TWI248359B - Food materials for metabolic bone diseases - Google Patents

Description

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 技術領域 本發明係關於以骨質祕症爲代表之代謝性骨疾病用、 醫藥及飲食品。 々 先前技術 骨爲身體之支持組織，同時爲鈣及磷等各種礦物質之貯 藏庫，再者，其亦爲擔任體液之礦物質調節機構之重要2 織。在該骨組織中，骨形成及骨吸收經常活潑地進行，以 將舊骨換成新骨。尤其在成長終止之骨中，骨形成系之骨 芽細胞與骨吸收系之破骨細胞彼此密切相關；爲了維持4 組織以及將體液之礦物質保持恆定，反覆進行骨吸收及骨 形成。孩骨之再構築被稱爲骨之再塑造。該骨之再塑造， 藉著物理因子、激素及細胞激素等，精密地調節及保持一 足平衡。但是，若該平衡崩潰，骨吸收超過骨形成，則骨 量將減少。此種骨量減少之疾病中，骨成分正常者被稱爲 骨質疏鬆症。 已知骨質疏鬆症爲隨著高齡化之進展，數目增加最多的 健康障害之一，停經後之婦女尤常發生。骨質疏鬆症，易 引起大腿骨頸部骨折，同時常發生腦血管障害，爲造成 「只能臥床老人」之主要原因，社會負擔大。因此，對於 骨質疏鬆症進行適當的治療，同時預防其惡化及確立有效 的預防方法在社會上被強烈的需求。至目前爲止，做爲抗 骨質疏鬆症藥劑之維生素D製劑、降血鈣素（⑹也⑽⑻製 劑及貳膦酸鹽製劑已被開發及被應用於臨床。但是，目前 特效藥之開發尚未達成。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐） I MB· ^ MB Μ* UMII i mb (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 1248359

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 如上述，於骨質疏鬆症之充分治療法尚未被確立之現 在，預防最爲重要。理論上，若將青年期及壯年期之骨量 f可能提@並長期維持如此，以及於停經後能略微抑制骨 量之減少’則到了高齡期也可能保持高骨量。爲此，雖钬 在小兒期、青年期及壯年期連續攝取適當量㈣不可欠 缺，但只攝取㉟尚^充分。所以，若有具㈣或改善骨質 疏鬆症作用之食品材料，則藉著將其添加至日常攝取之食 品中，可以期待在日常飲食生活之中預防或改善骨質疏鬆 症。又’若鑑定及分離出該食品材料中之有效成分，將可 期待以其做爲骨質疏鬆症之預防或治療藥。 公知做爲血液凝固因子之維生素κ與骨代謝之關係已被 明瞭且焚到汪目。所以在日纟，維生素製劑係以做爲 骨質疏鬆症之骨量及疼痛之改善藥而被販售。又，含有維 生素1或維生素Κ2之食品材料亦被投入市場。 因此，本發明之課題爲提供一種在代謝性骨疾病（尤其 疋骨質疏鬆症）之預防及改善上有用之新穎食品材料。本 發明之另一課題爲提供一種在代謝性骨疾病之預防及治療 上有用之醫藥。 發明之揭示 本發明者’爲解決上述課題，廣泛檢索食品材料並進行 研％之結果，發現若口服丙酸菌及乳酸菌之培養物，將能 知:南骨里及骨強度。繼而發現含有效量之該培養物之食品 在預防或改善以骨質疏鬆症爲代表之代謝性骨疾病上有 效。再者，發現該培養物所含之2_胺基_3_竣基β1，4_萘酉昆 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） >裝--------訂— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248359 A7 _B7__ 五、發明說明（3 ) 及其類似物一方面具有促進骨芽細胞分化及機能表現之作 用，另一方面具有抑制破骨細胞形成之作用，以及發現此 等化合物可以作爲代謝性骨疾病之預防治療藥。 亦即，本發明係關於： (1) 一種具骨形成促進機能之飲食品，其含有丙酸菌及/或 乳酸菌之培養物（以下被稱爲「發酵產物」；又丙酸菌培 養物被稱爲「BGS」）以做爲有效成分。 (2) 在（1)之飲食品中，該培養物爲培養上清液及/或菌體。 (3) 在⑴之飲食品中，該有效成分爲2-胺基-3-羧基-1，4-莕 醌（以下被稱爲「ACNQ」）。 (4) 在（1)之飲食品中，該丙酸菌爲費氏丙酸桿菌 (Propionibacterium freudenreichii) 〇 (5) 在（1)之飲食品中，該乳酸菌爲乳酸乳球菌乳酸亞種 (Lactococcus lactis subsp. lactis) 0 (6) —種丙酸菌及/或乳酸菌培養物之用途，其係用於製造 具骨形成促機能之飲食品。 (7) 在（6)之用途中，該培養物爲培養上清液及/或菌體。 (8) 在（6)之用途中，該丙酸菌爲費氏丙酸桿菌 (Propionibacterium freudenreichii)。 (9) 在（6)之用途中，該乳酸菌爲乳酸乳球菌乳酸亞種 (Lactococcus lactis subsp. lactis) 0 (10) —種代謝性骨疾病之預防治療藥，其以選自2-胺基-3-羧基-1，4·莕醌、1，4-茬醌、2-羥基-1,4-莕醌、2,3-二氯-1，4_莕醌、5_羥基-1，4_莕醌、8_羥基_1，4·莕醌、2_(α·羥 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •Ί · 1Τ---------線%. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248359 A7 __________B7 五、發明說明（4 ) 基-δ_甲基戊烯基）_5,8_二羥基]，4_莕醌以及其鹽所組成族 群中之莕醌化合物做爲有效成分。 (11) 在（10)之代謝性骨疾病之預防治療藥中，該莕醌化合 物爲2-胺基-3-羧基-M_萘醌。 (12) 在（10)或（11)之預防治療藥中，該代謝性骨疾病爲骨質 疏鬆症。 (13) 種奈化合物之用途，其係用於製造代謝性骨疾病 之預防治療用醫藥’其中該莕酿化合物選自胺基叛 基-M-#醌、1，‘莕醌、2_荛基_M_莕醌、2，夂二氯 茬醌、5-羥基_1，4-萘醌、8_羥基{4-蓁醌、2_(α-羥基各 甲基戊烯基）-5,8-二羥基-ΐ，4-莕醌以及其鹽所組成之族 群。 (14) 在（13)之用途中，該莕g昆化合物爲2-胺基_3_叛基义‘ 萘醌。 (15) 在（13)之用途中，該代謝性骨疾病爲骨質疏鬆症。 (16) —種代謝性骨疾病之治療方法，其特徵爲投與2_胺基_ 3-羧基-I，4-萘醌、1，4-萘醌、2_羥基-1，4_萘醌、2,3-二氯· M-莕醌、5-羥基+4·莕醌、8_羥基-l，4-莕醌、羥 基-δ-甲基戊烯基）_5,8_二羥基-1,4-萘醌以及其鹽。 (17) 在（16)之治療方法中，該签g昆化合物爲2 _胺基_ 3 -羧 基-1,4-¾:醌。 (18) 在（16)之治療方法中，該代謝性骨疾病爲骨質疏鬆 症。 圖式之簡單説明 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —裝--------訂--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -l· Π48359 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 '—---- ---B7 _ 五、發明說明 177 —〜 圖1係顯示使SD家鼠自由攝取含2%或10% BGS粉末之 精製飼料4星期後，SD家鼠之脛骨骨密度（mg/cm2)之圖； 圖2係顯示該家鼠之大腿骨斷裂能量（mJ)之圖；圖3係顯 不琢家鼠之大腿骨乾燥重量中之鈣量（mg/g)。在圖U 中’長條圖表示平均値土標準偏差（p<〇 〇5)。 圖4係表示將小鼠ST_2細胞於各種濃度之acnq存在下 培養3日後，該細胞之鹼性磷酸酶活性；圖5係表示藉著 該細胞之MTT測定所得之活細胞數（以595 nm之吸光度表 示）〇 圖6係顯示在人類骨芽細胞中，活性型維生素 D3、維生素K2、ACNQ、以及活性型維生素D3與ACNQ之 組合對於鈣蓄積之影響之圖。 圖7係顯示在人類骨芽細胞（SaM-Ι)中，活性型維生素 D3、維生素K2、ACNQ、以及活性型維生素D3與ACNQ之 組合對於磷蓄積之影響之圖。 圖8係顯示在人類骨芽細胞（SaM-Ι)中，活性型維生素 D3、維生素K2、ACNQ、以及活性型維生素D3與ACNQ之 組合之細胞毒性之圖。 圖9係顯示在人類骨聽細胞（SaM-Ι)培養物中，ACNQ以 及維生素D3對於TRAP陽性多核細胞之影響。 圖10顯示來自ddY小鼠新生兒之頭蓋骨之骨芽細胞樣間 質細胞與來自相同小鼠之骨髓細胞於存在活性型維生素D3 或ACNQ下共培養之場合對於破骨細胞形成之影響。 圖11顯示來自ddY小鼠新生兒之頭蓋骨之骨芽細胞樣間 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------訂---------. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1248359 A7 B7 五、發明說明（6 ) 質細胞與來自相同小鼠之骨髓細胞於存在ACNQ下共培養 之場合，破骨細胞之活性。 實施發明之最佳形態 在本發明之醫藥及飲食品中，可以使用上述莕醌化合 物、丙酸菌培養物及乳酸菌培養物中之任一種。其中，上 述莕自昆化合物之中’以2-胺基-3-瘦基-1，4-莕醜（ACNQ)爲 特佳。已知該 ACNQ得自例如丙酸样菌（屬於 Propionibacterium屬之微生物）之培養物（特開平07-227207 號，特開平07-289273號、特開平10-304871號）。再者， ACNQ以外之蓁·化合物亦可從丙酸菌之培養物獲得（特開 平08-98677號）。此等莕醌化合物以及丙酸菌培養物雖已 知有雙歧菌之增殖活性，但完全不知道對於代謝性骨疾病 有作用。 做爲丙酸菌者’例如有費氏丙酸样菌(Propionibacterium freudenreichii)、特氏丙酸样菌(P. thoenii)、丙酸丙酸桿菌 (P.acidipropionici)、詹氏丙酸桿菌(P. iensenii^，貪婪丙酸样 菌(R avidum)、痤瘡丙酸样菌(P.acnes)、嗜淋巴丙酸捍菌（已 lvmphophilum、、顆粒丙酸桿菌(P· granulosam、。做爲費氏丙 酸桿菌 fPropionibacterium freudenreichiil 者，例如有費氏丙酸 桿菌IFO 12424或費氏丙酸桿菌ATCC 6207。 做爲乳酸菌者，例如有乳桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌 屬、明串珠菌屬（Leuconostoc)之細菌。爲乳样菌屬者例如 有嗜酸乳样菌（Lb. acidophilus)、德氏乳桿菌保加利亞亞種 (Lb· delbrueckii subsp· bulgalicus);爲鏈球菌屬者例如有嗜熱 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -. ^ ·£ν 丨！丨丨丨訂-丨------. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248359 A7 _B7__ 五、發明說明（7 ) 鏈球菌（Str. thermophilus);爲乳球菌屬例如有乳酸乳球菌 克里默亞種（Lc. lactis subsp. cremoris)及乳酸乳球菌乳酸亞 種（Lc. lactis subsp. lactis);爲明串珠菌屬者例如有腸膜明串 珠菌克里默亞種（Leuc. mesenteroides subsp. cremoris)及乳酸 明串珠菌（Leu. lactis)。 丙酸菌或乳酸菌之培養物藉公知之手段得到。舉例言 之，以高濃度培養丙酸菌之方法，例如有在乳清蛋白質 (WPC)或其酵素分解物中添加礦物質及單糖所得之培養基 中培養丙酸菌之方法（特開平10-304871號公報）。以高效 率培養丙酸菌之方法，例如有將雙歧菌及丙酸菌在不同的 培養槽中使培養液循環之培養方法（特開平8-66178號公 報）。此等培養方法可被用於實施本發明。再者，本技藝 人士，爲了將此等公知之方法最適化，可以變更培養基組 成及培養條件等（例如溶解之氧濃度等）。舉例言之，關於 氮源，除了乳酪蛋白質及乳清蛋白質之外，可以進行各種 胺基酸添加效果之檢討以及培養條件（厭氧培養及喜氧培 養）之檢討，以達到最適化（菌體增加以及BGS之骨代謝活 性提高）。因此，此等變更方法亦被包含在本發明之中。 BGS之雙歧菌增殖活性存在於除去培養物菌體所得之濾 過物中以及菌體之甲醇萃取物中（Kaneko，T. et al.:J. Dairy Sci.，77:393-404, 1944)。骨代謝活性則被認爲包含在培養上 清液及菌體二者之中。因此，本發明之「BGS」包含丙酸 菌及/或乳酸菌本身及/或處理物。做爲該處理物者，包含 培養上清液、培養物之過濾物、菌體及其之萃取物、除去 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一I· -------訂---------. 1248359 A7 B7 五、發明說明（8 ) 菌把之培養物、其之乾燥物以及其之稀釋物等。 之加工形悲大致分爲粉末狀及液狀兩類。關於粉末 狀和做爲賦形劑t脱脂奶粉或奶粉、生殿粉或糊精等直 接添加至培養液中，將培養固形份調整至30〜40重量= 後，噴霧乾燥，·或者將培養液與賦形劑之還原液混合，將 固形份濃縮成30〜40重量％後，喷霧乾燥。充填時藉著脱 氧處理（封入氮氣及添加脱氧劑）可以長期保存。做爲賦形 劑者，了上述者以外，需要時可以使用wpc、彻、加 工澱粉(除了糊精之外，尚有可溶性澱粉、氧化澱粉、殿 粉酉旨類、殿粉醚類等）。又，亦可以加工成便於使用於食 品之倍散型製劑（例如〇·2%倍散劑）。 另一方面，㈣化合物可從丙酸菌之培養物萃取出及精 製而獲得（特開平07_2贿3號）。會產生含審酿化合物之 發酵產物之微生物，除了丙酸菌之外，尚有普通擬桿菌 '脆弱擬捍菌 mact— ί» ATCC 23745 等 屬，以及 ^^科、 科、数杯I科、羞球菌科、腸桿菌科等。 又，萘醌化合物亦可藉化學合成得到，舉例言之， CNQ可用市售之1，4_ 一备基奈酸爲原科，以4段步驟製 得（特開平10-36328號）。 做局奈醌化合物之鹽者，例如爲藥學或食品學容許之 鹽，其之代表性鹽包括乙酸鹽、苯磺酸鹽、安息香酸鹽、 碳酸氫鹽、乳酸鹽及檸檬酸鹽等，不過此等鹽^爲例示， 本發明不限於此等鹽。 • 11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公董） 1248359 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（9 7 在本發明中所用之莕醌化合物， 與 右存在立體異構體或光 予"構肢，此等異構體皆可被用於本發明中。 〃上述㈣化合物及培養物可以促進骨芽細胞之驗性辨酸 轉（ALP)活性，該活性爲骨形成之指標；$ 一方面，雖铁 该奈醒化合物及培養物不會抑制象牙片上破骨細胞造成之 吸收葛之形成，因而不會阻礙破骨細胞活性，對於破骨細 胞未顯示細胞毒性，但會濃度依存性地抑制破骨細胞之分 匕房導#即，此等奈酿化合物及培養物同時具有骨形成 促進作用及骨吸收抑制作用，能使骨代謝保持平衡，因而 可做爲極獨特之代謝性骨疾病之預防治療藥，或者代謝性 骨疾病之預防改善用飲食品。 用試管内評價系統及活體内評價系統調查BGs及acnq 在骨代謝方面，亦即骨形成及骨吸收方面之作用之結果被 述於下文。 β 在BGS之活體内評價系統中，$ 口服聰，大腿骨及腔 骨之骨密度，大腿骨斷裂能量以及大腿骨之，與對照 群相較有意義地增加。亦即在活體實驗中顯示藉著口服 BGS，骨量及骨強度有意義地增強（圖i ，2及3)。所 以，爲了分析BGS之該骨形成促進作用，調查爲雙歧菌: 增殖活性成分之ACNQ在試管實驗中對於骨代謝之影響。 骨由骨芽細胞等骨形成系細胞、破骨細胞等骨吸收系細 胞、以及各種間質細胞（纖維芽細胞、脂肪細胞、細網細 胞）及造血細胞構成，此等細胞高度聯合形成網狀鲈構而 構築成骨組織。 θ -12 - ‘紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------訂-------->^wi. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248359 A7 _B7__ 五、發明說明（10 ) 首先調查ACNQ對於骨形成之影響。在骨形成上扮演主 要角色者爲骨芽細胞。在成長後之骨中，於破骨細胞所造 成之骨吸收窩中，骨芽細胞被動員，而開始進行骨形成以 填補被吸收之骨。在骨芽細胞活潑增殖之同時，骨芽細胞 被分化。繼而，隨著分化進展而成熟之骨芽細胞使得形成 的骨基質石灰化，於是骨形成完成。做爲骨芽細胞分化之 指標者，除了各種基質蛋白質之合成之外，以鹼性磷酸酶 (ALP)之表現及活性上升最爲重要。 接著，將爲骨髓基質（stroma)細胞之細胞株之ST-2在添 加ACNQ之培養基中培養，然後測定爲骨芽細胞分化之指 標之ALP活性。ACNQ在濃度至1 pg/ml下，會濃度依存性 地促進骨芽細胞形成（圖4 )。亦即，ACNQ會濃度依存性 地促進骨髓基質細胞分化成骨芽細胞。再者，ACNQ在濃 度至1 pg/ml下，未顯示細胞毒性（圖5 )。 雖然ALP活性與石灰化之關係尚不明確，但由於ALP若 有遺傳上之缺陷，將會引起骨骼發育之異常，所以暗示該 酵素扮有重要的角色。ALP活性之上升被認爲會促進骨芽 細胞之石灰化。所以ACNQ之骨形成作用藉人類骨芽細胞 (SaM-Ι)之石灰化促進作用評價。已知SaM-Ι保持骨芽細胞 之全部特徵，於2 mM α-甘油磷酸存在下，依存於 la，25(OH)2D3 (活性型維生素D3)之濃度而進行石灰化（Kos hihara，Y.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 145:651-657, 1987)。所以於各種濃度之ACNQ存在下，培養SaM-1以及 測定蓄積在母質上之鈣量及磷量。ACNQ在1(Τ5Μ〜1(Γ7 Μ -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tr---------. 1248359 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（U ) 下，會濃度依存性地促進石灰化（圖6及7)。另一方面， ACNQ在10 5M〜1〇-7 ]V[下，由測定培養液中之游離LDH之 結果可知，未顯示細胞毒性。 從以上結果可以明白ACNQ在所謂1(T51V[〜1(Γ7Μ之極低 濃度下能夠促進骨形成，而且在該濃度下未顯示細胞毒 性。 接下來調查ACNQ對於骨吸收之影響。破骨細胞，爲來 自巨噬細胞系之造血細胞在骨組織特有之環境下，藉著骨 吸收因子之刺激而形成之骨吸收系細胞。藉著在試管中， 使存在於骨髓之破骨細胞前驅細胞形成破骨細胞，可以解 析其之機能。關於形成破骨細胞之培養系統，可以使用骨 髓細胞培養、骨髓細胞與骨芽細胞之共存培養、脾細胞與 骨芽細胞之共存培養等。若骨髓細胞與活性型維生素 一起培養，則將形成爲酒石酸耐性酸性磷酸酶（TRAp)陽性 之多核破骨細胞，其中TRAP爲破骨細胞之識別酵素。 所以，將人類單核細胞於存在活性型維生素d3及acnq 下培養，以調查ACNQ對於活性型維生素〇3造成之TRAp 陽性多核破骨細胞形成之影響。ACNQ在ΐ(Τ8Μ〜10-5μ 下，會濃度依存性地抑制破骨細胞形成（圖9 )。該抑制作 用與同濃度維生素&之作用相比顯著較強。 再者，調查將來自小鼠新生兒之頭蓋骨之初代骨芽細胞 樣間質細胞與小鼠之骨髓細胞共存培養所形成之TRAp陽 性細胞。ACNQ於1·5 pg/ml以上時，會顯著抑制破骨細胞 形成（圖10)。又調查ACNQ對於骨吸收系活性之影響。測 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂--— II--- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248359 A7

定如上述藉著將小鼠之初代骨芽細胞樣間質細胞與小鼠之 骨髓細胞共存培養而得之破骨細胞形成系在象牙切片上之 吸收窩形成以及細胞毒性。ACNQ不會抑制已分化·成熟 之破骨細胞之骨吸收活性（圖n)。又ACNQ對於破骨細胞 未顯示毒性（圖11 )。此點顯示ACNq對於已分化·成熟之 破骨細胞，不會損傷其之機能。 從以上結果可以明白BGS，若經口攝取，顯示同時具有 增加骨量及提高骨強度之作用。一方面，被認爲係其之主 要活性成分之一之ACNQ能提高骨芽細胞形成，同時促進 骨形成，另一方面，雖然會抑制破骨細胞之形成，但已形 成之破骨細胞仍具正常機能（即有骨吸收活性），因而bgs 顯示極獨特之骨代謝作用。上述BGS之骨形成活性，雖然 被涊爲係BGS之各種成分之複合作用所造成者，但咸認爲 其之大邵分活性必定是基於含量極微之ACNq之作用。 一般公知做爲血液凝固因子之維生素κ與骨代謝相關之 點已被明瞭且受到注目。維生素Κι及&天然存在。維生 素Ki及K2具有共同的莕g昆主幹，其只是在該主幹之3位 所鍵結之側鏈不同，在i位則皆是與甲基結合。維生素& 雖爲單種化合物，但維生素Κ〕，依據鍵結於3位之異戊 二#之數目，有14個同族體。其中只有異戊二烯單位數 爲4 (香葉基香葉醯基）之維生素1-4會促進骨形成、抑 制骨吸收及抑制骨量之減少。調查維生素Κι或維生素h 之側鏈對骨吸收之影響之結果確認爲維生素Id之側鍵 之香葉基香葉醯基（geranylgeran〇yl)，與維生素Κ〆具相同 -15- 本紙張尺度適用中關家標準（CNS)A4規格咖χ 297公羞） --------

.I. > --------*ir--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1248359 _____ B7 五、發明說明（l3 程度之破骨細胞形成抑制作用。爲維生素K1之侧鏈之葉 綠醇，抑制活性弱；又維生素〖2之異戊二缔單位數爲2〜7 〈側鏈’與其説未顯示抑制作用’不如説是具促進作用 (Hara，K· et al.:Bone，16:179_184, 1995) 〇 本發明之ACNQ，雖然與維生素&及&同樣具有苯醮 2幹，但在該主幹之2位鍵結有胺基而且在3位鍵結有羧 :、。至於是否如上述維生素&及驗，骨代謝活性係依 存於側鏈’咸認爲兩者全然不同。 上迷4醌化合物及培養物可以習用之醫藥組合物形能被 =用。醫藥組合物用藥學上允許之載體（例如充填劑了增 里劑、黏合劑、潤濕劑、崩散劑、表面活性劑、潤滑，等 稀釋劑或賦形劑）調製。該醫藥組合物可根據治療目— 擇適當劑型，此等劑型之代表例如有鍵劑、丸劑、散劑、 液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑、拾劑、注: (液劑、懸浮劑）等。 / Μ 代谢性骨疾病預防治療藥之投與量，雖期望考慮年齡 體重等患者狀態、投與路徑、疾病性令 — 又守而加以設 疋’但通币對於成人而言，萘醌化合物之每日口服劑量一 般在〇·5〜100 mg/kg之範園内。依情況，該劑量以下之=可

能已經足夠；相反地需要時亦可以使用該劑量以上之L 量。又每日劑量可分成2〜4次投與。 投與本發明之醫藥之時，&於舞在骨形成上爲必需者， 可以併用鈣製劑。亦可以併用骨吸收抑制劑，例如2性塑 維生素D2、活性型維生素a、降血鈣素、雌二烯= -16- I. ' 1 — --------tr--------- C請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐 1248359 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（I4 ) iprifurabon(商品名：〇sten)。 代謝性骨疾病之預防或改善用飲食品，從安全性及健康 衛生方面觀之，以使用來自天然物者，尤其是丙酸菌培養 物爲較佳。培養物不僅包含其本身，亦包含其之溶媒萃取 物、其之處理物（例如含菌體之培養液、菌體之萃取物、 培養液之上清液、彼等之濃縮物、乾燥物及稀釋物等）。 、上述莕醌化合物或培養物，爲了製造在促進骨代謝及預 防或改吾θ貝疏鬆症上有用之食品，可以將其之有效量添 加至日^攝取之食品中。做爲添加對象之食品沒有特殊限 疋在日本，其例如可爲被允許標示爲保健用途或限定用 途之特殊用途食品（病患用食品、高齡者用食品、特定保 健用食品）。在外國，其例如可爲被允許標示爲增進健康 之食品。 爲維持食品中有效成分之活性，可以添加安定劑，例如 抗壞血酸鈉等。培養物之添加量雖然係按有效成分之萘醌 化合物心含量計算，但一般可以添加〇 5〜1〇重量❹/❶之培養 物0 本發明之飲食品用組合物，雖然可以單獨使用，但也可 人良P口學上允泎之載體以及一種以上之其他食品營養素 (例如維生素、礦物質及胺基酸等）調配在一起。其中，食 口口予上允許之載體例如有黏合劑、賦形劑、保存劑及著色 劑等。 實施例 在下又中，本發明之特定態樣雖然藉參考例及試驗例説 -17- 木紙張尺度適用中_家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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五、發明說明（I5 明 ，但應當了解本技藝人士可在本發明之範 〜TO固内實篇久轉 各樣之修飾。 員她备《 [參考例1] BGS粉末之製造 將10 w/w%乳清粉還原液用8 N NaOH掘：u 7Π ^ 肝ΡΗ値調整至 0後’將6.79耄克蛋白酶（Amano A，Amarm制·- mnaiio製藥公司出 品）添加至乳清粉中，然後於50乇進行酵素分解2 A。 在反應期間，用8NNaOH將pH値保持在7〇。 ° 式、10分鐘使酵素失活後，冷卻至35 〇C 〇知人战 加入酵母萃取物 01 W/W%，用4 N HC1將pH調整至6·7後，於 — yV ^ L 滅菌 7 分鐘以做爲培養基。 將費氏丙酸桿菌ATCC 6207株（菌株編號爲—例）在預先 製備之TPY培養基（參照特開平7_289273公 /、 A ^公報實施例 1)中靜置培養（37 Ό，3日），將其做爲種菌並以2❶/❶之濃 度植菌於上述培養基中。培養溫度爲35。〇， △ 4 咬酸雀甲 7 ’谷液將pH値保持6.0並培養72小時。又將培養槽之頭 郅空間用氮氣置換並於100-150 rpm檀拌〇左兮植至、 仏必得養液中 添加0.5 w/w%之抗壞血酸鈉後，於121 π殺菌 一 q 1 J V。添加 爲培養液固形份之4倍量之脱脂奶粉並噴霧乾燥。該乾燥 粉末中之ACNQ之含量爲〇·56 pg/g。 ^ [試驗例1] BGS在骨量及骨強度方面之效果 將含有2%或10%參考例1得到之BGS粉末之精製甸料 (依據AIN-93G組成）讓雄性SD家鼠自由攝取4星期。至 於試驗試料之調製，考慮採用來自BGS粉末之蛋白質、乳 糖、鈣、磷、鎂，並將各試驗飼料平準化。對照飼料依照 -18 本紙張尺度國家標準（CNS)A4規格（21〇 χ ^7公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 11111111 %· 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248359 A7 _B7__ 五、發明說明（l6 ) 含20%酪蛋白之AIN-93G組成。 結果，飼育後之體重增加及飼料效率在3群間未觀察到 差異。關於大腿骨與脛骨之乾燥重量在3群間沒有觀察到 差異。骨密度方面，給予10% BGS粉末之群與對照群相 較，顯示有意義之較高値；而給予2% BGS粉末之群與對 照群相較，雖然顯示區別不顯著但有較高値傾向（圖1 )。 大腿骨斷裂能量方面，給予10% BGS粉末之群與對照群及 給予2% BGS粉末之群相較，顯示有意義之較高値；而給 予2% BGS粉末之群與對照群相較，雖然顯示區別不顯著 但有較高値傾向（圖2)。大腿骨鈣量方面，給予10% BGS 粉末之群與對照群相較，顯示有意義之較高値；而給予 2% BGS粉末之群與對照群相較，雖然顯示區別不顯著但 有較高値傾向（圖3 )。 從此等活體内試驗結果可知，BGS經由口服可以提高骨 密度，增強斷裂應力以及提高鈣蓄積。亦即BGS經由口 月良，顯然有促進骨形成以及提高骨量及骨強度之效果。 [試驗例2 ] ACNQ之骨形成促進作用 使用來自小鼠骨髓之基質細胞系ST-2細胞做爲骨芽細 胞（Udagawa，N· et al.:Endocrinology，125:1805-1813，1989)。該 細胞對於骨髓細胞有與骨芽細胞同等之破骨細胞分化謗導 能力。 將細胞以4x 104細胞/凹穴之比率播種於96凹穴平m之各 凹穴中，然後在含有10% FBS 、青黴素G及鏈黴素之 RPMI1640培養基中培養1日。用含ACNQ之相同培養基交 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨：-----.---：-------- --訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1248359 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（17 ) 換培養基，然後再培養3日。培養後，測定細胞之ALP活 性。 將細胞用PBS洗淨後，用乙醇固定1分鐘。加入37 °C之 酵素反應液（含有做爲基質之磷酸對-硝基苯酯，〇·1Μ甘 油，lmMMgCl2 及 0·1 mMZnCl2 之緩衝液，pH 10.5)並於 37 °C反應30分鐘。添加等量之0.05N NaOH並使反應停止。 ALP活性，以每1毫克蛋白質於1分鐘時間生成之對硝基 驗之量（用415 nm之吸光度測定）爲1單位來表示。蛋白質 含量，用蛋白質測定試藥（Bio-Rad Lab.)測定。再者， ACNQ之細胞毒性藉MTT測定法測定（圖5 )。 細胞之ALP活性，在ACNQ之濃度到達1 pg/ml之前，呈 濃度依存性地增加，在ACNQ之濃度接近1 pg/ml時，ALP 活性到達峰値（圖4)。在該ALP活性之峰値濃度時，全然 未見到細胞毒性（圖5 )。 [試驗例3 ] ACNQ之石灰化促進效果 使用骨折手術時得到之20歲男性之長管骨膜建立之培 養骨芽細胞（SaM_l)。該SaM-Ι細胞全然保持骨芽細胞之特 徵（Koshihara，Y. et al·: In Vitro Cell. Dev. Biol·，25:37-43, 1989) 〇 將18PDL (總體雙倍濃度）之SaM-1播種於12凹穴平皿 中，培養至匯合後，添加爲石灰化促進劑之α-甘油嶙酸至 濃度爲2 mM。在該培養系中添加1〇-8Μ至1(Τ9Μ之活性型 維生素D3， 1(Τ5Μ〜10_6Μ之維生素Κ2， 10_5Μ〜10_7Μ之 ACNQ，或者10·9Μ之活性型維生素D3+10_5M〜l〇-6M之 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I „---*—--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1248359

五、發明說明（is 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ACNQ並培養32日。至於對照群，添加爲培養液之〇 1%之 办媒DMSO。培養基每隔工日用含有各個試驗物質之培養 基交換。 ⑴細胞外母質（matrix)中_之測定 細胞外母質中鈣之測定係依據文獻（Anal Bi〇chem， 18·520·531，1967) ’按照鄰甲酚酞胺羧配位劑法（〇Cpc 法）’使用套組（_ c試驗Wako )進行。 培養終了後在漢克氏液中洗淨細胞。添加冷5%過氯酸/ 凹穴’於4 C振搖15分鐘並萃取出。將萃取液25μ1與缓 衝液2.5 ml混合後，加入25〇 μ1顯色液（含有〇Cpc 〇 4 mg/ml 8-峻淋醇）並攪拌，5分鐘後，將該反應液在吸光度 計（570 nm)中測定。 ACNQ於1〇·5Μ〜10·7Μ之範園内，濃度依存性地提高鈣之 沉著量。此顯示ACNQ在低濃度下會促進骨石灰化，在 10_6 Μ下顯示石灰化能力爲供比較之對照維生素Κ2之約2 倍（圖6) 〇 (2)細胞外母質中之磷濃度 細胞外母質中之Ρ之濃度係依照文獻（Anal. Biochem·， 28:1758-1778, 1956)進行。 將0.84%鉬酸銨、2N-硫酸及10%抗壞血酸以3 : 3 : 1 之體和比混合而调製成反應試樂。將上述在Ca測定中萃 取出之萃取液100 μΐ用800 μΐ蒸餾水稀釋後，加入2.1 ml 反應試藥，然後於45 °C培育20分鐘。用水冷卻後，，將 該反應液在吸光度計（570 nm)中測定。 -21- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨： * ： --------tr--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) !248359

五、發明說明（I9 ) ACNQ，與鈣之場合相同，在i〇-5M〜i〇_7M之範園内，濃 度依存性地提高嶙之沉著量（圖7 )。 從以上結果可以確認ACNQ在低濃度領域，具有濃度依 存性的骨石灰化促進作用。 (3) ACNQ之細胞毒性 使用LDH·細胞毒性試驗Wako (細胞毒性測定用套組）測 定培養上清液中之游離LDH，然後調查ACNQ之細胞毒 性。培養32日後採取目標培養上清液，顯色反應後用微 量平皿讀數器（54〇 nm)測定LDH。 結果，ACNQ，在1(Τ5Μ〜1(Γ7Μ之濃度内，與對照群相 車交未見到有思義之差異’因而判斷在該濃度不可能有細胞 母性（圖8 ) 〇 [試驗例4 ] ACNQ之破骨細胞形成抑制作用 (1)將人工骨頭置換手術時得到之人類骨髓細胞進行密度 梯度離心，然後採取單核細胞。將該單核細胞以8x10 5細 胞/凹穴（0.79cm2)之比率播種於含20%馬血清及10-8Μ活 性型維生素D3之α-ΜΕΜ培養基中，並培養17日。培養液 每週交換2次，每次交換1/2。ACNQ之添加於開始時進 行。至培養之第16日進行炭色鏈酶菌蛋白酶/EDTA處理並 除去基質細胞。第二天將細胞用PBS(-)洗淨後，將細胞用 福馬林過滤。將以福馬林固定之細胞進行TRAP染色並計 測各凹穴之TRAP陽性多核細胞數。用維生素κ!做爲對 照。 ACNQ，在1〇_8Μ〜10_5Μ之濃度内，濃度依存性地抑制破 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1111111 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1248359 A7 ___ _______________ B7__ 五、發明說明（20 ) 骨細胞形成。 (2)將ddY小鼠新生兒之頭蓋骨予以酵素處理（膠原酶與 dyspase之混合溶液）而得到初代骨芽細胞樣間質細胞。另 一方面從相同小鼠（6〜9週齡）之大腿骨及脛骨單離骨髓細 胞。將初代骨芽細胞樣間質細胞與骨髓細胞於存在ACNQ 下共存培養，然後調查ACNQ對破骨細胞之分化謗導作 用。 初代骨芽細胞樣間質細胞與骨聽細胞以大約1 : 2〇之 比率之細胞數，在添加10% FBS之α-ΜΕΜ中，於存在 10_8M〜ΙΟ’Μ之活性型維生素D3下，共存培養6〜8日。在 培養期間，將各種濃度之ACNQ或者已知會抑制破骨細胞 形成而做爲供比較之對照群之維生素K2添加至交換之培 養基中（每隔2日交換一次培養基，每次交換半量之培養 基）。 以TRAP染色時爲陽性之細胞且分化成細胞内之核數爲 3以上之細胞爲破骨細胞。TRAP染色液，在即將使用 前，將受質（莕酚AS-MX磷酸）5 mg及色素（快速紫紅LB 鹽）25 mg溶解於約0.5 ml之Ν，Ν·二甲基甲醯胺，然後在 其中添加含50 mM酒石酸鈉之0.1Μ乙酸鈉緩衝液（pH 5.0) 50 ml並調製。除去培養細胞之培養基後在PBS中洗淨， 用含10%福馬林之PBS固定5分鐘，然後用1 : 1之乙 醇·丙酮再固定1分鐘。風乾後，於室溫，在TRAP染色 液中使之反應10〜15分鐘，然後水洗及乾燥。鏡檢此等細 胞並計測破骨細胞數。ACNQ會濃度依存性地抑制存在於 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I .--I ^----------^--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1248359 五、發明說明（21 ) 骨髓細胞中之單核細胞分化成破骨細胞（圖10)。 [試驗例5 ] ACNQ對於骨吸收之影響 凋查ACNQ對於在象牙切片上破骨細胞造成之吸收窩形 成之影響。 與試驗例4之（2)同樣，將來自ddY小鼠新生兒之頭蓋骨 之初代骨芽細胞樣間質細胞以及從相同小鼠（6〜9週齡）之 大腿骨及脛骨單離得之骨髓細胞，在20 ml之100 mm皿 中’以lxlO6細胞：lxl〇7細胞之比率，在添加1〇0/〇 Fbs及 10 Μ維生素D3之α·ΜΕΜ培養基中，共存培養6〜8日。每 2日交換培養基一次。培養後，加入〇 2%膠原酶溶液，於 37 °C振搖20分鐘以消化膠原凝膠，然後回收已被分化之 破骨細胞樣多核細胞。用該方法所得到之破骨細胞數最大 爲4x104細胞/ 100 mm皿。 將該破骨細胞樣多核細胞在添加10% FBS之α-ΜΕΜ培 養基中調製成濃度爲4xl〇3細胞/ml，然後以1〇〇 μι /凹穴之 比率播種至放入象牙切片之凹穴（96凹穴）中，並於37 培養2小時。培養後，移至每凹穴裝入〇·5〜10毫升培養基 之24或48凹穴皿中。同時將各種濃度之ACnq添加至各 凹穴中並於37 °C培養24小時。培養後，除去培養基，將 象牙切片在梅爾公司之酸性礬紫（hemalum)染色液中短時間 染色。除去染色液後，在顯微鏡下計算經由骨芽細胞之貪 食所形成之象牙質切片表面之吸收窩之數目。結果以對照 群（未添加ACNQ )之吸收窩數當做100%時各群之吸收窩數 (%)表示。ACNQ即使在最高濃度（7.5 pg/ml)下，也不會使 破骨細胞之吸收活性降低（圖11 )。此表示ACNQ不會抑制 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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疾病 1248359 五、發明說明（22 ) 分化·成熟之破骨細胞之骨吸收活性，其對破骨細胞亦未 顯示細胞毒性。 產業上之利用可能性 本發明之丙酸菌及/或乳酸菌之培養物可以添加至食品 中，然後藉著攝取該食品，可以期待能預防或改善代謝性 骨疾病，尤其是骨質疏鬆症。又，該培養物中所本、 基-3·羧基·1，4_蒸自昆及蓁臟之衍生物可做爲代謝 I玍骨 之預防治療藥。 ------*—ί.—--------訂--------- (請先閲讀背面之>i意事項再填寫本貢) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

12483^^121955號專利申請案..41— 中文申請專利_圜_本(94年9月） §| δ 六、申請專利ΐέϋ—. ‘…·一·——- 1. 一種具骨形成促進機能之飲食品組合物，其含有選自 費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、特氏丙 酸桿菌(T· thoenii)、丙酸丙酸桿菌(P.acidipropionici)、詹 氏丙酸桿菌(P. iensenii)，貪婪丙酸桿菌(P. avidum)、痤 瘡丙酸桿菌(P.acnes)、嗜淋巴丙酸桿菌（已 lvmphophilum)、顆粒丙酸桿菌(P. granulosam)之產生 2 -胺基-3-羧基_1，4·莕醌之丙酸菌，及/或選自屬於乳桿菌 屬（lactobacillus )、鏈球菌屬（Streptcoccus )、乳球菌屬 (Lactococcus)、明串珠菌屬（Leuconostoc)細菌之產生2 -胺基-3-羧基-1，4-蓁醌之乳酸菌之培養物上清液及/或菌 體以作為有效成分。 2·如申請專利範圍第1項之飲食品組合物，其中該有效 成分為2-胺基-3-羧基-1,4-莕醌。 3·如申請專利範圍第1項之飲食品組合物，其中該丙酸 菌為費氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii) 〇 4.如申請專利範圍第1項之飲食品組合物，其中該乳酸 菌為乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis subsp. lactis) 〇 5· —種具骨形成促進機能之飲食品組合物之製造方法， 其係培養選自費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii^)、特氏丙酸桿菌(P. thoenii)、丙酸丙酸桿 菌(P.acidiDropionici)、詹氏丙酸桿菌(P. iensenii)，貪婪 丙酸桿菌(P. avidum)、痤瘡丙酸桿菌(P>acnes)、嗜淋巴 丙酸桿菌(P. lymphophilum)、顆粒丙酸桿菌(P. granulosam) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝 玎 # 1248359 έ88 C8 D8 六、申請專利範圍 之產生2-胺基-3-羧基-1,4-莕醌之丙酸菌及/或選自屬 於乳桿菌屬（lactobacillus )、鏈球菌屬（Streptcoccus )、乳 球菌屬（Lactococcus)、明串珠菌屬（Leuconostoc)細菌之 產生2-胺基-3-羧基-1，4-莕醌之乳酸菌後，將其培養物 添加於飲食品者。 6. 如申請專利範圍第5項之製造方法，其中該培養物為 培養上清液及/或菌體。 7. 如申請專利範圍第5項之製造方法，其中該丙酸菌為 費氏丙酸桿菌。 8. 如申請專利範圍第5項之製造方法，其中該乳酸菌為 乳酸乳球菌乳酸亞種。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)