TWI284537B

TWI284537B - Blood-viscosity reducing agent

Info

Publication number: TWI284537B
Application number: TW094116711A
Authority: TW
Inventors: Masahito Hitosugi; Hiroaki Maeda; Kazunobu Omura
Original assignee: Daiwa Pharmaceutical Co Ltd; Masahito Hitosugi
Priority date: 2004-11-16
Filing date: 2005-05-23
Publication date: 2007-08-01
Also published as: EP1657304B1; HK1088849A1; JP2006143601A; KR20060055302A; US20060105071A1; EP1657304A1; CA2527154A1; CN1775284B; US7972835B2; ATE446360T1; DE602005017235D1; KR100709300B1; CN1775284A; US20090202982A1

Description

1284537 九、發明說明：【發明所屬之^技冬好領域】本發明係為一種血液黏度降低劑。【先前技術3 5 發明背景本發明係關於一降低全血液黏度之血液黏度降低劑。納豆是上溯自十七世紀至今長久以來的日本傳統發酵食品，且疋使日本人充分攝取豆類蛋白質之優良食品。例如納豆具有一較諸黃豆更高之可消化性。這是因為黃豆是 10由納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)來將黃豆之蛋白質、脂肪、澱粉及類似主要成份分解為一胺基酸、脂肪酸、及葡萄糖，故於攝取時能夠增進可消化性。大部分蘊藏於納豆之維生素β群皆有益於生理功能且可縮短疲勞的復原期。納豆包含大量的維生素&，且被預 15期能夠復原視力疲勞。納豆内的維生素Κ含量是食物中最高的納丑被預期此狗改善血約代謝，其係例如··預防骨質疏鬆及改善血液凝固力。近年來，多種納豆功能已被證實，且納豆的效用已經成為大受矚目的健康食品。納豆的食用量已增加。特別是 2〇被稱為納豆激酶(Nattokinase)之含納豆酵素，其係具有如曰本專利案公開字號第6M62184號(參考文獻1)、第3-168082 號(參考文獻2)及第6-153977號(參考文獻3)所揭露之製造方法生理化學性質及生物化學性質，而具有可用為凝血纖、准蛋白溶解劑及血栓溶解劑之效用。 1234537 如曰本專利案公開字號第1-180834號(參考文獻4)及第 8-208512號（參考文獻5)所描述，納豆激酶已經成為大受矚目之凝血纖維蛋白溶解劑及血栓溶解劑。這些參考文獻揭露的技術是涉及使用由含納豆激酶為活性成份之安全可簡 5易獲得試劑來取代一意指如目前臨床治療血栓所使用之尿激酶(urokinase)、鏈激酶(streptokinase)、及一組織胞漿素原活化劑（tissue plasminogen activator)之血栓溶解劑及血小板凝結抑制劑。曰本專利案公開字號第2001 -352929號（參考文獻6)係 10揭藤由下列方式來製造納豆的加工食品。納豆的獨特活性成份是在一不具有納豆發酵獨特氣味之狀態下，予以萃取自一使用純化自黃豆之黃豆蛋白質粉末來培養納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)之透析培養液。依照參考文獻6之揭露内容，此加工食品係容許於使用 15納豆激酶來達到溶解血栓效用之外，還能夠延緩血液凝固時間及抑制血栓形成。如上文所描述，獲得自納豆之產物係具有除了溶解血栓效用之外，還能夠延緩血液凝固時間及抑制血栓形成的多項功能。本發明係於參考文獻6揭露之納豆加工食品中發 20 現一種除上述效用之外的新功能。【明内容;J 發明概要一本發明目標是提供一具有由使用一源自納豆之產物來獲得一新功能之試劑。

7 I2§4537 本發明係為了達成上述本發明目標而提供一血液黏度降低劑’其主要是由一源自納旦枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)之蛋白質所構成，且此蛋白質係依序由一胺基基團端部開始包含：一具有下列胺基酸之第一結構胺基酸序列： 5 丙胺酸(ala)、蘇胺酸(thr)、天冬胺酸(asp)、甘胺酸(gly)、纈胺酸(val)、麵胺酸(glu)、色胺酸(trp)、天冬醯胺酸(asn)、纈胺酸(val)、天冬胺酸(asp)、麵醯胺酸(gln)、異白胺酸(iie)、天冬胺酸(asp)、丙胺酸(ala)、脯胺酸(pro)、離胺酸(iys)、丙胺酸(ala)、色胺酸(trp)、丙胺酸(ala)、白胺酸（leu)、甘 10 胺酸(gly)、酪胺酸(tyr)、天冬胺酸(asp)、甘胺酸(gly)、蘇胺酸(thr)、甘胺酸(gly)、蘇胺酸(thr)、纈胺酸(vai)、纈胺酸 (val)、丙胺酸(ala)、絲胺酸(ser)、異白胺酸(ile)、天冬胺酸 (asp)、蘇胺酸(thr)、甘胺酸(gly)、纈胺酸(vai)、麵胺酸(giu)、色胺酸(trp)、天冬醯胺酸(asn)、組胺酸(his)、脯胺酸(pro)、 15 丙胺酸(ala)、白胺酸（leu)、離胺酸(lys)、麵胺酸(glu)、離胺酸(lys)、酪胺酸(tyr)、精胺酸(arg)、甘胺酸(gly)、酪胺酸 (tyr)、天冬醯胺酸(asn)、脯胺酸(pro)、麩胺酸(glu)、天冬醯胺酸(asn)、脯胺酸(pro)、天冬醯胺酸(asn)、麩胺酸(giu)、脯胺酸(pro)、麩胺酸(glu)、天冬醯胺酸(asn)、麩胺酸(glu)、 20 甲硫胺酸(met)、天冬醯胺酸（asn)、色胺酸(trp)、路胺酸 (tyr)、天冬胺酸(asp)、丙胺酸(ala)、纈胺酸(val)、丙胺酸 (ala)、甘胺酸(gly)、麩胺酸(glu)、丙胺酸(ala)、絲胺酸(ser)、脯胺酸(pro)、酪胺酸(tyr)、天冬胺酸(asp)、天冬胺酸（asp)、白胺酸(leu)、丙胺酸(ala)、組胺酸(his)、甘胺酸(gly)、蘇胺 I2B4537 酸(thr)、組胺酸(his)、纈胺酸(val)、及蘇胺酸(thr); 一具有下列胺基酸之弟一^结構胺基酸序列·丙胺酸(ala)、笨丙胺酸(phe)、絲胺酸(ser)、麩胺酸(glu)、天冬胺酸(asp)、甘胺酸(gly)、甘胺酸(giy)、蘇胺酸(thr)、天冬胺酸(asp)、丙胺 5 酸(ala)、天冬胺酸(asp)、異白胺酸(ile)、白胺酸(ieu)、麵胺酸(glu)、丙胺酸(ala)、甘胺酸(gly)、麩胺酸(glu)、色胺酸 (trp)、綠胺酸(val)、及白胺酸（leu); —具有下列胺基酸之第二結構胺基酸序列：天冬胺酸(aSp)、丙胺酸(ala)、麵胺酸(ghi)、甘胺酸(gly)、天冬醯胺酸(asn)、脯胺酸(pr〇)、組 10胺酸(his)、脯胺酸(pro)、麵胺酸(glu)、甲硫胺酸(瓜吻、丙胺酸(ala)、脯胺酸(pro)、天冬胺酸(aSp)、及綠胺酸(_); 以及一具有下列胺基酸之第四結構胺基酸序列：纈胺酸 (val)、脯胺酸(pro)、甘胺酸(gly)、麩醯胺酸(gln)、丙胺酸 (ala)、酪胺酸(tyr)、麵胺酸(glu)、天冬胺酸(asp)、甘胺酸 15 (gly)、色胺酸(trp)、及天冬胺酸(asp)，藉此可降低全血液之黏度。圖式簡單說明第1圖是一血液黏度量測結果之顯示圖；及第2圖是一血液黏度量測結果之顯示圖。【J/li 較佳實施例之詳細說明見在將> 3铋附圖式來描述一本發明具體例。本發明由研九毛現—有如加工食品之產物（以下稱為一NKCP) 此NKCP產物是—由有效純化自一培養納豆枯草桿菌 20 12,845.37 (Bacillus subtilis natto)之黃豆液體培養液所獲得之凝血纖維蛋白溶解物質。於研發期間，本發明人是由一衲豆溶解血塊之凝血纖維蛋白溶解活性研究過程中獲得一碩血液黏度降低效用的新發現。 5 NKCP之製備方法係描述如下。將納豆枯草桿菌 (Bacillus subtilis natto)(菌種名稱：Takahashi)添加入純水中，然後由攪拌來製備成一散浮液。將一少量散浮液接種至一使用標準瓊脂培養基製備之瓊脂平面上。j复脂平面上的散浮液將經由37°C培養24小時來獲得一納豆枯草桿菌 10 (Bacillus subtilis natto)之菌落。將一材料包含1克葡萄糖及4克黃豆蛋白質粉末之2〇〇毫升液體培養液配製入一内容量500毫升之三角錐瓶 (Erlenmeyer flask)内。將三角錐瓶置入一高壓滅菌签來進行 120°C歷時30分鐘之三角錐瓶内部滅菌。可以使用一獲得自 15研磨黃豆之黃豆粉末材料。意即黃豆蛋白質被包含於材料中。納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)採樣是使用_直徑2毫米之接種環並單一地挑取自培養於瓊脂平面上之納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)菌落。將採樣之鈉豆栝草 20 桿菌（Bacillus subtilis natto)接種入三角錐瓶内的液體培養液。令裝盛液體培養液内接種納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)之三角錐瓶在40°C之環境下維持開故，然後由旋轉搖蘯2天來培養三角錐瓶内的液體培養液。將一包含100克葡萄糖、400克黃豆蛋白質粉末及一可 10 d 12,84537 浴性澱粉之2〇公升液體培養液配製入一内容量3〇公升之直桶型發酵槽，然後滅菌該液體培養液。此外，將培養於三角錐瓶内之毫升納豆枯草桿菌（BadUus subtms峨啦加入直桶型發酵槽内的液體培養液。所產生之培養液進行 5 42°C通氣攪拌培養，歷時2天。另外製備3份相同的培養液，俾以獲得大約50公升之黃豆蛋白質液體培養液。自该經培養產生之黃豆蛋白質液體培養液離心移除納丑枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)菌體及不純物，然後添加 1莫耳的硫酸銨。添加硫酸銨所造成之蛋白質厭水性可協助 10凝聚包含例如多種分散於發酵溶液内之酵素高分子化合物。添加硫酸銨會產生新的不可溶物質。這些物質是使用玻璃纖維濾紙來過濾。將一配製於一 1莫耳硫酸銨溶液之厭水性層析樹脂浸泡入該經過濾產生之黃豆蛋白質液體培養液。厭水性高分 15子化合物會凝聚(接結)於樹脂上。由樹脂上的化合物浸泡入一0·1莫耳之碳酸氫銨溶液，來析出該接結於樹脂上之高分子化合物，藉此獲得一40公升之濃縮液體培養液。此濃縮液體培養液是使用一具有一製備分子量等級為 10,000之超過濾濾膜，來進行分離低分子量物質之超過濾 20 。此濃縮液體培養液將由40公升濃縮至1〇公升。將1〇公升純水添加入此由通過超過濾濾膜而獲得之濃縮液體培養液，藉此獲得一20公升溶液。將此獲得之溶液再次引入超過遽。》谷液重覆進彳于》辰細3次’直至由分離低分子量物質使體積變成10公升為止。經由這3次濃縮，可製得一幾近所有低 11 © I2B4537 分子篁物質皆已移除之發酵黃豆蛋白質液體培養液。具有發酵納豆獨特氣味之主要成份皆是低分子量化合物，例如··二甲基,比啡（分子量：1〇814)、三甲基吡哜（分子篁· 122.17)、四甲基，比畊（分子量：126 2〇)、丁酸2•甲酯 5 (分子罝· 1〇2·13)、異戊酸(分子量：102.13)、及氨(分子量 :17.03)。包含於納豆之維生素&2是一具有分子量料9之碳水化合物。然而，就例如一酵素（例如··納豆激皞 (Nattokinase))之蛋白質而言，則為一具有數萬或更高分子量之聚合物化合物。 10 當由超過濾來移除低分子量物質時，幾近所有如發酵納豆獨具之”氣味，，組份及維生素&2之低分子量物質皆可自發酵汽豆蛋白貝液體培養液移除。最後，將用為一稀釋劑之2公斤乳糖添加入該經由超過濾移除低分子量物質之發酵黃豆蛋白質液體培養液，其後冷凍乾燥所產生之溶液， 15藉此可製得大約2Λ公斤之黃豆蛋白質發酵粉末(NKCP)。自從大約1990年以來，獲自納豆且用為一凝血纖維蛋白溶解物質之納豆激酶(Nattokinase)已被報導是枯草桿菌蛋白（Subtilisin)(鹼性蛋白質酶）。純化該由上述製得之 NKCP活性物質，然後使用多種儀器分析來進行檢測。分析 20結果顯示主要的活性物質是一分子量34,000之桿菌胜肽酶 F (Bacillopeptidase F)，其係為一由納豆枯草桿菌（Badllus subtilis natto)分泌之酵素，且其係不同於納豆激酶 (Nattokinase) 〇為了確定NKCP功能性食品之標準成份而進行一項定

12 1284537 • » 量分析，此分析是於該被稱為間質分解活性的傳統組成係數之外，另外製備下列量測套組。套組是由製備一具有一分子量34,000之桿菌胜肽酶ρ (Bacillopeptidase F)的抗體來進行一酵素連結免疫分析法(ELISA)。這些分析方法已經 5 由（JaPan f〇〇d research laboratories Inc·驗證為一適合使用的定量分析方法。為了將NKCP研發為功能性食品，因此由多項動物試驗及人體床試驗來測定安全性及效力。就安全性而言，測定結果符合一項由健康勞動及社會福利管理局核准之特定 10健康使用食品專級規定，且於臨床劑量範圍内沒有觀測到臨床問題。預期獲得之凝血纖維蛋白溶解活性效力是由多項動物试驗及多項人體臨床試驗來驗證。於這些試驗及測試期間，不僅對血栓展現早期報導為枯草桿菌蛋白 (Subtilisin)之凝血纖維蛋白溶解活性，且於nkcp發現抑制 15 血栓生成及降低血液黏度之效用。下文將描述此驗證一包含NKCP之抗凝固劑具有降低血液黏度效用的具體例。新鮮的血液是抽取自條件符合非吸煙者、事先簽署同意書及年齡20-22歲之志願者。新鮮的血液是於抽取自志願者後迅即傾倒入一其内一振盪黏度 2〇益維持37〇C之稱量容器中。血液的臨床試驗數值及血液黏度數值是於經歷時間内由一4〇〇_5〇〇 mPa.s之剪力速率來量測。將樣品溶解於一般生理食鹽水中，然後於傾倒新鮮血液日守，將1/100的樣品添加入量測容器内。·於黏度量剩期間

13 12,84537 ’快速攪拌麟血液與樣品。血液是在不鑛凝血/凝血纖維蛋白溶解系統之下小心抽取。經處理之血液可由振盪黏度器來觀測其凝固。由上述方法量測之人類血液黏度是在一生理溫度且無 5抗凝固劑或稀釋劑之下進行觀測，且此生理變化係代表血液是在一真實的人體内流動。血液黏度會迅即於血液置放入里測系統後展現平衡狀態。黏度是以血液凝固反應來計 • #黏度疋於平衡狀悲後經由歷時大約％〇秒來達到呈指數增加。更進一步細節請參閱參考文獻7、8及9。 1〇於另一例如一 M c—F AN (微管陣列流動分析儀）之血液黏度量測儀器係使用抗凝固劑來進行量測，俾以於儀器内避免血液凝固。藉此可量測涉及血球細胞（大部分是紅血球細胞)黏附及變形之血液黏度。然而，就於活體狀態下量測包含凝固及凝血纖維蛋白溶解而言，一振盪黏度計會優於 15 上述儀器。 # 當血液添加服。？是呈一0·05毫克/毫升或更高之數量時，黏度達到指數增加之時間會被延緩。一〇·5毫克/毫升或更南之數量並沒有證實會使黏度增加。一〇·25毫克/毫升之數里會使平衡黏度下降大約1〇%，而一〇·5毫克/毫升之數量 2〇則使平衡黏度下降大約20%。由血液添加NKCP所造成之凝固形態及表現時間的等級會不同於添加一作為一血栓溶解 Μ之組織胞漿素原活化劑（tiSSUe plasmin〇gen activat〇r)或作為一抗凝血劑之肝素(Heparin)。一臨床血液黏度是於吞服NKCP時量測。8名成人受測 14 ⑤ 1284537 者皆事先已簽署同意書。另外挑選其他6名受測者為一安慰劑治療對照組。於挑選受測者時，明顯染患急性疾病及慢性疾病猛然突發者皆被排除為受測者。每曰劑量是10顆藥錠，其係相當於L250毫克<NKCp 5 。於試驗第一天，10顆藥錠是於早晨與2粒飯團同時投藥。自弟一天開始，10顆藥旋是每日一次於晚餐後投藥，持續歷時一週。於試驗第一天，血液黏度量測是於投藥前、投藥後歷時105分鐘、180分鐘、及240分鐘。血液黏度是於一如上述其内所有血液樣品皆維持37〇c 10之稱量容器中，由一振盪黏度器使用400-500 mPa.S之剪力速率來量測。血液黏度變化是使用於黏度呈指數變化前達到之平衡黏度來測定。如表1及第1圖所顯示，於180分鐘及240分鐘可觀測到血液黏度下降，然而於安慰劑治療組則沒有觀測到任何血液黏度變化。表1 於NKCP投藥後經歷時間的變化參數投藥前 45分鐘 105分鐘 180分鐘 240分鐘 NKCP (n=8) 3.93±0.283 3.86±0.243 3.80 士 0.193 3.79±0.244 3.89 士 0.205 女慰劑 (n=16) 4· 1〇土 0.444 4.11 士 0.528 4·00±0·513 4.09 士 0.298 4.02±〇.359 數值是8名志願者之平均士標準差。標準差是由Duncan，^、,j試就每一個投藥來計算，* : p<〇.〇5，: ρ<〇.〇ι。 ^18:32°(：之血液黏度(1111^.3)，1^:血球比容39.8-51.8%。使用振盪黏度計來量測添加NKCP之血液黏度、額外添 15 1284537 加納豆激酶(Nattokinase)之血液黏度、及無添加物之血液黏度。變化顯示於第2圖。於第2圖中，添加NKCP之血液、額外添加納豆激酶(Nattokinase)之血液、及無添加物之血液的量測結果是分別由圓點、實心方格、及實心三角形來表示 5 。由圓點來表示之添加NKCP血液的量測結果係展現較諸額外添加納豆激酶(Nattokinase)之血液更低的黏度增加。因此觀測到的血液黏度變化並不全然來自包含於納豆内的酵素及蛋白質。就血液黏度量測而言’請參閱Masahito Hitosugi et al.， 10 ^Rheologic Changes in Venous Blood During Prolonged

Sitting”，Thrombosis Research 100, pp· 409-412, 2000 (參考文獻 7)、Masahito Hitosugi et al” “Changes in Blood Viscosity by Heparin and Argatroban”，Thrombosis Research 104, pp. 371-374, 2001 (參考文獻8)、及Masahito Hitosugi et 15 al·，Changes in Blood Viscosity with Synthetic Protease Inhibitors59, Journal of Pharmacological Sciences, Vol. 91, pp. 334-336, 2003 (參考文獻9)。如上文所述，就此包含N K C P之血液黏度降低劑的具體例來看，血液黏度係明顯下降。血液黏度降低效用係被期 20望能夠用以改善健康醫療及人類健康，例如：預防一作為血栓形成誘導因子之凝血機制(hemostasis)、改善於例如肌肉之周邊組織内涉及增加提供氧氣及養份的有效容量、由降低周邊血管阻抗來改善高血壓、預防動脈硬化形成及改善由一周邊血管阻抗引發之心臟衰竭狀態。 16 (g 1284537 血液黏度降低劑具有的性能係可預防一造成臨床試驗使用血液樣品問題之抽血後增加血液黏度及凝固，而能夠改善臨床試驗的精準度及便利性。錢黏度降低劑亦被預期能夠藉由抑制臨床檢驗及治療使用器具產生血液污染所 5導致之黏度上升來改善清除效力。血液黏度降低劑係有助益於維持及保存接受治療及外科手術之組織、自一活體移除之組織、及自其等採收之血液。下文將描述上述NKCP作為血液黏度降低劑之具體例的生理化學特性研究結果。用為一生產NKCP菌株之納豆枯 10 草桿菌（Bacillus subtilis natto)(菌種名稱：Takahashi)的基因序列分析是由，，16S核糖體DNA核甘酸序列方法，，來展現168 株枯草桿菌屬（Bacillus subtilis subsp)、枯草菌（Subtilis)、以及99·9%或更高的相似度。由TOF-MS(飛行時間質譜術）量測之NKCP分子量為 15 34，134道耳吞。。NKCP分子量係預計是大約34,000道耳呑。就此量測而言，NKCP樣品係由重覆使用一例如 SuperQ-Toyopeal 650M、Butyl-Toyopearl 650M、Toyopearl HW-40F之分子篩載體來進行重力層析純化。於下述量測中使用由同上述方式純化之樣品。 -° NKCP之結構是由一使用艾氏裂解方法（Edman degradation)之自動胺基酸序列分析儀器來分析85個由胺基端開始之胺基酸序列。N K C P是使用離胺酸端部内胜β禮來進行限制性裂解為數段胜篮片段。這些胜篮片段是使用高壓液相層析來進行純化。經純化之片段則引入一使用 ⑧ 12,84537 TOF-MS(飛行時間質譜術)及使用Edman裂解方法之自動胺基酸序列分析儀器來進行質量分析。所產生之NKCP結構如下。 NKCP係經證實具有下列由胺基端開始之結構胺基酸 5 序列（胜 1片段）：’’ATDGV EWNVD QIDAP KAWAL GYDGT GTWA SIDTG VEWNH PALKE KYRGY NPENP NEPEN EMNWY DAVAG EASPY DDLAH GTHVT”、 ”AFSED GGTDA DILEA GEWVL”、，，DAEGN PHPEM APDV”、以及”VPGQA YEDGW D”。換句話說，NKCP是一 10 源自納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)且具有上述由胺基端開始之胺基酸序列的蛋白質。於上述序列中，大寫字母係代表：丙胺酸(A)、甘胺酸(G)、甲硫胺酸(M)、絲胺酸 (S)、半胱胺酸(C)、組胺酸(H)、天冬醯胺酸(N)、蘇胺酸(T) 、天冬胺酸(D)、異白胺酸(I)、脯胺酸(P)、纈胺酸(V)、麩 15 胺酸(E)、離胺酸(K)、麩醯胺酸(Q)、色胺酸(W)、苯丙胺酸 (F)、白胺酸(L)、精胺酸(R)、及酪胺酸(Y)。

由综合質量分析結果及分子量計算值之分子結果，來綜合Xu-Chu，Wu，et al·，“Cloning，Genetic Organization，and Characterization of a Structural Gene Encoding 20 Bacillopeptidase F from Bacillus Subtilis*”，The Journal of Biological Chemistry Vol· 265, No· 12, pp· 6845-6850，1990 (參考文獻10)以及簡易生物切割胺基酸序列之測定結果， NKCP之結構序列被鑑定為”“ATDGV EWNVD QIDAP KAWAL GYDGT GTWA SIDTG VEWNH PALKE KYRGY ⑧ 12845,37

NPENP NEPEN EMNWY DAVAG EASPY DDLAH GTHVT GTMVG SEPDG QNTIG VAPGA KWIAVK AFSED GGTDA DILEA GEWVL APKDA EGNPH PEMAP DVVNN SWGGG SGLDE WYRDM VNAWR AADIF PEFSA GNTDL FIPGG 5 PGSIA NPANY PESFA TVATD INKKL ADFSL QGPSP YDEIK PEISA PGVNI RSSVP GQAYE DGWDF TSMAG PHVSA VAALL KQANA SLSVD EMEDI LTSTA EPLTD STFPD SPNNG YGHGL VNAFD VSAVT DGLGK”。 NKCP被證實具有由一包含精胺酸殘基酸殘基、組胺酸 10 殘基、及絲胺酸殘基之相似序列構成之絲胺酸蛋白酶活性中心。如 Alan Sloma，et al·，“Cloning and Characterization of the Gene for an Additional Extra)cellular Serine Protease of Bacillus Subtilis”，Journal of Bacteriology，Vol· 173, No· 21， pp· 6889-6895, Vol. 1191(參考文獻11)所指述，此等係證明桿菌胜肽酶F(Bacillopeptidase F)係擔任枯草桿菌（Bacillus subtilis)之細胞外蛋白酶。這證明NKCP是一種絲胺酸蛋白酶。下文將描述日本發酵傳統食品納豆的正常生理活性。納豆係具有一較諸黃豆更高之可消化吸收性。這是因為黃 20豆是由納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)來將其蛋白質、脂肪、澱粉及類似之主要成份分解為一胺基酸、脂肪酸、及葡萄糖。納豆於攝取時將具有一較高之消化吸收效率。大部分蘊藏於納豆之維生素B群皆有益於生理功能及疲勞復原。納旦包含大量的維生素B2，且被預期能夠復原視力 19 ⑧ 1284537 疲勞。納豆内的維生素κ：2含量是食物中最高的。因此被預期能夠改善例如改善骨質疏鬆及血液凝固之血鈣代謝。由納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)來分解黃豆蛋白質的過程中，會藉由分泌多種擔任活性酵素試劑且係例 5如蛋白酶及澱粉酶之酵素，來改善消化及活化代謝。納豆激酶(Nattokinase)可溶解血栓。納豆激酶(Nattokinase)與NKCP之間的酵素差異將被納入考慮。於納豆中被發現且效用為一強凝血纖維蛋白溶解酵素之納豆激酶(Nattokinase)是一種分泌自納豆枯草桿菌 10 (Bacillus subtilis natto)之絲胺酸蛋白酶，且其分子量為 20,000道耳吞。納豆激酶(Nattokinase)具有分解血栓及胞漿素（plasmin)之合成色原體基質（synthetic chromogenic substrate)的能力。除了上述酵素之外，可以由納豆中真檢測到某些具有27,000或高更分子量之凝血纖維蛋白溶解酵 15 素。

於納豆中被發現且係由於具有強凝血纖維蛋白溶解活性而擔任一種新的凝血纖維蛋白溶解酵素之納豆激酶 (Nattokinase)係可自納豆中容易地使用一般生理食鹽水來進行萃取。納豆激酶(Nattokinase)係具有一20,000道耳吞之 20 分子量及一 8.6之等電點。納豆激酶(Nattokinase)不僅能夠分解凝血纖維蛋白’亦能夠分解合成色原體胞聚素基質 (S-2251)。納豆激酶(Nattokinase)於一中性酸驗值係相當安定，且會在被加熱至6〇°C時喪失活性。於4°C將一 1〇倍數量的一般生理食鹽水添加入納豆’然 20 ⑧ 1284537 後分別進行攪拌及離心。由添加8〇%之乙醇來使產生之上清液形成凝膠濾液。濃縮該產生之濾液，然後由冷凍乾燥來製備成一粗製之酵素部分。此製備之粗製酵素部分具有某些具有前驅尿激酶(prowrokinase)活化劑活性之凝血纖 5維蛋白溶解酵素。發現3個或數個活性峰值皆落在分子量 27,000道耳呑。如上文所述，NKCP是一由一獲得自納豆枯草桿菌 (Bacillus subtilis natto)培養產物之凝血纖維蛋白溶解蛋白質所構成的粗製純化產物。此具有水解一離胺酸_χ鍵專一 10 性且係源自納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)之NKCP係包含一預定數量之活性蛋白質，且其分子量及最適酸鹼值是分別為大約34，100道耳呑及9.0。此粗製純化產物會移除該由維生素K及納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)菌體所產生之獨特的發酵納豆氣味。NKCP具有一不同於納豆激 15 酶(Nattokinase)之分子量。

20 下文將論述NKCP之血检溶解及凝血纖維蛋白溶解系統的作用。N K C P被證明具有一能夠於活體外及活體内進行溶解凝血纖維蛋白之作用。此作用係較諸一可商業蹲買之組織胞漿素原活化劑(t-Pa)更為溫和。一由NKCP增加之凝血纖維蛋白溶解活性的作用機制是由直接分解凝血纖維蛋白組成物以及分解胞漿素原活化劑抑制因子1 1，PAM)所引發。 (plasminogen activator inhibition factor NKCP作用機制亦由使用一振蘯黏度計量測發現會導致血液黏度降低。 ⑧ 12,84537 一組織培養及動物試驗顯示出NKCP對凝血性血栓溶解系統之作用的試驗結果。試驗是使用一HUVEC細胞及 U87-MG細胞進行於活體外及原位添加NKCP及不添加 NKCP來比較胞襞素原活化劑抑制因子1 (piasmin〇gen

5 activator inhibition factor 1，PAI-1)的產物數量。由HUVEC 細胞於歷時48小時產生的ΡΑΙ-l總量是700 ng/mL，而一不添加NKCP之PAI-1則增加多達580 ng/mL。於〇小時及24小時皆沒有觀測到任何NKCP對PAI-1數量造成影響。於一 NKCP高濃度（1〇 pg/mL)之完全培養液内， 10 U87-MG細胞的產物數量係於培養全程中皆被完全抑制。就 DMEM培養液而言，ΡΑΙ-l產物亦被完全抑制。當添之完全培養液及DMEM培養液是與那些不添加任何NKCP 者來比較其PAI-1產物時’並沒有觀測到NKCP對HUVEC細胞的影響，而U87-MG細胞會增加低分子量蛋白質。這指出 15 NKCP之凝血纖維蛋白溶解活性是來自分解pAM之胞漿素原活化功能。當NKCP被添加入迅即抽取之血液，然後使用一振盪黏度計量測血液黏度時，可發現血液黏度下降。使用不添加及添加組織胞漿素原活化劑(t_Pa)與添加肝素(heparin)來作 20為對照組樣品，當由振盪黏度計展現之300秒臨床血液試驗時，由添加NKCP並不會發現該非由抗血栓形成活性及胞漿素活性所引發之凝血纖維蛋白溶解活性。一健康成人可於服用250-500毫克之NKCP歷時7天後觀測到血液黏度下降。依照本發明如上文所述，由於上述胺基酸序列是獲得 ⑧ 22

1284537 i I 自一源自納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)之蛋白質，因此本發明係提供一種由使用該源自納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)而如同源自納豆產物之蛋白質來降低血液黏度之新試劑。 5 【圖式簡單說明】第1圖是一血液黏度量測結果之顯示圖；及第2圖是一血液黏度量測結果之顯示圖。【主要元件符號說明】 (無）

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Claims

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十、申請專利範圍： 1· 一種血液黏度降低劑，其特徵是主要由一源自納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis natto)之蛋白質所構成，且係依序由一胺基基團端部開始而包含：一具有下列胺基酸之第一結構胺基酸序列：丙胺酸 (ala)、蘇胺酸(thr)、天冬胺酸(asp)、甘胺酸(gly)、纈胺酸(val)、麩胺酸(giu)、色胺酸(师）、天冬醯胺酸(asn)、纈胺酸(val)、天冬胺酸(asp)、麩醯胺酸(gin)、異白胺酸 (ile)、天冬胺酸(asp)、丙胺酸(ala)、脯胺酸(pr〇)、離胺酸(lys)、丙胺酸(ala)、色胺酸(trp)、丙胺酸(da)、白胺酸(leu)、甘胺酸(gly)、酪胺酸(tyl·)、天冬胺酸(asp)、甘胺酸(gly)、蘇胺酸(thr)、甘胺酸(gly)、蘇胺酸(thr)、纈胺酸(val)、纈胺酸(val)、丙胺酸(ala)、絲胺酸(ser)、異白胺酸(ile)、天冬胺酸(asp)、蘇胺酸(thr)、甘胺酸(gly) 、纈胺酸(val)、麩胺酸(glu)、色胺酸(trp)、天冬醢胺酸 (asn)、組胺酸(his)、脯胺酸(pro)、丙胺酸(ala)、白胺酸 (leu)、離胺酸(lys)、麩胺酸(glu)、離胺酸(iys)、酪胺酸 (tyr)、精胺酸(arg)、甘胺酸(gly)、酪胺酸(tyr)、天冬醯胺酸(asn)、脯胺酸(pro)、麩胺酸(gh^、天冬醯胺酸(asn) 、脯胺酸(pro)、天冬酿胺酸(asn)、麵胺酸(glu)、脯胺酸 (pro)、麩胺酸(glu)、天冬醯胺酸(asn)、麩胺酸(glu)、甲硫胺酸(met)、天冬酿胺酸(asn)、色胺酸(trp)、赂胺酸(tyr) 、天冬胺酸(asp)、丙胺酸(ala)、纈胺酸(vai)、丙胺酸(ala) 、甘胺酸(gly)、麩胺酸(glu)、丙胺酸(aia)、絲胺酸(ser) ⑧ 、脯胺酸(pro)、酪胺酸(tyr)、天冬胺酸(asp)、天冬胺酸 (asp)、白胺酸(ieu)、丙胺酸(aia)、組胺酸(⑽）、甘胺酸 (gly)、蘇胺酸(thr)、組胺酸(his)、纈胺酸(val)、及蘇胺酸(thr)，一具有下列胺基酸之第二結構胺基酸序列：丙胺酸 (ala)、本丙胺酸(phe)、絲胺酸(ser)、麩胺酸(giu)、天冬胺酸(asp)、甘胺酸(gly)、甘胺酸(gly)、蘇胺酸恤）、天冬胺酸(asp)、丙胺酸(ala)、天冬胺酸(asp)、異白胺酸、白胺酸(leu)、麩胺酸(giu)、丙胺酸(aia)、甘胺酸(gly)、麩胺酸(glu)、色胺酸(trp)、綠胺酸(vai)、及白胺酸(⑻），一具有下列胺基酸之第三結構胺基酸序列：天冬胺酸(asp)、丙胺酸(aia)、麩胺酸(glu)、甘胺酸(gly)、天冬醯胺酸(asn)、脯胺酸(pro)、組胺酸(his)、脯胺酸(pr〇) 、麩胺酸(glu)、曱硫胺酸(met)、丙胺酸(da)、脯胺酸(pr〇) 、天冬胺酸(asp)、及纈胺酸(val)，以及具有下列知基酸之第四結構胺基酸序列：顯胺酸 (val)、脯胺酸(pro)、甘胺酸(gly)、麵醯胺酸、丙胺酸(ala)、酪胺酸(tyr)、麩胺酸(glu)、天冬胺酸(asp)、甘胺酉文(gly)、色胺酸(trp)、及天冬胺酸(aSp)，藉此可降低全血液之黏度。如申請專利範圍第1項之血液黏度降低劑，其中該源自納豆枯草才干細（Bacillus subtilis natto)之蛋白質係主要是由-黃豆蛋白質發酵物所構成，該發酵物是藉由從包含由育丑所獲得之黃且蛋白質的納豆枯草桿菌伽别仍 1284537 subtilis natto)液體培養液中，移除納豆枯草桿菌 (Bacillus subtilis natto)菌體及低分子量組份來獲得，且該低分子量組份係具有分子量低於納豆枯草桿菌 (Bacillus subtilis natto)所製造之酵素的分子量。 5 3.如申請專利範圍第2項之血液黏度降低劑，其中該低分子量組份是由超過濾、(ultrafiltration)來予以移除。

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