CN114316050A - Cd133抗体、嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及CD133抗体、嵌合抗原受体及其应用。本发明所提供CD133抗体或其抗原结合片段对CD133具有较好的亲和力和特异性，且含有CD133抗体片段的嵌合抗原受体具有优秀的抗肿瘤效果。

Description

CD133抗体、嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及CD133抗体、嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

人CD133蛋白与鼠prominin-1(一种富集于神经上皮干细胞顶端表面微绒毛上的表面蛋白)有大约60％的同源性，故也称人CD133为人prominin-1。CD133是一个5次跨膜糖蛋白，最初于1997年作为CD34阳性造血干细胞上的表面抗原被AC133单抗靶定而被发现。与此同时测定其分子量约为97kDa，由865个氨基酸组成，包括85个氨基酸N端胞外域、5个跨膜区、2个大的胞外环(包含8个潜在的连接N端的糖基化位点)以及一个由50个氨基酸组成的胞内尾端。有研究表明AC133抗原是一个表观分子量为120kDa的糖基化蛋白。同年发现了另一个CD133糖基化表位-AC141。CD133抗原被认为是肿瘤干细胞(CSCs)的特异性标记物，在多种实体瘤中表达。CD133在肿瘤细胞中表达对癌症的发展具有重要意义，CD133+肿瘤起始细胞是多种侵袭性癌症中化学和放射耐药的已知标志物，可能会导致肿瘤异质性。

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)是人工合成的T细胞受体，由抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成。抗原结合结构域位于T细胞膜外，包括单链抗体或配体，用于特异性地结合靶抗原。胞内信号传导结构域位于T细胞膜内，用于向T细胞内传导信号以刺激T细胞产生免疫反应。

CAR-T能够特异性识别肿瘤细胞依赖于CAR分子细胞外结构域的scFv。然而，目前对于实体肿瘤，尤其是脑胶质瘤的CAR-T治疗，尚缺失理想的靶点选择。实体肿瘤的异质性使得现有的表达嵌合抗原受体的T细胞不能识别肿瘤组织内低表达或不表达所选抗原的肿瘤细胞，从而整体上对肿瘤细胞的杀伤能力仍然较弱。然而，CAR-T在实体肿瘤中，特别是脑胶质瘤的应用尚没有取得理想结果。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种能够特异性识别CD133的抗体或其抗原结合片段，其具有SEQ ID NO:1～3所示的重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及SEQ ID NO:4～6所示的轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。

本发明的第二目的在于提供一种嵌合抗原受体，其胞外域具有如上所述scFv。

本发明的第三目的在于提供一种分离的核酸，其能够表达如上所述抗体或其抗原结合片段，或如上所述的嵌合抗原受体。

本发明的第四目的在于提供含有如上所述核酸的载体。

本发明的第五目的在于提供宿主细胞，其含有如上所述的核酸或如上所述的载体，或表达有如上所述的嵌合抗原受体。

本发明的第六目的在于提供药用组合物，其包含如上所述的宿主细胞。

本发明所提供CD133抗体或其抗原结合片段对CD133具有较好的亲和力和特异性，且含有CD133抗体片段的嵌合抗原受体具有优秀的抗肿瘤效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例所提供的SEQ ID NO:11所代表的scFv与脑胶质母细胞瘤细胞的流式细胞仪检测结果图；(standard为商品化CD133兔抗人单抗，proteintech公司，货号18470)；

图2为本发明一个实施例所提供的SEQ ID NO:11所代表的scFv与脑胶质母细胞瘤细胞的ELISA结果图；standard为商品化CD133兔抗人单抗，proteintech公司，货号18470)。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。

本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2％，可以允许±0.1％范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1％、±2％、±5％等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10％的波动。

本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本发明中，术语“特异性结合”和“特异性地结合”是指抗体或其抗原结合片段对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10^-7M，例如大约小于10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或更强的亲和力(K_D)结合。

如本文所用，术语“互补性决定区”或“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，在本发明中采用Kabat等人所定义(Kabat等人，Sequences of proteins ofimmunological interest,5th Ed"US Department of Health and Human Services,NIH,1991,和后来的版本)。有三个重链CDR(HCDR)和三个轻链CDR(LCDR)。此处，取决于情况，术语“CDR”和“CDRs”用于指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。

如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是指包含能够结合抗原的胞外结构域、衍生自不同于衍生胞外结构域的多肽的多肽的跨膜结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。“嵌合抗原受体(CAR)”有时称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指可结合特定抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知在细胞中作为传输信号以引起生物过程的活化或抑制的结构域起作用的任何寡肽或多肽。

如本文所用，所述嵌合抗原受体中所包含的“区”或者“域”是指多肽中的一个区，其可以独立于其它区而折叠成为特定结构。这些“区”或者“域”可以是鼠源或其他动物源性的序列，优选为人源序列。

本发明涉及能够特异性识别CD133的抗体或其抗原结合片段，其具有SEQ ID NO:1～3所示的重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及SEQ ID NO:4～6所示的轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。

抗体或其抗原结合片段的变体也在本发明范围内，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列与SEQ ID NO:4～6所示互补决定区组合中的任一组相比，分别包含至多3个氨基酸的突变(例如1个、2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；优选地，所述突变为保守突变。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列与SEQ ID NO:1～3所示互补决定区组合中的任一组相比，分别包含至多3个氨基酸的置换(例如1个、2个或3个氨基酸置换)。

在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段为鼠抗体、人鼠嵌合抗体或人源化抗体。

在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段具有SEQ ID NO:7所示的重链可变区HCVR和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区LCVR。

在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区HCVR和轻链可变区LCVR，其中所述HCVR和LCVR的氨基酸序列与SEQ ID NO:7～8所示序列相比分别具有至少80％的同一性。在一些实施方式中，所述HCVR的氨基酸序列与SEQ ID NO:7所示的HCVR序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；所述LCVR的氨基酸序列与SEQ ID NO:8所示的LCVR序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在一些情况下，抗体或其抗原结合片段的变体至少包括上述6个CDR；在一些情况下，抗体的变体至少包括一个重链和一个轻链，而在其他情况下，变体形式含有两个相同的轻链和两个相同的重链(或其子部分)。在一些情况下，变体是在本发明所提供的抗体序列上发生保守突变(例如保守置换或修饰)所得到的。“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变，优选为保守置换。

“保守置换”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。

通常视为保守置换的置换是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此置换、羟基残基Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的置换、碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香残基Phe、Tyr间的置换。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。

修饰可以为通过天然过程(诸如加工和其他翻译后修饰)，或通过化学修饰技术所得到衍生物，例如通过添加一个或多个聚乙二醇分子、糖、磷酸酯和/或其他这样的分子来进行化学修饰，其中一个或多个分子不是天然地附着到蛋白质。衍生物包括盐。这样的化学修饰在基础教科书和更详细的专论中以及在大量研究文献中有详细描述，并且它们是本领域技术人员熟知的。应当理解，相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定抗体或其抗原结合片段中的几个位点。此外，给定的抗体或其抗原结合片段可以含有许多类型的修饰。修饰可发生在抗体或其抗原结合片段中的任何位置，包括肽骨架，氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲基化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚接、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白质酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、烃基化和ADP-核糖基化、硒化、硫酸化、蛋白质的氨基酸的传递RNA介导加成(诸如精氨酰化)以及泛素化。它们还可以结合至维生素，例如生物素、叶酸或维生素B12。参见例如Proteins--Structure And Molecular Properties,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993)和Wold,F.,“Posttranslational ProteinModifications：Perspectives and Prospects,”pgs.1-12in PosttranslationalCovalent Modification Of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York(1983)；Seifter等人.,MetH.Enzymol.182：626-646(1990)和Rattan等人,“ProteinSynthesis：Posttranslational Modifications and Aging,”Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-621992)。

变体保留特异性结合CD133的能力(优选能够特异性结合天然非变性CD133蛋白)。所属领域技术人员将能够使用熟知的技术确定如本文所阐明的抗原结合分子的合适变体。在某些实施方案中，所属领域技术人员可鉴别抗体或其抗原结合片段中对于特异性结合CD133的活性而言不重要的区来改变而不破坏活性的合适区域。对于核苷酸和氨基酸序列，术语“同一性”表明当具有适当的插入或缺失的情况下最佳比对和比较时两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。

“抗原结合片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab')₂、Fd、Fv、scFv、抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scFv-Fc等，优选地为scFv。

术语“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子，其保留结合抗原的能力。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-VL-连接肽-VH-COOH或NH₂-VH-连接肽-VL-COOH。

连接肽通常是柔性的，柔性的连接肽可以减少融合蛋白与目的蛋白之间的空间位阻，从而更有利于蛋白正确折叠。在另外的实施方案中，连接肽是刚性接头肽；即相对非柔性肽接头。刚性连接肽不要求完全缺乏柔性，而是比柔性接头肽如富甘氨酸肽接头柔性少。由于其相对缺乏柔性，刚性连接肽降低通过刚性连接肽连接在一起的两个蛋白结构域(在当前情况下是稳定剂蛋白和热稳定逆转录酶)的运动。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸数目为1～30个；可以是1，2，3，4，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个；优选5～20个。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸是不具有除连接以外的额外功能(例如蛋白定位、酶切位点等)的无意义多肽。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自Gly、Ser、Pro、Ala以及Glu中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自(GGGGS)n、(GGGS)n、(GGS)n、(GS)n或(G)n，其中n选自1，2，3，4，5或6。

在一些实施方式中，所述scFv的连接肽序列为SEQ ID NO:9所示。

根据本发明的再一方面，还涉及嵌合抗原受体，其胞外域具有如上所述的scFv。

在一些实施方式中，所述的嵌合抗原受体还包含铰链区、跨膜域和胞内信号传导区。

在一些实施方式中，所述铰链区选自CD8α的hinge区。

跨膜域可以选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和NKG2C中的一种。在一些实施方式中，所述跨膜域为CD8α跨膜区。

在一些实施方式中，所述胞内信号传导区包括CD3ζ信号传导域。

在一些实施方式中，所述胞内信号传导区还包含CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、CD40-MyD88、DAP12、DAP10、2B4中的一种或多种。

根据本发明的再一方面，还涉及分离的核酸，其能够表达得到如上所述抗体或其抗原结合片段，或如上所述的嵌合抗原受体。

根据本发明的再一方面，还涉及含有如上所述核酸的载体。

术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

载体也可以为组合物，例如，可以将不同区段的不同核酸位于不同载体上。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体或CRISPR/CAS质粒。

根据本发明的再一方面，还涉及宿主细胞，其含有如上所述的核酸或如上所述的载体，或表达有如上所述的嵌合抗原受体。

在一些实施方式中，所述的宿主细胞为免疫细胞。

免疫细胞例如T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞等。

在一些实施方式中，所述的宿主细胞为T细胞。

T细胞可以为本领域所熟知的亚类，例如辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、MAIT细胞、γδT细胞中的任一种。

根据本发明的再一方面，还涉及药用组合物，其包含如上所述的宿主细胞。

所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载剂。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括当与活性组分组合时允许所述组分保持生物学活性并且与受试者的免疫系统不发生反应的任何材料。实例包括但不限于标准药物载剂(诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水乳液))和各种类型的润湿剂中的任一者。用于气雾剂或肠胃外施用的示例性稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(0.9％)盐水。包含此类载剂的组合物通过熟知的常规方法来配制(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，A.Gennaro编,Mack PublishingCo.,Easton,PA,1990；和Remington,The Science and Practice ofPharmacy,第21版,Mack Publishing,2005)。

根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的宿主细胞(特别是T细胞)在制备用于预防和/或肿瘤的药物中的应用。

根据本发明的再一方面，还涉及一种治疗有需要的患者的肿瘤的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的如上所述的宿主细胞或药用组合物。

肿瘤优选实体瘤，在本发明中，“实体瘤”包括：骨、骨连接、肌肉、肺、气管、心脏、脾脏、动脉、静脉、毛细血管、淋巴结、淋巴管、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛门、阑尾、肝、胆、胰腺、腮腺、舌下腺、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、外阴部、阴囊、睾丸、输精管、阴茎、眼、耳、鼻、舌、皮肤、脑、脑干、延髓、脊髓、脑脊液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺、性腺、舌下腺以及腮腺中任一处病变生成的肿瘤。特别地，优选预期的肿瘤所具有的标志物可被本发明所提供的CD133抗体或其结合片段所靶向，例如脑胶质瘤。

应该理解的是，设想的治疗方法还将包括施用其他免疫治疗实体，特别优选为免疫治疗实体，包括病毒癌症疫苗(例如，编码癌症特异性抗原的腺病毒载体)、细菌癌症疫苗(例如，表达一种或多种癌症特异性抗原的非热原性大肠杆菌)、酵母癌症疫苗、N-803(也被称为ALT-803，ALTOR生物科学公司)、和抗体(例如，与肿瘤相关抗原或患者特异性肿瘤新抗原结合)、干细胞移植物(例如，异体或自体)和肿瘤靶向细胞因子(例如，NHS-IL12，IL-12与肿瘤靶向抗体或其片段偶联)。

“患者”是哺乳动物，哺乳动物包括但不限于人、猴子、猪和其他农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、啮齿动物(包括小鼠、大鼠、豚鼠)等。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

实施例1

本实施例用于说明CD133抗体的制备。

1.培养杂交瘤细胞

复苏杂交瘤细胞株后培养，待细胞数扩增至约1×10⁷时，1000rpm×5min，离心收集细胞。

2.提取细胞RNA

超净工作台环境下，将1ml Trizol试剂加入离心细胞，静置5min，加入氯仿2mL，剧烈摇晃15sec，室温静置3min，12000rpm×15min，移取上层水样层至新的EP管，加入0.5mL异丙醇，室温静置10min。12000rpm×10min。弃上清，加入1mL 75％乙醇，7500rpmx5 min，干燥沉淀，加入50μL双蒸水。琼脂糖电泳鉴定纯度并定量，保存于-70℃备用。

3.反转录制备cDNA

细胞总RNA1μL，RNase Free ddH₂O 6μL，oligo dT Primer 0.5μL，PRIME ScriptRT Enzyme Mix I 0.5μL，5×Prime Script Buffer 2μL，混匀，37℃15min，85℃5s。

4.扩增cDNA

用公本司设计的小鼠IgG HCVR LCVR引物库，分别扩增上述cDNA。5×Prime StarBuffer 10μL，dNTP 4μL，cDNA 1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，PrimeSTAR 0.5μL，补水至50μL。按以下反应条件进行PCR反应:94℃温育5min，94℃变性45s，63℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸10min。

5.琼脂糖凝胶电泳及胶回收

将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果，将分子量在250-350bp的扩增产物送交测序。

所得抗体命名为2E1，测序得到CD133抗体重链可变区(HCVR)氨基酸序列：

EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATITGGGTYTYYPDSMEGRFTISRDNAKNTLYLKMSSLRSEDTAMYYCARRHTVVPHWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:7)

CD133抗体轻链可变区(LCVR)氨基酸序列：

DVVMTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK(SEQ ID NO:8)

实施例2

本实施例用于说明嵌合抗原受体表达载体的构建。

(1)采用全序列合成方法，合成靶向CD133 scFv分子的核苷酸片段(SEQ ID NO:10所示，其对应的蛋白质序列如SEQ ID NO:11所示)，

(2)采用常规方法插入步骤(1)中合成的核苷酸序列构建质粒过表达载体。

实施例3

本实施例用于说明本案例中的重组抗CD133单链抗体对脑胶质瘤肿瘤干细胞的结合活性。

(1)将实施例2中构建的质粒过表达载体按照下述方法进行大肠杆菌的转染、扩增以及蛋白质纯化。

(2)蛋白表达与纯化流程：

将构建好的质粒转化BL21 DE3感受态细胞，接种抗性LB平板培养基，生长过夜；挑选转化平板的6个单克隆，分别接种3ml抗性液体培养基；37℃，220RPM培养至OD600nm 0.5-0.6，加入0.5mM IPTG 20℃诱导表达3.5小时；离心收集菌体，超声破碎，SDS-PAGE检测表达情况。小样表达结果分析：蛋白质在上清和包涵体中均有表达，可继续进行可溶性表达纯化。

选择小样表达良好的菌株进行大样表达。接种60ul菌种至200ml抗性培养基中，37℃，220RPM培养过夜。次日加入新鲜抗性培养基至800ml，培养1-2h至OD600nm 0.5-0.6。加入200ul的1M IPTG(28℃或37℃)诱导表达3.5h。4℃离心收集菌体(66转/秒×15min)，弃上清，加入30ml PBST悬浮菌体，加入终浓度1mM PMSF，冰浴条件下超声波200W破碎6min。摇床4℃孵育1h。4℃高速离心，133转/秒×15min，取上清，加入400ul镍柱4℃结合过夜。收集镍柱(33转/秒×5min)，用20mM imidazole洗涤液洗涤beads，洗去杂蛋白(1ml×3次)。加入300ul 300mM imidazole洗脱液，让洗脱液与beads充分结合1h，离心收集上清。向beads中再次加入300ul的洗脱液，洗脱1h，离心收集上清，两次洗脱液合为一管。对PBS缓冲液透析换液。SDS-PAGE鉴定蛋白质分子量，纯度及浓度。大样表达结果分析：目标蛋白质为可溶性上清表达，总量2mg。

(3)通过倍比稀的方法对scFv进行稀释并与脑胶质瘤细胞株进行结合。具体方法为：将原浓度为10ug/ml的scFv按照4倍进行倍比稀释，并设立1ug/ml作为标准工作浓度。同时作为对比，选用商品化小鼠抗人CD133抗体(proteintech)进行相同浓度的对照实验。浓度梯度，10、2.5、1、0.625、1.6、0.04、0.01ug/ml。不同浓度抗体溶液体积均为100ul，重悬10⁵个脑胶质瘤细胞。室温孵育20分钟。此后，用1ml PBS重悬，1000g离心5分钟，去上清，保留细胞沉淀。再次用1ml PBS重悬，1000g离心5分钟，去上清，保留细胞沉淀。此后，用100ulPBS重悬细胞，加入1ul APC标记的山羊抗小鼠/兔H+L抗体(abcam)，室温避光孵育20分钟。用1ml PBS重悬，1000g离心5分钟，去上清，保留细胞沉淀。再次用1ml PBS重悬，1000g离心5分钟，去上清，保留细胞沉淀。此后，用500ul PBS重悬细胞，上机检测各个scFv浓度处理下肿瘤干细胞APC的荧光强度。实验结果如图1所示。

(4)通过倍比稀的方法对scFv进行稀释并与重组人CD133蛋白进行结合。具体做法为：用ELISA包被液(solarbio)稀释重组人CD133蛋白(sino biological)至1ug/ml，4℃过夜包被96孔板。次日吸去液体，每个孔用300ul PBS清洗3次。每孔用2％FBS的PBS溶液室温封闭30分钟。加入scFv及商品化小鼠抗人CD133抗体(proteintech)。通过倍比稀释的方法进行2倍稀释。浓度梯度，5、2.5、1.25、0.625、0.03、0.015、0.08、0.04、0.02、0.01ug/ml。每孔100ul，室温孵育1小时。弃上清，每个孔用300ul PBS清洗3次。每孔加入100ul 1:1000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠H+L抗体(abcam)，室温孵育1h。弃上清，每个孔用300ul PBS清洗3次。每孔加入100ul ELISA显影剂(solarbio)，室温避光15分钟，加入100ul ELISA终止液(solarbio)，450nm波长下检测吸光度。实验结果如图2所示。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京市神经外科研究所

<120> CD133抗体、嵌合抗原受体及其应用

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 2

Ile Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Thr

1 5

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 3

Ala Arg Arg His Thr Val Val Pro His Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 4

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 5

Tyr Leu Val Ser

1

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 6

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg

1 5 10 15

Ser Glu Gly Gly

20

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 7

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Lys Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Thr Val Val Pro His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 8

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg

85 90 95

Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys

100 105

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 9

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 10

<211> 768

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 10

catcatcacc atcaccatag tggtggtggt ggttctgaag tgatgctggt ggagtctggg 60

ggaggcttag tgaagcctgg agggtccctg aaactctcct gtgcggcctc tggattcact 120

ttcagtaact atgccatgtc ttgggttcgc cagactccgg agaagaggct ggagtgggtc 180

gcaaccatta ctggtggtgg tacttacacc tactatccag acagtatgga ggggcgattc 240

accatctcca gagacaatgc caagaacacc ctgtacctga aaatgagcag tctgaggtct 300

gaggacacag ccatgtatta ctgtgcaaga cggcatacgg tagtccctca ctggtacttc 360

gatgtctggg gcgctgggac cacggtcacc gtctcctcgg gtggcggcgg tagcggtggc 420

ggtggtagtg gtggtggcgg tagcgatgtt gtgatgaccc agtctcctgc ttccttagct 480

gtatctctgg ggcagagggc caccatctca tacagggcca gcaaaagtgt cagtacatct 540

ggctatagtt atatgcactg gaaccaacag aaaccaggac agccacccag actcctcatc 600

tatcttgtat ccaacctaga atctggggtc cctgccaggt tcagtggcag tgggtctggg 660

acagacttca ccctcaacat ccatcctgtg gaggaggagg atgctgcaac ctattactgt 720

cagcacatta gggagcttac acgttcggag gggggaccaa gctggaaa 768

<210> 11

<211> 256

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 11

His His His His His His Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Met Leu

1 5 10 15

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu

20 25 30

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp

35 40 45

Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr

50 55 60

Gly Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met Glu Gly Arg Phe

65 70 75 80

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Lys Met Ser

85 90 95

Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His

100 105 110

Thr Val Val Pro His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

115 120 125

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

145 150 155 160

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser

165 170 175

Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro

180 185 190

Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser

195 200 205

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

210 215 220

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys

245 250 255

Claims (10)

1.能够特异性识别CD133的抗体或其抗原结合片段，其具有SEQ ID NO:1～3所示的重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及SEQ ID NO:4～6所示的轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其为鼠抗体、人鼠嵌合抗体或人源化抗体。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其具有SEQ ID NO:7所示的重链可变区HCVR和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区LCVR。

4.根据权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为scFv。

5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，所述scFv的连接肽序列为SEQ IDNO:9所示。

6.嵌合抗原受体，其胞外域具有权利要求4或5中所述scFv；

优选的，所述的嵌合抗原受体，其还包含铰链区、跨膜域和胞内信号传导区。

7.分离的核酸，其能够表达得到权利要求1～5任一项所述抗体或其抗原结合片段，或权利要求6所述的嵌合抗原受体。

8.含有权利要求7所述核酸的载体。

9.宿主细胞，其含有权利要求8所述的核酸或权利要求9所述的载体，或表达有权利要求6所述的嵌合抗原受体；

优选的，所述的宿主细胞为T细胞。

10.药用组合物，其包含权利要求9所述的宿主细胞。

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