KR20070093977A

KR20070093977A - 케라티노사이트 성장 인자의 치료학적 제형

Info

Publication number: KR20070093977A
Application number: KR1020077013435A
Authority: KR
Inventors: 마이클 제이 트루헤이트; 바수마시 다르마바람; 주디스 퍼텔; 수잔 이 로이
Original assignee: 암젠 인코포레이티드
Priority date: 2004-12-15
Filing date: 2005-12-12
Publication date: 2007-09-19
Also published as: CA2589889A1; UA88497C2; EA013369B1; RS53548B1; MY145638A; IL183435A; TW200635603A; PL1827483T3; AR052339A1; AU2005317166B2; EP1827483B1; CR9246A; ZA200706095B; HK1115298A1; AU2005317166A1; CN101084008B; BRPI0519070A2; US20060128622A1; SI1827483T1; MX2007006822A

Abstract

본 발명은 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자의 장기간 안정한 제형 및 케라티노사이트 성장 인자를 포함하는 동결건조시킨 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

케라티노사이트 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 폴리소르베이트 20, KGF-매개 자극, 동결건조시킨 KGF 조성물

Description

케라티노사이트 성장 인자의 치료학적 제형{THERAPEUTIC FORMULATIONS OF KERATINOCYTE GROWTH FACTOR}

본 발명은 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자의 제형 및 케라티노사이트 성장 인자를 포함하는 동결건조시킨 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

케라티노사이트 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF) 는 상피세포에 특이적인 성장 인자이며 인간의 폐 배아 섬유아세포주의 조정 배지에서 처음으로 확인되었다 [Rubin 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:802-806 (1989) 문헌을 참조하라]. KGF 에 대한 mRNA 의 발현은 다양한 발생 단계의 상피 조직으로부터 유도된 몇몇 간질(stromal) 섬유아세포주에서 검출되었다. KGF 의 전사는 또한 정상적인 성인의 신장 및 위장관 기관에서 추출된 RNA 에서 분명히 나타난다 [Finch 등의 Science 245:752-755 (1989) 문헌을 참조하라]. KGF 가 배양물에서 섬유아세포로부터 분비되고 표피가 아닌 진피에서 생체내 발현된다는 증거는 KGF 가 케라티노 사이트 증식에 중요한 정상적인 파라크린 효과기(paracrine effector) 임을 나타내는 것이다. KGF 가 조직 배양에서 1 차 또는 2 차 인간 케라티노사이트의 증식을 자극하는데 있어서 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor, EGF) 만큼 효력이 있음이 연구에 의해 나타났다 [Marchese 등의 J. Cell. Phys. 144:326-332 (1990) 문헌을 참조하라]. KGF 는 표피, 경구 상피 및 하부 위장관 상피, 췌장, 간, 폐, 요로상피, 전립선 상피세포 및 그밖의 다른 것들을 함유하는 많은 기관들의 상피에 인접한 간엽 세포에 의해 생산된다 [Finch 등의 상기 문헌, Housley 등의 J Clin Invest. 94:1764-77, (1994) ; Yi 등의 Am J Path. 145:80-85, (1994) ; Pierce 등의 J Exp. Med. 179831-40, (1994) ; Yi 등의 J Urol. 154;1566-70,(1995) ; 및 Ulich 등의 J Clin Invest. 93:1298-1306 (1994) 문헌을 참조하라].

정제된 KGF 의 부분적인 아미노산 서열분석 뿐만 아니라 인간 배아 섬유아세포주의 조정 배지로부터의 KGF 의 정제, KGF 유전자의 클로닝 및 생물학적으로 활성인 재조합 KGF 를 수득하기 위한 박테리아 세포에서의 유전자 발현이 국제 특허 공개 문헌 제 WO 90/08771 호에 기재되어 있다. 이러한 공개 문헌에는 또한 KGF 또는 KGF-유사 폴리펩티드가 이식된 각막 조직을 자극시키거나 또는 화상 상처에 적합한 상처 치료제로서 유용함이 기재되어 있다.

정상적인 성장한 동물에서의 생체외 및 생체내 연구로 KGF-1(이하 "KGF"라 명명함) 이 모낭 형태형성, 간세포 증식, 및 폐, 가슴, 췌장, 위, 소장 및 대장에서의 상피세포 증식에서 변화를 일으키는 것으로 밝혀졌다 [Panos 등의 J. Clin. Invest. 92:969-977 (1993) ; Ulich 등의 Am. J. Path. 144:862-868 (1994) ; Yi 등의 Am. J. Path. 145:80-85 (1994) ; 및 Ulich 등의 J. Clin. Invest. 93:1298-1306 (1994) 문헌을 참조하라]. 배아 또는 신생아 발생에 있어서 KGF 의 역할은 현재 연구 중에 있다 ; 그러나 갓 태어난 마우스에서 정낭 발생의 중요한 매개자인 것으로 상세히 기록되어 있다 [Alarid 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1074-1078, (1994) 문헌을 참조하라]. 또한, 간세포에서 KGF 를 과발현시킨 마우스에서 다낭포성 신장이 나타나는데 [Nguyen 등의 Oncogene 12:2109-19, (1996) 문헌을 참조하라], 계면활성제 촉진제를 사용하여 폐에서의 KGF 의 과발현으로 마우스에서 폐 낭선종이 나타나고 [Simonet 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:12461-65, (1995) 문헌을 참조하라], 이는 정상적인 신장 및 폐 발생에 있어서 KGF 의 중요성을 나타내는 것이다.

재조합 KGF 를 토끼의 귀 또는 돼지 피부에서 유도된 외과적 상처에 국소적으로 사용할 경우에, KGF 가 재-상피형성을 증가시키고 상피세포의 두께를 증가시키는 것으로 나타나 있다 [Pierce 등의 J. Exp. Med. 179:831-840 (1994) ; 및 Staiano-Coico 등의 J. Exp. Med. 179:831-840 문헌을 참조하라]. Bosch 등의 [J. Clin. Invest. 98:2683-2687 (1996)] 문헌에는 케라티노사이트 성장 인자의 투여로 간세포 증식이 유도될 거라고 보고되어 있다.

일반적으로, 정제된 폴리펩티드는 수성 상태에서 단지 최저의 안정성을 나타내며 화학적 및 물리적 분해로 인해 처리과정과 저장기간 동안에 생물학적 활성도를 상실하게 된다. 또한, 수용액 형태의 폴리펩티드 조성물은 탈아미드화 반응(deamidation) 및 펩티드 결합 절단과 같은 가수분해 반응을 겪게 된다. 이러한 결과는 생물학적 활성도를 기본으로 한 규정된 투여량 범위 내에서 사람에게 투여하고자 하는 치료학적으로 활성인 폴리펩티드에 심각한 문제를 나타낸다.

정제된 케라티노사이트 성장 인자의 투여로 인해 인구에 영향을 미치는 많은 질환들을 치료하기 위한 가망성 있는 후보물질을 유지하게 된다. 그러나, 다양한 저장 조건에서 정해진 시간 동안에 안정한 약학적 조성물을 유지하여 생체내에서 환자에게 효과적인 KGF 의 능력을 입증하지 못하였다. 따라서, 상피세포 성장의 KGF-매개 자극으로 이익을 얻은 다양한 질환을 치료하기 위한 치료제로서 유용한 안정한 제형 내에서 케라티노사이트 성장 인자를 제공하려는 노력이 본 분야에 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 케라티노사이트 성장 인자(KGF) 를 동결건조시키기에 유용한 신규한 제형을 제공하여, 결과적으로 고도로 안정한 KGF 산물을 형성하는 것이다. 안정한 KGF 산물은 KGF 투여로 이익을 얻을 수 있는 장애 또는 증상을 앓고 있는 개체를 치료하는데 유용한 치료제이다.

하나의 양상에서, 본 발명은 히스티딘, 증량제(bulking agent), 계면활성제 및 안정화 당(stabilizing sugar) 과 같은 당을 포함하는 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자 조성물을 제공한다.

하나의 실시형태에서, KGF 조성물은 SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다. KGF 단백질의 변이체는 대립형질 변이체, 또는 천연 KGF 의 단편, 키메라 또는 하이브리드 분자를 포함하여 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 KGF 는 천연 KGF 중 처음의 23 개의 아미노산이 결실된 △N23 KGF (SEQ ID NO : 3) 임을 생각할 수 있다. 변이체는 다음과 같이 본원에 기재되어 있는 분자들을 포함한다 : 예를 들어, 전하가 변경된 폴리펩티드로서, 여기에서 천연 KGF (SEQ ID NO : 2) 의 아미노산 잔기 41-154 중 하나 또는 그 이상이 결실되거나, 또는 감소된 양전하를 갖는 단백질에 영향을 미치도록 선별된 음하전된 잔기 또는 중성 잔기로 치환된다. 또다른 KGF 의 예로는 다음을 포함하지만 이것으로 제한하는 것은 아니다 : 천연 KGF 의 Asn¹¹⁵ -His¹¹⁶ -Tyr¹¹⁷ -Asn¹¹⁸ -Thr¹¹⁹ 의 루프-형성 영역(loop forming region) 내의 적어도 하나의 아미노산에 대한 고도의 루프-형성 잠재력을 갖는 적어도 하나의 아미노산을 치환시킴으로써 형성된 단백질. 또다른 예로는 천연 KGF 의 아미노산 123-133 (SEQ ID NO : 2 의 아미노산 154-164) 의 영역 내에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환되거나, 결실되거나 또는 추가된 단백질을 포함한다.

하나의 양상에서, 본 발명은 증량제/삼투몰농도 조절제(osmolarity regulating agent) 의 사용을 생각할 수 있다. 증량제는 결정형(예를 들어, 글리신, 만니톨)이거나 또는 무정형(예를 들어, L-히스티딘, 수크로스, 덱스트란과 같은 중합체, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로스 및 락토스) 일 것이다. 하나의 실시형태에서, 증량제는 만니톨이다. 다른 실시형태에서, 만니톨은 약 2 ％ w/v 내지 약 5 ％ w/v 의 농도에서 혼입된다. 또다른 실시형태에서, 농도는 약 3 ％ w/v 내지 약 4.5 ％ w/v 이다. 다른 실시형태에서, 만니톨의 농도는 4 ％ w/v 이다.

다른 양상에서, 본 발명은 안정화 당(stabilizing sugar)을 포함하는조성물을 제공한다. 사용하고자 하는 당류로는 수크로스, 트레할로 스 또는 글리신을 포함하지만 이것으로 제한하는 것은 아니다. 하나의 실시형태에서, 당은 수크로스이다. 관련 실시형태에서, 수크로스의 농도는 약 1-3 ％ w/v 이다. 다른 실시형태에서, 수크로스의 농도는 2 ％ w/v 이다.

본 발명의 조성물의 pH 를 약 5.0 내지 약 8.0 의 범위로 조절하는 것을 생각할 수 있다. 하나의 실시형태에서, KGF 조성물의 pH 범위는 약 6.0 내지 약 8.0 이다. 다른 실시형태에서, 조성물의 pH 범위는 약 6.0 내지 약 7.0 이다. 또다른 실시형태에서, 조성물의 pH 는 약 6.5 이다.

또다른 양상에서, 본 발명의 조성물은 계면활성제의 사용을 생각할 수 있다. 사용된 계면활성제로는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 를 포함하지만 이것으로 제한하는 것은 아니다. 하나의 실시형태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20 이다. 관련 실시형태에서, 폴리소르베이트 20 농도는 약 0.1 ％ w/v 내지 약 0.004 ％ w/v 의 범위 이내이다. 다른 실시형태에서, 폴리소르베이트 20 농도는 약 0.01 ％ w/v 이다.

하나의 양상에서, 본 발명은 10 mM 히스티딘, 4 ％ 만니톨, 2 ％ 수크로스, 및 0.01 ％(w/v) 폴리소르베이트 20 을 포함하는, pH 가 6.5 인 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자 조성물을 생각할 수 있다.

본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자의 제조방법을 제공한다 : (a) 히스티딘, 증량제, 안정화 당(stabilizing sugar), 및 계면활성제로 이루어진 용액을 제조하는 단계 ; 및 (b) 상기 케라티노사이트 성장 인자(KGF) 를 동결건조시키는 단계. 관련 양상에서, 본 발명은 동결건조시키는 단계 전에 다음의 단계들을 추가로 포함하여 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자의 제조방법을 생각할 수 있다 : (b) 용액의 pH 를 약 6.0 내지 약 8.0 의 pH 로 조절하는 단계 ; (c) 케라티노사이트 성장 인자를 함유하는 용액을 제조하는 단계 ; (d) 단계 (b) 용액에서의 완충용액을 단계 (c) 용액의 완충용액으로 교체하는 단계 ; (e) 적절한 양의 계면활성제를 첨가하는 단계 ; 및 (f) 단계 (e) 로부터 혼합물을 동결건조시키는 단계. KGF 는 SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 에 기재되어 있는 KGF 단백질이거나 또는 이의 변이체임을 또한 생각할 수 있다.

하나의 양상에서, 본 발명의 방법에서 증량제/삼투몰농도 조절제의 사용을 생각할 수 있으며, 여기에서, 증량제는 결정형(예를 들어, 글리신, 만니톨)이거나 또는 무정형(예를 들어, L-히스티딘, 수크로스, 덱스트란과 같은 중합체, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로스 및 락토스) 일 것이다. 하나의 실시형태에서, 증량제는 만니톨이다. 다른 실시형태에서, 만니톨의 농도는 약 2 ％ w/v 내지 약 5 ％ w/v 이다. 관련 실시형태에서, 만니톨의 농도는 약 3 ％ w/v 내지 약 4.5 ％ w/v 이다. 또다른 실시형태에서, 만니톨의 농도는 4 ％ w/v 이다.

다른 양상에서, 본 발명의 방법은 당을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서 당은 안정화 당(stabilizing sugar)이다. 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 당으로는 수크로스, 트레할로스 또는 글리신을 포함하지만 이것으로 제한하는 것은 아니다. 하나의 실시형태에서, 당은 수크로스이다. 관련 실시형태에서, 수크로스의 농도는 약 1 ％ w/v 내지 약 3 ％ w/v 이다. 또다른 실시형태에서, 수크로스의 농도는 2 ％ w/v 이다.

본 발명의 방법에서 pH 를 생리학적 pH 로 조절하는 것을 생각할 수 있다. 하나의 실시형태에서, pH 범위를 약 0.5 내지 약 8.0 으로 조절한다. 다른 실시형태에서, pH 범위를 약 6.0 내지 약 8.0 으로 조절한다. 또다른 실시형태에서, pH 범위를 약 6.0 내지 약 7.0 으로 조절한다. 다른 실시형태에서, pH 를 pH 값 6.5 로 조절한다.

다른 양상에서, 본 발명의 방법에서 계면활성제의 사용을 생각할 수 있다. 사용된 계면활성제로는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80 을 포함하지만 이것으로 제한하는 것은 아니다. 하나의 실시형태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20 이다. 관련 실시형태에서, 폴리소르베이트 20 의 농도 범위가 약 0.1 ％ w/v 내지 약 0.004 ％ w/v 이내이다. 또다른 실시형태에서, 폴리소르베이트 20 농도는 약 0.01 ％ w/v 이다.

하나의 양상에서, 본 발명은 10 mM 히스티딘, 4 ％ 만니톨, 2 ％ 수크로스, 및 0.01 ％ (w/v) 폴리소르베이트 20 을 포함하는, pH 가 약 6.5 인 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자 조성물의 유효량을 피실험자에게 투여하여 상피세포 성장의 KGF-매개 자극을 증가시킴으로써 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 치료하려는 질환은 다음과 같은 질환을 생각할 수 있다 : 장독소 ; 점막염 ; 화상 또는 그밖의 다른 부분층 피부 손상 및 전층 피부 손상 ; 모낭, 땀샘(한선) 및 기름샘(피지선)의 재증식 ; 부속기(adnexal) 구조의 증식 ; 수포성표피박리증 ; 화학요법으로 유도된 탈모증 ; 남성형 탈모증(male-pattern baldness) ; 위궤양 ; 십이지장궤양 ; 미란성위염, 식도염 또는 식도역류 ; 염증성 장질환 ; 하이알린막증(폐초자막증) ; 담배 연기 흡입으로 인한 손상(injuries from smoke inhalation) ; 폐기종 ; 간경변증, 간부전(liver failure), 급성 바이러스 간염, 그밖에 다른 독성으로 인한 간 손상 ; 또는 대숙주성이식편병(GVHD).

또한 본 발명은 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자 조성물을 가지고 있는 제 1 용기, 및 상기 동결건조시킨 조성물에 생리학적으로 수용가능한 재구성 용액(reconstitution solution)을 가지고 있는 제 2 용기를 포함하는 수성의 약학적 조성물을 제조하기 위한 키트를 제공한다. KGF 단백질은 SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 에 기재되어 있거나, 또는 이의 변이체일 것이다. 생리학적으로 수용가능한 재구성 용액은 본원에 기재되어 있는 제제를 포함하여 임상적으로 유용한 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항균제와 항진균제, 등장성 제제(isotonic agent)와 흡수 지연제(absorption delaying agent) 등을 포함하지만 이것으로 제한하는 것은 아닌 모든 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제일 것이다. 또한, KGF 조성물은 경구적, 국소적, 경피적, 비경구적, 흡입용 스프레이, 질내, 직장내, 또는 두개골내 주사를 포함하여 치료 의사가 적절하다고 생각하는 모든 경로에 의해 피실험자에게 투여될 것이다. 본원에서 사용된 비경구적 이란 용어는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 낭내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다. 정맥내, 피내, 근육내, 유선내, 복강내, 척수강내, 구후(retrobulbar), 허파내 주사 및/또는 특정 부위에서의 외과적 이식에 의한 투여 또한 생각할 수 있다.

도 1 은 상이한 pH 에서 액체의 KGF 제형 내의 가용성 단백질의 크기-배제 (SE)-HPLC (도 1A) 및 양이온-교환 (CE)-HPLC (도 1B) 분석을 나타낸 것이다.

도 2 는 10 mM 히스티딘, 0.01 ％ 폴리소르베이트 20, 및 4 ％ 만니톨/ 2 ％ 수크로스이거나 또는 3 ％ 만니톨/2 ％ 수크로스에서 동결건조시킨 KGF 제형을 비교한 역-상(RP)-HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 도 2A 는 동결건조시킨 후의 0 시간을 나타낸 반면에, 도 2B 는 4 ℃ 에서 1 년 동안 저장한 후의 산물을 나타낸 것이다. 삽입된 도면은 메인 피크 주변의 영역을 나타낸 것이다.

도 3 은 45 ℃ 에서 24 주 동안 저장한 후에 동결건조시킨 KGF 제형의 SE-HPLC 분석으로부터 단백질 농도를 기능적으로 표현한 메인 피크 백분율을 나타낸 것이다.

본 발명은 정제된 케라티노사이트 성장 인자를 동결건조시키기 위한 제형에 관한 것으로, 상기 제형은 안정한 단백질 산물을 제공하며 정제된 단백질의 저장 기간을 증가시킨다. 본 발명은 또한 케라티노사이트 성장 인자를 포함하는 동결건조시킨 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "케라티노사이트 성장 인자" 또는 "KGF" 는 케라티노사이트 성장 인자 폴리누클레오티드 (SEQ ID NO : 1, 진뱅크 기탁번호 제 NM_002009 호)나 또는 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 폴리펩티드 (진뱅크 기탁 번호 제 NP_002000 호) 또는 이의 유사체, 또는 선택적으로 △N23 KGF (SEQ ID NO : 3) 와 같은 케라티노사이트 성장 인자의 활성 단편이나 이의 유사체, 또는 케라티노사이트 성장 인자 수용체에 결합하고 활성화시키는 인자를 의미한다. 바람직한 실시형태에서, KGF 는 △N23 KGF 이고, 이것은 성숙한 KGF 로부터 아미노 말단에서 처음의 23 개의 아미노산이 결실된 KGF 를 재조합적으로 생산해낸 형태이다. 예를 들어, 다음과 같은 특허 문헌을 참조하며 이들 모두의 문헌들은 도면을 포함하여 그 전체를 본원에서 참고문헌으로 인용하였다 : 미국 특허 번호 제 5,677,278 호, 제 6,677,301 호, 제 6,074,848 호, 제 5,843,883 호, 제 5,863,767 호 및 제 5,773,586 호 (이들 모두를 CHIRON Corp.에 지정하였음), 제5,731,170 호 ; 1990 년 8 월 9 일자로 공개된 PCT 출원 번호 제 WO 90/08771 호 (전장 형태의 KGF 및 변이체에 관한 것임) ; 1996 년 4 월 25 일자로 공개된 PCT 출원 번호 제 WO 96/11949 호 ; 1996 년 4 월 25 일자로 공개된 PCT 출원 번호 제 WO 96/11951 호 ; 및 1998 년 6 월 11 일자로 공개된 PCT 출원 번호 제 WO 98/24813 호 (KGF 의 안정한 유사체에 관한 것임).

천연의 KGF 에 비해 향상된 안정성을 갖는 KGF 유사체는 PCT 국제 공개 제 WO 96/11951 호 및 미국 특허 번호 제 6,677,301 호에 기재되어 있으며, 이러한 KGF 유사체는 본 발명에서 고려된다. 선택적으로, 완전한 또는 일부의 KGF 활성을 보유하고 있는 완전한(entire) KGF 폴리펩티드의 모든 단편 또는 이의 유사체도 고려된다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "케라티노사이트 성장 인자(keratinocyte growth factor)" 및 "KGF" 는 천연 KGF 및 KGF 유사 단백질(또는 "돌연변이 단백질")을 포함하고, 다른 식으로 규정하지 않는다면 상기 용어들은 상호교환하여 사용할 수 있음을 의미하며, 상기 천연 KGF 및 KGF 유사 단백질은 천연 KGF 의 펩티드 서열의 전체 또는 일부와 실질적으로 동일한 펩티드 서열을 가짐을 특징으로 하고, H-티미딘 결합에 의해 측정된 바와 같이, 예를 들어, NIH/3T3 섬유아세포보다 BALB/MK 케라티노사이트 세포를 적어도 약 500-배 보다 크게 자극하고, BS/589 상피세포 또는 CC1208 상피세포에 비해 BALB/MK 케라티노사이트 세포를 적어도 약 50-배 보다 크게 자극한다는 것을 나타내는 천연 KGF 의 생물학적 활성도, 특히 비-섬유아세포 상피세포를 증식시키는 활성도의 일부 또는 전체를 보유함을 특징으로 한다. 또한 본 발명에서 고려되는 펩티드는 본원에 예시되어 있는 바와 같은 온화하고 매우 엄격한 혼성화 조건 하에서 SEQ ID NO : 1 의 코딩 영역과 혼성화 될 수 있는 DNA 서열에 의해 코드되는 펩티드 서열이라고 불리는 "천연 KGF 의 펩티드 서열과 실질적으로 동일한 펩티드 서열을 특징으로 한다".

혼성화 내용에 있어서의 엄격한 조건은 염, 온도, 유기 용매 및 일반적으로 혼성화 반응에서 조절되는 다른 파라미터의 엄격한 복합성 조건이다. 엄격한 혼성화 조건의 예는 62 ℃-67 ℃ 의 4×SSC 에서 혼성화시킨 다음 대략 1 시간 동안 62 ℃-67 ℃ 의 0.1×SSC 에서 세척하는 것이다. 선택적으로, 엄격한 혼성화 조건의 예는 40 ℃-45 ℃ 의 4×SSC, 45 %-55 % 포름아미드에서 혼성화시키는 것이다[T. Maniatis 등의 Molecular Cloning(A Laboratory Manual) ; Cold Spring Harbor Laboratory(1982), pages 387 to 389 참조].

KGF 단백질은 천연 KGF 의 단편, 키메라 또는 하이브리드 분자를 포함하여, 대립유전자의 변이체, 또는 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입을 포함한다. 본 발명의 바람직한 KGF 분자는 △N23 KGF 이다. KGF 의 다른 예는 모분자(미국 특허 번호 제 6,008,328 호 참조)에 비해 향상된 안정성을 갖는 결과적으로 생성된 분자를 포함하는, 치환되거나 결실된 SEQ ID NO : 2 의 Cys¹ 및 Cys¹⁵ 에 대응되는 잔기를 갖는 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. KGF 의 또다른 예는 전하-변화 폴리펩티드를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 상기 폴리펩티드에서 천연 KGF 의 아미노산 잔기 41-154 중 하나 또는 그 이상(바람직하게 잔기 Arg⁴¹, Gln⁴³, Lys⁵⁵, Lys⁹⁵, Lys¹²⁸, Asn¹³⁷, Gln¹³⁸, Lys¹³⁹, Arg¹⁴⁴, Lys¹⁴⁷, Gln¹⁵², Lys¹⁵³ 또는 Thr¹⁵⁴)이 결실되거나, 또는 중성 잔기 또는 감소된 양전하를 갖는 단백질에 영향을 미치기 위해 선택된 음성적으로 하전된 잔기로 치환된다. KGF 의 더 추가적인 예는 천연 KGF 의 루프-형성 영역 Asn¹¹⁵-His¹¹⁶-Tyr¹¹⁷-Asn¹¹⁸-Thr¹¹⁹(미국 특허 번호 제 6,008,328 호 참조) 내의 적어도 하나의 아미노산이 보다 높은 루프-형성 잠재력을 가지는 적어도 하나의 아미노산으로 치환됨으로써 생성되는 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또다른 예는 천연 KGF 의 아미노산 123-133(SEQ ID NO : 2 의 아미노산 154-164) 영역 내에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 단백질을 포함한다.

특히 고려되는 KGF 단백질은 다음의 KGF 분자[일반적으로 기재되어 있는 숫자는 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 성숙한 단백질 내의 지정된 위치까지 신호 서열이 결실된 잔기를 의미하며, 괄호 안의 아미노산 위치의 잔기는 치환된 잔기이거나 또는 결실된 것("-" 로 나타내었음)을 나타낸다]를 포함한다 : △N15, △N16, △N18, △N23, △N24, △N25, △N26 또는 △N27 KGF, C(1, 15)S, △N15-△N24, △N3/C(15)S, △N3/C(15)-, △N8/C(15)S, △N8/C(15)-, C(1,15)S/R(144)Q, C(1,15)S/R(144)Q, △N23/R(144)Q, C(1,15,40)S, C(1,15,102)S, C(1,15,102,106)S, △N23/N(137)E, △N23/K(139)E, △N23/K(139)Q, △N23/R(144)A, △N23/R(144)E, △N23/R(144)L, △N23/K(147)E, △N23/K(147)Q, △N23/K(153)E, △N23/K(153)Q, △N23/Q(152)E/K(153)E ; R(144)Q 및 H(116)G.

상이한 많은 유형의 상피세포 및 내피세포에 관한 KGF 의 증식적인 효과는 개체에 영향을 미치는 다수의 증상 또는 질환을 치료하는데 유용한 치료제와 관련되어 있다. 하기에 뵨 발명의 KGF 로 치료할 수 있는 질환 및 의학적 증상을 설명하였다.

장독소는 방사선 및 화학요법 치료 섭생에 있어서 중요한 제한요인이다. KGF 로의 예비치료는 이러한 치료제의 투여량을 증가시키면서 장독소의 잠재적으로 치명적인 부작용은 감소시키는, 소장 점막에 대한 세포보호 효과를 나타낸다. 화학요법제 5-플루오로우라실로 치료하기 전에 재조합 인체 KGF 를 투여한 환자의 최근 I 상 임상시험은 KGF 로의 치료가 점막염의 발생빈도를 감소시킬 것이라는 것을 제안하였다[Meropol 등의 J Clin Oncol. 21 : 1452-8(2003) 참조]. 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, 방사선으로 유도된 장독소에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다[Withers 및 Elkind, "Microcolony Survival Assay for Cells of Mouse Intestinal Mucosa Exposed to Radiation", Int. J. Radiat., 17 : 261-267(1970) 참조]. 인체 치료학적 효능을 예상할 수 있는, 화학요법으로 유도된 장독소에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다[Sonis 등의 "An Animal Model for Mucositis Induced by Cancer Chemotherapy, Oral Surg.", Oral Med. Oral Pathol., 69 : 437-431(1990) ; 및 Moore, "Clonogenic Response of Cells of Murine Intestinal Crypts to 12 Cytotoxic Drugs", Cancer Chemotherapy Pharmacol., 15 : 11-15(1985) 참조].

KGF 치료는 위장관을 통해 점액의 생성에 현저한 영향을 미친다. 이러한 특성은 흡수된 해로운 물질로부터 장 점막을 보호하거나 또는 염증성 장질환과 같은 증상에 있어서 손상이 확산되는 것을 저해하는데 유용하다.

모낭, 땀샘(한선) 및 기름샘(피지선)과 같은 부속기 구조의 증식 및 분화를 자극하는 것은 화상, 및 다른 부분층 피부 손상 및 전층 피부 손상을 입은 환자의 외피 및 진피를 재생시키는데 매우 중요하다. 현재, 표피 결손은 반흔 형성 및 케라티노사이트 표면재생에 의해 치료되며 ; 피부를 완전하게 재생시키는 것은 아직 가능하지 않다. 모낭, 한선 및 피지선의 재분포는 화상을 포함하는 전층 피부 결손에서는 발생하지 않는다. KGF 는 이러한 재분포가 발생할 수 있도록 한다. 화상, 및 다른 부분층 피부 손상 및 전층 피부 손상에 대한 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, 부속기 구조 증식 및 자극에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다[Mustoe 등의 "Growth factor-induced acceleration of tissue repair through direct and inductive activities in a rabbit dermal ulcer model" J. Clin. Invest., 87 : 694-703(1991) ; Pierce 등의 "Platelet-derived growth factor(BB homodimer), transforming growth factor-beta 1, and basic fibroblast growth factor in dermal wound healing. Neovessel and matrix formation and cessation of repair" Am. J. Path. 140 : 1375-88(1992) ; 및 Davis 등의 "Second-degree burn healing : the effect of occlusive dressings and a cream." J. of Surgical Res. 48 : 245-248(1990) 참조].

수포성표피박리증은 밑에 있는 진피에 외피가 부착하는데 문제가 있으며, 이로 인해 심각한 이환율을 유발시킬 수 있는, 빈번한 개방성의 동통성 수포가 발생한다. KGF 에 의한 치료와 같은, 이러한 병변의 가속화된 재-상피화는 감염의 위험성을 감소시키고 동통을 감소시키며 상처를 치료하는데 횟수를 감소시킨다.

화학요법으로 유도된 탈모증은 악성종양에 대한 화학요법 과정으로 치료받고 있는 환자에게서 발생한다. 현재로서는 머리카락이 일시적으로 손실되는 것을 유발시키는 세포 사멸로부터 모낭 세포를 예방하는데 효과적인 치료제가 없다. KGF 는 이러한 수단을 제공한다. 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, 화학요법으로 유도된 탈모증에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다[Sawada 등의 "Cyclosporin A Stimulates Hair Growth in Nude Mice", Laboratory Investigation, 56(6) : 684 (1987) ; Holland, "Animal Models of Alopecia", Clin. Dermatol, 6 : 159 : 162(1988) ; Hussein, "Protection from Chemotherapy-induced Alopecia in a Rat Model", Science, 249 : 1564-1566(1990) : 및 Hussein 등의 "Interleukin 1 Protects against 1-B-D-Arabinofuranosyulcytosine-induced Alopecia in the Newborn Rat animal Model", Cancer Research, 51 : 3329-3330(1991) 참조].

남성형 탈모증은 일반적으로 발병되며 본질적으로 치료가 불가능하다. 남성 및 여성에게서 머리카락의 증진적인 손실은 심각한 미용적 문제점이다. KGF 수용체 넉아웃은 얇은 피부, 적은 수의 모낭을 나타내고, 상처 치료를 지연시키지만, KGF 가 결핍된 마우스에서는 주름이 잡힌 지저분한 외피가 나타난다[Werner 등의 Science 266 : 819-22(1994) 참조]. 탈모증의 시험 모델에 있어서, 재조합 KGF 에 의한 예비-치료는 화학요법제 시토신 아라비노사이드(ARA-c)를 투여하여 유도되는 탈모증의 대략 50 % 를 보호한다[Danilenko 등의 Am J Path. 147 : 145-54(1995) 참조]. 이러한 증상은 KGF 를 전신적으로, 또는 약물이 두피를 통해 투여되고 흡수되거나 또는, 에어건 또는 유사한 기술을 사용하여 두피 내로 분무 주사되는 경우에는 국소적으로 사용하여 치료할 수 있다. 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, 남성형 탈모증에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다[Uno, "The Stumptailed Macaque as a Model for Baldness : effects of Minoxidil", International Journal of Cosmetic Science, 8 : 63-71(1986) ; Porter R., "Mouse models for human hair loss disorders" J Anat. 202 : 125-31 (2003) 참조].

KGF 를 투여하여 위장관에서 세포 성장을 유도할 수 있다는 것이 연구를 통해 밝혀졌다[Playford 등의 J Pathol. 184 : 316-22(1998) 참조]. 위궤양은 H2 길항물질에 의해 치료할 수 있으나, 상기 위궤양은 현저한 이환율 및 재발률을 일으키며, 점막선에 반흔을 형성하면서 치료된다. 예를 들어, KGF 의 치료에 의해 위궤양을 앓고 있는 환자에게서 좀 더 신속하게 선 점막을 재생시키는 능력은 위궤양을 치료하는데 현저한 치료학적 향상을 제공한다. 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, 위궤양에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 다음의 문헌에 기재되어 있다 : Tarnawski 등의 ["Indomethacin Impairs Quality of Experimental Gastric Ulcer Healing : A Quantitative Histological and Ultrastructural Analysis", In : Mechanisms of Injury, Protection and Repair of the Upper Gastrointestinal Tract, (eds) Garner and O'Brien, Wiley & Sons(1991)] ; 및 Astudillo 등의 ["Gastroprotective activity of oleanolic acid derivatives on experimentally induced gastric lesions in rats and mice" J Pharm Pharmacol. 54 : 583-8(2002)].

위궤양과 유사한 십이지장궤양은 치료가능하지만, 십이지장의 점막내층을 좀 더 완전하고 신속하게 재생시키기 위한 치료제의 개발이 중요하다. 또한, 이러한 궤양을 재생적으로 치료하고 이들의 재발을 감소시키는 치료제가 유용하다. KGF 는 이러한 잠재력을 제공한다. 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, 십이지장궤양에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다[Berg 등의 "Duodenal ulcers produced on a diet deficient in pantothenic acid", Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 7 : 374-376(1949) ; Szabo 및 Pihan, "Development and Significance of Cysteamine and Propionitrile Models of Duodenal Ulcer", "Chronobiol. Int., 6 : 31-42(1987) ; Robert 등의 "Production of Secretatogues of Duodenal Ulcers in the Rat", Gastroenterology, 59 : 95-102(1970) ; 및 Keshavarzian 등의 "Gastroducdenal ulcers in rats induced by 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine(MPTP) : requirement for gastric acid secretion and the role of prostaglandins" Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 70 : 21-48(1990) 참조].

미란성위염, 식도염 또는 식도역류와 같은 위와 식도의 미란은 치료가능하지만, 위와 식도의 점막내층을 좀 더 완전하고 신속하게 재생시키기 위한 치료제의 개발이 중요하다. 또한, 이러한 미란을 재생적으로 치료하고 이들의 재발을 감소시키는 치료제가 유용하다. KGF 는 이러한 잠재력을 제공한다. 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, 미란성위염, 식도염 또는 식도역류와 같은 위와 식도의 미란에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다[Geisinger 등의 "The histologic development of acid-induced esophagitis in the cat", Mod-Pathol., 3 : 619-624(1990) ; Carlborg 등의 "Tetracycline induced esophageal ulcers. A clinical and experimental study", Laryngoscope, 93 : 184-187(1983) ; Carlborg 등의 "Esophageal lesions caused by orally administered drugs. An Experimental study in the cat", Eur-Surg-Ethanol on esophageal motility in cats, Alcohol-Clin-Exp-Res., 15 : 116-121(1991), 및 Katz 등의 "Acid-induced esophophagitis in cats is prevented by sucralfate but not synthetic prostaglandin E.", Dig-Dis-Sci., 33 : 217-224(1988) 참조].

크론병(일차적으로 소장에 영향을 미침) 및 궤양성 대장염(일차적으로 대장에 영향을 미침)과 같은 염증성 장질환은 점막 표면의 파괴, 염증, 반흔 및 치료중 유착 형성, 및 병에 걸린 개체에 대한 현저한 이환율을 일으키는 공지되어 있지 않은 병인론의 만성 질환이다. 현재의 치료법은 염증을 조절하는 것이지만, KGF 치료는 IBD 에 걸린 동물에게서 위장관 상피의 증식을 유도함이 밝혀졌다[Housley 등의 J Clin Invest. 94 : 1764-77(1994) 참조]. 좀 더 신속하게 치료되도록 하고, 점막 표면의 상피화를 자극하는 KGF 와 같은 치료제는 질환의 진행을 조절하는데 효과적이다. 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, 염증성 장질환에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다[Morris 등의 "Hapten-induced Models of Chronic Inflammation and Ulceration in the Rat Colon", Gastroenterology, 96 : 795-803(1989) ; Rachmilewitz 등의 "Inflammatory Mediators of Experimental Colitis in Rats", Gastroenterology, 97 : 326-327(1989) ; Allgayer 등의 "Treatment with 16,16'-dimethyl-prostaglandin E2 before and after induction of colitis with trinitrobenzenesulfonic acid in Rats", Gastroenterology, 96 : 1290-1300 (1989) ; "Review : Experimental Colitis in Animal Models", Scand. J. Gastroenterol, 27 : 529-537(1992) 참조].

미숙아의 하이알린막증(폐초자막증)인 경우에는 폐 내에서 제 II 형 폐포세포에 의해 계면활성제가 생성되지 않으며, 이로 인해 폐포의 허탈이 유발된다. 하이알린막증은 급성 및 만성 상태 둘 다를 나타낸다. 하이알린막증(신생아 호흡곤란 증후근 : Infant Respiratory Distress Syndrome-IRDS)의 급성형은 인공적으로 환기시키고 80-100 % 농도의 추가적인 산소를 처리하여 치료할 수 있으며, 외인성 계면활성제를 투여함으로써 치료한다. 장기간 치료를 받고 있는 이러한 환자들은 하이알린막증(기관지폐이형성증 : bronchopulmonary dysplaisa-BPD)의 만성형 질환을 발병시킬 수 있다. 계면활성제는 IRDS 와 관련된 사망률을 급격히 감소시킬수 있으나, BPD 와 관련된 이환율은 여전히 높게 나타난다. 따라서, BPD 의 이환율을 감소시키기 위해 신생아에게서 폐의 성숙 및 계면활성제의 분비를 가속화시키는 효과적인 치료법을 개발하는 것이 필요하다. 코르티코스테로이드가 28 주 태아에게서 성숙 및 분비를 가속화시킬 수 있으나, 현재 이러한 군집에서 현저한 이환율 및 사망률을 일으키는 보다 어린 태아에 대한 치료법은 존재하지 않는다. BPD 에 대한 이전 기술은 IRDS 치료의 향상이 보다 작은 미숙아의 인공적 환기 및 보다 작은 태아의 BPD 의 이환율의 계속적인 증가에 의해 조절될 수 있음을 제안한다. 제 II 형 폐포세포[Yi 등의 Inflammation 22 : 315-25(1998) 참조]의 증식 및 분화를 유도하는 KGF 와 같은 치료제는 이러한 질환을 치료하는데 효과적이라고 여겨진다. 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, IRDS 에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다. Seider 등의 "Effects of antenatal thyrotropin-releasing hormone, antenatal corticosteroids, and postnatal ventilation on surfactant mobilization in premature rabbits", Am. J. Obstet. Gynec., 166 : 1551-1559(1992) ; Ikegami 등의 "Corticosteroid and thyrotropin-releasing horment effects on preterm sheep lung function", J. Appl. Physiol., 70 : 2268-2278(1991)을 참조하라. 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, BPD 에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다[Yuh-Chin 등의 "Natural surfactant and hyperoxide lung injury in primates I. Physiology and biochemistry", J. Appl. Physiol. 76 : 991-1001(1994) ; 및 Galan 등의 "Surfactant replacement therapy in utero for prevention of hyaline membrane disease in the preterm baboon", Am. J. Obstet. Gynecol., 169 : 817-824(1993) 참조].

담배 연기 흡입(smoke inhalation)은 기관지 상피 및 폐포의 괴사에 의한, 화상 손상에 따른 매주의 이환율 및 사망률의 중요한 원인이다. 이러한 구조의 증식 및 분화를 자극하고 이들의 치료 및 재생을 유도할 수 있는 KGF 와 같은 성장 인자는 흡입 손상을 치료하는데 효과적이다. 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, 연기 흡입에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다. Hubbard 등의 "Smoke inhalation injury in sheep", Am. J. Pathol., 133 : 660-663(1988)을 참조하라.

폐기종은 폐포의 진행적 손실에 의해 발병한다. 재성장을 자극하거나 또는 남아있는 폐포를 세포보호[Kaza 등의 Circulation. 106(12 Suppl 1) : I120-4(2002) 참조]하는 KGF 와 같은 성장 인자는 치료학적으로 효과적이다. 현재, 허용가능한 효과적인 치료방법은 없다. 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, 폐기종에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다[Stolk 등의 "Induction of emphysema and bronchial mucus cell hyperplasia by intratracheal instillation of lipopolysaccharide in the hamster." J. Pathol., 167 : 349-56(1992) 참조].

바이러스성 간염 및 만성 알콜 섭취에 대하여 2 차적으로 발생하는 간경변증은 이환율 및 사망률의 현저한 원인이 된다. 간 기능을 향상시키기 위한 KGF 의 사용[Danilenki, D., Toxicol Pathol. 27 ; 64-71(1999) 참조]으로 인한 간세포의 세포보호, 증식 및 분화는 간경변의 발병을 늦추거나 예방하는데 효과가 있다. 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, 간경변증에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다[Tomaszewski 등의 "The production of hepatic cirrhosis in rats", J. Appl. Toxicol., 11 : 229-231(1991) 참조].

전격성 간부전(fulminant liver failure)은 말기 간경변과 함께 발병하는 치명적인 증상이다. 남아있는 간세포의 증식을 유도할 수 있는 KGF 와 같은 제제는 현재로서 간 이식으로만 치료할 수 있는 이러한 질환에 직접적으로 효과적이다. 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, 전격성 간부전에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다[Mitchell 등의 "Acetaminophen-induced hepatic necrosis I. Role of drug metabolism", J. Pharmacol. Exp. Ther., 187 : 185-194(1973) ; 및 Thakore 및 Mehendale, "Role of hepatocellular regeneration in CC14 autoprotection", Toxicologic Pathol. 19 : 47-58(1991) 참조].

급성 바이러스성 간염은 주로 무증상적이며 자율성 질환이다. 그러나, 소수의 환자에게서, 심각한 간 손상이 여러 주에 걸쳐 발생할 수 있다. KGF 와 같은 세포보호제는 간세포성 변성을 예방하는데 효과적이다.

아세트아미노펜, 할로탄, 사염화탄소 및 다른 독성에 의해 유발되는 간에 대한 독성 손상(toxic insult)은 간세포에 대해 세포보호적인 성장 인자(KGF)에 의해 개선될 수 있다. 인체 치료학적 효능을 가지고 있는 화합물의 예측시험을 가능하게 하는, 간독소에 대한 표준 생체내 모델은 널리 공지되어 있다[Mitchell 등의 (1973), 상기문헌, 및 Thakore 및 Mehendale(1991) 상기문헌 참조].

대숙주성이식편병(GVHD)(만성 또는 급성)은 환자의 비효과적인 골수 또는 간세포 이식으로 인해 발병한다. GVHD 는 면역조절 및 세포독성 인자의 상향조절로 인한 다양한 기관계의 손상을 유발한다. GVHD 는 기관지, 폐, 간, 피부 및 눈의 점액선, 구강 내의 침샘 및 위내막 및 장을 윤활시키는 샘을 포함하는 다양한 부위에 손상을 유발한다. GVHD 가 유도된 동물에서 이루어진 최근 연구는 rHuKGF-치료받은 피실험자는 장내 GVHD 가 발병되지 않으며, 내독소혈증도 발병되지 않고, 사망하지 않는다는 것을 나타낸다[Panoskaltsis-Mortari 등의 "Keratinocyte growth factor facilitates alloengraftment and ameliorates graft-versus-host disease in mice by a mechanism independent of repair of conditioning-induced tissue injury" Blood. 96 : 4350-6(2000) 참조]. 이러한 데이타는 KGF 가 TNF-알파, NO 및 다른 잠재적인 세포독성 인자에 의해 매개되는 상피세포를 보호함으로써 급성의 치명적인 GVHD 의 발병을 예방한다는 것을 나타낸다. 다양한 유형의 세포에서 상피의 증식을 유도할 수 있는 KGF 와 같은 제제는 인체 이식 수령자에게서 GVHD 를 치료하는데 효과적이다.

제형 및 투여

KGF 단백질 또는 펩티드는 상기한 바와 같은 인체 질환을 치료하기 위해 약학적 제형으로 사용하는데 유용하다. KGF 는 액상 또는 동결건조시킨 제형으로 제조할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, KGF 조성물은 동결건조시켰다. 동결건조는 본 분야에 일반적인 기술을 사용하여 수행할 수 있으며, 제조될 조성물에 대하여 최적이어야 한다[Tang 등의 Pharm Res. 21 : 191-200(2004) 및 Chang 등의 Pharm Res. 13 : 243-9(1996) 참조].

동결건조 사이클은 일반적으로 다음의 3 개의 단계를 포함한다 : 동결시키는 단계, 1 차 건조시키는 단계 및 2 차 건조시키는 단계[A.P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278 : 167(1977) 참조]. 동결시키는 단계에서, 얼음 형성이 시작되어 완료될 때까지 용액을 냉각시켰다. 더욱이, 이러한 단계로 증량제의 결정화가 유도된다. 진공을 사용하고 승화를 촉진시키기 위해 열을 가하여, 챔버 압력을 얼음의 증기압 이하로 감소시킴으로써 수행하는 1 차 건조시키는 단계에서 얼음을 승하시켰다. 마지막으로, 흡수되거나 결합된 물을 환산된 챔버 압력 및 상승된 선반 온도 하의 2 차 건조 단계에서 제거하였다. 이러한 과정으로 동결건조시킨 케이크로 공지되어 있는 물질을 생성하였다. 그런 다음, 사용하기 전에 케이크는 주사용 멸균수 또는 적합한 다회용 재구성 용액으로 재구성할 수 있다.

동결건조 사이클은 부형제의 최종 물리적 상태를 결정할 뿐만 아니라 재구성 시간, 외형, 안정성 및 최종 수분 함량과 같은 다른 파라미터에 영향을 미친다. 특정 온도에서 발생하며 동결건조 과정을 이해하고 최적화하는데 사용할 수 있는 다양한 전이(예를 들어, 유리 전이 및 결정화)를 통해 동결된 상태의 조성물 구조를 발생시켰다. 유리 전이 온도(Tg)는 용질의 물리적 상태에 대한 정보를 제공할 수 있으며 시차주사열계량법(differential scanning calorimetry : DSC)으로 결정할 수 있다. 이는 동결건조 사이클을 설계하는 경우 고려되어야만 하는 중요한 파라미터이다. 더욱이, 건조시킨 상태에서, 유리 전이 온도는 최종 산물의 저장 온도에 대한 정보를 제공한다.

본 발명의 조성물의 특정 실시형태에서, 동결건조 유도 및 저장 유도 응집 및 화학적 분해를 예방하거나 감소시키기 위해 동결건조시킨 제형에 안정화제를 첨가하였다. 재구성시 혼탁한 용액은 단백질이 침전되었음을 나타낸다. 용어 "안정화제"는 수성 및 고체 상태에서 응집 또는 다른 물리적 분해, 뿐만 아니라 화학적 분해[예를 들어, 자기분해, 탈아미드화(diamidation), 산화 등]를 예방할 수 있는 부형제를 의미한다. 수크로스, 트레할로스 또는 글리신을 포함하나 이에 한정되지 않는, 약학적 조성물에 통상적으로 사용할 수 있는 안정화제를 사용할 수 있다[Carpenter 등의 Develop. Biol. Standard 74 : 225(1991) 참조]. 폴리소르베이트 20(Tween 20) 또는 폴리소르베이트 80(Tween 80)과 같은 계면활성제는 또한 동결시키고 건조시키는 동안 표면 관련 응집 현상을 예방하기 위해 적합한 양으로 첨가할 수 있다[Chang, B, J. Pharm. Sci. 85 : 1325(1996) 참조]. 필요에 따라, 동결건조시킨 조성물은 또한 동결건조시킨 "케이크"를 형성하는데 적합한 적절한 양의 증량제 및 삼투몰농도 조절제를 첨가할 수 있다. 증량제는 결정질(예를 들어, 만니톨, 글리신) 또는 비결정질(예를 들어, 수크로스, 덱스트란과 같은 중합체, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로스)이다. 하나의 실시형태에서, 증량제는 만니톨이다. 물리적으로 및 약학적으로 안정하고 정밀한 케이크를 형성하기 위해 추가적인 실시형태에서, 만니톨은 약 2 % w/v 내지 약 5 % w/v 의 농도로 혼합되고, 또다른 추가적인 실시형태에서, 약 3 % w/v 내지 4.5 % w/v 의 농도로 혼합된다. 다른 실시형태에서, 만니톨의 농도는 2 % w/v 이다.

약학적으로-허용가능한 완충용액 및 pH 는 또한 본 발명의 조성물의 안정성에 영향을 미치는 것으로 선택하였다. 본 발명의 조성물 내에 존재하는 완충 시스템은 물리학적으로 적합한 것을 선택하고 재구성된 용액뿐만 아니라 동결건조시키기 전의 용액에서 바람직한 pH 를 유지하도록 선택하였다. 바람직하게, 완충용액은 약 pH 6.0 내지 약 pH 8.0 범위의 pH 완충능을 갖는다. 상기한 파라미터에 관련된 일련의 스크리닝 연구는 일반적으로 가장 안정한 제형화 조건을 선택하기 위해 수행하였다.

조성물은 동결건조시킨 상태로 2 ℃ 내지 8 ℃ 에서 적어도 2 년 동안 안정할 것이라고 예상된다. 장기간 안정성은 약학적 산물의 저장기간을 연장시키는데 유용하다.

본 발명은 또한 KGF 제형을 제조하는 방법에 관한 것이다. 하나의 양상에서, 동결건조시킨 KGF 제형을 제조하는 방법은 다음의 단계를 포함한다 : (a) 히스티딘을 포함하는 완충용액, 증량제, 당 및 계면활성제에서 상기 KGF 조성물을 혼합하는 단계 ; (b) 상기 KGF 를 동결건조시키는 단계.

본 발명의 방법은 하나 또는 그 이상의 다음의 단계를 추가로 포함한다 : 동결건조시키기 전에 상기 혼합물에 안정화제를 첨가하는 단계 및 동결건조시키기 전에 상기 혼합물에 증량제 및 삼투몰농도 조절제 중에서 선택한 적어도 하나의 제제 및 계면활성제를 첨가하는 단계. 증량제는 상기한 모든 증량제일 수 있다. 바람직하게, 증량제는 만니톨이다. 당은 상기한 모든 안정화 당일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 안정화제는 수크로스이다. 계면활성제는 상기한 모든 계면활성제일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20 이다.

동결건조시킨 물질에 대한 표준 재구성 방법은 비경구 투여용 약품의 생산에서 희석된 용액의 항균제를 때때로 사용하기는 하지만 일반적으로 동결건조시키는 동안 제거된 양에 상당하는 동량의 순수(pure water) 또는 멸균 주사용 증류수(water for injection : WFI)를 다시 첨가하는 방법이다[Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354(1992)].

동결건조시킨 KGF 조성물은 수용액으로서 재구성될 수 있다. 다양한 수성의 담체, 예를 들어 멸균 주사용 증류수, 다중 투여용 보존제를 갖는 물, 또는 적절한 양의 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20), 0.4 % 염, 0.3 % 글리신 또는 수성의 현탁액을 갖는 물은 수성의 현탁액을 제조하는데 적절한 부형제와 함께 혼합물에 활성 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 부형제는 현탁화제, 예를 들어 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트래거캔스 고무 및 아리비아 고무이고 ; 분산제 또는 습윤제는 천연적으로 생성되는 인지질, 예를 들어 레시틴, 또는 지방산을 갖는 산화알킬렌 축합물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 긴사슬 지방족 알콜류를 갖는 산화에틸렌 축합물, 예를 들어 헵타데카에틸-에네옥시세타놀(heptadecaethyl-eneoxycetanol), 또는 헥시톨 및 지방산으로부터 유도된 부분 에스테르를 갖는 산화에틸렌의 축합물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레이트, 또는 무수헥시톨 및 지방산으로부터 유도된 부분 에스테르를 갖는 산화에틸렌의 축합물, 예를 들어 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트일 수 있다. 수성의 현탁액은 하나 또는 그 이상의 보존제, 예를 들어 에틸, 또는 n-프로필, p-히드록시벤조에이트를 또한 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 인간 또는 실험 동물에 투여하기 위해, 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에서 조성물을 제형화시키는 것은 바람직하다. "약학적으로" 또는 "약리학적으로 허용가능한" 이란 용어는 안정되고, 응집물 및 분해 산물과 같은 단백질의 분해를 저해할 뿐만 아니라 하기한 바와 같이 본 분야에서 널리 공지된 경로를 사용하여 투여하였을 때도 알레르기 반응 또는 그밖의 유해작용을 일으키지 않는 분자물질(molecular entity) 및 조성물을 나타낸다. "약학적으로 허용가능한 담체" 는 상기한 이러한 제제를 포함하는 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산매, 코팅제, 항균제, 항진균제, 및 등장성 및 흡수 지연제(isotonic and absorption delaying agent) 등을 포함한다.

케라티노사이트 성장 인자 조성물은 경구적으로, 국소적으로, 경피적으로, 비경구적으로, 흡입 스프레이에 의해, 질내, 직장내, 또는 두개내(intracranial) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "비경구적으로" 는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 조내(intracisternal)의 주사, 또는 주입 기술을 포함한다. 정맥내, 피내, 근육내, 유방내, 복강내, 초내(intrathecal), 안구후(retrobulbar), 폐내 주사에 의한 투여 및/또는 특정 부위에서의 외과적 이식도 예상할 수 있다. 일반적으로, 조성물은 수용자에게 유해할 수 있는 발열원 뿐만 아니라 그밖의 불순물을 본질적으로 함유하지 않는다.

키트

부가적인 양상에서, 본 발명은 피실험자에게 투여하기 위해 하나 또는 그 이상의 화합물 또는 조성물을 용이하게 사용할 수 있는 정도로 포장된 하나 또는 그 이상의 화합물 또는 조성물을 포함하는 키트를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 이러한 키트는 방법을 실행하기 위한 화합물 또는 조성물의 사용을 기재한 포장지를 포함하거나 용기에 부착된 라벨을 갖는 밀봉된 병 또는 도관(vessel)과 같은 용기 내에 포장된 본원에 기재한 화합물 또는 조성물(예를 들어, 케라티노사이트 성장 인자를 포함하는 조성물)을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 키트는 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자 조성물을 가지고 있는 제 1 용기 및 동결건조시킨 조성물을 위한 생리학적으로 허용가능한 용액을 가지고 있는 제 2 용기를 포함한다. 바람직하게, 화합물 또는 조성물은 단위 약제학적 제형으로 포장되었다. 키트는 투여의 특정 경로에 따라 조성물을 투여하기 위한 적절한 장치를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 키트는 케라티노사이트 성장 인자 조성물의 사용을 기재한 라벨을 포함한다.

본 발명의 부가적인 양상 및 항목은 다음의 실시예로부터 명백할 것이다.

실시예 1

KGF 의 액제( liquid formulation )

산물의 안정성, 저장기간 및 생물학적 활성도는 모든 치료학적으로 유효한 조성물의 중요한 양상이다. 현저한 생물학적 활성도를 유지하면서 장기간 동안 권고된 저장 온도에서 저장하였을 때 안정된 조성물을 설계하는 것(desinging)과 제형화시키는 것은 약학적 조성물의 중요한 요소이다.

이전의 실험에서, KGF 의 액제는 높은 온도(37 ℃)에서 현저하게 응집되었으며 이로 인해 단백질이 손실되었다. KGF 조성물에 대하여 가장 큰 안정성을 제공하는 pH 를 측정하기 위해, 케라티노사이트 성장 인자의 액제의 pH 를 pH 3.0 내지 9.0 의 범위에서 시험하였다.

다음의 실험, 예를 들어 실시예 1-3 에서 사용된 KGF 는 △N23 KGF 분자이다. 용액의 pH 는 농축 HCl 또는 수산화나트륨 둘 중 하나를 사용하여 조절되었다. 상이한 pH 에서의 KGF 제형의 시료(0.5 mg/ml, 10 mM 완충액, 0.1 M NaCl)를 37 ℃ 에서 항온시킨 후 0 시, 6 시 및 28 시에 취하였다. 회수된 단백질의 백분율을 SE-HPLC(도 1A) 또는 CE-HPLC(도 1B)로 측정하였다. 크기-배제 HPLC(SE-HPLC)에서, 시료(40 ㎍)를 HP 1090/1050 기계에 연결된 G2000SWx1 컬럼(7.8 mm x 30 cm) 상에 로딩하였다. 단백질을 pH 7.0 에서 20 mM 인산나트륨(NaP) 및 1 M NaCl 을 사용하여 용출시켰다. 단백질을 215 nm 에서 흡광도로 모니터하였다. 단량체 피크(monomeric peak)는 KGF 제형에서 응집물이 거의 없음을 나타내었다.

양이온-교환(CE)-HPLC 를 실온에서 Mono-S 컬럼을 구비한 HP 1090/1050 기계에서 실행하였다. 40 ㎍ 의 KGF 단백질을 컬럼 상에 로딩하고 pH 8.0 의 20 mM 인산나트륨 완충액 및 염 구배(salt gradient)(1 M NaCl)를 사용하여 용출시켰다. 용출된 단백질을 215 nm 에서 흡광도로 모니터하였다.

역-상 HPLC(RP-HPLC)를 Vydac 으로부터 입수한 기공 크기 300A 의 C4 컬럼(4.6 x 250 mm)을 사용하여 HP 1090/1050 기계에서 실행하였다. 단백질(30 ㎍)을 컬럼 상에 주입하고 물에 용해시킨 0.1 % TFA, 및 0.1 % 트리플루오로아세트산(TFA)(v/v) 및 90 % ACN 으로 아세토니트릴(ACN) 구배를 사용하여 용출시켰다. 단백질 피크를 215 nm 에서 흡광도로 모니터하였다.

pH 5.0 내지 9.0 의 범위에서는 0 시에 단백질의 완전한 회복(recovery)이 관찰되었다. 그러나, pH 3.0 에서는 단백질의 완전한 손실이 관찰되었으며, pH 4.0 에서는 직접적인 침전때문에 약 80 % 의 단백질의 손실이 관찰되었다. 37 ℃ 에서 6 시간 후에, pH 4.0 의 시료로부터 가용성 단백질을 수득하지 못했다. pH 5 내지 9 에서 가용성 KGF 를 제형화시켰을 때 37 ℃ 에서 28 시간 후에 회복된 단백질의 백분율은 20 % 미만이었다. 그러나, pH 7.0 에서 총 단백질의 20 % 만이 손실되었다. 37 ℃ 에서 28 시간 후에 가용성 단백질에서의 손실은 주로 응집때문이었다.

액제에서 KGF 단백질은 중성 pH 에서 대부분 안정되었지만, 이러한 최적의 pH 범위에서조차도 액체로서 KGF 를 유지시키는 것은 응집으로 인하여 단백질의 현저한 손실을 가져올 수 있음을 이러한 결과를 통해 알 수 있다.

실시예 2

동결건조시키기 위한 KGF 조성물의 제형화

보다 안정된 KGF 조성물을 생산하기 위해, 동결건조시킨 산물로 KGF 를 제형화시키기로 결정하였다. 동결건조시킨 KGF 조성물을 제형화시 킬 때의 이전의 시도는 재구성 용액의 처리를 수반하여, 그 결과 재구성 용액의 조성에 따라 보다 적은 단백질 응집물이 생성된 조성물이 생성되었다[Zhang 등의. Pharm. Res. 12:1447-52(1995)]. 그러나, 이러한 이전의 연구에서 재구성 동안에 생성된 모든 응집물을 전환하기는 매우 어렵거나 또는 불가능하다.

본 실시예는 특정한 재구성 용액의 사용없이, 응집을 예방하는데 영향을 주지 않는 단순한 재구성 용액을 사용한 재구성시 응집을 예방할 수 있는 용액에서 단백질을 동결건조시키는 방법에 대해 기재하였다.

동결건조시킨 안정한 제형의 조성물을 측정하기 위해, pH, 증량제, 당 농도 및 계면활성제 농도와 같은 파라미터를 변경하여 KGF, 예를 들어 △N23 KGF 를 다양한 조건 하에서 동결건조시켰다. 그 다음에 KGF 의 장기간의 저장 안정성을 권고된 저장 온도에서 측정하였다.

동결건조 사이클

동결건조시키기 위해, 약 4 ℃ 의 챔버 온도로 예비-냉각시킨 VirTis Genesis 12 EL 실험용 규모의 동결건조기(미국 뉴욕 가드너에 소재하는 VirTis 에서 입수) 내에 시료를 로딩하였다. 시료를 신속하게 냉각시키고(약 1 ℃/분으로 - 50 ℃ 까지) 적어도 2 시간 동안 그 온도에 두었 다. 시료를 동결건조기에 두자마자, 선반 온도를 약 27 ℃/시의 속도로 - 50 ℃ 까지 낮추었다. 완전히 냉동시키기 위해 시료를 2 시간 동안 - 50 ℃ 에 두었다. 만니톨을 결정화하기 위한 선택적인 단계에서, 선반 온도를 10 ℃/시의 속도로 - 25 ℃ 까지 높이고 2-3 시간 동안 평형을 유지한 다음 9 ℃/시의 속도로 - 55 ℃ 까지 냉각시켰다. 적어도 2 시간 동안 추가적으로 둔 후에, 약 100 mTorr 의 진공을 적용하였다. 일차 건조 동안에 선반 온도를 - 35 ℃ 까지 높였지만 - 45 ℃ 내지 - 10 ℃ 의 범위 내 일 수 있다. 일차 건조를 40 시간 동안 지속시켰지만 24 - 48 시간의 범위 내 일 수 있다. 이차 건조를 5 ℃/시의 속도로 + 20 ℃ 내지 + 25 ℃ 까지 선반 온도를 높인 다음, 진공을 약 50 mTorr 로 낮추었다. 이차 건조를 36 시간 동안 실행하였지만 대체로 24 - 72 시간 동안 실행할 수 있다. 이차 건조의 종결시, 시료를 진공 하(≤ 25 mTorr)에서 마개를 막고 동결건조기로부터 바이알을 옮겼다. 바이알은 뚜껑이 덮인 크림프(crimp)이고 안정성 테스트를 위해 다양한 온도에 두었다.

동결건조시킨 KGF 의 안정성에서의 pH 의 효과

pH 값의 범위에서 KGF 의 안정성을 첫 번째로 평가하였다. pH 6.0, pH 6.5 또는 pH 7.0 에서 10 mM 히스티딘, 3 % 만니톨, 2 % 수크로스 및 0.01 % 폴리소르베이트 20 을 포함하는 용액에서 KGF(5 mg/ml)를 제형화시켰다. 예비-동결건조시킨 시료의 SE-HPLC 는 99 % 의 단량체 활성 성분에 해당하는 99 % 의 메인 피크 백분율(percent main peak)을 나타내었다.

단축된 안정성 연구를 수행하기 위해, 몇몇 시료를 저장용 항온기로 옮겼다. 다른 시료를 대조군으로 사용하기 위해 - 70 ℃ 의 냉동기에 옮겼다. 바이알의 벌크를 4 ℃ 에서 저장하였다. 분석하는 시간에, 시료를 1.2 mL 의 멸균 주사용 증류수(WFI)로 재구성하였다.

45 ℃ 에서 6 개월 동안 저장한 후에 동결건조시킨 KGF 시료의 SE-HPLC 는 시험된 모든 pH 에서의 시료의 메인 피크 백분율이 약 97.5 % 임을 나타내었으며, 이는 pH 6.0 내지 7.0 의 범위에서 동결건조시킨 KGF 조성물이 고온에서 6 개월 저장한 후에도 안정됨을 나타낸 것이다. 제형을 4 ℃ 에서 유지시켰을 때, pH 5.0 내지 8.0 의 범위에서 안정한 단백질을 제공함을 이러한 연구를 통해 또한 알 수 있다.

KGF 의 안정성에서의 수크로스 농도의 효과

동결건조시킨 KGF 에 가장 큰 안정성을 제공하는 수크로스의 양을 측정하기 위해, 수크로스가 결여된 용액 또는 2 % 수크로스(w/v)를 갖는 용액에 용해시킨 pH 7.0 에서 10 mM 히스티딘, 3 % 만니톨을 포함하는 조 성물에서 재조합 인간 KGF(1 mg/ml)를 제형화시켰다. 시료를 상기와 같이 동결건조시키고 45 ℃ 에서 3 개월까지 항온시켰다.

수크로스를 포함하거나 수크로스를 포함하지 않는 KGF 제형의 메인 피크 백분율의 SE-HPLC 측정은 2 % 의 수크로스의 첨가가 동결건조시킨 KGF 제형에 대해 현저한 안정성을 제공함을 나타내었다. 2 % 수크로스로 동결건조시킨 KGF 는 동결건조시킨 후에 즉시 약 99.5 % 의 메인 피크를 나타내었으며, 동결건조시킨 후에 1 개월 및 3 개월 둘 다에서 98.5 % 를 나타내었다. 수크로스가 결여된 제형은 동결건조시킨 후에 1 개월 및 3 개월에서 각각 약 96 % 및 약 93.5 % 의 메인 피크를 나타내었다.

수크로스가 결여된 제형에서 3 개월 동안 45 ℃ 에서 저장한 후 활성 단량체 피크 백분율이 7 % 로 감소된 반면에 수크로스를 갖는 제형에서의 단량체 피크 백분율은 단지 적게 감소되었음을 이러한 결과를 통해 알 수 있다. 따라서, 동결건조시킨 제형에 수크로스를 첨가하였을 때, 수크로스는 KGF 에 효능있는 안정화제로서 작용한다.

1 % 내지 3 % 의 수크로스 농도의 범위에서 pH 6.5 의 10 mM 히스티딘을 포함하는 KGF 동결건조시킨 산물을 사용하여 부가적인 분석을 실행하 였으며, 여기에서 용액은 적절한 백분율의 만니톨로 등장성이 항상 유지되었다. 1 년 동안 37 ℃ 에 저장한 1 % - 3 % 의 수크로스를 갖는 동결건조시킨 산물은 시험된 모든 제형에 대해 99 % 이상의 잔존한 메인 피크 백분율을 갖는, 2 % 수크로스를 갖는 제형에 필적하는 단백질 안정성을 나타내었다.

KGF 의 안정성에서의 폴리소르베이트 20 농도의 효과

KGF 에 대해 동결건조시킨 제형에서 폴리소르베이트 20 의 농도는 재구성시 입자의 형성을 제거하는 이의 능력을 기초로 선택되었다. pH 7.0 에서 10 mM 히스티딘, 3 % 만니톨 및 2 % 수크로스를 포함하는 조성물에서 재조합 인간 KGF 를 제형화시키고 동결건조시켰다. 그 다음에 KGF 를 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 을 함유하는 용액에서 재구성하였다. 동결건조시킨 케이크(cake)는 상기한 바와 같이 제형화시킨 5 mg/ml KGF 로 구성되었다. 표 1 은 재구성시 동결건조시킨 제형에서 기록된 관찰을 나타낸 것이다.

동결건조시키기 전에 케이크에 함유된 폴리소르베이트 20 을 갖는 제형은 재구성 용액에 폴리소르베이트 20 을 첨가한 것과 비교하였을 때 45 ℃ 에서 4 개월 후에 동등하게 안정됨을 추가적인 연구를 통해 알 수 있다. 0 개월, 1 개월 및 4 개월에서 시험된 모든 폴리소르베이트 농도(표 1 참고)에 대한 단량체 KGF 의 손실은 무시해도 좋은 정도임을 SE-HPLC 분석[Biorad Biosil SEC 125(7.8 mm x 30 cm), 20 mM NaP, pH 7.0, 1 M NaCl, 40 ㎍ 주입 로드(injection load)]을 통해 알 수 있다. 재구성시 눈에 보이는 입자를 일관되게 제거할 수 있는 이의 능력에 기초하여 제형에서 포함물(inclusion)에 대해 0.01 %(w/v)의 농도가 선택되었다.

KGF 의 안정성에서의 만니톨 농도의 효과

제형은 우수한 케이크의 외형 및 품질을 수득하기 위한 만니톨 및 다른 증량제를 함유하고 있다. 게다가, 이들은 생리적 유체(physiological fluid)와 약학적 조성물의 등장성을 유지하는데 도움을 준다. 예를 들어, 생리적 유체는 290-320 mOsm 의 등장성을 갖는다. 생리적 유체와 등장성이 되도록 최종 KGF 제형에서의 만니톨의 농도를 조절하였다.

동결건조시킨 제형에서 단백질 안정성을 제공하는 만니톨 농도의 백분율을 측정하기 위해, pH 7.0 에서 10 mM 히스티딘, 2 % 수크로스 및 0.01 % 폴리소르베이트 20, 및 3 % 만니톨 또는 4 % 만니톨을 포함하는 제형에서 3 mg/ml 로 KGF 를 동결건조시켰다. KGF 제형을 동결건조시키고 4 ℃ 에서 1 년 동안 저장하였다. Advanced Instruments(미국 매사추세츠 노우드에 소재)로부터 입수한 Osmometer Model 3D3 을 사용하여 삼투몰농도를 측정하였다. 4 % 만니톨 용액에 대해 측정된 삼투몰농도는 312 mOsm 인 반면에 3 % 만니톨 제형은 250 mOsm 의 용액을 결과로 나타내었다.

도 2 는 0 시(도 2A 참고) 또는 4 ℃ 에서 저장한 1 년 후(도 2B 참고)에 취한 약간의 저장성 3 % 만니톨/2 % 수크로스 제형과 비교한 등장성 4 % 만니톨/2 % 수크로스 제형의 역-상(RP-HPLC) 크로마토그램의 오버레이(overlay)를 나타낸 것이다. 등장성 제형은 2 ℃ 내지 8 ℃ 의 권고된 저장 온도에서 1 년 후에도 안정됨을 이러한 결과를 통해 알 수 있다. 게다가, 등장성 제형에 대한 케이크의 외형 또한 좋았으며 이의 수분 함유량은 2 % 미만이었다. 이러한 연구에 기초하여, 동결건조시킨 제형에 사용하기 위해 4 % 만니톨이 권고되었다.

rHuKGF 의 안정성에서의 단백질 농도의 효과

동결건조시킨 시료에서 단백질 농도는 재구성된 산물의 안정성 뿐만 아니라 단백질의 동결건조 품질의 안정성에서도 효과를 가질 수 있다.

안정성에서 KGF 농도의 효과는 0.5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml 및 5 mg/ml 에서 조사하였다. 시료를 pH 6.5 에서 10 mM 히스티딘, 3 % 만니톨, 2 % 수크로스 및 0.005 % 폴리소르베이트 20 에서 제형화시키고 동결건조시켰다. 동결건조시킨 시료를 재구성하기 전에 45 ℃ 에서 24 주 동안 저장하였다. SE-HPLC, RP-HPLC, CE-HPLC 및 SDS-PAGE 로 단백질 분해를 모니터하였다. 본 실험에 대해, SE-HPLC 를 HP 시스템 및 G2000SWx1 컬럼을 사용하여 상기와 같이 실행하였다.

도 3 은 45 ℃ 에서 24 주 동안 저장한 후에 KGF 의 SE-HPLC 분석으로부터 단백질 농도의 기능으로서의 메인 피크 백분율을 나타낸 것이다. 점선은 측정된 데이터에 대한 추세선(trend line)을 나타낸 것이다. SE-HPLC 데이터를 기초로 하여, 적어도 5 mg/ml 의 농도까지 KGF 의 농도가 증가함에 따라 안정성도 증가되었다. RP-HPLC 및 CE-HPLC 로 측정된 바와 같이 단백질 농도에서의 메인 피크 백분율의 의존성은 SE-HPLC 에서 보여진 바와 유사하였다. 부가적인 연구에서는 15 mg/mL 의 단백질 농도 또한 동결건조시킨 안정한 제형을 결과로써 나타내었다.

pH 6.5 에서 10 mM 히스티딘, 0.01 % 폴리소르베이트 20, 2 % 수크로스 및 3 % 만니톨을 포함하는 최적화된 KGF 동결건조시킨 제형을 2 ℃ 내지 8 ℃ 에서 4 년 동안 저장하였다. 재구성시, KGF 제형은 하기에 시험한 바와 같이 KGF 활성도를 유지하는 것으로 나타났으며, 이는 특정 조성물이 치료학적으로 유효한 약학적 조성물에 필요한 전형적인 안정성 및 활성도를 유지함을 나타낸 것이다.

실시예 3

재구성된 KGF 제형의 생물 검정

약학적으로 유효한 산물의 제형에서의 요인 중 하나는 관심있는 단백질의 높은 생물학적 활성도를 필요로 한다.

Hsu 등의, 1999 Biochemistry, 38, 2523-2534 에 기재된 바와 같이, 32D KECA 클론 16 세포를 사용하여 KGF, 예를 들어 △N23 KGF 제형의 생물학적 활성도를 시험하였으며, 여기에서 32D KECA 클론 16 세포는 32D 클론 3 세포(ATCC 기탁번호 제 #CRL-11346 호)와 유사한 KGF 의 존재 하에서 증식하는 IL-3 의존 마우스 림프아구 세포이며, 유용한 증식의 정량분석계(proliferation assay system)이다.

37 ℃ 및 5.5 % CO₂ 에서 성장 배지[RPMI, 우태아혈청(10 %)(미국 유타 로젠에 소재하는 Hyclone 에서 입수), 글루타민(1 %)(미국 캘리포니아 칼즈배드에 소재하는 Gibco/Invitrogen 에서 입수), 제네티신(2 %)(Gibco 에서 입수) 및 마우스 IL-3(12 ng/mL)(미국 캘리포니아 카마릴로에 소재하는 Biosource International 에서 입수)]에 32D 클론 16 세포를 유지시켰다. 시료 KGF 제형 또는 표준품(reference standard)(- 70 ℃ 에서 동결건조시켜 저장한 △N23 KGF)을 약 25 ng/ml 로 검정 배지[RPMI, FBS(6 %), 글루타민(1 %), 헤파린(0.6 ㎍/ml)(미국 미주리 세인트루이스에 소재하는 Sigma 에서 입수)]에서 재구성하였다. 그 다음에 약 25 ng/mL 내지 1.6 ng/mL 의 농도 범위를 수득하기 위해 계열 희석물을 제조하였다.

KGF 제형의 생물학적 활성도를 시험하기 위해, 32D 클론 16 세포를 2.0 x 10⁵ 세포/mL 로 150 μL 에 평판하였다. 바람직한 농도의 표준품, 대조군 및 KGF 테스트 시료를 50 μL 부피로 시료의 웰에 첨가하였다. 세포 및 시료의 플레이트를 37 ℃ 및 5.5 % CO₂ 에서 약 24 시간 동안 항온시켰다. 2 일에, 40 μL 의 Alomar Blue(미국 일리노이 시카고에 소재하는 AccuMed International 에서 입수)를 모든 웰에 첨가하고 혼합하였다. 플레이트를 37 ℃ 및 5.5 % CO₂ 에서 추가로 24 시간 동안 항온시켰다. 24 시간 후에, 530-560 nm 의 여기(excitation) 파장 및 590 nm 의 방출 파장을 사용하여 Fluorescence Reader(Cytofluor Ⅱ 또는 Cytofluor Series 4000, 미국 매사추세츠 프레이밍햄에 소재하는 PerSeptive Biosystems 에서 입수)에서 형광을 측정하였다.

7 일 동안 2 ℃ 내지 8 ℃ 에서 저장한 3 개의 재구성된 로트(lots)로부터의 동결건조시킨 KGF 제형은 0 일에 ≥ 100 % 및 7 일에 각각 92 %, 100 % 및 107 % 의 생물학적 활성도를 나타낸, 표준품 KGF 단백질(- 70 ℃ 에서 동결건조시켜 저장함)과 유사한 생물학적 활성도를 나타내었다. 천연 KGF 와 비교하여 25 ℃ 에서 저장된 KGF 제형은 0 시에서 ≥ 100 % 의 생물학적 활성도를 나타내었고 4 시간 후에는 각각 90 %, 95 % 및 100 % 로 생물학적 활성도가 약간 감소되었다. 이러한 수준의 활성도는 24 시간 동안 25 ℃ 에서 재구성된 KGF 제형을 저장한 후에도 유지되었으며, 이는 KGF 제형의 안정성을 나타낸 것이다.

본원에 기재된 재구성된 KGF 제형은 표준품 KGF 단백질과 같은 효력이 있으며 제형은 KGF, 예를 들어 △N23 KGF 의 안정성 또는 효능에 해로운 영향을 끼치지 않으므로, 상기 제형은 상피세포 등의 성장을 촉진시키기 위한 개별적인 치료에서 치료제로서 유용함을 이러한 결과를 통해 알 수 있다.

게다가, Balb/C-MK 세포의 성장을 촉진시키는 재구성된 제형의 능력에 의해 KGF 의 생물학적 활성도를 측정할 수 있다. Balb/MK 세포의 스톡 배양물을 성장시키고 10 % 우태아혈청, 0.25 ㎍/ml 펀지존(fungizone) 및 10 ng/ml aPGF 로 보충된 저칼슘 달베코 변형된 이글 배지(low calcium Dulbecco's modified Eagle medium)에서 유지시켰다. 세포를 99 % 습도를 갖는 10 % CO₂ 대기에서 37 ℃ 로 항온시켰다. 생물학적 활성도의 검정에서, Gospodarowicz 등의 J. Cell. Physiol. 142:325-333(1990)에 기재된 바와 같은 1 ml 의 배지에서 웰 당 5 x 10³ 세포의 밀도로 12-웰 플레이트에 세포를 접종하였다. 예비측정된 양의 KGF 제형을 세포 배양물 웰에 첨가하였다. FGF 를 양성 대조군으로서 사용하였다.

배양하여 5 일 후에, 세포를 트립신처리하고 최종 세포의 밀도를 세포 계수기를 사용하여 측정하였다. 세포 배지를 0.9 % NaCl, 0.01 M 인산나트륨(pH 7.4), 0.05 % 트립신 및 0.02 % EDTA(STV)를 함유하는 용액으로 교체하여 플레이트로부터 세포를 분리하고 37 ℃ 에서 5 - 10 분 동안 항온시킨 다음 스톡 배양 배지를 세포에 첨가하였다.

KGF 처리하지 않은 세포와 비교하여 KGF 처리된 시료에서의 Balb/C-MK 세포의 개체군의 증가는 KGF 조성물이 제형 과정 동안에 이의 생물학적 활성도가 상실되지 않음을 나타내며, 이는 KGF 제형이 증가된 KGF 활성도를 필요로 하는 피실험자를 치료하기 위해 유효한 치료학적 제제로 제공됨을 나타낸 것이다.

본 분야의 숙련자는 상기의 예증적인 실시예에서 설명한 바와 같이 본 발명에서 수많은 변형 및 변이가 생성될 수 있음을 예측할 수 있다. 따라서, 첨부된 청구의 범위에서 나타낸 바와 같은 이러한 한정만이 본 발명에 포함될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> Therapeutic Formulations of Keratinocyte Growth Factor <130> 01017/40453 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3853 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (446)..(1030) <400> 1 acgcgctcac acacagagag aaaatccttc tgcctgttga tttatggaaa caattatgat 60 tctgctggag aacttttcag ctgagaaata gtttgtagct acagtagaaa ggctcaagtt 120 gcaccaggca gacaacagac atggaattct tatatatcca gctgttagca acaaaacaaa 180 agtcaaatag caaacagcgt cacagcaact gaacttacta cgaactgttt ttatgaggat 240 ttatcaacag agttatttaa ggaggaatcc tgtgttgtta tcaggaacta aaaggataag 300 gctaacaatt tggaaagagc aactactctt tcttaaatca atctacaatt cacagatagg 360 aagaggtcaa tgacctagga gtaacaatca actcaagatt cattttcatt atgttattca 420 tgaacacccg gagcactaca ctata atg cac aaa tgg ata ctg aca tgg atc 472 Met His Lys Trp Ile Leu Thr Trp Ile 1 5 ctg cca act ttg ctc tac aga tca tgc ttt cac att atc tgt cta gtg 520 Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg Ser Cys Phe His Ile Ile Cys Leu Val 10 15 20 25 ggt act ata tct tta gct tgc aat gac atg act cca gag caa atg gct 568 Gly Thr Ile Ser Leu Ala Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala 30 35 40 aca aat gtg aac tgt tcc agc cct gag cga cac aca aga agt tat gat 616 Thr Asn Val Asn Cys Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp 45 50 55 tac atg gaa gga ggg gat ata aga gtg aga aga ctc ttc tgt cga aca 664 Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr 60 65 70 cag tgg tac ctg agg atc gat aaa aga ggc aaa gta aaa ggg acc caa 712 Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln 75 80 85 gag atg aag aat aat tac aat atc atg gaa atc agg aca gtg gca gtt 760 Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val 90 95 100 105 gga att gtg gca atc aaa ggg gtg gaa agt gaa ttc tat ctt gca atg 808 Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met 110 115 120 aac aag gaa gga aaa ctc tat gca aag aaa gaa tgc aat gaa gat tgt 856 Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys 125 130 135 aac ttc aaa gaa cta att ctg gaa aac cat tac aac aca tat gca tca 904 Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser 140 145 150 gct aaa tgg aca cac aac gga ggg gaa atg ttt gtt gcc tta aat caa 952 Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln 155 160 165 aag ggg att cct gta aga gga aaa aaa acg aag aaa gaa caa aaa aca 1000 Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr 170 175 180 185 gcc cac ttt ctt cct atg gca ata act taa ttgcatatgg tatataaaga 1050 Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 190 acccagttcc agcagggaga tttctttaag tggactgttt tctttcttct caaaattttc 1110 tttcctttta ttttttagta atcaagaaag gctggaaaaa ctactgaaaa actgatcaag 1170 ctggacttgt gcatttatgt ttgttttaag acactgcatt aaagaaagat ttgaaaagta 1230 tacacaaaaa tcagatttag taactaaagg ttgtaaaaaa ttgtaaaact ggttgtacaa 1290 tcatgatgtt agtaacagta atttttttct taaattaatt tacccttaag agtatgttag 1350 atttgattat ctgataatga ttatttaaat attcctatct gcttataaaa tggctgctat 1410 aataataata atacagatgt tgttatataa ggtatatcag acctacaggc ttctggcagg 1470 atttgtcaga taatcaagcc acactaacta tggaaaatga gcagcatttt aaatgctttc 1530 tagtgaaaaa ttataatcta cttaaactct aatcagaaaa aaaattctca aaaaaactat 1590 tatgaaagtc aataaaatag ataatttaac aaaagtacag gattagaaca tgcttatacc 1650 tataaataag aacaaaattt ctaatgctgc tcaagtggaa agggtattgc taaaaggatg 1710 tttccaaaaa tcttgtatat aagatagcaa cagtgattga tgataatact gtacttcatc 1770 ttacttgcca caaaataaca ttttataaat cctcaaagta aaattgagaa atctttaagt 1830 ttttttcaag taacataatc tatctttgta taattcatat ttgggaatat ggcttttaat 1890 aatgttcttc ccacaaataa tcatgctttt ttcctatggt tacagcatta aactctattt 1950 taagttgttt ttgaacttta ttgttttgtt atttaagttt atgttattta taaaaaaaaa 2010 accttaataa gctgtatctg tttcatatgc ttttaatttt aaaggaataa caaaactgtc 2070 tggctcaacg gcaagtttcc ctcccttttc tgactgacac taagtctagc acacagcact 2130 tgggccagca aatcctggaa gcagacaaaa ataagagcct gaagcaatgc ttacaataga 2190 tgtctcacac agaacaatac aaatatgtaa aaactctttc accacatatt cttgccaatt 2250 aattggatca tataagtaaa atcattacaa atataagtat ttacaggatt ttaaagttag 2310 aatatatttg aatgcatggg tagaaaatat catattttaa aactatgtat atttaaattt 2370 agtaattttc taatctctag aaatctctgc tgttcaaaag gtggcagcac tgaaagttgt 2430 tttcctgtta gatggcaaga gcacaatgcc caaaatagaa gatgcagtta agaataaggg 2490 gccctgaatg tcatgaaggc ttgaggtcag cctacagata acaggattat tacaaggatg 2550 aatttccact tcaaaagtct ttcattggca gatcttggta gcactttata tgttcaccaa 2610 tgggaggtca atatttatct aatttaaaag gtatgctaac cactgtggtt ttaatttcaa 2670 aatatttgtc attcaagtcc ctttacataa atagtatttg gtaatacatt tatagatgag 2730 agttatatga aaaggctagg tcaacaaaaa caatagattc atttaatttt cctgtggttg 2790 acctatacga ccaggatgta gaaaactaga aagaactgcc cttcctcaga tatactcttg 2850 ggagagagca tgaatggtat tctgaactat cacctgattc aaggactttg ctagctaggt 2910 tttgaggtca ggcttcagta actgtagtct tgtgagcata ttgagggcag aggaggactt 2970 agtttttcat atgtgtttcc ttagtgccta gcagactatc tgttcataat cagttttcag 3030 tgtgaattca ctgaatgttt atagacaaaa gaaaatacac actaaaacta atcttcattt 3090 taaaagggta aaacatgact atacagaaat ttaaatagaa atagtgtata tacatataaa 3150 atacaagcta tgttaggacc aaatgctctt tgtctatgga gttatacttc catcaaatta 3210 catagcaatg ctgaattagg caaaaccaac atttagtggt aaatccattc ctggtagtat 3270 aagtcaccta aaaaagactt ctagaaatat gtactttaat tatttgtttt tctcctattt 3330 ttaaatttat tatgcaaatt ttagaaaata aaatttgctc tagttacaca cctttagaat 3390 tctagaatat taaaactgta aggggcctcc atccctctta ctcatttgta gtctaggaaa 3450 ttgagatttt gatacaccta aggtcacgca gctgggtaga tatacagctg tcacaagagt 3510 ctagatcagt tagcacatgc tttctactct tcgattatta gtattattag ctaatggtct 3570 ttggcatgtt tttgtttttt atttctgttg agatatagcc tttacatttg tacacaaatg 3630 tgactatgtc ttggcaatgc acttcataca caatgactaa tctatactgt gatgatttga 3690 ctcaaaagga gaaaagaaat tatgtagttt tcaattctga ttcctattca ccttttgttt 3750 atgaatggaa agctttgtgc aaaatataca tataagcaga gtaagccttt taaaaatgtt 3810 ctttgaaaga taaaattaaa tacatgagtt tctaacaatt aga 3853 <210> 2 <211> 194 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met His Lys Trp Ile Leu Thr Trp Ile Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Arg 1 5 10 15 Ser Cys Phe His Ile Ile Cys Leu Val Gly Thr Ile Ser Leu Ala Cys 20 25 30 Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys Ser Ser 35 40 45 Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile 50 55 60 Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp 65 70 75 80 Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn 85 90 95 Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly 100 105 110 Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr 115 120 125 Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu 130 135 140 Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly 145 150 155 160 Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly 165 170 175 Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala 180 185 190 Ile Thr <210> 3 <211> 140 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe 1 5 10 15 Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys 20 25 30 Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr 35 40 45 Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr 50 55 60 Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn 65 70 75 80 Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr 85 90 95 Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala 100 105 110 Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu 115 120 125 Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr 130 135 140

Claims

히스티딘 완충용액, 증량제(bulking agent), 당(sugar) 및 계면활성제를 포함하는 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자(keratinocyte growth factor, KGF) 조성물.
제 1 항에 있어서, 케라티노사이트 성장 인자(KGF)는 SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 및 이의 변이체 중에서 선택함을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 케라티노사이트 성장 인자(KGF)는 SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 케라티노사이트 성장 인자(KGF)는 SEQ ID NO : 3 에 기재되어 있는 △N23 KGF 를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 증량제는 만니톨임을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 만니톨의 농도가 약 2 ％ w/v 내지 약 5 ％ w/v 임을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서, 만니톨의 농도가 4 ％ w/v 임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 당은 수크로스임을 특징으로 하는 조성물.
제 8 항에 있어서, 수크로스의 농도가 약 1 ％ w/v 내지 약 3 ％ w/v 임을 특징으로 하는 조성물.
제 9 항에 있어서, 수크로스의 농도가 2 ％ w/v 임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, pH 범위가 약 6.0 내지 약 8.0 임을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, pH 범위가 약 6.0 내지 약 7.0 임을 특징으로 하는 조성물.
제 12 항에 있어서, pH 가 6.5 임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20 임을 특징으로 하는 조성물.
제 14 항에 있어서, 폴리소르베이트 20 의 농도 범위가 약 0.1 ％ w/v 내지 약 0.004 ％ w/v 이내임을 특징으로 하는 조성물.
제 15 항에 있어서, 폴리소르베이트 20 의 농도가 0.01 ％ w/v 임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, KGF 농도가 3 mg/mL 내지 15 mg/mL 임을 특징으로 하는 조성물.
제 17 항에 있어서, KGF 농도가 5 mg/mL 임을 특징으로 하는 조성물.
10 mM 히스티딘, 4 ％ 만니톨, 2 ％ 수크로스, 및 0.01 ％ (w/v) 폴리소르베이트 20 을 포함하는, pH 가 6.5 인 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자 조성물.
다음 단계를 포함하는 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자의 제 조방법

(a) 히스티딘, 증량제, 당(sugar), 및 계면활성제로 이루어진 용액을 제조하는 단계 ; 및

(b) 상기 케라티노사이트 성장 인자(KGF) 를 동결건조시키는 단계.
제 20 항에 있어서, 동결건조시키는 단계 전에 다음의 단계들을 추가로 포함함을 특징으로 하는 제조방법

(b) 용액의 pH 를 약 6.0 내지 약 8.0 의 pH 로 조절하는 단계 ;

(c) 케라티노사이트 성장 인자를 함유하는 용액을 제조하는 단계 ;

(d) 단계 (b) 용액에서의 완충용액을 단계 (c) 용액의 완충용액으로

교체하는 단계 ;

(e) 적절한 양의 계면활성제를 첨가하는 단계 ; 및

(f) 단계 (e) 로부터 혼합물을 동결건조시키는 단계.
제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 상기 케라티노사이트 성장 인자는 SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 및 이의 변이체 중에서 선택함을 특징으로 하는 제조방법.
제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 상기 케라티노사이트 성장 인자는 SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 상기 케라티노사이트 성장 인자는 SEQ ID NO : 3 에 기재되어 있는 △N23 KGF 를 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
제 21 항에 있어서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20 임을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항의 동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자의 유효량을 피실험자에게 투여하여 상피세포 성장의 KGF-매개 자극을 증가시킴으로써 질환을 치료하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 질환은 다음과 같은 질환임을 특징으로 하는 방법

장독소 ; 점막염 ; 화상 또는 그밖의 다른 부분층 피부 손상 및 전층 피부 손상 ; 모낭, 땀샘(한선) 및 기름샘(피지선)의 재증식 ; 부속기(adnexal) 구조의 증식 ; 수포성표피박리증 ; 화학요법으로 유도된 탈모증 ; 남성형 탈모증(male-pattern baldness) ; 위궤양 ; 십이지장궤양 ; 미란성위염, 식도염 또는 식도역류 ; 염증성 장질환 ; 하이알린막증(폐초자막증) ; 담배 연 기 흡입으로 인한 손상(injuries from smoke inhalation) ; 폐기종 ; 간경변증, 간부전(liver failure), 급성 바이러스 간염, 그밖에 다른 독성으로 인한 간 손상 ; 또는 대숙주성이식편병(GVHD).
동결건조시킨 케라티노사이트 성장 인자 조성물을 가지고 있는 제 1 용기, 및 상기 동결건조시킨 조성물에 생리학적으로 수용가능한 용매를 가지고 있는 제 2 용기를 포함하는, 수성의 약학적 조성물을 제조하기 위한 키트.
제 28 항에 있어서, 케라티노사이트 성장 인자는 SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 및 이의 변이체 중에서 선택함을 특징으로 하는 키트.
제 28 항에 있어서, 케라티노사이트 성장 인자는 SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 키트.
제 28 항에 있어서, 케라티노사이트 성장 인자는 SEQ ID NO : 3 에 기재되어 있는 △N23 KGF 를 포함함을 특징으로 하는 키트.