TWI351966B - Therapeutic formulations of keratinocyte growth fa - Google Patents

Description

1351966 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於凍乾角質細胞生長因子之調配物及用於製 造包含角質細胞生長因子之凍乾組合物之方法。 【先前技術】 角質細胞生長因子（KGF)係對於上皮細胞具有特異性之 生長因子，其在人類胚胎肺纖維母細胞株之改良性培養基 中首次識別[Rubin 等人，Proe. 86:802-806 (1989)]。在源自上皮組織之若干基質纖維母細 胞株之不同發育階段中已偵測到KGF之信息核糖核酸之表 現。KGF之轉錄在自正常成人腎臟及腸胃管道器官萃取之 RNA 中亦已明顯[Finch 等人，Sc/ertce 245:752胃755 (1989) ]。在培養中KGF由纖維母細胞分泌且活體内在真皮 而非表皮中表現之跡象顯示：KGF可能係角質細胞增殖之 一重要的正常副分泌效應。研究已顯示：KGF在組織培養 中刺激初級或次級人類角質細胞之增殖中與表皮生長因子 (EGF)同樣有效[Marchese等人，《/. Ce//. PA少144:326-332 (1990) ]。KGF由許多器官之上皮附近之間葉細胞產生，該 等器官之上皮包括表皮、口腔及下腸胃上皮、胰腺、肝、 肺、尿道上皮、前列腺上皮及其他[Finch等人 ，supra » Housley 等人，/ hve"· 94:1764-77, (1994) ; Yi 等 人，dw J 尸以/2· 145:80-85，（1994) ; Pierce等人，J 五印

MeA 179831-40，（1994) ; Yi等人，J t/ro/. 154:1566-70, (1995),及 Ulich 等人 ’《/ 93:1298-1306 107296.doc (1994)] 〇 國際專利公開案W〇 90/08771中描述：自人類胚胎纖維 母細胞株之改良性培養基中純化KGF ;及經純化之KGF之 部分胺基酸序列；KGF基因之選殖；及產生生物活性重組 KGF之細菌細胞中之基因表現。此公開案亦揭示可用作灼 傷創口之創口癒合劑或用來刺激經移植之角膜組織的Kgf 或KGF樣多狀。 對正常成年動物之活體外及活體内研究顯示：kGF_丨（以 下為"KGF")在毛囊形態形成、肝細胞增殖、及肺、胸、胰 腺、胃、小腸及大腸中之上皮細胞增殖中產生變化[Pan〇s 等人，·/. /nvew. 92:969-977 (1993) ; Ulich等人，jm. «/·户如/z. 144:862-868 (1994) ; Yi 等人，/. 145.80-85 (1994)，及 Ulich等人 ’《/. /«να，. 93:1298· 1306 (1994)]。當前正在研究KGF在胚胎及新生兒發育中 之作用；然而，已記載KGF在新生小鼠之精囊發育中係_ 重要介體[Alarid等人，尸"％.；\^/.」£^15^.6^491:1〇74-1078 (1994)]。此外，在肝細胞内過度表現KGF之小鼠展 示多囊腎[Nguyen等人，12:2109-19,（1996)]，而 使用一界面活性促進劑在肺中過度表現KGF導致小鼠伴發 肺部囊腺瘤[Simonet 等人，/Voc. A^/. 5W. "Μ 92:12461-65，（1995)]，表明KGF在正常腎臟及肺發育中之 重要性。 已表明：在將重組KGF局部應用於在兔耳或豬皮中之外 科誘發之創口時，KGF增加上皮再植且增加上皮之厚度 107296.doc 1351966 [Pierce等人，J.五叩·似179:831-840 (1994);及 Staiano-Coico 等人’ i 五;φ. mm. 178:865_878 (1993)]。B〇sch 等 人，[乂 C"«. /«veiyr. 98:2683-2687 (1996)]報導投與角質細 胞生長因子將誘發肝細胞之增殖。 通常’經純化之多肽在含水狀態下僅係半穩定的 (marginally stable)，且在加工及儲存中經受化學及物理降 解導致生物活性損耗。此外，水溶液中之多肽組合物經受 水解，諸如脫醯胺及肽鍵斷裂，此等效應代表希望將其在 —基於生物活性之界定劑量範圍内對人類投與之治療用活 性多肽的一嚴重問題。 投與經純化之角質細胞生長因子仍係治療影響人類群體 之許多疾病的有前景候選。然而，未曾提出KGF隨著時間 的過去在不同儲存條件下保持為一穩定醫藥組合物且隨後 在患者活體内有效之能力。因此，此項技術中仍需要提供 L疋》周配物形式之角質細胞生長因子，其可用作治療不同 疾病之治療劑，該等疾病受益於KGF-介導刺激之上皮細 胞生長。 【發明内容】 本發明提供適用於凍乾角質細胞生長因子（KGF)之新穎 凋配物，生成高穩定性KGF產品。該穩定KGF產品用作治 療®患可文益於投與KGF之病症或病症之個體的治療劑。 在態樣中，本發明提供一種凍乾角質細胞生長因子組 计勿，勺^^ "匕έ組胺酸、膨化劑、界面活性劑及諸如穩定化 糖之糖。 107296.doc 1351966 在一實施例中，該KGF组合物包含SEQ出N〇:2之胺基 酸序列或其變異體。KGF蛋白質之變異體包㈣偶基因變 異體或胺基酸之（數個）缺失體、（數個）取代體或（數個）插入 體’包括原生KGF之片段、嵌合或雜交分子。舉例而言，

本發明涵蓋KGF係ΔΝ23 KGF(SEq ID n〇:3)，其中，原生 KGF之最前端的胺基㈣缺失。變異體包括本文描述之彼 等分子，諸如電荷變換多肽，其中原生KGF之-或多個胺 基酸殘基仏叫㈣ID N0:2)缺失，或經中性殘基或帶負 電荷之殘基取代’選擇該殘基係以_還原之正電荷影響蛋 白質。KGF之另-實例包括(但$限於）：#由取代至少— 個胺基酸產生之蛋白質’該等蛋* f在原生咖之 W'ms丨'Tyr】”‘W〜丨9成環區域内具有對至少— 個胺基酸之較高的成環潛能環形成可能。又一實例包括： 在原生KGF之胺基酸123_133(SEQ m N〇:2之胺基酸 154-164)之區域内具有—或多個胺基酸取代體、缺失體或 添加體之蛋白質。 在一態樣中，本發明涵蓋膨化劑/容積滲透濃度調節劑 之用途。膨化劑可為結晶(例如甘胺酸、甘露糖醇)或非晶 形(例如’ L-組胺酸；蔬糖；諸如葡聚糖、聚乙烤吼咯： 嗣 '叛甲基纖維素之聚合物及乳糖）。在一實施例中“亥 膨化劑為甘露糖醇。在另_實施财，甘露糖醇以約以 w/v至約5% w/v之濃度併入。在又一實施例中，該濃度為 約3% W/V至約4,5% w/v。在另—實施例中，甘露糖醇之濃 度為4% w/v。 107296.doc 1351966 在另一態樣中，本發明提供一種包含穩定化糖之組合 物。所涵蓋之適於使用之糖包括（但不限於）薦糖' 海藻糖 或甘胺酸。在-實施例中’該糖為$糖。在—相關實施例 中，該庶糖之濃度為約卜3% w/v。在另一實施例中，該蔗 糖之濃度為2%。 涵蓋將本發明之組合物調節pH值至約5 〇至約8 〇之範 圍。在一實施例中，該KGF組合物具有約6〇至約8〇範圍 之pH值。在另一實施例中，該組合物具有約6 〇至約7 〇範 圍之PH值。在另一實施例中，該組合物具有約6 $之 值。 在另一態樣中，該組合物涵蓋界面活性劑之用途。所涵 蓋使用之界面活性劑包括（但不限於），聚山梨醇酯2〇或聚 山梨醇酯80。在一實施例中，該界面活性劑為聚山梨醇酷 。在一相關實施例中，該聚山梨醇酯2〇濃度在約〇1% w/v至約0.004% w/v之範圍内。在另一實施例中該聚山 梨醇酯20濃度為約0.01% w/v。 在一態樣中，本發明涵蓋一種凍乾角質細胞生長因子組 合物，包含10 mM組胺酸、4%甘露糖醇、2%蔗糖及〇 〇1% t山梨酵酷20 ’其中該組合物之pH值為6 5。 本發明進一步提供一種用於製造凍乾角質細胞生長因子 之方法，包含以下步驟：a)製備組胺酸 '膨化劑、穩定化 糖及界面活性劑之溶液；及b)凍乾該KGF。在一相關態樣 中，本發明涵蓋一種用於製造凍乾角質細胞生長因子之方 法，進一步包含：在凍乾之前之以下步驟· b)調節該溶液 107296.doc •10- 丄妁1966 PH值至約6.0與約8.〇之間；。)製備含有角質細胞生長因子 之溶液“)緩衝交換步驟⑷中之溶液為步驟(b)中之溶 液；e)添加適當量之界面活性劑；及⑽乾來自步驟⑷: 混合物。本發明進一步涵蓋該KGF可係列於沾9 ι〇 SEQIDNC^或其變異體之Kgf蛋白。 ·，

在一態樣中，本發明之方法涵蓋膨化劑/容積滲透濃度 調節劑之用途，其中該膨化劑可為結晶（例如甘胺酸、^ 露糖酵）或非晶形（例如L-組胺酸；蔗糖；諸如葡聚糖、聚 乙烯吼咯啶酮、羧甲基纖維素之聚合物及乳糖）。在一實 施例中’該膨化劑為甘露糖醇。在另一實施射，該甘露 糖醇之濃度為約2%w/v至約5%w/v。在—相關實施例中， 該甘露糖醇濃度為約3% w/v至約45% w/v。在另一實施例 中’該甘露糖醇之濃度為4〇/〇 w/v。 在另一態樣中，本發明之方法提供一種包含糖之組合 物’其中該糖為穩定化糖。所涵蓋使用之糖包括（但不限

於）薦糖、海藻糖或甘胺酸。在-實施例中，該糖為嚴 糖。在一相關實施例中，該蔗糖之濃度為約w〜至約 3%W/V。在另-實施例中，該蔗糖之濃度為2%。 本發明之方法涵蓋將PH值調節至生理ρίΐ值。在一實施 例中，將ΡΗ值調節至約5()至約8()之範圍。在另一實施例 中’將PH值调節至約6·0至約8.0之範圍》在另一實施例 中將pH值调節至約6.0至約7·〇之範圍。在又一實施例 中’將pH值調節至約6 5。 在另態樣中’本發明之方法涵蓋界面活性劑之用途。 107296.doc 1351966 所涵蓋使用之界面活性劑包括（但不限於）聚山梨醇酯2〇或 聚山梨醇酯80。在一實施例中，該界面活性劑為聚山梨醇 酯20。在一相關實施例中，該聚山梨醇酯2〇濃度在約 ' w/v至約〇.〇〇4〇/。w/v之範圍内。在另一實施例中，該聚山 • 梨醇酯20濃度為約〇.〇 1 % w/v。 • 在一態樣中，本發明涵蓋一種用於製造凍乾角質細胞生 ^ 長因子組合物之方法，該組合物包含10 mM組胺酸、4%甘 φ 露糖醇、2〇/°蔗糖及0,01%(w/v)聚山梨醇酯20，其中該組合 物之pH值為6.5。 本發明進一步涵蓋—種藉由增加KGF_介導刺激上皮細 胞生長來治療疾病之方法，其包含對受檢者投與有效量之 本發明之凍乾角質細胞生長因子組合物。 所涵盍之待治療疾病係消化道毒性；黏膜炎；灼傷或其 他局uP及全。p厚度損傷；毛囊、汗腺及皮脂腺再生；附件 結構增殖；大皰性表皮鬆懈；化學療法誘狀充髮；男性 • 31儿髮@ /貝瘍,十—指腸潰瘍；糜爛性胃炎；食道炎或 民道逆"IL，發炎性腸病；透明膜病，•煙霧吸入引起之損. 傷，肺氣腫，肝硬化；肝衰竭；急性病毒性肝炎，其他肝 毒性知傷；或移植物抗宿主病（GVHD)。 本心月亦涵蓋一種用於製備含水醫藥組合物之套組，其 匕3 〃有凍乾角質細胞生長因子組合物之第一容器，及 -具：用。於該康乾組合物之生理學上可接受之復水溶液的 第令器本發明涵蓋該KGF蛋白列於SEq ID N〇:2、 SEQ ID N〇:3或JL樂里辨兮a 受異體。遠生理上可接受之復水溶液可 107296.doc •12· 1351966 為任何醫藥上可接受之載劑或稀釋劑’其包括(但不限於) 任何及所有臨床有用之溶劑、分散介質、衣料、抗菌及抗 真菌劑、等張及吸收延緩劑及其類似物，包括本文所揭示 之彼等藥劑。另外’該KGF組合物可以治療醫師認為適當 之任何途徑對受檢者投與，該等途徑包括經口、局部、經 ，經直_腸或藉由顱内 注射、靜脈内、肌

肉内、腦池内注射或滴注技術。本發明亦涵蓋藉由靜脈 内、皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内，、眼球後、肺 内注射及或在一特定部位外科植入來投與。 【實施方式】 本發明係關於用於凍乾經純化之角質細胞因子之調配 物’其k供穩定之蛋白質產物且增加該經純化蛋白質之存 放期。本發明進一步提供一種用於製造包含角質細胞生長 因子之凍乾組合物之方法。

皮、非經腸、藉由吸入噴霧、經陰道、 注射。本文使用之術語非經腸包括皮下 本文所使用之"角質細胞生長因子，，或"KGF"係指角質細 胞生長因子聚核苷酸（SEQ ID N0:1，Genbank Accession第 NM_002009 號）或如 SEQ ID N0:2 所述之多肽（Genbank Accession第NP一002000號）或其類似物，或者角質細胞生 長因子之活性片段或其類似物，諸如ΔΝ23 KGF(SEQ ID NO:3) ’或結合且活化角質細胞生長因子受體之因子。在 一較佳實施例中，KGF為ΔΝ23 KGF，一 KGF重組產生形 式’其中胺基端之最前端的胺基酸23自成熟KGF(無訊號 序列連接）缺失。參見，例如皆讓渡於CHIRON公司之美國 107296.doc •13- 1351966 專利第5,677,278號、美國專利第6,677,301號、美國專利第 6,074,848號、美國專利第5,843,883號、美國專利第 5,863,767號及美國專利第5,773,586號，美國專利第 5,731，170號，及1990年8月9曰公開之卩(：1'申請案第你〇 90/08771號（針對全長度形式之KGF及變異體）；及1996年4 月25日公開之PCT申請案第WO 96/11949號；1996年4月25 曰公開之PCT申請案第WO 96/11951號；及1998年6月II日 公開之卩0：7'申請案第\^〇 98/24813號（針對1<：〇?之穩定類似 物），該等案之全文（包括圖）皆以引用的方式併入本文。 在卩(：丁國際公開案\^〇 96/11951及美國專利第6,677,3 01 號中描述具有高於天然KGF之增加之穩定性的KGF類似 物，且此等KGF類似物涵蓋於本發明中。或者，本發明涵 蓋保持完全或甚至部分KGF活性之全部KGF多肽或其類似 物之任何片段。 應瞭解：除非另外指明，否則本說明書中使用之術語 ”角質細胞生長因子，，及"KGF”希望包括且互換地意謂原生 KGF及KGF類似蛋白質（或"突變蛋白質”），其特徵為肽序 列與原生KGF之所有或部分肽序列大體上相同且保持原生 KGF之某些或所有生物活性，尤其係無纖維母細胞上皮細 胞增殖，例如，如藉由併入H_胸苷所判定：展示 BALB/MK角質細胞之刺激比NIH/3T3纖維母細胞之刺激強 至少約500倍’及對BALB/MK角質細胞之刺激比對bs/589 上皮細胞或CC120S上皮細胞之刺激強至少約5〇倍。本發 明亦涵蓋"特徵為一肽序列大體上與原生KGF之狀序列相 I07296.doc • 14- 1351966 同"之肽’其係指在如本文所例示之適度至高度嚴格之雜 交條件下以一DNA序列編碼之肽序列能與SEQ ID NO: 1之 編碼區域雜交。 在雜交情形下’嚴格條件應係鹽、溫度、有機溶劑及在 雜交反應中通常控制之其他參數的嚴格組合條件。例示性 嚴格雜交條件係於62°C-67°C下在4xSSC中雜交，隨後於62 °C -67°C下在O.lxSSC中洗滌約1小時。或者，例示性嚴格 雜交條件係於40°C -45°C下在45-5 5%之曱醯胺、4xSSC中雜 交。[參見，T. Maniatis 等人，Mo/ecw/ar C7om.«g Μ

Laboratory Manual) ； Cold Spring Harbor Laboratory (1982)，第 387-389頁。] KGF蛋白質包括對偶基因變異體，或胺基酸之（數個）缺 失體、（數個）取代體或（數個）插入體，包括原生KGF之片 段、欲合或雜交分子。本發明之較佳KGF分子為AN23 KGF。KGF之其他實例包括（不限於）具有對應於SEq id N0:2之Cys1及Cys15經置換或缺失之殘基的蛋白質，生成 分子與母體分子相比較具有改良之穩定性（如共同擁有之 美國專利6,008,328所教示）。KGF之另一實例包括（但不限 於）電荷變換多肽，其中原生KGF之一或多個胺基酸殘基 41-154(較佳地殘基 Arg4丨、GIn43、Lys55、Lys95、Lys128、

Asn丨37、Gin丨38、Lys丨39、Arg,44、Lys丨”、Gln丨52、Lys,53 或

Thr )缺失或以一中性殘基或負性電荷殘基取代，選擇該 等殘基以用一還原之正電荷影響蛋白質。KGF之又一實例 包括（但不限於）藉由取代至少一個胺基酸產生之蛋白質， 107296.doc •15、 1351966 該胺基酸在原生 KGF之 Asn"5-His"6-Tyr117-Asnm-Thrnl 環區域内對於至少一個胺基酸具有較高成環潛能（如美國 專利6,008,328所教示）。又一實例包括在原生KGF之胺基 酸123-133(SEQ ID NO:2之胺基酸154-164)區域内具有一或 多個胺基酸之取代體、缺失體或添加體的蛋白質。

特定涵蓋之KGF蛋白質包括以下KGF分子（藉由以下來提 及：在列於SEQ ID N0:2之成熟蛋白質（負訊號序列）中之 該位置上所發現之殘基；隨後圓括號中該胺基酸位置；及 然後經取代之殘基或表示缺失體）：ΔΝ15、AN16、 △N18、ΔΝ23 ' ΔΝ24 ' ΔΝ25、ΔΝ26、或 ΔΝ27 KGF、 C(1,15)S ' ΔΝ15-ΔΝ24 ' AN3/C(15)S ' AN3/C(15)- ' AN8/C(15)S 、 AN8/C(15)- 、 C(1,15)S/R(144)E 、 C(1,15)S/R(144)Q 、 AN23/R(144)Q 、 C(1，15,40)S 、 C(1，15，102)S 、 C(1，15，102，106)S 、 ΔΝ23/Ν(137)Ε 、 ΔΝ23/Κ(139)Ε 、 AN23/K(139)Q 、 AN23/R(144)A 、

△N23/R(144)E 、 AN23/R(144)L 、 ΔΝ23/Κ(147)Ε 、 △N23/K(147)Q 、 ΔΝ23/Κ(153)Ε 、 AN23/K(153)Q 、 △N23/Q(152)E/K(153)E; R(144)Q及 H(116)G。 KGF對於許多不同類型之上皮細胞及内皮細胞之增瘦性 效應暗示其係治療患病個體之許多病症或疾病之有用治療 劑。以下係可用本發明之KGF治療之疾病及醫學病症的描 消化道毒性係輻射與化學療法治療方法中之一個主要限 因素。以KGF預處理可對小腸黏膜起細胞保護效應，允 107296.doc 16· 1351966 許增加此療法之劑量，而降低消化道毒性之潛在致命之副 作用。最近在以化學療法用劑5 -氟脲嘧啶治療前，投與重 組人類KGF之患者的階段I臨床試驗提出：以KGF治療將促 進減少黏膜炎之發病率[Meropol等人，j 0«c£?/· 21:1452-8 (2003)]。衆所熟知輻射誘發之消化道毒性之標 準活體内模型，其允許預測性測試具有人類治療用功效之 化合物[Withers 及 Elkind，"MiCroc〇l〇ny Survival Assay f〇r

Cells of Mouse Intestinal Mucosa Exposed t0 Radiati〇n"， 乂 17:26卜267 (1970)]。衆所熟知化學療法誘 發之消化道毒性之標準活體内模型，其允許預測性測試具 有人類治療功效之化合物。[Sonis等人，”An Animal Model for Mucositis Induced by Cancer Chemotherapy, Oral Surg. ，施乂 (ορό);及

Moore - "Clonogenic Response of Cells of Murine Intestinal

Crypts to 12 Cytotoxic Drugs", Cancer Chemotherapy Pharmacol., 15:1 1-15 (1985)] ° KGF治療對於貫穿腸胃管道之黏液產生具有顯著效應。 此特性可用於保護消化道黏膜不受攝取之有害物質影響或 限制諸如發炎性腸病之病症中之損傷擴展。 刺激諸如毛囊、汗腺及皮脂腺之附件結構的增殖及分化 在伴有灼傷或其他部分及全部厚度損傷之患者的表皮及真 皮再生中至關重要。目前，表面缺陷藉由症痕形成及角質 細胞表面重修來治癒，皮膚全部再生仍不可能。目前，在 包括灼傷之全部厚度皮膚缺陷中並不發生毛囊、汗腺及皮

107296.doc -17- 1351966 脂腺之再生。使用KGF可使此再生成為可能。衆所熟知附 件結構增殖及刺激之標準活體内模型，其允許預測性測試 對於灼傷及其他部分及全部厚度損傷具有人類治療功效之 化合物[Mustoe等人，"Growth factor-induced acceleration of tissue repair through direct and inductive activities in a rabbit dermal ulcer model" J. Clin. Invest., 87:694-703

(1991) ; Pierce等人，"Platelet-derived growth factor (BB homodimer)，transforming growth factor-beta 1，and basic fibroblast growth factor in dermal wound healing. Neovessel and matrix formation and cessation of repair" /·尸如/2· 140:1375-88 (1992);及 Davis 等人，"Second-degree burn healing: the effect of occlusive dressings and a cream·"乂 48:245-248 (1990)]。

大皰性表皮鬆懈係黏附於表皮至下方真皮之缺陷，其導 致頻繁張開、疼痛性疱疹，其可引起嚴重發病率。諸如藉 由用KGF治療加速此等損害之上皮形成可引起更少的感染 危險、減少的疼痛及更少的創口護理。 當對患者用化學療法途徑治療惡性腫瘤時，產生化學療 法誘發之禿髮。目前沒有防止引起頭髮瞬間損失之毛囊細 胞死亡的有效治療劑^ KGF提供此方法。衆所熟知化學療 法誘發之禿髮的標準活體内模型為，其允許預測性測試具 有人類治療功效之化合物。[Sawada等人，"Cyclosporin A Stimulates Hair Growth in Nude Mice", Laboratory Investigation, 56(6):684 (1987) ； Holland, "Animal Models -18· 107296.doc 1351966 of Alopecia" > Clin. Dermatol, 6:159:162 (1988) ； Hussein, "Protection from Chemotherapy-induced Alopecia in a Rat Model"，*Sc/e«ce，249:1564-1566 (1990);及 Hussein等人， Interleukin 1 Protects against 1-B-D-Arabinofuranosyulcytosine-induced Alopecia in the Newborn Rat Animal Model", Ca/ice/- 51:3329-3330 (1991)]。 男性型禿髮普遍且基本上無法治療。男性及女性進行性 頭髮損失係一嚴重美容問題。缺乏KGF之小鼠展示糟皺 的、蓮亂的皮毛，而KGF受體基因剔除者展示薄皮膚、低 數目之毛囊，及延緩之創口癒合[Werner等人，iWewce 266:819-22 (1994)]。在禿髮之實驗模型中，以重組KGF預 處理使之免於由投與化學療法藥劑胞嘧啶阿拉伯糖苷 (cytosine arabinoside)(ARA-c)誘發之大約 50% 之禿髮 [Danilenko等人，J 147:145-54，（1995)]。若藥物 可經由頭皮應用且吸收或使用一空氣搶或類似技術喷霧注 射入頭皮内，則可系統地或局部地使用KGF來治療此等病 症。衆所熟知男性型禿髮之標準活體内模型，其允許預測 性測試具有人類治療功效之化合物。[Uno，"The Stumptailed Macaque as a Model for Baldness: effects of Minoxidil", International Journal of Cosmetic Science, 8:63-71 (1986) ; Porter R.，’’Mouse models for human hair loss disorders" J Anat. 202:125-31 (2003)] 〇 研究已顯示投與KGF可誘發腸胃管道中之細胞生長 [Playford等人，Pwh/· 184:316-22，（1998)]。儘管胃潰 107296.doc •19- 1351966

瘍可用H2拮抗劑治療，但引起顯著發病率及復發率且藉由 黏膜内層形成症痕癒合。例如藉由以KGF治療能使患有胃 潰瘍之患者的腺狀黏膜再生更快速，此提供胃潰瘍治療之 顯著治療改良。衆所熟知胃潰瘍之標準活體内模型，其允 許預測性測試具有人類治療功效之化合物，例如Tarnawski 等人["Indomethacin Impairs Quality of Experimental Gastric Ulcer Healing: A Quantitative Histological and Ultrastructural Analysis"，在 Mechanisms of injury,

Protection and Repair of the Upper Gastrointestinal Tract， (編者）Garner 與 O’Brien，Wiley & Sons (1991);]及 Astudillo 等人’ ["Gastroprotective activity of oleanolic acid derivatives on experimentally induced gastric lesions in rats and mice”P/zarmaco/· 54:583-8 (2002)]。

如同胃潰瘍，十二指腸潰瘍係能治療的，但使十二指腸 黏膜内層更全面更快速地再生之治療劑的發展將係一重要 進步。此外’有益的應係再生地癒合此等潰瘍且減少其復 發之治療劑。KGF提供此潛能。衆所熟知十二指腸潰瘍之 標準活體内模型，其允許預測性測試具有人類治療功效之 化合物[Berg 等人 ’ "Duodenal ulcers produced on a diet deficient in pantothenic acid", Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 7:374-376 (1949) ; Szabo 及 Pihan，"Development and

Significance of Cysteamine and Propionitrile Models of Duodenal Ulcer", Chronobiol. Int., 6:31-42 (1987) ； Robert 專人 ’ "Production of Secretatogues of Duodenal Ulcers in 107296.doc -20- 1351966 the Rat", Gastroenterology, 59:95-102 (1970)；及

Keshavarzian等人，"Gastroduodenal ulcers in rats induced by 1 - methyl-4-phenyl -1,2,5,6-tetrahydropyridine (MPTP): requirement for gastric acid secretion and the role of prostaglandins" Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 70:21-48 (1990)]。

如糜爛性胃炎、食道炎或食道逆流之胃及食道之腐蝕係 能治療的，但是使胃及食道之黏膜内層更全面更快速地再 生之治療劑的發展將係一重要進步。此外，有益的係再生 地癒合此等腐蝕且減少其復發之治療劑^ KGF提供此潛 能。衆所熟知如糜爛性胃炎、食道炎或食道逆流之胃及食 管之腐蝕的標準活體内模型，其允許預測性測試具有人類 治療功效之化合物[Geisinger等人，"The histologic development of acid-induced esophagitis in the cat", Mod-Poi/io/·，3:619-624 (1990) ; Carlborg等人，’'Tetracycline induced esophageal ulcers. A clinical and experimental study", 尸e，93:184-187 (1983) ; Carlborg等人， "Esophageal lesions caused by orally administered drugs. An experimental study in the cat", Eur-Surg-Ethanol on esophageal motility in cats, Alcohol-Clin-Exp-Res., 15:116-121 (1991);及 Katz等人，"Acid-induced esophophagitis in cats is prevented by sucralfate but not synthetic prostaglandin E·"，Dzg-DziJcz·.，33:217-224 (1988)]。 如克羅恩氏（Crohn’s)病（初始影響小腸）及潰瘍性結腸炎 107296.doc -21· (初始影響大腸）之發炎性腸病係病原未知之慢性疾病，其 導致黏膜表面之破壞、發炎、疤痕及修復期間形成黏著及 患病個體之顯著發病率。目前設計治療以控制發炎，然 而，已顯示KGF治療誘發患IBD之動物的腸胃管道上皮增 殖[Housley等人’ / /«veii. 94:1764-77，（1994)]。刺激 黏膜表面之表面重修引起快速癒合之治療劑，諸如KGF， 可對控制疾病進程有利。衆所熟知發炎性腸病之標準活體 内模型’其允許預測性測試具有人類治療功效之化合物。 [Morris 等人，"Hapten-induced Models of Chronic Inflammation and Ulceration in the Rat Colon", 96:795_8〇3 (1989) ; Rachmilewitz等人， Inflammatory Mediators of Experimental Colitis in Rats", Gastroenterology, 97:326-327 (1989) ; Allgayer 等人，

Treatment with 16,16'-dimethyl-prostaglandin E2 before and after induction of colitis with trinitrobenzenesulfonic acid in Rats" > Gastroenterology, 96:1290-1300 (1989)；"

Review: Experimental Colitis in Animal Models", Scand. J. Gasiroewiero/，27:529-537 (1992)] ° 早產兒透明膜病導致肺内由Π型肺細胞產生之界面活性 劑缺失，從而導致肺泡之塌陷。透明膜病可有急性階段及 慢性階段。急性階段之透明膜病（嬰兒呼吸窘迫综合征… IRDS)以機械通風治療及以80-100%濃度之補充氧治療且投 與外源性界面活性劑來治療。彼等經受長期治療過程之患 者可能發展為透明膜病之慢性階段（支氣管肺發育不良__ 107296.doc •22· 1351966 BPD)。儘管界面活性劑已較大地降低與IRDS相關之死亡 率，但是與BPD相關之發病率仍然高。因此，需要開發有 效治療來加速嬰兒肺成熟及界面活性劑分泌從而降低BPD 之發病率。儘管皮質類固醇可加速二十八週大及超過一大 範圍之胎兒的成熟及分泌，但是目前無用於較小胎兒之治 療，此導致此群體之顯著發病率及死亡率。BPD之歷史表 明IRDS治療之改良應與甚至更小之早產嬰兒之機械通風及 此等較小嬰兒BPD發病率之併發增加相匹配。將誘發II型 肺細胞增殖及分化之治療劑，諸如KGF[Yi等人， 22:3 15-25 (1998)]對治療此疾病相當有益。 衆所熟知IRDS之標準活體内模型，其允許預測性測試具有 人類治療功效之化合物。Seider等人，"Effects of antenatal thyrotropin-releasing hormone， antenatal corticosteroids, and postnatal ventilation on surfactant mobilization in premature rabbits"，Am. J. Obstet. Gynec., 166:155 1-1 559 (1992); Ikegami等人，"Corticosteroid and thyrotropin-releasing hormone effects on preterm sheep lung function", J. J/?/?/. P/2_yiz'o/.，70:2268-2278 (1991)。衆 所熟知BPD之標準活體外模型，其允許預測性測試具有人 類治療功效之化合物[Yuh-Chin等人，"Natural surfactant and hyperoxide lung injury in primates I. Physiology and biochemistry", J. Appl. Physiol. 76:99 1 -1001 (1994);及 Galan 等人，"Surfactant replacement therapy in utero for prevention of hyaline membrane disease in the preterm 107296.doc •23· (§) 1351966 baboon··，J. G_y«ec0/.，169:817-824 (1993)]。 歸因於細支氣管上皮及肺泡壞死，煙霧吸入係繼灼傷損 傷後之週内發病率及死亡率之顯著原因。在治療吸入損傷 中有益的係可刺激此等結構增殖及分化且誘發其修復及再 生生長因子，諸如KGF。衆所熟知煙霧吸入之標準活體内 模型，其允許預測性測試具有人類治療功效之化合物。 Hubbard等人，"Smoke inhalation injury in sheep", jw. «/. Ραί/ζο/.，133:660-663 (1988)。 肺氣腫由肺泡進行性損失造成。治療有益的係可刺激再 生長或對於剩餘肺泡具有細胞保護性之生長因子，諸如 KGF[Kaza 等人 ’ Circulation. 106(12 Suppl 1):1120-4 (2002)]。目前，無有效治療可用。衆所熟知肺氣腫之標準 活體内模型’其允許預測性測試具有人類治療功效之化合 物[Stolk 等人 ’ "Induction of emphysema and bronchial mucus cell hyperplasia by intratracheal instillation of lipopolysaccharide in the hamster." J. Pathol., 167:349-56 (1992)] 〇 繼發於病毒性肝炎及長期酒精攝取之肝硬化係發病率及 死亡率之顯著原因。諸如藉由使用KGF以增加肝功能之肝 細胞的細胞保護、增殖及分化將有益於延緩或預防硬化之 發展[Danilenki，D.，Ραί/ιο/· 27:64-71 (1999)]。衆 所熟知肝硬化之標準活體内模型’其允許預測性測試具有 人類治療功效之化合物[Tomaszewski等人，"The production of hepatic cirrhosis in rats", J. Appl. Toxicol

107296.doc 1351966 1 1:229-231 (1991)] ° 爆發性肝衰竭係發生於硬化末期之威脅生命的病症。諸 如KGF之可誘發剩餘肝細胞增殖之藥劑將對目前僅可用肝 移植治療之此疾病直接有益❶衆所熟知爆發性肝衰竭之標 準活體内模型，其允許預測性測試具有人類治療功效之化 合物[Mitchell 專人 ’ Acetaminophen-induced hepatic necrosis I. Role of drug metabolism", J. Pharmcol. Exp. 77^·，187:185-194 (1973);及 Thakore及 Mehendale，"Role of hepatocellular regeneration in CC14 autoprotection", roxz.co/ogz.c Ραί/20/· 19:47-58 (1991)] 〇 急性病毒性肝炎經常係亞臨床的及自我限制的。然而， 在少數患者甲，若干週内可產生重度肝損害。可使用諸如 KGF之細胞保護藥劑來預防肝細胞衰退。 由乙醯胺笨酚、氟烷、四氣化碳及其他毒素引起之肝臟 毒性損傷可藉由肝細胞之細胞保護性生長因子（KGF)改 善。衆所熟知肝毒性之標準活體内模型，其允許預測性測 試具有人類治療功效之化合物[MitcheU等人（1973)， ，及 Thakore及 Mehendale (1991)’ Mpra]。 移植物抗宿主病（GVHD)(慢性或急性）係患者無效骨髓或 肝細胞移植之一主要原因。GVHD導致歸因於免疫調節及 細胞毒素因子之上調的若干器官系統損害。GVHD導致多 區域損害’該等區域包括腸胃管道、肺、肝臟'皮膚及眼 内黏液腺、口中唾液腺及潤滑胃内層及腸之腺體。對於誘 發GVHD之動物之近來研究顯示：rHuKGF治療接受者不 107296.doc -25- 1351966 發展腸GVHD、不發展内毒素血症、且不死亡 [Panoskaltsis-Mortari 等人，"Keratinocyte growth factor facilitates alloengraftment and ameliorates graft-versus-host disease in mice by a mechanism independent of repair of conditioning-induced tissue injury" Blood. 96:4350-6 (2000)]。此等資料指明KGF藉由保護由TNF- a:、NO及其 他潛在細胞毒性因子介導之上皮細胞損傷來預防急性致死 GVHD之發展。諸如KGF之可誘發許多此等細胞型之上皮 細胞增殖之藥劑可對治療人類移植接受者之GVHD直接有 益。 調配物及投與 KGF蛋白質或肽適用於以醫藥調配物形式來治療以上描 述之人類疾病。可將KGF製備為液態或凍乾調配物。在一 較佳實施例中，該等KGF組合物係經凍乾的。凍乾可使用 此項技術中通用之技術進行且對於發展中之組合物應係最 優化的[Tang等人，P/mrm 21..191-200,（2004)及 Chang 等人，P/iarm 13:243-9 (1996)] 〇 一個凍乾循環通常包含三個步驟：凍結、初級乾燥及次 級乾燥[A.P. Mackenzie, P/n·/ Λ Soc Lowdow, Ser 价〇/ 278:167 (1977)]。在凍結步驟中，將溶液冷卻來促進 冰形成及完成。此外，此步驟誘發膨化劑結晶。在初級乾 燥階段中藉由將腔室壓降至冰之蒸汽壓以下來進行冰昇 華，使用真空且引入熱以促進昇華。最終在次級乾燥階段 中，在降低之腔室壓及升高之存放溫度下移除經吸附或結 107296.doc • 26- 1351966 合之水。此製程產生稱為凍乾餅之物質。此後，在使用之 剛’可將該餅以注射用無菌水或適當多劑量復水溶液復 水。 凌乾循環不僅決定賦形劑之最終物理狀態，而且影響其 他參數’諸如復水時間、外觀、穩定性及最终之水分含 ^ 量。减結狀態之組合物結構經由發生於特定溫度之若干轉 ， 移（例如，玻璃轉移及結晶）得以生成且可用於瞭解且優化 φ 减乾方法。玻璃轉移溫度（Tg)可提供關於溶質物理狀態之 資訊且可由差示掃描熱量測定（DSC)來測定。此係設計凍 乾循環時須考慮之-重要參數。此外，在乾燥狀態中，玻 璃轉移溫度提供關於最終產物儲存溫度之資訊。 在本發明組合物之一特定實施例中，向該凍乾調配物中 添加穩疋劑來防止或降低凍乾誘發或儲存誘發之聚結及化 學降解。復水過程中之霧濁或混濁溶液顯示蛋白質已沈 澱。術語”穩定劑”意謂能夠防止聚結或其他物理降解，及 • 化學降解(例如’自溶、脫醯胺、氧化等)之含水及固體狀 態的賦形劑。可使用在醫藥組合物中習知使用之穩定劑， 其包括（但不限於）蔗糖、海藻糖或甘胺酸[carpenter等人， 仏V，·财Ld 74:225,（1991)]。諸如聚山梨醇酿 2〇(吐溫（Tween)20)或聚山梨醇㈣（吐溫8〇)之界面活性劑 穩定劑亦可以適當量添加以防止;東結及乾燥期間與表面相 ，之聚結現象[Chang，B，以卿·85:1325,（199叫。 右需要，該;東乾組合物亦包括適當量之適於形成;東乾"餅” 之膨化劑及容積渗透調節劑。膨化劑可為結晶（例如甘露

107296.doc -27- 1351966 糖醇、甘胺酸）或非晶形（例如，蔗糖；諸如葡聚糖、聚乙 烯吡咯啶酿1、羧甲基纖維素之聚合物在一實施例中， 該膨化劑為甘露糖醇。在另一實施例中，甘露糖醇以約2 w/v%至約5 w/v%之濃度併入，且在又一實施例中，濃度 為约3 w/v。/。至4.5 w/v%，以產生一機械及醫藥穩定且極佳 之餅。在另一實施例中’甘露糖醇之濃度為2 w/v〇/〇。

亦已發現醫藥學上可接受之緩衝劑及pH之選擇影響本發 明組合物之穩定性。選擇存在於該等組合物中之緩衝劑系 統應係生理上相容的且在復水溶液及凍乾前之溶液中保持 所要的pH。較佳地，該等緩衝劑具有約1)]^值為6 〇至約pH 值為8.0範圍之PH緩衝能力》通常執行一系列併入以上提 及參數之篩檢研究來選擇最穩定之調配物條件。 預期該等組合物在凍乾狀態於2 t至8它下穩定至少2 年。此長期穩定性有益於增加該醫藥產品之存放期。 本發明進一步涵蓋用於製備本發明KGF調配物之方法。 在態樣中，用於製備凍乾KGF調配物之方法包含以下步 驟： ⑷在包含組胺酸、膨化劑、糖及界面活性劑之緩衝劑中 混合該KGF組合物； (b)凍乾該KGF。 本方法進-步包含一或多個以下步驟：於凍乾前向該混 合物中添加穩定劑’於;東乾前向該混合物中添加選自膨化 劑及容積滲透濃度調節劑及界面活性劑之至一 乂 種樂劑。 該膨化劑可為以上列出之任何膨化劑。較佳地，該膨化劑 I07296.doc -28· 1351966 為甘露糖醇。該糖可為以上 施例中，該穩定化藥劑為蔗 出之任何界面活性劑。在一 山梨醇酯20。 列出之任何穩定化糖。在一 糖。該界面活性劑可為以上 實施例中，該界面活性劑為 實 列 聚 用於凉乾物質之標準復水實踐係添加回一體積之注射用 純水或無菌水（刪)(通常與凌乾過程中移除之體積等量），

儘管在用於非經腸投與之醫藥生產中有時使用抗菌藥劑之 稀釋溶、液 Drug Devehpmeju _ __

Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)] 〇

可將該滚乾KGF組合物復水為水溶液。不㈣水載劑在 與適於製造含水懸浮液之賦形劑的混雜物中可能含有活性 化合物，該等載劑為例如’注射用無菌水、多劑量使用之 具有防腐劑之水、或具有適當量之界面活性劑（例如，聚 山梨醇醋20)之水、議之生理食鹽水、〇3%之甘胺酸， 或含水懸浮液。此等賦形劑為懸浮劑，例如叛甲基纖維素 納、甲基纖維素'經基丙基甲基纖維素、海藻酸納、聚乙 稀。比略賴、黃蓍膠及阿拉伯膠；可為天然產生之麟脂分 散或濕潤劑，例如印磷脂’或氧化烯與脂肪酸之縮合產 物’例如聚氧乙稀硬脂酸醋’或氧化乙烯與長鏈脂族醇之 縮合產物’例如十七伸乙基氧基十六醇，或氧化乙烯與衍 生自脂肪酸之部分醋及己糖醇之縮合產物，例如聚氧乙烯 山梨糖醇單油酸酷’或氧化乙稀與衍生自脂肪酸之部分酯 及己糖醇if之縮合產物’例如聚乙稀脫水山梨糖醇單油酸 醋。該等含水懸浮液亦可会右_ +少# & a 十〆力J 3有或多種防腐劑，例如對羥 107296.doc -29- 1351966 基本甲酸乙s旨或對經基苯曱酸正丙醋。 為對人類或測試動物投與本發明之組合物，較佳地，以 包含一或多種醫藥學上可接受之載劑之組合物形式調配該 等組合物。如下所述，短語”醫藥學上"或"醫藥學上可接 支係4曰穩疋之分子貫體及組合物，抑制蛋白質諸如聚結 ► 及裂解之降解的產品’且此外在使用此項技術中衆所熟知 - 之途徑投與時不產生過敏或其他不利反應。"醫藥學上可 • 接爻之載劑"包括任何及所有臨床上有用之溶劑、分散介 質衣料、抗菌及抗真菌劑、等張及吸收延緩劑及其類似 物，包括以上揭示之彼等藥劑。 可經口、局部 '經皮、非經腸、藉由噴霧吸入、經陰 道入經直腸或藉由顧内注射來投予該等角質細⑯生長因子 .且。物。本文所使用之術語非經腸包括皮下注射、靜脈内 庄射肌肉内注射、腦池内注射或灌注技術。亦涵蓋以靜 脈内 '、皮内、肌肉内、乳房内、腹膜内、勒内、眼球後' • 冑内注射及或在一特定部位外科植入來投與。-般而言， 組口物本質上無熱原質及其他可對接受者有害之雜質。 外態樣，本發明包括包含-或多種化合物或麵 -=:r::r使用其對受檢者投― 物(例如，包含V/包括本文描述之化合物或㈣ 或組合物封裝” 子之組合物），該等化合妆 有--貼二容封瓶或容器之容器内，該套組具 s匕括於该封裝中之標籤來描述在實踐 107296.doc 1351966 該方法中該化合物或組合物之用途。在一實施例中，該套 組含有一具有凍乾角質細胞生長因子組合物之第一容器及 ： 一具有用於凍乾組合物之生理學上可接受之復水溶液的第 • 二容器。較佳地，該化合物或組合物係以一單位劑型封 裝。該套組可進-步包括適於根據一特定投與途徑投與該 組合物之裝置。較佳地’該套組含有描述角質細胞生長因 ， 子組合物之用途之標籤。 _ 本發明之另外態樣及細節自以下實例將變得顯而易見。 實例1 KGF之液態調配物 產品穩定性、存放誠生物活性係任何治療#效組合物 之重要態樣。設計且調配在所推薦儲存溫度儲存增加之時 間週期時穩定且保持顯著生物活性之組合物係醫藥組合物 之關鍵要素。 先前實驗中，KGF之液態調配物在高溫（37〇c )下顯示顯 • 著聚結且併發蛋白質損失。為確定提供KGF組合物之最大 穩定性的pH值，在3.0至9.0之pH值範圍内測試角質細胞生 長因子液態調配物之pH值。 在以下實驗例如實例1-3中，使用之KGF為ΛΝ23 KGF分 子。使用濃鹽酸或氫氧化鈉來調節溶液之ρίί值。於37〇c培 育之後，於0小時、6小時及28小時之時間下取出不同卩}1值 之KGF調配物樣品（0.5 mg/ml ' 1〇 mM緩衝劑、〇.〗M NaCl)(圖 1)。以 SE-HPLC(圖 1A)或以 CE_HPLC(圖 1B)量測 回收蛋白質之百分比。對於尺寸排斥hplc(se-hplc)而 107296.doc 1351966 s ’將樣品（40 pg)載入連接至HP 1090/1050機器之 G2000SWxl 管柱（7.8 mmx30 cm)上。使用 pH 值為 7.0 之 20 mM磷酸鈉（Nap)、1 M NaCl溶離該蛋白質。藉由215 nm處 之吸光率監控蛋白質。單體峰顯示在KGF調配物中幾乎無 _ 聚結物。 - 在室溫下在一配備一單-S管柱之HP 1090/1050機器中執 行陽離子交換（CE)-HPLC »將40 pg KGF蛋白質載入管柱 _ 且使用pH值為8.0之20 mM鱗酸納緩衝劑及梯度鹽（1 μ

NaCl)溶離。藉由215 11111處之吸光率監控所溶離之蛋白 質。 在一使用來自¥丫<^(：之〇4管柱（(4.6乂25〇111„1)孔尺寸3〇〇 A)之HP 1090/1050上執行逆相HPLC(RP-HPLC)。將蛋白質 (3〇 Rg)注入管柱且使用具有0.1%三氟乙酸（TFA)(Wv)及 90。/。ACN、水中之〇·ι〇/0 TFA(v/v)的梯度乙腈（ACN)來溶 離。藉由215 nm處吸光率監控蛋白質峰值。 • 於0小時時間下在PH值為5.0至9.0之範圍内，可觀測到 蛋白質之完全回收。然而，在pH值為3.0下可觀測到蛋白 質之完全損失’且在pH值為4.0導致約80%之蛋白質損失， 此歸因於即刻沈澱。在37t：下6小時後，無可溶性蛋白質 自pH值為4.0之樣品中獲得。於”艺下“小時後，當於 值為5至9中調配可溶性kgf時所回收之蛋白質的百分比小 於20%。然而，於pH值為7 〇下僅2〇%之總蛋白質損失。於 37°C下28小時後，可溶性蛋白質之損失主要歸因於聚結。 此等結果顯示液態調配物形式之KGF蛋白質在中性卩^下 107296.doc •32- 1351966 最穩定，然而，即使在此最佳阳範圍中保持kgf為液體亦 導致歸因於聚結之蛋白質顯著損失。 實例2 凉·乾之KGF組合物調配物 為開發更穩定之KGF組合物，吾人決定將KGF調配為;束 乾產品。調配猿乾KGF組合物之先前f試包括處理復水溶 液此視°玄復水/谷液之組合物而定得到產生較少蛋白質聚 結之組合物[Zhang等人，户h (1995)]。然而，在此先前研究中，在復水期間所發現之任 何聚結係非常難以或不可能逆轉的。 此實例描述;東乾溶液中之蛋白質，其在復水過程中不取 決於復水溶液，將防止聚結以消除對於常規復水溶液之需 要。 為測定組合物之穩定凍乾調配物，在改變例如pH、膨化 劑、糖濃度及界面活性劑濃度之參數的不同條件下凍乾 KGF，例如ΔΝ23 KGF。接著於所推薦儲存溫度下測定 KGF的長期儲存穩定性。 凍乾循環 對於凍乾而言，將樣品載入一VirTis Genesis 12 EL試驗 規模（VirTis，Gardiner，Ν·γ·)之冷凍乾燥器中，將該冷凍乾 燥器預冷卻至腔室溫度為約。將樣品快速凍結（約it/ 分鐘至-50°C )，且保持於此溫度下至少2小時。一旦將樣品 置於該冷凍乾燥器中，就將存放溫度以約27<t /小時之速 率降至-50Ϊ。將樣品於_5(rc下保持2小時以確保完全凍 107296.doc •33· 丄力丄966 結。在一結晶甘露糖醇之可選步驟中，存放溫度以約⑺^ /小時之速率升高至_25。(： ’平衡2·3小時，且接著以9口小 時之速率冷卻至_55°C。另外保持至少2小時之後，施用約 〇毫托之真空《對於初級乾燥而言，將存放溫度升高 至-351，但可在·45ΐ：至·10。〇之範圍内。初級乾燥持續4〇 小時，但可在2“8小時之範圍内。接著，對於次級乾燥 而言，將存放溫度以5t/小時之速率升高至十^工至+以 C且將真空降至約50毫托。執行次級乾燥％小時，但亦 可執行24_72小時内之任一時間。次級乾燥結束時，將樣 品在真空(小於等於25毫托)終止且自冷束乾燥器移除裝入 小航中°對於穩定性測試而言，將錢卷邊覆蓋且置於不 同溫度中。 PH對凍乾KGF穩定性之影響 首先》乎估pH值範圍内之尺仰穩定性。在阳值為6 〇、 pH值為6.5或pH值為7·〇下於溶液中調配kgf(5叫㈣該 溶液包心福組胺酸、3%甘露糖醇、2%絲及請％聚 山梨醇㈣。料乾樣品之SE_HPLC表明主峰百分比為 99% ’其對應於99%之單體活性組份。 為執灯加速之穩定性研究，將一些樣品轉移至恆溫箱中 儲存。將其他樣品轉移至充當控制器之Μ之冷康器 中。將大批小航於4t：下儲存。分析日夺，以i 2 4之注射 用無菌水（WFI)將樣品復水。 於4 5 °C儲存6個月絲+& 後之凍乾KGF樣品的SE-HPLC表明： 在所測試之所有PH下樣品的主峰百分比為約97篇，此顯 I07296.doc -34· 不在6.0至7.0之PH值範圍内凍乾Kgf組合物在高溫下儲存6 個月後穩定。此等研究亦顯示當該調配物保持在4〇c下時 5.0至8.0之pH值範圍提供穩定蛋白質。 藏糖漢度對KGF穩定性之影響 為砰估提供凍乾KGF最大穩定性之蔗糖量，在pH值為 7.0下在包含1〇 mM組胺酸、3%甘露糖醇之組合物溶液中 調配重組人類KGF(1 mg/mi)，該溶液缺少蔗糖或具有2% 之嚴糖（W/V)°如上將該等樣品凍乾且允許將其於45°C下培 育南達3個月。 具有及不具有蔗糖之KGF調配物之SE-HPLC量測的主峰 百分比顯不添加2%之蔗糖提供凍乾KGF調配物之顯著穩定 诠以2 /(>之蔗糖凍乾之KGF凍乾後立即表明約99.5%之主 峰，且於凍乾後i個月及3個月表明98.5%之主峰。缺少蔗 糖之調配物於凍乾後丨個月及3個月分別展示約96%之主峰 及約93.5%之主峰。 此等結果顯示於45°C儲存3個月之後在無蔗糖之調配物 :活性單體峰百分比減少7%，而在具有蔗糖之調配物中 單體峰僅有很小之減少。因&，#將嚴糖添加至康乾調配 物中時’蔗糖充當KGF之有效穩定劑。 使用pH值為6_5、蔗糖濃度範圍為1%蔗糖與3%蔗糖之間 包含10 mM組胺酸之KGF凍乾產物來執行進一步分析，其 中以適當百分比之甘露糖醇使溶液一直保持等張性。具有 1 庶糖且於3 7*>C儲存一年之凍乾產物顯示相應於具有 2%蔗糖之調配物的蛋白質穩定性，對於所有測試調配物 I07296.doc •35· 1351966 而言其保持9 9 %以上之主峰百分比。 聚山梨醇酯20之濃度對KGF穩定性之影響 KGF凍乾調配物中聚山梨醇酯2〇之濃度係基於在復水中 其消除粒子形成之能力來選擇。在pH值為7.0包含10 mM 組胺酸、3%甘露糖醇、2%蔗糖之組合物中調配重組人類 KGF且將其凍乾《接著將KGf在含有不同濃度聚山梨醇酯 20之溶液中復水。該凍乾餅由如上所調配之5 mg/ml KGF 組成。表1描述復水中凍乾調配物之記錄觀測。 表1 復水溶液中之稀釋劑 復水後之視覺觀測 0.1 %聚山梨醇酯20 澄清但有發泡體 0.01%聚山梨酵酯20 澄清 0.004%聚山梨醇酯2〇 少許微粒/邊界 0.001%聚山梨醇酯2〇 微粒 水 微粒 進步研究顯示於45。(：下4個月後，當與在復水溶液中 添加聚山梨醇酯20相比時，在凍乾前聚山梨醇酯2〇包括於 餅内之調配物同樣穩定。SE_HPLC分析[BiQrad則㈣聊 125(7.8 mmx30 cm), 20 mM NaP, pH 7.0, 1 M NaCl ^ 40 μ§ 注射載入]顯示對於在〇、丨及4個月測試之所有聚山梨醇酯 濃度（如表1)而言單體KGF損失係微不足道的。基於聚山梨 醇醋20—貫消除復水中可見粒子之能力，選擇〇.㈣之濃 度（w/v)包含於調配物中。

107296.doc -36· 1351966 甘露糖醇濃度對KGF穩定性之影響 將甘露糖醇及其他膨化劑包括於調配物中來獲得優良之 餅外觀及品質。此外，其有助於保持生理流體之醫藥组合 物的等張性。舉例而言，生理流體具有290-320 m0sm容積 滲透濃度。將最终KGF調配物中之甘露糖醇濃度調節至與 生理流體等滲。 為評估在凍乾調配物中提供蛋白質穩定性之甘露糖醇濃 度百分比，在pH值為7.0包含10 mM組胺酸、2%嚴糖及 0.01%聚山梨酵酯20及3%甘露糖醇或4%甘露糖醇之調配物 中凍乾3 mg/ml之KGF。將該等KGF調配物凍乾且於4<)(：儲 存1年。使用來自Advanced Instruments之滲壓計模型 3D3(N〇rw〇〇d, MA)量測容積滲透濃度。所量測之4%甘露 糖醇溶液之容積滲透濃度為312 mOsm，而溶液中生成之 3%甘露糖醇調配物的容積滲透濃度為25()111〇301。 圖2顯示在〇時間下（圖2A)或於4°C儲存1年後（圖2B)取得 之等張4%甘露糖醇/2%蔗糖調配物與張力輕微減退之3%甘 露糖醇/2%蔗糖調配物相比較的逆相（Rp_HpLC)層析覆蓋 圖。結果證明於2。(：至8。(：之標準儲存溫度儲存丨年後等滲 調配物穩定。此外，等滲調配物之餅外觀亦優良且其水分 含：!：低於2%。基於此研究，推薦在凍乾調配物中使用4% 之甘露糖醇》 蛋白質濃度對rHuKGF穩定性之影響 康乾樣品中之蛋白質$農度亦可對蛋白質康乾品質的穩定 性及復水產物的穩定性產生影響。 107296.doc -37- 探測 KGF 濃度為 0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml及5 mg/ml下對穩定性之影響。將樣品在pH值為6.5 下於10 mM組胺酸、3%甘露糖醇、2%蔗糖及0.005%聚山 梨醇酯20中調配且凍乾。在復水前將凍乾樣品於45 °C下儲 存 24 週。藉由 SE-HPLC、RP-HPLC、CE-HPLC 及 SDS-PAGE監測蛋白質降解。對於此實驗而言，使用HP系統及 G2000SWxl管柱如上來執行SE-HPLC。 圖3表示作為來自於45 °C下儲存24週後之KGF的SE-HPLC分析之蛋白質濃度函數的主峰百分比。虛線代表所 量測資料之傾向線。基於SE-HPLC資料，穩定性隨KGF濃 度之增加而增加，濃度至少增至5 mg/ml。如RP-HPLC及 CE-HPLC:所測定之主峰百分比與蛋白質濃度之相關性與以 SE-HPLC所見之類似。進一步研究顯示15 mg/ml之蛋白質 濃度亦生成穩定之凍乾調配物。 將pH值為6.5包含10 mM組胺酸、0.01%聚山梨醇酯20、 2%蔗糖及3%甘露糖醇之最佳KGF凍乾調配物於2°C至8°C 下儲存4年以上。復水中，如以下所測試，顯示KGF調配 物保持KGF活性，此表明特定組合物保持治療有效醫藥組 合物所需之穩定及活性類型。 實例3 復水KGF調配物之生物檢定 醫藥有效產物調配物之因子中之一者係需要重要蛋白質 之高生物活性。 如 Hsu等人，1999 Biochemistry，38, 2523-2534 所描述， 107296.doc -38- 1351966 使用32D KECA選殖16細胞測試KGF(例如AN23 KGF)調配 物之生物活性，該32D KECA選殖16細胞係在KGF存在時 增殖之IL-3依賴$鼠科淋巴母細胞，其類似於32D選殖3細 胞（ATCC#CRL-11346)，且其係一有用增殖檢定系統。 於37°C下及5.5% C02中將32D選殖16細胞保持於生長培 養基中[RPMI，胎牛血清（10%)(Hyclone，Logan，UT)、麩 酿胺酸（l%)(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA)，遺傳徽素 (2%)(Gibco)及鼠科 IL-3(12 ng/mL)(Biosource International， Camarillo, CA)]。在檢定培養基[RPMI，FBS(6%)、麩醯胺 酸（1%)、肝素（0.6 pg/mg)(Sigma，St. Louis，MO)]中將 KGF調配物樣品或參考標準物（於-70°C儲存凍乾之AN23 KGF)復水至約25 ng/mL。接著進行連續稀釋來獲得約25 ng/mL至1.6ng/mL之濃度範圍。 為測試KGF調配物之生物活性，將32D選殖16細胞在150 μι中以2.0x105細胞/毫升裝板。以50 μί體積將所要濃度之 參考標準物、對照物及KGF測試樣品添加至樣品孔中。於 37°C下及5.5% C02中將細胞及樣品板培育約24小時。第二 天’將 40 pL 阿洛明藍（Alomar Blue)(AccuMed International，Chicago，IL)添加至所有孔中且混合。於37 °C下及5.5°/。C02中將該等板再培育24小時^ 24小時後，使 用530-560 nm之激發波長及590 nm之發射波長在一螢光讀 取器(Cytofluor II 或 Cytofluor Series 4000，PerSeptive Biosystems，Framingham，ΜΑ)上量測營光性。 於2°C至8°C儲存7天之來自3個復水組之凍乾KGF調配物 107296.doc -39- 1351966 表明與參考標準KGF蛋白質（於·701儲存凍乾）類似之生物 活性，在0天展示大於等於100%之生物活性，且在第7天 分別展示92%、1〇〇%及1〇7%之活性。與原生KGF相比，於 25°C下儲存之KGF調配物在〇時間下顯示大於等於ι〇〇%之 生物活性’其於4小時後分別輕微降低至90%、95%及 100%之生物活性。復水KGF調配物於25。(：下儲存24小時後 此活性水平亦保持’此顯示該等KGF調配物之穩定性。 此等結果顯示：本文描述之復水KGF調配物與參考標準 KGF蛋白質同樣有效’且該調配物對例如aN23 kgf之 KGF之穩定性或效能無不利之影響，且因此作為促進上皮 細胞及其類似物生長之個體治療中有用之治療劑。 此外’ KGF生物活性可藉由復水調配物促進Balb/C-MK 細胞生長之能力來評估^ Balb/MK細胞之儲備培養物於以 10%胎牛血清、0.25 pg/ml兩性黴素B及10 ng/ml aPGF補充 之低#5杜爾貝科氏（Dulbecco's)改良Eagle培養基中生長且 保持。將該等細胞於37eC下在99%濕度之10% c〇2氣氛中 培月。對於生物活性檢定而言’如Gospodarowicz等人所 述[乂 Ce//·户 Αρ.σΛ 142:325-333 (1990)]，將該等細胞在 1 ml之培養基中以每孔5χ1〇3個細胞之密度在12-孔板中接 種。將預定量之KGF調配物添加至細胞培養孔中。FGF用 作為陽性對照物。 在培養五天後’將該等細胞胰蛋白酶化且使用一細胞計 數器測定最終細胞密度。藉由以含有0 9% NaCl、0.0 1 Μ填 酸納（pH值為7.4)、0.05%肤島素及〇·〇20/。EDTA(STV)之溶 I07296.doc -40- 1351966 液置換該培養基來將該等細胞自該等板上脫模，且於37<>c 培育5-〗〇分鐘，且接著將該儲備培養基添加至該等細胞 中。 與未經處理之細胞相比’ KGF處理樣品中之Baib/C-MK 細胞群體之增加顯示KGF組合物在調配製程中不損失其生 物活性，且顯示KGF調配物提供有效治療劑來治療需要增 加KGF活性之受檢者。 如以上說明性實例所述，熟習此項技術者預期進行本發 明之許多修正及變化。因此’本發明應僅受限於隨附申請 專利範圍所顯示之此等限制。 【圖式簡單說明】 圖1描述不同pH值下液態KGF調配物中可溶蛋白質之尺 寸排斥（SE)-HPLC(圖1A)及陽離子交換（CE)_HPLC(圖1B)分 析。 圖2描述比較在10 mM&胺酸、〇 〇1%聚山梨醇酯、及

4%甘露糖醇/2%蔗糖或3%甘露糖醇/2%蔗糖中凍乾之kgF 調配物之逆相（RP)_HPLC層析圖。圖2入描述凍乾後零時間 之產物而圖2B顯示於4t儲存1年後之產物。插圖顯示主峰 周圍之區域。 圖3表示作為來從於45^儲存24週後之凍乾Kgf調配物 之SE-HPLC分析的蛋白質濃度函數的主峰百分比。 107296.doc .41· 1351966 序列表 <110>美商安美基公司 <120>角質细胞生長因子之治療用調S物 <130> 01017/40453 <]40> 094]44470 <141> 2005-12-15 <150> 60/636,210；11/302,033 <151> 2004-12-15 ； 2005-12-12 <160> 3 <170:> Paientln 版本 3.3 b > > > 0123 2 0-22 <v < < 85DNA人 1323 智 <220>

<221> CDS <222> (446)..(1030) <400> 1 acgcgctcac acacagagag tctgctggag aacttttcag gcaccaggca gacaacagac agtcaaatag caaacagcgt tiatcaacag agttatttaa gctaacaatt tggaaagagc aagaggtcaa tgacctagga tgaacacccg gagcactaca aaaatccttc tgcctgttga ctgagaaata gtttgtaect atggaattct tatatatcca cacagcaact gaacttacta ggaggaatcc tgtgttgtta aactactctt tcttaaatca gtaacaatca actcaagatt data atg cac aaa \gg Met His Lys Trp tttatggaaa caattatgat 60 acagtagaaa ggctcaagu 120 gctgttagca acaaaacaaa 180 cgaactgttt ttatgaggat 240 tcaggaacta aaaggataag 300 atctacaatt cacagatagg 360 cattttcatt atgttattca 420 ata ctg aca tgg ate 472 lie Leu Thr Trp lie ctg cca act ttg etc tac aga tea tgc ttt cac att ate tgt eta gtg Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg Ser Cys Phe His lie lie Cys Leu Val 10 15 20 25 ggc ace ata tet tta get tgc aat gac atg act cca gag caa atg get Gly Thr lie Ser Leu Ala Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gin Met Ala 30 35 40 aca aat gtg aac tgt tcc age cci gag ega cac aca aga agt tat gat Thr Asn Va] Asn Cys Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp 45 50 55 tac atg gaa gga ggg gat ata aga gtg aga aga etc ttc tgt ega aca Tyr Met Glu Gly Gly Asp He Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr 520 568 616 664 65 cag tgg tac ctg agg ate gat aaa aga ggc aaa gta aaa ggg acc Gin Trp Tyr Leu Arg lie Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin caa 712 75 80 85 gag atg aag aat aat tac aat ate aig gaa ate agg aca gtg gca gtt 760

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Met His Lys Trp lie Leu Thr Trp lie Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg 15 10 15

Ser Cys Phc His He lie Cys Leu Val Gly Thr He Scr Leu Ala Cys 20 25 30

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Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gin Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn 85 90 95 lie Met Glu lie Arg Thr Val Ala Val Gly lie Val Ala lie Lys Gly 107296.doc -3-

1351966 loo 105 no

Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr 115 120 125

Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu He Leu 130 135 140

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Gin Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala lie Thr 130 135 140 107296.doc • 4-

Claims (1)

1. 第094144470號專利ΐ請案 中文申請專利範圍替槎本(98年8月 十、申請專利範菌^— 1. 一種凍乾角質細胞生長因子（KGF)組合物’其包含列於 SEQ ID NO:3 之 ΔΝ23 KGF，其濃度在3 mg/mL 與 15 mg/mL之間，濃度為約2% w/v至約w/v之甘露糖醇’ 濃度為約1% w/v至約3% w/v之蔗糖’濃度在約0.1% w/v 至約0.004°/〇 w/v之範圍内之聚山梨醇酯20及組胺酸缓衝 液，其中該pH值在約6.0至約8.0之範圍内。 2.如請求項1之組合物，其中該甘露糖醇濃度為4% w/v。 3 .如請求項1之組合物，其中該蔗糖為2 % w/v。 4.如請求項1之組合物，其中該pH值在約6.0至約7.0之範圍 内。 5. 如請求項4之組合物，其中該pH值為6.5。 6. 如請求項1之組合物，其中該聚山梨醇酯20濃度為0.01% w/v。 7. 如請求項1之組合物，其中該KGF濃度為5 mg/mL。 8. 一種凍乾角質細胞生長因子（KGF)組合物，其包含5 mg/mL ΔΝ23 KGF、10 mM組胺酸、4%甘露糖醇、2%藉、 糖及0.01 %(w/v)聚山梨醇酯20，其中該组合物之pH值為 6.5。 9. 一種如請求項1之凍乾角質細胞生長因子於製備治療疾 病之藥物之用途，其中該藥物增加KGF-介導刺激上皮細 胞生長。 10. 如請求項9之用途，其中該疾病為消化道毒性；黏膜 炎；灼傷或其他部分及全部厚度損傷；毛囊、汗腺及皮 107296-980804.doc 1351966 脂腺之再生；附件結構增殖；大皰性表皮鬆懈；化學療 法誘發之禿髮；男性型禿髮；胃潰瘍；十二指腸潰瘍； 糜爛性胃炎、食道炎或食道逆流；發炎性腸病；透明膜 病；煙霧吸入引起之損傷；肺氣腫；肝硬化、肝衰竭、 急性病毒性肝炎、其他肝毒性損傷；或移植物抗宿主病 (GVHD)。 107296-980804.doc