BRPI1014637B1 - Imunoconjugados anti-mesotelina e composição farmacêutica compreendendo os referidos imunoconjugados - Google Patents

Imunoconjugados anti-mesotelina e composição farmacêutica compreendendo os referidos imunoconjugados Download PDF

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Abstract

imunoconjugados anti-mesotelina e uso destes. a presente invenção fornece os compostos imunoconjugados de anticorpos, por exemplo, anticorpos monoclonais, ou fragmentos de anticorpo que se ligam a mesotelina, que são conjugados com agentes citotóxicos, por exemplo, maitansina, ou derivados desta, e/ou co- administrados ou formulados com um ou mais agentes anticancerígenos adicionais. os imunoconjugados da invenção podem ser usados nos métodos da invenção para tratar e/ou diagnosticar e/ou monitorar cânceres, por exemplo, tumores sólidos. os imunoconjugados compreendem anticorpos e fragmentos funcionais que contêm tais regiões ligantes antigênicas que são específicas para o polipeptídeo mesotelina de 40kda fixado na membrana, que é superexpressado em diversos tumores, tais como células cancerígenas de tumores pancreáticos e ovarianos, mesotelioma e cancro do pulmão.

Description

[001] A presente invenção fornece os imunoconjugados que compreendem um anticorpo ou um fragmento deste, tendo a especificidade para a proteína da mesotelina, e um agente terapêutico. As composições de tais imunoconjugados podem ser usadas para tratar, impedir, ou diagnosticar desordens relacionadas à mesotelina, por exemplo, câncer.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A ocorrência do câncer é mais geralmente associada com o envelhecimento onde 65% de todos os exemplos novos de câncer são registrados para pacientes com 65 anos ou mais. O câncer é a segunda causa principal de morte nos Estados Unidos, com exceção somente para a doença cardíaca. Certamente, a Sociedade Americana contra o Câncer estimou que 1 a cada 4 pessoas morrerão de câncer nos Estados Unidos, supondo que as taxas de mortalidade atuais permanecem estáticas. Só nos Estados Unidos, 1.437.180 novos casos e 565.650 mortes de câncer são esperadas em 2008.
[003] A terapia baseada em anticorpo está provando ser muito eficaz no tratamento de vários tipos de câncer, incluindo os tumores sólidos. Por exemplo, HERCEPTIN® foi usado com sucesso para tratar o câncer de mama. Central ao desenvolvimento de uma terapia baseada em anticorpo bem-sucedida é o isolamento de anticorpos contra as proteínas da superfície celular que se sabe serem expressas preferencialmente em células tumorais. O polipeptídeo precursor da mesotelina é uma proteína da superfície celular glicosilada ancorada no glicofosfatidilinositol (GPI), que é proteoliticamente clivada num polipeptídeo segregado de 30kDa N-terminal e num polipeptídeo de 40kDa, C-terminal da superfície celular, que ocorre predominante na forma ligada a membrana, ancorada a GPI (Chang, K. and I. Pastan, Proc. Nacional. Acad. Sci. EUA, (1996) 93 (1): 136), e que é aqui nomeado de mesotelina. A Mesotelina é expressa preferencialmente por determinadas células tumorais, particularmente células de mesotelioma, células do tumor pancreático e células do carcinoma ovariano, enquanto sua expressão é limitada no tecido normal, tornando-a um alvo atrativo para o desenvolvimento da terapia tumoral (Argani, P. et al., Clin. Cancer Res. (2001) 7(12): 3862; Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res. (2004) 10(12 Pt 1):3937). A função da mesotelina é desconhecida, e nenhuma anomalia reprodutiva, hematológica, ou anatômica aparente foi observada nos ratos deficientes na expressão do gene da mesotelina (Bera, T.K. and I. Pastan, MoI. Cell. Biol. (2000) 20(8):2902). A terapia alvo baseada no anticorpo contra as células cancerosas expressando a mesotelina foi proposta para o tratamento do câncer de pulmão, ovariano e pancreático. Mab K1 foi o primeiro anticorpo contra o polipeptídeo mesotelina ligado a membrana que foi descrito (Chang, K., et al., Int. J. Cancer, (1992) 50(3):373). O Mab K1 foi gerado imunizando ratos. Devido à baixa afinidade e às taxas pobres da internalização do anticorpo, uma imunotoxina consistindo de Mab K1 ligada a uma forma truncada quimicamente modificada da exotoxina A de Pseudomonas não foi considerado apropriado para o desenvolvimento clínico (Hassan, R., et al., J. Immunother. (2000) 23(4):473; Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res. (2004) 10(12 Pt 1): 3937). Subsequentemente, os anticorpos de cadeia simples com afinidades mais elevadas foram desenvolvidos, incluindo SS1- (dsFv) - PE38, que mostrou a atividade de morte de células do tumor in vitro (Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res. (2002) 8(11): 3520) assim como o potencial em um modelo murino de tumores expressando a mesotelina humana (Fan, D., et al., MoI. Cancer Ther. (2002) 1(8): 595). Estes dados validam a mesotelina como um alvo atrativo para desenvolver a imunoterapia para o tratamento de cânceres múltiplos. SS1- (dsFv) - PE38 foi mostrado ter uma depuração (sanguínea)plasmática rápida e estão sendo relatadas tentativas para aumentar o peso molecular por peguilação da proteína de fusão (Filpula, D., et al., Bioconjugate Chem. (2007) 18(3): 773).
[004] MS-1, MS-2 e MS-3 são anticorpos ligados a mesotelina queelicitam a atividade efetora da imunidade na superfície celular devido a seu isotipo IgGI humano e internalizam em células que expressam a mesotelina (WO 2006/099141 A2). Um destes anticorpos, não conjugado, o anticorpo anti-mesotelina MORAb 009 IgGI quimérico ((camundongo)ratinho/homem) está sendo testado atualmente em um ensaio clínico para efeitos terapêuticos no tratamento do câncer pancreático. O mecanismo postulado de ação de MORAb 009 aciona funções efetoras da imunidade tais como o ADCC e a obstrução da função.
[005] Novas terapias com o potencial aumentado para lutar contra cânceres agressivos tais como o câncer ovariano, pancreático e pulmonar são altamente desejáveis e representam um avanço no estado da técnica. Assim, a presente invenção descreve as novas composições do imunoconjugado que são úteis no tratamento, na prevenção e/ou no diagnóstico de doenças relacionadas a mesotelina, por exemplo, câncer.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] A presente invenção se relaciona aos imunoconjugados que compreendem os anticorpos, por exemplo, os anticorpos monoclonais, ou os fragmentos destes que se ligam a mesotelina, que são conjugados aos agentes citotóxicos, por exemplo, os maitansinóides ou derivados destes, e/ou são co- administrados ou formulados com um ou mais agentes anti-câncer adicionais. Os imunoconjugados da invenção podem ser usados para tratar e/ou diagnosticar e/ou monitorar doenças relacionadas à mesotelina, por exemplo, câncer. É um objetivo da invenção o fornecimento de imunoconjugados que compreendem anticorpos, ou fragmentos do anticorpo ligados ao antígeno deste, ou variações destes, que são altamente seletivas para a parte extracelular do C-terminal de 40kDa, do polipeptídeo do precursor da mesotelina, e se ligam a mesotelina na presença do antígeno do câncer 125 (CA125; MUC16), e uma fração do efetor. As propriedades particulares dos anticorpos da mesotelina foram descritas em PCT/EP2008/009756, e em um aspecto da invenção, a combinação de sua habilidade particular especificamente ao imunoreator com a mesotelina na presença de CA125 em combinação com um agente citotóxico, por exemplo, maitansinóide, a conjugação fornece a eficácia melhorada sobre a função que obstrui os anticorpos, que competem com o CA125 para a ligação da mesotelina.
[007] Em um aspecto, os anticorpos, ou os fragmentos destes da invenção são anticorpos IgG ou fragmentos IgG. Os anticorpos ou os fragmentos podem também ser anticorpos IgG1, lgG2a, lgG2b, lgG3, IgM, IgD, IgE, IgA1 ou IgM, fragmentos Fab, fragmentos F (ab')2, fragmentos scFv, fragmentos Fv, diabodies, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia simples, anticorpos bioespecíficos, anticorpos multiespecíficos, ou anticorpos quiméricos (por exemplo, compreendendo um esqueleto do anticorpo humano enxertado na região de ligação do anticorpo humano ou não-humano, ou a um esqueleto do anticorpo não-humano enxertado a uma região de ligação do anticorpo humano ou não-humano). Os anticorpos quiméricos podem incluir, por exemplo, regiões do esqueleto do anticorpo de fontes não-humanas, como, por exemplo, vaca, rato, lhama, camelo ou coelho. As informações adicionais na engenharia dos anticorpos podem ser encontradas na literatura, por exemplo, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, (Sep, 2005) 23: 1126-1136, que é incorporado aqui por referência. Os fragmentos acima mencionados podem ser obtidos a partir de uma imunoglobulina ou ser produzidos através de meios apropriados, por exemplo, expressão de recombinação, em uma forma de fragmento. Os anticorpos ou os fragmentos do anticorpo da invenção podem também estar, onde as sequências CDR ou as regiões (por exemplo, CDR1, CDR2, CDR3) podem ser não-humanas, por exemplo, murino humanizado. Os anticorpos ou os fragmentos do anticorpo da invenção, ou das composições que incluem os anticorpos ou os fragmentos, podem incluir um agente citotóxico que seja conjugado a um anticorpo ou a um fragmento deste. Em um aspecto, o agente citotóxico é um maitansinóide ou um derivado deste, entretanto, outros agentes citotóxicos são também fornecidos, que pode incluir, por exemplo, outros agentes citotóxicos, por exemplo, aplidina, auristatina, azaribina, anastrozole, azacitidina, bleomicina, bortezomib, briostatin-1, busulfan, caliqueamicina, camptotecina, 10- hidroxicamptotecina, carmustina, celebrex, clorambucil, cisplatina, irinotecano (CPT-I 1), SN-38, carboplatina, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicina, daunomicina glucuronida, daunorubicina, dexametasona, dietilestilbestrol, doxorubicina, doxorubicina glucuronido, epirubicina glucuronido, etinil estradiol, estramustina, etoposida, etoposida glucuronido, etoposida fosfato, floxuridina (FUdR), 3',5'-O-dioleoil-FudR (FUdR-dO), fludarabina, flutamida, fluorouracil, fluoximesterona, gemcitabina, hidroxiprogesterona caproato, hidroxiuréia, idarubicina, ifosfamida, L-asparaginase, leucovorina, lomustina, mecloretamina, acetato de medroprogesterona, acetato de megestrol, melfalan, mercaptopurina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mitramicina, mitomicina, mitotano, fenil butirato, prednisona, procarbazina, paclitaxel, pentostatina, PSI-341 , estreptozocina de semustina, tamoxifeno, taxanos, taxol, propionato de testosterona, talidomida, tioguanina, tiotepa, teniposida, topotecano, mostarda de uracil, velcade, vinblastina, vinorelbina, vincristina, ricina, abrina, ribomiclease, onconase, rapLRI, DNase I, enterotoxina-A de Estafilococos, proteína antiviral pokeweed, gelonina, toxina da difteria, ou combinados destes. Qualquer um dos agentes citotóxicos podem também incluir análogos funcionais destes ou derivados destes. Em outro aspecto, a presente invenção fornece imunoconjugados nos quais o agente citotóxico é não-imunogênico, por exemplo, não aumenta a imunogenicidade do anticorpo parental contribuindo com epitopos de humanos ou célula B de mamíferos ou epitopos de célula T a uma formulação da droga.
[008] As composições da invenção podem incluir em adição aos anticorpos e fragmentos (com ou sem os agents citotóxicos conjugados acima mencionados) vários agentes anticancerígenos, que pode incluir, por exemplo, bleomicina, docetaxel (Taxotere), doxorubicina, edatrexato, erlotinib (Tarceva), etoposida, finasterida (Proscar), flutamida (Eulexin), gemcitabina (Gemzar), genitinib (Lrresa), acetato de goserelina (Zoladex), granisetron (Kytril), imatinib (Gleevec), irinotecano (Campto/Camptosar), ondansetron (Zofran), paclitaxel (Taxol), pegaspargase (Oncaspar), hidrocloreto de pilocarpina (Salagen), porfimero de sódio (Photofrin), interleucina-2 (Proleukin), rituximab (Rituxan), topotecano (Hycamtin), trastuzumab (Herceptin), Triapina, vincristina, e tartarato de vinorelbina (Navelbine), ou anticorpos terapêuticos ou fragmentos destes, ou agente anti-angiogênico, tais como, por exemplo, angiostatina, bevacizumab (Avastin®), sorafenib (Nexavar®), baculostatina, canstatina, maspina, anticorpos ou peptídeos anti-VEGF, anticorpos ou peptídeos do fator de crescimento anti-placental, anticorpos anti-Flk-1, anticorpos ou peptídeos anti-Fit- 1, peptídeos da laminina, peptídeos da fibronectina, inibidores do ativador de plasminogêneo, inibidores do tecido da metaloproteinase, interferons, interleucina 12, IP-IO, Gro-β, trombospondina, 2- metoxioestradiol, protein relacionada a proliferina, carboxiamidotriazole, CMIOI, Marimastat, polissulfato de pentosana, angiopoietina 2, interferon-alfa, herbimicina A, PNU145156E, fragmento de prolactina 16K, Linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteina, TNP-470, endostatina, paclitaxel, acutina, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM- 1470, fator 4- de plaqueta ou minociclina.
[009] A presente invenção também fornece em outro aspecto um método para tratar a doença relacionada à mesotelina administrando uma quantidade terapeuticamente efetiva de imunoconjugados da invenção, ou as composições da invenção que incluem os imunoconjugados da invenção. A doença relacionada à mesotelina pode incluir, por exemplo, câncer, tais como, um câncer de tumor sólido. O tumor sólido pode estar no ou ser originado a partir do ovário, pâncreas, trato respiratório, pulmão, colon, estômago, esôfago, cervix, fígado, mama, cabeça e pescoço.
[0010] Estas e outras modalidades são descritas ou são óbvias de e compreendidas pela descrição detalhada seguinte.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0011] Figura 1 mostra a eficácia antitumoral do imunoconjugado anti mesotelina MF-T-SPDB-DM4 em células humanas do carcinoma do pâncreas transfectadas com mesotelina em um modelo do xenógeno enxertado transfectado com mesotelina (a) assim como em tumores controle não-transfectados (b).
[0012] Figura 2 mostra a eficácia antitumoral de imunoconjugados anti- mesotelina com ligantes estáveis e cliváveis, assim como polares e não polares em um modelo de xenoenxerto de HeLaMATU com as células do carcinoma que expressam a mesotelina endógena.
[0013] Figura 3 mostra a eficácia antitumoral de imunoconjugados anti- mesotelina com lingantes estáveis e cliváveis, assim como polares e não polares em um modelo xenoenxerto transfectado com mesotelina (a) assim como em tumores controle não-transfectados (b).
[0014] Figura 4 mostra um exemplo de uma curva de resposta da dose de toxicidade de MF-T-SPDP-DM4 em células de HelaMatu positivas para mesotelina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0015] A presente invenção é baseada na descoberta de novos imunoconjugados que são específicos a ou têm uma afinidade elevada para a mesotelina e podem conferir um benefício terapêutico a um sujeito. Os imunoconjugados da invenção podem ser usados em muitos contextos, que são descritos mais completamente aqui. Deve ser compreendido que a presente invenção como descrita aqui não deve ser limitada aos detalhes particulares determinados aqui em relação a nenhum aspecto da invenção, incluindo, os anticorpos anti-mesotelina, os imunoconjugados, os métodos de tratamento, os protocolos, as linhagens celulares, a espécie ou os gêneros animais, as construções, e os reagentes descritos, porque estes podem variar. Deve também ser compreendido que a terminologia usada aqui tem a finalidade de descrever modalidades particulares somente, e não é pretendido limitar o escopo da presente invenção.
Definições
[0016] A menos que definidos de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados têm o significado aqui compreendido geralmente por um técnico no assunto a que esta invenção pertence. As seguintes referências, entretanto, podem fornecer uma das habilidades no assunto a que esta invenção pertence com uma definição geral de muitos dos termos usados nesta invenção, e podem ser referenciadas e usadas a medida que tais definições são consistentes no significado compreendido geralmente no estado da técnica. Tais referências incluem, mas não são limitadas a, Singleton et al, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2d ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991); e Lackie et al., The Dictionary of Cell & Molecular Biology (3d ed. 1999); e Cellular and Molecular Immunology, Eds. Abbas, Lichtman and Pober, 2nd Edition, W.B. Saunders Company. Quaisquer recursos técnicos adicionais disponíveis ao técnico no assunto fornecem definições de termos usados aqui apresentando o significado compreendido geralmente no estado da técnica os quais podem ser consultados. Para as finalidades da presente invenção, os seguintes termos são ainda definidos. Os termos adicionais são definidos em outra parte na descrição. Como usado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares "a," "e," e "o" inclui uma referência plural a menos que o contexto exponha claramente de outra maneira. Assim, por exemplo, a referência a "um gene" é uma referência a um ou mais genes e inclui os equivalentes conhecidos destes aos técnicos no assunto, e assim por diante.
[0017] Como usado aqui, o termo "anticorpo" inclui moléculas de imunoglobulina (por exemplo, qualquer tipo, incluindo IgG, IgE1 IgM, IgD, IgA e IgY, e/ou qualquer classe, incluindo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e Ig A2) isolado da natureza ou preparado por meio de recombinação. Como usado aqui, os anticorpos também abrangem fragmentos do anticorpo ligados ao antígeno, tais como Fab, F (ab')2, scFv (Fvs de cadeia simples), Fv, anticorpos de cadeia simples, diabodies, Fvs com ligação bissulfeto (sdFv), e os fragmentos que compreendem um domínio VL ou VH, que são preparados a partir de imunoglobulinas intatas ou preparados por meio de recombinação.
[0018] Os anticorpos e/ou os fragmentos do anticorpo ligados ao antígeno da presente invenção podem ser monoespecíficos (por exemplo, monoclonal), biespecífico, triespecífico ou mais de multi especificidade. Os anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de um antígeno ou podem ser específicos para epípotos de mais de um antígeno. Ver, por exemplo, publicações PCT, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147:60 69; patentes US 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny et al., 1992, J. ImmunoL 148:1547 1553, cada um das quais é aqui incorporada por referência.
[0019] Preferencialmente, os anticorpos ou fragmentos do anticorpo ligado ao antígeno são humanos, humanizados, murinos (por exemplo, camundongo e rato), burro, ovelha, coelho, cabra, cobaia, camelo, cavalo ou galinha. Como usado aqui, anticorpos "humanos" incluem anticorpos apresentando a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e inclui anticorpos isolados de bibliotecas humanas da imunoglobulina, de células humanas B, ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas, como descritas acima e, por exemplo, na patente americana US 5,939,598 por Kucherlapati et al. O termo anticorpo também se estende a outros esqueletos de proteína que podem orientar inserções de CDR do anticorpo na mesma conformação de ligação ativa como a encontrada em anticorpos naturais de forma que a ligação do antígeno alvo observado nestas proteínas quiméricas é mantido relativo à atividade de ligação do anticorpo natural a partir da qual os CDRs foram derivados. Como usado aqui, o termo formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm a sequência mínima derivada da imunoglobulina não-humana. Geralmente, os anticorpos humanizados são as imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos da região hipervariável (por exemplo, a complementaridade que determina as regiões "CDR") do receptor são substituídos por resíduos da região hipervariável (CDRs) de uma espécie não-humana (anticorpo doador) como o camundongo, o rato, o coelho, ou o primata não humano que tem a especificidade, a afinidade, e a capacidade desejada. Em alguns casos, os resíduos da região do esqueleto (FR) da imunoglobulina humana podem ser substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender os resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Tais modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpo humanizado pode compreender substancialmente pelo menos um ou dois domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todos os FRs são aqueles de uma sequência da imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente pode também compreender pelo menos uma parte de uma região constante da imunoglobulina (Fc), normalmente de uma imunoglobulina humana. Para revisão, ver Jones, et al., (Nature 321: 522-525, 1986); Reichmann, et al., (Nature 332:323-329, 1988); e Presta, (Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992). A preparação dos anticorpos pode ser encontrada nas patentes americanas US 7,049,135, 6,828,422, 6,753,136, 6,706,484, 6,696,248, 6,692,935, 6,667,150, 6,653,068, 6,300,064, 6,294,353, e 5,514,548, cada uma destas é incorporada aqui por completo.
[0020] Como usado aqui, o termo "Fv de cadeia simples" ou fragmentos do anticorpo " sFv" compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo, onde estes domínios estão presentes em uma cadeia simples do polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo Fv ainda compreende um ligante do polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite o sFv dar forma à estrutura desejada para o ligamento ao antígeno. Para uma revisão, veja Pluckthun (The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer- Verlag, New York, pp. 269- 315, 1994), que é incorporado aqui em sua totalidade por referência. O termo "diabodies" se refere aos pequenos fragmentos do anticorpo com os dois sítios de ligação ao antígeno, onde os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia do polipeptídeo (VH-VL). Usando um lingante que é muito curto para permitir o emparelhar entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar-se com os domínios complementares de outras cadeias e cria dois sítios de ligação do antígeno. Diabodies é mais completamente descrito em, por exemplo, EP 404.097; WO 93/11161; e Hollinger, et al, (Proc. Nacional. Acad. Sci. 90:6444 dos EUA - 6448, 1993), cada qual é incorporado aqui por referência.
[0021] A expressão "anticorpos lineares" refere-se aos anticorpos descritos no estado da técnica, por exemplo, em Zapata, et al., (Protein Eng. 8 (10): 1057-1062, 1995), que é incorporado por referência. Resumidamente, tais anticorpos compreendem um par de segmentos Fd tandem (VH-CHI-VH-CHI) que formam um par de regiões de ligação ao antígeno. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.
[0022] O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, anticorpos individuais 10 que compreendem uma população idêntica à exceção das mutações naturais possíveis que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, isto é, direcionado a um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com as preparações (policlonais) convencionais do anticorpo que incluem normalmente anticorpos diferentes direcionados aos diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é decionado a um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como a produção requerida do anticorpo por nenhum método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método do hibridoma descrito primeiramente por Kohler, et al, (Nature 256:495, 1975), ou podem ser feitos por métodos do DNA recombinante {veja, por exemplo, a patente americana US 4,816,567). Os anticorpos monoclonais podem também ser isolados das bibliotecas do anticorpo do fago usando as técnicas descritas em, por exemplo, Clackson, et al, (Nature 352:624 - 628.1991) e Marks et AL., (J. MoI. Biol. 222:581 - 597, 1991). Os anticorpos monoclonais aqui também incluem anticorpos " quiméricos" onde uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de espécies particulares ou pertence a uma classe ou a um subclasse particular do anticorpo, quando o restante das cadeias forem idênticas ou homólogas as sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertence a uma outra classe ou subclasse do anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que exibam a atividade biológica desejada (considerar, por exemplo, a patenteamericana US 4,816,567; e Morrison, et al, Proc. Nacional. Acad. Sci. EUA 81: 6851-6855, 1984, cada qual é incorporado por referência).
[0023] Como usado aqui, os termos "amostra biológica" ou " amostra de paciente" como usado aqui, se refere uma amostra obtida de um organismo ou de componentes (por exemplo, células) de um organismo. A amostra pode ser de qualquer tecido ou fluido biológico. A amostra pode ser uma "amostra clínica" a qual é uma amostra derivada de um paciente. Tais amostras incluem, mas não são limitadas a, sputum, sangue, soro, plasma, glóbulos (por exemplo, células brancas), amostras de tecido, amostras de biópsia, urina, fluido pleural, e fluido peritoneal, saliva, sêmen, exsudado da mama, fluido cerebroespinal, lágrimas, muco, linfa, citosóis, ascites, líquido amniotico, washes da bexiga, e washes ou células bronquioalveolar daí, entre outras amostras de líquido do corpo. As amostras de pacientes podem ser frescas ou congeladas, e podem ser tratadas com a heparina, o citrato, ou o EDTA. As amostras biológicas podem também incluir secções de tecidos tais como as secções congeladas obtidas para finalidades histológicas.
[0024] O termo "câncer" inclui, mas não é limitado a, tumores sólidos, como cânceres do pâncreas, mama, trato respiratório, cérebro, órgãos reprodutivos, trato digestivo, aparelho urinário, olho, fígado, pele, cabeça e garganta, tiróide, paratireóide, e suas metástases distantes. O termo também inclui sarcomas, linfomas, leucemia, e mielomas da célula plasmática.
[0025] Os tumores do trato respiratório incluem, mas não são limitados a, carcinoma do pulmão de célula pequena e da célula não-pequena, assim como o adenoma brônquico e o blastoma pleuropulmonar. Os tumores da mama incluem, mas não são limitados a, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma ductal in situ, e carcinoma lobular ductal. Os tumores do cérebro incluem, mas não são limitados a, haste do cérebro e da glioma hipotalâmico, cerebelar e astrocitoma cerebral, meduloblastoma, ependimoma, assim como tumor neuroectodérmico e pineal. Os tumores dos órgãos reprodutivos masculinos incluem, mas não são limitados a, próstata e câncer testicular. Os tumores dos órgãos reprodutivos femininos incluem, mas não são limitados a, câncer endometrial, cervical, ovariano, vaginal, e vulvar, assim como o sarcoma do útero. Os tumores do trato digestivo incluem, mas não são limitados a, anal, colon, colorretal, esofágico, da vesícula biliar, gástrico, pancreático, retal, intestino delgado, e câncer da glândula salivar. Os tumores do aparelho urinário incluem, mas não são limitados a, bexiga, pênis, rim, pelve renal, ureter, e câncer uretral. Os cânceres do olho incluem, mas não são limitados a, melanoma e retinoblastoma intraocular. Os tumores do fígado incluem, mas não são limitados a, a carcinoma hepatocelular (carcinomas da célula do fígado com ou sem variação fibrolamelar), o colangiocarcinoma (carcinoma ductal da bile intrahepática), e colangiocarcinoma hepatocelular misturado. Os cânceres de pele incluem, mas não são limitados a, a carcinoma de célula escamosa, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, câncer de pele da célula de Merkel, e câncer de pele não-melanoma. Os cânceres da cabeça- e-garganta incluem, mas não são limitados a, câncer da laringe/hipofaringe/nasofaringe/orofaringe, e câncer do lábio e da oral cavidade. Os Linfomas incluem, mas não são limitados a, linfoma relacionado a AIDS, linfoma não-Hodgkin, linfoma de célula T cutânea, doença de Hodgkin, e linfoma do sistema nervoso central. Sarcomas incluem, mas não são limitados a, sarcoma do tecido mole, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, linfosarcoma, e rabdomiossarcoma. As leucemias incluem, mas não são limitadas a, leucemia mielóide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogenosa crônica, e leucemia da célula capilar.
[0026] Como usado nesta invenção, o termo "epitopo" significa qualquer determinante antigênico em um antígeno, por exemplo, a proteína da mesotelina, ao qual o anticorpo se liga através de um sítio de ligação antigênico. As causas determinantes ou as causas determinantes antigênicas consistem geralmente de grupos de moléculas de superfície quimicamente ativa tais como cadeias de aminoácidos ou cadeias laterais do açúcar e têm geralmente características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específica. O termo " especificamente imunoreativo" se refere a uma reação de ligação entre um anticorpo e uma proteína, um composto, ou um antígeno, tendo um epitopo reconhecido pelo sítio de ligação antigênico do anticorpo. Esta reação de ligação é determinante na presença de uma proteína, de um antígeno ou de um epitopo tendo o epitopo reconhecido entre a presença 10 de uma população heterogênea das proteínas e dos outros biologies. No contexto de um imunoensaio, os anticorpos especificamente imunoreativos podem se ligar a uma proteína que tem o epitopo e o ligamento reconhecidos, se de todo, a um grau pouco detectável a outras proteínas que faltam o epitopo que estão presentes na amostra. Um contexto in vivo, "especificamente imunoreativo" pode se referir as condições sob as quais em um animal forma uma resposta imune de encontro a uma vacina ou a um antígeno, por exemplo, uma resposta humoral ao antígeno (a produção de anticorpos, de encontro a uma vacina, proteína, composto, ou antígeno apresentado a este sob condições imuno reativas) ou a mediadas pelas células (também aqui como "resposta imune celular", isto é, uma resposta intermediada por linfócitos T de encontro à vacina, à proteína, ao composto ou ao antígeno apresentados a este). Como usado aqui, o termo "condições imunologicamente reativas” é usado no contexto de um imunoensaio ou um em reação in vitro em que as condições físicas da reação, incluem, por exemplo, a temperatura, concentração de sal, pH, reagentes e suas concentrações, e as concentrações de antígeno e anticorpo cognato que é especificamente imunoreativo ao antígeno, são fornecidos ou é ajustado para permitir ligar o anticorpo cognato ao antígeno. Condições imunologicamente reativas são dependentes sobre a forma da reação de ligação do anticorpo e, geralmente esses são utilizados em protocolos de imunoensaio. Veja Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, para uma descrição de formatos e condições de um imunoensaio. O termo "paciente" ou "sujeito" como usado aqui inclui mamíferos (por exemplo, seres humanos e animais).
[0027] Como usado aqui, o termo “ligação invariante” de um anticorpo particular a mesotelina refere-se a sua habilidade de ligar a mesotelina em uma larga escala da linhagem celular expressando mesotelina do câncer que expressam formas diferentes de mesotelina. A ligação invariante pode ser causada por, mas não é restringida, ao fato de que os anticorpos, ou fragmentos do anticorpo de ligação ao antígeno destes, ou as variações destes, reconhecem um epitopo da mesotelina que não é mascarado por outro antígeno extracelular, como o antígeno do câncer 125 (CA125), que interage com a mesotelina. Para anticorpos invariavelmente ligados, os valores EC50 determinados pela titulação FACS em duas linhagens celulares distintas do câncer podem diferir não mais que 10 vezes, ou, preferencialmente, 5 vezes e mais preferencialmente entre 1 e 3 vezes.
[0028] Como usado aqui, o termo "imunoconjugado" se refere a uma molécula conjugada que compreende pelo menos um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, o ligado a um agente citotóxico, por exemplo, um maitansinoide ou um derivado deste, preferencialmente através de um grupo de ligação apropriado ou um precursor deste.Imunoconjugados da Invenção
[0029] A presente invenção se relaciona aos métodos para inibir o crescimento de células cancerosas mesotelina-positivas e a progressão da doença neoplásica fornecendo imunoconjugados anti-mesotelina. A parte do anticorpo dos imunoconjugados fornecidos é especificamente imunoreativo ao domínio do C- terminal de 40kDa do polipeptídeo do precursor da mesotelina (SEQS.ID NO. 36), que é nomeado “mesotelina” aqui.
[0030] Em um aspecto da invenção, os anticorpos, os fragmentos do anticorpo de ligação ao antígeno, e as variações dos anticorpos e os fragmentos da invenção foram descritos em PCT/EP2008/009756 e são compreendidos de uma região variável da cadeia leve e de uma região variável da cadeia pesada. As variações dos anticorpos ou dos fragmentos do anticorpo de ligação ao antígeno descritos na invenção são as moléculas em que a atividade de ligação do anticorpo ou do fragmento do anticorpo de ligação ao antígeno para a mesotelina é mantida.
[0031] A presente invenção também se relaciona aos imunoconjugados compostos de anticorpos anti-mesotelina, de fragmentos do anticorpo de ligação ao antígeno, e de variações dos anticorpos e fragmentos da invenção diferentes daqueles que foram descritos em (PCT/EP2008/009756), e ligados a um agente quimioterapêutico, por exemplo, maitansinóides, ou derivados destes.
[0032] Os maitansinóides que podem ser usados na presente invenção são conhecidoa no estado da técnica e podem ser isolados das fontes naturais de acordo com métodos conhecidos ou ser preparado sinteticamente de acordo com métodos conhecidos.
[0033] Os exemplos de maitansinóides apropriados incluem o maitansinol e os analogos do maitansinol. Os exemplos de analogos apropriados do maitansinol incluem aqueles que têm um anel aromático modificado e aqueles que têm modificações em outras posições.
[0034] Os exemplos específicos de analogos apropriados domaitansinol que tem um anel aromático modificado incluem:(1) C-19-decloro (patente Americana US 4,256,746) (preparada pela reduçãode LAH da ansamitocina P2);(2) C-20-hidroxi (ou C-20-demetil) +/-C-19-decloro (patente americana US4,361 ,650 e 4,307,016) (preparada por demetilação usando Streptomyces ouActinomyces ou declorinação usando LAH); e(3) C-20-demetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), +/-decloro (patente Americana US4,294,757) (preparada por acilação usando cloretos de acil).
[0035] Exemplos específicos de análogos apropriados de maitansinolapresentando modificações de outras posições incluem: (1) C-9-SH (patenteAmericana US 4,424,219) (preparada pela reação de maitansinol com H2S ouP2S5);(2) C-14-alcoximetil (demetoxi/CH2OR) (patente Americana US 4,331 ,598);(3) C-14-hidroximetil ou aciloximetil (CH2OH ou CH2OAc) (patenteAmericana US 4,450,254) (preparada a partir de Nocardia);(4) C-15-hidroxi/aciloxi (patente Americana US 4,364,866) (preparada porconversão de maitansinol por Streptomyces);(5) C-15-metoxi (patente Americana US 4,313,946 e 4,315,929) (isolado deTrewia nudiflora);(6) C-18-N-demetil (patente Americana US 4,362,663 e 4,322,348)(preparada por demetilação de maitansinol por Streptomyces); e(7) 4,5-deoxi (patente Americana US 4,371 ,533) (preparada pela redução detricloreto de titânio/LAH de maitansinol).
[0036] A síntese dos maitansinóides contendo tiol na presente invenção é inteiramente divulgada nas patentes americanas US 5,208,020; 5,416,064 e 7,276,497.
[0037] Maitansinóides com uma fração do tiolato na posição C-3, na posição C-14, na posição C-15 ou na posição C-20 são todos esperados para serem úteis. A posição C-3 é preferida e a posição C-3 do maitansinoide é especialmente preferida. Também são preferidos um N-metil-alanina contendo o maitansinóide com uma fração do tiolato na posição C-3, e um N-metil-cisteína contendo o maitansinóide com uma fração do tiolato na posição C-3, e análogos de cada um. Os maitansinóides preferidos são aqueles descritos nas patentes US 5,208,020; 5,416,064; 6,333,410; 6,441,163; 6,716,821; RE39.151 e 7.276.497, cada qual é incorporado aqui em sua totalidade por referência. Em uma modalidade preferida, o maitansinol esterificado é selecionado de N2' - deacetil-N2' - (3-mercapto-1- oxopropil) - maitansina (DM1, CAS. Reg. No. 139504-50-0), N2' - deacetil-N2' - (4- mercapto-1-oxopentil) - maitansina (DM3, CAS. Reg. No. 796073-54-6), e N2’- deacetil-N2' - (4-metil-4-mercapto-1-oxopentil) - maitansina (DM4 CAS. Reg. No. 796073-69-3).
[0038] Através de todo este documento, a referência é feita aos seguintes anticorpos representativos da invenção: "MF-J", "MOR06640", "MF-226" , e "MF-T". MF-J representa um anticorpo que tem uma região pesada variável correspondendo a SEQ ID NO: 28 (DNA) / SEQ ID NO: 20 (proteína) e uma região variável leve que corresponde a SEQ ID NO: 32 (DNA) / SEQ ID NO: 24 (proteína). MOR 06640 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável correspondente a SEQ ID NO: 29 (DNA) / SEQ ID NO: 21 (proteína) e a região leve variável que corresponde a SEQ ID NO: 33 (DNA) / SEQ ID NO: 25 (proteína). MF- 226 representa um anticorpo que tem uma região pesada variável corresponder a SEQ ID NO: 30 (DNA) / SEQ ID NO: 22 (proteína) e uma região leve variável que corresponde a SEQ ID NO: 34 (DNA) / SEQ ID NO: 26 (proteína). O MF-T representa um anticorpo que tem uma região pesada variável correspondente a SEQ ID NO: 31 (DNA) / SEQ ID NO: 23 (proteína) e uma região leve variável que corresponde a SEQ ID NO: 35 (DNA) / SEQ ID NO: 27 (proteína). A invenção não é limitada a estes anticorpos que são usados aqui como são exemplos. Outros anticorpos úteis são divulgados, por exemplo, em PCT/EP2008/009756. Em um aspecto, a invenção fornece os imunoconjugados que são especificamente immunoreativos ao mesotelina na presença do antígeno 125 do câncer (CA 125/MUC 16), e consequentemente alveja eficientemente as células cancerosas que expressam a mesotelina e o CA125, por exemplo células OVCAR-3.
[0039] Em outros aspectos a invenção fornece os imunoconjugados que são especificamente imunoreativos a um ou mais aminoácidos dos epitopos de MOR 06640 dos anticorpos ou de MF-T. Em determinados aspectos, esses imunoconjugados são especificamente imunoreativos a pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis aminoácidos dos epitopos de MOR 06640 dos anticorpos ou de MF-T. Em determinados aspectos os imunoconjugados da presente invenção são especificamente imunoreativos a um ou mais aminoácidos do epitopo reconhecido por MOR 06640 do anticorpo. Em aspectos alternativos, os anticorpos da presente invenção são especificamente imunoreativo a um ou mais aminoácidos do epitopo reconhecido pelo MF-T do anticorpo. Em outro aspecto, a invenção fornece os imunoconjugados que têm uma região de ligação ao antígeno que é especificamente imunoreativa ou tenha uma afinidade elevada para uma ou mais regiões da mesotelina, cuja sequência de aminoácido é descrita pela SEQ ID NO: 36. Um imunoconjugado é dito ter uma "afinidade" elevada para um antígeno se a medida da afinidade é de pelo menos 100 nM (afinidade monovalente do fragmento Fab). Um imunoconjugado inventivo pode ser preferencialmente especificamente imunoreativo a mesotelina com uma afinidade menor do que aproximadamente 100 nM, mais preferencialmente menor do que aproximadamente 60 nM, e ainda mais preferencialmente menor do que aproximadamente 30 nM. Mais preferidos ainda são os anticorpos que se ligam a mesotelina com uma afinidade menor do que de aproximadamente 10 nM, e mais preferencialmente menor do que aproximadamente 3 nM. Por exemplo, a afinidade de um anticorpo da invenção de encontro a mesotelina pode ser aproximadamente 9,1 nanômetros ou 0,9 nanômetros (afinidade monovalente do formato de IgGI).
Métodos do uso
[0040] O termo "tratamento" inclui todo o processo, ação, aplicação, terapia, ou afins, onde um sujeito (ou o paciente), incluindo o ser humano, sendo fornecida ajuda médica com o objetivo de melhorar a condição do sujeito, diretamente ou indiretamente, ou retardando a progressão de uma condição ou de uma doença no sujeito, ou melhorando pelo menos um sintoma da doença ou da doença sob o tratamento.
[0041] O termo "combinação de terapia" ou "co-terapia" significa a administração de dois ou mais agentes terapêuticos para tratar uma doença, uma condição, e/ou uma doença. Tal administração abrange a co-administração de dois ou mais agentes terapêuticos de uma maneira substancialmente simultânea, tal como dentro de uma única cápsula que tem uma taxa fixa de ingredientes ativos ou múltiplos, cápsulas separadas para cada agente inibidor. Além disso, tal administração abrange o uso de cada tipo de agente terapêutico de uma maneira sequencial. A ordem da administração de dois ou de mais agentes terapêuticos sequencialmente co-administrados não são limitados. A frase "quantidade terapêutica eficaz" significa a quantidade de cada agente administrado que conseguirá como objetivo a melhoria de uma doença, condição, e/ou em uma severidade da doença, e/ou de um sintoma destes, enquanto evita os efeitos secundários adversos associados com o tratamento terapêutico.
[0042] O termo "fármaco aceitável" significa que o item em questão é apropriado para o uso em um produto farmacêutico.
[0043] Os imunoconjugados desta invenção são esperados para serem valiosos como agentes terapêuticos. Consequentemente, uma modalidade desta invenção inclui um método para tratar as várias condições em um paciente (que incluem mamíferos) que compreenda a administração ao dito paciente de uma composição que contém uma quantidade de um imunoconjugado da invenção que é eficaz para tratar a condição alvo.
[0044] Os imunoconjugados da presente invenção podem ser usados no tratamento ou na prevenção de doenças e/ou comportamentos que são associados com a proteína da mesotelina. Estas doenças e/ou comportamentos incluem, por exemplo, o câncer, como, os carcinomas do pâncreas, ovário, estômago, esôfago, cervix, colon, fígado, trato respiratório, e pulmão. A presente invenção também se relaciona aos métodos para melhorar sintomas de uma doença em que a mesotelina é elevada ou expressa de outra maneira anormalmente. Estas doenças incluem, sem limitação, carcinomas do pâncreas, ovário, estômago, esôfago, cervix, colon, fígado, trato respiratório, e pulmão (veja, por exemplo, (Liao, Cancer Res. 57:2827-2831, 1997; Turner, Hum. Pathol. 28:740-744, 1997; Liao, et al., Am. J. Pathol. 145:598-609, 1994; Saarnio, et al., Am. J. Pathol. 153:279-285, 1998; Vermylen, et al., Eur. Respir. J. 14:806-811, 1999). Em uma modalidade da invenção, uma dose terapêutica eficaz de um imunoconjugado da invenção é administrada a um paciente que tem uma doença em que a mesotelina é elevada.
[0045] Imunoconjugados da presente invenção podem ser administrados sozinhos ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. A terapia em combinação inclui a administração de formulação de uma única dosagem farmacêutica que contenha um imunoconjugado da presente invenção e um ou mais agentes terapêuticos adicionais, assim como a administração do imunoconjugado da invenção e cada agente terapêutico adicional na sua própria formulação da dosagem farmacêutica separado. Por exemplo, um imunoconjugado da presente invenção e de um agente terapêutico pode ser administrado ao paciente junto a uma única composição oral de dosagem ou cada agente pode ser administrado em formulações orais separadas de dosagem.
[0046] Onde as formulações separadas de dosagem são usadas, o imunoconjugado da presente invenção de um ou mais agentes terapêuticos adicionais pode ser administrado essencialmente ao mesmo tempo (por exemplo, simultaneamente) ou em horas separadas coordenadas (por exemplo, sequencialmente). A ordem da administração dos agentes não é limitada. Por exemplo, em um aspecto, a co-administração de um imunoconjugado anti- mesotelina da invenção junto com um ou mais agentes anticancerígenos para potencializar o efeito do imunoconjugado anti-mesotelina ou dos agentes anticancerígenos ou de ambos é contemplado para o uso no tratamento de doenças relacionadas à mesotelina, como, câncer. Tais terapias de combinação podem também ser usadas para impedir o câncer, impedir a recorrência do câncer, para impedir a propagação ou a metástase de um câncer, ou para reduzir ou melhorar os sintomas associados com o câncer.
[0047] Um ou mais agentes anticancerígenos podem incluir qualquer composto conhecido e apropriado no estado da técnica, como, por exemplo, quimioagentes, outros imunoterapêuticos, vacinas do câncer, agentes anti- angiogênicos, citocinas, terapias hormonais, terapias gênicas, e radioterapias. Um quimioagente (ou "agente anticancerígeno" ou "agente antitumoral" ou "terapêutico" do câncer) se refere a qualquer molécula ou composto que ajude no tratamento de um câncer. Os exemplos de quimioagentes contemplados pela presente invenção incluem, mas não são limitados a, citosina arabinosida, taxóides (por exemplo, paclitaxel, docetaxel), agentes anti-tubulina (por exemplo, paclitaxel, docetaxel, epotilona B, ou seus análogos), macrolidas (por exemplo, rizoxina) cisplatina, carboplatina, adriamicina, tenoposida, mitozantrona, discodermolida, eleutherobina, 2- clorodeoxiadenosina, agentes alquilantes (por exemplo, ciclofosfamids, meclorotamina, tioepa, clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, streptozotocina, mitomicina C, e cis- diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina, tiotepa), antibioticos (por exemplo, dactinomicina (formalmente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina), antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, flavopiridol, 5-fluorouracil, fludarabina, gemcitabina, dacarbazina, temozolamida), asparaginase, Bacillus Calmette e Guerin, toxina de difteria, hexametilmelamina, hidroxiureia, LYSODREN. RTM., análogos do nucleosídeo, alcalóides da planta (por exemplo, Taxol, paclitaxel, camptotecina, topotecano, irinotecano (CAMPTOSAR, CPT-I I), vincristina, alcaloides da vinca tais como vinblastina), podofilotoxina (incluindo derivados tais como epipodofilotoxina, VP- 16 (etoposida), VM-26 (teniposida)), citocalasina B, colchina, gramicidina D, brometo de etídeo, emetina, mitomicina, procarbazina, meclorotamina, antraciclinas (por exemplo, daunorubicina (formalmente daunomicina), doxorubicina, doxorubicina lipossomal), dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, puromicina, agentes anti-mitóticos, abrin, ricina A, exotoxina de pseudomonas, fator de crescimento do nervo, fator de crescimento derivado da plaqueta, ativador do plasminogênio do tecido, aldesleucina, alutamina, anastrozle, bicalutamida, biaomicina, busulfan, capecitabina, carboplain, chlorabusil, cladribina, cilarabina, daclinomicina, estramusina, floxuride, gamcitabina, gosereina, idarubicina, itosfamida, acetato de lauprolida, levamisole, lomuslina, mecloretamina, magestrol, acetato, mercaptopurino, mesna, mitolanc, pegaspergase, pentoslatina, picamiein, riuxlmab, campath-1 , straplozocin, tioguanina, tretinoina, vinorelbina, ou qualquer fragmentos, membros da família, ou derivatidos destes, incluindo sais farmaceuticamente aceitáveis destes. Composições compreendendo um ou mais quimioagentes (por exemplo, FLAG, CHOP) são também comtemplados pela presente invenção. FLAG compreende fludarabina, citosina arabinosida (Ara-C) e G-CSF. CHOP compreende ciclofosfamida, vincristina, doxorubicina, e prednisona.
[0048] O quimioagente pode ser um agente anti-angiogenico, tais como, por exemplo, angiostatina, bevacizumab (Avastin®), sorafenib (Nexavar®), baculostatin, canstatina, maspina, anticorpos ou peptídeos anti-VEGF, anticorpos ou peptídeos do fator de crescimento anti-placental, anticorpos anti-Flk-1, anticorpos ou peptídeos anti-Fit- 1, peptídeos laminina, peptídeos da fibronectina, inibidores do ativador de plasminogênio, inibidores da metaloproteinase do tecido, interferons, interleucina 12, IP-10, Gro-β, trombospondina, 2-metoxioestradiol, proteína relacionada a proliferina, carboxiamidotriazole, CMIOI, Marimastat, polissulfato de pentosana, angiopoietina 2, interferon-alfa, herbimicina A, PNU145156E, fragmento 16K da prolactina, Linomida, talidomida, pentoxifilina, genisteina, TNP-470, endostatina, paclitaxel, acutina, cidofovir, vincristina, bleomicina, AGM- 1470, fator 4 da plaqueta ou minociclina.
[0049] Em um aspecto, dito quimioagente é gemcitabina em uma dose que varia de 100 a 1000 mg/m2/ciclo. Em uma modalidade, dito quimioagente é dacarbazina em uma dose que varia de 200 a 4000 mg/m2/ciclo. Em outro aspecto, ditas doses variam de 700 a 1000 mg/m2/ciclo. Em ainda outro aspecto, dito quimioagente é o fludarabina em uma dose que varia de 25 a 50 mg/m2/ciclo. Em outro aspecto, dito quimioagente é a arabinoside da citosina (ara-c) em uma dose que varia de 200 a 2000 mg/m2/ciclo. Em outro aspecto, dito quimioagente é o docetaxel em uma dose que varia de 1,5 a 7,5 mg/kg/ciclo. Em ainda outro aspecto, dito quimioagente é o paclitaxel em uma dose que varia de 5 a 15 mg/kg/ciclo. Em ainda outro aspecto, dito quimioagente é cisplatina em uma dose que varia de 5 a 20 mg/kg/ciclo. Ainda outro aspecto, dito quimioagente é fluorouracil 5 em uma dose que varia de 5 a 20 mg/kg/ciclo. Em outro aspecto, dito quimioagente é doxorubicina em uma dose que varia de 2 a 8 mg/kg/ciclo. Em ainda outro aspecto, dito quimioagente é o epipodofilotoxina em uma dose que varia de 40 a 160 mg/kg/ciclo. Em ainda outro aspecto, dito quimioagente é ciclofosfamida em uma dose que varia de 50 a 200 mg/kg/ciclo. Em ainda outro aspecto, dito quimioagente é irinotecano em uma dose que varia de 50 a 150 mg/m2/ciclo. Ainda outro aspecto, dito quimioagente é vinblastina em uma dose que varia de 3,7 a 18,5 mg/m2/ciclo. Em outro aspecto, dito quimioagente é vincristina em uma dose que varia de 0,7 a 2 mg/m2/ciclo. Em um aspecto, dito quimioagente é o metotrexato em uma dose que varia de 3,3 a 1000 mg/m /ciclo.
[0050] Em outro aspecto, os imunoconjugados anti-mesotelina da presente invenção são administrados em combinação com um ou mais agentes imunoterapêuticos, tais como os anticorpos ou os imunomoduladores, que incluem, mas não limitados a, Herceptin®, Retuxan®., OvaRex, Panorex, BEC2, IMC-C225, Vitaxin, Campath I/H, Smart MI95, LymphoCide, Smart I D 10, e Oncolim, rituxano, rituximab, gemtuzumab, ou trastuzumab.
[0051] A invenção também contempla administrar os imunoconjugados anti-mesotelina da presente invenção com um ou mais agentes anti-angiogênicos, que inclui, mas não é limitada a, angiostatina, talidomida, kringle 5, endostatina, antitrombina de Serpin (inibidor de Protease da Serina), e fragmentos N-terminal do 29kDa proteolítico de um C-terminal do 40kDa da fibronectina, fragmento proteolítico da prolactina, fragmento proteolítico do 16kDa do 7,8 kDa do fator-4 da plaqueta, um peptídeo e-aminoácido correspondendo a um fragmento da plaqueta fator-4 (Maione et al., 1990, Cancer Res. 51 :2077), um aminoácido peptídeo 14 que corresponde a um fragmento do colágeno I (Tolma et al., 1993, J. Cell Biol. 122:497), um peptídeo do aminoácido 19 que corresponde a um fragmento de trombospondina I (Tolsma et al., 1993, J. Cell Biol. 122:497), um peptídeo do aminoácido 20 que corresponde a um fragmento SPARC (Sage et al., 1995, J. Cell. Biochem. 57: 1329-), ou alguns fragmentos, membros da família, ou derivados destes, incluindo sais farmacêuticos aceitáveis destes. Outros peptídeos que inibem a angiogênese e correspondem aos fragmentos da laminina, fibronectina, procolageno, e EGF foram também descritos (veja a revisão por Cao, 1998, Prog. MoI. Subcell. Biol. 20:161). Os anticorpos monoclonais e os pentapeptídeos cíclicos, que bloqueiam determinadas integrinas que se ligam as proteínas RGD (isto é, possuem o motivo Arg-Gly- Asp do peptídeo), foram demonstrados para ter atividades de anti-vascularização (Brooks et al., 1994, Science 264:569; Hammes et al., 1996, Nature Medicine 2:529). Além disso, a inibição do receptor plasminogen do ativador da uroquinase por antagonistas inibe a angiogênese, o crescimento do tumor e a metástase (Min et al., 1996, Cancer Res. 56:2428-33; Crowley et al_, 1993, Proc Natl Acad. Sci. USA 90:5021). O uso de tais agentes anti-angiogênicos é contemplado também pela presente invenção.
[0052] Em outro aspecto, os imunoconjugados anti-mesotelina dapresente invenção são administrados em combinação com um regime de radiação.
[0053] Os imunoconjugados anti-mesotelina da presente invençãopodem também ser administrados em combinação com uma ou várias citocinas, que incluem, mas não são limitados a, linfocinas, fatores de necrose do tumor, fator de necrose do tumor como citocinas, linfotoxina-α, linfotoxina-β, interferon-β, proteínas inflamatórias do macrófago, fator da colônia do monocito do granulocito, as interleucinas (que incluem, mas não são limitados a, interleucina-1, interleucina-2, interleucina-6, interleucina-12, interleucina-15, interleucina- 18), OX40, CD27, CD30, CD40 ou CD 137de estimulação ligantes, ligante do Fas-Pas, 4 - IBBL, proteína de ativação do monocito endotelial ou nenhum fragmento, membros da família, ou derivados destes, incluindo sais farmacêuticos aceitáveis destes.
[0054] Os imunoconjugados anti-mesotelina da presente invenção podem também ser administrados em combinação com uma vacina do câncer, exemplos que incluem, mas não são limitados a, células ou tecidos autólogos, células ou tecidos não-autólogos, antígeno carcinoembriônico, alfa-fetoproteína, gonadotropina coriônica humana, vacina BCG viva, proteínas da linhagem do melanocito (por exemplo, gplOO, MART-1/MelanA, TRP-I (gp75), tirosinase, tumor- associado extensamente compartilhado, incluindo antígenos de tumor-específico, (por exemplo, BAGE, GAGE-I, GAGE-2, MAGE-I, MAGE-3, N- acetilglucosaminiltransferase-V, pl5), antígenos transformados que são associados ao tumor (β-catenina, MUM-I, CDK4), antígenos do nãomelanoma (por exemplo, HER-2/neu (carcinoma da mama e ovariano), papillomavirus-E6, E7 5 do ser humano (carcinoma cervical), MUC- carcinoma pancreatico 1 (mama e ovariano). Para os antígenos humanos do tumor reconhecidos por células T, veja geralmente Robbins e Kawakami, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:628. As vacinas do câncer podem ou não podem ser preparações purificadas.
[0055] Em ainda outra modalidade, os imunoconjugados anti- mesotelina da presente invenção são usados em combinação com um tratamento hormonal. Os tratamentos terapêuticos hormonais compreendem os agonistas hormonais, antagonistas hormonais (por exemplo, o flutamida, tamoxifeno, acetato de leuprolida (LUPRON), antagonistas de LH-RH), inibidores da biossíntese e processamento hormonal, e esteróides (por exemplo, dexametasona, retinoides, betametasona, cortisol, cortisona, prednisona, dehidrotestosterona, glucocorticóides, mineralocorticóides, hormônio estrogênio, testosterona, progestina), antigestagenos (por exemplo, mifepristona, onapristona), e antiandrogenos (por exemplo, acetato de ciproterona).
[0056] Os imunoconjugados anti-mesotelina da invenção podem ser usados em combinação com, por exemplo, co-administrado com um agente do fenotipo anti-MDR (de resistência a multidroga). Muitos cânceres humanos intrínsecos expressam ou desenvolvem espontaneamente a resistência a diversas classes de drogas anticancerígenas ao mesmo tempo, apesar de que cada uma das classes da droga apresenta diferentes estruturas e mecanismos de ação. Este fenômeno, que pode ser imitado em células mamíferas cultivadas, é consultado geralmente como à resistência de multidruga ("MDR") ou o fenotipo da resistência de multidroga. O fenotipo de MDR apresenta obstáculos significativos aos tratamentos quimioterapêuticos bem-sucedidos para cânceres em pacientes humanos. A resistência de tumores malignos aos agentes quimioterapêuticos múltiplos é uma causa principal da falha do tratamento (Wittes et al., Cancer Treat. Rep. 70:105 (1986); Bradley, G. et al., Biochim. Biophys. Acta 948:87 (1988); Griswald, D. P. et al., Cancer Treat. Rep. 65(S2):51 (1981); Osteen, R. T. (ed.), Cancer Manual, (1990)). Os tumores inicialmente sensíveis aos agentes citotóxicos frequentemente retornam ou tornam-se refratários às drogas quimioterapêuticas múltiplas (Riordan et al., Pharmacol. Ther. 28:51 (1985); Gottesman et al., Trends Pharmacol. Sci. 9:54 (1988); Moscow et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:14 (1988); Croop, J. M. et al., J. Clin. Invest. 81 :1303 (1988)). As células ou os tecidos obtidos de tumores e crescidos na presença de uma droga de seleção citotóxica podem conduzir à resistência cruzada a outras drogas nessa classe assim como outras classes de drogas que incluem, mas não são limitados a, de antraciclinas, alcalóides de Vinca, e epipodofilotoxinas (Riordan et al., Pharmacol. Ther. 28:51 (1985); Gottesman et al., J. Biol. Chem. 263:12163 (1988)). Assim, a resistência adquirida a uma única droga conduz à resistência simultânea a um grupo diverso de drogas que são estruturalmente e funcionalmente não relacionadas. Tal resistência pode ser um problema para os tumores de forma sólida e forma líquida (por exemplo, cânceres do sangue ou baseados na linfa).
[0057] Um mecanismo principal da resistência de multidroga em células mamíferas envolve a expressão aumentada do sistema de bomba da glicoproteína da membrana plasmática de 170kDa (Juranka et al., FASEB J 3:2583 (1989); Bradley, G. et al., Blochem. Biophys. Acta 948:87 (1988)). O gene que codifica este sistema de bombeamento, referido às vezes como um transportador de multidroga, foi clonado das células humanas cultivadas e é referido geralmente como mdrl. Este gene é expresso em diversas classes de tecidos normais, mas os substratos fisiológicos transportados para o produto do gene mdrl nestes tecidos não foram identificados. O produto de MDRI é um membro da superfamília da proteína transportadora ABC, um grupo de proteínas que têm a função de exportação dependente de energia. O produto da proteína do gene mdrl, conhecido geralmente como a P-glicoproteína (" P-170", " P-gp"), é uma proteína da membrana do transporte do plasma de 170kDa que compreende a bomba dependente de energia acima mencionada do efluxo. A expressão de PGP na superfície da célula é suficiente para tornar as células resistentes às drogas citotoxicas múltiplas, incluindo muitos agentes anticancerigenos. MDR P-gp-intermediado parece ser um componente clínico importante de resistência do tumor nos tumores de diferentes tipos, e a expressão do gene mdrl correlaciona-se com a resistência à quimioterapia em diferentes tipos de câncer. A sequência de nucleotideo do gene mdrl (Gros, P. et al., Cell 47:371 (1986); Chen, C. et al., Cell 47:381 (1986)) indica que codifica um polipeptídeo similar ou idêntico à P-glicoproteína e a são membros da classe altamente conservada de proteínas da membrana similares aos transportadores bacterianos e envolvidas em processos de transporte fisiológicos normais. A análise da sequência do gene mdrl indica que o PGP consiste em 1280 aminoácidos distribuídos entre duas metades homólogas (43% de identidade). Cada metade da molécula tem seis domínios hidrofóbicos da transmembrana e cada um tem um sítio de ligação do ATP dentro das grandes alças citoplasmáticas. Somente aproximadamente 8% da molécula é extracelular, e a fração do carboidrato (aproximadamente 30 kDa) é ligada aos sítios nesta região.
[0058] Assim, será apreciado que as células mamíferas que têm um fenótipo "resistência a multidroga" ou "resistente a multidroga" é caracterizado pela habilidade de sequestrar, exportar ou expelir uma pluralidade de substâncias citotóxicas (por exemplo, drogas quimioterapêuticas) do ambiente intracelular. As células podem adquirir este fenótipo em consequência da pressão da seleção imposta pela exposição a uma única droga quimioterápica (a toxina selecionada). Alternativamente, as células podem exibir o fenótipo antes da exposição a toxina, uma vez que a exportação de substâncias citotóxicas pode envolver um mecanismo em comum com a exportação normal de produtos de secreção celular, metabólitos e afins. A resistência a multidroga difere da resistência adquirida simples para selecionar a toxina onde a célula adquire a competência para exportar as citotoxinas adicionais (outras drogas quimioterapêuticas) a que a célula não foi previamente exposta. Por exemplo, Mirski et al (1987), 47 Cancer Res. 2594-2598, descreve o isolamento da população da célula resistente a multidroga cultivando a linhagem celular H69, derivada de um carcinoma do pulmão da célula pequena humana, na presença de adriamicina (doxorubicina) como uma toxina selecionada. As células sobreviventes foram encontradas para resistir aos efeitos citotóxicos de análogos da antraciclina (por exemplo, daunomicina, epirubicina, menogaril e mitoxantrona), acivicina, etoposida, gramicidina D, colchicina e alcalóides derivados da Vinca (vincristina e vinblastina) assim como de adriamicina. As técnicas de cultivo da seleção similar podem ser aplicadas para gerar populações resistentes a multidrogas adicionais da célula. Consequentemente, as composições farmacêuticas da invenção podem ainda incluir os compostos que atuam para inibir o fenótipo e/ou as condições de MDR associados com o fenótipo de MDR. Tais compostos podem incluir todos os compostos conhecidos do inibidor de MDR no estado da técnica, como, nos anticorpos específicos para componentes de MDR (por exemplo, anticorpos transportadores anti-MDR) ou em inibidores pequenos da molécula de transportadores de MDR, incluindo especificamente, tamoxifeno, verapamil e ciclosporina A, que são agentes conhecidos para inverter ou inibir a resistência a multidroga. (Biol de Lavie e outros J. Chem. 271: 19530-10536, 1996, incorporados aqui por referência). Tais compostos podem ser encontrados nas patentes americanas US 5,773,280; 6,225,325; e 5,403,574, cada qual é incorporada aqui por referência. Tais compostos do inibidor de MDR podem co-ser administrados com os imunoconjugados anti-mesotelina da invenção para várias finalidades, incluindo, inverter o fenótipo de MDR que segue a detecção do fenótipo de MDR para ajudar ou melhorar um tratamento quimioterapêutico. O inibidor de MDR, como, por exemplo, tamoxifeno, verapamil ou ciclosporina A, pode ser usado em conjunto com os compostos da invenção para ajudar na detecção do fenótipo de MDR. De acordo com este aspecto, um inibidor de MDR pode aumentar a tomada e o acúmulo de um composto da invenção em uma célula cancerosa de MDR uma vez que a capacidade do sistema de transporte de MDR no transporte ou na saída de bombeamento; o composto da imagem latente em frente do domínio do substrato seria diminuído na presença de um inibidor de MDR.
[0059] Em ainda outra modalidade, os imunoconjugados anti- mesotelina da presente invenção é usada em colaboração com um programa de terapia gênica no tratamento do câncer. A terapia gênica com as células recombinantes que segregam interleucina-2 pode ser administrada em combinação com os imunoconjugados inventivos para impedir ou tratar o câncer, particularmente câncer de mama (veja, por exemplo, Deshmukh et al, 2001, J. Neurosurg. 94:287). Para avaliar a habilidade de um imunoconjugado particular de ser terapeuticamente útil para tratar o câncer, como um exemplo, o imunoconjugado pode ser testado in vivo em um modelo do tumor de enxerto xenógeno do rato. Os exemplos de modelos terapêuticos são detalhados nos exemplos 1 e 2. Uma atividade do anticorpo pode também ser testada usando um ensaio da citotoxidade mediado por células dependentes dos anticorpos como descrito no exemplo 3.
Composições Farmacêuticas e Dosagens
[0060] Os imunoconjugados descritos aqui podem ser fornecidos em uma composição farmacêutica que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável. O transportador farmaceuticamente aceitável pode ser não-pirogênicos. As composições podem ser administradas sozinhas ou em combinação com pelo menos outro agente, como composto estabilizante, que pode ser administrado em algum transportador farmacêutico estéril, inclusive biocompatível, mas não limitado a, solução salina, solução salina tamponada, glicose, e água. Uma variedade de portadores aquosos pode ser empregada incluindo, mas não limitado a solução salina, glicina ou afins. Estas soluções são estéreis e geralmente livres da matéria particular. Estas soluções podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais conhecidas (por exemplo, filtragem). Geralmente, a frase "transportador farmaceuticamente aceitável" é a matéria conhecida e inclui um material, uma composição ou um veículo farmaceuticamente aceitável apropriado para administrar compostos da presente invenção aos mamíferos. Os portadores incluem preenchedores líquidos ou sólidos, diluente, excipiente, solvente ou material de encapsulamento, envolvido em carregar ou em transportar o agente em questão de um órgão, ou parte do corpo, a outro órgão, ou parte do corpo. Cada portador deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial ao paciente. Alguns exemplos dos materiais que podem servir como portadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: açúcares, como a lactose, a glicose e a sacarina; amidos, tais como o amido de milho e o amido de batata; celulose, e seus derivados, tais como a celulose carboximetil de sódio, a celulose de etilo e o acetato de celulose; tragacanto pulverizado; malte; gelatina; talco; excipientes, tais como ceras da manteiga de cacau e do supositório; óleos, tais como o óleo de amendoim, o óleo de semente de algodão, o óleo de girassol, o óleo de sésamo, o óleo de oliva, o óleo de milho e o óleo de soja; glicóis, tais como o propilenoglicol; polióis, tais como a glicerinaglicol, sorbitol, manitol e polietileno; ésteres, tais como o oleato de etilo e o laurato de etilo; ágar; agentes de proteção, tais como o hidróxido de magnésio e o hidróxido de alumínio; ácido alginico; água livre de pirogeno; solução isotonica salina; solução de Ringer; álcool de etilo; soluções de tampão fosfato; e outras substâncias compatíveis não-tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas. Agentes molháveis, emulsivos e lubrificantes, tais como o sulfato de sódio e o lauril estearatode magnésio, assim como agentes de coloração, os agentes liberadores, os agentes de revestimento, agentes adoçantes, de condimento e aromatizantes, preservativos e antioxidantes pode também estar presente nas composições do imunoconjugado da invenção.
[0061] Os exemplos de antioxidantes farmaceuticametne aceitáveis incluem: água - antioxidantes solúveis, tais como o ácido ascórbico, hidrocloreto de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfeto de sódio, sulfeto de sódio e afins; os antioxidantes solúveis em óleo, tais como o palmitato ascorbil, hidroxianisole butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato propil, alfa-tocoferol, e afins; e agentes quelantes do metal, tais como o ácido cítrico, ácido tetraacético do etilenodiamina (o EDTA), sorbitol, ácido tartarico, ácido fosfórico, e afins.
[0062] As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis como necessário para aproximar condições fisiológicas tais como ajuste de pH e tamponamento de agentes, e afins.
[0063] A concentração do imunoconjugado da invenção em tal formulação farmacêutica pode variar extensamente, e pode ser selecionada baseada primeiramente nos volumes fluidos, viscosidades, etc., de acordo com a modalidade particular da administração selecionada. Se desejado, mais de um tipo de anticorpo ou imunoconjugado podem ser incluídos em uma composição farmacêutica (por exemplo, um anticorpo com o Ka diferente para a ligação da mesotelina). As composições podem ser administradas a um paciente sozinho, ou em combinação com outras agentes, drogas ou hormônios. Além dos ingredientes ativos, estas composições farmacêuticas podem conter portadores farmaceuticamente aceitáveis apropriados que compreendem os excipientes e os auxiliares que facilitam o processamento dos compostos ativos nas preparações farmacêuticas que podem ser usadas.
[0064] As composições farmacêuticas da invenção não podem ser administradas por qualquer número de rotas que incluem, mas não limitadas a, meios orais, intravenosos, intramusculares, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdermal, subcutâneo, intraperitoneal, intranasal, parenteral, tópicos, sublingual, ou retal.
[0065] As composições da invenção contemplam adicionalmente imunotransportadores apropriados, como, proteínas, polipeptídeos ou peptídeos tais como a albumina, hemocianina, tiroglobulina e os derivados destes, particularmente albumina do soro bovino (BSA) e hemocianina do keyhole limpet (KLH), polissacáridos, carboidratos, polímeros, e fases sólidas. Outras substâncias derivadas de proteína ou não-derivadas de proteína são conhecidas por técnicos no assunto.
[0066] Nos aspectos que envolvem vacinas, por exemplo, vacinas do câncer junto com os anticorpos da invenção, as composições da invenção podem ser administradas com ou sem um adjuvante. A administração pode ser realizada na ausência de um adjuvante a fim de evitar qualquer toxicidade induzida pelo adjuvante. O técnico no assunto a que esta invenção pertence, por exemplo, um médico que é especializado em câncer, apreciará e compreenderá como verificar se um adjuvante deve ou não deve ser usado e pode depender do histórico médico de um sujeito, de dados familiares, de dados de toxicidade, de resultados da análise relacionados à alergia, etc. Nas modalidades onde um adjuvante é usado, é vantajoso que o adjuvante promova a formação de anticorpos protetores, tais como anticorpos protetores IgG. Todo o adjuvante apropriado conhecido por um técnico no assunto é contemplado pela presente invenção e adaptado prontamente a esta invenção. Os adjuvantes apropriados para o uso em animais de vacinação podem incluir, mas não são limitados a, hidróxido de alumínio, saponina e seu componente purificado Quit A, adjuvante Freund completo (CFA); adjuvante de Freund incompleto (IFA). O sulfato de dextrano foi demonstrado para ser um estimulador poderoso do anticorpo lgG2 de encontro aos antígenos estafilococais da superfície da célula, e também é apropriado como um adjuvante. Será apreciado por técnicos no assunto que alguns adjuvantes possam ser mais preferidos para a aplicação veterinária, visto que outros adjuvantes serão preferidos para o uso nos seres humanos, e que as toxicidades adjuvantes são uma consideração que deve ser feita por um técnico no assunto antes da administração do composto a um ser humano.
[0067] Formulações apropriadas para parenteral, subcutânea, intravenoso, intramuscular e afins; portadores farmaceuticamente apropriados; e as técnicas para a formulação e a administração podem ser preparadas por alguns dos métodos conhecidos no estado da técnica (veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20th edition, 2000). As formas de dosagens líquidas para a administração oral dos compostos da invenção incluem emulsões farmaceuticamente aceitáveis, microemulsão, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Além do ingrediente ativo, as formas de dosagens líquidas podem conter o diluente inerte de uso geral no estado da técnica, como, por exemplo, na água ou nos outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes, tais como o álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzilico, benzoato de benzil, propilenoglicol, 1, 3 - butilenoglicol, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, amendoim, milho, germem, azeitona, de castor e de sésamo), glicerol, álcool tetrahidrofuril, polietilenoglicóis e ésteres do ácido graxos de sorbitano, e misturas destes. As frases "administração parenteral "e" administrado parenteralmente"; como usado aqui significa modalidades da administração à excepção da administração enteral e tópica, geralmente por injecção, e inclui, sem limitação, intravenoso, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaco, intradermal, intraperitoneal, transtraqueal, subcutâneo, infusão subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnóide, injeção intraespinal e intraesternal. A determinação de uma dose terapêutica eficaz está bem dentro da capacidade técnicos no assunto.
[0068] Uma dose terapêutica eficaz se refere a quantidade de um imunoconjugado que possa ser usado para tratar eficazmente uma doença (por exemplo, câncer) comparada com a eficácia que é evidente na ausência da dose terapêutica eficaz.
[0069] A dose terapêutica eficaz pode ser estimada inicialmente nos modelos animais (por exemplo, camundongos, ratos, coelhos, cães ou porcos). O modelo animal pode também ser usado para determinar a escala de concentração e a rota de administração apropriada. Tal informação pode então ser usada para determinar doses e rotas úteis para a administração nos seres humanos. Eficácia e toxicidade terapêutica (por exemplo, ED50 - a dose terapêutica eficaz em 50% da população e LD50 - a dose letal em 50% da população) de um imunoconjugado podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de célula ou em animais experimentais. A relação da dose tóxica aos efeitos terapêuticos consiste no índice terapêutico, e pode ser expressa como a relação, LD50/ED50. Os dados obtidos dos estudos animais podem ser usados para formular uma escala de dosagem para o uso humano. A dosagem contida em tais composições pode estar dentro de uma escala de concentrações de circulação que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem varia dentro desta escala dependendo da forma de dosagem empregada, da sensibilidade do paciente, e da rota de administração.
[0070] A dosagem exata pode ser determinada pelo médico, de acordo com os fatores relativos ao paciente que necessita do tratamento. A dosagem e a administração podem ser ajustadas para fornecer níveis suficientes do imunoconjugado ou para manter o efeito desejado. Os fatores que podem ser levados em consideração incluem a severidade do estado da doença, saúde geral do sujeito, idade, peso, e o sexo do sujeito, dieta, época e frequência da administração, combinações da droga, sensibilidades da reação, e tolerância/resposta à terapia. Os polinucleotidos que codificam imunoconjugados da invenção podem ser construídos e introduzidos em uma célula utilizando técnicas in vivo ou in vitro bem conhecidas que incluem, mas não são limitadas a, transferência do DNA intermediada pela transferrina-polication, transfecção com ácidos nucleicos livres ou encapsulados, a fusão celular intermediada pelo lipossoma, transporte intracelular de partículas de látex revestidas pelo DNA, fusão do protoplasma, infecção viral, eletroporação, " injetor do gene, " e a trasfecção intermediada pelo DEAE ou o fosfato de cálcio.
[0071] As dosagens eficazes in vivo de componentes de toxofora de um imunoconjugado é de aproximadamente 5μg a aproximadamente 500 μg/kg do peso corporal do paciente. A modalidade da administração de composições farmacêuticas contendo imunoconjugados da presente invenção pode ser qualquer rota apropriada para entregar o anticorpo ao hospedeiro. Como um exemplo, as composições farmacêuticas da invenção podem ser úteis para a administração intravenosa, administração intranasal parenteral (por exemplo, subcutânea, intramuscular,). Todas as patentes e pedidos de patente mencionadas nesta divulgação são incorporadas aqui por referência. A divulgação acima descreve geralmente a presente invenção. Uma compreensão mais completa pode ser obtida através da referência aos seguintes exemplos específicos, que são fornecidos para finalidades de ilustração somente e não pretendendo limitar o escopo da invenção.EXEMPLO 1: Eficácia do Imunoconjugado em um modelo em (camundongos xenoenxertados)ratinhosde xenoenxerto de carcinoma pancreático humano que expressa mesotelina.
[0072] A fim de analisar se os imunoconjugados anti-mesotelina poderiam reduzir o crescimento dos tumores em uma maneira dependente da mesotelina, as células pancreáticas humanas do carcinoma (MiaPaCa-2) foram transfectadas estavelmente com a mesotelina e foram usadas para estabelecer um modelo de tumor de crescimento subcutâneo em (camundongos)ratinhos. A linhagem celular humana HT29 do carcinoma do cólon foi usada para estabelecer tumores de controle negativo da mesotelina dentro do estudo da eficácia. As células de MiaPaCa foram mantidas como culturas aderentes no meio de DMEM suplementadas com 10% (v/v) FCS, 2,5% (v/v) soro de cavalo, 1,5 g/l do bicarbonato de sódio, 4,5 g/l da glicose, glutamina 4mM e 0,4% (v/v) Higromicina. As células HT29 foram cultivadas em meio 5a de McCoy com glutamina 1,5mM, 2,2g/l bicarbonato de sódio e FCS 10% (v/v). A expressão de Mesotelina em células MiaPaCa-2 e ausência de mesotelina nas células HT29 foi confirmada por FACS (não mostrado). Para avaliar o crescimento das células do tumor in vivo, camundongos nudes fêmeas NMRI foram inoculados subcutâneamente no flanco direito com 3 x 106 de células MiaPaCa-2 ou 1 x 106 de células HT29, resuspendidas em 50% Matrigel™ e em meio 50%. Como imunoconjugados anti-mesotelina os MF- J-SPDB-DM4, MF-T-SPDB-DM4, MF226-SPDB-DM4 e MOR6640-SPDB-DM4 foram testados em doses de tratamento de 0,01 mg/kg, de 0,03 mg/kg, de 0,05 mg/kg e de 0,2 mg/kg (relativos à quantidade de toxophore). MF-J-SPDB-DM4, MF-T-SPDB- DM4, MF226-SPDB-DM4 e MOR6640-SPDB-DM4 foram gerados pelo seguinte procedimento: Os anticorpos anti-mesotelina foram modificados com ácido 4-[2- piridiltio] butanóico de N-hidroxisuccinimida do éster (SPDB) para introduzir grupos do ditiopiridil. Em 8 mg/mL de anticorpo, um excesso molar de ~ 6-vezes de SPDB (solução conservada em estoque de ~ 20mM em EtOH) foi usado para modificar o anticorpo.
[0073] Os anticorpos modificados foram reagidos com um excesso (do) molar de 1,7 vezes da forma livre de tiol do maitansinóide sobre o tiopiridil. A reação foi realizada em 2,5 mg/ml de anticorpo na presença do dimetilacetamida a 3% (3% - v/v) por 20 horas em temperatura ambiente. A mistura de reação da conjugação purificada dos biprodutos sem reação da droga e da reação usando uma coluna de dessalinização Sephadex G25. O número de moléculas de maitansinóide por anticorpo foi calculado medindo as (absorbâncias) absorvâncias a 252 nm e em 280 nm, usando coeficientes de extinção de 224000 M-1 cm-1 para o anticorpo e 5180 M-1 cm-1 para DM4 a 280nm. A relação da (absorbância)absorvância entre 252 nm/280 nanômetro é de 0,37 para o anticorpo e 5,05 para DM4.
[0074] O tratamento começou após o estabelecimento do tumor no dia 5 após a inoculação da célula tumoral, seguido por dois tratamentos adicionais nos dias 8 e 12 após a inoculação da célula tumoral. Os camundongos controle foram tratados com 0,2 mg/kg do imunoconjugado não alvo (anti-lisozima-SPDB-DM4) ou com os volumes iguais de veículo sozinho (10 mM de histidina, 130 mM de glicina, 5% (p/v) sacarina, pH 5,5). Os tratamentos ocorreram com um volume de dosagem do peso corporal de 100 μl/10 g através da aplicação intravenosa. Os grupos consistiram em 6 animais cada um. O estado de saúde dos camundongos foi examinado diariamente. O comprimento e a largura dos tumores subcutâneos foram medidos usando um compasso de calibre eletrônico, duas vezes por a semana. A área do tumor foi calculada pela fórmula: área do tumor [mm2] = comprimento [mm] x largura [mm]. Todos os dados obtidos durante todo o experimento foram documentados. Um exemplo da eficácia antitumoral do imunoconjugado anti- mesotelina MF-T-SPDB-DM4 em células de carcinoma do pâncreas humano transfectado com mesotelina em diferentes doses de tratamento mostrado na figura 1. Os camundongos nude fêmeas NMRI foram inoculados com 3 x 106 células humanas mesotelina positivas do carcinoma do pâncreas MiaPaCa-2 ou 1 x 106 células humanas mesotelina negativas do carcinoma do colon HT29 (b) ressuspendidas em 50% Matrigel™/ 50% de meio em seu flanco direito. 5, 8, e 12 dias após a inoculação da célula tumoral, os camundongos receberam 0,01, 0,03, 0,05, 0,2 mg/kg de MF-T-SPDB-DM4, (todas as concentrações se relacionam à quantidade de toxophore), ou veículo sozinho. O comprimento e a largura dos tumores foram medidos duas vezes por semana e a área do tumor foi calculada pela multiplicação da largura pelo comprimento.
[0075] Os valores médios e a derivação padrão para cada grupo e ponto de tempo medido foram traçados. Todo o n = 6. Asterisco indica valores de P < 0,05.
[0076] O tratamento dos camundongos portadores de tumor revelou que todos os imunoconjugados anti-mesotelina testados puderam suprimir o crescimento in vivo dos tumores MiaPaCa-2 de mesotelina positivos em doses de 0,03 mg/kg, 0,05 mg/kg e 0,2 mg/kg. Em doses de 0,05 mg/kg e de 0,2 mg/kg de MF-T-SPDB-DM4 completou a erradicação do tumor sem recrescimento de tumores ocorridos até o fim do período de observação de 132 dias. 0,05 mg/kg de controle não alvo de anti-lisozima SPDB-DM4 não tiveram nenhum efeito no crescimento positivo de mesotelina do tumor de MiaPaCa (tabela 1). Comparado aos tumores não tratados e veículo tratados, o crescimento dos tumores de mesotelina negativos de HT29 não foi reduzido significativamente pela dose mais elevada de 0,2 mg/kg MF-T-SPDB-DM4. Isto demonstra que a eficácia inibitoria do tumor forte de MF-T- SPDB-DM4 é dependente da mesotelina expressa dentro do tumor.
[0077] Tabela 1: Eficácia inibitória do tumor de imunconjugados anti- mesotelina no modelo positivo do tumor do xenógeno enxertado de MiaPaCa da mesotelina.
Figure img0001
Figure img0002
EXEMPLO 2: Eficácia nos tumores que expressam mesotelina endogena e a comparação de diferentes ligantes.
[0078] A fim de testar se os imunoconjugados anti-mesotelina podem suprimir o crescimento de mesotelina endogena expressada em células tumorais in vivo, um modelo do xenógeno enxertado com crescimento subcutâneo do carcinoma das células da cervix humanas (HeLaMATU) foram usados. As células de HeLaMATU foram mantidas como culturas aderentes no meio DMEM/HAMS12 suplementadas com 10% (v/v) de FCS, 2,5% (v/v) de soro de cavalo, piruvato do sódio a 1%, e 1% (w/v) de glutamina. A expressão de mesotelina foi confirmada pela análise de FACS in vitro. Os camundongos nude fêmeas de NMRI foram inoculados subcutaneamente com 1,5 x 106 células de HeLaMATU, ressuspendidas em 50% Matrigel™/50% de meio, no flanco direito. Foi direcionado adicionalmente se a troca do ligante SPDB clivado por um polar (-sulfo-SPDB), por um ligante estável (- SMCC), ou por um ligante polar estável (-(PEG) 4-mal) conduz a uma eficácia antitumoral alterada de imunoconjugado de base MOR6640 in vivo. Certos camundongos da ligação do tumor de HeLaMATU foram tratados intravenosamente com 0,2 mg/kg de MOR6640-SPDB-DM4, de MOR6640-SMCC-DM1, de MOR6640- Sulfo-SPDB-DM4, ou de MOR6640- (PEG) 4-mal-DM1 (relativo à quantidade de toxophore) no dia 5, 8, e 12 após a inoculação da célula tumoral. Os camundongos controle foram tratados com 0,2 mg/kg do imunoconjugado não alvo (anti-Iisozima- SPDB-DM4) ou com volumes iguais de veículos isolados. Os grupos consistiram de 6 animais cada um. A examinação diária do estado de saúde dos camundongos foi conduzida. O comprimento e a largura dos tumores subcutaneos foram medidos usando um compasso de calibre eletrônico duas vezes por semana. A área do tumor foi calculada pela fórmula: área do tumor [mm2] = comprimento [mm] x largura [mm]. Os dados obtidos são apresentados na figura 2. O tratamento de camundongos portadores do tumor revelaram que a) que os imunoconjugados anti-mesotelina foram eficientes em suprimir o crescimento dos tumores que expressam o mesotelina endogena in vivo e b) os conjugados com ligantes clivaveis (MOR6640- SPDB-DM4 e MOR6640) indicaram um eficacia antitumoral mais elevado do que os conjugados com ligantes estáveis (MOR6640-SMCC-DM1 e MOR6640- (PEG) 4- mal-DM1). Em particular, MOR6640-SPDB-DM4 e MOR6640-sulfo-SPDB-DM4 conduziram a uma erradicação dos tumores de todos os animais tratados onze dias após o último tratamento, visto que o tratamento com MOR6640-SMCC-DM1 e MOR6640- (PEG) 4-mal-DM1 conduziu somente a um atraso do crescimento do tumor. Entretanto, onze dias depois do último tratamento, a área dos tumores tratados com o MOR6640-SMCC-DM1 e o MOR6640- (PEG) 4-mal-DM1, respectivamente, foi significativamente menor em comparação aos tumores tratados com veículo ou anti-Iisozima-SPDB-DM4. O conjugado controle não alvo não teve nenhum efeito no crescimento do tumor. A fim de comparar a eficácia antitumoral dos diferentes ligantes em um segundo modelo do xenógeno enxertado, nós empregamos o modelo com vetor subcutaneamente crescente ou transfectado por mesotelina (#37) as células MiaPaCa-2 (células humanas do carcinoma do pâncreas). As células do vetor MiaPaCa-2 e MiaPaCa-2#37 foram mantidas como culturas aderentes no meio DMEM/HAMS12 suplementadas com 10% (v/v) FCS, 1% (w/v) glutamina, e 0,1mM de aminoácidos não-essenciais. A expressão de Mesotelina foi confirmada pela análise de FACS e pela análise immunohistoquimica de tumores subcutaneos ex vivo. Os camundongos nude fêmeas NMRI foram inoculados subcutaneamente com 3 x 106 células de vetor MiaPaCa-2 e MiaPaCa- 2#37, resuspendidos no meio de 50% Matrigel™/50% de meio, respectivamente, no flanco direito. Os camundongos portadores de tumor foram tratados com 0,05 mg/kg de MOR6640-SPDB-DM4, de MOR6640-SMCC-DM1, de MOR6640-Sulfo-SPDB- DM4, ou de MOR6640- (PEG) 4-mal-DM1 (relativo à quantidade de toxophore) no dia 5, 8, e 12 após a inoculação da célula do tumor. Os camundongos controle foram tratados tanto com 0,05 mg/kg do Imunoconjugado não alvo (anti-lisozima-SPDB- DM4) ou com volumes iguais de veículo isolado. Os grupos consistiram em 6 animais cada um. O exame diário do estado de saúde dos camundongos foi conduzido. O comprimento e largura dos tumores subcutâneos foram medidos usando um compasso eletrônico duas vezes por semana. A área de tumor foi calculada pela fórmula: área do tumor [mm2] = comprimento [mm] x largura [mm]. Os dados de crescimento de tumor são apresentados na Figura 3. Camundongos portadores de mesotelina expressando tumores, o tratamento com MOR6640-SPDB- DM4 e MOR6640-sulfo-SPDB-DM4 levou a uma erradicação dos tumores de todos animais tratados após 12 dias do último tratamento. No entanto, o re-crescimento destes tumores foi obtido dez dias mais tarde (Figura 3A). O tratamento com MOR6640-SMCC-DM 1, MOR6640-(PEG)4-mal-DM1, e anti-lisozima-SPDB-DM4 não afetaram significativamente o crescimento do tumor. Em contraste com mesotelina expressando tumores, nenhum dos tratamentos levou a um crescimento alterado das células MiaPaCa-2 transfectadas pelo vetor in vivo (Figura 3B).EXEMPLO 3: Citotoxidade in vitro de imunoconjugados anti-mesotelina.
[0079] Para avaliar a citotoxidade de imunoconjugados anti-mesotelina, diferentes mesotelinas que expressam linhagens celulares foram crescidas em uma confluência 80-90%, tripsinizadas e contadas. As células foram então semeadas em placas com 384 poços inferiores a 800 com 25ul de volume por poço dentro seus meios do crescimento para todas as linhagens celulares. Os poços dos meios foram ajustados para a subtração em branco. Em 24h após a semeadura MF-J-SPDB- DM4, MF-226-SPDB-DM4 MOR6640-SPDP-DM4, MF226-SPDP-DM4 e anti- Lisozima - SPDP-DM4 foram dosados na escala de 0,01 a 3 00 nM. As Triplicatas foram configuradas para cada diluição. As medidas do valor final foram realizadas em 96hrs. A viabilidade da célula foi avaliada pela medida do ensaio WST-1 (Roche Cat# 1644807). Os valores IC50 são mostrados na tabela 2.
[0080] Uma curva de resposta de dose que demonstra a citotoxidade de MF-T-SPDP-DM4 em células de HelaMatu é mostrada in vitro na figura 4.Tabela 2: valores do nanômetro IC50 de anti-mesotelina imunoconjugados no mesotelina que expressa linhagem celular.
Figure img0003
Figure img0004

Claims (5)

1. Imunoconjugado caracterizado por compreender um agente citotóxico e um anticorpo humano ou humanizado ou um fragmento funcional deste, em que o referido anticorpo ou fragmento funcional deste compreende uma região de ligação a antígeno que é específica para Mesotelina (SEQ ID NO: 36), e em que o sítio de ligação do anticorpo inclui uma CDR1, CDR2 e CDR3 em que:a) HCDR1 é apresentado pela SEQ ID NO: 3,b) HCDR2 é apresentado pela SEQ ID NO: 6,c) HCDR3 é apresentado por SEQ ID NO: 9,d) LCDR1 é apresentado pela SEQ ID NO: 12,e) LCDR2 é apresentado pela SEQ ID NO: 15,f) LCDR3 é apresentado pela SEQ ID NO: 19, eem que o agente citotóxico é um maitansinoide.
2. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do anticorpo ou do fragmento funcional deste compreender um domínio variável de cadeia pesada correspondente a SEQ ID NO: 23.
3. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato do maitansinoide ser DM4.
4. Imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato do anticorpo ou do fragmento funcional deste e do DM4 estarem ligados por meio de um ligante SPDB.
5. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um imunoconjugado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um veículo ou excipiente farmacêutico aceitável do mesmo.
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