TWI328586B - Novel 1,2,4-thiadiazole derivatives as melanocortin receptor modulators - Google Patents

Description

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1328586 A7 B7 五、發明說明（2)

Melanocortin Receptors: new opportunities in drug discovery,^ Exp. Opin. Ther. Patents，2000, 11(1), 61-76)。 此等肽結合5種黑皮質素受體(MC1-MC5)，其係與G-蛋白質偶合之受體。均可正向調節腺苷酸環化酶。MC4與 5 MC5受體廣泛分布於腦與脊柱中，其中MC3受體主要 位於下視丘[Gantz，I.，et al.，如上述文獻]〇MC4受體可被 aMSH選擇性活化，並可在神經(Neuro)2A細胞中誘發神 經突成長（Adan R.A.H，et al.,Molecular Brian Research, 1996,36, pp 37-44: Mountjoy, K.G., Mortud, M.T„Low, M.J., 10 Simerly, R.B. and Cone, R.D., Mol. Endocrinol., 1994, 8, pp 1298-1308)。ACHT為效力低於aMSH之MC4受體活化 劑（Adan, R.A.H·，Cone, R.D.，Burbach, J.P.H. and Gispen, W.H.，mol.pharmacol” 1994，46, pp 1182-1190)。可活化 MC5受體之物質依其程度依序為NDP=a-MSH> ACHT (1-15 24) >aMSH ACHT (1-39) = (PMSH > > yMSH (The

Melanocortin Receptors, Cone, R.D., Editor, Human Press Inc.’Totowa，N. J” 2000, Chen, W” pp449_472)。 在大鼠之動物試驗中，壓擊坐骨神經模式已證實，α-MSH提高神經突之成長，且其為最強效之ACTH衍生 20肽’可顯著促進神經末端分支、增加終板面積、與周長 [Bijisma, W. A., et al.，The Enhanced Recovery of Sensorimotor Function in Rats is Related to the Melantropic Moiety of ACTH/MSH Neuropeptides,Eur.J.Pharmacol, 1983, 92，23 l-236;Van der Neut. R.，et al.，Stimulation by -4- 本紙張尺度適用t國國家標準(CNS)A4規格（210x297公楚）

1328.586 A7 B7 五、發明說明（3)

Melanocortin of Neurite Outgrowth from Spinal and Sensory^ Neurons In Vitro, Peptides, 1992, 13, 1109-1115; Van Der Zee, C. E. E. M., et al., α-MSH and Org 2766 in Peripheral Nerve Regeneration: Different Route of Delivery, Eur. J. Pharmacol., 5 1988, 147, 351-357; Strand, F. L, et al., Melanocortin as

Factors in Somatic Neuromuscular Growth and Regrowth, Pharmac. Ther.，1994, 62, 1-27]。此外，神經受損後投與 ct-MSH與其他黑皮質素後，可縮短恢復運動功能之時間 [Strand, F. L” et al”如上述文獻]〇 10 小白鼠之MC4受體經專一性基因處理法失去活性後 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 變得肥胖之結果顯示，MC4受體應涉及攝食作用[Huszar， D·，et al·，Targeted Disruption of the Melanocortin-4 Receptors Results in Mice, Cell，1997，88，131-141]。此點 更由文獻中提出多種MC4肽促效劑可抑制刺鼠之攝食行 15 為之報告證實[Fan，W.，et al.，Role of Melanocortingenic Neurons in Feeding and the Agouti Obesity Syndrome, Nature, 1997, 385，165-168]。α-MSH誘發大鼠舔毛行為，但並不 顯著，而且可能不經由MC4受體媒介[Adan，R. A. H., et al., Differential Effects of Melanocortin Peptide on Neural 20 Melanocortin Receptors, Molecular Pharmacology, 1994,46,1182-1190] 〇 亦已知黑皮質素aMSH與ACTH分別有能力刺激色素 沉積及分泌腎上腺糖皮質激素。黑皮質素，特定言之 aMSH ’於調節皮脂腺（係一種腺溶分泌型外分泌腺）活性 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1328586 A7 B7 五、發明說明（4) 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 上之角色最早於大鼠中發現。更特定言之，該試驗顯示，，， 去除腦垂體中葉(係產生POMC肽)後，可降低皮脂產生， 使用aMSH進行置換療法後，則完全恢復至正常程度 (Thody，A.J. and Shuster，Nature，237, 346-347，1972)。完成 切除腦下垂體之大鼠之試驗中，以aMSH治療之結果為 提高皮脂產生，但僅經過aMSH與睪固酮之組合治療後， 即可完全恢復正常皮脂產生程度(Thody，A.J.，Shuster，S.，JT. Endocr.64, 503-510, 1975; Ebling, F.J., Ebling, E., Randall, V. and Skinner，J_，J.Endocr· 66, 407-412，1975)。經刪除 MC5 受體之擊倒處理小白鼠（knock-out mice)，因皮脂生產降 低，而在排水及調節熱度上出現嚴重缺陷（Chen，W.Kelly， M.A., Opitz-Araya, X., Thomas, R.E., Low, M.J., and Cone, R” Cell，91，788-798，1997)。 已知MC5受體表現在人類皮脂腺中，可能涉及調節 人類皮脂之合成作用。已有人選殖出人類MC5-R，並判 別其特性（Chhajlani，V.Muceniece，R·, Wikberg，JES.， Biochem. Biophys. Res. Commun· 195，866-873，1993)。此 外’人類皮脂腺中所含之MC5-R m RNA已利用RT-PCR 證實，並使用免疫組織化學及西方墨點分析法檢測蛋白質 (Thiboutot, D., Sivarajah,Gililand, K., Cong, Z. and Clawson, G·, J. Invest. Dermatol. 115(4), 614-619,2000)〇 人類皮脂之組成不同於其他哺乳動物。人類皮脂中之 主要脂肪為三酸甘油酯、蠟酯及角鯊烯（Greene，R S.， -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇χ297公釐） 裝 計 線

1328586 A7 B7 五、發明說明（6) 黑皮質素-3'黑皮質素-4與/或黑皮質素-5受體。 發明概要 本發明係有關通式II化合物 5

經濟部智慧財產局員工消費合作枉印製 10 其中 R1係選自下列各物組成之群中：雜芳基、雜芳基-烷 基、雜環烷基、雜環烷基-烷基、環烷基、環烷基-烷基、 經取代之芳基及經取代之芳烷基；（R1不為未取代之芳基 或未取代之芳烷基）； 15 其中雜芳基、雜芳基-烷基、雜環烷基、雜環烷基-烷 基、環烷基或環烷基-烷基可視需要經一個或多個分別獨 立選自下列之取代基取代：齒素、羥基、烷基、烷氧基； 齒化烷基 '自化烷氧基、胺基、烷胺基或二(烷基)胺基； 其中芳基或芳烷基經一個或多個分別獨立選自下列之取代 20 基取代：齒素、羥基、烷基、烷氧基；鹵化烷基、鹵化烷 氧基 '胺基、烷胺基或二(烷基)胺基； R2係選自下列各物組成之群中：雜芳基、雜芳基-烷 基、雜環烷基、雜環烷基-烷基、環烷基、環烷基-烷基、 經取代之芳基與經取代之芳烷基；（R2不為未取代之芳基 本纸張尺度適用申國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1328586 A7 B7 五、發明說明（7) 或未取代之芳烷基）； 其中雜芳基、雜芳基-烷基、雜環烷基、雜環烷基-烷 基、環烧基或環烧基-烧基可視需要經一個或多個分別獨 立選自下列之取代基取代：齒素、羥基、烷基、烷氧基； 5自化烷基、_化烷氧基、胺基、烷胺基或二(烷基)胺基； 其中芳基或芳烧基係經一個或多個分別獨立選自下列 之取代基取代：鹵素、經基、烧基、烧氧基；鹵化烧基、 鹵化烷氧基、胺基、烷胺基或二(烷基)胺基； 言 R4係選自下列各物組成之群中：芳基、芳烷基、雜芳 10 基、雜環烷基、及環烷基-烷基;其中芳基、芳烷基、雜芳 基、雜環烷基或環烷基-烷基可視需要經一個或多個分別 獨立選自下列之取代基取代：鹵素、羥基、烷基、烷氧 基：齒化烷基、齒化烷氧基、胺基、烷胺基或二(烷基)胺 基： 15 但其限制條件為當R1為經一個鹵素取代之芳基且R4 為經一個鹵素取代之芳基時，則R2不為嗎咁基； 及其醫藥上可接受之鹽類。 本發明進一步有關通式(II)化合物：

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 其中 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 1328586 A7 B7 五、發明說明（ο R1係選自下列各物組成之群中：雜芳基、雜芳基-烧,, 基、雜環烷基、雜環烷基-烷基、環烷基、環烷基-烷基、 經取代之芳基及經取代之芳烷基；（R1不為未取代之芳基 或未取代之芳烷基）； 5 其中雜芳基、雜芳基-烷基、雜環烷基、雜環烷基-烷 基、環烷基或環烷基-烷基可視需要經一個或多個分別獨 立選自下列之取代基取代：齒素、羥基、烷基、烷氧基； 鹵化烷基、齒化烷氧基、胺基、烷胺基或二(烷基)胺基； 其中芳基或芳烷基係經一個或多個分別獨立選自下列 ίο 之取代基取代：齒素、羥基、烷基、烷氧基；i化烷基、 鹵化烷氧基、胺基、烷胺基或二(烷基)胺基； R2係選自下列各物組成之群中：芳基、芳烷基、雜芳 基、雜芳基-烷基、雜環烷基、雜環烷基-烷基、環烷基、 環烷基-烷基、經取代之芳基及經取代之芳烷基； 15 其中芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳基-烷基、雜環烷 基、雜環烧基-烧基、環院基或環烷基-烧基可視需要經一 個或多個分別獨立選自下列之取代基取代：鹵素、羥基、 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 烷基、烷氧基；鹵化烷基、齒化烷氧基、胺基、烷胺基或 '一(烧基)胺基； 20 r4係選自下列各物組成之群中：雜芳基、雜環烷基、 環烷基-烷基、經取代之芳基及經取代之芳烷基；（R4不為 未取代之芳基或未取代之芳烷基）； 其中雜芳基、雜環烷基或環烷基_烷基可視需要經一個 或少個分別獨立選自下列之取代基取代：鹵素、羥基、烷 -10-

1328586 A7 B7 五、發明說明（10)

(H) 5 其中 R1係選自下列各物組成之群中：烷基、芳基、芳烷 基、雜芳基、雜芳基-烧基、雜環烧基、雜環炫基-烷基、 環烷基與環烷基-烷基；其中芳基、芳烷基、雜芳基、雜 10芳基-烷基、雜環烷基、雜環烷基-烷基、環烷基或環烷基_ 烷基可視需要經一個或多個分別獨立選自下列之取代基取 代：_素、羥基、烷基、烷氧基；鹵化烷基、鹵化烷氧 基、胺基、烷胺基或二(烷基)胺基； 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 R2係選自下列各物組成之群中：烷基、芳基、芳烷 15基、雜芳基、雜環烷基與環烷基-烷基；其中芳基、芳烷 基、雜芳基、雜芳基-烷基、雜環烷基、雜環烷基-烷基、 環烧基或環烷基可視需要經一個或多個分別獨立選自下列 之取代基取代：齒素、羥基、烷基、烷氧基；鹵化烷基、鹵 化烧氧基、胺基、烷胺基或二(烷基)胺基； 20 r4係選自下列各物組成之群中：氫、烷基、芳基、芳 烷基、雜芳基、雜環烷基、及環烷基_烷基;其中芳基、芳 烧基、雜芳基、雜環烷基或環烷基_烷基可視需要經一個 或多個分別獨立選自下列之取代基取代：齒素、羥基、烷 基、烧氧基；鹵化烷基、南化烷氧基、胺基、烷胺基或二 •12- 本紙張疋度適用令圉國iJJ"(CNS)A4規格（21〇χ297公爱 1328586

A7 五、發明說明（π) 群中··芳基、.芳烷基與雜芳基;其中芳基、芳烷基或雜芳 基可視需要經一個或多個分別獨立選自下列之取代基取 代：齒素、羥基、烷基'烷氧基；三鹵甲基、三鹵曱氧 基、胺基 '烷胺基或二(烷基)胺基。較佳者，Ri係選自芳 5基組成之群中；其中芳基可視需要經一個或多個分別獨立 選自下列之取代基取代：齒素、烷基與烷氧基。更佳者， R1係選自下列各物組成之群中：苯基、2_氣苯基、4_氣苯 基、2-曱苯基、4-甲苯基、2-甲氧苯基與4-甲氧苯基。最 佳者’ R1為2-曱氧苯基。 10 本發明另一項具體實施例中，R1係選自下列各物組成 之群中：經取代之芳基與經取代之芳烷基，其中芳基或芳 烧基要經-個或二個分別獨立選自下列之取代基取代：齒 素、赵基、烧基、院氧基、三齒甲基、三鹵甲氧基、胺 基、烷胺基、或二(烷基)胺基。較佳者，Rl係選自經取代 之芳基，·且成之群中，其中芳基經選自下列之取代基取代： 齒素、烷基或烷氧基。更佳者，！^為2_甲氧苯基。 本發明另-項具體實施例中，R1係選自下^各物組成 之群中：娜狀芳基與經取代之奸基;其巾芳基或芳 烧基經-個或多個分關立選自下狀取絲取代：齒 素、經基、烧基、焼氧基；函化貌基、齒化烧氧基、胺 基、烷胺基或二(烷基)胺基。 ，本發明一項具體實施例中，R2係選自下列各物組成之 群中：芳基、芳烧基與雜芳基；其中芳基、芳烧基或雜芳 基可視需要經-個❹個分卿与自下狀取代基取 •15-本紙張尺度適用争國國家標準(CNS)A4規格（2丨〇 X 297公袭；) 1328586 A7 B7 五、發明說明 代：函素、誠、燒基、燒氧基；三自甲基、三 基、胺基 '烧胺基或二(烧基)胺基。較佳者，r2 关 基組成之群；其中芳基可視需要經_個或多個分別獨立選 自下列之取代基取代：烧基與絲基。更佳者，r2係“ 下=物組成之群中：苯基、4_f笨基、2_甲氧笨基與^ 甲乳本基·》最佳者’ R2係選自下列各物城之群中 與2-甲氧苯基。 ’ +丞 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 本發明另-項具體實施例中，r2係選自下列各物組成 之群中.經取代之芳基與經取代之芳烷基，其中芳基或芳 烧基經-個或二個分別獨立選自下狀取代基取代：函 素、經基、烧基、⑥氧基、三豳甲基、三齒甲氧基、胺 基、烷胺基或二(烷基)胺基。較佳者，R2係選自經取代之 芳基組成之群巾；其巾芳基㈣自烧基姐氧基之取代基 取代β更佳者’ R2為2-甲氧苯基。 本發明另-項具體實施财’R2係選自下列各物組成 之群中彡基與务燒基，其中芳基或芳烧基可視需要經一 個或多個分別獨立選自下列之取代基取代：齒素、羥基、 烷基、烷氧基；齒化烷基、南化烷氧基、胺基、烷胺基或 二(烷基)胺基。 本發明另一項具體實施例中，R4係選自下列各物組成 之群中：芳基、芳烷基與雜芳基；其中芳基、芳烷基或雜 芳基可視需要經一個或多個分別獨立選自下列之取代基取 代：齒素、羥基、烷基、烷氧基；三鹵甲基、三齒甲氧 基、胺基、烧胺基或二(烧基)胺基。較佳者，R4選自下列 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（2丨〇 X 297公爱） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1328586 A7 B7 五、發明說明（2〇 ) 包含3至8個環碳之飽和單環結構。較佳者包含5至7 個碳。適當實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環己 基、環庚基、與環辛基。 本文所使用"芳基"一詞指芳香系碳環結構，如：苯 5 基、萘基，等等。 本文所使用"芳烷基"一詞除非另有說明，否則應指 經芳基取代之任何低碳數烷基。例如：苯曱基、苯乙 基、苯丙基、萘甲基，等等。 本文所使用"雜芳基"一詞除非另有說明，否則應指 10 包含至少1個選自0、N與S中雜原子之5或6員單環 -芳香環結構，其可視需要另包含1至3個分別獨立選自 0、N與S之雜原子；或指包含至少1個選自0、N與 S中雜原子之9或10員雙環芳香環結構，其可視需要 另包含1至4個分別獨立選自Ο、N與S之雜原子。雜 15 芳基可附接在可形成安定結構之任何環碳原子上。 適當雜芳基實例包括（但不限於）：吡咯基、呋喃 基、喧吩基、畤唾基、咪唾基、°比。坐基、異唾基、異 嗔α坐基、三唾基、喧二嗤基、吼咬基、荅π井基、嘴咬 基、吡°井基、吡喃基、吱咱基、吲哚啡基、吲哚基、異 20 吲哚咐基、丨唾基、異啐嗤基、苯並吱喃基、苯並喧吩 基、苯並咪唑基、苯並噻唑基、嘌呤基、喳畊基、喳啉 基、異基、異嗟嗤基、噌咐基、敵_基、σ奎峻咐 基、畤呤咁基、萘啶基、蝶啶基，等等。較佳雜芳基包 括°比咬基、嗟吩基與_嗤基。 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

1328586 A7 B7 五、發明說明（21) 本文所使用"雜環烷基，，一詞應指任何5至7員單 環、飽和、部份不飽和或部份芳香環結構，其包含至少 1個選自0、N與S中雜原子，可視需要另包含1至3 個分別獨立選自〇、N與s之雜原子；或指9至10員 5飽和、部份不飽和或部份芳香系雙環結構，其包含至少 1個選自〇、N與S中雜原子，可視需要另包含1至4 個分別獨立選自〇、N與s之雜原子《雜環烷基可附接 在可形成安定結構之任何環碳原子上。 適當雜環烧基實例包括（但不限於）：u比哈喷基、η比洛 10 咬基、二畤茂烧基、β米唾咐基、味唾咬基、批喷0#·基、π比 唑啶基、哌啶基、二呤烷基、嗎咁基、二噻烷基、硫嗎咁 基、哌畊基、三噻烷基、吲哚咁基、色烯基、3,4-亞曱二 氧苯基、2,3-一1L本並吱喃基，等等。 本文所使用代號應指其中含有立體性形成中心。 15 若根據本發明化合物含有至少一個對掌性中心時， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 其可出現對映異構物。若化合物含有兩個或更多個對掌 性中心時，其可再出現非對映異構物。咸了解，所有此 等異構物與其混合物均涵括在本發明範圍内。此外，化 合物之有些結晶型可呈多晶型，且均包括在本發明中。 20 此外’有些化合物可與水形成溶合物（亦即水合物）或與 一般有機溶劑形成溶合物，此等溶合物亦包括在本發明 範圍内。 當某特定基團為"經取代，，時(例如：環烷基、芳基、 芳炫基、雜芳基、雜環烷基），該基團可具有一個或多 -23- 本紙張尺度邮規施297公^ -- 1328586 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 10 15 20 發明說明 (24) DMF =二甲基甲醯胺 DMEM =杜氏最基本培養基 DMSO =二甲亞艰 DPBS =杜氏磷酸鹽缓衝食鹽水 EDTA =乙二胺四乙酸鹽 FBS =胎牛血清 GDP =鳥嘌呤核苷二磷酸 GTP =鳥嘌呤核苷三磷酸 GM =生長培養基 HBSS =漢克氏緩衝鹽溶液 HEPES =4-(2-經乙基)-1-π底B井乙續酸 HS =人類血清 IgG =免疫球蛋白G %Inh =抑制百分比 MEM =最基本培養基 NBS =N- >臭玻ίέ酿亞胺 NCS =Ν-氯玻拍驢亞胺 NDP aMSH =[Nle4，D-Phe7]aMSH，aMSH 之類似物 PBS =磷酸鹽緩衝食鹽水 PEG =聚乙二醇 PNC =青黴素 rt 或 RT =室溫 SPA =閃爍近似分析法 STM =鏈黴素 -26-

本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1328586 A7 B7 五、發明說明C25；)

TLC TM TMS =薄層層析法 ==過渡培養基 =三甲矽烷基 5 式（I)中 備0 R3為氫之化合物可依反應圖 所示方法製

經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 20 反應圖1 更特定言之

由式(ΠΙ)之適當取代之氰基化合物(係已 t 一級胺或r依已知方法製備之化合物）與式(IV)之適當取代 之級胺（係已知化合物或依已知方法製備之化合物）反 應，其係於綠+ + I μ 鹼之存在下，如：NaNH2、NaH、 回流下推"4，較佳為NaNH2,於加溫下，較佳為約 口-下進仃’產生相應之式(v)化合物。 -27-

1328586 A7 B7 五、發明說明（26) 由式(V)化合物與式(VI)之適當取代之硫氰酸酯化合物, (係已知化合物或依已知方法製備之化合物）反應，其係於 DCE之存在下’於加溫下’較佳為約45°c下進行，產生 相應之式(VII)化合物。 5 由式(VI1)化合物於Br2之存在下，及於室溫下，進行 環封合/氧化反應，產生式(la)化合物。 式(II)化合物之製法為由適當取代之式(I)化合物，其 中R3為氫，依據反應圖2所示方法製備。 10

• N

R4 •NH .N- R1 (la) ：N R4 ‘ :N S’ (ii) 5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 反應圖2 更特定言之，由適當取代之式(la)化合物經鹼處理， 如：NaHC〇3〜Na2C〇3、NaOH，等等，較佳為 NaHC03， 其係於室溫下進行，產生相應之式(II)化合物。 式(Π)化合物亦可由式(vii)適當取代之化合物依據反 應圓3所示方法製備。 r4\ NHX r2、A R4 N r2 又 Ν-

H .R1 (VII) 反應圖3

(H) -28- 紙尺.s國家標準(CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） 1328586 A7 _____ B7 27 五、發明說明 更特定言之，由式(VII)適當取代之化合物與氧化劑反, 應，如：MBS、NCS、DEAD，等等，較佳為NBS，其係 於室溫下進行，產生式(II)之相應化合物。較佳者，自鹼 性水溶液中（如：NaHC03、Na2C03、NaOH，等等）萃取式 (Π)化合物。 式⑴中R3為烷基之化合物可由式(II)適當取代之化合 物依據反應圖4所示方法製備。 Μ

尸4 R3—X -Ν R -Ν

R 1/ Ν. (VIII)

R

FT (II) X' (Ο 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 反應圖4 因此’由式(II)適當取代之化合物與式(VIII)中X-為三 氟曱磺酸根、Br-及Γ之適當取代之化合物（係已知化合物 或依已知方法製備之化合物），於室溫下反應，產生相應 之式(I)化合物。 式(1)中R3為氫之化合物可由式(II)適當取代之化合物 依據反應圖5所示方法製備。 20

;N R4)=N (II) 反應圖5

-29- 本紙張尺度適用令國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1328586 A7 B7 五、發明說明（3〇 ) 膠、溶液、懸浮液、油膏、發泡氣溶膠、硬式或軟式明膠,, 囊、面膜、拭條、滾輪棒、散劑、噴霧泡沫，等等。局部 用調配物中，除了活性成份外，尚可包含一種或多種非活 性成份，包括（但不限於）：螯合劑、緩衝劑、著色劑、防 5 腐劑、香料、乳化劑、界面活性劑、不透明劑、軟化劑、 溶劑、防晒劑、黏度改良劑、抗氧化劑、濕化劑、滲透加 強劑、膜形成劑，等等。 包括在本發明範圍内治療痤瘡用之局部用調配物亦可 包含一種或多種下列成分，包括：去粉刺劑與/或去角質 10 劑、抗微生物劑與類固醇性或非類固醇性消炎劑。（去粉 刺劑指可瓦解黑頭粉刺之任何化合物。去角質劑指可打破 角質細胞，以致表皮剝落之任何化合物）。合適之去粉刺 劑與/或去角質劑包括（但不限於）：類視黃素、水楊酸、乙 醇酸、鯨蠟基甜菜鹼，等等。合適之抗氧化劑包括（但不 15 限於）：苯甲醯基過氧化物、紅黴素、四環黴素、克林達 黴素、壬二酸等等。局部用調配物典型地包含0.01-1%活 性成份。 本文之醫藥組合物中，每劑量單位（例如：錠劑、膠 囊、散劑、注射液、茶匙量，等等）將包含為了傳送上述 20 有效劑量所必要之活性成份用量。本文之非局部用醫藥組 合物中，每劑量單位（例如：錠劑、踢囊、散劑、注射 液、栓劑、茶匙量，等等）將包含約0.03mg至 100mg/kg(較佳為 0.1-30mg/kg)，且可依約 0.1-300mg/kg/ 天之劑量投藥（較佳為1-50 mg/kg/天）。然而，該劑量可依 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）

1328586 A7 B7 五、發明說明（3〇 患者之需求、所治療之病症嚴重性及所使用之化合物而 定。可採用每天投藥或周期後之投藥法。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 此等組合物最好呈單位劑型如，例如：旋劑、丸劑、 膠囊、散劑、粒劑、無菌非經腸式溶液或懸浮液、定量氣 5溶膠或液體喷液、滴劑、安瓶、自動注射裝置或栓劑；經 口、非經腸式、經鼻内、舌下、或直腸内投藥，或經吸入 或吹入投藥。或者，組合物可呈適合一週投藥一次或一個 月才又藥久之型式，可採用例如：活性化合物之不可溶性 鹽類，如：癸酸鹽，製成儲積式製劑，供經肌内注射。製 10備固體組合物如：錠劑時，由主要活性成份與醫藥載劑混 合，例如：常用之製錠成分如：玉米澱粉、乳糖、蔗糖、 山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠質， 及其他醫藥用稀釋劑，例如：水，以形成含有本發明化合 物或其醫藥上可接受之鹽類之均勻混合物之固體預調配組 15合物。當提及此等預調配組合物為均勻混合物時，表示活 性成份均勻分散在組合物中，因此很容易細分成同等有效 劑型，如.錠劑、丸劑與膠囊。此固體預調配組合物則再 分成含有0.1至約500毫克本發明活性成份之上述單位劑 型。新穎組合物之錠劑或丸劑可包覆包衣或經過化合，形 20 f可提供長效優點之劑型。例如：錠劑或丸劑可包含内劑 量與外劑量組成分’後者可為前者之封套型式。這兩種組 成分可利用腸溶性詹分隔，以抗拒胃中崩解，並使内成分 得以完整進人十二㈣或延_出。衫㈣料可用於此 等勝溶性層或包衣，此等材料包括使用如：蟲勝 、鯨蠟醇 -33- 本紙張尺度適財S g家標準(CNS)A4規格（210x29^53------· 1328586 Α7 Β7 五、發明說明（33 ：) 系統投藥時，投藥療程中之投藥劑量當然為連續性而非間 斷性。 例如：呈藥錠或膠囊形式經口投藥時，活性藥物成分 可與口服用無毒性醫藥上可接受之惰性載劑組合，如：乙 5醇、甘油、水’等等。此外，當需要或必要時，亦可在混 合物中加入合適結合劑、潤滑劑 '崩解劑與著色劑。合適 結合劑包括（但不限於）：澱粉、明膠、天然糖如：葡萄糖 或β-乳糖、玉米甜味劑 '天然膠與合成膠如：金合歡膠、 黃耆膠或油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯曱酸鈉、乙酸 10鈉、氣化鈉，等等。崩解劑包括（但不限於）：澱粉、曱基 纖維素、洋菜、皂土、黃原膠，等等。 液體形式可包括適當調味之懸浮劑或勻散劑，如：合成 膠與天然膠，例如：黃耆膠、金合歡膠、甲基纖維素，等 等。供非經腸式投藥用時，需要無菌之懸浮液與溶液。當經 15靜脈内投藥時’需要通常包含合適防腐劑之等張性製劑。 本發明化合物亦可呈微脂粒傳送系統投藥，如：單層 小囊胞、單層大囊胞、與多層囊胞。微脂粒可由多種磷脂 形成，如：膽固醇、硬脂基胺或磷醯基膽鹼。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明化合物亦可利用單株抗體作為與化合物分子偶 20合之個別載劑傳送。本發明化合物亦可與作為目標藥物載 劑之合適聚合物偶合。此等聚合物可包括聚乙烯吡咯烷 酮、吡喃共聚物'聚羥丙基甲基丙烯基醯胺笨酚、聚羥乙 基天冬醯胺苯酚、或經棕櫚醯基取代之聚環氧乙烷聚離胺 酸。此外，本發明化合物可與一類適用於控制藥物釋出之 -35- 本紙银尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 χ 297公釐） ' — 1328586 A7 B7 五、發明說明（35)

ch3 CH3 步驟A : 取含鄰甲氧基苯胺（15.0g，121.8mmol)與胺化納（50重 10量％甲苯懸浮液之無水甲苯(2〇〇mi)混 合物於室溫下攪拌1小時。在混合物中添加苯基氰(9.86 ml, 96.6 mmol)，回流加熱16小時。反應混合物冷卻，添 加l.ON HC1(150 ml)中止反應。添加活性碳，反應混合物 經寅式鹽墊過濾。添加l.ON NaOH(200ml)調整混合物pH 15至約14。水層經氣仿(3xl50 ml)萃取。合併之有機層經無 水MgSCU脫水，蒸發。所得固體經己貌洗條，真空乾 燥，產生淺白色固體產物。 lR NMR (300MHz,CDC13)™ 3-83(s, 3H),4.79(S} 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2H),6.96(m, 3H),7.04 (m, lH),7.43(m, 3H),7.93(d, 2H) 2〇 MS (APCI, MH+) 227 步驟B : 取含N-芳基苯曱脎(3.0 g，i3.27mmol)(步驟a製備）與 4-甲苯基異硫氰酸酯（2.18 g，I4.60mmol)之無水氣仿(3〇 ml) -37- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1328586 A7 B7 五、發明說明（36) 混合物回流加熱16小時。反應混合物冷卻，蒸發溶劑。， 所得殘質經急驟管柱層析法，使用25%己烷之二氯甲烷溶 液為移動相純化。合併之溶離份蒸發；所得固體真空乾 燥，產生黃色固體產物。 5 ·Η NMR (300MHz, CDC13)™ 2.36(5，3H)，3.66(s， 3H),6.76(m, 1H),6.97 (t, 1H), 7.17-7.39 (m, 7H), 7.47 (d, 2H), 7.60 (d, 2H), 8.20 (s, 1H), 14.18 (s, 1H) MS (ES,MH+) 376.29 10 步驟C : 緩緩添加溴（438 μ1，8.51ππηο1)至含硫脲（2.90 g，7.73 mmol)(依步驟B製備)之無水氣仿（15 ml)溶液中。授拌16 小時後，蒸發溶劑。所得固體經無水乙醚洗滌。粗產物自 15 20%乙醇水溶液中再結晶，產生黃色固體產物。 NMR (300MHz,CDC13)™ 2.39(s, 3H)，3.66 (s, 3H),6.96 (d, 1H),7.06 (t, 1H), 7.20 - 8.07 (m, 7H), 7.61 (d, 2H), 7.80 (d, 2H), 12.40 (s, 1H) MS (ES,MH+) 374.25 20 實例2 2-(2-甲氣笨基V3-(2-甲氣苯基V5-苯胺某-「1,2,41噻二唑-2- 遂' 化合物#74 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

1328586 A7 B7 五、發明說明（37

步驟A : 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 取含鄰甲氧基苯胺（13.5g，110_0mniol)與胺化鈉(50重量 %甲笨懸浮液)(9.4〇g，i2〇.〇mm〇l)之無水甲苯(2〇〇mi)混合物 於室溫下攪拌1小時。在混合物中添加2-曱氧基苯基氰 (16ml’131_〇mmol)，反應混合物回流加熱16小時。反應混 合物冷卻’添加l.ON HC1(150 ml)中止反應。添加活性 碳’反應混合物經寅式鹽墊過濾。添加i 0NNa〇H(200ml) 調整混合物pH至約14 〇水層經氣仿(3x150 ml)萃取。合 併之有機層經無水MgS04脫水，蒸發。所得固體經己烷 洗滌’真空乾燥，產生淺白色固體產物。 MS (APCI, MH+) 257

20 步驟B 取含N-芳基苯曱月米（15.5g，60.6mmol)(依步驟A製備） 與苯基異硫氰酸酯（8.70ml，72.7mmol)之無水氯仿(30 mi)混 合物於45°C下加熱16小時。反應混合物冷卻，蒸發溶 劑。所得殘質經急驟管柱層析法，使用25%己烷之二氣甲 -39-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1328586 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（3〇 烷溶液為移動相純化。合併之溶離份蒸發；所得固體真空 乾燥，產生黃色固體產物。 MS(ES，MH+)391.50 5 步驟C : 緩緩添加溴（1.78ml, 34.75mmol)至含硫脲（12.95g， 33.lmmol)(依步驟B製備）之無水氣仿（15 ml)溶液中。攪拌 16小時後，蒸發溶劑。所得固體經無水乙醚洗滌。粗產物 自20%乙醇水溶液中再結晶，產生黃色固體產物。 10 MS (ES,MH+) 390.1 依本文說明之製法製備本發明之代表性式（I)化合物， 如表1所示。 表1 RVy/ R1々S V Br- ID No. R1 R2 R3 R4 1 4-曱苯基 苯基 Η 4-曱氧苯基 2 4-曱苯基 苯基 Η 苯基 3 4-甲苯基 苯基 Η 2-甲氧苯基 4 4-甲苯基 苯基 Η 4-甲苯基 5 4-曱苯基 苯基 Η 2-曱苯基 6 4-甲苯基 苯基 Η 4-氣苯基 7 4-曱苯基 苯基 Η 2-氣苯基 8 2-甲苯基 苯基 Η 苯基 9 2-曱苯基 苯基 Η 4-曱氧苯基 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1328586 A7 B7 五、發明說明（39 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 10 2-曱苯基 苯基 Η 2-曱氧苯基 11 2-甲苯基 苯基 Η 4-曱苯基 ” 12 2-曱苯基 苯基 Η 2-甲苯基 13 2-甲苯基 苯基 Η 4-氣苯基 14 2-甲苯基 苯基 Η 2-氯苯基 15 4-氣苯基 苯基 Η 苯基 16 4-氯苯基 苯基 Η 4-曱氧苯基 17 4-氣苯基 苯基 Η 2-甲氧苯基 18 4-氣苯基 · 苯基 Η 4-曱苯基 19 4-氣苯基 苯基 Η 2-曱苯基 20 4-氯苯基 苯基 Η 4-氯苯基 21 4-氣苯基 苯基 Η 2-氯苯基 22 苯基 苯基 Η 苯基 23 苯基 苯基 Η 4-甲氧苯基 24 苯基 苯基 Η 2-曱氧苯基^ 25 苯基 苯基 Η 4-曱苯基 26 苯基 苯基 Η 2-甲苯基 27 苯基 苯基 Η 4-氣苯基 28 2-甲氧苯基 苯基 Η 苯基 29 2-甲氧苯基 苯基 Η 4-甲氧苯基 30 2-曱氧苯基 苯基 Η 2-甲氧苯基 31 2-甲氧苯基 苯基 Η 4-曱苯基 32 2-曱氧苯基 苯基 Η 2-甲苯基 33 2-甲氧苯基 苯基 Η 4-氣苯基 34 2-甲氧苯基 苯基 Η 2-氣苯基 35 4-曱氧苯基 苯基 Η 苯基 36 4-曱氧苯基 苯基 Η 4-甲氧苯基 37 4-甲氧苯基 苯基 Η 2-甲氧苯基 38 4-曱氧苯基 苯基 Η 4-曱苯基 39 4-甲氧苯基 苯基 Η 2-曱苯基 40 4-曱氧苯基 苯基 Η 4-氣苯基 41 4-曱氧笨基 苯基 Η 2-氣苯基 42 4-氣苯基 苯基 Η 笨基 -41- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1328586 A7 五、發明說明（40 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 43 4-鼠苯基 苯基 Η 4-甲氧苯基 44 4-氣苯基 苯基 Η 2-甲氧苯基 ’’ 45 4-氣苯基 苯基 Η 4-曱苯基 46 4-氣苯基 苯基 Η 2-甲苯基 47 4-氣苯基 苯基 Η 4-氯苯基 48 4-氣苯基 苯基 Η 2-氯苯基 49 苯基 苯基 Η 2-氣苯基 50 4-曱苯基 苯基 ch3 4-甲氧苯基 51 苯基 苯基 Η 4-曱氧苯曱基 52 苯基 苯基 Η 2-甲氧苯曱基 53 苯基 苯基 Η 4-甲基苯甲基 54 苯基 苯基 Η 2-甲基苯曱基 55 苯基 苯基 Η 4-氣苯曱基 56 苯基 苯基 Η 2-氯苯甲基 57 4-曱氧苯基 4-甲氧苯基 Η 苯基 58 4-甲氧苯基 4-曱氧苯基 Η 4-曱氧苯基 59 4-甲氧苯基 4-曱氧苯基 Η 2-甲氧苯基 60 4-甲氧苯基 4-甲氧苯基 Η 4-曱苯基 61 4-曱氧苯基 4-甲氧苯基 Η 2-甲苯基 62 4-曱氧苯基 4-甲氧苯基 Η 4-氣苯基 63 4-甲氧苯基 4-甲氧苯基 Η 2-氯苯基 64 4-曱氧苯基 4-曱氧苯基 Η 3-吡啶基 65 2-甲氧苯基 4-曱氧苯基 Η 苯基 66 2-甲氧苯基 4-甲氧苯基 Η 4-甲氧苯基 67 2-甲氧苯基 4-甲氧苯基 Η 2-甲氧苯基 68 2-曱氧苯基 4-甲氧苯基 Η 4-曱苯基 69 2-甲氧苯基 4-甲氧苯基 Η 2-甲苯基 70 2-甲氧苯基 4-甲氧苯基 Η 4-氯苯基 71 2-甲氧苯基 4-曱氧苯基 Η 2-氣苯基 72 2-甲氧苯基 4-甲氧苯基 Η 3-吡啶基 73 2-曱氧苯基 苯基 Η 3-吡啶基 74 2-曱氧苯基 2-甲氧苯基 Η 苯基 75 2-甲氧苯基 2-甲氧苯基 Η 4-曱氧苯基 -42- 計_ .線_

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1328586 A7 B7 五、發明說明（41) .裝， 計·

-線丨

76 2·甲氧苯基 2-甲氧苯基 Η 2·甲氧踩 77 2-甲氧苯基 2-甲氧苯基 Η 4-甲苯;g - 78 2-曱氧苯基 2-甲氧苯基 Η 2-曱苯基 79 2-曱氧笨基 2-甲氧苯基 Η 4-氣苯~~ ~ 80 2-甲氧苯基 2-甲氧苯基 Η 2-氣苯基~~ 81 84、 85〜 2-甲氧苯基 2-曱氧苯基 Η 3-吡咬基 笨基 苯基 Η 苯曱基 -- 2·甲氧苯基 2-甲氧苯基 Η 4-溴笨墓 86 2·甲氧苯基 2-甲氧苯基 Η 2,6-二氟苯基 87 2-甲氧苯基 2-曱氧苯基 Η 2-氣 88 2-甲氧苯基 2-甲氧苯基 Η 3,5-二 CS ~ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 添加N-氣破珀酿亞胺(326 mg, 2.71 mmol)至含實例2 步驟B所製備化合物(0.921 g，2.36 mmol)之無水氣仿（1〇 mL)溶液中。反應混合物攪拌16小時後，中止反應，以 NaHC03水溶液洗滌2次。有機層經疏酸鎂脫水，真空排 15 除殘留溶劑，產生標題化合物之固體。 MS (ES,MH+) 390.1 -43- 本紙張尺度適用宁國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1328586 A7 B7 五、發明說明（42) 依本文說明之製法製備本發明之代表性式（II)化合 物，如表2所示。 表2 R2、 R1 vv/R4 1 )=N /N、s’ ID No. R1 R2 R4 82 4-甲苯基 苯基 苯基 83 2-甲苯基 苯基 4-曱氧苯基 89 2-甲氧苯基 2-曱氧苯基 苯基 90 2-甲氧苯基 2-甲氧苯基 2,6-二氟苯基 91 2-曱氧苯基 2-甲氧苯基 2-裁r6-甲苯基 92 2-甲氧苯基 2-甲氧苯基 3,5-二氟苯基 5 除非另有說明，否則NMR光譜係於Bruker Avance 300 MHz NMR分光計上測定。除非另有說明，否則分子 量係採用Micromass LC平台式電喷灑質譜儀測定，如表3 所示。 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

1328586 A7 B7 五、發明說明（43 ) 表3 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ID No MW 1 (as + 離子 > MW 2 (w/Br-) 乎·均.MW 1 374.49 454.39 374.0 2 344.46 424.36 344.0 3 374.49 454.39 . 374.3 4 358.49 438.39 358.3 5 358.49 438.39 358.4 6 378.91 458.81 378.1,380.3 7 378.91 458.81 378.2, 380.2 8 344.46 424.36 344.3 9 374.49 454.39 374.2 10 374.49 454.39 374.2 11 358.49 438.39 358.3 12 358.49 438.39 358.3 13 378.91 458.81 378.2, 380.2 14 378.91 458.81 378.2, 380.2 15 364.88 444.78 346.2, 366.2 16 394.90 474.81 394.1, 396.1 17 394.90 474.81 394.1, 396.1 18 378.91 458.81 378.2, 380.2 19 378.91 458.81 378.2, 380.2 20 399.32 479.23 398.1,400.1 21 399.32 479.23 398.1,400.0 22 330.43 410.34 330.3 23 360.46 440.37 360.3 24 360.46 440.37 360.3 25 344.46 424.37 344.4 26 344.46 424.37 344.3 27 364.88 444.78 364.2, 366.2 28 360.46 440.37 360.3 -45-

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1328586 A7 五、發明說明（44 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 29 390.49 470.39 390.2 30 390.49 470.39 390.2 31 374.49 454.39 374.3 32 374.49 454.39 374.3 33 394.90 474.81 394.1,396.1 34 394.90 474.81 394.1,396.1 35 360.46 440.37 360.3 36 390.49 470.39 390.3 37 390.49 470.39 390.3 38 374.49 454.39 374.3 39 374.49 454.39 374.3 40 394.90 474.81 394.2, 396.2 41 394.90 474.81 394.2, 396.2 42 364.88 444.78 364.3, 366.3 43 394.90 474.81 394.2, 396.2 44 394.90 474.81 394.2, 396.2 45 378.91 458.81 378.2, 380.2 46 378.91 458.81 378.2, 380.2 47 399.32 479.23 398.1,400.1 48 399.32 479.23 398.1,400.1 49 364.88 444.78 364.2, 366.2 50 388.51 537.58 388.3 51 374.49 454.39 374.3 52 374.49 454.39 374.3 53 358.49 438.39 358.4 54 358.49 438.39 358.4 55 378.91 458.81 378.3, 380.3 56 378.91 458.81 378.3, 380.3 57 390.49 470.39 390.1 58 420.51 500.42 420.1 59 420.51 500.42 420.1 60 404.51 484.42 404.1 -46- .裝丨 .計· 4

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1328586 五、發明說明（45 ) A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 61 404.51 484.42 404.0 62 424.93 504.83 424.0, 426.0 63 424.93 504.83 424.0, 426.0 64 391.47 471.38 391.0 65 374.49 454.39 374.2 66 404.51 484.42 404.2 67 404.51 484.42 404.1 68 388.51 468.42 388.3 69 388.51 468.42 388.2 70 408.93 488.84 408.6, 410.0 71 408.93 488.84 408.1,410.0 72 375.47 455.38 375.2 73 361.45 441.35 361. 74 390.49 470.39 390.2 75 420.51 500.42 420.2 76 420.51 500.42 420.2 77 404.51 484.42 404.1 78 404.51 484.42 404.1 79 424.93 504.84 424.1,426.1 80 424.93 504.84 424.1,426.1 81 391.47 471.38 391.1 82 343.45 344.3 83 373.48 374.3 84 344.46 424.36 344.3 85 469.38 549.29 86 426.5 506.4 426.3 87 439.0 518.9 438.3, 440.3 88 426.5 506.4 426.2 89 389.5 390.1 90 425.5 426.2 91 437.9 438.3, 440.3 92 425.5 426.2 -47- .計· 4

本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1328586 A7 B7 ———' 五、發明說明（46 ) 實例4 受體結合性分妍法 取購自Receptor Biology公司之黑皮質素[MC-4]-膜與 塗覆小麥胚芽凝集素之聚乙烯基曱苯之閃爍近似分析法用 5之小珠[購自Amersham Pharmacia公司]，於25 C下偶合 30分鐘。在96孔Opti板[購自加州packard公司]之各孔 中添加2.5 pg膜與〇.25mg小珠，於lOOpL體積之培養基 中混合。培養基為50mM HEPES，pH 7.4，其中包含0.1 % 牛血清白蛋白、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、與蛋白酶抑制 10 劑。添加含試驗化合物之ImM 30% DMSO-50mM HEPES， pH 7.4緩衝液(ΐ.5μ1)至板上各孔中。在各孔中添加放射活 性配位體125I_NDP-黑細胞刺激性激素[ΝΕΝ, 2000Ci/mmol](每孔48.5 μΐ，終濃度40 pM)。培養板密封 後，於25°C下靜置16小時。使用NDP-黑細胞刺激性激素 15狀與α-黑細胞刺激性激素狀[購自pai〇mar Research公 司，ΙμΜ]作為參考抑制劑化合物，以定義非專一性結合性 (Ν)。使用 30% DMSO-50 mM HEPES，pH 7.4 緩衝液定義 總結合性(T)。以TopCount [加州Packard公司]測定各孔中 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 結合之放射活性(Y)，以每分鐘計數(Cpm)表示。抑制百分 20 比之計算法為： [(Τ-Υ)/(Τ-Ν)]*1〇〇% 實例5 環狀腺苷箪磷酸kAMPl刺激作用分妍法 -48- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1328586 Α7 B7 五、發明說明（47 ) 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 使表現人類黑皮質素MC-4受體之人類包威氏黑色素 瘤細胞(Human Bowes melanoma cells)於24-孔培養板中生 長至融合止。生長培養基棄置不要，在各孔中添加〇.5mL 漢克氏溶液(Hank's solution)。添加試驗化合物至96孔板 之各孔中。添加NDP-黑細胞刺激性激素肽（ΐμΜ)至陽性對 照組孔中，而陰性對照組孔則添加含30%DMSO-50mM HEPES，pH7緩衝液之媒劑。培養板於37°C與5%C02中 培養30分鐘《棄置上澄液，以漢克氏溶液洗滌細胞2 次。在各孔中添加乙醇(80%，〇.5ml)，培養板於4。(：下培 養30分鐘。使用NEN Flashplate套組[NEN]測定環狀 AMP含量。黑皮質素受體促效劑之定義為在本分析法中 使cAMP產量提高之試驗化合物。 實例6 G-蛋白質活化作用分析法 每次分析法中，使表現黑皮質素MC-4受體之膜 (5pg)，於 25°C 下與 0.5nM 35S-GTP yS，於 ΙΟΟμΙ 之含 100mM NaC卜蛋白酶抑制劑、〇.5μΜ GDP、5 mM 2-氫硫 基乙醇、1 mM MgCl2 之 25mM HEPES 缓衝液，pH7.5 中’與試驗化合物、ΙμΜ NDP-黑細胞刺激性激素或NDP-黑細胞刺激性激素與試驗化合物之組合共同培養。基礎 35S-GTP 結合性係由含 3〇〇/〇DMSO 之 10mM HEPES 緩 衝液’ pH7.4測定。添加5〇μ1含25mM HEPES緩衝液， pH7.5、20mM MgCl2、蛋白酶抑制劑、1〇〇μΜ GDP、 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公复） 1328586 A7 B7 五、發明說明（48) ΙΟΟμΜ GTP、5 mM 2-氫硫基乙醇之中止反應緩衝液及清, 潔劑(0_5%毛地黃皂苷、0.2%去氧膽酸鈉、與〇 5%Np_4〇) 中止反應β膜於25t下溶解30分鐘。結合35S_GTP _^之 GaS蛋白質係使用聯結抗兔子IgG蛋白質A共軛SpA之 5抗GaS(0·5㈣進行免疫沉澱法。於Topcount[Packard公司] 上測定結合之放射活性。非專一性35S_GTP yS結合性係 由與正常兔子Ig〇(〇.5pg)免疫沉澱之35s-GTPyS決定。 基礎結合性(B) 非專一性結合性(NSB) 專一性基礎結合性(SB) 各孔中cpm 各孔中淨cpm(N) 刺激％ 10

=經抗GctS免疫沉澱之平均計數/分鐘(cpm) =經正常兔子IgG免疫沉澱之平均cpm =B-NSB =C

=C-NSB =[(N-SB)/SB]xl00% 15 使用黑皮質素MC-3受體重覆上述黑皮質素MC_4受 體之方法。依所說明之方法測試本發明代表性化合物於 MC-4與/或MC-3分析法中之結合性，如表4所示。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ID No. IC5〇 MC-4 (μΜ) (過濾） 1C50 MC-4 (nM) (SPA、 1 1.1 ------V 174 2 1.5 234 3 0.7 159 4 無活性 297 5 1.3 207 6 2.5 293 -50- 本紙張尺度適用_國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1328586 A7 B7 五、發明說明（49 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 7 2.2 218 8 1.4 201 9 1.1 217 10 2.3 130(90) 11 2.4 243 12 不可溶 不可溶 13 3.4 347 14 5.6 234 15 4.5 482 16 4.3 424 17 7.7 351 18 6.0 463 19 3.9 460 20 3.5 636 21 7.8 392 22 124 23 124 24 76 25 57 26 63 27 89 28 68 29 48 30 103 31 22 32 48 33 91 34 46 35 100 36 79 37 72 38 159 39 146 40 133 41 483 -51- 本紙張尺度適用+國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1328586 五、發明說明（50 ) A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 42 482 43 • 237 44 89 45 246 46 368 47 874 48 444 49 96 50 30,000 51 1,000 52 1,000 53 1,000 54 800 55 800 56 3,000 57 無活性 58 無活性 59 無活性 60 無活性 61 無活性 62 無活性 63 1,000 64 1,200 65 114 66 120 67 130 68 110 69 139 70 566 71 234 72 155 73 725 74 194 75 103 76 332 -52- .裝— -計· .線·

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1328586 A7 ____ B7五、發明說明Οι) 77 4.4 ^ ~~ 78 ~99 ~~~'~~ 79 216 " — 80 378 ~~~ 81 672 82 1.5 826 ~ 83 1.9 833 " 84 82nm ------ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 15 實例7 嚅齒類動物攝食試驗：禁食大鼠之食物摄取晉 取雄性Long-Evans大鼠（體重180-200克）分別關在^ 5 内隔離後，保持一天餵食一次之計畫（亦即早上1〇點至下 午4點）’共5天，使動物適應攝取粉末狀飼料(#5〇〇2 pMi 合格智齒類動物飼料(Certified Rodent Meal))。飼料置於以 鐵線固定在籠上之開口瓶中，飼料上覆蓋一個從動輪，以 防止飼料溢出。可以自由飲水。 10 試驗前，動物禁食a小時。禁食期結束時，對動物 投與試驗化合物或媒劑。媒劑或試驗化合物係於實驗前的 分鐘經口投藥（5 mL/kg)，實驗前3〇分鐘經皮下投藥 m道g)，執貫職30分鐘經腹膜内投藥（1心㈣。經口 投藥之試驗化合物係呈〇.5%甲基纖維素顿⑽ 之水性㈣液’或經腹助投藥之試驗化合物係呈含於 PEG 200中之溶液或懸浮液;化合物漠度之典型範圍為: =g ^o〇mg/kg’較佳為 10_3〇mg/kg，稱取實 料瓶中飼料量與指定時間點之_量，決定㈣後2 4 與6小時之飼料攝取量4驗結束時，所有動物均接受- •53- 本紙張尺錢用帽國家標準(CNS)A4規格（210 x 297^7

A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1328586 五、發明說明（52) 週之清洗期，以便進一步下一次試驗。 依上述方法，試驗所選定之本發明化合物，測定禁食 老鼠之食物攝取量，如表5與6所示。 5 表5 ID No. [mg/kg]，途徑 飼料攝取量 0-2小時 飼料攝取量 2-6小時 PEG-200 ip 8.25g 13.38g 1 10μ, ip 7.29g 8.43g 表6 ID No. [mg/kg]，途徑 飼料攝取量之變化 0-2小時(％) 飼料攝取量之變化 2-6小時(％) 對照組 po 0 0 PEG-200 ip 0 0 1 10, ip -11.60% -37.00% 1 30, po -21.2 -6.7 84 10, ip -7 -24.5 84 10, ip 3.9 -17.8 84 30, po -7 32 26 10, ip -12.7 -32.3 27 3〇, ip -27.4 -29.1 29 30, po -26.3 -3.7 29 10, ip -62.3 -70.7 31 3, ip -37.8 -50 31 1，ip -20.6 -71.2 31 30, po -23.6 31.5 31 10, po -10.1 39.7 31 3, po -9 52.1 31 1，po 1.2 19.5 32 10, ip -29.6 -60.2 32 30, po -12.5 -15 32 10, po -20 -1 32 3, P〇 -11.5 31.17 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）

1328586 A7 B7 五、發明說明（53 32 1，po -13.8 26 34 10, ip •38 ' — -72 - 34 30, po -7.5 — 2 34 10, po -1.3 -6 49 30, ip -20.6 -21.2 實例8 神經突細胞成長分析法 細胞培養物： 5 依 Mattson，M.P” Barger，S.W·，Begley, J 與 Mark, R j 述 於"Methods CellBiol.，1994, 46:087-216"中之方法，自 18 天大胚胎切下海馬回與皮質細胞培養物。簡言之，依據 AVMA安樂死小組(Panel on Euthanasia)之方法，以氣烧麻 醉懷孕母鼠（Sprague-Dawley品種），剖腹取出胚胎。切下 10 小鼠頭，取出腦部，置入HEPES-緩衝之漢克氏平衡鹽溶 液(Hank's Balanced Salt solution (HBSS; Gibco))中。切下海 馬回與皮質’依據組織型態分開收集。組織經膜蛋白酶處 理15分鐘(lmg/ml胰蛋白酶-HBSS;Worthington)，以新鮮 HBSS潤洗後，於胰蛋白酶抑制劑(lmg/ml; Sigma)中培養5 15 分鐘，再以新鮮HBSS潤洗，然後於1ml新鮮HBSS中， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使用經過火磨光之玻璃吸管研磨。將所分離之細胞接種至 塗覆聚-D-離胺酸之 96 孔板上（Collaborative Bioscience)， 每孔30,000個細胞》各孔中含有補充26mM NaHC03(Sigma) 、 56mM 葡萄糖（Sigma) 、 15mM 20 KCl(Sigma)、ImM 丙酮酸鈉（Sigma)、l.lmM L-麩醯胺 (Sigma)、10%(v/v)加熱去活性之胎牛血清（Hyclone)及 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1328586 A7 B7 五、發明說明（54) 0.001%健大徽素硫酸鹽（Sigma) (pH 7.4)之ΙΟΟμΙ伊格氏 最基本培養基（Eagle’s Minimal Essential Media (MEM; Gibco))。實驗前，細胞置於有濕氣之^^與5%C〇2培養 箱中24小時，使之附著。每3天吸出培養基，換成新鮮 5 培養基。 分析法： 塗覆24小時後，以媒劑(pbs+0.1% BSA)、α-黑細胞 刺激性激素(α-MSH)或試驗化合物(於DpBS中稀釋)處理培 10養物。各處理條件均進行四重覆》培養第3天時，吸出培 養基’換成新鮮培養基與試驗化合物。培養一週時，使用 ίο%难酸鹽緩衝之福馬林固定細胞15分鐘，然後以DPBS (Sigma)潤洗，置入阻斷血清中3〇分鐘（馬血清；於DpBS 中稀釋1 : 50; Vector Labs)。再以DPBS潤洗培養物，然 15後於第一抗體（與微小管連接之蛋白質-2(MAP-2)，係一 種用於樹突細胞之選擇性計號；抗小白鼠單株抗體 (Chemicon); MAP-2 於抗體稀釋液(Zymed)中稀釋 1 : 1〇〇〇) 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 中培養2小時。陰性對照組孔則於只含抗體稀釋劑中培 養。由空白孔（無細胞)在有或沒有抗體下培養，決定背景 20訊號。再以DpBS潤洗培養物，然後置入螢光素中1小時 (FITC;抗小白鼠IgG ;吸附大鼠；於dPBs中稀釋i : 5〇;VeCtor Labs)。最後以DPBS潤洗培養物，培養板再於 CytofluoHOOO螢光讀數機上讀取數據。神經突之成長以相 對於對照組(媒劑）之百分比變化表示。 -56-

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1328586 A7 B7 五、發明說明（55) 於上述分析法中，試驗本發明選定之化合物，結果示 於表7。數據以相對於媒劑反應之百分比變化表示。所有 化合物均於50nM下篩選。縮寫NA表示沒有變化/沒有活 性；縮寫ND表示該化合物未測試/未測定反應。 5 表7:神經突成長試驗 化合物# 海馬回細胞 皮質細胞 媒劑 19% 4% 1 6% NA 2 18% 18% 3 17% 23% 4 20% 21% 5 28% 9% 6 23% 24% 7 NA 11% 8 NA 12% 9 NA NA 10 7% 11% 11 9% 10% 12 28% 20% 13 29% 32% 14 30% 19% 15 18% 31% 16 8% 18% 17 8% 17% 18 17% 17% 19 22% NA 20 17% NA 21 27% 2% 22 NA 30% 23 10% 20% 24 10% 16% 25 NA 23% 26 16% 47% 27 17% 52% 28 NA 25% 29 NA 8% -57- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1328586 A7 B7 五、發明說明（56 ) 30 NA NA 31 NA 16% 32 NA 6% 33 NA 21% 34 NA 22% 35 NA 28% 36 NA 16% 37 NA 26% 38 NA NA 39 NA ND 40 26% NA 41 36% 5% 42 26% NA 43 30% 37% 44 43% 198% 45 46% 25% 46 40% 19% 47 20% 13% 48 NA 19% 49 16% 51% 50 46% NA 51 74% 28% 52 65% NA 53 67% NA 54 45% NA 55 19% NA 56 33% NA 57 9% NA 58 72% 10% 59 61% 21% 60 66% 14% 61 66% 17% 62 13% 13% 63 20% 17% 64 22% 12% 82 14% 15% 83 11% 9% 84 ND 17% -58- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）

1328586 A7 B7 五、發明說明（57) 上列數據顯示，由MAP2-FITC免疫螢光測定本發明 所遽定化合物處理培養物之結果為可顯著提高神經突成 長。比較試驗化合物與α-MSH顯示，許多試驗化合物在 試驗濃度下促進神經突成長之結果均優於a-MSH。此外， 5有數種試驗化合物對海馬回或皮質細胞中神經突之成長展 現逡擇性效應。 内顏面神經壓迫模式 10 於顏面神經壓迫模式中探討試驗化合物提供保護神經 或再生神經效應之能力。顏面神經運動軸索係獨特地自特 定腦橋核中之神經元長成。顏面神經壓迫結果造成接近受 傷位置產生退化反應’及在其遠端部份造成華李倫變性 (Wallerian degeneration)，以致受傷側邊鬍鬚之運動減少。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 15 使雄性Long-Evans大鼠（150-180 g)接受3-5%異氣烧 (isoflorane)誘發麻醉，於手術期間使用2%維持麻醉。曝 露出右邊顏面神經，使用録子在神經突乳突孔之出口處壓 迫30秒《左邊顏面神經則接受假手術處理，作為内部對 照組。壓迫神經會造成鬍鬚肌肉麻痒，因此降低受傷側邊 20之鬍鬚運動，此點在自麻醉中恢復後立即可見。所觀察到 與功能缺陷有關之異常形態如下： (1) 受傷侧邊之顏面神經核中之神經元周夥質細胞數目 增加，約第3-6天時，增加數達最高峰； (2) 受傷後約一週時，壓迫之顏面神經中，染色之髓勒 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇χ297公爱） 1328586 A7

10 15 顏色較淡，且髓鞘質鹼性蛋白質之數量較少； (3) N-M接合處及鬍鬚小囊區周邊之形態出現變化，且 顏面神經核中運動神經元逐漸變性。 自麻醉中恢復後’將老鼠隨機分成媒劑組、aMSH组 或試驗化合物組，每組6隻動物。以aMSH組(每牝小時 經皮下投與70叫)作為陽性對照組。試驗化合物係經口$ 與伽g/kg，每天2次，共14天。手術後，採用兩項標 準，每天追蹤鬍子恢復運動之情形： (1) 受傷側邊之鬍鬚運動頻率相對於作為基線對照組之 相反側邊(假手術組）之變化， (2) 以鬍鬚肌肉強度進行半定量性測定(0至4+)，其 徵在於依據峨察親狀職之肌肉 彈性，及鼻子之位置。行為觀察者對進行所有觀察之實驗 设汁均保持盲目未知。 行為分析結果顯示，兩種試驗化合物：化合物#3丨與 #84均可使受傷老鼠恢復鬍鬚運動之時間比媒°劑對日以且縮 短(p< 0.05)。運動恢復比例以相對於其 ;;隋昭 組(假手術)之百分比表示，如表8所示。 。卩對*、、、 裝 計 線

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 -60- 1328586 A7 B7 五、發明說明〇9) 表8 顏面神經壓迫模式中，經口投與化合物#31與#84後之鬍 子運動功能恢復結果 恢復百分比 「D9 D10 D11 D12 D13 D14 夫#傷侧邊 100 100 100 100 100 100 媒劑 0 5.0土 27.6+ 72.5土 86·4士 91.3+ 6.8 15.9 21.2 14.5 8.3 a-MSH 2.0士 24.6+ 60.1+ 93.8土 98.1土 100士 2.8 15.8 19.3 14.0 5.3 0.0 化合物#31 0 3.5土 67.8± 98.5土 100+ 100土 (246377) 3.1 9.5 3.7 0.0 0.0 化合物#84 0 4.8士 35.1+ 90.0+ 98.3+ 100土 Π53791) 4.3 12.9 10.9 4.1 0.0 5 實例10 活體外分析法：調節皮脂合成作用之測定法 步驟A :餵養層之製法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 取3T3小白鼠纖維母細胞（瑞士小白鼠（Swiss Α1Μη〇 mouse)，ATCC CCL-92)之半融合培養物，經絲裂黴素 10 C( 4pg/ml)處理3小時’以胰蛋白酶處理，接種至含杜氏 最基本培養基(DMEM)(内含1〇%科羅拉多（c〇i〇rad〇)小牛 血清、PNC (100U/ml)、STM (lOOpg/mi)、l-麩醯胺 (0.3mg/ml)、丙酮酸鈉（ImM)與非必需胺基酸（100μΜ))之 組織培養板中，密度為2.5xl05/9.5cm2。細胞於37°C下培 15 養24小時後，才用為皮脂細胞之银養層。 步驟B :人類皮脂細胞之單離法 自人體深0.4-0.8mm皮膚處(過去已顯示此皮膚部份富 -61· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1328586 A7 B7 五、發明說明（60 ) 含皮脂腺）手+術取付皮膚之植皮刀刮屑中（Dermatome， shavings)單離出人體皮脂細胞。所得之刮屑於含10%血清 之艾絲考吱培養基(Iscoves medium)中，以1% Dispase，於 37X：下處理20分鐘。然後將組織置於含0.3%胰蛋白酶 5 /1%EDTA之碟酸鹽緩衝食鹽水(PBS)中，於37°C下1〇分 鐘。經過此培養後’小心地將組織上之細胞刮至含 DMEM/F12培養基混合物之生長培養基(gm)(3:1)中，其 中並補充8%加熱去活性之FBS、2%加熱去活性之人體 血清(HS)、ImM丙酮酸鈉、表皮生長因子（iOng/mi)、胰島 10素（lOpg/ml)、氫可體松（〇.4pg/ml)與+/-霍亂弧菌毒素 (lOOpg/ml)、L-麩醯胺與抗生素《所得之細胞經尼龍篩網 (孔徑100μ)過濾，於750RPM下離心，再懸浮於GM中， 並計數。 15步驟C :人類皮質細胞之培養 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 取上述單離法所得之細胞塗覆在生長培養基中之3Τ3 银養層上，2xl05/9.5cm2，維持在37°C與5%C02下3天 (第Ϊ期）。初生長期之後，移至過渡培養基(TM)中，其中 包含補充ImM丙酮酸鈉、胰島素鐵傳遞蛋白 20 (6.7nS/ml)與硒(5.5pg/ml)(ITS)、2% 加熱去活性之 FBS 與 2%加熱去活性之人體血清與+/_霍亂弧菌毒素 (ch.t.XIOOpg/ml)、L-麵醯胺與抗生素之DMEM/F12培養基 (第11期）。3天後’細胞換至分化培養基(DM)中，即補充 ITS、3,3'，5-三碘甲腺原胺酸鈉(3ηΜ)、1%(ν/ν)微量元素 -62- 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS)A4規格（21〇 X 297公愛） 1328586 A7 B7 五、發明說明（61) 混合物及選用之分化劑，亦即牛腦垂體抽出物（10gg/ml)之 DMEM/F12。每3天更換此培養基（第Hi期）。 步驟D:皮脂細胞分化與脂質合成之試驗刺激劑或抑制劑 5 在第I〗1期開始時，添加激素、激素混合物（亦即牛腦 垂體抽出物）或試驗化合物至培養物中。採用兩項標準評 估此等物質對皮脂培養物之影響：1)目視觀察與2)評估 皮脂堆積與合成。採用尼羅紅方法(Nile red method)分析脂 質之堆積。此方法依據目視尼羅紅對中性脂肪之染色，以 10讀板機於535nm激發光與580nm發射光下，讀取螢光值 疋里。月曰貝合成分析法係採用14C乙酸鹽進行放射活性標 ό己，以填顯影器（Bio Rad Phosphoimager) (Molecular Imager， FX)，使用4.1軟體定量。 15步驟E :脂質堆積之目視觀察與尼羅紅分析法 經濟部智慧財產局員工消費合作钍印製 由於細胞會擴大，且細胞中之脂質顆粒在亮視野光學 顯微鏡下呈現黃色圓環，因此很容易由形態辨認脂質堆 積。皮脂細胞中中性脂質之堆積/抑制作用之定量法係採 用尼羅紅結合性分析法進行。簡言之，皮脂細胞曝露在試 20驗化合物下後，使細胞與ΐμΜ尼羅紅於含DMSO及 Plunmic F127之漢克氏緩衝食鹽水中交互反應。培養4小 時後’洗蘇’培養一夜，以螢光讀板機於535mn激發光與 580nm發射光下，讀取螢光值定量。為了測定化合物是否 對細胞生長具有抑制效應，計算細胞數。 25 依上述方法，測試本發明所選定化合物於脂質堆積試 -63- 本紙張尺度適用中國国象標準(CNS)A4規格（210 X 297公楚） 1328586 A7 B7 五、發明說明（62) 驗之目視結果與尼羅紅分析結果，示於表9。 表9 ID No. 抑制°/〇 0.4μΜ 抑制％ 0·8μΜ 目視結果* 0.4μΜ 目視結果 0.8μΜ MC5-R IC5〇 74 72 100 +-Η- ++-Ι + 154nM 76 48 88 -Η- +++ 317nM 80 61 91 ++ ++++ 138nM 67 Ν.Τ. Ν.Τ. ++ +++ 246nM 50 0 0 0 0 未結合 84 0 0 0 0 未結合 記號數目增加表示抑制程度提高，抑制脂質顆粒形成++++ = 100%，+++ = 75%，++ = 50% 及+ = 25%。 步驟F :使用皮脂細胞評估皮脂合成作用 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於培養第11天時，以14C乙酸鹽標記皮脂細胞，終 濃度為2pCi/ml ’於無血清培養基中24小時。自培養板上 刮下細胞至玻璃瓶中，於-80°C下冷凍。使用Bligh- Dyer 10 法（Bligh，E.G. and Dyer，WJ.，Can. J· Biochem. Physiol” 1959, 37, pp 911-916)萃取脂質，其中稍作修改且將說明於 本文中。簡言之，取細胞於2:1氣仿-甲醇混合物中，於 ^CCl之存在下均質化。自混合物中取出有機層，分離之脂 質於氬氣下乾燥，點在高效薄層層析(HPTLC)板上。層析 15板經3種分開之移動相展開。首先使用己烷(展開至板子 頂端），然後為甲笨(至頂端”最後使用70:30:1己烷：醚： 乙酸混合物（半途至板子_1〇cm)。層析板曝露在放射照相底 片上’目視觀察放射活性脂質。觀察未標記之脂質時，以 8%銅酸噴麗層析板，於加熱板上燒烤。採用Image pr〇 20 plus 3·〇 (Media Cybernetics，Silver Springs, MD)得到定量結 -64- 本纸張尺度適用t國國家標準(CNS)A4U721Q χ 297公爱）~~ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1328586 A7 B7 五、發明說明（63) 果。 * 1, 依上述方法，測試本發明所選定化合物對人體皮脂細 胞分化作用之抑制效應。經化合物#74處理之染色細胞培 養物之目視觀察結果顯示，經過7天處理後，皮脂細胞培 5 養物中之脂質顆粒已完全消失。由HPTLC測定所分離之 標記放射活性脂質，檢視相同細胞之脂質合成結果顯示， 角鯊烯、膽固醇醋與蝶S旨已受到抑制。採用Image Pro Plus (5.0版)測定條帶強度，為細胞板定量。依據處理組樣 本與媒劑處理對照組之間差異計算抑制％，其結果示於表 10 10 中。 表10 脂質 誘發劑 細胞性別 抑制％ 0·4μΜ 抑制％ 0.6μΜ 角鯊烯 霍亂弧菌毒素與 牛腦垂體抽出物 F/M 100/100 100/100 膽固醇酯 霍亂弧菌毒素與 牛腦垂體抽出物 F/M 85/64 88/76 未知物 霍亂弧菌毒素與 牛腦垂體抽出物 F/M 75/68 85/80 蠛酯 霍亂弧菌毒素與 牛腦垂體抽出物 F/M 70/50 67/42 三酸甘油 酯 霍亂弧菌毒素與 牛腦垂體抽出物 F/M 0 0 實例11 試驗化合物對皮脂生產影響之活體内分析法：人體皮膚-15 SCID小白鼠嵌合體模式 嚴重複合式免疫缺陷小白鼠（SCID)為皮膚異種移植提 供無價之模式。此等動物已被剝除T與B細胞免疫力。 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1328586 A7 B7 五、發明說明（64) SCID小白鼠中之人體皮膚移植物則保留人類細胞組織成,, 分，包括皮膚免疫細胞，亦即朗格漢細胞（Langerhans cells)、巨噬細胞與淋巴球，及一部份植入之内皮 (Kaufman R”et al” Exp. Dermatol. 1993: 2: 209-216, 5 1993)。由此等性質可以探討人類皮膚細胞對試驗化合物 之生理與/或病理反應。 步驟A:移植法 使用 5-6 週大之 C.B-17 scid/scid 小白鼠（Taconic， 10 Germantown, N.Y.)進行移植。使用福曼植皮刀（Forman Dermatome)到下全厚度之人類顏面皮膚至約0.4mm處。皮 膚刮屑於含抗生素與抗黴菌素（青黴素、鏈黴素、兩性黴 素）（Life technologies)之杜氏改良式伊格培養(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM，Life Technologies)中洗蘇 15 3次。取橢圓形皮膚約2.0-2.5xl.0-l.5移植至預備好之移 植床上’使用4.0絲線縫合。手術期間，小白鼠使用 Ketaset (0.16 mg/g 體重）與 R〇mpun(8.0pg/g 體重）之混合物 麻醉。 咸了解’ SCID小白鼠之移植皮膚傷口癒合過程需費 20時一個月，此時才可使用人類皮膚進行實驗。吾等亦發現 移植之人類皮膚中之皮脂腺逐漸再生，由Sebutape及組織 形態測定計之結果顯示，此等皮脂腺於7週後完全再生並 分泌皮脂。當移植後3個月，觀察到皮脂腺之最大面積。 皮脂線仍保留其生產人類專一性皮脂之能力，且皮脂腺組 -66- 本纸張尺度適用t國國家標準(CNS)A4^ (21Qx297公

1328586 Α7 Β7 五、發明說明（65) 織表現人類專一性記號’包括MC5-R»由於皮脂腺在移植， 後2-3個月時達到最大面積，因此於此時間點測定抑制劑 對皮脂分泌之影響。 5 步驟B :處理法 使用接受人類顏面皮膚移植後2-3個月之小白鼠進行 試驗。移植區域使用溶於聚乙二醇-乙醇(2〇μ1/2 cm2)中之 所需濃度試驗化合物處理。對照組只使用媒劑處理。除了 遇末以外，每天施用試驗化合物。於處理後15天及30天 10 時，使用Sebutape測定皮脂分泌。 步驟C :實驗終點 實驗終點係使用SEBUTAPE進行皮脂生產之預備臨床 分析法測定，。此時切下人類皮膚移植物，收集代表性樣 15本’供進行組織分析。更特定言之，以打孔機剪下2mm 活體組織，用於分析處理組織中之脂質合成及脂質總堆積 量。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 步驟D:所檢視組織中脂質合成與脂質總堆積量之分析法 將所收集之2mm活體組織片分別置於含有克氏(Krebs) 緩衝液之96孔板中，以iOpCi c14乙酸鹽標記3小時。經 過此標記期後，樣本於培養基中洗滌，收集5片活體組織 樣本’稱重，用於萃取脂質。脂質萃取法與HFTLC分析 法均如上述來自組織培養物之細胞所使用之相同方法。 -67- i紙張尺度適用t國國家標準(CNS)A4規格⑵0 χ 297公楚 — 1328586 A7 B7 五、發明說明（66 )

依上述方法，測試本發明化合物#74對移植至saD 小白鼠之人類皮膚處理丨丨天後之抑制皮脂腺活性結果。· 使用化合物#74之〇.1%溶液局部處理皮脂腺後之目 =析結果顯示，皮脂腺出現可見之縮小現象且皮脂分泌 =。以〇观及議5%溶液局部處理15天時不足以 使月曰質產量向下調降。使用 皮脂受抑狀奸料麟，結^胞之人類 抑制％數值係相對於對照組表示。、U與13 ° 10 表11 人類錢之影響(處理 Μ質 11天）

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表12對脂質堆，影響(處 15

-68- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1328586 A7 B7 五、發明說明（67 ) 表13 化合物#74對皮脂合成之影響(處理30天) 脂質 抑制％ @0.05% 抑制％ @0.01% 角鯊烯 90 80 壤酯 93 86 三酸甘油酯 90 75 膽固醇 82 33 如上述表12與13所示，在使用化合物#74之0.05% 5 及0.01%溶液局部處理30天後，皮脂總堆積量及重新合 成之皮脂量顯著減少。 實例12 口調配物 口服組合物之明確具體實施例中，使用100mg實例 10 2之化合物#74與充分細碎之乳糖調配，形成總量580至 590 mg，供填入0號規格之硬明膠囊中， 實例13 局部用調配物 15 A :微乳液 微乳液之明確具體實施例係混合下列成分，必要時可 加熱： 聚山梨酸酯60 (例如：來自ICI界面活性劑之Tween60) 20份 棕櫊酸異丙酯 20份 -69- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1328586 Α7 Β7 五、發明說明（68 ) 油酸山梨糖醇酐酯 (例如：來自ICI界面活性劑之Span80) 13份 2_乙基己二醇-1^ 4份 丁基化羥基-曱苯 0_05 份 化合物#74 0.05 份 在混合物中缓_添加水(42.9份重量比），必要時可以 混合，形成乳液。 5 B:含水醇凝膜 含水醇凝膠之明確具體實施例係混合聚丙二醇（10份 重量比）、丁二醇（10份重量比）、苯甲醇(2份重量比）、 EDTA (〇.〇5份重量比)與BHT (〇.〇5份重量比）及水(總量占 74.85份重量比）。混合混合物至所有成分均溶解為止。然 10後緩緩添加Carbomer (例如：Goodrich公司之Carbopol 934P)(3份重量比）並常常旋轉混合，形成凝膠。然後將 化合物#74 (0.05份重量比）混合勻散至凝膠中。凝膠pH 調至約pH 3-4。 15 C =無水凝豚 &無水凝膠之明確具體實施例中，添加異丙醇(20份重 ，比）至丁一醇(20份重量比）中。然後添加ΒΗΤ(〇 〇5份重 ΐ比)與笨甲醇(1.G份重量比)至異丙醇/丁二醇混合物中。 在所得混合物中，於持續麟下，添加環时氧烧㈣與

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1328586 A7 B7 五、發明說明（69) 有機聚石夕氧院-11(例如：Grant Industries 之 Gransil GSM,， 凝膠)(58.85份重量比）。取化合物#74 (0.1份重量比)微粉 化，在連續攪拌下勻散至凝膠中，並均勻分散。 5 D :乳霜 o/w(油/水）乳霜之明確具體實施例中，依指定量混合 下列成分（重量份數）。最終混合物使用鹽酸調至約pH 2。

Cetearyl 醇 4.3份 微晶蠟 9.0份 Ceteth-20界面活性劑 (例如：來自ICI界面活性劑之Brij58) 1.1份 癸酸/辛酸三酸甘油酯 (例如：來自 GoldSchmidt之 TegosoftCT) 3.6份 甘胺酸 0.6份 化合物#74 0.1份 BHT 0·05 份 水 81.25 份 10 雖然上述說明已教示本發明，其中利用實例說明，但 咸了解，本發明之操作涵括下列申請專利範圍及其同等物 之範圍内之所有一般變化、擷用與/或修飾。 -71- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）

Claims (1)

1. 丄 一一^—1六、申请專利範圍 B8 |訾申請案第91133320號 · C8 ^ X ^ J^fS Patfnt ΑΡΡ1η· Νο·91 !33320 ^正後無劃線之申請專利範園中文本—附件(二） .Aniended Claims in Chinese - Fnr iR國95」」_ (Subm] 1. 一 種式(II)化合物 ΙψΕ igW^> aww^ •0ctob .an )er ^ , 200i)

   其中 m η 篆 % 案 U St 10 R係為笨基，其經一個分別獨立選自下列之取代 1取代，CI-6烧基、及CM炫氧基； ^ 4 R2係為經Cl_6烷氧基取代之苯基； | R係為笨基，其可視需要經一個或二個分別獨立選i 自下列之取代基取代：鹵素、c〗_6烷基、及Q.6烷] 氧基； 1

   i I I I I I I I I I 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 及其醫藥上可接受之鹽類。 2.根據申請專利範圍第1項之化合物，其中 15 Rl為2-甲氧苯基； R為2-曱氧苯基； R係選自：笨基、4-甲氧苯基、2,6-二氟苯基、3,5-二氟苯基與2-氯-6-甲苯基； 及其醫藥上可接受之鹽類。 20 3.根據申請專利範圍第2項之化合物，其係選自[2-(2-曱 氧笨基)-3-(2-甲氧苯基)-2Η·[1，2,4]-亞噻二唑-5-基]苯基 胺 （[2-(2-methoxyphenyl)-3-(2-methoxyphenyl)-2H-[l，2,4]-thiadiazol-5-ylidene]-phenylamine)，及其醫藥上 可接受之鹽類。 -72 - 訂

   本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇χ297公釐） 91502Β-接 1 六、申請專利範圍 4. 一種用於治療黑皮質素受體所媒介的病症之醫藥組合 物，其包含根據申請專利範圍第1項之化合物與醫藥 上可接受之載劑。 5. —種製造用於治療黑皮質素受體所媒介的病症之醫藥 5 組合物之方法，其包括混合根據申請專利範圍第1項 之化合物與醫藥上可接受之載劑。 6. 根據申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中黑皮質 素受體所媒介的病症係選自包括代謝病症、CNS病症 與皮膚病症。 10 7.根據申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中黑皮質 素受體所媒介的病症係選自包括肥胖症、口服葡萄糖 耐受性受損、血糖濃度增加、Π型糖尿病、X-症候 群、糖尿病性腎病變、急性神經退化病症、慢性神經 退化病症、神經叢病變、男性勃起功能障礙、乾眼 15 症、痤瘡、皮膚乾燥、皮膚老化、皮脂漏皮膚炎、酒 造鼻、耳垢過多、臉板腺病症、假毛囊炎、酵母菌感 染、頭皮屑、化膿性汗腺炎、眼紅斑痤瘡、及分泌腺 病症。 8. 根據申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中黑皮質 20 素受體所媒介的病症係選自包括肥胖症、口服葡萄糖 而ί受性受損、血糖濃度增加、II型糖尿病、及X-症候 群。 9. 根據申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中黑皮質 素受體所媒介之病症係選自包括痤瘡、皮膚乾燥、及 -73 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 1328586 A8 B8 C8 _D8_ 六、申請專利範圍 皮脂漏皮膚炎。 10.根據申請專利範圍第7項之醫藥組合物，其中黑皮質 素受體係選自包括黑皮質素-3、黑皮質素-4及黑皮質 素-5受體。 5 11.根據申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中該醫藥 組合物為局部用調配物。 12. 根據申請專利範圍第11項之醫藥組合物，其中該局部 用調配物另含有一種或多種下列成分：去粉刺劑/去角 質劑、抗微生物劑、類固醇性消炎劑、及非類固醇性 10 消炎劑。 13. 根據申請專利範圍第12項之醫藥組合物，其中該去粉 刺劑/去角質劑係選自包括類視黃素、水楊酸、乙醇 酸、及錄堪基甜菜驗。 14. 根據申請專利範圍第13項之醫藥組合物，其申該抗微 15 生物劑係選自包括苯曱醯基過氧化物、紅黴素、四環 黴素、克林達黴素、壬二酸。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）