CN113498353A - 靶定b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体和其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供BCMA CAR和CAR‑T细胞、其制造方法和使用方法。在一些实施例中，提供用于治疗和临床管理有此需要的个体的多发性骨髓瘤的特定的给药方案、重新给药方案和具有淋巴清除的组合方案。

Description

靶定B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体和其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年12月1日申请的美国临时申请第62/774,209号；2019年3月10日申请的美国临时申请第62/816,187号；和2019年11月6日申请的美国临时申请第62/931,487号的优先权，其全部的内容通过全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，且其全部内容以引用方式并入本文。所述创建于2019年11月7日的ASCII拷贝被命名为AT-022-04TW_SL且大小为412,161字节。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma)(MM)为一种恶性肿瘤，其特征在于同源浆细胞(clonal plasma cell)的累积。MM大部分仍然无法治愈，且大多数个体会随着时间发展出抵抗力。
B细胞成熟抗原(BCMA、CD269或TNFRSF17)为肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员且参与促生存(pro-survival)信号传导。BCMA是在含有t(4；16)转位的恶性人类T细胞淋巴瘤中被鉴定出。BCMA高度表达于所有阶段的MM的正常和恶性浆细胞，以及某些其它浆细胞恶性肿瘤(例如DLBCL)中。BCMA还表达在大多数或所有骨髓瘤细胞中，而不表达在非B细胞谱系中。
过继性转移经遗传工程修饰的T细胞以识别与恶性肿瘤相关的抗原显示出有望作为治疗癌症的新方法。T细胞可经遗传工程修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体为由抗原识别部分和T细胞活化结构域所组成的融合蛋白。
对于可有效治疗MM(包括复发性(relapsed)/难治性(refractory)MM)的干预措施的医学需求仍未被满足。本文提供能解决所述需求的方法和组合物。
发明内容
本文提供与BCMA结合的嵌合抗原受体(CAR)；以及用于治疗多发性骨髓瘤(MM)(包括复发性和/或难治性MM)的给药范式。
更具体地，在一方面中，本文提供治疗个体的MM的方法，所述方法包含对所述个体施用至少一个剂量的包含抗人BCMA CAR的同种异体嵌合抗原受体(CAR)-T细胞(BCMA CAR-T细胞)，其中所述至少一个剂量为约7×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量。
在一些实施例中，所述个体的体重≥50kg，且所述方法包含施用至少一个剂量的BCMA CAR-T细胞，其中所述剂量是在约20×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量的范围内。在一些实施例中，所述至少一个剂量为约20×10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量、约120×10^6个细胞/剂量、约360×10^6个细胞/剂量、或约480×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述至少一个剂量为约20×10^6个细胞/剂量至约40×10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量至约120×10^6个细胞/剂量、约120×10^6个细胞/剂量至约360×10^6个细胞/剂量、或约360×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量。
在一些实施例中，所述个体的体重>50kg，且所述方法包含施用至少一个剂量的BCMA CAR-T细胞，其中所述剂量是在约20×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量的范围内。在一些实施例中，所述至少一个剂量为约20×10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量、约240×10^6个细胞/剂量、约320×10^6个细胞/剂量、或约480×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述至少一个剂量为约20×10^6个细胞/剂量至约40×10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量至约160×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量至约240×10^6个细胞/剂量、约240×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量、或约320×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量。
在一些实施例中，所述个体的体重<50kg，且所述方法包含施用至少一个剂量的BCMA CAR-T细胞，其中所述剂量是在约7×10^6个细胞/剂量至约360×10^6个细胞/剂量的范围内。在一些实施例中，所述至少一个剂量为约7×10^6个细胞/剂量、约14×10^6个细胞/剂量、约20×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量、约240×10^6个细胞/剂量、或约360×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述至少一个剂量为约7×10^6或14×10^6个细胞/剂量至约20×10^6个细胞/剂量、约20×10^6个细胞/剂量至约80×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量至约240×10^6个细胞/剂量、或约240×10^6个细胞/剂量至约360×10^6个细胞/剂量。
在一些实施例中，所述个体的体重≤50kg，且所述方法包含施用至少一个剂量的BCMA CAR-T细胞，其中所述剂量是在约14×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量的范围内。在一些实施例中，所述至少一个剂量为约14×10^6个细胞/剂量、约20×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量、约200×10^6个细胞/剂量、或约320×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述至少一个剂量为约14×10^6个细胞/剂量至约20×10^6个细胞/剂量、约20×10^6个细胞/剂量至约80×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量至约200×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量至约160×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量至约200×10^6个细胞/剂量、或约200×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量。
在一些实施例中，所述个体尚未接受任何针对多发性骨髓瘤的先前疗法。在一些实施例中，所述个体已接受至少一种、二种或三种用于多发性骨髓瘤的先前疗法。在一些实施例中，所述给药方案为第一线疗法。在一些实施例中，所述给药方案为第二线疗法。在一些实施例中，所述给药方案为第三线疗法。在一些实施例中，所述给药方案为第四线疗法。
在一些实施例中，所述个体已接受先前的化疗方案；先前的基于生物制剂的方案和/或先前的基于自体细胞疗法的方案(例如干细胞疗法)。
在一些实施例中，所述个体患有复发性MM。在一些实施例中，所述个体患有难治性MM。在一些实施例中，所述个体患有难治性MM和复发性MM。
在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含胞外结合结构域，所述胞外结合结构域包含单链Fv片段(scFv)，其中所述scFv包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中所述VH区包含VH互补决定区1(VH CDR1)、VH互补决定区2(VH CDR2)和VH互补决定区3(VH CDR3)且所述VL区包含VL互补决定区1(VL CDR1)、VL互补决定区2(VL CDR2)和VL互补决定区3(VL CDR3)，其中：(a)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：150、151或152的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQ ID NO：153或154的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列；所述VL CDR1包含SEQ ID NO：209的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQID NO：221的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：222的氨基酸序列；(b)所述VHCDR1包含SEQ ID NO：150、151或152的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQ ID NO：187或188的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列；所述VL CDR1包含SEQ IDNO：249的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：221的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：225的氨基酸序列；(c)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：150、151或152的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQ ID NO：165或166的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列；所述VL CDR1包含SEQ ID NO：226的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ IDNO：221的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：227的氨基酸序列；(d)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：151、156或157的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQ ID NO：159或162的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：161的氨基酸序列；所述VL CDR1包含SEQ ID NO：251的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：252的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQID NO：253的氨基酸序列；(e)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：151、156或157的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQ ID NO：190或191的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：161的氨基酸序列；所述VL CDR1包含SEQ ID NO：262的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：252的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：263的氨基酸序列；(f)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：150、151或152的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQ ID NO：154或169的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列；所述VL CDR1包含SEQ ID NO：271的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：221的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ IDNO：272的氨基酸序列；(g)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：129、130或131的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQ ID NO：139或140的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列；所述VL CDR1包含SEQ ID NO：217的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：210的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列；(h)所述VH CDR1包含SEQID NO：151、156或157的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQ ID NO：158或159的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列；所述VL CDR1包含SEQ ID NO：209的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：221的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：225的氨基酸序列；或(i)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：129、130或131的氨基酸序列；所述VHCDR2包含SEQ ID NO：132或133的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列；所述VL CDR1包含SEQ ID NO：377的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：210的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：214的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述BCMA CAR的scFv的VH区包含：VH CDR1，其包含SEQ ID NO：150、151、或152的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ ID NO：153或154的氨基酸序列；和VHCDR3，其包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列；且所述scFv的VL区包含：VL CDR1，其包含SEQID NO：209的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ ID NO：221的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含SEQ ID NO：222的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述BCMA CAR的scFv的VH区包含：VH CDR1，其包含SEQ ID NO：151、156或157的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ ID NO：158或159的氨基酸序列；和VHCDR3，其包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列；且所述scFv的VL区包含：VL CDR1，其包含SEQID NO：209的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ ID NO：221的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含SEQ ID NO：225的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含SEQ ID NO：344所示的氨基酸序列。在一些所述实施例中，所述CAR进一步包含CD20表位。在一些所述实施例中，所述CD20表位包含SEQ ID NO：397或SEQ ID NO：398所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含：CD8α信号肽，其具有SEQ ID NO：318的序列；VH区，其具有SEQ ID NO：112的序列；GS接头，其具有SEQ ID NO：333的序列；VL区，其具有SEQ ID NO：38的序列；CD8α铰链，其具有SEQ ID NO：320的序列；CD8α跨膜结构域，其具有SEQ ID NO：322的序列；4-1BB胞内信号传导结构域，其具有SEQ IDNO：323的序列；和CD3ζ胞内信号传导结构域，其具有SEQ ID NO：324的序列。
在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含：CD8α信号肽，其具有SEQ ID NO：318的序列；VH区，其具有SEQ ID NO：112的序列；GS接头，其具有SEQ ID NO：333的序列；VL区，其具有SEQ ID NO：38的序列；CD20表位，其具有SEQ ID NO：398的序列；CD8α铰链，其具有SEQ ID NO：320的序列；CD8α跨膜结构域，其具有SEQ ID NO：322的序列；4-1BB胞内信号传导结构域，其具有SEQ ID NO：323的序列；和CD3ζ胞内信号传导结构域，其具有SEQ ID NO：324的序列。
在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含：CD8α信号肽，其具有SEQ ID NO：318的序列；VH区，其具有SEQ ID NO：33的序列；GS接头，其具有SEQ ID NO：333的序列；VL区，其具有SEQ ID NO：34的序列；CD8α铰链，其具有SEQ ID NO：320的序列；CD8α跨膜结构域，其具有SEQ ID NO：322的序列；4-1BB胞内信号传导结构域，其具有SEQ IDNO：323的序列；和CD3ζ胞内信号传导结构域，其具有SEQ ID NO：324的序列。
在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含：CD8α信号肽，其具有SEQ ID NO：318的序列；VH区，其具有SEQ ID NO：33的序列；GS接头，其具有SEQ ID NO：333的序列；VL区，其具有SEQ ID NO：34的序列；CD20表位，其具有SEQ ID NO：398的序列；CD8α铰链，其具有SEQ ID NO：320的序列；CD8α跨膜结构域，其具有SEQ ID NO：322的序列；4-1BB胞内信号传导结构域，其具有SEQ ID NO：323的序列；和CD3ζ胞内信号传导结构域，其具有SEQ ID NO：324的序列。
在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含胞外结合结构域，所述胞外结合结构域包含单链Fv片段(scFv)，其中所述scFv包含VH区和VL区，其中所述VH和VL区的组合选自表1中所呈现的组合。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含胞外配体结合结构域、第一跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述胞外结构域包含scFv，所述scFv包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区包含表1中SEQ ID NO：33、72、39、76、83、92、25、112或8所示的序列；所述轻链可变(VL)区包含表1中SEQ ID NO：34、73、40、77、84、93、18、38或80所示的序列，其中所述第一跨膜结构域包含CD8α链跨膜结构域且其中所述胞内信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域和/或4-1BB信号传导结构域。在一些实施例中，所述VH包含SEQID NO：33且所述VL包含SEQ ID NO：34。在一些实施例中，所述VH包含SEQ ID NO：112且所述VL包含SEQ ID NO：38。
在一些实施例中，所述CAR-T细胞缺乏CD52。在一些实施例中，所述CAR-T细胞缺乏TCRα和/或TCRβ。在一些实施例中，所述CAR-T细胞不表达安全开关。在一些实施例中，所述细胞的基因型为TCRαβ-和CD52+/-。
在一些实施例中，所述个体在施用所述至少一个剂量之前接受第一淋巴清除(lymphodepletion)方案。在一些实施例中，所述第一淋巴清除方案包含施用氟达拉滨(fludarabine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)。在一些实施例中，所述第一淋巴清除方案包含施用氟达拉滨、环磷酰胺和抗CD52抗体。在一些实施例中，所述第一淋巴清除方案包含施用抗CD52抗体。在一些实施例中，所述第一淋巴清除方案包含仅施用抗CD52抗体。在一些实施例中，氟达拉滨的施用剂量为约30mg/m2/天；环磷酰胺的施用剂量为约300mg/m2/天；且CD52抗体的施用剂量为约10至约13mg/天、约13至20mg/天、约13至30mg/天、或约20至30mg/天。在一些实施例中，所述第一淋巴清除方案是在施用所述至少一个剂量之前约1至15天之间开始。在一些实施例中，所述第一淋巴清除方案是在1、2、3、4或5天的过程中施用。在一些实施例中，在3天的过程中，所述第一淋巴清除方案是在施用所述至少一个剂量之前5天施用。在一些实施例中，在3天的过程中，所述第一淋巴清除方案是在施用所述至少一个剂量之前7天施用。
在一些实施例中，所述个体接受所述CAR-T细胞之后续剂量。
在另一方面中，本文提供包含BCMA CAR-T细胞的配制剂。在一实施例中，所述配制剂包含溶液，所述溶液含有约5％二甲亚砜(DMSO)和14×10^6个细胞/mL。在另一实施例中，所述细胞是配制在
Figure BDA0003095371290000061
Basal Solution和
Figure BDA0003095371290000062
CS10的1:1混合物(其导致二甲亚砜的最终浓度为5％)中，其中所述配制剂的剂量强度为14×10^6个细胞/mL，其中所述细胞的基因型为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-，且其中所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含胞外配体结合结构域、二个利妥昔单抗结合结构域、第一跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述胞外结构域包含scFv，所述scFv包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区包含表1的SEQ ID NO：33、72、39、76、83、92、25、112或8所示的序列；所述轻链可变(VL)区包含表1的SEQ ID NO：34、73、40、77、84、93、18、38或80所示的序列，其中所述第一跨膜结构域包含CD8α链跨膜结构域且其中所述胞内信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域和/或4-1BB信号传导结构域。
附图说明
图1显示本公开的含BCMA的CAR-T细胞。所述CAR具有通过利妥昔单抗和抗BCMAscFv活化的功能性开关。所述经修饰的T细胞进一步具有降低的CD52表达(以将排斥最小化)和T细胞受体基因(TCRα和/或TCRβ)表达(以避免GvHD，移植物抗宿主疾病)。
图2显示所述由利妥昔单抗介导的开关使得本公开的含BCMA的CAR-T细胞能够被检测和消耗(使用利妥昔单抗)。
图3显示本公开的含BCMA scFV的CAR-T细胞(BCMA-1)，其内源性CD52基因被敲落(knock down)/剔除(knock out)而对CD52抗体治疗具有抗性。
图4显示靶细胞中的BCMA的表达。
图5显示本公开的含BCMA scFV的CAR-T细胞(BCMA-1)，其显示靶的依赖性扩增且在反复刺激之后保持酶活性。
图6显示本公开的含BCMA scFV的CAR-T细胞(BCMA-1)，其显示特异的细胞毒性活性。所述非基因编辑的BCMA-1是指不包含敲落/剔除的CD52和/或TCRα和/或TCRβ的CAR-T细胞。
图7显示本公开的含BCMA scFV的CAR-T细胞(BCMA-1)具有不会被可溶性BCMA抑制的剂量依赖性细胞毒性活性。
图8-11A和11B本公开的含BCMA scFV的CAR-T细胞(BCMA-1)在原位肿瘤模型中显示具抗肿瘤效力并可使用利妥昔单抗耗尽。图8显示本公开的含BCMA scFV的CAR-T细胞(BCMA-1)在MM.1S模型中的活性。图9显示本公开的含BCMA scFV的CAR-T细胞(BCMA-1)在第二个剂量后的肿瘤根除效果。图10显示本公开的含BCMA scFV的CAR-T细胞(BCMA-1)辅以IL-7/IL-15在小鼠中的抗肿瘤效果。使用MOLP-8动物模型。对NSG小鼠(N＝10)施用5×106个MM.1S细胞或2×106MOLP-8个细胞。细胞因子是通过AAV介导的基因递送提供。结果以平均值±SEM显示。图11A-11B显示利妥昔单抗在模型中耗尽本公开的含BCMA scFV的CAR-T细胞(BCMA-1)(图11B)，并废除抗肿瘤活性(图11A)。
图12-15描绘本公开的BCMA CAR-T细胞-具体来说，本公开的含BCMA scFV的CAR-T细胞(BCMA-1)可在保存抗肿瘤活性的GMP样条件下制造。图12显示用于本公开的BCMA CAR-T细胞的示例性同种异体CAR-T制造过程。图13显示本公开的含BCMA scFV的CAR-T细胞(BCMA-1)的高存活力和扩增。图14显示TCRαβ阴性细胞的有效富集。MACS：经磁性活化的细胞分选系统(Miltenyi Biotec)。图15显示不同剂量的本公开的含BCMA scFV的CAR-T细胞(BCMA-1)在MM.1S原位肿瘤模型中的高抗肿瘤效果。
图16显示BCMA-1 scFv在组织交叉反应性研究中未显示脱靶结合，这表明在临床环境中脱靶结合的风险低或不存在。
图17描述自体CAR-T疗法的局限性。
图18描述同种异体CAR-T疗法的优点。
图19显示第1期(设计A或B)研究的图解。
图20显示第1期，设计B研究的图解。
图21显示本公开的示例性载体组件/构建体的示意图。
具体实施方式
本公开提供嵌合抗原受体(CAR)和包含与BCMA特异性结合的CAR的免疫细胞(例如T细胞)(CAR-T细胞)，以及用于治疗MM(包括难治性/复发性MM)的给药方案。本公开还提供编码这些CAR的多核苷酸、包含这些CAR-T细胞的组合物，以及制造和使用这些CAR和CAR-T细胞的方法。
本公开提供与BCMA(例如人BCMA，Uniprot登录编号：Q02223-2)结合的CAR。本文提供的BCMA特异性CAR包括单链CAR和多链CAR。所述CAR有能力利用单克隆抗体的抗原结合特性，以非MHC限制性方式，将T细胞特异性和反应性重新对准BCMA。所述非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的T细胞不倚赖抗原加工而能识别抗原的能力，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。
I.BCMA特定CAR
在一些实施例中，本文提供的CAR包含胞外配体结合结构域(例如单链可变片段(scFv))、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在一些实施例中，所述胞外配体结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域是在一个多肽中，即，在单链中。本文还提供多链CAR和多肽。在一些实施例中，所述多链CAR包含：第一多肽(其包含跨膜结构域和至少一个胞外配体结合结构域)和第二多肽(其包含跨膜结构域和至少一个胞内信号传导结构域)，其中所述多肽组装在一起以形成多链CAR。
在一些实施例中，BCMA特异性多链CAR是基于IgE的高亲和力受体(FcεRI)。表达在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的FcεRI触发过敏反应。FcεRI为四聚体复合物，其是由单一α亚单位、单一β亚单位和二个通过二硫键连接的γ亚单位所组成。所述α亚单位含有IgE结合结构域。所述β和γ亚单位含有介导信号转导的ITAM。在一些实施例中，所述FcRα链的胞外结构域缺失并被BCMA特异性胞外配体结合结构域替代。在一些实施例中，所述多链BCMA特异性CAR包含与BCMA、CD8α铰链和FcMAβ链的ITAM特异性结合的scFv。在一些实施例中，所述CAR可包含或可不包含FcRγ链。在一些实施例中，存在二份利妥昔单抗模拟表位的拷贝(例如CPYSNPSLC(SEQ ID NO：397)；还参见WO 2016/120216，其全部内容以引用方式并入本文)。示例性构建体显示于第21图中。
如本文所提供者，所述BCMA CAR的胞外配体结合结构域包含scFv，所述scFv包含靶的抗原特异性单克隆抗体的轻链可变(VL)区和重链可变(VH)区，所述轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)是通过弹性接头连接。单链可变区片段是通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区来制造(Bird等人,Science 242:423-426,1988)。连接肽的一种实例为具有氨基酸序列(GGGGS)3(SEQ ID NO：333)的GS接头，其桥接介于一个可变区的羧基端和另一可变区的氨基端之间约3.5nm。现已设计和使用具有其它序列的接头(Bird等人，1988，同上)。在一般情况下，接头可以是短的、有弹性的多肽且优选为由约20个或更少的氨基酸残基所组成。接头可再经修饰以实现其它功能，例如连接药物或连接固体支持物。所述单链变体可经重组或合成产生。为了合成产生scFv，可使用自动合成仪。为了重组产生scFv，可将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入合适的宿主细胞中，所述宿主细胞或为真核的(例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞)，或为原核的(例如大肠杆菌)。编码所述所欲scFv的多核苷酸可通过常规操作，例如连结多核苷酸来制造。所得的scFv可使用所属领域已知的标准蛋白质纯化技术分离。
在一些实施例中，本文提供BCMA CAR，其中所述CAR包含胞外结合结构域，所述胞外结合结构域包含单链Fv片段(scFv)，其中所述scFv包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中所述VH区包含VH互补决定区1(VH CDR1)、VH互补决定区2(VH CDR2)和VH互补决定区3(VH CDR3)且所述VL区包含VL互补决定区1(VL CDR1)、VL互补决定区2(VL CDR2)和VL互补决定区3(VL CDR3)，其中：(a)所述VH CDR1包含选自由下列所组成的群组的序列：SEQ IDNO：129、130、131、150、151、152、156、157、301、302、303、381、382、386、387和388；(b)所述VHCDR2包含选自由下列所组成的群组的序列：SEQ ID NO：132、133、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、153、154、158、159、160、162、163、165、166、167、168、169、171、172、174、175、176、177、178、179、180、181、183、184、185、186、187、188、190、191、192、193、194、195、196、198、199、200、201、202、203、204、206、207、208、304、305、306、383、384、389和390；(c)所述VH CDR3包含选自由下列所组成的群组的序列：SEQ ID NO：134、135、136、137、148、149、155、161、164、170、173、182、189、197、205、307、308、385和391；(d)所述VL CDR1包含选自由下列所组成的群组的序列：SEQ ID NO：209、212、215、217、218、219、223、226、228、230、232、235、238、239、241、243、245、246、247、249、250、251、254、257、260、262、265、266、267、269、270、271、273、275、277、279、283、285、287、290、292、295、297、299、309、377、415和417；(e)所述VL CDR2包含选自由下列所组成的群组的序列：SEQ ID NO：210、221、252、310、392和395；和(f)所述VL CDR3包含选自由下列所组成的群组的序列：SEQ ID NOS：211、213、214、216、220、222、224、225、227、229、231、233、234、236、237、240、242、244、248、253、255、256、258、259、261、263、264、268、272、274、276、278、280、281、282、284、286、288、289、291、293、294、296、298、300、311、312、393和416。
在一些实施例中，本文提供BCMACAR，其中所述CAR包含胞外配体结合结构域，所述胞外配体结合结构域包含：VH区，所述VH区包含具有下列所示的VH序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3：SEQ ID NO：2、3、7、8、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、37、39、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、83、87、92、95、97、99、101、104、106、110、112、114、76、118、120、122、125、127、313、314或413；和/或VL区，所述VL区包含具有下列所示的VL序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3：SEQ ID NO：1、4、5、6、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、34、36、38、40、41、43、45、47、49、51、53、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、317、81、82、84、85、86、88、89、90、91、93、94、96、98、100、102、103、105、107、108、109、111、113、115、116、117、119、121、123、124、126、128、315、316或414。在一些实施例中，所述VH和VL是通过弹性接头连接在一起。在一些实施例中，所述弹性接头包含SEQ ID NO：333所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开的CAR包含胞外配体结合结构域，所述胞外配体结合结构域具有如表1中所列的任一部分轻链序列和/或表1中所列的任一部分重链序列。表1中，所述下方划线的序列是根据Kabat的CDR序列，所述粗体的序列是根据Chothia的序列，但下列重链CDR2序列除外(其中所述Chothia CDR序列下方划线，而所述Kabat CDR序列为粗体)：P5A2_VHVL、A02_Rd4_0.6nM_C06、A02_Rd4_0.6nM_C09、A02_Rd4_6nM_C16、A02_Rd4_6nM_C03、A02_Rd4_6nM_C01、A02_Rd4_6nM_C26、A02_Rd4_6nM_C25、A02_Rd4_6nM_C22、A02_Rd4_6nM_C19、A02_Rd4_0.6nM_C03、A02_Rd4_6nM_C07、A02_Rd4_6nM_C23、A02_Rd4_0.6nM_C18、A02_Rd4_6nM_C10、A02_Rd4_6nM_C05、A02_Rd4_0.6nM_C10、A02_Rd4_6nM_C04、A02_Rd4_0.6nM_C26、A02_Rd4_0.6nM_C13、A02_Rd4_0.6nM_C01、A02_Rd4_6nM_C08、P5C1_VHVL、C01_Rd4_6nM_C24、C01_Rd4_6nM_C26、C01_Rd4_6nM_C10、C01_Rd4_0.6nM_C27、C01_Rd4_6nM_C20、C01_Rd4_6nM_C12、C01_Rd4_0.6nM_C16、C01_Rd4_0.6nM_C09、C01_Rd4_6nM_C09、C01_Rd4_0.6nM_C03、C01_Rd4_0.6nM_C06、C01_Rd4_6nM_C04、COMBO_Rd4_0.6nM_C22、COMBO_Rd4_6nM_C21、COMBO_Rd4_6nM_C10、COMBO_Rd4_0.6nM_C04、COMBO_Rd4_6nM_C25、COMBO_Rd4_0.6nM_C21、COMBO_Rd4_6nM_C11、COMBO_Rd4_0.6nM_C20、COMBO_Rd4_6nM_C09、COMBO_Rd4_6nM_C08、COMBO_Rd4_0.6nM_C19、COMBO_Rd4_0.6nM_C02、COMBO_Rd4_0.6nM_C23、COMBO_Rd4_0.6nM_C29、COMBO_Rd4_0.6nM_C09、COMBO_Rd4_6nM_C12、COMBO_Rd4_0.6nM_C30、COMBO_Rd4_0.6nM_C14、COMBO_Rd4_6nM_C07、COMBO_Rd4_6nM_C02、COMBO_Rd4_0.6nM_C05、COMBO_Rd4_0.6nM_C17、COMBO_Rd4_6nM_C22、和COMBO_Rd4_0.6nM_C11。
表1
Figure BDA0003095371290000111
Figure BDA0003095371290000121
Figure BDA0003095371290000131
Figure BDA0003095371290000141
Figure BDA0003095371290000151
Figure BDA0003095371290000161
Figure BDA0003095371290000171
Figure BDA0003095371290000181
Figure BDA0003095371290000191
Figure BDA0003095371290000201
Figure BDA0003095371290000211
Figure BDA0003095371290000221
Figure BDA0003095371290000231
Figure BDA0003095371290000241
Figure BDA0003095371290000251
Figure BDA0003095371290000261
Figure BDA0003095371290000271
Figure BDA0003095371290000281
Figure BDA0003095371290000291
Figure BDA0003095371290000301
Figure BDA0003095371290000311
Figure BDA0003095371290000321
Figure BDA0003095371290000331
本文还提供与BCMA结合的CAR的胞外配体结合结构域的CDR部分(包括Chothia、Kabat CDR和CDR接触区)。CDR区的测定完全在所属领域的技术范围内。应理解的是，在一些实施例中，CDR可以是Kabat和Chothia CDR的组合(也称为“组合的CR”或“延伸的CDR”)。在一些实施例中，所述CDR为Kabat CDR。在其它实施例中，所述CDR为Chothia CDR。换句话说，在具有一个以上的CDR的实施例中，所述CDR可以是Kabat、Chothia、组合CDR或彼的组合的其中任一个。表2A和表2B提供本文所提供的CDR序列的实例。
表2A
Figure BDA0003095371290000332
Figure BDA0003095371290000341
Figure BDA0003095371290000351
Figure BDA0003095371290000361
Figure BDA0003095371290000371
Figure BDA0003095371290000381
Figure BDA0003095371290000391
Figure BDA0003095371290000401
Figure BDA0003095371290000411
Figure BDA0003095371290000421
Figure BDA0003095371290000431
表2B
Figure BDA0003095371290000441
Figure BDA0003095371290000451
Figure BDA0003095371290000461
Figure BDA0003095371290000471
Figure BDA0003095371290000481
Figure BDA0003095371290000491
Figure BDA0003095371290000501
Figure BDA0003095371290000511
在一些实施例中，所述BCMA CAR包含胞外配体结合结构域、第一跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述胞外结构域包含单链Fv片段(scFv)，所述scFv包含重链可变(VH)区和轻链可变区(VL)，所述VH区包含三个互补决定区(CDR)，所述CDR包含表1的SEQ IDNO：33、72、39、76、83、92、25、112或8所示的序列；所述VL区包含三个CDR，所述CDR包含表1的SEQ ID NO：34、73、40、77、84、93、18、38或80所示的序列，其中所述第一跨膜结构域包含CD8α链跨膜结构域，且其中所述胞内信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域和/或4-1BB信号传导结构域。
在一些实施例中，所述BCMA CAR的胞外结合区包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQID NO：112所示的氨基酸序列，而所述VL区包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述BCMA CAR的胞外结合区包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQID NO：33所示的氨基酸序列，而所述VL区包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述BCMA CAR的胞外结合区包含VH区和VL区，所述VH区包含：VHCDR1，其包含SEQ ID NO：150、151或152所示的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ ID NO：153或154所示的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列；所述VL区包含：VL CDR1，其包含SEQ ID NO：209所示的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ ID NO：221所示的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含SEQ ID NO：222所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述BCMA CAR的胞外结合区包含VH区和VL区，所述VH区包含：VHCDR1，其包含SEQ ID NO：151、156或157所示的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ ID NO：158或159所示的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列；所述VL区包含：VL CDR1，其包含SEQ ID NO：209所示的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ ID NO：221所示的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含SEQ ID NO：225所示的氨基酸序列。
如本文所描述的BCMA特异性CAR与BCMA(例如人BCMA(例如SEQ ID NO：354)结合的结合亲和力(KD)可以是约0.002至约6500nM。在一些实施例中，所述结合亲和力约为下列任一个：6500nm、6000nm、5986nm、5567nm、5500nm、4500nm、4000nm、3500nm、3000nm、2500nm、2134nm、2000nm、1500nm、1000nm、750nm、500nm、400nm、300nm、250nm、200nM、193nM、100nM、90nM、50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、19nm、18nm、17nm、16nm、15nM、10nM、8nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5.5nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.3nM、0.1nM、0.01nM或0.002nM。在一些实施例中，所述结合亲和力约小于下列任一个：6500nm、6000nm、5500nm、5000nm、4000nm、3000nm、2000nm、1000nm、900nm、800nm、250nM、200nM、100nM、50nM、30nM、20nM、10nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM、3nM、2.5nM、2nM、1.5nM、1nM或0.5nM。
根据本公开的CAR的胞内信号传导结构域是负责在胞外配体结合结构域与靶的结合后的胞内信号传导，从而导致免疫细胞活化和免疫反应。胞内信号传导结构域有能力活化其中表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助细胞活性，包括分泌细胞因子。
在一些实施例中，用于CAR的胞内信号传导结构域可以是(例如，但不限于)所述T细胞受体和共受体(其与T细胞受体协同作用以在抗原受体接合后起始信号转导)的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。胞内信号传导结构域包括二种不同类别的细胞质信号传导序列：启动抗原依赖性初级活化的序列和那些以无关抗原的方式作用以提供第二信号或共刺激信号的序列。主要细胞质信号传导序列可包含信号传导基序，所述基序被称为免疫受体酪氨酸活化基序ITAM。ITAM为明确定义的信号传导基序，其是在各种受体的细胞质内尾端找到，作为syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。用于本公开的ITAM的实例可包括从下列群组衍生的非限制性实例：TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在一些实施例中，所述CAR的胞内信号传导结构域可包含CD3ζ信号传导结构域，所述CD3ζ信号传导结构域具有与SEQ.ID NO：324所示的氨基酸序列具有至少约70％，优选为至少80％，更优选为至少90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激分子的结构域。
在一些实施例中，本公开的CAR的胞内信号传导结构域包含选自由下列所组成的群组的共刺激分子的一部分：41BB(GenBank：AAA53133)和CD28(NP_006130.1)的片段。在一些实施例中，本公开的CAR的胞内信号传导结构域包含与SEQ.ID NO：323和SEQ.ID NO：327所示的氨基酸序列具有至少70％，优选为至少80％，更优选为至少90％、95％、97％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
CAR是表达在细胞的表面膜上。因此，CAR可包含跨膜结构域。本文公开的CAR的合适跨膜结构域具有以下能力：(a)表达在细胞表面，所述细胞优选为免疫细胞，例如，但不限于淋巴细胞或天然杀手(NK)细胞，和(b)与配体结合结构域和胞内信号传导结构域交互作用，以指导免疫细胞的细胞反应针对预定的靶的细胞。所述跨膜结构域可源自天然或合成来源。所述跨膜结构域可源自任何与膜结合的蛋白质或跨膜蛋白。作为非限制性实例的跨膜多肽可以是T细胞受体的亚单位(例如α、β、γ或δ)、构成CD3复合物的多肽、IL-2受体p55(α链)、p75(β链)或γ链、Fc受体的亚单位链，特别是Fcγ受体III或CD蛋白。或者，所述跨膜结构域可以是合成的且可主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，所述跨膜结构域是源自人CD8α链(例如NP_001139345.1)。所述跨膜结构域可进一步在胞外配体结合结构域和所述跨膜结构域之间包含茎结构域。一个茎结构域可包含至多300个氨基酸，优选为10至100个氨基酸且最优选为25至50个氨基酸。茎区可源自全部或部分的天然产生的分子，例如全部或部分的CD8、CD4或CD28的胞外区，或源自全部或部分的抗体恒定区。或者，所述茎结构域可以是对应于天然产生的茎序列的合成序列，或可全部为合成的茎序列。在一些实施例中，所述茎结构域为人CD8α链的一部分(例如NP_001139345.1)。在另一特定的实施例中，所述跨膜和铰链结构域包含一部分人CD8α链，优选地，其包含与选自由SEQID NO：318所组成的群组的氨基酸序列具有至少70％，优选为至少80％，更优选为至少90％、95％、97％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所公开的CAR可包含与BCMA特异结合的胞外配体结合结构域、CD8α人铰链和跨膜结构域、CD3ζ信号传导结构域，以及4-1BB信号传导结构域。
表3提供可用于本文所公开的CAR中的示例性结构域序列。
表3：CAR组成分的示例性序列
Figure BDA0003095371290000541
Figure BDA0003095371290000551
在另一方面中，本公开提供编码本文所描述的任何CAR和多肽的多核苷酸。多核苷酸可通过所属领域已知的程序制造和表达。
在另一方面中，本公开提供包含本公开的任何细胞的组合物(例如药物组合物)。
Ⅱ.经工程处理的免疫细胞
本公开提供经工程处理的免疫细胞，其包含本文所描述的任何BCMA CAR多核苷酸。在一些实施例中，所述BCMA CAR与慢病毒载体引入免疫细胞中。在一些实施例中，所述慢病毒载体为整合入受体免疫细胞中的自行去活化的慢病毒载体。在一些实施例中，所述BCMA CAR以转基因的形式通过质粒载体引入免疫细胞中。在一些实施例中，所述质粒载体还可以含有，例如用于鉴定和/或选择接受所述载体的细胞的选择标记。在一些实施例中，所述CAR可使用非病毒方法引入免疫细胞中。
第21图中显示一种示例性载体构建体。
WO/2016/166630(其全部内容以引用方式并入本文)中描述产生表达本文所提供的任何BCMA CAR的经工程处理的免疫细胞的方法。
本文提供根据上述任一方法取得的经分离的免疫细胞。能够表达异源DNA的任何免疫细胞均可用于表达所欲的CAR的目的中。在一些实施例中，所述免疫细胞为T细胞。在一些实施例中，免疫细胞可源自，例如，但不限于干细胞。所述干细胞可以是成年干细胞、非人类胚胎干细胞，更特别地，非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导性多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。代表性的人类细胞为CD34+细胞。所述经分离的细胞还可以是树突状细胞、杀手树突状细胞、肥大细胞、NK细胞、B细胞或T细胞，所述T细胞选自由下列所组成的群组：发炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞。在一些实施例中，所述细胞可源自由下列所组成的群组：CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。
在一些实施例中，根据本发明的经分离的细胞包含一个选自由下列所组成的群组的去活化的基因：CD52、GR、PD-1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、HLA、TCRα和TCRβ和/或表达CAR、多链CAR和/或pTα转基因。在一些实施例中，所述经分离的细胞包含编码包含多链CAR的多肽的多核苷酸。在一些实施例中，根据本公开的经分离的细胞包含二个选自由下列所组成的群组的去活化的基因：CD52和GR、CD52和TCRα、CDR52和TCRβ、GR和TCRα、GR和TCRβ、TCRα和TCRβ、PD-1和TCRα、PD-1和TCRβ、CTLA-4和TCRα、CTLA-4和TCRβ、LAG3和TCRα、LAG3和TCRβ、Tim3和TCRα、Tim3和TCRβ、BTLA和TCRα、BTLA和TCRβ、BY55和TCRα、BY55和TCRβ、TIGIT和TCRα、TIGIT和TCRβ、B7H5和TCRα、B7H5和TCRβ、LAIR1和TCRα、LAIR1和TCRβ、SIGLEC10和TCRα、SIGLEC10和TCRβ、2B4和TCRα、2B4和TCRβ和/或表达CAR、多链CAR和pTα转基因。
基因去活化可以通过所属领域的技术人员所实践的方法进行。所述方法包括，但不限于使用锌指、
Figure BDA0003095371290000561
和基于CRISPR/Cas的系统来进行基因去活化。
在一些实施例中，所述含有BCMA CAR的免疫细胞具有去活化的CD52基因。在一些实施例中，仅将一份所述CD52基因的拷贝去活化。
在一些实施例中，所述含有BCMA CAR的免疫细胞具有去活化的TCRα基因。
在一些实施例中，所述含有BCMA CAR的免疫细胞具有去活化的TCRβ基因。
在一些实施例中，使用
Figure BDA0003095371290000562
将基因去活化。在所述实施例中，使用
Figure BDA0003095371290000563
将基因去活化的效率并非100％，且所产生的TCRαβ阴性T细胞是在冷冻保存之前通过消耗残余的TCRαβ阳性T细胞富集。然而，CD52阴性细胞未经纯化而导致具有不同频率的CD52阴性细胞(通常是在60至80％之间)的细胞产物。因此，在一些实施例中，本公开的BCMA CAR-T细胞的基因型为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。
在一些实施例中，通过将TCRα基因和/或TCRβ基因去活化，使根据本公开的TCR在细胞中不起作用。在一些实施例中，提供取得源自个体的经修饰的细胞的方法，其中所述细胞可独立于所述主要组织兼容性复合体(MHC)信号传导途径增殖。本公开的范围包含容易通过本方法获得的经修饰的细胞，所述经修饰的细胞可独立于MHC信号传导途径增殖。本公开的经修饰的细胞可用于治疗有需要对抗宿主抗移植物(HvG)排斥和移植物抗宿主疾病(GvHD)的个体。因此，本公开的范围包含治疗有需要对抗宿主抗移植物(HvG)排斥和移植物抗宿主疾病(GvHD)的个体的方法，所述方法包含通过对所述个体施用有效量的经修饰的细胞来治疗所述个体，所述经修饰的细胞包含去活化的TCRα和/或TCRβ基因。
在一些实施例中，所述免疫细胞经工程处理以对一或多种化疗药物具有抗性。所述化疗药物可以是，例如嘌呤核苷酸类似物(PNA)，而使所述免疫细胞适合与过继性免疫疗法和化学疗法组合以治疗癌症。示例性PNA包括，例如单独或组合的氯法拉滨(clofarabine)、氟达拉滨(fludarabine)和阿糖胞苷(cytarabine)。PNA是由脱氧胞苷激酶(dCK)代谢成单磷酸、二磷酸和三磷酸PNA。其三磷酸形式与ATP竞争合成DNA，作为促凋亡剂，且为参与生产三核苷酸的核糖核苷酸还原酶(RNR)的有效抑制剂。本文提供包含去活化的dCK基因的BCMA特异性CAR-T细胞。在一些实施例中，所述dCK基因剔除细胞是通过使用多核苷酸转染T细胞(例如通过mRNA的电穿孔)来制造，所述多核苷酸编码针对dCK基因的特异性TAL-核酸酶。所述dCK剔除的BCMA特异性CAR-T细胞对PNA(包括，例如氯法拉滨和/或氟达拉滨)具有抗性，并维持T细胞对表达BCMA的细胞的细胞毒性活性。
在一些实施例中，本公开的经分离的细胞或细胞系可包含pTα或其功能变体。在一些实施例中，经分离的细胞或细胞系可通过将所述TCRα基因去活化而进行进一步的遗传修饰。
在一些实施例中，所述CAR-T细胞包含编码安全开关的多核苷酸，例如，例如RQR8。参见，例如WO2013153391A，其全部内容以引用方式并入本文。在包含所述多核苷酸的CAR-T细胞中，所述安全开关多肽表达在CAR-T细胞的表面。在一些实施例中，所述安全开关多肽包含SEQ ID NO：342所示的氨基酸序列。
CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(SEQ IDNO:342)
所述安全开关多肽还可以在氨基端包含信号肽。在一些实施例中，所述安全开关多肽包含SEQ ID NO：400所示的氨基酸序列。
MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(SEQ ID NO:400)
当所述安全开关多肽表达在CAR-T细胞表面时，利妥昔单抗与所述多肽的R表位结合导致所述细胞溶解。每一表达在所述细胞表面的多肽可与一个以上的利妥昔单抗分子结合。所述多肽的每一R表位可与单独的利妥昔单抗分子结合。BCMA特异性CAR-T细胞的除去可在体内发生，例如通过对个体施用利妥昔单抗。除去所述转移的细胞的决定可能起源于在所述个体中检测到归因于所述转移的细胞的不良作用，例如，例如当检测到不能接受的毒性程度时。
在一些实施例中，所述CAR-T细胞在所述scFv内包含选定的表位，其具有可被特异抗体识别的特异性。参见，例如2016年1月25日提交的PCT申请PCT/EP2016/051467，WO2016/120216，“mAb-DRIVEN CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR SYSTEMS FOR SORTING/DEPLETINGENGINEERED IMMUNE CELLS”(其全部内容以引用方式并入本文)。所述表位促成分选和/或消耗所述CAR-T细胞。所述表位可选自任何数量的所属领域已知的表位。在一些实施例中，所述表位可以是被核准用于医学用途的单克隆抗体的靶的，例如，但不限于可被利妥昔单抗识别的CD20表位。在一些实施例中，所述表位包含SEQ ID NO：397所示的氨基酸序列。
CPYSNPSLC(SEQ ID NO：397)
在一些实施例中，所述表位位于CAR内。例如，但不限于：所述表位可位于CAR的scFv和铰链之间。在一些实施例中，可在CAR中使用通过接头分开的同一表位的二个实例。例如，所述包含SEQ ID NO：398所示的氨基酸序列的多肽可用于CAR内的位于轻链可变区和铰链之间的位置。
GSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGS(SEQ ID NO:398)
在一些实施例中，所述表位特异性抗体可与细胞毒性药物轭合。还可能通过使用经工程处理的抗体来提高CDC细胞毒性，所述经工程处理的抗体上是经移植所述补体系统的组成分。在一些实施例中，可通过使用可识别所述表位的抗体消耗所述CAR-T细胞以调节所述细胞的活化。
Ⅲ.治疗应用
通过上述方法获得的经分离的细胞或源自所述经分离的细胞的细胞系可作为药物。在一些实施例中，所述药物可用于治疗MM。在一些实施例中，所述MM为难治性MM。在一些实施例中，所述MM为复发性MM。在一些实施例中，所述MM为难治性/复发性MM。
在一些实施例中，所述个体尚未接受任何用于多发性骨髓瘤的先前疗法。在一些实施例中，所述个体已接受至少一种，二种或三种用于多发性骨髓瘤的先前疗法。在一些实施例中，本文提供的给药方案为一线疗法。在一些实施例中，本文提供的给药方案为二线疗法。在一些实施例中，本文提供的给药方案为三线疗法。在一些实施例中，本文提供的给药方案为四线疗法。在一些实施例中，所述个体患有复发性MM。在一些实施例中，所述个体患有难治性MM。在一些实施例中，所述个体患有难治性MM和复发性MM。
在一些实施例中，根据本公开的经分离的细胞或源自所述经分离的细胞的细胞系可用于制备用于治疗有此需要的个体的癌症的药物。
本文还提供用于治疗个体的方法。在一些实施例中，所述方法包含对有此需要的个体提供本公开的免疫细胞。在一些实施例中，所述方法包含对有此需要的个体施用本公开的经转化的免疫细胞的步骤。所述个体可以是男性或女性、成年、青少年或儿童。在一些实施例中，所述个体为人类个体。
在一些实施例中，本公开的T细胞可经历体内T细胞扩增并可持续一段延长的时间。
本公开的治疗方法可以是改善、治愈或预防性。本公开的方法可以是自体免疫疗法的一部分或同种异体免疫疗法治疗的一部分。本公开特别适合用于同种异体免疫疗法。来自供体的T细胞可使用标准方案转化为非同种异体反应性细胞并依需要复制，从而产生可施用一或多名个体的CAR-T细胞。所述CAR-T细胞疗法可制成可以“现成的”治疗产品的形式取得。第17和18图描述自体CAR-T疗法的局限性和同种异体疗法的优点。
可以本公开的方法使用的细胞描述于前述章节。治疗可以用于治疗被诊断患有MM的个体。本公开还包括成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。在一些实施例中，所述治疗可与一或多种选自下列群组的针对MM的疗法组合：抗体疗法、化学疗法、细胞因子疗法、树突细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光光疗法和放射疗法。
在一些实施例中，可对经历免疫抑制治疗的个体施用治疗。实际上，本公开优选为依赖已被制成对至少一种免疫抑制剂具有抗性的细胞或细胞群，所述细胞或细胞群是由于编码所述免疫抑制剂的受体的基因被去活化而对所述免疫抑制剂具有抗性。在所述方面中，所述免疫抑制治疗应有助于在个体内选择和扩增根据本公开的T细胞。
根据本公开的细胞或细胞群可以任何方便的方式施用，包括通过气雾吸入、注射、摄入、输注、植入或移植。本文所描述的组合物可通过静脉内或淋巴内注射通过皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌肉内途径，或通过腹腔内途径施用个体。在一实施例中，本公开的细胞组合物优选为通过静脉内注射施用。
在一些实施例中，本公开的经工程处理的表达BCMA CAR的免疫细胞配制成用于输注。在一些实施例中，所述细胞是在包含约5％DMSO的溶液中配制。在一实施例中，在包含约5％DMSO的溶液中配制14×10^6个BCMA-CAR-T细胞/mL。在进一步的实施例中，所述配制剂包含
Figure BDA0003095371290000591
Basal Solution和
Figure BDA0003095371290000592
CS10的1:1的混合物(其导致5％二甲亚砜的最终浓度)。在一些实施例中，所述配制剂的剂量强度为14×10^6个BCMA-CAR-T细胞/mL。在一些实施例中，所述配制的药物产品是在2mL的封闭系统小瓶中供给，所述封闭系统小瓶具有整体的瓶塞，标称体积为1mL。
在一些实施例中，本公开的BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞且被配制成用于输注的悬浮液。在一些实施例中，所述BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞配制在包含
Figure BDA0003095371290000601
Basal Solution和
Figure BDA0003095371290000602
CS10的1:1的混合物(其导致5％二甲亚砜的最终浓度)中。在一些实施例中，所述配制剂的剂量强度为14×10^6个BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞/mL。
IV.淋巴清除
在一些实施例中，在第一和/或随后的BCMA CAR-T细胞剂量之前对所述个体施用淋巴清除(LD)方案。在一些实施例中，所述淋巴清除方案与第一和/或随后的CAR-T细胞剂量同时施用个体。在一些实施例中，所述淋巴清除方案是在施用第一和/或随后的BCMACAR-T细胞剂量之前、期间和/或之后施用。
合适的LD方案描述于本文中和/或为所属领域所已知。在一些实施例中，LD是在输注CAR-T之前、同时或之后开始。施用LD的剂量和施用时点可根据BCMA CAR-T的第一或后续剂量进行调整。在一些实施例中，LD的持续时间为约3至5天。在一些实施例中，LD结束和开始施用CAR-T之间的时间窗为约2天至约2周。在一些实施例中，在施用一定剂量的CAR-T细胞之前约15至7天开始LD。在一些实施例中，在施用CAR-T细胞剂量之前约19至5天开始LD。在一些实施例中，在施用CAR-T细胞剂量之前约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天开始LD。在一些实施例中，LD方案的持续时间为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天。在一些实施例中，在LD结束后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天施用一定剂量的CAR-T细胞。
在一些实施例中，LD方案包含施用一或多种化疗药物。
在一些实施例中，LD方案包含施用抗CD52抗体，例如识别人类分化(CD)52抗原群的抗体，所述抗原为表达在大多数淋巴样细胞的细胞表面糖蛋白。如本文所使用的CD52单克隆抗体为针对21-28kD细胞表面糖蛋白CD52的抗体。CD52为在至少95％的全部人类外周血淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞上呈现的丰富分子(每一细胞约5×105个抗体结合位点)。用于本文所描述的方法和组合物中的示例性CD52抗体包括，例如阿仑单抗(alemtuzumab)。在一些实施例中，CD52抗体包含如下列表4中所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
表4：示例性CD52抗体CDR序列
CDR 序列(SEQ ID NO)
HCDR1 DFYMN(SEQ ID NO:402)
HCDR2 FIRDKAKGYTTEYNPSVKG(SEQ ID NO:403)
HCDR3 EGHTAAPFDY(SEQ ID NO:404)
LCDR1 KASQNIDKYLN(SEQ ID NO:405)
LCDR2 NTNNLQT(SEQ ID NO:406)
LCDR3 LQHISRPRT(SEQ ID NO:407)
在一些实施例中，CD52抗体包含VH和/或VL，所述VH和/或VL包含下列表5中所示的序列。
表5：示例性CD52抗体VH和VL序列
Figure BDA0003095371290000611
Figure BDA0003095371290000621
在一些实施例中，CD52抗体包含VH，所述VH具有SEQ ID NO：408的序列或具有与SEQ ID NO：408具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些实施例中，CD52抗体包含VL，所述VL具有SEQ ID NO：410的序列，或具有与SEQ ID NO：410具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些实施例中，CD52抗体包含具有SEQ ID NO：408的序列的VH和具有SEQID NO：410的序列的VL。在一些实施例中，CD52抗体包含由SEQ ID NO：409的DNA序列编码的VH和由SEQ ID NO：411的DNA序列编码的VL。
在一些实施例中，所述抗CD52抗体为重组的人化IgG1κ单克隆抗体(mAb)。在一些实施例中，所述抗CD52抗体为阿仑单抗。阿仑单抗为针对所述21-28kD细胞表面糖蛋白CD52的源自重组DNA的人化单克隆抗体。参见，例如Saif等人,Pediatr Transplant 2015Mar；19(2):211-8。在一些实施例中，所述抗CD52抗体包含一或多个从阿仑单抗的CDR分离或衍生的CDR序列。在一些实施例中，所述抗CD52抗体包含SEQ ID NO：408的序列，或与SEQ ID NO：408具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述抗CD52抗体包含SEQID NO：410的序列，或与SEQ ID NO：410具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述抗CD52抗体包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：402的序列；HCDR2，其包含SEQ IDNO：403的序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO：404的序列；LCDR1，其包含SEQ ID NO：405的序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：406的序列；和/或LCDR3，其包含SEQ ID NO：407的序列。在一些实施例中，所述抗CD52抗体包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO：402的序列；HCDR2，其包含SEQ IDNO：403的序列；HCDR3，其包含SEQ ID NO：404的序列；LCDR1，其包含SEQ ID NO：405的序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO：406的序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO：407的序列；其中所述抗CD52抗体包含SEQ ID NO：408和/或SEQ ID NO：410的序列，或与SEQ ID NO：408和/或SEQID NO：410具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的序列。
在一些实施例中，LD包含仅施用CD52抗体。
在一些实施例中，LD包含施用联合疗法。在一些实施例中，所述组合包括：氟达拉滨(总剂量为约90至150mg/m2)和环磷酰胺(总剂量为约1000至4000mg/m2)，加上或不加上抗CD52药物(例如抗CD52抗体，例如包含SEQ ID NO：408和/或SEQ ID NO：410的序列的抗体)(总剂量为约0.3至约1mg/kg，或固定剂量为约30mg至约40mg、约25mg至约60mg、约60mg至约90mg、或约100mg至约120mg)。在一些实施例中，所述组合包括：氟达拉滨(约30mg/m2)和环磷酰胺(总剂量为约500至600mg/m2)，加上或不加上抗CD52药物(例如CD52抗体)(总剂量为约0.3至约1mg/kg，或固定剂量为约30mg至约40mg、约25至约60mg、约60mg至约90mg、或约100mg至约120mg)。在一些实施例中，所述组合包括：氟达拉滨(约30mg/m2)和环磷酰胺(约300mg/m2)，加上或不加上抗CD52药物(例如CD52抗体)(总剂量为约0.3至约1mg/kg，或固定剂量为约30mg至约40mg、约20mg至约30mg、约25mg至约60mg、约60mg至约90mg、或约100mg至约120mg)。在一些实施例中，所述组合包括：氟达拉滨(约90mg/m2)和环磷酰胺(约900mg/m2)，加上或不加上抗CD52药物(例如CD52抗体)(总剂量为约0.3至约1mg/kg，或固定剂量为约30mg至约40mg、约20mg至约30mg、约25mg至约60mg、约60mg至约90mg、或约100mg至约120mg)。在一些实施例中，所述组合包括：氟达拉滨(约90mg/m2)和环磷酰胺(约1500mg/m2)，且加上或不加上抗CD52药物(例如CD52抗体，约1mg/kg)。在一些实施例中，所述组合包括：氟达拉滨(约150g/m2)和环磷酰胺(约130mg/kg)，加上或不加上抗CD52药物(例如抗CD52抗体，总剂量为约0.3至约1mg/kg，或固定剂量为约30mg至约40mg、约25至约60mg、约60mg至约90mg、或约100mg至约120mg)。在一些实施例中，所述组合包括：氟达拉滨(约150g/m2)和环磷酰胺(约120mg/kg或约130mg/kg)，加上或不加上抗CD52药物(例如抗CD52抗体，总剂量为约0.3至约1mg/kg，或固定剂量为约30mg至约40mg、约25至约60mg、或约100mg至约120mg)。在一些实施例中，所述组合包括：氟达拉滨(约30mg/m2/天)和环磷酰胺(约300mg/m2/天)，加上或不加上抗CD52药物(例如抗CD52抗体，约13mg/天)。在一些实施例中，所述组合包括：氟达拉滨(约30mg/m2/天)和环磷酰胺(约300mg/m2/天)，加上或不加上抗CD52药物(例如抗CD52抗体，约10mg/天)。在一些实施例中，所述组合包括：环磷酰胺和抗CD52药物(例如抗CD52抗体)。在一些实施例中，以上这些剂量是在一天之中施用。在一些实施例中，以上这些剂量是在数天内施用。
在一些实施例中，氟达拉滨和环磷酰胺是在第一天施用，而所述抗CD52抗体(例如，包含SEQ ID NO：408和/或SEQ ID NO：410的序列的抗体)是在第二天施用。在一些实施例中，氟达拉滨和环磷酰胺是在第一天施用CAR-T细胞之前施用且抗CD52抗体(例如，包含SEQ ID NO：408和/或SEQ ID NO：410的序列的抗体)是在第二天施用；其中第二天为施用CAR-T细胞的同一天，或者第二天是在施用CAR-T细胞之后。在一些实施例中，氟达拉滨和环磷酰胺是在第一天施用，CAR-T细胞是在第二天施用且抗CD52抗体(例如，包含SEQ ID NO：408和/或SEQ ID NO：410的序列的抗体)是在第二天之后至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12周施用。在一些实施例中，氟达拉滨和环磷酰胺是在施用CAR-T细胞之前施用且抗CD52抗体(例如，包含SEQ ID NO：408和/或SEQ ID NO：410的序列的抗体)是在施用CAR-T细胞之后至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12周施用。
在一些实施例中，淋巴清除方案包含施用氟达拉滨和环磷酰胺(FC)。在一些实施例中，淋巴清除方案包含施用氟达拉滨和抗CD52抗体(例如，包含SEQ ID NO：408和/或SEQID NO：410的序列的抗体)(FA)。在一些实施例中，淋巴清除方案包含施用环磷酰胺和抗CD52抗体(例如，包含SEQ ID NO：408和/或SEQ ID NO：410的序列的抗体)(CA)。在一些实施例中，淋巴清除方案包含施用氟达拉滨、环磷酰胺和抗CD52抗体(例如，包含SEQ ID NO：408和/或SEQ ID NO：410的序列的抗体)(FCA)。
在CAR-T细胞的第一或第二/随后剂量之前对特定淋巴清除方案药物和剂量的选择可基于患者的血液学分析和血液学恢复来测定。在重新给药的情况下，第二淋巴清除方案可较第一淋巴清除方案的强度强一些或低一些(例如，基于在第一个剂量后淋巴细胞、嗜中性粒细胞的恢复和病毒再活化)。例如，在重新给药时，如果淋巴细胞和嗜中性粒细胞的量很高，那么可能使用强力或积极手段的淋巴清除方案。或者，在重新给药时，如果淋巴细胞量少，那么可能使用较弱或较不积极的淋巴清除方案。在一些实施例中，如果重新给药时胚细胞的数目高，那么使用强力或积极手段的淋巴清除方案。在一些实施例中，如果重新给药时的胚细胞数目少，那么使用较弱或较不积极的淋巴清除方案。
在一些实施例中，在重新给药时可应用增加强度的LD方案(使用或不使用抗CD52药物)。在一些实施例中，在重新给药时可应用降低强度的LD方案，例如在3-4级淋巴细胞减少的情况下(使用或不使用抗CD52药物)。
在一些实施例中，氟达拉滨/环磷酰胺(FC)或氟达拉滨/环磷酰胺/抗CD52抗体(FCA)的淋巴清除方案的组成分是同时施用；在其它实施例中，所述组成分连续施用。在一些实施例中，所述氟达拉滨/环磷酰胺(FC)或氟达拉滨/环磷酰胺/抗CD52抗体(FCA)的淋巴清除方案的组成分是在第-5天、第-4天和第-3天同时施用。在一些实施例中，氟达拉滨/环磷酰胺(FC)的淋巴清除方案的组成分是在施用所述抗CD52抗体之前施用。在一些实施例中，氟达拉滨/环磷酰胺(FC)是在第-7天、第-6天和第-5天施用后，接着在第-4天和第-3天施用抗CD52抗体(A)。在一些实施例中，氟达拉滨/环磷酰胺(FC)是在第-7天、第-6天和第-5天施用，接着在第-5天、第-4天和第-3天施用抗CD52抗体(A)。在一些实施例中，所述个体是在CAR-T细胞疗法的第一个剂量之前接受FC方案；和在CAR-T细胞疗法重新给药之前接受FCA方案。在一些实施例中，所述个体是在CAR-T细胞疗法的第一个剂量前接受FCA方案；和在CAR-T细胞疗法重新给药之前接受第二FCA方案。
表6A、6B、6C、6D、6E、6F和6G中提供示例性LD方案。表6A至6G中，时间表下方所指明的时点是相对于施用CAR-T细胞的剂量的时点(D0)(以天计)。负数表示在施用CAR-T细胞之前的天数(在D0)。
表6A
Figure BDA0003095371290000651
表6B
淋巴清除 剂量 途径
氟达拉滨 30mg/m<sup>2</sup>/天 IV，在15-30分钟内
环磷酰胺 500mg/m<sup>2</sup>/天 IV，在1小时内
抗CD52抗体 8mg/天 IV
表6C
淋巴清除 剂量 途径
氟达拉滨 30mg/m<sup>2</sup>/天 IV，在15-30分钟内
环磷酰胺 500mg/m<sup>2</sup>/天 IV，在1小时内
抗CD52抗体 6mg/天 IV
表6D
Figure BDA0003095371290000661
表6E
Figure BDA0003095371290000662
表6F
淋巴清除 剂量 总剂量
氟达拉滨 30mg/m<sup>2</sup>/天 90mg/m<sup>2</sup>
环磷酰胺 300mg/m<sup>2</sup>/天 900mg/m<sup>2</sup>
抗CD52抗体 30mg/天 90mg
表6G
淋巴清除 剂量 总剂量
氟达拉滨 30mg/m<sup>2</sup>/天 90mg/m<sup>2</sup>
环磷酰胺 300mg/m<sup>2</sup>/天 900mg/m<sup>2</sup>
抗CD52抗体 30mg/天 60mg
V.给药方案
在一些实施例中，本公开的同种异体BCMA CAR-T细胞使用固定剂量施用。在其它实施例中，同种异体BCMA CAR-T细胞是使用剂量分带法施用。例如，可使用剂量分带法来避免广泛的CAR-T细胞暴露的风险。在一些实施例中，可使用重量带。例如，但不限于：<66kg的个体可施用X剂量，而≥66kg的个体可施用约1.33X剂量。在一些实施例中，≥50kg的个体可施用一个剂量，而≤50kg的个体可施用不同剂量。
用于具有复发性/难治性MM的个体的同种异体BCMA CAR-T细胞的第一剂量的示例性剂量水平提供于表7A中。所述指定为“-1”的剂量水平仅依需要施用。
表7A
Figure BDA0003095371290000671
在一些实施例中，对其体重≥50kg的个体施用一定剂量的本公开的同种异体BCMACAR-T细胞，其中所述剂量范围为约20×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞(描述于实例1中)。
在一些实施例中，对其体重≥50kg的个体施用一定剂量的本公开的同种异体BCMACAR-T细胞，其中所述剂量范围为约20×10^6个细胞/剂量至约40×10^10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量至约120×10^6个细胞/剂量、约120×10^6个细胞/剂量至约360×10^6个细胞/剂量、或约360×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMACAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞。
在一些实施例中，对其体重<50kg的个体施用一定剂量的本公开的同种异体BCMACAR-T细胞，其中所述剂量范围为约7×10^6个细胞/剂量至约360×10^10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞。
在一些实施例中，对其体重<50kg的个体施用一定剂量的本公开的同种异体BCMACAR-T细胞，其中所述剂量范围为约7×10^6个细胞/剂量或14×10^6个细胞/剂量至约20×10^10^6个细胞/剂量、约20×10^6个细胞/剂量至约80×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量至约240×10^6个细胞/剂量、或约240×10^6个细胞/剂量至约360×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞。
表7B中提供用于具有复发性/难治性MM个体的用于同种异体BCMA CAR-T细胞的第一剂量的可供选择的示例性剂量水平。所述中间剂量水平和被指定为“4”和“-1”的剂量水平仅依需要施用。
表7B
Figure BDA0003095371290000681
在一些实施例中，对其体重>50kg的个体施用一定剂量的本公开的同种异体BCMACAR-T细胞，其中所述剂量范围为约20×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞(描述于实例1中)。
在一些实施例中，对其体重>50kg的个体施用一定剂量的本公开的同种异体BCMACAR-T细胞，其中所述剂量范围为约20×10^6个细胞/剂量至约40×10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量至约160×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量至约240×10^6个细胞/剂量、约240×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量、约240×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量、或约320×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。
在一些实施例中，对其体重≤50kg的个体施用一定剂量的本公开的同种异体BCMACAR-T细胞，其中所述剂量范围为约14×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞。
在一些实施例中，对其体重≤50kg的个体施用一定剂量的本公开的同种异体BCMACAR-T细胞，其中所述剂量范围为约14×10^6个细胞/剂量至约20×10^6个细胞/剂量、约20×10^6个细胞/剂量至约80×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量至约160×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量至约200×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量至约200×10^6个细胞/剂量、约200×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量、或约200×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞。
在一些实施例中，对其体重>50kg的个体施用一定剂量的本公开的同种异体BCMACAR-T细胞，其中所述剂量为约40×10^6个细胞/剂量、160×10^6个细胞/剂量、或320×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，如果在剂量水平3下观察到毒性或为了测定较低的有效剂量，那么施用约240×10^6个细胞/剂量的中间剂量(或介于剂量水平1或剂量水平3之间的另一剂量水平)。在一些实施例中，如果在剂量水平3见到不足的效力参数，那么施用为480×10^6个细胞/剂量的剂量水平(剂量水平4)(第20图)。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞。
所述细胞或细胞群可在一或多个剂量中施用。在一些实施例中，所述有效量的细胞可以单剂量的形式施用。在一些实施例中，所述有效量的细胞可以一个以上的剂量形式在一段时间内施用。施用时点是由医师判断并取决于所述个体的临床状况。所述细胞或细胞群可从任何来源获得，例如血库或供体。虽然个体的需求有所不同，测定用于特定疾病或病况的指定细胞类型的有效量的最优选范围是在所属领域的技术范围内。有效量意指提供治疗或预防益处的量。所述施用的剂量大致上将取决于所述接受者的年龄、健康状况和体重、同时进行的治疗的种类(如果有的话)、治疗的频率和所需效果的性质。在一些实施例中，通过肠胃道外施用有效量的细胞或包含那些细胞的组合物。在一些实施例中，施用可以是静脉内施用。在一些实施例中，施用可通过直接注射在肿瘤内进行。
在本公开的一些实施例中，可将细胞联同(例如之前、同时或之后)任何数量的相关治疗方式施用个体，所述相关治疗方式包括，但不限于使用作用剂进行治疗，例如使用用于MS个体的单克隆抗体疗法、CCR2拮抗剂(例如INC-8761)、抗病毒疗法、西多福韦(cidofovir)和介白素-2、阿糖胞苷(还称为ARA-C)或那他昔单抗(nataliziimab)治疗、或用于牛皮癣个体的依法西单抗(efaliztimab)治疗、或用于PML个体的其它治疗。在一些实施例中，BCMA特异性CAR-T细胞是联同下列一或多者施用个体：抗PD-1抗体(例如纳武鲁单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)或PF-06801591)、抗PD-L1抗体(例如阿维鲁单抗(avelumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)或杜伐鲁单抗(durvalumab))、抗OX40抗体(例如PF-04518600)、抗4-1BB抗体(例如PF-05082566)、抗MCSF抗体(例如PD-0360324)、抗GITR抗体和/或抗TIGIT抗体。在一些实施例中，本公开的BCMA特异性CAR-T细胞是联同抗PD-L1抗体阿维鲁单抗施用个体。在进一步的实施例中，本公开的T细胞可与下列群组组合使用：化学疗法、放射线、免疫抑制剂，例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体、或其它免疫消融剂，例如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素、氟达立滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸(mycoplienolic acid)、类固醇、FR901228、细胞因子和/或放射线。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(calcineurin)(环孢菌素和FK506)或抑制p70S6激酶(其对生长因子诱导的信号传导很重要)(雷帕霉素)(Henderson,Naya等人,1991；Liu,Albers等人,1992；Bierer,Hollander等人,1993)。在进一步的实施例中，本公开的细胞组合物联同(例如之前、同时或之后)下列群组施用个体：骨髓移植、使用任一化疗剂(例如氟达拉滨)的T细胞消融疗法、体外放射线疗法(XRT)、环磷酰胺、或抗体，例如OKT3或CAMPATH。在一些实施例中，本公开的细胞组合物是在B细胞消融疗法(例如与CD20反应的药物，例如利妥昔单抗)之后施用。例如，在一实施例中，个体可接受使用高剂量化学疗法的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些实施例中，在移植后，个体接受输注本公开的扩增的免疫细胞。在一些实施例中，扩增的细胞是在手术之前或之后施用。
VI.使用CAR-T细胞再治疗的方法
本文还提供使用BCMA CAR-T细胞进行再治疗(重新给药)的方法。特别是，所述方法涉及对已接受第一剂量的个体施用一或多个后续的细胞剂量和/或施用第一和一或多个后续剂量。所述剂量通常以特定量并根据特定的时间参数施用。在一些实施例中，所述方法通常涉及施用第一细胞剂量，从而减少疾病负担，随后相对于所述第一剂量在特定的时间窗期间施用后续的细胞剂量或随后对已接受所述第一剂量的个体施用后续剂量。在一些实施例中，接着再施用的另外的后续剂量是，例如在相对于所述后续剂量的相同或相似的时间窗口内施用。在一些实施例中，设计施用的细胞数量和所述多个剂量的时点以改善一或多种结果，例如降低对所述个体的毒性的可能性或程度、改善所述个体对施用的细胞的暴露和/或所述施用的细胞的持久性和/或改善治疗效力。还提供包含所述细胞和经设计以在所述给药方案之后施用的制品。
在一些再治疗(重新给药)的实施例中，对其体重>50kg的个体施用本公开的同种异体BCMA CAR-T细胞的追加剂，其中所述剂量范围为约20×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞(描述于实例1中)。
在一些再治疗(重新给药)的实施例中，对其体重>50kg的个体施用本公开的同种异体BCMA CAR-T细胞的追加剂，其中所述剂量为约20×10^6个细胞/剂量至约40×10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量至约160×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量至约240×10^6个细胞/剂量、约240×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量、约240×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量、约320×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。
在一些再治疗(重新给药)的实施例中，对其体重>50kg的个体施用本公开的同种异体BCMA CAR-T细胞的追加剂，其中所述剂量为约40×10^6个细胞/剂量、160×10^6个细胞/剂量、或320×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，如果在剂量水平3观察到毒性或为了测定较低的有效剂量，那么施用约240×10^6个细胞/剂量的中间剂量(或介于剂量水平1或剂量水平3之间的另一剂量水平)。在一些实施例中，如果在剂量水平3下见到不足的效力参数，那么施用为480×10^6个细胞/剂量的剂量水平(剂量水平4)(第20图)。在一些实施例中，所述BCMACAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMACAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞。
在一些再治疗(重新给药)的实施例中，对其体重≥50kg的个体施用本公开的同种异体BCMA CAR-T细胞的追加剂，其中所述剂量为约20×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞(描述于实例1中)。
在一些再治疗(重新给药)的实施例中，对其体重≥50kg的个体施用本公开的同种异体BCMA CAR-T细胞的追加剂，其中所述剂量范围为约20×10^6个细胞/剂量至约40×10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量至约120×10^6个细胞/剂量、约120×10^6个细胞/剂量至约360×10^6个细胞/剂量、或约360×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞。
在一些再治疗(重新给药)的实施例中，对其体重≤50kg的个体施用本公开的同种异体BCMA CAR-T细胞的追加剂，其中所述剂量范围为约14×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞。
在一些再治疗(重新给药)的实施例中，对其体重≤50kg的个体施用本公开的同种异体BCMA CAR-T细胞的追加剂，其中所述剂量范围为约14×10^6个细胞/剂量至约20×10^6个细胞/剂量、约20×10^6个细胞/剂量至约80×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量至约160×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量至约200×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量至约200×10^6个细胞/剂量、约200×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量或约200×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞。
在一些再治疗(重新给药)的实施例中，对其体重<50kg的个体施用本公开的同种异体BCMA CAR-T细胞的追加剂，其中所述剂量范围为约7×10^6个细胞/剂量至约360×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞。
在一些再治疗(重新给药)的实施例中，对其体重<50kg的个体施用本公开的同种异体BCMA CAR-T细胞的追加剂，其中所述剂量范围为约7×10^6或约14×10^6个细胞/剂量至约20×10^10^6个细胞/剂量、约20×10^6个细胞/剂量至约80×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量至约240×10^6个细胞/剂量、或约240×10^6个细胞/剂量至约360×10^6个细胞/剂量。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞。在一些实施例中，所述BCMA CAR-T细胞为BCMA-1CAR-T细胞。
Ⅶ.试剂盒和制品
本公开还提供用于所公开的方法中的试剂盒和制品。本公开的试剂盒包括一或多个容器(例如玻璃瓶)和根据本文所描述的任一公开方法的使用说明，所述一或多个容器包含编码BCMA特异性CAR的多核苷酸或经工程处理的免疫细胞(例如BCMA-1CAR-T细胞，例如BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞)，所述经工程处理的免疫细胞包含编码如本文所描述的BCMA特异性CAR的多核苷酸。在一些实施例中，所述经工程处理的免疫细胞配制在包含约5％DMSO的溶液中。此外，所述经工程处理的免疫细胞可以冷冻状态提供。
在一些实施例中，本文提供另外的小瓶，所述小瓶包含CD52抗体的单位剂量(其可以冷冻状态或包含缓冲介质的室温溶液形式提供)、氟达拉滨和/或环磷酰胺。
通常，本文提供的这些说明书包含关于施用用于上述治疗性治疗的经工程处理的免疫细胞的描述。关于如本文所描述的经工程处理的免疫细胞的使用说明书一般包括关于用于预期治疗的剂量、给药时间表和施用途径的信息。所述容器可以是单位剂量、散装包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。本公开的试剂盒中提供的说明书通常为在标签或仿单(例如包含在所述试剂盒中的纸张)上的书面说明，但机器可读的说明(例如磁盘或光盘上所携带的说明)也可以接受。
本公开的试剂盒是在合适的包装中。合适的包装包括，但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软质包装(例如密封的Mylar聚酯薄膜或塑料袋)等。还考虑用于与特定装置(例如输注装置，例如微型泵)组合使用的包装。试剂盒可具有无菌的进入口(例如所述容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述容器亦可具有无菌的进入口(例如所述容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述组合物中的至少一种活性剂为BCMA抗体。所述容器可进一步包含第二药物上活性的作用剂。
试剂盒可视需要地提供额外组分，例如缓冲液和解释性信号。通常，所述试剂盒包含容器和在所述容器上或与所述容器结合的标签或仿单。
下列实例仅用于说明，而不意图以任何方式限制本公开的范围。实际上，除了本文中所显示和描述的之外，根据前述内容，本公开的各种修饰对所属领域的技术人员来说将是显明的且是在所附的权利要求书内。
实例
实例1：BCMA-1的生产和测试
第1至16图描述BCMA-1的生产和测试。BCMA-1为同种异体T细胞，其包含表达BCMACAR的经整合的自行去活化的第三代重组慢病毒载体。所述BCMA CAR包含scFv，其中所述CAR的scFV为表1中的P5A2。所述scFV包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列且所述VL包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列。所述CAR的胞外区还包含2个可被利妥昔单抗识别的模拟表位。
所述BCMA CAR-T细胞的基因型为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-。所述细胞可配制在包含5％DMSO的溶液中。在一实施例中，所述细胞是在
Figure BDA0003095371290000741
Basal Solution和
Figure BDA0003095371290000742
CS10的1:1的混合物(其导致5％二甲亚砜的终浓度)中配制成用于输注的悬浮液，且所述所产生的配制剂的剂量强度为14×10^6个BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-T细胞/mL。
第2图显示由利妥昔单抗介导的安全开关可检测和消耗(使用利妥昔单抗)本公开的含BCMA的CAR-T细胞。将BCMA-1细胞与兔子补体和利妥昔单抗一起培育。3小时后，将表达CAR的细胞染色。所述图形显示活CAR+细胞的百分比(平均值+/-SEM)。(第2图)
通过将BCMA-1效应细胞与稳定表达荧光素酶的靶细胞以增加的E:T比例共同培养，以在玻管内评估针对表达BCMA的细胞系测试的BCMA-1的细胞毒性，并在24小时后测量残留的荧光素酶活性，使用BCMA阴性REH细胞作为对照细胞系。与未经转导的对照T细胞(三角形)相比较，BCMA-1(圆形)显示出针对表达BCMA的细胞具有剂量依赖性细胞毒性，但对于对照细胞(REH)并无明显灭杀作用。BCMA-1和非基因编辑的BCMA-1(空心圆圈)的灭杀活性相当。图形代表相对于单独培养的靶细胞的细胞溶解百分比(第6图)。显示的结果为3个供体的平均值+/-SEM。阴性细胞毒性值(由分析过程中的靶细胞生长或增强的荧光素酶信号所导致)绘制为0％细胞溶解。
第16图显示BCMA-1的scFV在组织交叉反应性研究中并未显示脱靶结合，表明在临床设置中脱靶结合的风险低或不存在。在13个人体组织中进行测试。CAR的胞外结构域与人IgG2dA D265A融合(突变以防止Fc结合)。所述方法的研发是用于对过表达BCMA的细胞系进行最优选染色。人体组织中并未观察到染色。
在9个人体组织中的免疫组织化学染色的结果–进行三次信号放大以增加信号。在扁桃体、淋巴结、脾组织中检测到预期信号。乳房、胰腺、输卵管、前列腺、膀胱组织中没有上皮结合。因此，意外结合的风险被认为是低或不存在。
实例2：第1期研究，设计A
第19图显示出用于治疗难治性/复发性MM的第1期研究(设计A)的概述。设计A的设计包括：淋巴细胞清除期：在治疗前3至5天，氟达拉滨(flu)30mg/m2/天IV；环磷酰胺(cy)300mg/m2/天IV；和CD52抗体13mg/天IV；和治疗期(第0天)，其包括从20×10^6个细胞至80×10^6个细胞IV(用于≥50kg个体的递增剂量)或7×10^6个细胞至360×10^6个细胞IV(用于<50kg个体)。
纳入标准可包括下列一或多者：
·在≥3次先前MM方案后为可测量的MM
о诱导+/-ASCT+/-维持为1个方法
о接受先前的PI、IMiD和CD38抑制(除非禁忌)且每一方案至少2个连续周期，除非PD为最优选反应
о最近的方案无效。
·ECOG PS 0-1
·足够的器官功能
·在LD前有5次消除半衰期清洗
о4周mAb
·BCMA表达可用于选择患者。
表8中提供在第1期设计A中的用于BCMA-1递增的剂量分带水平。
表8
Figure BDA0003095371290000751
剂量递增通常将通过3+3设计控制；每一剂量水平可接受来自至少二个不同供体的细胞；最多可以测试五个剂量水平。表8中所述起始剂量记为剂量水平1，在一些实施例中，如果指明，所述个体可以接受-1的剂量水平。
复发的患者可使用来自不同供体的BCMA CAR-T细胞重新给药，例如使用20mgCD52抗体进行调节。
实例3：第1期研究，设计B
第19图显示用于治疗难治性/复发性MM的第1期研究(设计B)的概述。所述设计B的设计包括：淋巴细胞清除期：在治疗前3至5天，氟达拉滨(flu)30mg/m2/天IV；环磷酰胺(cy)300mg/m2/天IV；和CD52抗体13mg/天IV；和治疗期(第0天)，其包括20×10^6个细胞至80×10^6个细胞IV(用于≥50kg个体)或7×10^6个细胞至360×10^6个细胞IV(用于<50kg的个体)的递增剂量。
纳入标准可包括下列一或多者：
1.如多发性骨髓瘤中的反应和最小残留疾病评估的IMWG共识标准所定义的复发性/难治性多发性骨髓瘤(R/R MM)的记录诊断。
2.个体具有包括一或多项下列标准的可测量的疾病：
a.血清M蛋白≥0.5g/dL
b.尿M蛋白≥200mg/24小时，
c.如果血清FLC比例异常，涉及的血清游离轻链(FLC)水平≥10mg/dL(100mg/L)。
3.患者已接受至少≥3次先前的MM方案：
a.使用或不使用造血干细胞移植诱导以及使用或不使用维持疗法被视为单一方案。
b.接受先前的蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和抗CD38抗体(除非禁忌)，每一方案至少连续2个周期(除非慢性病为所述方案的最优选反应)。
c.最近的治疗方案无效。
4.美国东岸癌症临床研究合作组织(ECOG)体能状态为0或1。
一个治疗周期被视为是1次淋巴清除和1个治疗期的组合。
所述研究的一个目的为评估BCMA-1的MTD，和/或建立其RP2D。
在一些实施例中，所述研究包括二个部分：剂量递增和剂量扩增。
在剂量递增部分中，在3+3设计中继替的患者群可接受BCMA-1的递增剂量。在每个剂量水平下，可先使用BCMA-1治疗第一个患者并观察28天，然后再治疗后续患者。通常，在输注BCMA-1后的前28天内将严密监测所有患者的剂量限制性毒性(DLT)。BCMA-1的目标DLT率为<33％。可研究介于DL1和DL3之间的中间剂量水平(表9)。可执行使用2种不同的重量带的给药策略，所述2种不同的重量带是基于在一般人群中观察到的重量变化。体重≤50kg的患者可接受较体重>50kg的患者低33％至50％的剂量。第1期，设计B中的临时BCMA-1递增剂量水平提供于表9中。可依需要施用中间剂量水平、剂量水平-4和剂量水平-1。
表9
Figure BDA0003095371290000761
剂量递增通常是通过3+3设计控制；每一剂量水平可接受来自至少二个不同供体的细胞；最多可测试五个剂量水平。所述起始剂量在表9中被标记为剂量水平1，在一些实施例中，如果有指示，个体可接受剂量水平-1、剂量水平4或中间剂量水平(如表9中所示)。
因此，在设计B中，可在第0天通过静脉内(IV)输注约5分钟来施用BCMA-1。可研究对体重>50kg的患者施用40×10^6个、160×10^6个和320×10^6个同种异体CAR T细胞的递增剂量。用于体重≤50kg的患者的对应剂量为20×10^6个、80×10^6个和200×10^6个同种异体CAR T细胞。
识别人CD52抗原的抗CD52人IgG1单克隆抗体可作为淋巴清除方案的一部分。
可在第-5天、第-4天和第-3天通过静脉内(IV)输注在4小时内施用剂量为13mg/天的抗CD52抗体并同时施用氟达拉滨(30mg/m2/天)和/或环磷酰胺(300mg/m2/day)或单独施用抗体。在有毒性的情况下，计划施用10mg/天的较低剂量。可施用氟达拉滨(30mg/m2/天)3天。
从第一个患者纳入(enrol)到最后一个患者完成，所述1期研究的总持续时间为约48个月。
所述剂量扩增部分可包括加入所述计划书中的其它分群(cohort)，以使用适当的BCMA-1调节方案表征R2PD。在根据剂量递增的调查结果所选择的剂量水平下和调节方案中评估每组12名，至多3组的患者。
当所有接受BCMA-1治疗的患者从最初输注BCMA-1开始已追踪至少24个月、已撤回对任何进一步接触的同意书、失去追踪或死亡时，研究可以结束，除非所述研究更早被试验委托者(sponsor)终止。
在复发的患者中可使用来自不同供体的BCMA CAR-T细胞重新给药，使用，例如20mgCD52抗体进行调节。
实例4：第2期研究
第2期可涉及使用具有来自第1期设计A或设计B的可接受的毒性的最高剂量测试另外的包括6至12名个体的分群(或是RP2D-产生约20％的来自第1期的剂量限制性毒性的剂量水平；或是高于RP2D剂量的剂量水平)。个体可接受不包括flu/cy的CD52抗体；在CAR-T细胞治疗前可施用剂量为～40mg(13mg/天×3天)的CD52抗体，并在CAR-T细胞治疗后第7、14和21天重复施用13mg/天的剂量。
尽管已经参考各种应用、方法和组合物描述所公开的教示内容，应理解的是，在不脱离本文的教示内容和以下的权利要求书的情况下可进行各种变化和修改。前述实例是用于更清楚地说明所公开的教示内容，并非意图限制本文所呈现的教示内容的范围。尽管本教示内容已就这些示例性实施例加以描述，所属领域的技术人员将轻易理解可对这些示例性实施例进行多种变化和修改而无需过多的实验。所有所述变化和修改都在当前的教示内容的范围内。
本文所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及其中所引用的参考文献，在尚未被纳入的程度下，其全部内容以引用方式并入本文。在所述并入的一或多项文献和类似数据与本申请不同或矛盾的事件(包括，但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等)中以本申请为准。
前文的描述和实例详述本发明的某些具体实施例，并描述本发明者考虑的最优选模式。然而，应理解的是，无论前述内容多么详细地出现在文本中，本发明可以多种方式实行且本发明应根据所附的权利要求书和其任何等效项来解释。
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Claims (51)

1.一种治疗个体的多发性骨髓瘤的方法，其包含对所述个体施用至少一个剂量的包含抗人BCMA CAR的同种异体嵌合抗原受体(CAR)-T细胞(BCMA CAR-T细胞)，其中所述至少一个剂量为约7×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体的体重≥50kg，且所述方法包含施用至少一个剂量的BCMA CAR-T细胞，其中所述剂量是在约20×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量的范围内。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一个剂量为约20×10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量、约120×10^6个细胞/剂量、约360×10^6个细胞/剂量、或约480×10^6个细胞/剂量。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一个剂量为约20×10^6个细胞/剂量至约40×10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量至约120×10^6个细胞/剂量、约120×10^6个细胞/剂量至约360×10^6个细胞/剂量、或约360×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体的体重<50kg，且所述方法包含施用至少一个剂量的BCMA CAR-T细胞，其中所述剂量是在约7×10^6个细胞/剂量至约360×10^6个细胞/剂量的范围内。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一个剂量为约7×10^6个细胞/剂量、约14×10^6个细胞/剂量、约20×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量、约240×10^6个细胞/剂量、或约360×10^6个细胞/剂量。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一个剂量为约7×10^6或14×10^6个细胞/剂量至约20×10^6个细胞/剂量、约20×10^6个细胞/剂量至约80×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量至约240×10^6个细胞/剂量、或约240×10^6个细胞/剂量至约360×10^6个细胞/剂量。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体的体重>50kg，且所述方法包含施用至少一个剂量的BCMA CAR-T细胞，其中所述剂量是在约20×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量的范围内。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一个剂量为约20×10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量、约240×10^6细胞/剂量、约320×10^6个细胞/剂量、或约480×10^6个细胞/剂量。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一个剂量为约20×10^6个细胞/剂量至约40×10^6个细胞/剂量、约40×10^6个细胞/剂量至约160×10^6细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量至约240×10^6个细胞/剂量、约240×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量、或约320×10^6个细胞/剂量至约480×10^6个细胞/剂量。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体的体重≤50kg，且所述方法包含施用至少一个剂量的BCMA CAR-T细胞，其中所述剂量是在约14×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量的范围内。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一个剂量为约14×10^6个细胞/剂量、约20×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量、约200×10^6个细胞/剂量、或约320×10^6个细胞/剂量。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一个剂量为约14×10^6个细胞/剂量至约20×10^6个细胞/剂量、约20×10^6个细胞/剂量至约80×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量至约200×10^6个细胞/剂量、约80×10^6个细胞/剂量至约160×10^6个细胞/剂量、约160×10^6个细胞/剂量至约200×10^6个细胞/剂量、或约200×10^6个细胞/剂量至约320×10^6个细胞/剂量。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述多发性骨髓瘤为难治性多发性骨髓瘤(refractory multiple myeloma)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述多发性骨髓瘤为复发性多发性骨髓瘤(relapsed multiple myeloma)。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述多发性骨髓瘤为难治性和复发性多发性骨髓瘤。
17.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述个体未曾接受任何用于多发性骨髓瘤的先前疗法。
18.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述个体已接受至少一种、二种或三种用于治疗多发性骨髓瘤的先前疗法。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含胞外结合结构域，所述胞外结合结构域包含单链Fv片段(scFv)，其中所述scFv包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中所述VH区包含VH互补决定区1(VH CDR1)、VH互补决定区2(VH CDR2)和VH互补决定区3(VH CDR3)且所述VL区包含VL互补决定区1(VL CDR1)、VL互补决定区2(VL CDR2)和VL互补决定区3(VL CDR3)，其中：
(a)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：150、151或152的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQID NO：153或154的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列；所述VLCDR1包含SEQ ID NO：209的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：221的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：222的氨基酸序列；
(b)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：150、151或152的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQID NO：187或188的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列；所述VLCDR1包含SEQ ID NO：249的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：221的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：225的氨基酸序列；
(c)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：150、151或152的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQID NO：165或166的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列；所述VLCDR1包含SEQ ID NO：226的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：221的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：227的氨基酸序列；
(d)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：151、156或157的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQID NO：159或162的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：161的氨基酸序列；所述VLCDR1包含SEQ ID NO：251的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：252的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：253的氨基酸序列；
(e)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：151、156或157的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQID NO：190或191的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：161的氨基酸序列；所述VLCDR1包含SEQ ID NO：262的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：252的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：263的氨基酸序列；
(f)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：150、151或152的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQID NO：154或169的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列；所述VLCDR1包含SEQ ID NO：271的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：221的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：272的氨基酸序列；
(g)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：129、130或131的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQID NO：139或140的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列；所述VLCDR1包含SEQ ID NO：217的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：210的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：216的氨基酸序列；
(h)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：151、156或157的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQID NO：158或159的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列；所述VLCDR1包含SEQ ID NO：209的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：221的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：225的氨基酸序列；或
(i)所述VH CDR1包含SEQ ID NO：129、130或131的氨基酸序列；所述VH CDR2包含SEQID NO：132或133的氨基酸序列；所述VH CDR3包含SEQ ID NO：137的氨基酸序列；所述VLCDR1包含SEQ ID NO：377的氨基酸序列；所述VL CDR2包含SEQ ID NO：210的氨基酸序列；且所述VL CDR3包含SEQ ID NO：214的氨基酸序列。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述VH区包含：VH CDR1，其包含SEQ ID NO：150、151、或152的氨基酸序列；VH CDR2，其包含SEQ ID NO：153或154的氨基酸序列；和VH CDR3，其包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列；且所述VL区包含：VL CDR1，其包含SEQ ID NO：209的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ ID NO：221的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含SEQ ID NO：222的氨基酸序列。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述VH区包含：VH CDR1，其包含SEQ ID NO：151、156或157的氨基酸序列；和VH CDR2，其包含SEQ ID NO：158或159的氨基酸序列；和VHCDR3，其包含SEQ ID NO：155的氨基酸序列；且所述VL区包含：VL CDR1，其包含SEQ ID NO：209的氨基酸序列；VL CDR2，其包含SEQ ID NO：221的氨基酸序列；和VL CDR3，其包含SEQID NO：225的氨基酸序列。
22.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含胞外结合结构域，所述胞外结合结构域包含单链Fv片段(scFv)，其中所述scFv包含VH区和VL区，其中所述VH和VL区的组合选自表1中所呈现的组合。
23.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含胞外结合结构域、第一跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述胞外结构域包含scFv，所述scFv包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含表1中的SEQ ID NO：33、72、39、76、83、92、25、112或8所示的序列；和轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含表1中的SEQ ID NO：34、73、40、77、84、93、18、38或80中所示的序列，其中所述第一跨膜结构域包含CD8α链跨膜结构域且其中所述胞内信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域和/或4-1BB信号传导结构域。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述VH包含SEQ ID NO：33且所述VL包含SEQ IDNO：34。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述VH包含SEQ ID NO：112且所述VL包含SEQ IDNO：38。
26.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含SEQ ID NO：344中所示的氨基酸序列。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述CAR进一步包含CD20表位。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述CD20表位包含SEQ ID NO：397或SEQ ID NO：398中所示的氨基酸序列。
29.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含具有SEQ ID NO：318的序列的CD8α信号肽；VH区，其具有SEQ ID NO：112的序列；GS接头，其具有SEQ ID NO：333的序列；VL区，其具有SEQ ID NO：38的序列；CD8α铰链，其具有SEQ ID NO：320的序列；CD8α跨膜结构域，其具有SEQ ID NO：322的序列；4-1BB胞内信号传导结构域，其具有SEQ ID NO：323的序列；和CD3ζ胞内信号传导结构域，其具有SEQ ID NO：324的序列。
30.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含具有SEQ ID NO：318的序列的CD8α信号肽；VH区，其具有SEQ ID NO：112的序列；GS接头，其具有SEQ ID NO：333的序列；VL区，其具有SEQ ID NO：38的序列；CD20表位，其具有SEQ ID NO：398的序列；CD8α铰链，其具有SEQ ID NO：320的序列；CD8α跨膜结构域，其具有SEQ ID NO：322的序列；4-1BB胞内信号传导结构域，其具有SEQ ID NO：323的序列；和CD3ζ胞内信号传导结构域，其具有SEQ ID NO：324的序列。
31.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含具有SEQ ID NO：318的序列的CD8α信号肽；VH区，其具有SEQ ID NO：33的序列；GS接头，其具有SEQ ID NO：333的序列；VL区，其具有SEQ ID NO：34的序列；CD8α铰链，其具有SEQID NO：320的序列；CD8α跨膜结构域，其具有SEQ ID NO：322的序列；4-1BB胞内信号传导结构域，其具有SEQ ID NO：323的序列；和CD3ζ胞内信号传导结构域，其具有SEQ ID NO：324的序列。
32.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含具有SEQ ID NO：318的序列的CD8α信号肽；VH区，其具有SEQ ID NO：33的序列；GS接头，其具有SEQ ID NO：333的序列；VL区，其具有SEQ ID NO：34的序列；CD20表位，其具有SEQID NO：398的序列；CD8α铰链，其具有SEQ ID NO：320的序列；CD8α跨膜结构域，其具有SEQID NO：322的序列；4-1BB胞内信号传导结构域，其具有SEQ ID NO：323的序列；和CD3ζ胞内信号传导结构域，其具有SEQ ID NO：324的序列。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述CAR-T细胞缺乏CD52。
34.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述CAR-T细胞缺乏TCRα和/或TCRβ。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述细胞的基因型为TCRαβ-和CD52+/-。
36.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述CAR-T细胞不表达安全开关(safety switch)。
37.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述CAR-T细胞表达利妥昔单抗(rituximab)表位。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述个体在施用所述至少一个剂量之前接受第一淋巴清除(lymphodepletion)方案。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述第一淋巴清除方案包含施用氟达拉滨(fludarabine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述第一淋巴清除方案包含施用氟达拉滨、环磷酰胺和抗CD52抗体。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述第一淋巴清除方案包含施用抗CD52抗体。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述第一淋巴清除方案包含仅施用抗CD52抗体。
43.根据权利要求38所述的方法，其中氟达拉滨的施用剂量为约30mg/m2/天；环磷酰胺的施用剂量为约300mg/m2/天；且所述CD52抗体的施用剂量为约10至约13mg/天。
44.根据权利要求40所述的方法，其中氟达拉滨的施用剂量为约30mg/m2/天；环磷酰胺的施用剂量为约300mg/m2/天；且所述CD52抗体的施用剂量为约13至约30mg/天、约13至20mg/天、约13至30mg/天、或约20至30mg/天。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述CD52抗体的施用剂量为约13mg/天、约20mg/
天、或约30mg/天。
46.根据权利要求36至45中任一项所述的方法，其中在施用所述至少一个剂量之前约1至15天之间开始所述第一淋巴清除方案。
47.根据权利要求36至46中任一项所述的方法，其中所述第一淋巴清除方案是在1、2、3、4或5天的过程中施用。
48.根据权利要求36至47中任一项所述的方法，其中，在3天的过程中，所述第一淋巴清除方案是在施用所述至少一个剂量之前5天施用。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的方法，其中所述个体接受所述CAR-T细胞的后续剂量。
50.一种包含BCMA CAR-T细胞的配制剂，其中所述细胞是在包含约5％二甲亚砜的溶液中配制，其中所述配制剂的剂量强度为14×10^6个细胞/mL，其中所述细胞的基因型为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-，且其中所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含胞外配体结合结构域、二个利妥昔单抗结合结构域、第一跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述胞外结构域包含scFv，所述scFv包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含表1的SEQ ID NO：33、72、39、76、83、92、25、112或8中所示的序列；和轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含表1的SEQ ID NO：34、73、40、77、84、93、18、38或80中所示的序列，其中所述第一跨膜结构域包含CD8α链跨膜结构域且其中所述胞内信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域和/或4-1BB信号传导结构域。
51.一种包含BCMA CAR-T细胞的配制剂，其中所述细胞是在
Figure RE-FDA0003249904760000071
Basal Solution和
Figure RE-FDA0003249904760000072
CS10的1:1混合物中配制，所述
Figure RE-FDA0003249904760000073
Basal Solution和
Figure RE-FDA0003249904760000074
CS10的1:1混合物导致最终浓度5％的二甲亚砜，其中所述配制剂的剂量强度为14×10^6个细胞/mL，其中所述细胞的基因型为BCMA-CAR+_TCRαβ-_CD52+/-，且其中所述BCMA CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含胞外配体结合结构域、二个利妥昔单抗结合结构域、第一跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述胞外结构域包含scFv，所述scFv包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含表1的SEQ ID NO：33、72、39、76、83、92、25、112或8中所示的序列；和轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含表1的SEQ ID NO：34、73、40、77、84、93、18、38或80中所示的序列，其中所述第一跨膜结构域包含CD8α链跨膜结构域且其中所述胞内信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域和/或4-1BB信号传导结构域。
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