組成之群組的核酸序列具有至少70%，較佳為至少80%，更佳為至少90%、95%、97%或99%序列同一性之核酸序列。
遺傳工程處理免疫細胞之方法
本發明提供製備用於免疫療法之免疫細胞的方法。於一些實施態樣中，該方法包含將根據本發明之CAR引入免疫細胞中並擴增細胞。於一些實施態樣中，本發明關於藉由遺傳工程處理免疫細胞之方法，其包含：提供細胞，並在該細胞之表面表現至少一種如上述之CAR。用於遺傳工程處理免疫細胞之方法描述於，例如PCT專利申請刊物編號WO/2014/039523、WO/2014/184741、WO/2014/191128、WO/2014/184744及WO/2014/184143中，其全部內容各以引用方式併入本文。於一些實施態樣中，該方法包含：以至少一個編碼如上述之CAR的多核苷酸轉染該細胞，並在該細胞中表現該多核苷酸。
於一些實施態樣中，該多核苷酸係存在於慢病毒(lentiviral)載體中以在細胞中穩定表現。
於一些實施態樣中，該方法可進一步包含藉由將至少一個表現下列群組之基因去活化來遺傳上修飾細胞的步驟：例如，但不限於TCR的組分、免疫抑制劑之靶的、HLA基因及/或免疫檢查點蛋白質，諸如，例如PDCD1或CTLA-4。將基因去活化一詞意指該所欲基因並不以功能性蛋白之形式表現。於一些實施態樣中，該欲去活化之基因係選自由下列所組成之群組：例如，但不限於TCR α、TCR β、CD52、GR、PD-1及CTLA-4。於一些實施態樣中，該方法包含將能夠藉由選擇性之DNA裂解來將基因選擇性地去活化的罕見切割核酸內切酶引入細胞中來將一或多個基因去活化。於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶可為，例如轉錄活化子樣效應子核酸酶(TALE核酸酶)或Cas9核酸內切酶。
於一些實施態樣中，使用另外之催化結構域與罕見切割核酸內切酶來增強其將靶的基因去活化之能力。例如，另外之催化結構域可為DNA端加工酶。DNA端加工酶之非限制性實例包括5-3'核酸外切酶、3-5'核酸外切酶、5-3'鹼性核酸外切酶、5'瓣狀核酸內切酶(flap endonuclease)、解旋酶(helicase)、磷酸酶、水解酶和模板無關性DNA聚合酶。該等催化結構域之非限制性實例包含選自由下列所組成之群組的蛋白質結構域或該蛋白質結構域之催化上活性的衍生物：hExol(EX01_HUMAN)、酵母Exol(EX01_YEAST)、大腸桿菌Exol、人TREX2、小鼠TREX1、人TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、TdT(終端 脫氧核苷酸轉移酶)人DNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)。於一些實施態樣中，另外之催化結構域可以具有3'-5'-核酸外切酶活性，且於一些實施態樣中，該另外之催化結構域為TREX，更佳為TREX2催化結構域(WO2012/058458)。於一些實施態樣中，該催化結構域係由單鏈TREX多肽編碼。該另外之催化結構域可與核酸酶融合蛋白或嵌合型蛋白融合。於一些實施態樣中，該另外之催化結構域係使用，例如肽連接子來融合。
於一些實施態樣中，該方法進一步包含將包含至少一個與靶的核酸序列之一部分同源的序列之外源核酸引入細胞中，從而使該靶的核酸序列和外源核酸之間發生同源重組的步驟。於一些實施態樣中，該外源核酸包含分別與該靶的核酸序列之5'和3'區同源的第一和第二部分。該外源核酸亦可包含位在第一和第二部分之間的第三部分，該第三部分與該靶的核酸序列之5'和3'區不具同源性。在靶的核酸序列裂解後，刺激該靶的核酸序列和外源核酸之間發生同源重組事件。於一些實施態樣中，該供體基質內可使用具有至少約50bp、大於約100bp或大於約200bp之同源序列。該外源核酸可為，例如，但不限於約200bp至約6000bp，更佳為約1000bp至約2000bp。共享之核酸同源性係位於鄰接該斷裂位點之上游和下游的區，而該待引入之核酸序列係位於兩個臂之間。
於一些實施態樣中，核酸依次包含下列各項：與該裂解位點上游之序列同源的第一區；將選自由下列所組成 之群組的被靶向基因去活化之序列：TCR α、TCR β、CD52、糖皮質激素受體(GR)、脫氧胞苷激酶(DCK)及免疫檢查點蛋白質，諸如，例如程序性死亡-1(PD-1)；和與該裂解位點下游之序列同源的第二區。該多核苷酸引入步驟可在引入或表現該罕見切割核酸內切酶之同時、之前或之後進行。根據其中已發生斷裂事件之靶的核酸序列的位置，可使用該等外源性核酸來剔除基因(例如當外源核酸係位於該基因之開讀框內時)或用於引入所欲之新序列或基因。藉由使用該等外源核酸來插入序列可經由校正或替換該基因(非限制性之實例為等位基因交換)而修改被靶向之現存基因，或上調或下調被靶向之基因的表現(非限制性之實例為啟動子交換)、校正或更換被靶向之基因。於一些實施態樣中，藉由特異性TALE核酸酶可在被靶向之精確的基因組位置將選自由下列所組成之群組的基因去活化：TCR α、TCR β、CD52、GR、DCK及免疫檢查點蛋白質，其中該特異性TALE核酸酶催化裂解且其中該外源核酸依次包含至少一個同源區及序列以將一個選自由下列所組成之群組的被靶向之基因去活化：TCR α、TCR β、CD52、GR、DCK及藉由同源重組整合之免疫檢查點蛋白質。於一些實施態樣中，藉由使用數個分別且特異地靶向一個限定之基因的TALE-核酸酶及數個用於特定基因去活化之多核苷酸可依次或同時將數個基因去活化。
於一些實施態樣中，該方法包含將一或多個選自由下列所組成之群組的額外基因去活化：TCR α、TCR β、 CD52、GR、DCK及免疫檢查點蛋白質。於一些實施態樣中，基因去活化可藉由將至少一種罕見切割核酸內切酶引入細胞中，從而使該罕見切割核酸內切酶特異地催化該細胞基因組之被靶向之序列裂解；及可選擇地，將依次包含下列者之外源核酸引入該細胞：與該裂解位點上游之序列同源的第一區、欲插入該細胞之基因組中的序列及與該裂解位點下游之序列同源的第二區；其中該經引入之外源核酸將基因去活化並整合至少一個編碼至少一種所欲之重組蛋白的外源多核苷酸序列。於一些實施態樣中，該外源多核苷酸序列係整合在編碼選自由下列所組成之群組的蛋白質之基因內：TCR α、TCR β、CD52、GR、DCK及免疫檢查點蛋白質。
於另一態樣中，遺傳工程修飾細胞之步驟可包含：經由將至少一個表現免疫抑制劑之靶的之基因去活化來修改T細胞，及；擴增細胞，此可選擇性地在免疫抑制劑之存在下進行。免疫抑制劑為一種藥劑，其藉由數種作用機制的其中一者來抑制免疫功能。免疫抑制劑可減少免疫反應之程度及/或強烈。免疫抑制劑之非限制性實例包括鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑、雷帕黴素(rapamycin)之靶的、介白素-2 α-鏈阻斷劑、肌苷一磷酸脫氫酶抑制劑、二氫葉酸還原酶抑制劑、皮質類固醇及免疫抑制抗代謝物。一些細胞毒性免疫抑制劑係藉由抑制DNA合成來作用。其他可能係透過活化T細胞或藉由抑制輔助細胞活化來作用。根據本發明之方法經由將T細胞中之免疫抑制劑 之靶的去活化來賦予T細胞對免疫療法之免疫抑制抗性。免疫抑制劑之靶的之非限制性實例可為免疫抑制劑之受體，諸如，例如，但不限於CD52、糖皮質激素受體(GR)、FKBP族基因成員及親環素族基因成員。
於一些實施態樣中，該方法之遺傳修飾涉及在所提供之細胞中表現一種罕見切割核酸內切酶，從而使該罕見切割核酸內切酶特異地催化一個靶的基因中之裂解，藉此將該被靶向之基因去活化。於一些實施態樣中，遺傳工程處理細胞之方法包含至少一個下列步驟：提供T細胞(諸如來自細胞培養物或來自血液樣本)；在表現免疫抑制劑之靶的之T細胞中選擇基因；將能夠藉由DNA裂解來選擇性地將編碼免疫抑制劑之靶的之基因去活化的罕見切割核酸內切酶引入T細胞中，較佳地，該罕見切割核酸內切酶係藉由雙股斷裂來將該基因去活化並擴增該細胞，此係可選擇地在免疫抑制劑之存在下進行。
於一些實施態樣中，該方法包含：提供T細胞(諸如來自細胞培養物或來自血液樣本)；在其中該基因表現免疫抑制劑之靶的之T細胞中選擇基因；以編碼能夠藉由DNA裂解來選擇性地將編碼免疫抑制劑之靶的之基因去活化的罕見切割核酸內切酶之核酸轉染該T細胞，並在T細胞中表現該罕見切割核酸內切酶，較佳地，該罕見切割核酸內切酶係藉由雙股斷裂來將該基因去活化；及擴增細胞(此可選擇地在免疫抑制劑之存在下進行)。
於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶特異地 靶向CD52或GR。於一些實施態樣中，該被選定之去活化基因係編碼CD52且該免疫抑制治療包含靶向CD52抗原之人化抗體。於一些實施態樣中，該被選定之去活化基因係編碼GR，且該免疫抑制治療包含皮質類固醇，諸如地塞米松(dexamethasone)。於一些實施態樣中，該被選定之去活化基因為FKBP族基因成員或其變體，且該免疫抑制治療包含FK506，亦稱為他克莫司(Tacrolimus)或藤黴素(fujimycin)。於一些實施態樣中，該FKBP族基因成員為FKBP12或其變體。於一些實施態樣中，該被選定之去活化基因為親環素族基因成員或其變體且該免疫抑制治療包含環孢素。
於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶可為，例如大範圍核酸酶(meganuclease)、鋅指核酸酶或TALE核酸酶(TALEN)。於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶為TALE核酸酶。
本發明亦提供遺傳工程處理適合用於免疫療法之T細胞的方法，其中該方法包含：藉由至少去活化免疫檢查點蛋白質來遺傳修飾T細胞。於一些實施態樣中，該免疫檢查點蛋白質為，例如PD-1及/或CTLA-4。於一些實施態樣中，遺傳修飾細胞之方法包含：藉由去活化至少一個免疫檢查點蛋白來修飾T細胞；並擴增該細胞。免疫檢查點蛋白包括，但不限於程序性死亡-1(PD-1，亦稱為PDCD1或CD279，登錄編號：NM_005018)、細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4，亦稱為CD152，GenBank登錄 編號AF414120.1)、LAG3(亦稱為CD223，登錄編號：NM-002286.5)、Tim3(亦稱為HAVCR2，GenBank登錄編號：JX049979.1)、BTLA(亦稱為CD272，登錄編號：NM_181780.3)、BY55(亦稱為CD160，GenBank登錄編號：CR541888.1)、TIGIT(亦稱為VSTM3，登錄編號：NM_173799)、B7H5(亦稱為C10orf54，小鼠vista基因之同源物，登錄編號：NM_022153.1)、LAIR1(亦稱為CD305，GenBank登錄編號：CR542051.1)、SIGLEC10(GenBank登錄編號：AY358337.1)、2B4(亦稱為CD244，登錄編號：NM_001166664.1)，其直接抑制免疫細胞。例如，CTLA-4為表現在某些CD4和CD8 T細胞上之細胞表面蛋白；當與抗原呈遞細胞上之其配體(B7-1和B7-2)接合時，T細胞活化及效應子功能受抑制。
於一些實施態樣中，該遺傳工程處理細胞之方法包含至少一個下列步驟：提供T細胞(諸如來自細胞培養物或來自血液樣本)；將能夠藉由DNA裂解來選擇性地將編碼免疫檢查點蛋白質之基因去活化的罕見切割核酸內切酶引入T細胞中(較佳地，該罕見切割核酸內切酶係藉由雙股斷裂來將該基因去活化)，並擴增該細胞。於一些實施態樣中，該方法包含：提供T細胞(諸如來自細胞培養物或來自血液樣本)；以編碼能夠藉由DNA裂解來選擇性地將編碼免疫檢查點蛋白質之基因去活化的罕見切割核酸內切酶之核酸轉染該T細胞，較佳地，該罕見切割核酸內切酶係藉由雙股斷裂來將該基因去活化；在T細胞中表現該 罕見切割核酸內切酶；擴增該細胞。於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶特異地靶向選自由下列所組成之群組的基因：PD-1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、TCR α和TCR β。於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶可為大範圍核酸酶、鋅指核酸酶或TALE核酸酶。於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶為TALE核酸酶。
於一些實施態樣中，本發明可能特別適合異基因免疫療法。於該等實施態樣中，細胞可藉由包含下列步驟之方法來修飾：將T細胞中至少一個編碼T細胞受體(TCR)組分之基因去活化；及擴增該T細胞。於一些實施態樣中，該方法之遺傳修飾係依賴在所提供之欲加工的細胞中表現一種罕見切割核酸內切酶，從而使該罕見切割核酸內切酶特異催化一個被靶向之基因中的裂解，藉此將該被靶向之基因去活化。於一些實施態樣中，該遺傳工程處理細胞之方法包含至少一個下列步驟：提供T細胞(諸如來自細胞培養物或來自血液樣本)；將能夠藉由DNA裂解來選擇性地將編碼T細胞受體(TCR)之組分之基因去活化的罕見切割核酸內切酶引入T細胞中並擴增該細胞，較佳地，該罕見切割核酸內切酶係藉由雙股斷裂來將該基因去活化。
於一些實施態樣中，該方法包含：提供T細胞(諸如來自細胞培養物或來自血液樣本)；以編碼能夠藉由DNA裂解來選擇性地將編碼T細胞受體(TCR)之組分之基 因去活化的罕見切割核酸內切酶之核酸轉染該T細胞，較佳地，該罕見切割核酸內切酶係藉由雙股斷裂來將該基因去活化；在T細胞中表現該罕見切割核酸內切酶；分選出該經轉化之T細胞(此T細胞不會在其細胞表面上表現TCR)；及擴增該細胞。
於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶可為大範圍核酸酶、鋅指核酸酶或TALE核酸酶。於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶為TALE核酸酶。於一些實施態樣中，該TALE核酸酶識別並裂解編碼TCR α或TCR β之序列。於一些實施態樣中，TALE核酸酶包含選自SEQ ID NO：334、335、336、337、338、339、340或341所示之胺基酸序列的多肽序列。
TALE核酸酶多肽序列：
重複子TRAC T01-L
(SEQ ID NO：334)。
重複子TRAC T01-R
(SEQ ID NO：335)。
重複子TRBC T01-L
(SEQ ID NO：336)。
重複子TRBC T01-R
(SEQ ID NO：337)。
重複子TRBC T02-L
(SEQ ID NO：338)。
重複子TRBC T02-R
(SEQ ID NO：339)。
重複子CD52_T02-L
(SEQ ID NO：340)。
重複子CD52_T02-R
(SEQ ID NO：341)。
於另一態樣中，另一遺傳修飾細胞之步驟可為擴增TCR α缺失之T細胞的方法，其包含將pT α(亦稱為preTCR α)或其功能性變體引入T細胞中及擴增該細胞(此可選擇地透過刺激CD3複合物進行)。於一些實施態樣中，該方法包含：a)以編碼至少一個pT α之片段的核酸轉染該細胞，以支持CD3表面表現；b)在細胞中表現該pT α；和c)擴增該細胞(此可選擇地透過刺激CD3複合物進行)。
本發明亦提供製備用於免疫療法之T細胞的方法，其包含用於擴增T細胞之方法的步驟。於一些實施態樣中，該pT α多核苷酸序列可隨機地或藉由同源重組被引入細胞中。於一些實施態樣中，插入可能與該TCR α基因之去活化關聯。可使用pT α之不同功能性變體。肽之“功能性變體”係指基本上類似於該整個肽或其片段之分子。pT α或其功能性變體之“片段”係指該分子之任意子集，亦即，較全長pT α短之肽。於一些實施態樣中，pT α或功能變體可為，例如全長之pT α或C端截短之pT α 版本。C端截短之pT α缺乏C端之一或多個殘基。C端截短之pT α版本的非限制性實例為缺乏來自蛋白質之C端的18、48、62、78、92、110或114殘基。該肽之胺基酸序列變體可藉由在編碼該肽之DNA中的突變來製備。該等功能性變體包括，例如從胺基酸序列刪除、或插入或取代殘基。亦可製造任何缺失、插入和取代之組合以獲得最終之構建體，惟其該最終構建體具有所期望之活性，尤其是回復功能性CD3複合物。於較佳之實施態樣中，在如上述之不同的pT α版本中引入至少一個突變以影響二聚體化。突變之殘基的非限制性實例可能為人pT α蛋白之W46R、D22A、K24A、R102A或R117A中至少一者或使用CLUSTALW法在pT α族或同系成員上之經比對的位置。較佳地，如上述之pT α或其變體包含突變之殘基W46R或突變之殘基D22A、K24A、R102A和R117A。於一些實施態樣中，該pT α或變體亦可與轉導信號結構域融合，非限制實例有，諸如CD28、OX40、ICOS、CD27、CD137(4-1BB)和CD8。如上述之pT α或其變體的胞外結構域可與TCR α蛋白之片段融合，尤其是TCR α之跨膜結構域和胞內結構域。pT α變體亦可與TCR α之胞內結構域融合。
於一些實施態樣中，pT α版本可與胞外配體結合結構域融合。於一些實施態樣中，pT α或其功能性變體係與單鏈抗體片段(scFv)融合，該單鏈抗體片段(scFv)包含藉由彈性連接子連結之靶的抗原特異性單株抗體的輕和重鏈 可變片段。
術語“TCR α缺失之T細胞”係指缺少功能性TCR α鏈之表現的經分離之T細胞。此可藉由不同方式完成，非限制性實例為藉由遺傳工程處理T細胞，從而使其細胞表面上不表現任何功能性TCR α，或藉由遺傳工程處理T細胞，從而使其表面上產生極少之功能性TCR α鏈，或藉由遺傳工程處理T細胞以表現TCR α鏈之突變或截短形式。TCR α缺失之細胞無法再透過CD3複合物擴增。因此，為了克服此間題並允許TCR α缺失之細胞增殖，將pT α或其功能性變體引入細胞中，從而回復功能性CD3複合物。於一些實施態樣中，該方法進一步包含將罕見切割核酸內切酶引入該T細胞中，該罕見切割核酸內切酶能夠藉由DNA裂解來選擇性地將編碼T細胞受體(TCR)之一種組分的一個基因去活化。於一些實施態樣中，該罕見切割核酸內切酶為TALE核酸酶。
於另一態樣中，藉由本文所描述之方法取得之經遺傳工程處理的T細胞可與雙特異性抗體接觸。例如，該T細胞可在投予患者前先在活體外與雙特異性抗體接觸，或在投予患者後與雙特異性抗體在活體內接觸。雙特異性抗體包含二個具有不同抗原性質的可變區，該不同的抗原性質有助於將該經遺傳工程處理之細胞帶到接近靶的抗原處。雙特異性抗體之非限制性實例可為針對腫瘤標記及淋巴細胞抗原(諸如，例如，但不限於CD3)且具有重新定向和活化任何對抗腫瘤之循環T細胞的潛力者。
於一些實施態樣中，編碼根據本發明之多肽的多核苷酸可為mRNA，其可，例如藉由電穿孔直接被引入細胞中。於一些實施態樣中，可使用cytoPulse技術來瞬時通透活細胞以將物質遞送入細胞。參數可經修改以決定用於高轉染效率並具最小死亡率之條件。
本發明亦提供轉染T細胞之方法。於一些實施態樣中，該方法包含：將T細胞與RNA接觸並在T細胞上施用由下列各項所組成之機動脈衝順序(a)每厘米之電壓範圍為約2250至3000V的電脈衝；(b)脈衝寬度為0.1ms；(c)步驟(a)和(b)之電脈衝之間的脈衝間隔為約0.2至10ms；(d)電壓範圍為約2250至3000V，脈衝寬度為約100ms之電脈衝且步驟(b)和步驟(c)之第1個電脈衝之間的脈衝間隔為約100ms；和(e)4個電壓為約325V之電脈衝，其脈衝寬度為約0.2ms且4個電脈衝各自之間的脈衝間隔為2ms。於一些實施態樣中，轉染T細胞之方法包含將該T細胞與RNA接觸並在T細胞上施用包含下列各項之機動脈衝順序(a)每厘米之電壓範圍為約2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V的電脈衝；(b)脈衝寬度為0.1ms；(c)介於步驟(a)和(b)之電脈衝之間的脈衝間隔為約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ms；(d)一個具有約2250、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V之電壓範圍，並具有約 100ms之脈衝寬度且具有在步驟(b)之電脈衝和步驟(c)之第一個電脈衝間為100ms的脈衝間隔之電脈衝；和(e)4個電壓為約325V之電脈衝，其脈衝寬度為約0.2ms且4個電脈衝各自之間的脈衝間隔為2ms。包含在上述數值範圍內之任何數值被揭示於本申請案中。電穿孔介質可為本技藝中已知之任何合適的介質。於一些實施態樣中，該電穿孔介質在跨越約0.01至約1.0毫西門子(milliSiemens)之範圍內具有導電性。
於一些實施態樣中，非限制性實例有：RNA編碼罕見切割核酸內切酶、一種罕見切割核酸內切酶之單體，諸如半-TALE核酸酶、CAR、至少一個該多鏈嵌合型抗原受體之組分、pT α或其功能性變體、外源核酸及/或一個另外之催化性結構域。
經遺傳工程處理之免疫細胞
本發明亦提供包含任何本文所描述之任一CAR多核苷酸的經遺傳工程處理之免疫細胞。於一些實施態樣中，CAR可以轉基因形式經由質粒載體被引入免疫細胞中。於一些實施態樣中，該質粒載體亦可含有，例如用於鑑定及/或選擇接收該載體之細胞的選擇標記。
將編碼該CAR多肽之多核苷酸引入細胞後，CAR多肽可在該細胞內原位合成。或者，CAR多肽可在細胞外產生，然後再引入細胞中。用於將多核苷酸構建體引入細胞之方法為本技藝所已知。於一些實施態樣中，可使用穩定 轉化方法來將該多核苷酸構建體整合入該細胞之基因組中。於其他實施態樣中，可使用瞬時轉化方法來瞬時表現該多核苷酸構建體及該未整合入細胞之基因組中的多核苷酸構建體。於其他實施態樣中，可使用由病毒介導之方法。該多核苷酸可藉由任何合適之方式，諸如，例如重組病毒載體(例如逆轉錄病毒腺病毒)、脂質體和類似物被引入細胞中。瞬時轉化方法包括，例如，但不限於微注射、電穿孔或粒子轟擊(particle bombardment)。多核苷酸可被包含在載體中，諸如，例如質粒載體或病毒載體。
本發明亦提供藉由上述之遺傳工程處理本發明所提供之細胞的方法所取得之經分離的細胞和細胞系。於一些實施態樣中，經分離之細胞包含至少一個如上述之CAR。於一些實施態樣中，經分離之細胞包含CAR群，各CAR包含不同之胞外配體結合結構域。
本發明亦提供根據上述任一方法取得之經分離之免疫細胞。能夠表現異源DNA之任何免疫細胞均可用來表現所欲之CAR。於一些實施態樣中，該免疫細胞為T細胞。於一些實施態樣中，免疫細胞可源自，例如，但不限於幹細胞。該幹細胞可為成體幹細胞、非人類胚胎幹細胞，更特別地，非人類幹細胞、臍帶血幹細胞、祖細胞、骨髓幹細胞、誘導性多功能幹細胞、全能性幹細胞或造血幹細胞。代表性人類細胞為CD34+細胞。該經分離之細胞亦可為樹突細胞、殺手樹突細胞、肥大細胞、NK細胞、B細胞或選自由下列所組成之群組的T細胞：炎性T淋巴 細胞、細胞毒性T淋巴細胞、調節性T淋巴細胞或輔助T淋巴細胞。於一些實施態樣中，該細胞可源自由下列所組成之群組：CD4+T淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞。
在擴增和遺傳修飾之前，細胞的來源可透過各種非限制性方法從個體取得。細胞可從多種非限制性來源取得，包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴節點組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸膜積液、脾臟組織和腫瘤。於一些實施態樣中，本技藝之技術熟習人士所能取用且已知之任何數目的T細胞系均可使用。於一些實施態樣中，該細胞可源自健康供體、被診斷罹患癌症之患者或被診斷具有感染之患者。於一些實施態樣中，該細胞可為呈現出不同之表型特徵的混合細胞群之一部分。
本發明亦提供從根據上述任何方法轉化之T細胞取得之細胞系。本發明亦提供對免疫抑制治療具抗性之經修飾的細胞。於一些實施態樣中，根據本發明之經分離的細胞包含編碼CAR之多核苷酸。
本發明之免疫細胞可在基因修飾T細胞之前或之後使用通常描述於，例如，但不限於下列文獻中之方法來活化及擴增：美國專利案第6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041號；和美國專利申請刊物第 20060121005號。T細胞可在活體外或活體內擴增。一般而言，本發明之T細胞可，例如藉由與刺激CD3 TCR複合物之藥劑和T細胞表面上之共刺激分子接觸來創建用於T細胞之活化信號以進行擴增。例如可使用化學物質，諸如鈣離子載體A23187、佛波醇12-肉登蔻酸酯13-醋酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate)(PMA)或促有絲分裂凝集素(lectine)樣植物血凝素(PHA)來創建用於T細胞之活化信號。
於一些實施態樣中，該T細胞群可經由在玻管內與，例如抗CD3抗體或其抗原結合片段、或固定在表面上之抗CD2抗體接觸或經由接觸與鈣離子載體軛合之蛋白激酶C活化劑(例如苔蘚抑素(bryostatin))而受到刺激。為了共刺激在T細胞表面上之輔助分子，使用結合該輔助分子之配體。例如，可將T細胞群在適合用於刺激T細胞增殖之條件下與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸。用於T細胞培養之適當條件包括可能含有增殖和存活之必要因子的適當培養基(例如最小必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 5(Lonza))，該增殖和存活之必要因子包括血清(例如胎牛血清或人血清)、介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFp及TNF，或本技藝之技術熟習人士已知之用於細胞生長的任何其他添加劑。用於細胞生長之其他添加劑包括，但不限於界面活性劑、人血漿蛋白粉(plasmanate)及還原劑，諸如N-乙醯基-半胱胺酸和2-巰基乙醇。培養基可包括具 有添加之胺基酸、丙酮酸鈉及維生素的RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 1及X-Vivo 20、Optimizer，其不含血清或經補充適當量之血清(或血漿)或限定之激素組，及/或足以用於長成和擴增T細胞之細胞因子量。抗生素(例如青黴素和鏈黴素)僅包含在試驗培養物中，不包含在那些欲注入個體之細胞培養物中。靶的細胞被保持在支持生長之必要條件下，例如適當之溫度(例如37℃)和大氣(例如空氣加5%之CO2)。已暴露於各種刺激時間的T細胞可顯現出不同的特徵。
於一些實施態樣中，本發明之細胞可藉由與組織或細胞共同培養來擴增。該細胞亦可在活體內擴增，例如在該細胞被投予入個體後在該個體之血液中擴增。
於一些實施態樣中，該根據本發明之經分離的細胞包含一個選自由下列所組成之群組的經去活化之基因：CD52、GR、PD-1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、HLA、TCR α和TCR β及/或表現CAR、多鏈CAR及/或pT α轉基因。於一些實施態樣中，經分離之細胞包含編碼包含多鏈CAR之多肽的多核苷酸。於一些實施態樣中，該根據本發明分離之細胞包含二個選自由下列所組成之群組的經去活化之基因：CD52和GR、CD52和TCR α、CDR52和TCR β、GR和TCR α、GR和TCR β、TCR α和TCR β、PD-1和TCR α、PD-1和TCR β、CTLA-4和TCR α、CTLA-4和TCR β、LAG3和TCR α、LAG3和TCR β、 Tim3和TCR α、Tim3和TCR β、BTLA和TCR α、BTLA和TCR β、BY55和TCR α、BY55和TCR β、TIGIT和TCR α、TIGIT和TCR β、B7H5和TCR α、B7H5和TCR β、LAIR1和TCR α、LAIR1和TCR β、SIGLEC10和TCR α、SIGLEC10和TCR β、2B4和TCR α、2B4和TCR β及/或表現CAR、多鏈CAR和pT α轉基因。
於一些實施態樣中係藉由將TCR α基因及/或TCR β基因去活化來使得TCR無法在根據本發明之細胞中運作。於一些實施態樣中係提供用來取得源自個體之經修飾之細胞的方法，其中該細胞能夠無關於主要組織相容性複合體(MHC)信號傳導通路而增殖。可無關於MHC信號傳導通路而增殖，且容易藉由本方法取得之經修飾的細胞係包含在本發明之範圍內。本文所所揭示之經修飾的細胞可用於治療有需要對抗宿主抗移植物(HvG)排斥反應和移植物抗宿主病(GvHD)之患者；因此，本發明之範圍包含用於治療有需要對抗宿主抗移植物(HvG)排斥和移植物抗宿主病(GvHD)之患者的方法，該方法包含經由投予該患者有效量之包含經去活化的TCR α及/或TCR β基因的經修飾之細胞。
於一些實施態樣中，該免疫細胞經遺傳工程處理成對一或多種化療藥物具有抗性。該化療藥物可為例如嘌呤核苷酸類似物(PNA)，從而使免疫細胞適合與過繼性免疫療法和化療組合來治療癌症。示例性PNA包括，例如單 獨或組合之氯法拉濱(clofarabine)、氟達拉濱(fludarabine)和阿糖胞苷。PNA被脫氧胞苷激酶(dCK)代謝成單、二和三磷酸PNA。其三磷酸鹽形式與ATP競爭合成DNA，以促凋亡劑形式作用且為核糖核苷酸還原酶(RNR)之強效抑制劑，該核糖核苷酸還原酶參與製造三核苷酸。本發明提供包含經去活化之dCK基因的BCMA特異性CAR-T細胞。於一些實施態樣中，該dCK剔除細胞係使用編碼針對dCK基因之特異性TAL核酸酶的多核苷酸，經由，例如電穿孔mRNA轉染T細胞來製造。該dCK剔除之BCMA特異性CAR-T細胞對PNA(包括，例如氯法拉濱及/或氟達拉濱)具抗性並保持對表現BCMA之細胞的T細胞毒性活性。
於一些實施態樣中，本發明之經分離之細胞或細胞系可包含pT α或其功能性變體。於一些實施態樣中，經分離之細胞或細胞系可進一步藉由將該TCR α基因去活化來進行遺傳修飾。
於一些實施態樣中，該CAR-T細胞包含編碼自殺性多肽(諸如，例如RQR8)之多核苷酸。參見，例如WO2013153391A(其全部內容以引用方式被併入本文作為參考)。在包含該多核苷酸之CAR-T細胞中，該自殺性多肽係表現在CAR-T細胞之表面上。於一些實施態樣中，該自殺性多肽包含SEQ ID NO：342所示之胺基酸序列。 (SEQ ID NO：342)。
該自殺性多肽亦可在胺基端包含信號肽。於一些實施態樣中，該自殺性多肽包含SEQ ID NO：400所示之胺基酸序列。
(SEQ ID NO：400)。
當該自殺性多肽表現在CAR-T細胞的表面上時，利妥昔單抗(rituximab)與該多肽之R抗原決定部位結合造成細胞溶解。每一表現在細胞表面上之多肽可與一個以上之利妥昔單抗分子結合。該多肽之各R抗原決定部位可與單獨之利妥昔單抗分子結合。刪除BCMA特異性CAR-T細胞可，例如藉由投予患者利妥昔單抗而在活體內發生。刪除該轉移之細胞的決定可能來自於在患者中檢測到歸因於該轉移之細胞的不良影響，諸如，例如當檢測到不可接受之毒性水準時。
於一些實施態樣中，該CAR-T細胞在該具有可被特定抗體識別之特異性的scFv內包含選定之抗原決定部位。參見，例如2016年1月25日提交之PCT申請案“mAb-DRIVEN CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR SYSTEMS FOR SORTING/DEPLETING ENGINEERED IMMUNE CELLS”(其全部內容以引用方式併入本文中)。該等抗原決定部位促進CAR-T細胞之分選及/或消耗。該抗原決定部位可從本技藝已知之任何數目的抗原決定部位中選擇。於一些實施態樣中，該抗原決定部位可為經核准用於醫療之單株抗體的靶的，諸如，例如，但不限於可被 利妥昔單抗識別之CD20抗原決定部位。於一些實施態樣中，該抗原決定部位包含SEQ ID NO：397所示之胺基酸序列。
CPYSNPSLC(SEQ ID NO：397)
於一些實施態樣中，該抗原決定部位係位於該CAR內。例如，但不限於該抗原決定部位可位於該CAR之scFv和鉸鏈之間。於一些實施態樣中，被連接子分開之相同抗原決定部位的二個場位亦可用於CAR中。例如包含SEQ ID NO：398所示之胺基酸序列的多肽可用於CAR中，位於輕鏈可變區和鉸鏈之間。
GSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGS(SEQ ID NO：398)
於一些實施態樣中，該抗原決定部位特異性抗體可與細胞毒性藥物軛合。亦可能藉由使用其上為移植之補體系統組分的經遺傳工程處理之抗體來促進CDC細胞毒性。於一些實施態樣中，CAR T細胞之活化可藉由使用能識別該抗原決定部位之抗體來耗盡細胞而進行調節。
治療性應用
藉由上述方法取得之經分離的細胞或源自該等經分離之細胞的細胞系可用來作為藥物。於一些實施態樣中，該等藥物可用於治療癌症。於一些實施態樣中，該癌症為多發性骨髓瘤、惡性漿細胞瘤、何杰金氏淋巴瘤、結節性淋巴細胞為主的何杰金氏淋巴瘤、卡勒氏病和骨髓性白血病、漿細胞白血病、漿細胞瘤、B細胞前淋巴細胞性白血 病、髮細胞白血病、B細胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性髓細胞性白血病(CML)、濾泡性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤、髓性白血病、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、黏膜相關之淋巴組織淋巴瘤、小細胞淋巴細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、原發性縱隔(胸腺)大B-細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、結節性邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、T細胞/組織細胞富集之大B細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性皮膚瀰漫性大B細胞淋巴瘤(腿型)、老年EBV陽性瀰漫性大B細胞淋巴瘤、與發炎相關之瀰漫性大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、起源於HHV8相關之多中心性卡斯爾曼病的大B細胞淋巴瘤、介於瀰漫性大B細胞淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤特徵之間不能分類的B細胞淋巴瘤、介於瀰漫性大B細胞淋巴瘤和經典何杰金氏淋巴瘤特徵之間不能分類的B細胞淋巴瘤或其他B細胞相關之淋巴瘤。
於一些實施態樣中，根據本發明之經分離的細胞或源自該經分離之細胞的細胞系可用於製造用來治療有此需 要之患者的癌症之藥物。
本發明亦提供用於治療患者之方法。於一些實施態樣中，該方法包含提供本發明之免疫細胞給予有此需要之患者。於一些實施態樣中，該方法包含投予有此需要之患者本發明之經轉化的免疫細胞。
於一些實施態樣中，本發明之T細胞可經歷活體內強烈的T細胞擴增並可持續一段延長之時間。
本發明之治療方法可為改善、治療或預防性。本發明之方法可為自體免疫療法之一部分或同種異體免疫療法之一部分。本發明特別適合用於同種異體免疫療法。來自供體之T細胞可使用標準方案轉化成非同種異體反應性細胞並依需要複製，從而產生可投予一或多個患者之CAR-T細胞。該等CAR-T細胞療法可以“現成”之治療產品形式供入使用。
可用於所揭示之方法的細胞描述於先前的章節中。治療可用於治療確診罹患，例如癌症之患者。可治療之癌症包括，例如，但不限於涉及B淋巴細胞之癌症，包括上列癌症之任一者。欲以本發明之CAR及CAR-T細胞治療之癌症類型包括，但不限於某些白血病或淋巴惡性腫瘤。成人腫瘤/癌症及兒童腫瘤/癌症亦包括在內。於一些實施態樣中，該治療可與一或多種選自下列群組之針對癌症的療法組合使用：抗體療法、化學療法、細胞因子療法、樹突狀細胞療法、基因療法、激素療法、雷射光療法和放射線照射療法。
於一些實施態樣中，治療可投予經歷免疫抑制治療之患者。確實地，本發明較佳為依賴那些由於該編碼用於此等免疫抑制劑之受體的基因被去活化而被處理成對至少一種免疫抑制劑具抗性的細胞或細胞群。於此態樣中，該免疫抑制治療應在患者體內協助選擇根據本發明之T細胞並擴增之。根據本發明之細胞或細胞群可以任何習知方式投予，包括經由霧化吸入、注射、攝入、輸液、植入或移植投予。本文所描述之組成物可藉由靜脈內或淋巴內注射，經由皮下、皮內、瘤內、節點內、髓內、肌肉內途徑，或腹膜內途徑投予患者。於一實施態樣中，本發明之細胞組成物較佳為藉由靜脈內注射投予。
於一些實施態樣中，該細胞或細胞群之投予可包含，例如每kg體重投予約104至約109個細胞，包括在那些範圍內之所有整數值的細胞數。於一些實施態樣中，該細胞或細胞群之投予可包含每kg體重投予約105至約106個細胞，包括在那些範圍內之所有整數值的細胞數。該細胞或細胞群可在一或多個劑量中投予。於一些實施態樣中，該有效量之細胞可以單一劑量形式投予。於一些實施態樣中，該有效量之細胞可在一段時間內以一個以上之劑量形式投予。投予時點係由管理醫生判定並取決於患者之臨床病症。該細胞或細胞群可從任何來源取得，諸如血庫或供體。雖然個別需求不同，用於特定疾病或病症之指定細胞類型的有效量之最佳範圍的測定係在本技藝之技術範圍內。有效量意指能提供治療或預防益處之量。投予之劑 量將取決於接受者之年齡、健康和體重、並行治療(若有的話)之種類、治療之頻率和所期望效果之性質。於一些實施態樣中，該有效量之細胞或包含那些細胞之組成物係經由腸胃道外投予。於一些實施態樣中，該投予可為靜脈內投予。於一些實施態樣中，該投予可藉由直接注射在腫瘤內完成。
於本發明之一些實施態樣中，細胞可連同(例如之前、同時或之後)任何數目之相關治療形式一起投予患者，該相關治療形式包括，但不限於以下列藥劑進行之治療：諸如單株抗體療法、CCR2拮抗劑(例如INC-8761)、抗病毒療法、西多福韋(cidofovir)和介白素-2、阿糖胞苷(亦稱為ARA-C)、或用於MS患者之那他珠單抗(nataliziimab)治療、或用於牛皮癬患者之伊法利珠單抗(efaliztimab)治療或用於PML患者之其他治療。於一些實施態樣中，BCMA特異性CAR-T細胞係連同下列之一或多項投予患者：抗PD-1抗體(例如尼渥魯單抗(nivolumab)、沛洛珠單抗(pembrolizumab)或PF-06801591)、抗PD-L1抗體(例如艾維魯單抗(avelumab)、阿特柔珠單抗(atezolizumab)或德瓦魯單抗(durvalumab))、抗OX40抗體(例如PF-04518600)、抗4-1BB抗體(例如PF-05082566)、抗MCSF抗體(例如PD-0360324)、抗GITR抗體及/或抗TIGIT抗體。於一些實施態樣中，包含SEQ ID NO：396所示之胺基酸序列的BCMA特異性CAR係連同抗PD-L1抗體艾維魯單抗一起投予患者。於進一步 之實施態樣中，本發明之T細胞可與化療、放療、免疫抑制劑，諸如環孢菌素、硫唑嘌呤、甲胺喋呤、黴酚酸酯和FK506)、抗體或其他免疫消融劑，諸如CAMPATH、抗CD3抗體或其他抗體療法、細胞毒素、氟達拉濱、環孢菌素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228、細胞因子及/或放射照射組合使用。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調磷酸酶(環孢菌素和FK506)或抑制對於由生長因子誘導之信號很重要之p70S6激酶(雷帕黴素)(Henderson,Naya et al.1991；Liu,Albers et al.1992；Bierer,Hollander et al.1993)。於進一步之實施態樣中，本發明之細胞組成物係連同(例如之前、同時或之後)骨髓移植、使用化療劑(諸如氟達拉濱)之T細胞消融療法、外部光束放射療法(XRT)、環磷醯胺或抗體，諸如OKT3或CAMPATH組合投予患者。於一些實施態樣中，本發明之細胞組成物係在B細胞消融療法(諸如與CD20反應之藥劑，例如利妥昔單抗(Rituxan))後投予。例如，於一實施態樣中，個體可能經歷以高劑量化療及隨後之外周血造血幹細胞移植進行的標準療法。於某些實施態樣中，移植之後，個體接受輸注本發明之擴增的免疫細胞。於一些實施態樣中，擴增之細胞係在手術之前或之後投予。
套組
本發明亦提供用於本方法中之套組。本發明之套組包括一或多個容器及根據本文所描述之任一發明方法的使 用說明書，該一或多個容器中包含如本文所描述之編碼BCMA特異性CAR之多核苷酸或包含含有編碼BCMA特異性CAR之多核苷酸的經遺傳工程處理的免疫細胞。一般而言，這些說明書包含投予用於上述治療性治療之經遺傳工程處理的免疫細胞之描述。
與本文所描述之經遺傳工程處理的免疫細胞相關之使用有關的說明書大致上包括有關用於所欲治療之劑量、給藥時間表和投予途徑的信息。該容器可為單位劑量、散裝包裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。本發明之套組中所提供之說明書通常為書寫在標籤或包裝仿單上之書寫指示(例如包括在套組中之紙)，但亦可接受機器可讀之說明書(例如磁碟或光碟上所攜帶之說明書)。
本發明之套組係在合適之包裝中。合適之包裝包括，但不限於小瓶、瓶、罐、軟質包裝(例如密封之Mylar或塑料袋)及類似物。亦考慮與特定裝置組合使用之包裝，諸如吸入劑、鼻腔投予裝置(例如霧化器)或輸液裝置，諸如微型泵。套組可具有無菌存取口(例如該容器可為靜脈注射溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。該容器亦可具有無菌存取口(例如該容器可為靜脈注射溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組成物中至少一種活性劑為BCMA抗體。該容器可進一步包含第二藥學活性劑。
套組可選擇性地提供額外之組件，諸如緩衝液和解釋性信息。通常地，該套組包含容器和在該容器上或與該 容器聯結之標籤或包裝仿單。
所提供之下列實例僅用於說明目的並不意圖在任一方面限制本發明之範圍。實際上，本技藝之技術熟習人士將可從前述內容清楚明白除了本文所顯示和描述者外之本發明的各種修改且這些修改係在所附之申請專利範圍之範疇內。
本發明之代表性保藏物在2016年2月9日保藏於美國典型培養物保藏中心(ATCC)。該ATCC保藏號為PTA-122834之生物保藏物為包含編碼BCMA特異性CAR之多核苷酸的載體。該保藏物係根據國際承認之用於專利程序之微生物保存的布達佩斯條約之規定及據此(布達佩斯條約)條例製作。這確保該保藏物從保藏之日起30年維持可存活之培養。該保藏物將可在布達佩斯條約的條款下從ATCC取得，並受制於輝瑞公司和ATCC之間的協議，這確保公眾可在相關之美國專利發佈或任何美國或外國專利申請案(不論誰先)公開揭露時能永久和無限制地取得該保藏物之培養後代，並保證由美國專利和商標專員根據35 U.S.C.章節122和據此之專員規則(包括37 C.F.R.章節1.14，特別參考886 OG 638)所決定之具有取用權利者能取用該培養後代。
本申請案之受讓人已同意若在合適之條件下培養時若保藏物之培養死亡或喪失或被破壞，則該保藏物將在通知時被及時更換成另一相同者。該保藏物之可用性不能被解釋為允許在違反任何政府根據其專利法之權限所授予之 權利下實施本發明。
第1圖描繪在MM1.S腫瘤模型中以BCMA特異性CAR-T治療時總結該結果之圖形。
第2圖描繪在在Molp8腫瘤模型中以BCMA特異性CAR-T治療時總結該結果之圖形。
實例1：在25℃及/或37℃下測定BCMA/人IgG交互作用之動力學及親和力
本實例在25℃和37℃下測定各種抗BCMA抗體之動力學及親和力。
所有實驗均在Bio-Rad Proteon XPR36表面等離子體共振生物傳感器(Bio-Rad，Hercules，CA)上進行。使用胺偶聯方法在Bio-Rad GLC傳感器晶片上製備抗BCMA抗體陣列(類似於Abdiche,et al.,Anal.Biochem.411,139-151(2011)中所描述者)。用於固定化之分析溫度為25℃且該運行緩衝液為HBS-T+(10mM HEPES，150mM NaCl，0.05% Tween-20，pH 7.4)。將1mM ECD和0.25mM NHS之混合物以30μL/min之流速注射在分析物(水平)方向3分鐘來活化通道。將在10mM醋酸鹽，pH 4.5緩衝液中之濃度20μL/mL的IgG以30μL/min之流速注射在配體(垂直)方向1.5分鐘，以將IgG固定在經活化的斑點上。以30μL/min之流速將1M乙醇胺，pH 8.5注射在分析物 方向3分鐘以阻斷該經活化之表面。
在補充有1mg/mL之BSA的運行緩衝液HBS-T+中之BCMA結合分析的分析溫度為37℃或25℃。依Abdiche，et al.之描述採用動力學滴定法進行交互作用分析。使用一系列由低至高濃度之注射液將人類BCMA(huBCMA)或石蟹彌猴BCMA(cyBCMA)分析物注射在分析物方向。所使用之濃度為0.08nM、0.4nM、2nM、10nM和50nM(5員系列，具有5倍稀釋因子且最高濃度為50nM)。指定分析物稀釋液之結合時間為二分鐘。緊接著於注射50nM之BCMA後，監測解離2小時。在注射BCMA分析物之前，注射5次緩衝液，在BCMA分析週期使用相同之結合和解離次數以製備用於雙重參考目的之緩衝液空白感應圖(如Myszka,J.Mol.Recognit.12,279-284(1999)中所描述之雙重參考)。
將感應圖雙重引用並擬合至BIAevaluation軟體4.1.1版(GE Lifesciences，紐澤西州Piscataway)中之1：1 Langmuir with mass transport動力學滴定模型。表4A-4C中顯示本發明之各種抗BCMA抗體的動力學及親和力參數。表4A-4C中所示之抗體與表1中所示之具有相同名稱的CAR分享相同之VH和VL區。
實例2：BCMA特異性CAR-T細胞
此實例證明BCMA特異性CAR-T細胞針對BCMA陽性(BCMA+)腫瘤細胞之功能活性。
在所有生成之BCMA特異性CAR分子中，選擇8個基於其對BCMA之親和力、對人類BCMA和石蟹獼猴BCMA之交叉反應性和抗原決定部位做進一步的活性試驗。測試之CAR分子包括：P5A、P5AC1、P5AC16、PC1、PC1C12、COM22、P6DY和P6AP。設計三種不同 的架構：第1版(v1)包含FcyR Ⅲ α鉸鏈、第2版(v2)包含CD8 α鉸鏈且第3版(v3)包含IgG1鉸鏈。製備表5中所示之嵌合型抗原受體類(CARs)，並使用及對BCMA+細胞評估其脫粒活性。當各CAR瞬時表現在人T細胞中時測定脫粒活性。
在活性分析方面，從13個健康供體取得T細胞(供體1-13)。簡單地說，從血沉棕黃層樣本純化T細胞並使用CD3/CD28小珠活化之。在活化後之D11/12以編碼不同CAR分子之mRNA瞬時轉染細胞。藉由測量當將其與下列細胞共同培養時之脫粒能力、干擾素-γ(IFN γ)釋出和細胞毒性活性來評估CAR活性：(a)表現BCMA之細胞(MM1S、KMS12BM和L363)，或(b)不表現BCMA蛋白質之細胞(K562)。各分析內亦包括模擬之經轉染的T細胞(在緩衝液中之T細胞)以測定未表現CAR之T細胞的基線活性。
CAR檢測係使用其中該人類BCMA蛋白之胞外結構域與源自小鼠lgG1之Fc片段融合的融合蛋白進行。以抗Fc PE軛合抗體檢測細胞表面之CAR與該融合蛋白之BCMA部分的結合並藉由流式細胞術分析。
材料和方法
初級T細胞培養
T細胞係使用Ficoll梯度密度介質(Ficoll Paque PLUS/GE Healthcare Life Sciences)從EFS(Etablissement Fran ξ ais du Sang，巴黎，法國)所提供之血沉棕黃層樣本純化。將PBMC層回收並使用市售之T細胞富集套組(Stem Cell Technologies)純化T細胞。將純化之T細胞在補充有20ng/mL人IL-2(Miltenyi Biotech)、5%人血清(Sera Laboratories)及Dynabeads Human T活化劑 CD3/CD28(Life Technologies)(磁珠：細胞比為1：1)的X-VivoTM-15培養基(Lonza)中活化。活化後，將細胞在補充有20ng/mL人IL-2(Miltenyi Biotech)和5%人血清(Sera Laboratories)的X-VivoTM-15培養基(Lonza)中生長和維持。
CAR mRNA轉染
在純化和活化T細胞後第4/5天或11/12天進行轉染。以15μg的編碼不同CAR構建體之mRNA來轉染5百萬個細胞。使用mMESSAGE mMACHINE T7套組(Life Technologies)產生CAR mRNA並使用RNeasy Mini Spin柱(Qiagen)純化之。使用PulseAgileTM Cytopulse技術，將二個0.1ms脈衝(在3000V/cm下)及隨後之四個0.2ms脈衝(在325V/cm下)施用在最終體積為200μl之“Cytoporation緩衝液T”(BTX Harvard Apparatus)的0.4cm間隙電擊管(gap cuvette)中以進行轉染。立即將細胞在X-VivoTM-15培養基(Lonza)中稀釋並在37℃，5% CO2下溫育。電穿孔後2小時加入20ng/mL之IL-2(來自Miltenyi Biotec)。
脫粒分析(CD107a動員)
將T細胞與等量之表現BCMA蛋白質或不表現BCMA蛋白質之細胞在96孔盤中培養(50,000個細胞/盤)。將共同培養物在37℃和5% CO2下維持在最終體積為100μl之 X-VivoTM-15培養基(Lonza)中6小時。在細胞刺激期間，經由在共培養開始時加入螢光抗CD107a抗體(與APC軛合，來自Miltenyi Biotec)，連同1μg/ml之抗CD49d(BD Pharmingen公司)、1μg/ml之抗CD28(Miltenyi Biotec公司)及1x之莫能菌素(Monensin)溶液(eBioscience)來將CD107a染色。經過6小時之培育期後，以可固定之死活細胞鑑定染料(eFluor 780，來自eBioscience)和螢光染料軛合之抗CD8(PE軛合Miltenyi Biotec)將細胞染色並藉由流式細胞術分析。脫粒活性之檢測係以CD8 +/CD107a+細胞之%表示且係藉由測定CD8 +細胞中之CD107a染色的平均螢光強度信號(MFI)進行。脫粒分析係在mRNA轉染後24小時進行。結果總結在表6A-9H及下列表9A-9C中。在該等表中，第二欄(標示“CAR-T細胞”)指明表現在經轉染之T細胞中的BCMA特異性CAR。
表現在細胞上之CD107a為抗原特異性活化標記。當與BCMA高(H929)、中(MM1S)和低(KMS12BM，L363)表現細胞一起培育時，表現BCMA特異性CAR之CD8 T細胞上的CD107a之百分比和MFI增加，但在BCMA陰性細胞(K562和Daudi)的情況中則不(表6A-9H和9A-9C)。模擬經轉染之T細胞與BCMA接觸後CD107a表現水準並未增加。因此，該BCMA特異性CAR-T細胞在BCMA表現細胞之存在下會被活化，但在不表現BCMA細胞之存在下則不會被活化。
這些結果證明，當與BCMA表現細胞一起培育時， 表現BCMA特異性CAR之T細胞會被活化，且該活化為抗原特異性。
IFA γ釋出分析
將T細胞與(a)表現BCMA之細胞(MM1S、KMS12BM和L363)或(b)不表現BCMA蛋白質之細胞(K562)共同培育在96孔盤(50,000個細胞/孔)中。將共同培養物保持在37℃，5% CO2下，最終體積為100μl之X-VivoTM-15培養基(Lonza)中24小時。經過此培育期之後，將盤在3 1500rpm離心5分鐘並將上清液回收在新的盤中。藉由ELISA分析(Human IFNy Quantikine ELISA Kit，來自R & D系統)檢測細胞培養上清液中之IFN γ。該IFN γ釋出分析係經由在mRNA轉染後24小時開始細胞共同培養來進行。結果總結在下列表8A-8D和10中。
如表8A-8D和10中所示，表現BCMA特異性CAR之CD8 T細胞當與中度BCMA表現細胞(MM1S)或低度BCMA表現細胞(KMS12BM，L363)一起培育時會製造IFN γ。相反地，表現BCMA特異性CAR之CD8 T細胞當與BCMA陰性細胞(K562)一起培育時所製造之IFN γ微不足道。
這些結果證明表現BCMA特異性CAR之T細胞當與BCMA表現細胞一起培育時會被活化且該活化為抗原特異性。
細胞毒性分析
將T細胞在96孔盤(100,000細胞/孔)中連同在相同孔中之10,000個靶的細胞(表現BCMA)和10,000個對照(BCMAneg)細胞一起培育。在將靶的和對照細胞與CAR+ T細胞共同培養前以螢光細胞內染料(CFSE或Cell Trace Violet，來自Life Technologies)標記該靶的和對照細胞。將共同培養物在37℃，5% CO2下培育4小時。在此培育期之後，以可固定之死活細胞鑑定染料(eFluor 780，來自eBioscience)標記細胞並藉由流式細胞術分析。測定各細胞群(靶的細胞或BCMAneg對照細胞)之存活力並計算特定細胞溶解之%。在mRNA轉染後48小時進行細胞毒性試驗。結果總結於下列表7A-7H中。在表中，細胞毒性數據係以存活細胞之百分比表示，然後計算BCMA陽性細胞/活BCMA陰性細胞之比。細胞溶解之計算為100-模擬轉染之T細胞。
如表7A-7H中所示，表現BCMA特異性CAR之T細胞當與中度BCMA表現細胞(MM1S)或低度BCMA表現細胞(L363)一起培育時顯示出滅殺活性。相反地，表現BCMA特異性CAR之CD8 T細胞當與BCMA陰性細胞(K562)一起培育時不會顯示出滅殺活性。
總之，表5中所示之表現該選定之BCMA特異性CAR之T細胞在與BCMA表現細胞接觸時會被選擇性地活化。雖然BCMA特異性CAR之所有版本均顯示出BCMA特異性活化，與包含FcyR Ⅲ α(v1)鉸鏈或lgG1(v3) 鉸鏈之BCMA特異性CAR相比較，包含CD8 α鉸鏈(v2)之BCMA特異性CAR顯現出活化水準增加。
實例3：BCMA特異性CAR-T細胞誘導MM1.S腫瘤模型中之腫瘤消退
此實例說明使用MM1.S腫瘤模型以BCMA特異性 CAR-T細胞治療腫瘤。
以MM1.S(表現螢光素酶和GFP)原位模型進行BCMA特異性CAR-T細胞之活體內效力研究。將五百萬個MM1.S Luc2AGFP細胞透過尾靜脈，經由靜脈注射入6-8週齡之雌性Nod/Scid/IL2rg -/-(NSG)動物體內。經由腹膜內注射D-螢光素(Regis Technologies，伊利諾州Morton Grove)(每隻動物200μl，濃度15mg/mL)，接著以異氟烷(isoflourane)麻醉之，隨後進行全身生物發光成像(BLI)以監測腫瘤負荷。使用IVIS Spectrum CT儀(Perkin Elmer，麻薩諸塞州)成像來捕捉由腫瘤細胞表現之螢光素酶和螢光素之間的交互作用所發射之生物發光信號，並使用Living Image 4.4(Caliper Life Sciences，加州Alameda)定量總通量(光子/秒)。
本研究中使用三種不同的BCMA特異性CAR-T細胞：表現BCMA特異性CAR構建體P5AC1-V2、PC1C12-V2或COM22-V2之T細胞(參見上列表5)。使用未經轉導之對照T細胞作為陰性對照組。所有T細胞係經遺傳工程處理成為TCR α缺失。
當所有動物之總通量達到平均值為45E6時(腫瘤植入後第20天)，將動物隨機分為4組。透過尾靜脈彈丸注射投予單劑量之人BCMA特異性CAR-T細胞或未經轉導之對照T細胞。當動物表現出後肢麻痺或損失20%之體重時(為MM1.S原位模型終點)殺死動物。
本研究之結果總結於第1圖中。在第1圖中，總通 量[p/s]代表腫瘤進展。與陰性對照組(圓圈)相比較，以BCMA特異性CAR-T細胞治療(三角形、菱形、正方形)導致較低之總通量。因此，與陰性對照組相比較，以BCMA特異性CAR-T細胞治療時可抑制腫瘤進展。
這些結果證明BCMA特異性CAR-T細胞能有效誘導腫瘤消退。
實例4：以BCMA特異性CAR-T細胞治療多發性骨髓瘤
此實例說明使用Molp8原位模型，以BCMA特異性CAR-T細胞治療多發性骨髓瘤。
以Molp8(表現螢光素酶和GFP)原位模型進行BCMA特異性CAR-T細胞之活體內效力研究。將二百萬個Molp8 Luc2AGFP細胞透過尾靜脈，經由靜脈注射入6-8週齡之雌性NSG動物體內。經由腹膜內注射D-螢光素(Regis Technologies，伊利諾州Morton Grove)(每隻動物200μl，濃度15mg/mL)，接著以異氟烷(isoflourane)麻醉之，隨後進行全身生物發光成像(BLI)以監測腫瘤負荷。使用IVIS Spectrum CT儀(Perkin Elmer，麻薩諸塞州)成像來捕捉由腫瘤細胞表現之螢光素酶和螢光素之間的交互作用所發射之生物發光信號，並使用Living Image 4.4(Caliper Life Sciences，加州Alameda)定量總通量(光子/秒)。
當所有動物之總通量達到平均值為30E6時(腫瘤植入後第8天)，將動物隨機分為3組。投予各組下列細胞 之一：1)作為對照組之未經轉導之T細胞TCR KO(“TCR KO”)，2)表現P5AC1-V2.1之BCMA特異性CAR-T細胞(“P5AC1 V2 R2 TCR KO”)，或3)表現P5AC1-V2和RQR8自殺性多肽之BCMA特異性CAR-T細胞(“P5AC1 V2 RQR8 TCR KO”)。細胞1-3全部為TCR α缺失。依上述實例中之描述製備該BCMA特異性CAR-T細胞。BCMA特異性CAR構建體P5AC1-V2.1和P5AC1-V2顯示於上述表5中。透過尾靜脈彈丸注射投予單劑量之3百萬個對照細胞(TCR KO)或BCMA特異性CAR-T(P5AC1 V2 R2 TCR KO或P5AC1 V2 RQR8 TCR KO)。當動物喪失全部體重之15%時(為Molp8原位模型終點)殺死動物。
本研究之結果總結於第2圖中。與陰性對照組(圓圈)相比較，單劑量之3百萬個P5AC1 R2 TCRKO BCMA特異性CAR-T細胞(正方形)或P5AC1 RQR8 TCRKO CAR-T細胞(三角形)BCMA特異性CAR-T細胞導致腫瘤植入後10-35天之總通量較低(第2圖)。因此，與陰性對照組相比較，以BCMA特異性CAR-T細胞治療時可抑制腫瘤進展。
這些結果證明BCMA特異性CAR-T細胞能有效抑制腫瘤進展。
實例5：以BCMA特異性CAR-T細胞治療多發性骨髓瘤
此實例說明BCMA特異性CAR-T細胞在多發性骨髓 瘤之原位小鼠模型中的治療活性。
使用二個人化的小鼠模型來評估BCMA特異性CAR-T細胞對抗表現BCMA之人骨髓瘤細胞系的效力。從傑克遜實驗室購買六(6)至八(8)週齡之雌性Nod/Scid/IL2rg -/-(NSG)小鼠。將所有動物安置在Rinat之無病原體動物飼養設施中並根據按照機構動物護理和使用委員會(IACUC)指導方針之方案進行實驗。
從美國典型培養物保藏中心(ATCC.org)和德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ.de)購買MM1.S和Molp-8細胞系。使用慢病毒顆粒(amsbio)將細胞系進行遺傳工程處理以表現Luc-GFP融合蛋白。在37℃，5%二氧化碳(CO2)下，將細胞培養在具有L-麩胺醯胺，且補充有用於MM1.S細胞之10%胎牛血清或用於Molp-8細胞之20% FCS的RPMI 1640培養基中。收穫指數生長期中生長之細胞並用於腫瘤接種中。
依描述產生治療性BCMA特異性CAR-T細胞。以編碼BCMA特異性CAR之慢病毒顆粒和受EF-1a啟動子驅動之RQR8來活化及轉導健康之人類供體細胞、外周血單核細胞(PBMC)或純化之泛T細胞。本研究中使用三種不同的BCMA特異性CAR：P5AC1-V2、PC1C12-V2及COM22-V2(參見上列表5)。所有T細胞係經遺傳工程處理成為TCR α基因缺失。將細胞培養14至17天，然後冷凍保存在90% FCS/10% DMSO中。在T細胞注射方面， 將T細胞在37℃水浴中快速解凍並以含有25mM Hepes之RPMI 1640培養基清洗二次。將細胞在0.2ml之具有25mM Hepes的RPMI 1640中注射入荷瘤動物之尾靜脈中。
在接種腫瘤細胞的前一天以1Gy全身放射照射(RAD Source Technologies)為NSG小鼠進行放射照射。將在0.1ml磷酸鹽緩衝之鹽水(PBS)中的5×106個MM1.S/Luc2-EGFP細胞或2×106個Molp-8/Luc2-EGFP細胞注射入尾靜脈中。每週使用生物發光成像測量二次腫瘤負荷。為小鼠注射3μg之溶解於0.2ml PBS中的D-螢光素，並使用異氟烷麻醉之。為動物注射後7分鐘使用Perkin Elmer IVIS Spectrum照像系統成像。測量除小鼠尾巴外之全身發光並以總通量(每秒之光子數)報告腫瘤負荷。允許建立腫瘤直到出現指數增長。基於總通量將動物隨機分至治療組並以BCMA特異性CAR-T細胞或來自同一供體之未經轉導之對照T細胞治療之。使用生物發光成像及測量體重每週評估二次CAR-T治療之效果。當第一隻動物經由體重喪失(>20%之初始體重)、後肢麻痺或其他動物危難徵兆指示其顯示出末期疾病時，該研究達到終點。使用GraphPad Prism 6進行統計分析。使用重複量數單因子ANOVA與Tukey校正來比較所有組之間的抗腫瘤效力。P<0.05被認為是有意義的。
結果總結於下列表11(MM1.S)和表12(MolpP-8)中(每秒光子之總通量的log10值+/- SEM)。使用次優之 CAR-T細胞劑量來比較具有不同scFvs之BCMA特異性CAR-T細胞。該BCMA特異性CAR-T細胞群為P5AC1-V2、PC1C12-V2和COM22-V2(參見上述表5)。在MM1.S模型中，在移植腫瘤後第17天注射3.5x106個表現CAR之T細胞。在Molp8模型中，在移植腫瘤後第7天注射4x106個表現CAR之T細胞。在MM1.S小鼠模型中給予之BCMA特異性CAR-T細胞劑量的轉導效率係在19%至29%之範圍內，而在Molp8小鼠模型給予之BCMA特異性CAR-T細胞劑量的轉導效率係在31%至36%之範圍內。對照組係使用相等總劑量之未經轉導的T細胞。經對照T細胞治療之組別顯現出漸進之腫瘤生長，在MM1.S模型中係在第35天達到研究終點，而在Molp8模型中係在第23天達到研究終點。使用RM-ANOVA試驗與Dunnets校正之腫瘤負荷的統計分析顯示出與對照組中之腫瘤負荷相比較，所有三個BCMA特異性CAR-T治療組中之腫瘤負荷顯著降低(p<0.01)(表11和12)。例如在MM1.S腫瘤模型中，在第25天時，相較於給予對照T細胞之動物中的9.22 log10光子/秒，以P5AC1-V2 BCMA特異性CAR-T細胞治療之動物中的平均總通量為6.44 log10光子/秒(表11)。在移植腫瘤後第35天，相較於給予對照T細胞之動物中的10.18 log10光子/秒，以P5AC1-V2 BCMA特異性CAR-T細胞治療之動物中的平均總通量為6.82 log10光子/秒(表11)。在Molp8腫瘤模型中，在第14天時，相較於給予對照T細胞之動物中的9.39 log10光子/秒，以 P5AC1-V2 BCMA特異性CAR-T細胞治療之動物中的平均總通量為7.88 log10光子/秒(表12)。在移植腫瘤後第23天，相較於給予對照T細胞之動物中的10.37 log10光子/秒，以P5AC1-V2 BCMA特異性CAR-T細胞治療之動物中的平均總通量為9.29 log10光子/秒(表12)。
這些結果證明以BCMA特異性CAR-T細胞治療能有效誘導腫瘤消退。
實例6：以TCR α/dCK剔除BCMA特異性CAR-T細胞治療多發性骨髓瘤
此實例說明BCMA特異性CAR-T細胞在多發性骨髓瘤之原位小鼠模型中之治療活性。
使用人化小鼠模型來評估針對表現BCMA之人骨髓瘤細胞系之BCMA CAR-T細胞的效力。從傑克遜實驗室購買6至8週齡之雌性Nod/Scid/IL2rg -/-(NSG)小鼠。將所有動物安置在Rinat之無病原體動物飼養設施中並根據按照機構動物護理和使用委員會(IACUC)指導方針之方案進行實驗。
從美國典型培養物保藏中心(ATCC.org)購買MM1.S細胞系。使用慢病毒顆粒(amsbio)及利用TALEN核酶編輯以使脫氧胞苷(dCK)失能之基因將細胞系進行遺傳工程處理，以表現Luc-GFP融合蛋白。在37℃，5%二氧化碳(CO2)下，將細胞培養在補充有10%胎牛血清之RPMI 1640培養基中。收穫在指數生長期中生長之細胞並用於腫瘤接種中。
依描述產生治療性CAR-T細胞。以編碼BCMA scFv、CD8鉸鏈、CD8跨膜、41BB和CD3 ζ之慢病毒顆粒與受EF-1a啟動子控制之RQR8基因來活化及轉導健康之人類供體細胞、外周血單核細胞(PBMC)或純化之泛T細胞。使用TCR α和dCK TALEN之組合或單獨之TCR α TALEN編輯該BCMA特異性CAR-T細胞之基因以刪除該TCR α及/或dCK基因。所有T細胞之轉導效率為70%。 使用用於CD3陽性細胞之磁性選擇套組(Miltenyi公司)純化TCR α基因剔除T細胞；藉由在0.5μM氯法拉濱之存在下擴增來純化dCK剔除T細胞。將細胞培養14至17天，然後冷凍保存在90% FCS/10% DMSO中。在T細胞注射方面，將T細胞在37℃水浴中快速解凍並以含有25mM Hepes之RPMI 1640培養基清洗二次。在治療方面，將T細胞在0.2ml之具有25mM Hepes的RPMI 1640中注射入荷瘤動物之尾靜脈中。
在小鼠腫瘤模型方面，為動物注射MM1.S/dCK KO腫瘤細胞。然後，在移植腫瘤細胞後第18天以2.5x106個BCMA特異性CAR-T細胞治療小鼠。使用相等劑量之接受TCR α和dCK TALEN的未經轉導之T細胞作為對照組。在注射T細胞後以氯法拉濱或載劑治療動物五天。
結果：經對照組T細胞治療之組別顯現出漸進之腫瘤生長，直到第35天達到研究終點(表13，第1組)。與對照組相比較，以TCR α基因剔除BCMA特異性CAR-T細胞和載劑治療之組別顯現出腫瘤負荷顯著減少(p<0.05)，此在共同投予氯法拉濱(p<0.05)時減弱(表13，第2和3組)。以TCR α/dCK雙重剔除之CAR-T細胞治療的動物中顯現出腫瘤負荷顯著減少，無論該動物是否接受載劑或氯法拉濱(p<0.05)(表13，第4和5組)。在接受TCR α/dCK雙重剔除之T細胞的組別中腫瘤負荷減少的程度與接受TCR α單獨剔除之T細胞和載劑的組別並無不同(p>0.1)(表13，第2、4和5組)。
這些結果證明以TCR α/dCK雙重剔除之BCMA特異性CAR-T細胞進行之治療能在核苷類似物療法(諸如氟達拉濱和氯法拉濱)的存在下有效誘導腫瘤消退。
雖然所揭示之教示內容已參考各種申請案、方法、套組和組成物描述，須理解的是，在不偏離本文之教示內容及下列本發明之申請專利範圍下可對本發明進行各種變化和修改。提供前述實例係用於更清楚地說明所揭示之教示內容，而不意圖限制本發明所提出之教示範圍。雖然本教示內容已就這些示例性實施態樣描述，本技藝之技術熟習人士將可輕易地理解這些示例性實施態樣可能有許多變化和修改而無不當實驗。所有該等變化和修改均在本教示內容之範圍內。
本文引用之所有參考資料，包括專利、專利申請案、論文、教科書等及其中所引用之參考資料(包含彼等未已被併入者)的全部內容以引用方式併入本文。在該併入之文獻和類似材料中之一或多者與本申請案不同或矛盾的情況中(包括，但不限於定義之術語、術語用法、描述之技術，等)，以本申請案之主張為主。
前述說明和實例詳細描述本發明之某些具體實施態樣並描述本發明者所設想之最佳模式。然而，應理解的是，無論前述文本中之描述有多麼詳細，本發明可以多種方式實踐且本發明應根據所附之申請專利範圍及其任何同等物來解釋。
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<223> 合成之構建體
<400> 279
<210> 280
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 280
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 281
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 282
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成之構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成之構建體
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<212> PRT
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<220>
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<220>
<223> 合成之構建體
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<223> 合成之構建體
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 298
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 299
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 300
<210> 301
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
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<220>
<221> 變體
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
<222> (5)..(5)
<223> 其中X為G或S
<400> 302
<210> 303
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
<222> (5)..(5)
<223> 其中X為G或S
<220>
<221> 變體
<222> (8)..(8)
<223> 其中X為A或P
<220>
<221> 變體
<222> (10)..(10)
<223> 其中X為T,N，或S
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 304
<210> 305
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
<222> (2)..(2)
<223> 其中X為I,V,T,H,L,A，或C
<220>
<221> 變體
<222> (3)..(3)
<223> 其中X為S,D,G,T,I,L,F,M，或V
<220>
<221> 變體
<222> (4)..(4)
<223> 其中X為G,Y,L,H,D,A,S，或M
<220>
<221> 變體
<222> (5)..(5)
<223> 其中X為S,Q,T,A,F，或W
<220>
<221> 變體
<222> (7)..(7)
<223> 其中X為G或T
<220>
<221> 變體
<222> (8)..(8)
<223> 其中；X為N,S,P,Y,W，或F
<220>
<221> 變體
<222> (9)..(9)
<223> 其中；X為S,T,I,L,T,A,R,V,K,G，或C
<220>
<221> 變體
<222> (10)..(10)
<223> 其中X為F,Y,P,W,H，或G
<220>
<221> 變體
<222> (14)..(14)
<223> 其中X為V,R，或L
<220>
<221> 變體
<222> (15)..(15)
<223> 其中X為G或T
<400> 305
<210> 306
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(1)
<223> 其中X為S,V,I,D,G,T,L,F，或M
<220>
<221> 變體
<222> (2)..(2)
<223> 其中X為G,Y,L,H,D,A,S，或M
<220>
<221> 變體
<222> (3)..(3)
<223> 其中X為S,G,F，或W
<220>
<221> 變體
<222> (4)..(4)
<223> 其中X為G或S
<220>
<221> 變體
<222> (5)..(5)
<223> 其中X為G或T
<220>
<221> 變體
<222> (6)..(6)
<223> 其中X為N,S,P,Y，或W
<400> 306
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
<222> (5)..(5)
<223> 其中X為A或Y
<220>
<221> 變體
<222> (6)..(6)
<223> 其中X為A或S
<220>
<221> 變體
<222> (7)..(7)
<223> 其中X為G,Q,L,P，或E
<400> 307
<210> 308
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
<222> (5)..(5)
<223> 其中X為D,S,T，或A
<220>
<221> 變體
<222> (6)..(6)
<223> 其中X為I,S,L,P，或D
<400> 308
<210> 309
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(1)
<223> 其中X為R,G,W,A，或C
<220>
<221> 變體
<222> (2)..(2)
<223> 其中X為A,P,G,L,C，或S
<220>
<221> 變體
<222> (3)..(3)
<223> 其中X為S,G，或R
<220>
<221> 變體
<222> (4)..(4)
<223> 其中X為Q,C,E,V，或I
<220>
<221> 變體
<222> (5)..(5)
<223> 其中X為S,P,G,A,R，或D
<220>
<221> 變體
<222> (6)..(6)
<223> 其中X為V,G,I，或L
<220>
<221> 變體
<222> (7)..(7)
<223> 其中X為S,E,D,P，或G
<220>
<221> 變體
<222> (8)..(8)
<223> 其中X為S,P,F,A,M,E,V,N,D，或Y
<220>
<221> 變體
<222> (9)..(9)
<223> 其中X為T,I,V,E,S,F,A,M,Q,Y,H，或R
<220>
<221> 變體
<222> (10)..(10)
<223> 其中X為Y或F
<220>
<221> 變體
<222> (11)..(11)
<223> 其中X為L,W，或P
<220>
<221> 變體
<222> (12)..(12)
<223> 其中X為A,S，或G
<400> 309
<210> 310
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(1)
<223> 其中X為G或D
<220>
<221> 變體
<222> (4)..(4)
<223> 其中X為S或I
<220>
<221> 變體
<222> (7)..(7)
<223> 其中X為T或P
<400> 310
<210> 311
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
<222> (1)..(1)
<223> 其中X為Q或K
<220>
<221> 變體
<222> (2)..(2)
<223> 其中X為H或Y
<220>
<221> 變體
<222> (4)..(4)
<223> 其中X為G,N，或P
<220>
<221> 變體
<222> (5)..(5)
<223> 其中X為S,W，或Y
<400> 311
<210> 312
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
<222> (4)..(4)
<223> 其中X為G,Q,E,L,F,A,S,M,K,R，或Y
<220>
<221> 變體
<222> (5)..(5)
<223> 其中X為S,R,T,G,V,F,Y,D,A,H,V,E,K，或C
<220>
<221> 變體
<222> (6)..(6)
<223> 其中X為W,F，或S
<220>
<221> 變體
<222> (8)..(8)
<223> 其中X為L或I
<400> 312
<210> 313
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
<222> (30)..(30)
<223> 其中X為G或S
<220>
<221> 變體
<222> (33)..(33)
<223> 其中X為A或P
<220>
<221> 變體
<222> (35)..(35)
<223> 其中X為T,N，或S
<220>
<221> 變體
<222> (51)..(51)
<223> 其中X為I,V,T,H,L,A，或C
<220>
<221> 變體
<222> (52)..(52)
<223> 其中X為S,D,G,T,I,L,F,M，或V
<220>
<221> 變體
<222> (53)..(53)
<223> 其中X為G,Y,L,H,D,A,S，或M
<220>
<221> 變體
<222> (54)..(54)
<223> 其中X為S,Q,T,A,F，或W
<220>
<221> 變體
<222> (56)..(56)
<223> 其中X為G或T
<220>
<221> 變體
<222> (57)..(57)
<223> 其中X為N,S,P,Y,W，或F
<220>
<221> 變體
<222> (58)..(58)
<223> 其中X為S,T,I,L,T,A,R,V,K,G，或C
<220>
<221> 變體
<222> (59)..(59)
<223> 其中X為F,Y,P,W,H，或G
<220>
<221> 變體
<222> (63)..(63)
<223> 其中X為V,R，或L
<220>
<221> 變體
<222> (64)..(64)
<223> 其中X為G或T
<220>
<221> 變體
<222> (103)..(103)
<223> 其中X為A或Y
<220>
<221> 變體
<222> (104)..(104)
<223> 其中X為A或S
<220>
<221> 變體
<222> (105)..(105)
<223> 其中X為G,Q,L,P，或E
<400> 313
<210> 314
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
<222> (30)..(30)
<223> 其中X為G或S
<220>
<221> 變體
<222> (33)..(33)
<223> 其中X為A或P
<220>
<221> 變體
<222> (35)..(35)
<223> 其中X為T,N，或S
<220>
<221> 變體
<222> (51)..(51)
<223> 其中X為I,V,T,H,L,A，或C
<220>
<221> 變體
<222> (52)..(52)
<223> 其中X為S,D,G,T,I,L,F,M，或V
<220>
<221> 變體
<222> (53)..(53)
<223> 其中X為G,Y,L,H,D,A,S，或M
<220>
<221> 變體
<222> (54)..(54)
<223> 其中X為S,Q,T,A,F，或W
<220>
<221> 變體
<222> (56)..(56)
<223> 其中X為G或T
<220>
<221> 變體
<222> (57)..(57)
<223> 其中X為N,S,P,Y,W，或F
<220>
<221> 變體
<222> (58)..(58)
<223> 其中X為S,T,I,L,T,A,R,V,K,G，或C
<220>
<221> 變體
<222> (59)..(59)
<223> 其中X為F,Y,P,W,H，或G
<220>
<221> 變體
<222> (63)..(63)
<223> 其中X為V,R，或L
<220>
<221> 變體
<222> (64)..(64)
<223> 其中X13為G或T
<220>
<221> 變體
<222> (103)..(103)
<223> 其中X為D,S,T，或A
<220>
<221> 變體
<222> (104)..(104)
<223> 其中X為I,S,L,P，或D
<400> 314
<210> 315
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
<222> (24)..(24)
<223> 其中X為R,G,W,A，或C
<220>
<221> 變體
<222> (25)..(25)
<223> 其中X為A,P,G,L,C，或S
<220>
<221> 變體
<222> (26)..(26)
<223> 其中X為S,G，或R
<220>
<221> 變體
<222> (27)..(27)
<223> 其中X為Q,C,E,V，或I
<220>
<221> 變體
<222> (28)..(28)
<223> 其中X為S,L,P,G,A,R，或D
<220>
<221> 變體
<222> (29)..(29)
<223> 其中X為V,G,I，或L
<220>
<221> 變體
<222> (30)..(30)
<223> 其中X為S,E,D,P，或G
<220>
<221> 變體
<222> (31)..(31)
<223> 其中X為S,P,F,A,M,E,V,N,D，或Y
<220>
<221> 變體
<222> (32)..(32)
<223> 其中X為I,T,V,E,S,A,M,Q,Y,H,R，或F
<220>
<221> 變體
<222> (33)..(33)
<223> 其中X為Y或F
<220>
<221> 變體
<222> (34)..(34)
<223> 其中X為L,W，或P
<220>
<221> 變體
<222> (35)..(35)
<223> 其中X為A,S，或G
<220>
<221> 變體
<222> (51)..(51)
<223> 其中X為G或D
<220>
<221> 變體
<222> (54)..(54)
<223> 其中X為S或I
<220>
<221> 變體
<222> (57)..(57)
<223> 其中X為T或P
<220>
<221> 變體
<222> (90)..(90)
<223> 其中X為Q或K
<220>
<221> 變體
<222> (91)..(91)
<223> 其中X為H或Y
<220>
<221> 變體
<222> (93)..(93)
<223> 其中X為G,N，或P
<220>
<221> 變體
<222> (94)..(94)
<223> 其中X為S,W，或Y
<400> 315
<210> 316
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> 變體
<222> (24)..(24)
<223> 其中X為R,G,W,A，或C
<220>
<221> 變體
<222> (25)..(25)
<223> 其中X為A,P,G,L,C，或S
<220>
<221> 變體
<222> (26)..(26)
<223> 其中X為S,G，或R
<220>
<221> 變體
<222> (27)..(27)
<223> 其中X為Q,C,E,V，或I
<220>
<221> 變體
<222> (28)..(28)
<223> 其中X為S,L,P,G,A,R，或D
<220>
<221> 變體
<222> (29)..(29)
<223> 其中X為V,G，或I
<220>
<221> 變體
<222> (30)..(30)
<223> 其中X為S,E,D，或P
<220>
<221> 變體
<222> (31)..(31)
<223> 其中X為S,P,F,A,M,E,V,N,D，或Y
<220>
<221> 變體
<222> (32)..(32)
<223> 其中X為I,T,V,E,S,A,M,Q,Y,H，或R
<220>
<221> 變體
<222> (33)..(33)
<223> 其中X為Y或F
<220>
<221> 變體
<222> (34)..(34)
<223> 其中X為L,W，或P
<220>
<221> 變體
<222> (35)..(35)
<223> 其中X為A,S，或G
<220>
<221> 變體
<222> (51)..(51)
<223> 其中X為G或D
<220>
<221> 變體
<222> (54)..(54)
<223> 其中X為S或I
<220>
<221> 變體
<222> (57)..(57)
<223> 其中X為T或P
<220>
<221> 變體
<222> (93)..(93)
<223> 其中X為G,Q,E,L,F,A,S,M,R,K，或Y
<220>
<221> 變體
<222> (94)..(94)
<223> 其中X為S,R,T,G,R,V,D,A,H,E,K,C,F，或Y
<220>
<221> 變體
<222> (95)..(95)
<223> 其中X為W,S，或F
<220>
<221> 變體
<222> (97)..(97)
<223> 其中X為L或I
<400> 316
<210> 317
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 317
<210> 318
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 318
<210> 319
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 319
<210> 320
<211> 45
<212> PRT
<213> 智人
<400> 320
<210> 321
<211> 231
<212> PRT
<213> 智人
<400> 321
<210> 322
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<400> 322
<210> 323
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人
<400> 323
<210> 324
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 324
<210> 325
<211> 52
<212> PRT
<213> 智人
<400> 325
<210> 326
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人
<400> 326
<210> 327
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人
<400> 327
<210> 328
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<400> 328
<210> 329
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 329
<210> 330
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 330
<210> 331
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 331
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<211> 21
<212> PRT
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<400> 332
<210> 333
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 333
<210> 334
<211> 530
<212> PRT
<213> 智人
<400> 334
<210> 335
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 335
<210> 336
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 336
<210> 337
<211> 539
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 337
<210> 338
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 338
<210> 339
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 339
<210> 340
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 340
<210> 341
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 341
<210> 342
<211> 136
<212> PRT
<213> 智人
<400> 342
<210> 343
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 343
<210> 344
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 344
<210> 345
<211> 668
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 345
<210> 346
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 346
<210> 347
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 347
<210> 348
<211> 668
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 348
<210> 349
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 349
<210> 350
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 350
<210> 351
<211> 668
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 351
<210> 352
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 352
<210> 353
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 353
<210> 354
<211> 668
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 354
<210> 355
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 355
<210> 356
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 356
<210> 357
<211> 668
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 357
<210> 358
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 358
<210> 359
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 359
<210> 360
<211> 668
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 360
<210> 361
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 361
<210> 362
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 362
<210> 363
<211> 673
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 363
<210> 364
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 364
<210> 365
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 365
<210> 366
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 366
<210> 367
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<220>
<221> misc_feature
<222> (293)..(293)
<223> n為a,c,g，或t
<400> 367
<210> 368
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 368
<210> 369
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 369
<210> 370
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 370
<210> 371
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 371
<210> 372
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 372
<210> 373
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 373
<210> 374
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 374
<210> 375
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 375
<210> 376
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 376
<210> 377
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 377
<210> 378
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 378
<210> 379
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 379
<210> 380
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 380
<210> 381
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 381
<210> 382
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 382
<210> 383
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 383
<210> 384
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 384
<210> 385
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 385
<210> 386
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 386
<210> 387
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 387
<210> 388
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 388
<210> 389
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 389
<210> 390
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 390
<210> 391
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 391
<210> 392
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 392
<210> 393
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 393
<210> 394
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 394
<210> 395
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 395
<210> 396
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P5AC1-A2 BCMA CAR construct with R2抗原決定部位
<400> 396
<210> 397
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 397
<210> 398
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2抗原決定部位
<400> 398
<210> 399
<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼P5AC1-V2.1之核酸序列
<400> 399
<210> 400
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有信號序列之合成之構建體RQR8
<400> 400
<210> 401
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之構建體
<400> 401

Claims (37)

  1. 一種B細胞成熟抗原(BCMA)特異性嵌合型抗原受體(CAR)，其包含胞外配體結合結構域、第一跨膜結構域及胞內信號傳導結構域，其中該胞外結構域包含單鏈Fv片段(scFv)，該單鏈Fv片段(scFv)包含重鏈可變(VH)區和輕鏈可變(VL)區，該重鏈可變(VH)區包含三個來自包含SEQ ID NO：33、72、39、76、83、92、25、112或8所示之序列的VH區之CDR且該輕鏈可變(VL)區包含三個來自SEQ ID NO：34、73、40、77、84、93、18、38或80所示之VL區的CDR，其中該第一跨膜結構域包含CD8 α鏈跨膜結構域，以及其中該胞內信號傳導結構域包含CD3 ζ信號傳導結構域與/或4-1BB信號傳導結構域。
  2. 如申請專利範圍第1項之BCMA特異性CAR，其中該VH區包含VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，該VH CDR1包含SEQ ID NO：151、156或157所示之胺基酸序列，該VH CDR2包含SEQ ID NO：158或159所示之胺基酸序列且該VH CDR3包含SEQ ID NO：155所示之胺基酸序列；且，該VL區包含VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3，該VL CDR1包含SEQ ID NO：209所示之胺基酸序列，該VL CDR2包含SEQ ID NO：221所示之胺基酸序列且該VL CDR3包含SEQ ID NO：225所示之胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第2項之BCMA特異性CAR，其中該VH區包含SEQ ID NO：112所示之胺基酸序列且該VL區包含SEQ ID NO：38所示之胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項之BCMA特異性CAR，其中各CDR之定義係根據Kabat定義、Chothia定義、Kabat定義和Chothia定義之組合、AbM定義或CDR之接觸定義。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之BCMA特異性CAR，其進一步包含介於該胞外配體結合結構域和該第一跨膜結構域之間的莖結構域。
  6. 如申請專利範圍第5項之BCMA特異性CAR，其中該莖結構域係選自由下列所組成之群組：人CD8 α鉸鏈、IgG1鉸鏈及Fc γ R Ⅲ α鉸鏈。
  7. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之BCMA特異性CAR，其進一步包含CD20抗原決定部位。
  8. 如申請專利範圍第7項之BCMA特異性CAR，其中該CD20抗原決定部位包含SEQ ID NO：397或SEQ ID NO：398所示之胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第8項之BCMA特異性CAR，其中該BCMA特異性CAR包含SEQ ID NO：396所示之胺基酸序列。
  10. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之BCMA特異性CAR，其進一步包含另一非特異於BCMA的胞外配體結合結構域。
  11. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之BCMA特異性CAR，其中該胞外配體結合結構域、第一跨膜結構域及胞內信號傳導結構域係在單一多肽上。
  12. 一種多核苷酸，其包含編碼如申請專利範圍第1至11項中任一項之BCMA特異性CAR的核酸序列。
  13. 如申請專利範圍第12項之多核苷酸，其中該多核苷酸編碼由具有ATCC編號PTA-122834之載體的核酸序列所編碼的BCMA特異性CAR。
  14. 如申請專利範圍第12項之多核苷酸，其中該多核苷酸包含SEQ ID NO：399所示之核酸序列。
  15. 一種表現載體，其包含如申請專利範圍第12至14項中任一項之多核苷酸。
  16. 一種經遺傳工程處理之免疫細胞，其於細胞表面膜表現如申請專利範圍第1至11項中任一項之BCMA特異性CAR。
  17. 如申請專利範圍第16項之經遺傳工程處理之免疫細胞，其進一步包含另一非特異於BCMA之CAR。
  18. 如申請專利範圍第16項之經遺傳工程處理之免疫細胞，其進一步包含編碼自殺性多肽之多核苷酸。
  19. 如申請專利範圍第18項之經遺傳工程處理之免疫細胞，其中該自殺性多肽為RQR8。
  20. 如申請專利範圍第16至19項中任一項之經遺傳工程處理之免疫細胞，其中該免疫細胞係源自炎性T淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞、調節性T淋巴細胞或輔助性T淋巴細胞。
  21. 如申請專利範圍第16至19項中任一項之經遺傳工程處理之免疫細胞，其進一步包含破壞一或多種內源基因，其中該內源基因編碼TCR α、TCR β、CD52、糖皮質激素受體(GR)、脫氧胞苷激酶(dCK)或免疫檢查點蛋白(諸如例如細胞程序性死亡蛋白質-1(PD-1))。
  22. 如申請專利範圍第16至19項中任一項之經遺傳工程處理之免疫細胞，其中該免疫細胞係從健康供體取得。
  23. 如申請專利範圍第16至19項中任一項之經遺傳工程處理之免疫細胞，其中該免疫細胞係從患者取得。
  24. 如申請專利範圍第16至19項中任一項之經遺傳工程處理之免疫細胞，其係作為藥物。
  25. 如申請專利範圍第24項之經遺傳工程處理之免疫細胞，其中該藥物係用於治療選自由下列所組成之群組的B細胞相關癌症：多發性骨髓瘤、惡性漿細胞瘤、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、結節性淋巴細胞為主的何杰金氏淋巴瘤、卡勒氏病(Kahler's disease)和骨髓性白血病(Myelomatosis)、漿細胞白血病、漿細胞瘤(plasmacytoma)、B細胞前淋巴細胞性白血病、髮細胞白血病、B細胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性髓細胞性白血病(CML)、濾泡性淋巴瘤、伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤、髓性白血病、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulienemia)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、黏膜相關之淋巴組織淋巴瘤、小細胞淋巴細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、原發性縱隔(胸腺)大B-細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、結節性邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、T細胞/組織細胞富集之大B細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性皮膚瀰漫性大B細胞淋巴瘤(腿型)、老年EBV陽性瀰漫性大B細胞淋巴瘤、與發炎相關之瀰漫性大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、起源於HHV8相關之多中心性卡斯爾曼(Castleman)病的大B細胞淋巴瘤、介於瀰漫性大B細胞淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤特徵之間不能分類的B細胞淋巴瘤、介於瀰漫性大B細胞淋巴瘤和經典何杰金氏淋巴瘤特徵之間不能分類的B細胞淋巴瘤及其他B細胞相關之淋巴瘤。
  26. 一種以遺傳工程處理免疫細胞的方法，其包含：a.提供免疫細胞；及b.在該細胞之表面表現至少一種如申請專利範圍第1至11項中任一項之BCMA特異性CAR。
  27. 如申請專利範圍第26項之以遺傳工程處理免疫細胞的方法，其包含：a.提供免疫細胞；b.將至少一個編碼該BCMA特異性CAR之多核苷酸引入該細胞；及c.表現被引入該細胞之多核苷酸。
  28. 如申請專利範圍第26項之以遺傳工程處理免疫細胞的方法，其包含：a.提供免疫細胞；b.將至少一個編碼該BCMA特異性CAR之多核苷酸引入該細胞；及c.引入至少一個非特異於BCMA之其他CAR。
  29. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第16至23項中任一項之經遺傳工程處理之免疫細胞。
  30. 一種如申請專利範圍第29項之醫藥組成物於製備用於治療個體的與表現BCMA之惡性細胞相關的病症的藥物之用途。
  31. 如申請專利範圍第30項之用途，其中該病症為癌症。
  32. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該癌症為選自由下列所組成之群組的B細胞相關癌症：多發性骨髓瘤、惡性漿細胞瘤、何杰金氏淋巴瘤、結節性淋巴細胞為主的何杰金氏淋巴瘤、卡勒氏病和骨髓性白血病、漿細胞白血病、漿細胞瘤、B細胞前淋巴細胞性白血病、髮細胞白血病、B細胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性髓細胞性白血病(CML)、濾泡性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤、髓性白血病、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、黏膜相關之淋巴組織淋巴瘤、小細胞淋巴細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、原發性縱隔(胸腺)大B-細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、結節性邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、T細胞/組織細胞富集之大B細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性皮膚瀰漫性大B細胞淋巴瘤(腿型)、老年EBV陽性瀰漫性大B細胞淋巴瘤、與發炎相關之瀰漫性大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、起源於HHV8相關之多中心性卡斯爾曼病的大B細胞淋巴瘤、介於瀰漫性大B細胞淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤特徵之間不能分類的B細胞淋巴瘤、介於瀰漫性大B細胞淋巴瘤和經典何杰金氏淋巴瘤特徵之間不能分類的B細胞淋巴瘤及其他B細胞相關之淋巴瘤。
  33. 一種如申請專利範圍第29項之醫藥組成物於製備用於抑制具有表現BCMA之惡性細胞的個體之腫瘤生長或進展的藥物之用途。
  34. 一種如申請專利範圍第29項之醫藥組成物於製備用於抑制個體的表現BCMA之惡性細胞轉移的藥物之用途。
  35. 一種如申請專利範圍第29項之醫藥組成物於製備用於誘導具有表現BCMA之惡性細胞的個體之腫瘤消退的藥物之用途。
  36. 如申請專利範圍第30至35項中任一項之用途，其中該藥物進一步包含核苷類似物。
  37. 如申請專利範圍第36項之用途，其中該核苷類似物為氟達拉濱(fludarabine)或氯法拉濱(clofarabine)。
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