KR100898756B1

KR100898756B1 - 대사성 골질환의 예방 및 개선에 유용한 식품 소재 및 이소재의 유효 성분으로 이루어진 대사성 골질환의 예방치료약

Info

Publication number: KR100898756B1
Application number: KR1020027004619A
Authority: KR
Inventors: 나가이카즈오; 우제태; 사토요시로; 하시모토코우이치로; 타케토모나오키; 요다노부오; 츠시다히로시
Original assignee: 메이지 데어리즈 코포레이션
Priority date: 1999-10-19
Filing date: 2000-10-18
Publication date: 2009-05-25
Also published as: TWI243673B; WO2001028547A1; US20060093651A1; EP1230920A1; EP1230920A4; ATE333272T1; KR20070011621A; KR20020048959A; KR100866008B1; CN1187043C; EP1230920B1; TW200509888A; AU7947300A; CN1382043A; TWI248359B; CA2388243C; AU780598B2; CA2388243A1; JP4750991B2; DE60029469T2

Abstract

본 발명은 유효성분으로서 2-아미노-3-카르복시-1,4-나프토퀴논을 함유하는 프로피온산균 및/또는 유산균의 배양물의 유효량을 첨가한 골형성 기능을 갖는 음식물; 및 2-아미노-3-카르복시-1,4-나프토퀴논, 1,4-나프토퀴논, 2-히드록시-1,4-나프토퀴논, 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논, 5-히드록시-1,4-나프토퀴논, 8-히드록시-1,4-나프토퀴논, 2-(α-히드록시-δ-메틸펜테닐)-5,8-디히드록시-1,4-나프토퀴논 및 이들 염으로 이루어진 군에서 선택된 나프토퀴논 화합물을 유효성분으로 하는 대사성 골질환의 예방 치료약에 관한다. 이 배양물 및 나프토퀴논 화합물은 골대사를 촉진하고, 골량 및 골강도를 높인다.

Description

대사성 골질환의 예방 및 개선에 유용한 식품 소재 및 이 소재의 유효 성분으로 이루어진 대사성 골질환의 예방 치료약 {FOOD MATERIALS USEFUL IN PREVENTING AND AMELIORATING METABOLIC BONE DISEASES AND PREVENTIVES/REMEDIES FOR METABOLIC BONE DISEASES COMPRISING THESE MATERIALS}

본 발명은 골조송증으로 대표되는 대사성 골질환의 예방 및 개선에 유용한 음식품 및 예방 치료용 의약에 관한 것이다.

뼈는 생체의 지지조직임과 동시에 칼슘이나 인 등 각종 미네랄의 저장고로서, 더욱이 체액의 미네랄 조절 기구도 담당하고 있는 중요한 조직이다. 이 골조직에서는 골형성과 골흡수가 항상 활발하게 행하여지며, 낡은 뼈가 새로운 뼈로 치환되고 있다. 특히 성장이 끝난 뼈에서는, 골형성계의 골아세포와 골흡수계의 파골세포가 밀접하게 서로 관련하여 골조직의 유지와 체액의 미네랄을 일정하게 보유하기 위하여 골흡수와 골형성을 반복하고 있다. 이 뼈의 재구축을 "뼈의 리모델링"이라 부른다. 이 뼈의 리모델링은 물리적 인자, 호르몬, 사이토카인 등에 의해 정밀하게 일정 밸런스를 유지하여 조절되고 있다. 그러나, 이 밸런스가 무너져 골흡수가 골 형성을 상회하면 뼈의 양이 감소한다. 이 병적 뼈의 양의 감소 중에서 골성분이 정상적인 것을 골조송증이라고 한다.

골조송증은 고령화의 진전과 함께 가장 그 수가 증대하고 있는 건강 장해의 하나이며, 특히, 폐경후의 여성에게 많은 것은 잘 알려져 있다. 골조송증은 대퇴골 경부 골절을 일으키기 쉽고, 뇌혈관 장해와 함께 많은 "와병생활 노인"을 만드는 요인으로 되고 있으며, 사회적 부담이 크다. 따라서, 골조송증에 대해서 적절한 치료를 행하여, 악화를 예방함과 동시에 유효한 예방 방법을 확립하는 것이 사회적으로 강력하게 요구되고 있다. 현재까지 골조송증에 대한 약제로서 비타민 D제제, 칼시토닌 제제, 비스포스포네이트 제제 등이 개발되어 임상 응용되고 있다. 그러나, 특효약의 개발에는 도달하지 있지 못한 것이 현상이다.

이와 같이 골조송증의 충분한 치료법이 확립되어 있지 않은 현상에서는 예방이 가장 중요하다. 이론적으로는 청년기, 장년기의 뼈의 양을 가능한 한 높여 그것을 오랫동안 유지하고, 게다가 폐경 후의 뼈의 양의 감소를 조금이라도 억제할 수 있으면, 고령이 되어도 높은 뼈의 양을 유지하는 것이 가능해진다. 이를 위하여는 소아기, 청년기, 장년기에 적절한 칼슘을 계속 섭취하는 것이 불가결하지만, 칼슘의 섭취만으로는 불충분하다. 거기서, 골조송증 등을 예방 혹은 개선하는 작용을 가지는 식품 소재가 있으면, 그것을 일상 섭취하는 식품에 첨가하는 것으로써 일상의 식생활속에서 골조송증의 예방 또는 개선을 기대할 수 있다. 또한, 이 식품 소재중의 유효성분을 동정, 분리하고, 골조송증의 예방 혹은 치료약으로서 이용하는 것이 기대할 수 있다.

이러한 것 중에서 혈액 응고 인자로서 일반적으로 알려져 있는 비타민 K가 골대사에도 관여하는 것이 밝혀져 주목받고 있다. 그리 하여, 비타민 K₂ 제제가 골조송증에 있어서 뼈의 양, 동통의 개선약으로서 일본내에서 발매되었다. 또한, 비타민 K₁ 또는 비타민 K₂를 함유하는 식품 소재도 시장에 계속 투입되고 있다.

본 발명은 대사성 골질환, 특히 골조송증의 예방이나 개선에 유용한 새로운 식품 소재를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은 대사성 골질환의 예방 및 치료에 유용한 의약을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여, 식품 소재를 중심으로 널리 검색, 연구한 결과, 프로피온산균 및 유산균의 배양물을 경구 섭취하면 뼈의 양 및 골강도를 높일 수 있음을 발견하였다. 그리고 이 배양물의 유효량을 함유하는 식품은 골조송증으로 대표되는 대사성 골질환의 예방 또는 개선에 유효한 것을 발견하였다. 더욱이, 이 배양물 중에 포함되는 2-아미노-3-카르복시-1,4-나프토퀴논 및 그의 유연체가 골아세포의 분화와 기능 발현을 촉진하며, 한편 파골세포의 형성을 억제하는 작용을 갖는 것을 발견하고, 이들 화합물이 대사성 골질환의 예방치료약으로서 유용한 것을 발견하였다.

즉, 본 발명은

(1) 프로피온산균 및/또는 유산균의 배양물(이하, 「발효 산물」이라고 하 는 경우도 있다. 또한, 프로피온산균 배양물을 「BGS」라고 하는 경우도 있다.) 2-아미노-3-카르복시-1,4-나프토퀴논, 1,4-나프토퀴논, 2-히드록시-1,4-나프토퀴논, 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논, 5-히드록시-1,4-나프토퀴논, 8-히드록시-1,4-나프토퀴논, 2-(α-히드록시-δ-메틸펜테닐)-5,8-디히드록시-1,4-나프토퀴논 및 이들의 염으로 되는 군으로부터 선택된 나프토퀴논 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 골형성 촉진 기능을 가지는 음식품.

(2) 유효성분이 프로피온산균 및/또는 유산균의 배양물인 (1)의 음식품,

(3) 배양물이 배양상청 및/또는 균체인 (1)의 음식품,

(4) 유효성분이 2-아미노-3-카르복시-1,4-나프토퀴논인 (1) (이하, 「ACNQ」라고 하는 경우도 있다)의 음식품,

(5) 프로피온산균이 프로피오니박테리움·프로이덴라이히 (Propionibacterium freudenreichii)인 (1)의 음식품,

(6) 유산균이 락토콕카스·락티스·서브스피시스·락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis)인 (1)의 음식품,

(7) 프로피온산균 및/또는 유산균의 배양물, 또는 2-아미노-3-카르복시-1,4-나프토퀴논, 1,4-나프토퀴논, 2-히드록시-1,4-나프토퀴논, 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논, 5-히드록시-1,4-나프토퀴논, 8-히드록시-1,4-나프토퀴논, 2-(α-히드록시-δ-메틸펜테닐)-5,8-디히드록시-1,4-나프토퀴논 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 나프토퀴논 화합물의 골형성 촉진 기능을 가지는 음식품 제조를 위한 사용,

(8) 프로피온산균 및/또는 유산균의 배양물인 (7)의 사용,

(9) 배양물이 배양상청 및/또는 균체인 (7)의 사용,

(10) 프로피온산균이 프로피오니박테리움·프로이덴라이히 (Propionibacterium freudenreichii)인 (7)의 사용,

(11) 유산균이 락토콕카스·락티스·서브스피시스·락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis)인 (7)의 사용,

(12) 2-아미노-3-카르복시-1,4-나프토퀴논, 1,4-나프토퀴논, 2-히드록시-1,4-나프토퀴논, 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논, 5-히드록시-1,4-나프토퀴논, 8-히드록시-1,4-나프토퀴논, 2-(α-히드록시-δ-메틸펜테닐)-5,8-디히드록시-1,4-나프토퀴논 및 이들 염으로 이루어진 군에서 선택된 나프토퀴논 화합물, 또는 프로피온산균 및/또는 유산균의 배양물을 유효 성분으로 하는 대사성 골질환의 예방 치료약,

(13) 나프토퀴논 화합물이 2-아미노-3 카르복시-1,4-나프토퀴논인 (12)의 대사성 골질환의 예방 치료약,

(14) 대사성 골질환이 골조송증인 (12) 또는(13)의 예방 치료약,

(15) 2-아미노-3-카르복시-1,4-나프토퀴논, 1,4-나프토퀴논, 2-히드록시-1,4-나프토퀴논, 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논, 5-히드록시-1,4-나프토퀴논, 8-히드록시-1,4-나프토퀴논, 2-(α-히드록시-δ-메틸펜테닐)-5,8-디히드록시-1,4-나프토퀴논 및 이들 염으로 이루어진 군에서 선택된 나프토퀴논 화합물, 또는 프로피온산균 및/또는 유산균의 배양물의 대사성 골질환의 예방 치료용 의약 제조 제조를 위한 사용,

(16) 나프토퀴논 화합물이 2-아미노-3-카르복시-1,4-나프토퀴논인 (15)의 사용,

(17) 대사성 골질환이 골조송증인 (15)의 사용,

(18) 2-아미노-3 카르복시-1,4-나프토퀴논, 1,4-나프토퀴논, 2-히드록시- 1,4-나프토퀴논, 2,3-디클로로-1,4-나프토퀴논, 5-히드록시-1,4-나프토퀴논, 8-히 드록시-1,4-나프토퀴논, 2-(α-히드록시-δ-메틸펜테닐)-5, 8-디히드록시-1,4-나프 토퀴논 및 이들 염으로 이루어진 군에서 선택된 나프토퀴논 화합물, 또는 프로피온산균 및/또는 유산균의 배양물을 투여하는 것을 특징으로 하는 대사성 골질환의 처치 방법,

(19) 나프토퀴논 화합물이 2-아미노-3-카르복시-1,4-나프토퀴논인 (18)의 처치 방법,

(20) 대사성 골질환이 골조송증인 (18)의 처치 방법

에 관한 것이다.

도 1은 BGS 분말을 2% 또는 10% 함유하는 정제 사료를 SD랫트에게 4주간 자유 섭취시킨 후의 SD랫트의 경골 골밀도(mg/cm²)를 나타내는 도이다.

도 2는 이 랫트의 대퇴골 파단 에너지(mJ)를 나타내는 도이다.

도 3은 이 랫트의 대퇴골 건조 중량당의 칼슘량(mg/g)을 나타낸다.

도 1∼3에 있어서, 바는 평균치±표준오차를 나타낸다(p<0.05).

도 4는 마우스 골수 유래 스트로말 셀 라인 ST-2 세포를 각종 농도의 ACNQ의 존재하에서 3일간 배양후의, 이 세포의 알카리포스파타제 활성을 나타내는 도이다.

도 5는 이 세포의 MTT 앗세이에 의한 생세포수(595 nm에서의 흡광도)를 나타내는 도이다.

도 6은 사람 골아세포(SaM-1)에 있어서의, 1α, 25(OH)₂D₃, 비타민 K₂, ACNQ 및 1α,25(OH)₂D₃와 ACNQ와의 조합에 의한 Ca축적의 영향을 나타낸 도이다.

도 7은 사람골아세포(SaM-1)에서 1α,25(OH)₂D₃, 비타민 K₂, ACNQ 및 활성형 1α,25(OH)₂D₃와 ACNQ의 조합에 의한 P축적의 영향을 나타내는 도이다.

도 8은 사람 골아세포(SaM-1)에서 1α,25(OH)₂D₃, 비타민 K₂, ACNQ 및 1α,25(OH)₂D₃와 ACNQ와의 조합에 의한 세포 독성을 나타내는 도이다.

도 9는 사람 골수세포(SaM-1) 배양에서 ACNQ 및 비타민 K₁의 TRAP 양성 다핵세포에 주는 영향을 나타내는 도이다.

도 10은 ddY 마우스 신생자의 두개골 유래의 골아세포상 간질세포와 이 마우스 유래의 골수 세포를 1α,25(OH)₂D₃ 또는 ACNQ 존재하에서 공존 배양한 경우의 파골세포 형성에 주는 영향을 나타내는 도이다.

도 11은 ddY 마우스 신생자의 두개골 유래의 골아세포상 간질세포와 이 마우스 유래의 골수 세포를 ACNQ 존재하에서 공존 배양했을 경우의 파골세포 활성을 나 타내는 도이다.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

본 발명의 의약 및 음식품에는, 상기 나프토퀴논 화합물, 프로피온산균 배양물 및 유산균 배양물의 어느 것이라도 이용할 수가 있다. 여기서, 전술한 나프토퀴논 화합물중, 2-아미노-3-카르복시-1,4-나프토퀴논(ACNQ)이 특히 바람직하다. 이 ACNQ는, 예를 들면 프로피온산균(프로피오니박테리움(Propionibacterium)속에 속하는 미생물)의 배양물로부터 얻을 수 있음이 알려져 있다(일본국 특개평 7-227207호, 일본국 특개평 7-289273호, 일본국 특개평 10-30487l호). 또한, ACNQ 이외의 나프토퀴논 화합물에 대해서도, 프로피온산균의 배양물로부터 얻을 수 있다(일본국 특개평 8-98677호). 이들 나프토퀴논 화합물 및 프로피온산균 배양물이, 비피더스균의 증식 활성을 갖는 것에 대하여는 알려져 있으나, 대사성 골질환에 작용이 있는지 여부에 대해서는 전혀 알려져 있지 않다.

프로피온산균으로서는, 프로피오니박테리움·프로이덴라이히 (Propionibacterium freudenreichii), 프로피오니박테리움·토니(P. thoni), 프로피오니박테리움·아시디프로피오니시(P. acidipropionici), 프로피오니박테리움·젠세니(P. jensenii) 등의 치즈용, 프로피오니박테리움·아비댐(P. avidum). 프로피오니박테리움·아크네스(P. acnes), 프로피오니박테리움·림포피람(P. lymphophilum), 프로피오니박테리움 그라뉼로삼(P. granulosam) 등을 들 수 있다. 프로피오니박테리움·프로이덴라이히로서는, 예를 들면 P. freudenreichii IFO 12424, 또는 P. freudenreichii ATCC6207을 들 수 있다.

유산균으로서는, 예를 들면 락토바실러스속(lactobacillus), 스트랩토콕카스속(Streptococcus), 락토콕카스속(Lactococcus), 로이코노스톡속(Leuconostoc)에 속하는 균을 들 수 있다. 락토바실러스속으로서는 예를 들면, Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgalicus, 스트랩토콕카스속으로서는, 예를 들면 Str. thermophilus, 락토콕카스속으로서는, 예를 들면 Lc. lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. lactis, 로이코노스톡속으로서는, 예를 들면, Leuc. mesenteroides subsp. cremoris, Leuc. lactis 등을 들 수 있다.

프로피온산균 또는 유산균의 배양물은 공지의 수단에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 프로피온산균을 고농도로 배양하는 방법으로서 훼이 단백 농축물(whey Protein Concentrate: WPC) 또는 그의 효소 분해물에 미네랄과 단당을 첨가하고, 배지에서 프로피온산균을 배양하는 방법이 있다(일본국 특개평 10-304871호 공보). 또는 프로피온산균의 효율적인 배양법으로서 비피더스균과 프로피온산균을 상이한 배양조에서 배양액을 순환시키면서 배양하는 방법이 있다(일본국 특개평 8-66178호 공보). 이들 배양 방법은 본 발명의 실시에 이용할 수 있다. 더욱이 당업자이면, 이들 공지의 방법을 다시 더 최적화하기 위해서, 배지조성 및 배양 조건 등(용존 산소 농도 등)을 변경하는 것이 가능하다. 예를 들면, 질소원에 대해서는, 카제인 단백, WPC등 이외에, 다시 각종 아미노산(염)의 첨가 효과의 검토나, 배양 조건(혐기 배양과 호기배양)의 검토 등을 행하여 최적화(균체의 증가나 BGS의 골대사 활성 향상)하는 것이 가능하다. 따라서, 이들의 변경된 방법도 본 발명에 포함된다.

BGS의 비피더스균 증식 활성은 배양물의 균체를 제외한 여과물 및 균체의 메탄올 추출물 중에 존재하고 있다(Kaneko, T. et a1. : J. Dairy Sci., 77:393-404, 1994). 골대사 활성도, 배양상청 및 균체의 쌍방에 포함되어 있다고 고려된다. 따라서, 본 발명의 「BGS」는, 예를 들면 프로피온산균 및/또는 유산균의 배양물 그 자체, 배양상청, 균체, 이들의 추출물, 이들의 건조 분말 또는 이들의 희석물 등 모든 것이 포함된다.

BGS의 가공 형태는 분말상과 액상으로 대별된다. 분말상으로 하기 위하여는, 배양액에 부형제로서 탈지분유 또는 훼이분말, 생전분, 덱스트린 등을 직접 첨가하고, 배양 고형분을 30∼40중량%로 한 후, 분무 건조하던가, 배양액과 부형제의 환원액을 혼합하고, 고형분이 30∼40 중량%가 될 때까지 농축한 후, 분무 건조한다. 충전시에 탈산소처리(질소 봉입이나 탈산소제 첨가 등)함으로서 장기 보존하는 것이 가능하다. 부형제로서는 상기 이외에, 필요에 따라서는 WPC, 훼이 단백 분리물(Whey Protein Isolate: WPI), 가공 전분(덱스트린이외에, 소루블 스타치, 브리티슈 검, 산화 전분, 전분 에스테르, 전분 에테르 등)도 사용할 수 있다. 또한, 식품에 사용하기 용이하도록 분말화한 제제(0.2% 분말)로 가공해도 좋다.

한편, 나프토퀴논 화합물은 프로피온산균의 배양물로부터 추출, 정제하여 채취할 수 있다(일본국 특개평 7-289273호). 나프토퀴논 화합물을 함유하는 발효산물을 산생하는 미생물로서는, 그 외에 Bacteroides vulgatus JCM5826T, Bacteroides fragilis ATCC 23745 등의 Bacteroides속, Bacillaceae Enterococci, Bacteroidaceae, Streptcoccaceae, Enterobacteriaceae 등을 들 수 있다.

또한, 나프토퀴논 화합물은 화학 합성에 의해도 얻을 수 있으며, 예를 들면 ACNQ는 시판의 1,4-디히드록시나프토에산을 출발물질로 하여 4단계의 공정에 의해 얻을 수 있다(일본국 특개평 10-36328호).

나프토퀴논 화합물의 염으로서는 약학적 또는 식품학적으로 허용되는 염을 들 수 있으며, 대표적인 염으로는, 아세트산염, 벤젠술폰산염, 벤조산염, 중탄산염, 젖산염, 시트르산염 등을 들 수 있으나, 이들은 예시이며, 본 발명은 이들 염에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 이용되는 나프토퀴논 화합물에는 입체이성체, 광학이성이 존재하는 경우도 있으나, 이들은 모두 본 발명에 이용할 수가 있다.

전술한 나프토퀴논 화합물은 골형성의 지표인 골아세포의 알카리포스파타제(ALP) 활성을 촉진시키고 석회화를 촉진한다. 그리고 파골세포의 분화·성숙을 억제하는 한편으로, 파골세포 활성을 저해하지 않고, 파골세포에 대한 세포 독성을 나타내지 않는다. 즉, 이들의 나프토퀴논 화합물 및 배양물은 골형성의 촉진과 골흡수의 억제의 2개의 작용을 겸비하는 지극히 독특한 대사성 골질환의 예방·치료약 또는 대사성 골질환의 예방 개선용 음식품으로서 유용하다.

이상, BGS 및 ACNQ에 대해서, 골대사의 측면, 즉, 골형성과 골흡수작용을 in vitro 평가계 및 in vivo 평가계로 조사한 결과를 나타낸다.

BGS의 in vivo 평가계에 있어서, BGS를 경구 섭취하면, 대퇴골 및 경골의 골밀도, 대퇴골 파단 에너지 및 대퇴골 Ca량은 대조군에 대해서 유의하게 증강되었다. 즉, BGS의 경구 섭취에 의해, 뼈의 양 및 뼈 강도가 유의에 증강하는 것이 in vivo 실험에서 나타났다(도 1, 2 및 3). 여기서, BGS의 골형성 촉진작용을 분석하기 위해서, 비피더스균의 증식 활성성분인 ACNQ의 골대사에게 주는 영향을 in vitro 실험으로 조사했다.

뼈는 골아세포 등의 골형성계 세포, 파골세포 등의 골흡수계 세포, 더욱이 각종 간질세포(섬유아세포, 지방세포, 세망세포)나 조혈세포로 구성되며, 이들 세포가 서로 연대한 네트워크하에서 골조직이 구축되고 있다.

우선, ACNQ의 골형성에게 주는 영향에 대해서 조사했다. 골형성에 있어서, 주요한 역할을 하는 것은 골아세포이다. 성장 후의 뼈에서는, 파골세포에 의한 골흡수 소와(骨吸收小窩)에 골아세포가 동원되어 흡수된 뼈를 보충할 수 있도록 골형성이 개시된다. 골아 전구세포는 활발하게 증식됨과 동시에, 점차 골아세포의 분화 형질을 획득한다. 다시 분화가 진전하여 성숙한 골아세포에 의해, 형성된 골 기질의 석회화가 일어나 골형성이 완료된다. 골아세포의 분화의 지표로서는 각종 기질 단백의 합성이외에 ALP의 발현 및 그의 활성의 상승이 가장 중요하다.

여기서, 골수 스트로말 세포의 주세포인 ST-2를 ACNQ를 첨가한 배지에서 배양하고, 골아세포의 분화에 수반하는 지표인 ALP 활성을 측정했다. ACNQ는 1㎍/㎖의 농도까지, 농도 의존적으로 골아세포 형성을 촉진했다(도 4). 즉, ACNQ는 골수 스트로말 세포로부터 골아세포로의 분화를 농도 의존적으로 촉진했다. 또, ACNQ는 1㎍/㎖의 농도까지 세포 독성을 나타내지 않았다(도 5).

ALP 활성과 석회화와의 관계는 아직도 명확하지 않지만, ALP에 유전적 결함이 있으면, 골격의 발달에 이상을 가져오므로 이 효소가 중요한 역할을 나타냄을 시사하고 있다. 따라서, ALP 활성의 상승은 골아세포의 석회화를 촉진하고 있다고 생각된다. 여기서 ACNQ의 골형성 작용을 사람골아세포(SaM-1)에 의한 석회화 촉진작용에 의해 평가했다. SaM-1은 골아세포의 특징을 모두 보유하고 있으며, 2mM α-글리세로포스포린산 존재하에서, 1α,25(OH)₂D₃ (활성형 비타민 D₃)의 농도에 의존하여 석회화하는 것이 알려져있다(Koshihara, Y.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 145:651-657, l987). 여기서, 각종 농도의 ACNQ의 존재하에서 SaM-1을 배양하여 매트릭스상에 축적된 Ca량 및 P량을 측정했다. ACNQ는 10^-5M∼10^-7M에서 농도 의존적으로 석회화를 촉진했다(도 6 및 7). 한편, ACNQ는 10^-5M∼10^-7M에서, 배양 상청중의 유리 LDH를 측정한 결과에서는 세포 독성을 나타내지 않았다(도 8).

이상의 결과로부터, ACNQ는 10^-5M∼10^-7M라는 지극히 저농도로 골형성을 촉진하고, 그리고 이 농도에 있어서 세포 독성을 나타내지 않는 것이 밝혀졌다.

다음에, ACNQ의 골흡수에 주는 영향에 대해서 조사했다. 파골세포는 마크로파아지계의 조혈 세포에 유래하며, 골조직 특유의 환경하에서 골흡수 인자의 자극에 의해 형성되는 골흡수계 세포이다. 골수에 존재하는 파골세포 전구세포로부터 in vitro에서 파골세포를 형성시킴으로서 그의 기능 해석이 가능하다. 파골세포를 형성시키는 배양계로서는, 골수세포 배양, 골수세포와 골아세포의 공존 배양, 비세포(脾細胞)와 골아세포의 공존 배양 등이 이용되고 있다. 골수세포를 1α,25(OH)₂D₃와 함께 배양하면, 파골세포의 표지 효소인 타르타르산 내성 산 포스파타제(TRAP) 양성의 다핵 파골세포가 형성된다.

여기서, 사람단핵세포를 1α,25(OH)₂D₃ 및 ACNQ의 존재하에서 배양하고, 1α,25(OH)₂D₃에 의해 야기된 TRAP 양성 다핵 파골세포 형성에 부여되는 ACNQ의 영향을 조사했다. ACNQ는 10^-8∼10^-5M에서 농도 의존 적으로 파골세포 형성을 억제했다(도 9). 그의 억제 작용은 같은 농도의 비타민K₁ 보다 현저하고 강했다.

또한, 마우스 신생자의 두개골 유래의 초대 골아세포상 간질세포와 마우스의 골수세포와의 공존 배양계에 의해 형성되는 TRAP 양성 세포를 조사했다. ACNQ는 1.5㎍/㎖이상으로 파골세포 형성을 현저하게 억제했다(도 10). 여기서, ACNQ의 골흡수계 활성에게 주는 영향을 조사했다. 전술한 마우스의 초대 골아세포상 간질세포와 마우스의 골수 세포와의 공존 배양에 의한 파골세포 형성계에 있어서의 상아 절편상의 흡수와 형성 및 세포 독성을 측정했다. ACNQ는 분화·성숙한 파골세포의 골흡수 활성을 억제하지 않았다(도 11). 또한, ACNQ는 파골세포에 대해서 독성을 나타내지 않았다(도 11). 이것은 ACNQ는 분화·성숙한 파골세포에 대해 그의 기능을 손상되지 않음을 나타내고 있다.

이상의 결과로부터, BGS는 이것을 경구 섭취하면, 뼈의 양을 늘림과 동시에 골강도를 높이는 작용을 나타내는 것이 분명해졌다. 한편, 그의 주요한 활성 성분의 하나로 생각되는 ACNQ는 골아세포 형성을 높이는 것과 동시에, 골형성을 촉진하는 한편, 파골세포의 형성을 억제하나, 형성된 파골세포는 정상적으로 기능한다(골흡수 활성을 가진다)는 지극히 독특한 골대사 작용을 나타냈다. 전술한 BGS의 골형 성 촉진 활성은 BGS중의 각종 성분이 복합한 작용에 의한 것으로도 생각되지만, 그의 대부분은 BGS중에 극미량 포함되는 ACNQ의 작용에 의한 것임은 틀림없다고 생각된다.

그런데, 혈액 응고 인자로서 일반적으로 알려져 있는 비타민 K가 골대사에도 관련하는 것이 밝혀져 주목받고 있다. 천연에는 비타민 K₁과 K₂가 존재한다. 비타민 K₁ 및 K₂ 는 나프토퀴논 골격을 공유하며, 이골격의 3위에 결합하는 측쇄만이 다르고, 1위에는 함께 동일한 메틸기가 결합하고 있다. 비타민 K₁은 단일 화합물이지만, 비타민 K₂는 3위에 결합하는 이소프렌 수에 의해 14의 동족체가 있으며, 그 중, 이소프렌 단위수 4(게라닐게라니올)의 비타민 K₂-4만이 골형성을 촉진하고, 골흡수를 억제하여 뼈의 양의 감소를 억제한다. 비타민 K₁ 또는 비타민 K₂의 측쇄에 의한 골흡수에의 영향을 조사한 결과, 비타민 K₂-4의 측쇄인 게라닐게라니올에는 비타민K₂-4와 동일한 정도의 파골세포 형성 억제작용이 관찰되었다. 그런데, 비타민 K₁의 측쇄인 피톨은 억제 활성이 약하고, 또한, 비타민 K₁의 이소프렌 단위수가 2∼7(4는 제외한다)의 측쇄는 억제작용을 나타내지 않고 오히려 촉진했다(Hara, K. et al.: Bone, 16:179-184, 1995).

본 발명의 ACNQ도 비타민 K₁ 또는 K₂와 마찬가지로 나프토퀴논 골격을 갖지만, 이 골격의 2위에는 아미노기가, 그리고 3위에는 카르복실기가 결합하고 있으 며, 전술한 바와 같이, 비타민 K₁ 또는 비타민 K₂의 골대사 활성은 측쇄에 의존하고 있음을 고려하면 양자는 전혀 다른 것으로 생각된다.

전기 배양물 또는 나프토퀴논 화합물은 골대사를 촉진하고, 골조송증의 예방 또는 개선에 유용한 식품의 제조를 위해서, 그의 유효량을 일상 섭취하는 식품에 첨가할 수 있다. 첨가 대상의 식품은 특히 한정되지 않지만, 바람직하기로는 일본에 있어서는, 보건 용도의 표시나 한정된 용도에 대해서 표시 허가된 특별용도 식품(병자용 식품, 고령자용 식품, 특정 보건용 식품)을 들 수 있다. 외국에서는 헬스 크레임(건강 강조 표시)이 허가된 식품 등을 들 수 있다.

대사성 골질환의 예방 또는 개선용 음식품에는 전기 나프토퀴논 화합물을 이용할 수 있으나, 안전성, 건강 위생상의 면으로부터, 천연물 유래, 특히, 프로피온산균 배양물을 이용하는 것이 바람직하다. 배양물은 그 자체뿐만 아니라, 그의 용매 추출물, 그의 처리물(예를 들면, 균체를 함유하는 배양액, 균체 추출물, 배양액 상청, 이들의 농축물, 건조물, 희석물 등) 등을 포함한다.

식품중의 유효성분의 활성을 유지하기 위해서, 안정화제로서, 예를 들면, 아스코르빈산나트륨 등을 첨가하면 좋다. 배양물의 첨가량은 유효성분의 나프토퀴논 화합물의 함유량으로부터 계산될 수 있으나(예를 들면, 참고예 2 참조), 배양물을 예를 들면, 0.5∼10중량% 첨가하면 좋다.

본 발명의 음식품용 조성물은 단독으로 사용하여도 좋으나, 식품학적으로 허용되는 담체, 또한 1개 이상의 다른 식품 영양소, 예를 들면 비타민, 미네랄, 아미 노산 등과 함께 배합하여도 좋다. 여기서, 식품학적으로 허용되는 담체로서는 결합제, 부형제, 보존제, 착색제 등을 들 수 있다.

상기 나프토퀴논 화합물 및 배양물은 통상 일반적인 의약 조성물의 형태를 이용할 수 있다.

의약 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕괴제, 표면활성제, 활택제 등의 희석제, 또는 부형제를 이용하여 조제할 수 있다. 이 의약 조성물로서는 각종 형태가 치료 목적에 따라 선택할 수 있으며, 그의 대표적인 것으로서는 정제, 환약, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제, 캅셀제, 질좌제, 주사제(액제, 현탁제) 등을 들 수 있다.

대사성 골질환 예방 치료약의 투여량은 연령, 체중 등의 환자의 상태, 투여경로, 병의 성질과 정도 등을 고려하여 설정하는 것이 바람직하지만, 통상, 성인에 대하여 나프토퀴논 화합물량으로서 1일당, 경구투여의 경우, 0.5∼100mg/kg의 범위가 일반적이다. 경우에 따라서는, 이것 이하로 충분하며, 또한, 반대로 그 이상의 용량을 필요로 할 수도 있다. 또한, 1일에 2∼4회에 분할하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 의약을 투여시에는 골형성에는 칼슘이 필요하므로, 칼슘제를 병용하여 투여해도 좋다. 또한, 골흡수 억제제[예, 활성형 비타민D₂, 활성형 비타민D₃, 칼시토닌, 에스트로젠, 이프리파본("오스텐", 상품명) 등]과 병용하여 투여하여도 좋다.

이하, 본 발명의 특정의 구현을 참고예 및 시험예에 의해 설명하나, 당업자이면, 여러 가지 수식이 본 발명의 범위 내에서 실시할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다.

[참고예 1] BGS 분말의 제조

10 w/w% 훼이 분말 환원액을 8N-NaOH로 pH 7.0으로 조정한 후, 프로테아제("Amano A(Amano Enzyme Inc. 제))를 훼이분말 1 g에 대해 6.79mg 첨가하고, 50℃에서 2시간 효소 분해했다. 반응기간중은 8N-NaOH로 pH 7.0으로 유지했다. 85℃, 10분간 가열하여 효소를 실활시킨 후, 35℃까지 냉각했다. 효모 엑기스 0.1 w/w%를 가하고, 4N-HCℓ로 pH 6.7로 조정한 후, 121℃에서 7분간 멸균하여 배지로 했다.

Propionibacterium freudenreichii ATCC 6207주 (균주번호는 일예)를 미리 TPY 배지(일본국 특개평 7-289273호 공개공보의 실시예 1 참조)에서 정치배양(37℃, 3일)하여 놓고, 이것을 종균으로서 상기 배지에 2% 식균했다. 배양온도를 35℃로 하고, 8N 탄산칼륨 수용액으로 pH 6.0에 유지하면서, 72시간 배양했다. 또, 배양조의 헤드 스페이스는 질소로 치환하고, 교반은 100∼150rpm으로 했다. 이 배양액에 아스코르빈산나트륨 0.5 w/w% 첨가한 후, 121℃에서 15초 살균했다. 배양액 고형분의 4배량의 탈지분유를 첨가하고, 분무 건조했다. 이 건조 분말중의 ACNQ의 함량은 0.56㎍/g이었다.

[참고예 2] ACNQ의 분석

(1) 배양액의 경우

균체를 함유하는 배양액 0.5 m에, 1N 염산 0.05 m, 정제수 2㎖, 및 아세톤 2.5 ㎖를 가하고, 200 rev/min으로 60분간 진탕했다. 초산에틸 2.5㎖를 가하고 200 rev/min로 30분간 진탕한 후, 원심(2,500rpm, 4℃, 5분간)했다. 다시, 수층에 대해 에틸아세테이트 7.5 ㎖로 2회 추출했다. 유기용매층을 농축 한후, 메탄올 200㎕에 용해하고, HPLC로 분석했다.

HPLC 조건은 이하와 같다.

컬럼: CAPCELL PAK C18 SG120(φ4.6×250 ㎜, 시세이도)

컬럼 온도: 45℃

이동상: 아세토니트릴/메탄올/7.94 mmol/L과염소산나트륨 용액/아세트산

(250/100/900/0.6, pH 5.6)

유속: 1.0㎖/min

검출: 다전극형 전기화학검출기: Coulochem II(ESA, Inc)

가드 셀: -650mV

애너리컬 셀: DET. l -600mV, DET. 2 +150mV

시료 온도: 실온

주입량: 20㎕

(2) 동결건조 분말의 경우

분말 1g에 메탄올 50㎖를 가하고, 1시간 진탕한 후, 에틸아세테이트 50㎖를 가하고, 다시 30분간 진탕했다. 현탁액을 여과하고, 여액을 농축한 후, 메탄올 5㎖에 용해하고, HPLC로 분석했다.

[시험예 1] BGS의 뼈의 양 및 골강도에 미치는 효과(in vivo 시험)

참고예 1에서 얻은 BGS 분말을 2% 또는 10% 함유하는 정제 사료(AIN-93G 조성에 준함)를 수컷 SD랫트에게 4주간 자유 섭취시켰다. 시험 사료의 조제에 있어서는 BGS분말에서 유래하는 단백질, 유당, 칼슘, 인, 마그네슘을 고려하여, 각 시험 사료사이에 평준화시켰다. 대조 사료는 20%의 카세인을 함유하는 AIN-93G조성에 준했다.

그 결과, 사육 후의 체중증가, 사료 효율은 3군 사이에서 차이가 관찰되지 않았다. 대퇴골과 경골의 건조 중량에 관해서는 3군간에 차이가 관찰되지 않았다. 골밀도는 10% BGS 분말을 첨가한 군은 대조군에 대해서 유의하게 높은 값을 나타내고, 2% BGS 분말을 첨가한 군은 대조군에 대해서 유의하지는 않지만, 높은 값의 경향을 나타냈다(도 1). 대퇴골 파단에너지는 10% BGS 분말을 첨가한 군은 대조군 및 2% BGS 분말을 첨가한 군에 대해서 유의한 높은 값을 나타내며, 또한, 2% BGS 분말을 첨가한 군은 대조군에 대해서 유의하지는 않지만, 높은 값의 경향을 나타냈다(도 2). 대퇴골 칼슘량은 10% BGS 분말을 첨가한 군은 대조군에 대해서 유의한 높은 값을 나타내며, 2% BGS 분말을 첨가한 군은 대조군에 대해서 유의하지는 않았 지만 높은 값의 경향을 나타냈다(도 3).

이들 in vivo 시험 결과로부터, BGS를 경구 섭취시킴으로서 골밀도가 높아지고, 파단응력이 증강하여 칼슘 축적을 높여진다는 것이 밝혀졌다. 즉, BGS를 경구 섭취하면, 골형성을 촉진하고, 뼈의 양과 골강도를 높이는 효과를 가지는 것이 밝혀졌다.

[시험예 2] ACNQ의 골형성 촉진 작용

골아세포로서 마우스 골수 유래의 스트로말 셀 라인 ST-2 세포 (Udagawa, N. et al.: Endocrinology, 125:1805-18l3, 1989)를 이용했다. 이 세포는 골수세포에 대해서 골아세포와 동등의 파골세포 분화 유도능을 가지고 있다.

세포를 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 4×10⁴세포/웰 파종하고, 10% FBS, 페니실린 G, 및 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 1일 배양했다.

ACNQ를 함유하는 동일 배지로 배지 교환하고, 다시 3일간 배양했다. 배양 후, 세포의 ALP 활성을 측정했다.

세포를 PBS로 세정한 후, 에탄올로 1분간 고정했다. 37℃의 효소 반응액(기질로서 p-nitrophenyl phosphate, 0.1M 글리신, lmM MgCℓ₂, 및 0.1 mM ZnCℓ₂를 함유하는 완충액, pH 10.5)을 가하고, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 등량의 0.05N NaOH를 첨가하여 반응을 정지시켰다. ALP활성은 단백질 1mg 당, 1분간에 생성되는 p-nitrophenol량 (415 nm에서 흡광도로 측정)을 1U 로서 나타냈다. 단백질 함량은 단백질 측정시약(Bio-Rad Lab.)을 이용하여 측정했다. 또, ACNQ의 세포독성을 MTT 앗세이에 의해 측정했다(도 5).

세포의 ALP 활성은 ACNQ의 농도 1㎍/㎖까지는, 농도 의존적으로 증가하고, 농도 1㎍/㎖부근에서 ALP 활성이 피크로 달했다(도 4). 이 ALP 활성의 피크 농도에 있어서 세포 독성은 전혀 관찰되지 않았다(도 5).

[시험예 3] ACNQ의 석회화능 촉진 효과

골절 수술시에 얻을 수 있던 20세 남성의 장관골 골막으로 수립한 배양 사람 골아세포(SaM-1)를 사용했다. 이 SaM-1 세포는 골아세포의 특징을 모두 보유하고 있었다(Koshihara, Y. et al.: In Vitro Cell. Dev. Biol., 25:37-43, 1989). SaM-1은 2mM의 α-글리세로포스포린산 존재하에서, 1α,25(OH)₂D₃의 농도에 의존하여 석회화를 촉진하는 것이 알려져 있다(Koshihara, Y. et al.: Biochem. Biophys. Res. commun., 145:65l-657, 1987).

18 PDL(population doubling level)의 SaM-1을 12웰 플레이트에 파종하고, 콘플루언트로 될 때까지 배양했다. 다음에 석회화 촉진제인 α-글리세로포스포린산을 2mM가 되도록 첨가했다. 이 배양계에 10^-8M∼10^-9M의 1α,25(OH)₂D₃, 10^-5∼10^-6M의 비타민 K₂(2-methyl-3-all-trans-tetraphenyl-1, 4-naphtoquinone; menaquinone), 10^-6M∼10^-7M의 ACNQ, 또는 10^-9M의 1α,25(OH)₂D₃ + 10^-5M∼10^-6M의 ACNQ를 각각 첨가 하고, 32일간 배양했다. 대조에는 용매 DMSO을 배양액에 0.1%가 되도록 첨가했다. 배지는 각각의 시험 물질을 함유하는 배지에서 1일간 교환했다. 석회화도는 히드록시어퍼타이트의 구성 성분인 Ca 및 P량으로 나타냈다.

(1) 세포외 매트릭스중의 칼슘의 측정

세포외 매트릭스중의 Ca는 o-cresolphthalein complexone법(OCPC법) (Gitleman, H. I.: Anal. Biochem., 18:520-53l, l967)에 기초로 한 킷트(칼슘 C 테스트 와코)에 의해 정량했다.

배양 종료후 Hank's액으로 세포를 세정했다. 냉 5% 과염소산 0.5㎖/웰을 첨가하고, 4℃에서 15분간 진탕 추출했다. 추출액 25㎕와 완충액 2.5㎖를 혼합한 후, 발색액(OCPC 0.4mg/㎖, 8-퀴놀리놀 함유) 250㎕를 첨가하여, 교반한 후, 5 분후에 그 반응액을 흡광도계(570nm)에서 측정했다(도 6).

(2) 세포외 매트릭스중의 인의 측정

세포외 매트릭스중의 P는 Chen 등의 방법(Chen, P. S. et al. : Anal. Chem., 28:l756-l758, 1956)으로 정량했다.

0.84% 몰리브덴산암모늄, 2N-황산, 10% 아스코르빈산을 3: 3: 1(용적비)로 혼합하여 반응 시약을 조제했다. 상기 Ca측정에서 추출한 추출액 100㎕를 증류수 800㎕로 희석한 후, 반응시약 2.1㎖를 가하고, 45℃에서 20분간 인큐베이트했다. 물로 냉각한 후, 반응액을 흡광도계(570nm)에서 측정했다(도 7).

도 6 및 도 7로부터, 1α,25(OH)₂D₃은 전술한 바와 같이 10^-8M∼10^-9M의 농도에서 농도에 의존하여 석회화를 촉진하는 것이 확인되었다. 한편, ACNQ는 10^-5M∼10^-7M의 농도에서 농도에 의존해 석회화를 촉진하는 것이 확인되었다.

(3) ACNQ의 세포독성

LDH-Cytotoxic Test Wako(세포독성 측정용 킷트)를 이용하여 배지상청중의 유리 LDH를 측정하여 ACNQ의 세포독성을 조사했다. 배양 32일째의 배지 상청을 채취하여 발색 반응후에 마이크로 플레이트 리더(540nm)를 사용하여 LDH를 측정했다.

그 결과, ACNQ는 10^-5M∼10^-7M의 농도에서, 대조에 비해 유의한 차이는 관찰되지 않고, 이 농도에서 세포독성의 가능성은 없는 것이라고 판단되었다(도 8).

[시험예 4] ACNQ의 파골세포 형성 억제 작용

(1) 인공골두 치환 수술시에 얻어진 사람 골수 세포를 밀도 구배 원심법으로 제공하여 단핵세포를 채취했다. 이 단핵세포를 20% 말 혈청 및 10^-8M의 1α,25(OH)₂D₃을 함유하는 α-MEM 배지중 8×10⁵세포/웰(079 cm²)이 되도록 파종하고, 17일간 배양했다. 배양액은 주 2회, 1/2씩 교환했다. ACNQ의 첨가는 개시시에 행했다.

배양 16일째에 프로나제/EDTA 처리하여 스트로마 세포를 제거했다. 다음날 세포를 PBS(-)로 세정한 후, 세포를 포르말린 고정했다. 포르말린 고정세포는 TRAP 염색을 행하여 각 웰의 TRAP 양성 다핵세포수를 계측했다. 대조로서 비타민 K₁을 이용했다.

ACNQ는 10^-8M∼10^-5M의 농도에서 농도에 의존하여 파골세포 형성을 억제했다. (도 9).

(2) ddY 마우스 신생자의 두개골을 효소처리(콜라게나제와 디스파제의 혼합 용액)하여 초대 골아세포상 간질세포를 얻었다. 한편, 동일 마우스(6∼9주령 수컷)의 대퇴골과 경골로부터 골수세포를 분리하였다. 초대 골아세포상 간질세포와 골수세포를 ACNQ의 존재하에서 공존 배양하고, ACNQ의 파골세포에의 분화 유도작용을 조사했다.

초대 골아세포상 간질세포와 골수 세포를 대략 1: 20의 비율의 세포수로 함유하는 것을 10% FBS 첨가 αMEM를 이용하여 10^-8M∼10^-10M의 1α,25(OH)₂D ₃ 존재하, 6∼8일간 공존 배양했다. 배양 기간중, 각종 농도의 ACNQ, 또는 비교 대조로서 파골세포 형성을 억제하는 것이 알려져 있는 비타민 K₂를 배지 교환(배지 교환 반량, 교환일은 2일 마다) 별로 첨가했다.

TRAP 염색에 양성의 세포에서, 그리고, 세포내의 핵수가 3이상의 세포를 분 화한 파골세포로 했다. TRAP 염색액은 사용시 직전에, 기질(나프톨 AS-MX 인산) 5mg 및 색소(Fast red violet LB salt) 25 mg를 N,N-디메틸포름아미드 약 0.5㎖에 용해하고, 여기에 50mM 타르타르산 나트륨을 함유하는 0.1M 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0) 50㎖를 첨가하여 조제했다. 배양한 세포의 배지를 제거한 후, PBS로 세정하고, 10% 포르말린 함유 PBS에서 5분간 고정한 후, 1: 1의 에탄올·아세톤으로 1분간 재고정했다. 풍건후, TRAP 염색액으로 실온에서 10∼15분간 반응시킨 후, 수세·건조시켰다. 이것을 세균 현미경으로 검사하여 파골세포수를 계측했다. ACNQ는 골수세포중에 존재하는 단핵세포의 파골세포로 분화·성숙을 0.15∼15㎍/㎖의 농도에서 농도의존적으로 억제했다(도 10).

[시험예 5] ACNQ의 골흡수에게 주는 영향

상아 절편상에서의 파골세포에 의한 흡수와 소와 형성에 끼치는 ACNQ의 영향을 조사했다.

시험예 4의 (2)와 동일하게, ddY 마우스 신생자의 두개골 유래의 초대 골아세포상 간질세포와 동일 마우스(6∼9 주령 수컷)의 대퇴골과 경골에서 분리한 골수세포를 100mm 디쉬/20㎖중, 1×10⁶세포: 1×10⁷세포의 비율로 함유하는 것을 콜라겐 겔상에서 10% FBS 및 10^-8M의 1α,25(OH)₂D₃를 첨가한 αMEM 배지에서, 6∼8일간 공존 배양했다. 배지교환은 2일마다 행했다. 배양 후, 0.2% 콜라게나제 용액을 첨가하고, 37℃에서 20분간 천천히 진탕하여 콜라겐 겔을 소화하여 분화 유도된 파골세 포상 다핵세포를 회수했다. 이 방법으로 얻어진 파골세포수는 최대 4×10⁴세포/100mm 디쉬였다.

이 파골세포상 다핵세포는 10% FBS 첨가 αMEM 배지에서 4×10³세포/㎖로 조제하여 상아 절편을 넣은 웰(96웰)에 웰당 100㎕ 파종하고, 37℃에서 2시간 배양했다. 배양 후, 0.5∼1.0㎖/웰의 배지를 넣은 24 또는 48웰로 옮겼다. 동시에, 각종 농도의 ACNQ를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 24시간 배양했다. 배양 후, 배지를 제거하고, 상아 절편을 마이어 산성 헤마라운 염색액(Mayer's acidic hemalaun staining solution)에서 단시간 염색했다. 염색액을 제거한 후, 골아세포에 의해 형성된 상아질 절편 표면의 흡수 소와의 수를 현미경으로 계수하였다. 그 결과, 대조(ACNQ 무첨가)의 흡수 소와의 수를 100%로 하였을 때의 각각의 흡수 소와의 수(%)로 나타냈다. ACNQ는 최고 농도의 7.5㎍/㎖농도에서도 파골세포의 골흡수 활성을 저하하지 않았다(도 11). 이것은 ACNQ는 분화·성숙한 파골세포의 골흡수 활성을 억제하지 않음을 나타내고 있으며, 그것은 파골세포에의 세포 독성을 나타내고 있지 않은 것으로 말할 수 있다.

본 발명의 프로피온산균 및/또는 유산균의 배양물은 식품에 첨가할 수 있으며, 이 식품을 섭취함으로써 대사성 골질환, 특히, 골조송증을 예방 또는 개선하는 것이 기대할 수 있다. 또한, 이 배양물중에 함유되는 2-아미노-3-카르복시-1,4-나 프토퀴논 및 나프토퀴논의 유도체는 대사성 골질환의 예방, 치료약으로서 유용하다.

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
2-아미노-3-카르복시-1,4-나프토퀴논을 유효성분으로 함유하는 골형성 촉진용 음식품.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제