TWI472343B - 抗－間皮素的免疫接合物及其用途 - Google Patents

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Description

抗-間皮素的免疫接合物及其用途
本發明提供一種免疫接合物，其包含對間皮素蛋白質具有特異性之抗體或其片段，及醫療劑。此等免疫接合物之組合物可用於治療、預防或診斷與間皮素相關之病變，例如：癌症。
癌症之發生最常與老化有關，其中所有癌症新病例之65%患者為65歲及以上。癌症為美國第二大死因，僅次於心臟病。事實上，美國癌症學會估計，如果依據目前死亡率，每四位美國人即有一位死於癌症。單在美國一地，2008年即有1,437,180位新病例及565,650位死亡例。
已證實以抗體為主之療法極有效治療各種不同癌症，包括實體腫瘤。例如：HERCEPTIN已成功用於治療乳癌。發展以抗體為主之成功療法之中心在於單離對抗細胞表面蛋白質之抗體，已發現該細胞表面蛋白質優先表現在腫瘤細胞上。間皮素前體多肽為利用配糖磷脂醯肌醇(GPI)固定之糖基化細胞表面蛋白質，其可經蛋白質水解裂解成30 kDa N-末端分泌多肽及40 kDa之C-末端多肽，其主要呈與膜結合之利用GPI固定之型式(Chang,K.及I. Pastan,Proc. Natl. Acad. Sci. U S A,(1996) 93(1):136)，其在本文中稱為間皮素。間皮素優先表現在某些腫瘤細胞中，特定言之，間皮瘤細胞、胰臟腫瘤細胞及卵巢癌瘤細胞，但其於正常組織中之表現卻很有限，使其成為發展腫瘤療法時之吸引人之目標(Argani,P.等人之Clin. Cancer Res.(2001) 7(12)：3862；Hassan,R.,等人之Clin. Cancer Res.(2004) 10(12 Pt 1):3937)。間皮素之功能尚未知，且在間皮素基因表現缺陷之小鼠中沒有觀察到顯著之繁殖、血液或解剖學上之異常(Bera,T.K.及I. Pastan,Mol. Cell. Biol.(2000) 20(8):2902)。
已有文獻提出以抗體為主之對抗表現間皮素之癌症細胞之標靶療法，供治療肺、卵巢及胰臟癌症。Mab K1為已說明之針對與膜結合之間皮素多肽之第一抗體(Chang,K.等人之Int. J. Cancer,(1992) 50(3):373)。Mab K1係由免疫小鼠產生。由於抗體之親和性低及內化率差，因此認為由與假單胞素外毒素A之化學修飾截短型聯結之Mab K1組成之免疫毒素並不適合臨床發展(Hassan,R.等人之J.免疫ther.(2000) 23(4):473；Hassan,R.等人之Clin. Cancer Res.(2004) 10(12 Pt 1)：3937)。隨後發展具有較高親和性之單鏈抗體，包括SS1-(dsFv)-PE38，其在活體外展現消滅腫瘤細胞活性(Hassan,R.等人之Clin. Cancer Res.(2002) 8(11)：3520)及在囓齒類模式之表現人類間皮素腫瘤中展現效力(Fan,D.等人之Mol. Cancer Ther.(2002) 1(8)：595)。此等數據證實間皮素為發展治療多種癌症之免疫療法之吸引人之標靶。已知SS1-(dsFv)-PE38具有快速之血液清除率，且已有文獻試圖利用聚乙二醇化融合蛋白質提高分子量(Filpula,D.等人之Bioconjugate Chem.(2007) 18(3)：773)。
MS-1、MS-2及MS-3為與間皮素結合之抗體，由於其人類IgG1同型及其內化進入表現間皮素之細胞，因此會誘發細胞表面之免疫效應子活性(WO 2006/099141 A2)。其中一種抗體為未接合之嵌合性(小鼠/人類)IgG1抗間皮素抗體MORAb 009，目前已於臨床試驗中測試其於治療胰臟癌上之醫療效果。推斷之MORAb 009作用機轉為啟動免疫效應子(如ADCC)功能及阻斷功能。
相關技藝極需要具有對抗攻擊性癌症(如：卵巢癌、胰癌及肺癌)之改善效力之新穎療法，且將可代表相關技藝上之一大進步。因此，本發明揭示一種適用於治療、預防與/或診斷與間皮素相關之病變(例如：癌症)之新穎免疫接合物組合物。
本發明係有關一種包含與間皮素結合之抗體(例如：單株抗體)或其片段之免疫接合物，其可接合細胞毒性劑(例如：美登素類化合物(maytansinoids)或其衍生物)，及/或使用一種或多種其他抗癌劑共同投藥或調配。本發明免疫接合物可用於治療與/或診斷與/或追蹤與間皮素相關之病變，例如：癌症。本發明之目的在於提供一種免疫接合物，其包含對40 kDa之間皮素前體多肽C-末端細胞外部份具有高度選擇性且在癌症抗原125(CA125；MUC16)之存在下時仍會結合間皮素之抗體、或其抗原-結合性抗體片段或其變異體，及效應子部份。該間皮素抗體之特別性質已說明於PCT/EP2008/009756，且本發明之一項態樣中，由其在CA125之存在下與間皮素特異性免疫反應之特殊能力與一種細胞毒性劑(例如：美登素類化合物)接合之組合作法可提供一種比會與CA125競爭結合間皮素之功能性阻斷抗體具有更改善之效力。
一項態樣中，本發明抗體或其片段為IgG抗體或IgG片段。該抗體或片段亦可為IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA或IgM抗體、Fab片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體、生物特異性抗體、多重特異性抗體或嵌合抗體(例如：包含與人類或非人類抗體結合區連接之人類抗體架構，或與人類或非人類抗體結合區連接之非人類抗體架構)。該嵌合抗體可包括例如：來自非人類來源之抗體架構區，如，例如：牛、小鼠、羊駝、駱駝或兔子。其他有關抗體工程之資料可參見文獻，例如：Holliger及Hudson,Nature Biotechnology,(Sep,2005) 23：1126-1136，其揭示內容已以引用方式併入本文中。上述片段可由免疫球蛋白製得或採用合適方式(例如：重組表現法)製成片段型。
本發明抗體或抗體片段亦可擬人化，其中CDR序列或區(例如：CDR1、CDR2、CDR3)可為非人類，例如：囓齒類。
本發明抗體或抗體片段或包括該抗體或片段之組合物可包括會與抗體或其片段接合之細胞毒性劑。一項態樣中，該細胞毒性劑為美登素類化合物或其衍生物，然而，亦可提供其他細胞毒性劑，其可包括，例如：其他細胞毒性劑，例如：艾利定(aplidin)、奧利斯汀(auristatin)、阿扎立平(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、氮胞苷(azacytidine)、博來黴素(bleomycin)、硼替左米(bortezomib)、苔藓蟲素(bryostatin-1)、白消安(busulfan)、刺孢黴素(calicheamycin)、喜樹鹼(camptothecin)、10-羥基喜樹鹼(10-hydroxycamptothecin)、卡氮芥(carmustine)、希樂葆(celebrex)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、伊立替康(irinotecan)(CPT-I 1)、SN-38、卡鉑(carboplatin)、克拉屈濱(cladribine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、多烯紫杉醇(docetaxel)、放線菌素(dactinomycin)、道諾黴素葡萄糖苷酸(daunomycin glucuronide)、柔紅黴素(daunorubicin)、地塞米松(dexamethasone)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、多柔比星(doxorubicin)、多柔比星葡萄糖苷酸(doxorubicin glucuronide)、表阿黴素葡萄糖苷酸(epirubicin glucuronide)、炔雌醇(ethinyl estradiol)、雌氮芥(estramustine)、依替泊苷(etoposide)、依替泊苷葡萄糖苷酸(etoposide glucuronide)、依替泊苷磷酸鹽(etoposide phosphate)、氟尿苷(floxuridine)(FUdR)、3',5'-O-二油醯基-FudR(FUdR-dO)、弗達拉濱(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、福美多能(fluoxymesterone)、吉西他濱(gemcitabine)、己酸羥孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、羥基脲(hydroxyurea)、去甲氧柔紅黴素(idarubicin)、伊達比星(ifosfamide)、L-天冬醯胺酶(L-asparaginase)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、洛莫司汀(lomustine)、氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、安宫黃体酮(medroprogesterone acetate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、美法侖(melphalan)、氫硫基嘌呤、6-氫硫基嘌呤、甲胺蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、米拉黴素(mithramycin)、絲裂黴素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、丁酸苯酯、潑尼松(prednisone)、甲基苄肼(procarbazine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、噴妥司汀(pentostatin)、PSI-341、司莫司汀(semustine)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉烷(taxanes)、紫杉醇(taxol)、丙酸睾固酮(testosterone propionate)、沙利竇邁(thalidomide)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、噻替哌(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、拓撲替康(topotecan)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、萬珂(velcade)、長春鹼(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、長春新鹼(vincristine)、蓖麻毒素(ricin)、相思豆毒蛋白(abrin)、核糖核酸酶(ribonuclease)、豹蛙酶(onconase)、rapLR1、DNase I、葡萄球菌腸毒素-A(Staphylococcal enterotoxin-A)、美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、花白樹毒蛋白(gelonin)、白喉毒素(diphtheria toxin)或其組合。任何細胞毒性劑亦可包括其功能類似物或其衍生物。
另一態樣中，本發明提供一種免疫接合物，其中細胞毒性劑為非免疫原性，亦即不會因為提供人類或哺乳動物B細胞抗原決定基或T細胞抗原決定基給藥物調配物而提高親本抗體之免疫原性。
本發明組合物除了該等抗體及片段(含或不含上述接合細胞毒性劑)外，亦可包含各種不同抗癌劑，其可包括例如：博來黴素、多烯紫杉醇(Taxotere),多柔比星、乙基去氮胺蝶呤(edatrexate)、厄羅替尼(erlotinib)(Tarceva)、依替泊苷、柔沛(finasteride))(Proscar)、氟他胺(Eulexin)、吉西他濱(Gemzar)、吉非替尼(genitinib)(Lrresa)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)(Zoladex))、格拉司瓊(granisetron)(Kytril)、伊馬替尼(imatinib)(Gleevec)、伊立替康(Campto/Camptosar)、奧丹亞龍(ondansetron)(Zofran)、太平洋紫杉醇(Taxol)、培門冬酶(pegaspargase)(Oncaspar)、鹽酸毛果芸香鹼(pilocarpine hydrochloride)(Salagen)、卟吩姆鈉(porfimer sodium)(Photofrin)、介白素-2(Proleukin)、利妥昔單抗(rituximab)(Rituxan)、拓撲替康(Hycamtin)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin)、奇抑平(Triapine)、長春新鹼及長春瑞濱酒石酸鹽(Navelbine)或其醫療抗體或片段，或抗血管新生劑，如，例如：血管抑素(angiostatin)、貝伐珠單抗(bevacizumab)(Avastin)、索拉非尼(sorafenib)(Nexavar)、桿抑素(baculostatin)、血管能抑素(canstatin)、乳腺絲抑蛋白(maspin)、抗VEGF抗體或肽、抗胎盤生長因子抗體或肽、抗Flk-1抗體、抗Fit-1抗體或肽、層黏連蛋白肽、纖維結合蛋白肽、血纖維蛋白溶解酶原活化劑抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、介白素12、IP-IO、Gro-β、血小板反應蛋白、2-甲氧雌二醇、增生相關蛋白質、羧胺三唑(carboxiamidotriazole)、CMlO1、馬立馬司他(Marimastat)、聚戊醣(pentosan polysulphate)、促血管生成素2、干擾素-α、除莠霉素(herbimycin)A、PNU145156E、16K催乳激素片段、三羧胺基喹啉(Linomide)、沙利竇邁、己酮可可鹼、大豆異黃酮(genistein)、TNP-470、內皮抑素(endostatin)、太平洋紫杉醇、百步蛇蛇毒蛋白(accutin)、西多福韋(cidofovir)、長春新鹼、博來黴素、AGM-1470、血小板因子4或米諾環素(minocycline)。
本發明另一態樣進一步提供一種治療間皮素相關病變之方法，其係投與醫療有效量之本發明免疫接合物或包含本發明免疫接合物之本發明組合物。該間皮素相關病變可包括例如：癌症，如：實體腫瘤癌症。實體腫瘤可發生於或源於卵巢、胰臟、呼吸道、肺臟、結腸、胃、食道、子宮頸、肝臟、乳房、頭及頸。
下列詳細說明揭示此等及其他具體實施例，或由下列詳細說明了解此等及其他具體實施例，及下列詳細說明包括此等及其他具體實施例。
本發明係基於發現對間皮素具有特異性及高親和性且可傳送醫療效益給個體之新穎免疫接合物。本發明免疫接合物可用於許多方面，其將於本文中更詳細說明。咸了解，本發明並不限於本文在任何本發明態樣中特別詳細說明之內容，包括所說明之抗間皮素抗體、免疫接合物、治療方法、製程、細胞株、動物物種或屬種、構築體及試劑，因此其等可能變化。亦咸了解，本文所採用名詞僅為了說明特定具體實施例，並無意限制本發明範圍。
定義
除非另有說明，否則本文所採用所有技術及科學術語均具有習此本發明相關技藝之人士習知之定義。然而，下列參考文獻可為習此本發明相關技藝之人士提供本發明所採用許多術語之一般定義，且只要此等定義符合相關技藝上咸了解之定義，即可於本文中提及且使用。。此等參考文獻包括(但不限於)：Singleton等人之”微生物與分子生物學辭典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)”(第2版，1994)；”劍橋科技辭典(The Cambridge Dictionary of Science and Technology)”(Walker編輯，1988)；Hale & Marham,“哈伯-柯林生物辭典(The Harper Collins Dictionary of Biology)”(1991)；及Lackie等人之”細胞與分子生物學辭典(The Dictionary of Cell & Molecular Biology)”(第3版，1999)；及”細胞與分子免疫學(Cellular and Molecular Immunology)”,Abbas,Lichtman及Pober編輯，第2版，W.B. Saunders Company。亦可參考任何其他可提供本文所採用術語之定義之習此相關技藝之人士可取得之技術來源。為了本發明之目的，進一步定義下列術語。其他術語則如說明書中其他任何一處之定義。本文及附錄之申請專利範圍所採用單數型"一個"、"與"及"該"包括複數型，除非本文中另有詳細指示。因此例如：提及"一種基因"時，意指一種或多種基因，且包括習此相關技藝之人士習知之其同等物，等等。
本文所採用術語"抗體"包括自天然單離或採用重組方式製備之免疫球蛋白分子(例如：任何型態，包括IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY，與/或任何種類，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及Ig A2)。抗體亦包括抗原-結合性抗體片段，如：Fab、F(ab')2、scFv(單鏈Fvs)、Fv、單鏈抗體、雙功能抗體、二硫鍵連之Fvs(sdFv)及包含VL或VH功能域之片段，其係由完整之免疫球蛋白製備或採用重組方式製備。。
本發明抗體與/或抗原-結合性抗體片段可為單特異性(例如：單株)、雙特異性、三特異性或較多重特異性。多重特異性抗體可針對抗原之不同抗原決定基或可針對超過一種抗原之抗原決定基。參見例如：PCT公告案WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人之1991,J. Immunol. 147:60 69；美國專利案案號4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny等人之1992,J. ImmunoL 148:15471553，其各揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
抗原-結合性抗體片段可單獨包含可變區(群)或與下列完整或一部份功能域組合：樞紐區域、CH1、CH2、CH3及CL功能域。本發明亦包括抗原-結合性抗體片段，其中亦包含可變區(群)與樞紐區域、CH1、CH2、CH3及CL功能域之任何組合。
較佳者，該抗體或抗原-結合性抗體片段為人類、擬人化、囓齒類(例如：小鼠及大鼠)、猴子、綿羊、兔子、山羊、天竺鼠、羊駝、馬或雞。本文所採用"人類"抗體包括具有人類免疫球蛋白胺基酸序列之抗體，且包括自人類免疫球蛋白集合庫、人類B細胞或自轉殖一種或多種人類免疫球蛋白之動物單離之抗體，其說明於下文及例如：Kucherlapati等人之美國專利案案號5,939,598。術語抗體亦延伸至其他可以指揮抗體CDR嵌入與天然抗體相同之活性結合構型中之蛋白質架構，使此等嵌合蛋白質所觀察到標靶抗原之結合性維持在相當於衍生該CDR之天然抗體之結合活性下。本文所採用術語非人類(例如：囓齒類)抗體之"擬人化"型係指包含衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列之嵌合抗體。大部份擬人化抗體為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體之高度可變區殘基(例如：互補決定區"CDR")被來自非人類物種(供體抗體)(如：小鼠、大鼠、兔子或非人類靈長類)且具有所需特異性、親和性及能力之高度可變區殘基(CDR)置換。有些例子中，人類免疫球蛋白之框架區(FR)殘基可被相應之非人類殘基置換。此外，擬人化抗體可包含不會出現在受體抗體或供體抗體中之殘基。此等修飾法可進一步改善抗體性能。通常，擬人化抗體可包含實質上所有至少一個或典型為兩個可變功能域，其中所有或實質上所有高度可變區相當於彼等非人類免疫球蛋白，且所有或實質上所有FR為彼等人類免疫球蛋白序列。擬人化抗體亦可視需要含至少一部份免疫球蛋白恆定區(Fc)，典型為人類免疫球蛋白之恆定區。其概述可參見Jones等人之(Nature 321:522-525,1986)；Reichmann等人之(Nature 332:323-329,1988)；及Presta之(Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596,1992)。擬人化抗體之製法可參見美國專利案案號7,049,135、6,828,422、6,753,136、6,706,484、6,696,248、6,692,935、6,667,150、6,653,068、6,300,064、6,294,353及5,514,548，其各揭示內容已分別以引用方式併入本文中。
本文所採用術語"單鏈Fv"或"sFv"抗體片段包括抗體之VH及VL功能域，其中此等功能域出現在單一多肽鏈上。通常，Fv多肽進一步在VH及VL功能域之間包含多肽連接基，其可以讓sFv形成結合抗原所需之結構。其概述可參見Pluckthun之”單株抗體藥理學(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)”，Vol. 113,Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag,New York,pp. 269-315,1994)，其揭示內容已以引用方式完全併入本文中。
術語"雙功能抗體"係指具有兩個抗原-結合位點之小型抗體片段，該片段包含與相同多肽鏈(VH-VL)上之輕鏈可變功能域(VL)連接之重鏈可變功能域(VH)。利用短至無法使相同鏈上兩個功能域之間配對之連接基可迫使功能域與另一條鏈之互補功能域配對，創造兩個抗原-結合性位點。雙功能抗體更詳細說明於例如：EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人之(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448,1993)，其揭示內容已以引用方式併入本文中。
"線性抗體"之說法係指相關技藝中說明之抗體，例如：Zapata等人之(Protein Eng. 8(10)：1057-1062,1995)，其揭示內容已以引用方式併入本文中。簡言之，此等抗體包含一對串聯Fd片段(VH-CHI-VH-CHI)，形成一對抗原結合區。線性抗體可為雙特異性或單特異性。
本文所採用術語"單株抗體"係指來自實質上均質抗體族群之抗體，亦即個別抗體10中除了可能天然存在少量之突變以外，均包含相同之族群。單株抗體具高度特異性，亦即針對單一抗原位點。此外，與典型包括針對不同決定基(抗原決定基)之不同抗體之一般(多株)抗體族群相反，各單株抗體僅針對抗原上單一決定基。修飾語"單株"意指該抗體之特徵在於其係自實質上均質之抗體族群中得到，不需要採用任何特殊方法製造該抗體。例如：根據本發明所採用之單株抗體可依Kohler等人之(Nature 256:495,1975)首先說明之雜化瘤方法製得，或可採用重組DNA方法(參見例如：美國專利案4,816,567)。單株抗體亦可自噬菌體抗體集合庫，採用例如：Clackson等人之(Nature 352:624-628,1991)及Marks等人之(J. MoI. Biol. 222:581-597,1991)說明之方法製造。
本文之單株抗體亦包括"嵌合"抗體，其中一部份重鏈與/或輕鏈與衍生自持定物種之抗體中相應序列相同或同源，或屬於該特定抗體類或亞類，而其餘鏈(群)則與衍生自另一物種之抗體中相應序列相同或同源，或屬於另一抗體類或亞類，及此等抗體之片段，只要其具有所需之生物活性(參見例如：美國專利案4,816,567；及Morrison等人之Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855,1984，其各揭示內容已分別以引用方式併入本文中)。
本文所採用術語"生物樣本"或"患者樣本"係指來自生物體或生物體之組份(例如：細胞)之樣本。該樣本可為任何生物組織或液體。樣本可為衍生自患者之"臨床樣本"。此等樣本包括(但不限於)：痰、血液、血清、血漿、血液細胞(例如：白血球細胞)、組織樣本、生物檢體、尿液、腹腔液及胸腔積液、唾液、精液、乳頭溢液、腦脊髓液、淚液、黏膜、淋巴液、細胞內液、腹水、羊水、膀胱沖洗液及細支氣管肺泡灌洗液或其中之細胞，特別指體液樣本。患者樣本可為新鮮或冷凍，且可經過肝素、檸檬酸鹽或EDTA處理。生物樣本亦可包括組織切片，如針對組織學取用之冷凍切片。
術語"癌症"包括(但不限於)：實體腫瘤，如：胰臟、乳房、呼吸道、腦、生殖器官、消化道、尿道、眼睛、肝臟、皮膚、頭與頸、甲狀腺、副甲狀腺之癌症，及其遠距轉移。該術語亦包括肉瘤、淋巴瘤、白血病及漿細胞骨髓瘤。
呼吸道腫瘤包括(但不限於)：小細胞及非小細胞肺癌瘤，及支氣管腺瘤與胸膜肺母細胞瘤。乳房腫瘤包括(但不限於)：浸潤性導管癌瘤、浸潤性小葉癌瘤、原位導管癌瘤及原位小葉癌瘤。腦腫瘤包括(但不限於)：腦幹及下視丘膠質瘤、小腦與腦星形細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤，及原始神經外胚層瘤與松果體瘤。男性生殖器腫瘤包括(但不限於)：攝護腺及睪丸癌症。女性生殖器腫瘤包括(但不限於)：子宮內膜、子宮頸、卵巢、陰道與外陰癌症，及子宮肉瘤。消化道腫瘤包括(但不限於)：肛門、結腸、結腸直腸、食道、膀胱、胃臟、胰臟、直腸、小腸及唾液腺癌症。尿道腫瘤包括(但不限於)：膀胱、陰莖、腎臟、腎盂、輸尿管及尿道癌症。眼睛癌症包括(但不限於)：眼內黑色素瘤及視網膜母細胞瘤。肝臟腫瘤包括(但不限於)：肝細胞癌瘤(出現或不出現纖維板層肝細胞癌變之肝臟細胞癌瘤)、膽管癌瘤(肝內膽管癌瘤)，及混合型肝癌膽管癌瘤。皮膚癌症包括(但不限於)：鱗狀細胞癌瘤、卡波西氏(Kaposi's)肉瘤、惡性黑色素瘤、梅克爾(Merkel)細胞皮膚癌，及非黑色素皮膚癌。頭與頸癌症包括(但不限於)：喉/下嚥/鼻咽/口咽癌症，及唇與口腔癌症。淋巴瘤包括(但不限於)：AIDS-相關淋巴瘤、非霍金氏淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤、霍金氏症，及中樞神經系統之淋巴瘤。肉瘤包括(但不限於)：軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、淋巴肉瘤，及橫紋肌肉瘤。白血病包括(但不限於)：急性髓細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴母細胞白血病、慢性髓細胞性白血病，及毛細胞白血病。
本發明所採用術語"抗原決定基"意指抗原上(例如：間皮素蛋白質)可透過抗原結合位點與抗體結合之任何抗原性決定基。決定基或抗原性決定基通常係由化學活性表面分子群組成，如：胺基酸或糖側鏈，且通常具有特定三維立體結構特性，及特定電價特性。
術語"特異性免疫反應"係指抗體與蛋白質、化合物或抗原之間之結合反應，其具有可被抗體之抗原結合位點辨識之抗原決定基。此結合反應可在所存在之10蛋白質與其他生物物質之非均質族群中判別具有可辨識之抗原決定基之蛋白質、抗原或抗原決定基。在免疫分析法中，特異免疫反應性抗體可與具有可辨識之抗原決定基之蛋白質結合，且如果有任何結合，其與缺乏抗原決定基之其他蛋白質之結合性亦低於可檢測之程度。若於活體內時，"特異性免疫反應"可指動物對疫苗或抗原產生免疫反應之狀態，例如：對抗原之體液反應(針對疫苗、蛋白質、化合物或在免疫反應條件下出現之抗原產生抗體)或細胞所介導之體液反應(本文亦稱為"細胞免疫反應"，亦即由T淋巴細胞所介導對抗疫苗、蛋白質、化合物或其中所出現之抗原之免疫反應)。本文所採用術語"免疫反應條件"係指免疫分析法或活體外反應，其中提供或調整反應之物理條件，包括例如：溫度、鹽濃度、pH、試劑及其濃度，及抗原與對該抗原出現特異性免疫反應之同源抗體之濃度，以使同源抗體與抗原結合。免疫反應性條件隨抗體結合反應形式而定，且係彼等常用於免疫分析法之製程。有關免疫分析法模式及條件可參見Harlow及Lane(1988)之”抗體：實驗手冊(Antibodies：A Laboratory Manual)”,Cold Spring Harbor Publications,New York。本文所採用術語"患者"或"個體"包括哺乳動物(例如：人類及動物)。
本文中特定抗體對間皮素所採用術語‘不變結合性’係指其與表現不同形式間皮素之許多種表現間皮素之癌症細胞株之間皮素結合之能力。不變結合性可起因於(但不限於)該抗體或其抗原-結合性抗體片段或其變異體可辨識不會被另一種細胞外抗原(如：會與間皮素交互反應之癌症抗原125(CA125))遮蔽之間皮素之抗原決定基。由FACS滴定法對兩種不同癌症細胞株測定之不變結合性抗體之EC50值之差異不會超過10倍，或較佳為不超過5倍，及最佳為1至3倍之間。
本文所採用術語“免疫接合物”係指包含至少一種抗體或其抗原-結合性片段之接合物分子，其會與細胞毒性劑接合，例如：美登素類化合物或其衍生物，較佳為利用合適之連接基團或其前體連接。
本發明之免疫接合物
本發明係有關一種藉由提供抗間皮素免疫接合物來抑制間皮素陽性癌症細胞生長及新生贅瘤疾病發展之方法。所提供該免疫接合物之抗體部份體對間皮素前體多肽(SEQ ID NO 36)(本文中稱為‘間皮素’)之40 kDaC-末端功能域具有特異性免疫反應。
本發明之一態樣中，本發明之抗體、抗原-結合性抗體片段及該抗體與片段之變異體已說明於PCT/EP2008/009756，且係由輕鏈可變區與重鏈可變區組成。涵括在本發明內之抗體或抗原-結合性抗體片段之變異體為可維持該抗體或抗原-結合性抗體片段對間皮素之結合活性之分子。
本發明亦有關一種免疫接合物，其係由不同於PCT/EP2008/009756所說明之本發明抗間皮素抗體、抗原-結合性抗體片段及該抗體及片段之變異體組成，及與化療劑(例如：美登素類化合物)或其衍生物連接。
本發明可使用之美登素類化合物係相關技藝習知，且可依據已知方法自天然來源單離或依據已知方法合成製備。
合適之美登素類化合物實例包括美登醇(maytansinol)及美登醇類似物。合適之美登醇類似物包括彼等具有經修飾之芳香環者及彼等在其他位置經過修飾者。
具有經修飾之芳香環之合適美登醇類似物之特定實例包括：
(1) C-19-去氯(美國專利案4,256,746)(由安絲菌素(ansamitocin) P2進行LAH還原反應製得)；
(2) C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美國專利案案號4,361,650及4,307,016)(使用鏈黴菌(Streptomyces)或放線菌(Actinomyces)進行去甲基反應或使用LAH進行去氯反應製備)；及
(3) C-20-去甲氧基、C-20-醯基氧(-OCOR)、+/-去氯(美國專利案4,294,757)(使用醯基氯進行醯化反應製備)。
在其他位置經過修飾之合適美登醇類似物之特定實例包括：
(1) C-9-SH(美國專利案4,424,219)(由美登醇與H2S或P2S5反應製得)；
(2) C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美國專利案4,331,598)；
(3) C-14-羥基甲基或醯基氧甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利案4,450,254)(由諾卡氏菌(Nocardia)製備)；
(4) C-15-羥基/醯基氧(美國專利案4,364,866)(由鏈黴菌轉化美登醇製得)；
(5) C-15-甲氧基(美國專利案案號4,313,946及4,315,929)(自滑桃樹(Trewia nudiflora)中單離)；
(6) C-18-N-去甲基(美國專利案案號4,362,663及4,322,348)(由美登醇經過鏈黴菌脫去甲基製得)；及
(7) 4,5-去氧(美國專利案4,371,533)(由美登醇經過三氯化鈦/LAH還原反應製備)。
適用於本發明之含硫醇美登素類化合物合成法已詳細揭示於美國專利案案號5,208,020、5,416,064及7,276,497。
在C-3位置、C-14位置、C-15位置或C-20位置具有硫醇部份體之美登素類化合物均應適用。以C-3位置較佳，且以美登醇之C-3位置尤其佳。亦較佳為含N-甲基-丙胺酸之C-3硫醇部份體之美登素類化合物，及含N-甲基-半胱胺酸之C-3硫醇部份體之美登素類化合物，及其各類似物。較佳美登素類化合物為彼等說明於美國專利案5,208,020；5,416,064；6,333.410；6,441,163；6,716,821；RE39,151及7,276,497，其各揭示內容已分別以引用方式併入本文中。較佳之具體實施例，酯化美登醇係選自：N2’-去乙醯基-N2’-(3-氫硫基-1-側氧基丙基)-美登素(DM1，CAS登錄號139504-50-0)、N2’-去乙醯基-N2’-(4-氫硫基-1-側氧基戊基)-美登素(DM3，CAS登錄號796073-54-6)及N2’-去乙醯基-N2’-(4-甲基-4-氫硫基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4，CAS登錄號796073-69-3)。
本文獻中，提及下列代表性之本發明抗體：“MF-J”、“MOR06640”、”MF-226”及“MF-T”。MF-J代表具有相當於SEQ ID NO：28(DNA)/SEQ ID NO：20(蛋白質)之可變重鏈區及相當於SEQ ID NO：32(DNA)/SEQ ID NO：24(蛋白質)之可變輕鏈區之抗體。MOR 06640代表具有相當於SEQ ID NO：29(DNA)/SEQ ID NO：21(蛋白質)之可變重鏈區及相當於SEQ ID NO：33(DNA)/SEQ ID NO：25(蛋白質)之可變輕鏈區之抗體。MF-226代表具有相當於SEQ ID NO：30(DNA)/SEQ ID NO：22(蛋白質)之可變重鏈區及相當於SEQ ID NO：34(DNA)/SEQ ID NO：26(蛋白質)之可變輕鏈區之抗體。MF-T代表具有相當於SEQ ID NO：31(DNA)/SEQ ID NO：23(蛋白質)之可變重鏈區及相當於SEQ ID NO：35(DNA)/SEQ ID NO：27(蛋白質)之可變輕鏈區之抗體。本發明不限於此等抗體，其僅在本文中作為實例使用。其他適用之抗體揭示於例如：PCT/EP2008/009756。
一項態樣中，本發明提供一種免疫接合物，其可在癌症抗原125(CA 125/MUC 16)之存在下，與間皮素具有特異性免疫反應性，及因此可有效靶定同時表現間皮素與CA125之癌細胞，例如：OVCAR-3細胞。
本發明另一態樣提供一種免疫接合物，其針對抗體MOR 06640或MF-T之抗原決定基之一種或多種胺基酸具有特異性免疫反應性。某些態樣中，該免疫接合物對抗體MOR 06640或MF-T之抗原決定基之至少2種、至少3種、至少4種、至少5種或至少6種胺基酸具有特異性免疫反應性。某些態樣中，本發明免疫接合物對抗體MOR 06640所辨識抗原決定基之一種或多種胺基酸具有特異性免疫反應性。本發明抗體之其他態樣中，係對抗體 MF-T所辨識抗原決定基之一種或多種胺基酸具有特異性免疫反應性。
另一態樣中，本發明提供一種免疫接合物，其具有對間皮素(其胺基酸序列如SEQ ID NO：36所示)之一或多個區域之抗原-結合性區具有特異性免疫反應性或具有高親和性。若測定免疫接合物對抗原之親和性為至少100 nM(Fab片段之單價親和性)，則稱其具有“高度親和性”。本發明之免疫接合物對間皮素之特異性免疫反應之親和性較佳為低於約100 nM，更佳為低於約60 nM，及亦更佳為低於約30 nM。亦較佳為與間皮素之親和性低於約10 nM，更佳為低於約3 nM之抗體。例如：本發明抗體對間皮素之親和性可為約9.1 nM或0.9 nM(IgG1型之單價親和性)。
使用方法
術語"治療"包括任何可提供醫學協助，以直接或間接改善或減緩個體(或患者，包括人類)之病症發展，或減輕所治療至少一種疾病或病變之症狀之任何方法、作用、應用、療法，等等。
術語"組合療法"或"共同療法"係指投與兩種或更多種醫療劑來治療疾病、病症與/或病變。此等投藥法包括兩種或更多種醫療劑依實質上同時投藥之方式共同投藥，如：各抑制劑依固定之活性成份比例含於單一膠囊或分開含在多重膠囊中。此外，此等投藥法包括依序使用每一種醫療劑。共同投與該兩種或更多種醫療劑之投藥順序沒有限制。"醫療有效量"一詞意指各投與藥劑之用量將達到改善疾病、病症與/或病變嚴重性，與/或其症狀之目的，同時避免或儘量降低與該治療法相關之不良副作用。
術語"醫藥上可接受"意指該項目適用於醫藥產品。
本發明之免疫接合物應為有價值之醫療劑。因此，本發明之具體實施例包括治療患者(包括哺乳動物)各種不同病症之方法，其包括對該患者投與包含治療目標病症有效量之本發明免疫接合物。
本發明免疫接合物可用於治療或預防與間皮素蛋白質有關之疾病與/或行為。此等疾病與/或行為包括例如：癌症，如：胰臟、卵巢、胃、食道、子宮頸、結腸、肝臟、呼吸道及肺臟之癌瘤。本發明亦有關使其中間皮素之表現升高或異常之病變之症狀減輕之方法。此等病變包括(但不限於)：胰臟、卵巢、胃、食道、子宮頸、結腸、肝臟、呼吸道及肺臟之癌瘤(參見例如：Liao之Cancer Res. 57:2827-2831、1997；Turner之Hum. Pathol. 28:740-744,1997；Liao等人之Am. J. Pathol. 145:598-609,1994；Saarnio等人之Am. J. Pathol. 153:279-285,1998;Vermylen等人之Eur. Respir. J. 14:806-811,1999)。本發明一項具體實施例中，對患有間皮素升高之病變之患者投與醫療有效劑量之本發明免疫接合物。
本發明之免疫接合物可單獨投與或與一種或多種其他醫療劑組合投與。組合療法包括投與單一醫藥劑量調配物，其中包含本發明免疫接合物與一種或多種其他醫療劑，及以其本身分開之醫藥劑量調配物投與本發明免疫接合物及其他各醫療劑，例如：本發明免疫接合物與醫療劑可共同形成單一口服劑量組合物投與患者或各藥劑可呈分開之口服劑量調配物投與。
若使用分開之劑量調配物時，本發明免疫接合物與一種或多種其他醫療劑基本上可在同一時間投與(例如：併行)或在分開間隔時間投與(例如：依序)。藥物之投藥順序沒有限制。
例如：一項態樣中，用於治療與間皮素相關之病變(如：癌症)時，可由本發明之抗間皮素免疫接合物與一種或多種抗癌劑共同投藥，以加強抗間皮素免疫接合物或抗癌劑(群)或此二者之效力。此等組合療法亦可用於預防癌症、預防癌症復發、預防癌症擴散或轉移、或減少或減輕與癌症相關之症狀。
一種或多種抗癌劑可包括任何相關技藝已知及合適之化合物，如，例如：化療劑，其他免疫治療劑、癌症疫苗、抗血管新生劑、細胞因子、激素療法、基因療法及放射療法。化療劑(或"抗癌劑"或"抗腫瘤劑"或"癌症治療劑")係指任何有助於治療癌症之分子或化合物。本發明所涵括之化療劑實例包括(但不限於)：阿糖胞苷、紫杉醇衍生物(例如：太平洋紫杉醇、多烯紫杉醇)、抗微管劑(例如：太平洋紫杉醇、多烯紫杉醇、埃坡黴素(epothilone)B或其類似物)、大環內酯類(例如：根瘤菌素(rhizoxin))、順鉑、卡鉑、阿黴素(adriamycin)、依托泊苷(tenoposide)、米托蒽醌(mitozantron)、盤皮海綿內酯(discodermolide)、軟珊瑚醇(eleutherobine)、2-氯去氧腺苷、烷化劑(例如：環磷醯胺、氯甲基二乙胺、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法侖、卡氮芥(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、賽特醯胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露糖醇、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、絲裂黴素(mitomycin)C及順式-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑、噻替哌)、抗生素(例如：更生黴素(dactinomycin)(過去稱為放線菌素(actinomycin))、博來黴素、米拉霉素、安曲霉素(anthramycin))、抗代謝物(例如：甲胺蝶呤、6-氫硫基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、黃酮衍生物(flavopiridol)、5-氟尿嘧啶、氟達拉濱、吉西他濱、達卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolamide))、天冬醯胺酶、卡介苗(Bacillus Calmette and Guerin)、白喉毒素、六甲基蜜胺、羥基脲、LYSODREN.RTM.、核苷類似物、植物鹼(例如：紫杉醇、太平洋紫杉醇、喜樹鹼、拓撲替康、伊立替康(CAMPTOSAR、CPT-I1)、長春新鹼、長春花生物鹼，如：長春鹼)、鬼臼毒素(包括衍生物，如：表鬼臼毒素、VP-16(依替泊苷)、VM-26(替尼泊苷))、細胞鬆弛素(cytochalasin)B、秋水仙素、短桿菌肽(gramicidin)D、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素、甲基苄肼(procarbazine)、氯甲基二乙胺、蒽環素(例如：柔紅黴素(daunorubicin)(過去稱為道諾黴素)、多柔比星、多柔比星微脂粒)、二羥基蒽醌、米托蒽醌、米拉霉素、放線菌素D、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、心得安(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、抗有絲分裂劑、相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素、神經生長因子、血小板衍生之生長因子、組織血纖維蛋白溶解酶原活化劑、阿地白介素(aldesleukin)、路達胺(allutamine)、阿那曲唑(anastrozle)、比卡鲁胺(bicalutamide)、拜黴素(biaomycin)、白消安、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑恩(carboplain)、氯比消(chlorabusil)、克拉屈濱(cladribine)、賽拉濱(cylarabine)、達利黴素(daclinomycin)、抑姆辛(estramusine)、氟希利(floxuridhe)、甘希塔濱(gamcitabine)、戈舍林(gosereine)、去甲氧柔紅黴素、抑特醯胺(itosfamide)、醋酸亮丙瑞林(lauprolide acetate)、左旋咪唑(levamisole)、洛莫司汀(lomusline)、氯甲基二乙胺、醋酸甲地孕酮(magestrol acetate)、氫硫基嘌呤、美司那(mesna)、米特能(mitolanc)、培門冬酶(pegaspergase)、噴司拉丁(pentoslatin)、比克麥因(picamyein)、利路昔單抗(riuxlmab)、單抗(campath-1)、鏈脲菌素(straplozocin)、硫鳥嘌呤、維甲酸(tretinoin)、長春瑞濱，或其任何片段、家族成員或其衍生物，包括其醫藥上可接受之鹽。包含一種或多種化療劑(例如：FLAG、CHOP)之組合物亦涵括在本發明內。FLAG包括氟達拉濱、阿糖胞苷(Ara-C)及G-CSF。CHOP包括環磷醯胺、長春新鹼、多柔比星及潑尼松。
化療劑可為抗血管新生劑，如，例如：血管抑素、貝伐珠單抗(Avastin),索拉非尼(Nexavar)、桿抑素、血管能抑素、乳腺絲抑蛋白、抗VEGF抗體或肽、抗胎盤生長因子抗體或肽、抗Flk-1抗體、抗Fit-1抗體或肽、層黏連蛋白肽、纖維結合蛋白肽、血纖維蛋白溶解酶原活化劑抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、介白素12、IP-10、Gro-β、血小板反應蛋白、2-甲氧雌二醇、增生相關蛋白質、羧胺三唑、CMlOl、馬立馬司他、聚戊醣、促血管生成素2、干擾素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳激素片段、三羧胺基喹啉、沙利竇邁、己酮可可鹼、大豆異黃酮、TNP-470、內皮抑素、太平洋紫杉醇、百步蛇蛇毒蛋白、西多福韋、長春新鹼、博來黴素、AGM-1470、血小板因子4或米諾環素。
一項態樣中，該化療劑為吉西他濱之劑量範圍在100至1000 mg/m2/次循環。一項具體實施例中，該化療劑為達卡巴嗪之劑量範圍在200至4000 mg/m2/次循環。另一項態樣中，該劑量範圍在700至1000 mg/m2/次循環。再另一項態樣中，該化療劑為氟達拉濱之劑量範圍在25至50 mg/m2/次循環。另一項態樣中，該化療劑為阿糖胞苷(Ara-C)之劑量範圍在200至2000 mg/m2/次循環。另一項態樣中，該化療劑為多烯紫杉醇之劑量範圍在1.5至7.5 mg/kg/次循環。再另一項態樣中，該化療劑為太平洋紫杉醇之劑量範圍在5至15 mg/kg/次循環。另一項態樣中，該化療劑為順鉑之劑量範圍在5至20 mg/kg/次循環。又另一項態樣中，該化療劑為5-氟尿嘧啶之劑量範圍在5至20 mg/kg/次循環。另一項態樣中，該化療劑為多柔比星之劑量範圍在2至8 mg/kg/次循環。又另一項態樣中，該化療劑為表鬼臼毒素之劑量範圍在40至160 mg/kg/次循環。再另一項態樣中，該化療劑為環磷醯胺之劑量範圍在50至200 mg/kg/次循環。另一項態樣中，該化療劑為伊立替康之劑量範圍在50至150 mg/m2/次循環。又另一項態樣中，該化療劑為長春鹼之劑量範圍在3.7至18.5 mg/m2/次循環。另一項態樣中，該化療劑為長春新鹼之劑量範圍在0.7至2 mg/m2/次循環。一項態樣中，該化療劑為甲胺蝶呤之劑量範圍在3.3至1000 mg/m2/次循環。
另一項態樣中，本發明抗間皮素免疫接合物係與一種或多種免疫醫療劑組合投藥，如：抗體或免疫調節劑，其包括(但不限於)：Herceptin、Retuxan.、OvaRex、Panorex、BEC2、IMC-C225、Vitaxin、Campath I/H、Smart MI95、LymphoCide、Smart I D 10及Oncolym、利妥散(rituxan)、利妥昔單抗、吉妥珠單抗(gemtuzumab)或曲妥珠單抗。
本發明亦包括投與本發明抗間皮素免疫接合物與一種或多種抗血管新生劑，其包括(但不限於)：血管抑素、沙利竇邁、人纖溶酶原K5基因(kringle 5)、內皮抑素、Serpin(絲氨酸蛋白酶抑制劑)抗凝血酶、纖維結合蛋白之29 kDa N-末端及40 kDa C-末端蛋白質水解片段、催乳素之16 kDa蛋白質水解片段、血小板因子-4之7.8 kDa蛋白質水解片段、相當於血小板因子-4片段之β-胺基酸肽(Maione等人之1990,Cancer Res. 51:2077)、相當於膠原蛋白I片段之14個胺基酸肽(Tolma等人之1993,J.Cell Biol. 122:497)、相當於血小板反應蛋白I片段之19個胺基酸肽(Tolsma等人之1993,J. Cell Biol. 122:497)、相當於SPARC片段之20個胺基酸肽(Sage等人之1995,J. Cell. Biochem. 57：1329-)或其任何片段、家族成員或其衍生物，包括其醫藥上可接受之鹽。亦有說明可抑制血管新生作用且相當於層黏連蛋白、纖維結合蛋白、前膠原蛋白及EGF之片段之其他肽(其概論可參見Cao之1998,Prog. MoI. Subcell. Biol. 20:161)。阻斷某些與RGD蛋白質結合之整合素(亦即具有肽基序Arg-Gly-Asp)之單株抗體及環狀五肽已證實具有對抗血管形成活性(Brooks等人之1994,Science 264:569；Hammes等人之1996,Nature Medicine 2:529)。此外，採用拮抗劑抑制尿激酶血纖維蛋白溶解酶原活化劑受體可抑制血管新生作用、腫瘤生長及轉移(Min等人之1996,Cancer Res. 56:2428-33;Crowley等人,1993,Proc Natl Acad. Sci. USA 90:5021)，此等抗血管新生劑之用法亦包括在本發明內。
另一態樣中，本發明抗間皮素免疫接合物係與放射療法組合投與。
本發明抗間皮素免疫接合物亦可與一種或多種細胞因子組合投與，其包括(但不限於)：淋巴因子、腫瘤壞死因子、似腫瘤壞死因子之細胞因子、淋巴毒素-α、淋巴毒素-β、干擾素-β、巨噬細胞炎性蛋白質、粒細胞單核細胞集落刺激因子、介白素(包括(但不限於)：介白素-1、介白素-2、介白素-6、介白素-12、介白素-15、介白素-18)、OX40、CD27、CD30、CD40或CD137配位體、Fas-Pas配位體、4-IBBL、內皮單核細胞活化蛋白質或任何片段、家族成員，或其衍生物，包括其醫藥上可接受之鹽。
本發明抗間皮素免疫接合物亦可與癌症疫苗組合投藥，其實例包括(但不限於)：自體細胞或組織、非自體細胞或組織、癌胚抗原、α-胎兒蛋白、人類絨毛膜促性腺激素、BCG活疫苗、黑色素細胞系蛋白質(例如：gplOO、MART-1/MelanA、TRP-I(gp75)、酪胺酸酶、與廣泛表現之腫瘤相關(包括腫瘤-特異性)之抗原(例如：BAGE、GAGE-I、GAGE-2、MAGE-I、MAGE-3、N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶-V、pl5)、與腫瘤-相關之突變抗原(β-連環蛋白、MUM-I、CDK4)、非黑色素瘤之抗原(例如：HER-2/neu(乳房及卵巢癌瘤)、人類5乳頭狀瘤病毒-E6、E7(子宮頸癌瘤)、MUC-1(乳房、卵巢及胰臟癌瘤)。由T-細胞辨識之人類腫瘤抗原一般可參見Robbins及Kawakami之1996,Curr. Opin.Immunol.8:628。癌症疫苗可能為或可能不為已純化之製劑。
另一項具體實施例中，本發明抗間皮素免疫接合物係與激素治療組合使用。激素療法包括激素促效劑、激素拮抗劑(例如：氟他胺、他莫昔芬(tamoxifen)、醋酸亮丙瑞林(LUPRON)、LH-RH拮抗劑)、激素生合成及處理之抑制劑，及類固醇(例如：地塞米松、類視黃素、倍他米松(betamethasone)、氫化可體松(Cortisol)、可體松(cortisone)、潑尼松、脫氫睾酮、糖皮質激素、礦物質皮質素、雌激素、睪酮、孕激素)、抗雌激素(antigestagens)(例如：米非司酮(mifepristone)、奥那司酮(onapristone))及抗雄激素(例如：醋酸環丙孕酮)。本發明之抗間皮素免疫接合物可組合(例如：共同投與)抗MDR(多重藥物抗性)表型藥劑。許多人類癌症本身對許多種抗癌藥物可以同時表現或自發性發展出抗性，儘管各該藥物種類具有不同結構及作用機轉。此現象可被培養之哺乳動物細胞模擬，一般稱為多重藥物抗性("MDR")或多重藥物抗性表型。MDR表型成為成功治療人類癌症患者之化療劑之嚴重阻礙。惡性腫瘤對多重化療劑之抗性為治療失效之主因(Wittes等人之Cancer Treat. Rep. 70:105(1986)；Bradley,G.等人之Biochim. Biophys. Acta 948:87(1988)；Griswald,D. P.等人之Cancer Treat. Rep. 65(S2):51(1981)；Osteen,R. T.(ed.),Cancer Manual,(1990))。最初對細胞毒性劑敏感之腫瘤經常會復發或很難使用多重化療藥物治療(Riordan等人之Pharmacol. Ther. 28:51(1985)；Gottesman等人之Trends Pharmacol. Sci. 9:54(1988)；Moscow等人之J. Natl. Cancer Inst. 80:14(1988)；Croop,J. M.等人之J. Clin. Invest. 81:1303(1988))。得自腫瘤之細胞或組織在選擇性細胞毒性劑之存在下生長時，可能會與此類藥劑之其他藥物及其他類藥劑之藥物產生交叉抗性，其包括(但不限於)：蒽環素類，長春花植物鹼，及表鬼臼毒素(Riordan等人之Pharmacol. Ther. 28:51(1985)；Gottesman等人之J. Biol. Chem. 263:12163(1988))。因此，對單一藥物產生之抗性會同時對結構及功能上不相關之不同種類藥物產生抗性。此等抗性可成為實體及液態腫瘤(例如：血液或淋巴類癌症)之問題。
哺乳動物細胞之多重藥物抗性之主要機轉涉及170 kDa漿膜醣蛋白泵壓系統之表現提高(Juranka等人之FASEB J 3:2583(1989)；Bradley,G.等人之Biochem. Biophys. Acta 948:87(1988))。已在培養之人類細胞中選殖出編碼此泵壓系統之基因(有時候稱為多重藥物轉運子)，一般稱為mdr1。此基因表現在許多種正常組織中，但在此等組織中轉運mdr1基因產物之此等生理受質尚未判別出來。MDR1產物為ABC轉運子蛋白質超級家族(係一群具有依賴能量運出之功能之蛋白質)之成員之一。Mdr1基因之蛋白質產物(一般稱為P-醣蛋白("P-170"，"P-gp"))為一種170 kDa跨漿膜蛋白質，其構成上述依賴能量之流出泵壓。細胞表面上表現之P-gp足使細胞對多重細胞毒性藥物(包括許多抗癌劑)產生抗性。P-gp-介導之MDR似乎成為不同腫瘤之腫瘤抗性之重要臨床組成份，且mdr1基因表現與不同類癌症之化療抗性具有相關性。mdr1基因之核苷酸序列(Gros,P.等人之Cell 47:371(1986)；Chen,C.等人之Cell 47:381(1986))顯示其編碼與P-醣蛋白類似或相同之多肽，且此等係類似細菌轉運子且涉及正常生理轉運過程之膜蛋白質之高度保留型態之成員。mdr1基因之序列分析顯示，Pgp由1280個分佈在兩個一半同系物(同質性43%)之胺基酸組成。每一半分子具有6個疏水性跨膜功能域，且分別在大的細胞質環中具有ATP結合位點。僅約8%分子在細胞外，而碳水化合物部份體(約30 kDa)則結合在此區內之位點。
因此咸了解，具有"多重抗藥性"或"多重藥物抗性"表型之哺乳動物細胞之特徵在於其有能力螯合、運出或排除細胞內環境之許多種細胞毒性物質(例如：化療藥物)。細胞可能因曝露到單一化療藥物(選拔毒素)，在選拔壓力下獲得此表型。或者，細胞可能在曝露到毒素之前即具有此表型，因為運出細胞毒性物質可能涉及之機轉與正常運出細胞分泌產物、代謝物，等等之機轉相同。多重藥物抗性不同於單純之後來對選拔毒素產生抗性之處在於該細胞對過去未曾曝露過之其他細胞毒素(其他化療藥物)產生運出能力。例如：Mirski等人(1987),47 Cancer Res. 2594-2598，其說明在阿黴素(adriamycin)(多柔比星)作為選拔毒素之存在下培養H69細胞株(來自人類小細胞肺臟癌瘤)，單離出多重藥物-抗性細胞族群。已發現存活之細胞可抗拒蒽環素類似物(例如：道諾黴素、表阿黴素、美諾立爾(menogaril)及米托蒽醌)、阿西維辛(acivicin)、依替泊苷、短桿菌肽D、秋水仙素及長春花衍生之植物鹼(長春新鹼及長春鹼)，及阿黴素(adriamycin)之細胞毒性效應。可採用類似之選拔培養技術產生其他多重藥物-抗性細胞族群。因此，本發明醫藥組合物亦包括可抑制MDR表型及/或與MDR表型有關之病症之化合物。此等化合物可包括任何相關技藝已知之MDR抑制劑化合物，如：對MDR組成份具特異性之抗體(例如：抗MDR轉運子抗體)或MDR轉運子之小分子抑制劑，明確言之包括：他莫昔芬、維拉帕米(verapamil)及環孢素A，已知該製劑可逆轉或抑制多重藥物抗性。(Lavie等人之J. Biol. Chem. 271：19530-10536,1996，其揭示內容已以引用方式併入本文中)。此等化合物可參見美國專利案案號5,773,280、6,225,325及5,403,574，其各揭示內容已分別以引用方式併入本文中。此等MDR抑制劑化合物可與針對各種不同目的(包括在檢測到MDR表型後逆轉MDR表型，以協助或促進化療)治療之本發明抗間皮素免疫接合物共同投藥。該MDR抑制劑(如，例如：他莫昔芬、維拉帕米或環孢素A)可用於與本發明化合物組合投與，以協助檢測MDR表型。根據此態樣，MDR抑制劑可在MDR癌症細胞中加強吸收及累積本發明化合物，因為MDR轉運系統面對受質功能域時之轉運或"泵壓排除"該擬似化合物之能力可能在MDR抑制劑之存在下降低。
另一項具體實施例中，本發明抗間皮素免疫接合物可與治療癌症之基因療法組合使用。採用分泌介白素-2之重組細胞之基因療法可與本發明免疫接合物組合投藥，用於預防或治療癌症，特定言之乳癌(參見例如：Deshmukh et ah,2001,J. Neurosurg. 94:287)。
為了評估特定免疫接合物在醫療上治療癌症之能力，可以例如：在活體之小鼠異體移植腫瘤模式中測試免疫接合物。醫療模式實例詳細說明於實例1及2。亦可採用實例3所說明依賴抗體之細胞所介導細胞毒性分析法來測試抗體活性。
醫藥組合物及劑量
本文說明之免疫接合物可呈醫藥組合物提供，其中包含醫藥上可接受之載劑。醫藥上可接受之載劑可能為無熱原性。該組合物可單獨投藥或組合至少一種其他製劑投藥，如：安定作用化合物，其可在任何無菌之生物相容性醫藥載劑中投藥，包括(但不限於)：生理食鹽水、緩衝之生理食鹽水、右旋糖及水。有許多種水性載劑可以使用，包括(但不限於)：生理食鹽水、甘油，等等。此等溶液為無菌，且通常不含粒狀物質。此等溶液可依一般習知殺菌技術殺菌(例如：過濾)。
通常相關技藝上咸了解，"醫藥上可接受載劑"一詞包括適合投與本發明化合物給哺乳動物之醫藥上可接受之材料、組合物或媒劑。該載劑包括涉及將該藥劑自一種器官或身體之一部份攜帶或運送至另一種器官或身體之一部份之液態或固態填料、稀釋劑、賦形劑、溶劑或囊封材料。各載劑必需在可與調配物中其他成份相容且對患者無害之意義上為"可接受"者。有些可作為醫藥上可接受之載劑材料實例包括：糖類，如：乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，如：玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素，及其衍生物，如：羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及纖維素乙酸酯；黃著膠粉末；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，如：可可脂及栓劑用蠟；油類，如：花生油、椰子油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇類，如：丙二醇；多元醇類，如：甘油、山梨糖醇、甘露糖醇及聚乙二醇；酯類，如：油酸乙酯及月桂酸乙酯；洋菜；緩衝劑，如：氫氧化鎂及氫氧化鋁；藻酸；無熱原水；等滲生理食鹽水；林格氏溶液；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；及其他可用於醫藥調配物之無毒性可相容物質。本發明組合物免疫接合物中亦可包含濕化劑、乳化劑及潤滑劑，如：月桂基硫酸鈉及硬脂酸鎂，及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調味劑與香料、防腐劑及抗氧化劑。
醫藥上可接受之抗氧化劑實例包括：水溶性抗氧化劑，如：抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉，等等；油溶性抗氧化劑，如：棕櫚酸抗壞血基酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚，等等；及金屬螯合劑，如：檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸，等等。
該組合物若需要時可包含醫藥上可接受之輔助物質，以調整至約生理條件，如：pH調節劑及緩衝劑，等等。此等醫藥調配物中之本發明免疫接合物濃度可以有很大變化，且主要依據液體體積、黏度，等等，根據所選用之特定投藥模式來選擇。若需要時，醫藥組合物中可包含超過一種抗體或免疫接合物(例如：對間皮素結合性具有不同Ka之抗體)。
該組合物可單獨投與患者，或與其他藥劑、藥物或激素組合投與。除了活性成份外，此等醫藥組合物尚可包含合適之醫藥上可接受之載劑，包括可促進活性化合物處理製成可用於醫藥之製劑中之賦形劑及輔劑。本發明醫藥組合物可依任何途徑投藥，包括(但不限於)：經口、靜脈內、肌內、動脈內、脊髓內、鞘內、腦室內、穿皮式、皮下、腹膜內、鼻內、非經腸式、局部、舌下或直腸方式。
本發明組合物亦包括合適之免疫載劑，如：蛋白質、多肽或肽，如：白蛋白、血藍蛋白、甲狀腺球蛋白及其衍生物，特定言之牛血清白蛋白(BSA)及鑰孔血藍蛋白(KLH)、多醣、碳水化合物、聚合物及固相。其他蛋白質衍生或非蛋白質衍生之物質係習此相關技藝之人士已知者。
在涉及疫苗之態樣中，例如：與本發明抗體共同使用癌症疫苗時，本發明組合物可使用或不使用輔劑投藥。該投藥法可在沒有輔劑下進行，以避免任何由輔劑引發之毒性。習此本發明相關技藝之人士(例如：專攻癌症之醫師)咸了解如何決定是否應該使用輔劑，且可依個體之病史、家族資料、毒性數據、與過敏症相關之試驗結果，等等決定。在使用輔劑之具體實施例中，輔劑之優點在於促進形成保護性抗體，如：保護性IgG抗體。習此相關技藝之人士已知之任何合適輔劑均包括在本發明內，且很容易應用在本發明中。適用於為動物免疫接種之輔劑包括(但不限於)：氫氧化鋁、皂苷及其純化組成份Quit A、完全佛氏輔劑(complete Freund's adjuvant(CFA))及不完全佛氏輔劑(IFA)。已知硫酸葡聚醣為對抗葡萄球菌細胞表面抗原之IgG2抗體之強力刺激劑，亦適合作為輔劑。習此本發明相關技藝之人士咸了解，有些輔劑可能更適用於獸醫學用途，而其他輔劑可能較適用於人類，且習此本發明相關技藝之人士在投與該化合物給人類之前均應考慮該輔劑之毒性。
適合非經腸式、皮下、靜脈內、肌內，等等投藥之調配物；合適之醫藥載劑；及調配與投藥技術均可依相關技藝習知之任何方法製備(參見例如：雷氏醫藥學(Remington's pharmaceutical Sciences),Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，第20版，2000)。經口投與本發明化合物之液態劑型包括醫藥上可接受乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿及酏劑。除了活性成份外，液態劑型尚可包含相關技藝常用之惰性稀釋劑，如，例如：水或其他溶劑，溶解劑及乳化劑，如：乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲基酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油類(特定言之棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及脫水山梨醇之脂肪酸酯，及其混合物。
本文所採用"非經腸式投藥法"及"非經腸式投藥"意指不同於經腸式及局部投藥之投藥方式，通常經由注射法，且包括(但不限於)：經靜脈內、肌內、動脈內、關節囊內、眼內、心臟內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、角質層下、關節內、關節囊下、蜘蛛膜下、脊椎內及胸骨內注射及輸注。
醫療有效劑量之決定係彼等習此相關技藝之人士之能力範圍內。醫療有效劑量係指當與沒有醫療有效劑量時之效力比較下，該免疫接合物可用於有效治療疾病(例如：癌症)時之用量。
該醫療有效劑量可先在動物模式(例如：大鼠、小鼠、子、狗或豬)中估算。亦可採用動物模式來決定適當之濃度範圍及投藥途徑。此等資訊即可用於決定投與人類之適用劑量及途徑。免疫接合物之醫療效力及毒性(例如：ED50-對50%族群具有醫療效力時之劑量，及LD50-造成50%族群死亡時之劑量)可依標準醫藥製程，於細胞培養物或實驗動物中決定。毒性對醫療效力之劑量比即為治療指數，其以LD50/ED50之比例表示。自動物試驗得到之數據可用於調配供人類使用之劑量範圍。此等組合物所包含之劑量可在循環濃度之範圍內，包括低毒性或沒有毒性之ED50。該劑量可以隨所採用之劑型、患者之敏感度及投藥途徑而定，在此範圍內變化。
確實之劑量將由操作者依據需要治療之患者之相關因素決定。可以調整劑量及投藥法，以提供足量之免疫接合物或維持所需之效力。可考慮之因素包括疾病之嚴重性、個體之一般健康狀況、個體之年齡、體重及性別、飲食、投藥之時間與頻率、藥物組合(群)、反應敏感度及對療法之耐受性/效應。編碼本發明免疫接合物之聚核苷酸可採用已知技術於活體外或活體內構築，及引入細胞內，該等技術包括(但不限於)：轉鐵蛋白-聚陽離子介導DNA轉移、採用無封裝或有封裝之核酸轉染、脂質體介導之細胞融合、DNA-塗層乳膠珠之細胞內轉運、原生質融合、病毒感染、電穿孔法、"基因槍"及DEAE-或磷酸鈣介導之轉染法。
免疫接合物之發毒成份之活體內有效劑量在約5 μg至約500 μg/kg患者體重之範圍內。本發明含免疫接合物之醫藥組合物之投藥模式可為可將抗體傳送給宿主之任何合適途徑。例如：本發明醫藥組合物適用於非經腸式投藥法(例如：皮下、肌內、靜脈內或鼻內投藥)。所有專利案及專利申請案之揭示內容已以引用方式併入本文中。上述揭示內容一般說明本發明。可參考下列特定實例，更完整了解，該等實例僅供說明，且無意限制本發明之範圍。
 實例
實例1：免疫接合物於表現間皮素之人類胰臟癌瘤異體移植小鼠模式中之效力
為了分析抗間皮素免疫接合物是否可以依據與間皮素相關之方式降低腫瘤生長，因此採用間皮素穩定轉染人類胰臟癌瘤細胞(MiaPaCa-2)，並用於建立皮下生長腫瘤之小鼠模式。採用人類結腸癌瘤細胞株HT29作為該效力試驗之間皮素陰性對照組腫瘤。MiaPaCa細胞係維持在DMEM培養基(補充10%(v/v) FCS、2.5%(v/v)馬血清、1.5 g/l碳酸氫鈉、4.5 g/l葡萄糖、4 mM麩醯胺酸及0.4%(v/v)潮黴素(Hygromycin))中，成為附著培養物。HT29細胞係培養在McCoy' s 5a培養基(含1.5 mM麩醯胺酸、2.2g/l碳酸氫鈉及10%(v/v)FCS)中。採用FACS確認MiaPaCa-2細胞之間皮素之表現，且確認HT29細胞中沒有間皮素(未出示)。為了於活體內分析腫瘤細胞之生長，在雌性NMRI無毛小鼠右腹側皮下接種3 x 106 個MiaPaCa-2細胞或1 x 106 個HT29細胞(其係再懸浮於50% MatrigelTM及50%培養基)。作為抗間皮素免疫接合物之MF-J-SPDB-DM4、MF-T-SPDB-DM4、MF226-SPDB-DM4及MOR6640-SPDB-DM4係在治療劑量0.01 mg/kg、0.03 mg/kg、0.05 mg/kg及0.2 mg/kg(相當於發毒成份含量)下進行試驗。MF-J-SPDB-DM4、MF-T-SPDB-DM4、MF226-SPDB-DM4及MOR6640-SPDB-DM4係依下列製程製得：以4-[2-吡啶基二硫基]丁酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(SPDB)修飾抗間皮素抗體，以引進二硫吡啶基。在8 mg/mL之抗體下，使用超過約6倍莫耳量之SPDB(含於EtOH中之約20 mM母液)來修飾抗體。經過修飾之抗體再與超過硫代吡啶基1.7倍莫耳量之游離硫醇型美登素類化合物反應。該反應在2.5 mg/ml抗體下，於3%二甲基乙醯胺(3% v/v)之存在下，於室溫下進行20小時。採用脫鹽Sephadex G25管柱，自未反應之藥物與已反應之副產物中純化該接合反應混合物。測量252 nm及280 nm下之吸光度，使用280nm下之消光係數224000 M-1 cm-1 (針對抗體)及5180 M-1 cm-1 (針對DM4)，計算每個抗體之美登素類化合物分子數量。252 nm/280 nm吸光度比例為抗體之0.37及DM4之5.05。
接種腫瘤細胞後第5天確立腫瘤後，即開始治療，然後於接種腫瘤細胞後第8天及第12天後再進行兩次治療。對照組小鼠係接受0.2 mg/kg非靶向之免疫接合物(抗溶菌酶-SPDB-DM4)或僅接受等體積媒劑(10 mM組胺酸、130 mM甘胺酸、5%(w/v)蔗糖，pH 5.5)處理。經由靜脈內投與劑量體積100 μl/10g體重進行治療。每組包括6隻動物。每天檢查小鼠之健康狀態。每週兩次採用電子量徑器測量皮下腫瘤之長度與寬度。由公式：腫瘤面積[mm2 ]=長度[mm] x寬度[mm]計算腫瘤面積。記錄實驗過程所得之所有數據。抗間皮素免疫接合物MF-T-SPDB-DM4在不同治療劑量下對間皮素-轉染人類胰臟癌瘤細胞之抗腫瘤效力實例示於圖1。在雌性NMRI無毛小鼠右腹側內接種3 x 106 個間皮素陽性MiaPaCa-2人類胰臟癌瘤細胞(A)或1 x 106 個間皮素陰性HT29人類結腸癌瘤細胞(B)(其係再懸浮於50% MatrigelTM/50%培養基中)。在接種腫瘤細胞後5、8及12天時，使小鼠接受0.01、0.03、0.05、0.2 mg/kg MF-T-SPDB-DM4(其濃度均與發毒成份相關)，或僅接受媒劑。每週兩次測量腫瘤長度與寬度，並由寬度與長度之乘積計算腫瘤面積。由每組之平均值與標準偏差相對於測量之時間點作圖。所有組n=6。星號表示P-值<0.05。
治療帶有腫瘤之小鼠時顯示，所有試驗之抗間皮素免疫接合物在0.03 mg/kg、0.05 mg/kg及0.2 mg/kg之劑量下均可在活體內抑制間皮素陽性MiaPaCa-2腫瘤生長。MF-T-SPDB-DM4在0.05 mg/kg及0.2 mg/kg之劑量下可完全根除腫瘤，直到觀察期132天結束時，仍未觀察到腫瘤再生長。0.05 mg/kg非靶向對照組抗溶菌酶SPDB-DM4對間皮素陽性MiaPaCa腫瘤生長沒有效力(表1)。比較未處理及經媒劑處理之腫瘤，最高劑量之0.2 mg/kg MF-T-SPDB-DM4並未顯著降低間皮素陰性HT29腫瘤之生長。此證明MF-T-SPDB-DM4之強力腫瘤抑制效力與腫瘤內之間皮素表現有關。
實例2：對內因性表現間皮素之腫瘤之效力及不同連接基之比較
為了測試抗間皮素免疫接合物是否可在活體內抑制表現內因性間皮素之腫瘤細胞之生長，採用具有皮下生長之人類子宮頸癌瘤細胞(HeLaMATU)之異體移植模式。HeLaMATU細胞係維持在DMEM/HAMS12培養基(補充10%(v/v)FCS、2.5%(v/v)馬血清、1%丙酮酸鈉及1%(w/v)麩醯胺酸)中，成為附著培養物。採用活體外FACS分析法確認間皮素表現。在雌性NMRI無毛小鼠右腹側接種1.5 x 106 個HeLaMATU細胞(其再懸浮於50% MatrigelTM /50%培養基中)。此外，亦探討以極性(-磺基-SPDB)、穩定之連接基(-SMCC)或以極性且穩定之連接基(-(PEG)4-mal)替代可裂解之SPDB-連接基是否會改變基於MOR6640之免疫接合物於活體內之抗腫瘤效力。帶有HeLaMATU腫瘤之小鼠在接種腫瘤後第5、8及12天時，經靜脈內接受0.2 mg/kg MOR6640-SPDB-DM4、MOR6640-SMCC-DM1、MOR6640-磺基-SPDB-DM4或MOR6640-(PEG)4-mal-DM1(與發毒成份之含量相關)處理。對照組小鼠接受0.2 mg/kg非靶向免疫接合物(抗溶菌酶-SPDB-DM4)或僅接受等體積媒劑處理。每組包括6隻動物。每天檢查小鼠之健康狀態。每週兩次採用電子量徑器測量皮下腫瘤之長度與寬度。由公式：腫瘤面積[mm2 ]=長度[mm] x寬度[mm]計算腫瘤面積。所得數據示於圖2。治療帶有腫瘤之小鼠時發現：a)抗間皮素免疫接合物可於活體內有效抑制內因性表現間皮素之腫瘤生長，及b)具有可裂解之連接基之接合物(MOR6640-SPDB-DM4及MOR6640)比具有穩定連接基之接合物(MOR6640-SMCC-DM1及MOR6640-(PEG)4-mal-DM1)展現更高之抗腫瘤效力。特定言之，MOR6640-SPDB-DM4及MOR6640-磺基-SPDB-DM4在最後一次處理後11天，可以根除所有處理組動物之腫瘤，而使用MOR6640-SMCC-DM1及MOR6640-(PEG)4-mal-DM1治療時，僅會延後腫瘤生長。然而，在最後一次處理後11天時，使用MOR6640-SMCC-DM1及MOR6640-(PEG)4-mal-DM1治療之腫瘤面積分別顯著小於媒劑處理組或抗溶菌酶-SPDB-DM4處理組之腫瘤。該非靶向對照組接合物對腫瘤生長沒有效力。為了在第二個異體移植模式中比較不同連接基之抗腫瘤效力，吾等採用皮下生長之載體-或間皮素-轉染(#37) MiaPaCa-2細胞(人類胰臟癌瘤細胞)模式。MiaPaCa-2-載體及MiaPaCa-2#37細胞係維持在DMEM/HAMS12培養基(補充10%(v/v)FCS、1%(w/v)麩醯胺酸及0.1 mM非必需胺基酸)成為附著培養物。皮下腫瘤採用活體外之FACS分析法及免疫組織化學分析法確認間皮素之表現。在雌性NMRI無毛小鼠右腹側接種3 x 106 個MiaPaCa-2-載體及MiaPaCa-2#37細胞(其分別再懸浮於50% MatrigelTM /50%培養基)。帶有腫瘤之小鼠在接種腫瘤後第5、8及12天時接受0.05 mg/kg MOR6640-SPDB-DM4、MOR6640-SMCC-DM1、MOR6640-磺基-SPDB-DM4或MOR6640-(PEG)4-mal-DM1(與發毒成份之含量相關)。對照組小鼠接受0.05 mg/kg非靶向免疫接合物(抗溶菌酶-SPDB-DM4)或僅接受等體積媒劑處理。每組包括6隻動物。每天檢查小鼠之健康狀態。每週兩次採用電子量徑器測量皮下腫瘤之長度與寬度。由公式：腫瘤面積[mm2 ]=長度[mm] x寬度[mm]計算腫瘤面積。所得數據示於圖3。使用MOR6640-SPDB-DM4及MOR6640-磺基-SPDB-DM4治療帶有表現間皮素之腫瘤之小鼠時，在最後一次治療後12天時，所有處理組動物之腫瘤均已根除。然而，10天後，此等腫瘤再度生長(圖3A)。使用MOR6640-SMCC-DM1、MOR6640-(PEG)4-mal-DM1及抗溶菌酶-SPDB-DM4治療時，並未顯著影響腫瘤生長。與表現間皮素之腫瘤相反，沒有任何治療可以在活體內改變經載體轉染之MiaPaCa-2細胞之生長(圖3B)。
實例3：抗間皮素免疫接合物之活體外毒性
為了分析抗間皮素免疫接合物之細胞毒性，由表現間皮素之不同細胞株生長至80-90%匯合度，經胰蛋白酶處理及計數。然後，所有細胞株均在384孔之平底分析板中，接種至其生長培養基中，每孔體積為25 μl。僅含培養基之孔則作為空白扣除孔。接種後24小時，添加劑量範圍在0.01至3.00 nM之MF-J-SPDB-DM4、MF-226-SPDB-DM4、MOR6640-SPDP-DM4、MF226-SPDP-DM4及抗溶菌酶-SPDP-DM4。每個稀釋度進行三重覆。在96小時時為測定終點。採用WST-1分析測定法(Roche Cat# 1644807)測定細胞活力。IC50 值示於表2。由劑量-效應曲線證明MF-T-SPDP-DM4對HelaMatu細胞之活體外細胞毒性，如圖4所示。
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圖1出示抗間皮素-免疫接合物MF-T-SPDB-DM4於間皮素轉染異體移植模式(A)及非轉染對照組腫瘤(B)中，對經過間皮素轉染之人類胰臟癌瘤細胞之抗腫瘤效力。
圖2出示具有穩定與可裂解及極性與非極性連接基之抗間皮素免疫接合物在採用內因性表現癌瘤細胞之間皮素之HeLaMATU異體移植模式中之抗腫瘤效力。
圖3出示具有穩定與可裂解及極性與非極性連接基之抗間皮素免疫接合物在間皮素轉染異體移植模式(A)及非轉染對照組腫瘤(B)中之抗腫瘤效力。
圖4出示MF-T-SPDP-DM4毒性對間皮素陽性HelaMatu細胞之劑量效應曲線。

Claims (6)

  1. 一種免疫接合物，其包含細胞毒性劑及人類或擬人化抗體或其功能片段，其包含對間皮素(SEQ ID NO：36)具有特異性之抗原-結合性區，其中該細胞毒性劑係為美登素類化合物(maytansinoid)或其衍生物，其中該抗體係辨識不會被另一種細胞外抗原遮蔽之間皮素的抗原決定基，其中該抗體結合位點包括CDR1、CDR2及CDR3，其中：a)由SEQ ID NO：3所呈現的HCDR1，b)由SEQ ID NO：6所呈現的HCDR2，c)由SEQ ID NO：9所呈現的HCDR3，d)由SEQ ID NO：12所呈現的LCDR1，e)由SEQ ID NO：15所呈現的LCDR2，f)由SEQ ID NO：19所呈現的LCDR3。
  2. 根據申請專利範圍第1項之免疫接合物，其中該抗體及美登素類化合物或其衍生物經由SPDB連接基所連接。
  3. 根據申請專利範圍第1項之免疫接合物，其中該美登素類化合物為DM4。
  4. 根據申請專利範圍第1項之免疫接合物，其中該細胞外抗原為癌症抗原125(CA125)。
  5. 一種醫藥組合物，其包含根據申請專利範圍第1至4項中任一項之免疫接合物，及其醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
  6. 一種根據申請專利範圍第1-4項中任一項之免疫接合物的用途，係用於製備治療與不期望出現與間皮素有關之病變或病症的藥物。
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