TW586935B - Saponin-containing vaccine preparation - Google Patents

Description

586935 案號 88115728 年 月- 曰 五、發明說明（1) 【技術領域】 本發明係有關於以植 含此佐劑且在人及動物的 苗製劑者。 【技術背景】 疫苗被使用於各種疾 (天花）的特定病患上已漸 由於擁有許多疫苗的副作 疫苗的改善被強烈地期待 物專用的大多數疫苗，皆 做為抗原材料使用。因此 使病原體增殖的介質之成 將成為在接種時，引發不 量地接種賦予免疫作用之 之情形。 在儘可能避免上述情 I造方法可為’減少疫苗 度、改變接種技術等。但 更、將導致（容易降低）疫 疫力的降低’以往的佐劑 上卻殘留下有效性和安全 一般而言，大部分的 果將使血中抗體效價上昇 微生物所產生的疾病。另 ii # m微生物可透過呼 物皂 疾病 病的 顯現 用以 著。 是取 ，無 分是 被期 抗原 況下 的接 是， 苗免 已被 性之 疫苗 ，若 一方 吸道 素為有 >丈成分之佐劑，以及 之預防成治療上有效用之疫 預防，且在針對如患牛痘 出許多輝煌的成果。但是， 及其效果不完全之例子，故 目前，使用於人體專用或動 出病原體或病原體的一部分 法否定構成病原體之成分和 否混入疫苗中之可能性。這 許之副作用的原因，又若大 部位本身，亦有引發副作用 ，擁有優 種量，提 一般而言 疫力之問 利用。然 提昇等應 是藉由注 持續此情 面，因為 粘膜傳染 良之安全 高疫苗抗 ，件隨著 題的發生 而，在習 該改善之 射而被接 況，將可 如流感病 ，所以為 性的疫苗 原的純 如此的變 。針對免 知的佐劑 課題。 種。此結 防由病原 毒般之空 了阻止在

2125-278卜PF1 586935

案號 88115728 五、發明說明（2) 傳染初期階段之患病，故可強力引發與其在血中不如在# 膜之局部免疫的疫苗之事是被期望的。為此需要尋找容易 引發局部免疫之佐劑。因此就疫苗開發而言，有效且安 全’並容易引發必要之免疫的優良佐劑之開發為重要的課 題0 做為注射以外的接種技術而被注目者為口服接種或魯 孔吸入接種。因為注射非醫療技術者不可執行，例如1 ^ 療叹施不完備的情況下進行涉及廣範圍之疫苗接種時，注 射將成為障礙。對此，在口服接種或鼻孔吸入接種方面\ 只，攜帶疫苗製劑、即使無專家直接的幫助也能夠接種。 但是，一般在如此接種技術下將容易造成免疫不 故佐劑仍然是必要的。 ’ ，往，在疫苗方面做為佐劑之鋁化合物（硫酸鋁、 氧鋁、磷酸鋁等）漸被廣泛地使用起來。目前，銘 幾乎成為能約使用於人體用疫苗之唯一的二口。 即曰田ί佐劑方面’將有如其下的問題點被要求改善。 』：大=佐：在每批製造上易造成品質的差異，故不 操作變為須ΐ:Ϊ加=熟悉管柱操作之故’而使精製 性免疫的誘導wif:上的問題，雖然具優良之液 以在組合抗原ί將胞性免疫的誘導力將變低，所 以改善這歧你炎 究開發。並舉；列做為ΐ例J行植物阜素等之新佐劑的研 ;· ，表面活性作用物質。 」|a母素等，細菌毒素。 586935 — 案號 88115728 年月 日 修正 五、發明說明（3) 3.BCG、胞壁醯基胜肽（muramyl peptide)等，微生物 或植物成分。 4·内干擾素等，内質素。 5·陰離子合成率合物，陽離子聚合物等。 6·微載體等。 植物皂素類是，被包括於植物體内、總稱為三萜糖苔 (triterpene glycoside)和類固醇杳（steroid glycoside)之化合物族群。從古以來即知、被包括於植物 皂素之植物析出物有時也擁有佐劑之作用。但是、因為植 物皂素具有複雜的構造，且在佐劑作用以外也呈現出多樣 化的活性，故鑑定何種植物皂素化合物擔負佐劑活性之事 非常困難’即使在目前也非容易之事。 例如攸植物皂樹（(扣)植物皂素析出物 的一個凝膠Α中，20多種的植物皂素化合物被分離出，其 中QS-21等複的成分呈現出佐劑活性之事已被明顯化（曰本 專利公報（人）、平2-504266)。卩8-21具強力的細胞性免疫 誘導力，其做為補救鋁佐劑缺點的佐劑之研究被持續進 行。但是，QS-21卻擁有精製困難、構造複雜以及在溶解 性上之問題。因此，更有效率、價格便宜且安全的佐劑之 開發有其需求。例如植物皂素一般都呈現出強溶血活性。 由於溶血是成為貧血，臟器機能障礙、營養失調，或血 等，副作用症狀的原因，特別在做為注射劑接種時將成^ 問題0 '、 ^又本發明者們也明顯地表示，由類種生藥所構成之 藥萃取液中的某種物質具有佐劑作用，在藉由鼻孔吸入接 586935 _案號88115728_年月日_魅__ 五、發明說明（4) 種來使用流感疫苗的構成成分時，將使相對於在鼻腔洗液 或血清中之流感病毒之抗體效價上昇（H. Yawada and T. Nagai. Methods and Findings in Experimental

Clinical Pharmacology， 20(3)， 185-192， 1998)。但 是，在佐劑作用是藉由萃取液的何種化合物而造成之事這 方面，仍然尚未明白。 【發明概要】 本發明的課題是，為了製造即使減少疫苗使用量且改 變接種技術也不會使免疫力降低之疫苗，所提供使疫苗免 ^力增強之新方法。更具體地說，本發明的課題為，從生 藥中的植物皂素中，找出構造更單純且具有高安全性及有 ，性之植物皂素，並以其做為新穎的佐劑來開發。因為中 藥在中國、日本和亞洲各國皆經過長年的臨床使用而確立 :其有效ϋ和安全性’故其做為本課題之材料是非常合適 本發明的課題為，提供作為具高效果和安全 性之新規佐劑的一群植物皂争 之庐钴，# >二机 f k供包括這些植物皂素 之焱田，並也貝獻於有效且安全之疫苗製造上。飞 本發明者們以達成上述課為 於二百類十多種生藥之熱水萃取物之：孔關 生荜「遠*叙^檢索呈現佐劑性之物。其結果發現 利用臟和高效能液相的/性°更者，藉由 法，可鐘定由遠志二水層二= χ . 幻…、水萃取物中萃取分雛φ从亡#上、 y分’其結果為，在持有竿胜定嫌，生的儿:離出的有效成 二:》隱—二—^疋構&的化合物上發現強力的

第10頁 586935 ---案號88Π5728_年月日 條正 __ 五、發明說明（5) 无疫剌激活性，並且確認此化合物上具有可期待之高安全 性’而完成本發明。即是本發明係有關於以下的佐劑，以 及使用此佐劑之疫苗製劑。 (1) 包括以原遠志皂配基（presenegenin)骨架為母 核’且藉由糖侧鏈基或糖側鏈取代基使其28位被取代的植 物息素之佐劑，但是前述糖側鏈取代基是4取代的情況 為’包括以芹糖側鏈做為必須的取代基者。 (2) 如（1)所記載的佐劑，其中直接鍵結於前述植物皂

素的28位之糠側鏈基或糖側鏈取代基為碳數3以上的糖側 鍵基。 (3) 如（2)所記載之佐劑，其中直接鍵結於前述植物皂 素之28位的糖側鏈基或糖侧鏈取代基為岩藻糖側鏈基 取代體。 ' 、（4)如（3)所記載之佐劑，其中植物皂素為呈現下述構

2125-2781-PFl.ptc

第11頁 586935

案號 88115728

年月日 修A 五、發明說明（6)

式中、Glc表為葡萄糖支鏈，fuc表為岩藻糖支鏈，Rha表 為鼠李糖支鏈，Xyl表為木糖支鏈，Ri表為，單甲氧肉桂 酸支鏈，或三甲氧基肉桂酸支鏈， R2表為，氫或岩藻糖支鏈， 於3表為，氫或芹糖支鏈， I表為，氫或阿拉伯糖支鏈， I表為，氫或半乳糖支鏈， (1)如（4)所記載之佐劑，其中植物皂 〜 ， t |馬至少白杯 種由以下之無群中所選擇出來之化合物 匕枯'

&為單甲氧肉桂酸支鏈，I?2為鼠李糖支鏈為 鍵’ R4為氣’然後Rs為半乳糖支鍵所構成之化^^ 支 h為三甲氧基肉桂酸支鏈，&、Rs、R4為氫，缺Ί ’ 糖支鏈所構成之化合物， …為半乳

2125-2781-PFl.pt 第12頁 586935 案號 88115728 五、發明說明（7) R〗三曱氧基肉桂酸支鏈，心為氫，為芽糖支鏈，、為阿拉 伯糖支鏈，然後&為氫所構成之化合物，以及為三甲氧 ^肉桂酸支鏈，&為氫，R3為芹糖支鏈，然後&和 構成之化合物。 〇 ~ Λ f 、（2)如（1)〜（5)的任一個所記載之佐劑、其中前述植皂 素為由生藥所調製之植物皂素。 (3) —種疫苗製劑，其包括了記載於（1)〜（6)的任一種 (4) 如α)所記載之疫苗製劑，其是為了鼻腔吸入接種 或口服接種之物。 (5) 如（8)所記載之疫苗製劑，其包括了由作為免疫抗 原成刀之/’丨L感病毋、輪狀病毒、麻療病毒、風療病毒、勝 腺炎病毒、愛滋病毒、百日咳菌、白喉菌、小絨毛螺桿 菌、出血性大腸菌（EHEC)、披衣體原蟲、黴漿體原蟲、瘧 疫f蟲、毒漿體原蟲、以及住血吸蟲所構成三族群中選出 之單一或複數的病原微生物之抗原者。 或者本發明為有為關於以原遠志皂配基骨锫為母核， 並且藉由糖側鏈基或糖側鏈取代基取代其28位之植物皂素 但是在前述取代基為4取代時，則須包括做為必順取代基 之芹糖支鏈基；及其做為佐劑之使用，以及其在佐劑製造 上之使用，更進一步地說，本發明係有關於這些佐劑之疫 苗製劑的使用，以及其在疫苗製劑之製造上的使用。 藉由本發明所構成的植物皂素之佐劑為，擁有齊墩果 烷（oleanane)骨鹤之植物皂素的一部分，並且以原遠志皂 配基做為母核之一族群的化合物。本母核構造在CAS的命

2125-2781-?Fl.ptc 586935

羥基 QS_21等是做為具有佐劑活性的植物皂素，且構造已 之Λ合物。但是’本發明的植物皂素為不同於 如夕楠。;白類本緣之植物皂素。$然的_21也{具齊墩果烷骨 &植物皂π的另一部分，但是其母核為皂樹酸 2acid)，、且擁有此母核與各種糖或其他結合之構 ^9 & 的命名法上，皂樹酸母核構造被記述為齊墩果 -^-^-酸-^二經基…-氧代…点，“，^)。 ^疋^成本發明的佐劑之植物4素的原遠志皂配基母核為 23，28-一羧基，且在2、3、27位置上具有羥基。另一方 面：皂，酸母核為23-路基-28_幾基，且藉由其3, 16位置 形成經基之點而在構造上被明白他區分。 铂”更^一步地，在藉由特異的醜基使直接鏈結於母核的 第28位置之m基上的糖側鏈基被取代之觀點上，以及此糖 :鏈基為4取代以上時所包括做為必順取代基之芽糖支鏈 二構成本發明的佐劑之前述植物矣素)為新規 拖-4卜i劑。Χ ’在本發明中’前述糖側鏈基的取代 類意味者以與母核之鍵結當作！所含有的鍵結類。做為鍵 結於，核的28位之糖側鏈基者，以碳數為3以上的糖糖 醇或疋葡糖-酸為佳’而做為此類的糖側鏈基而可具體地 舉例者為甘油糖側鏈基’赤蘇糖側鍵基、岩藻糖側鍵基 (以Fuc表示），葡萄糖側鏈基（以门ρ圭一、 β

mSed〇heptUlaSe)_#|。=)，以及牙、天庚嗣 Α + π β 尤其為岩藻糖側鏈基時，則 586935 MW. 8811572« 五、發明說明（9) " -------- 糖為岩藻糖側鏈基時，若藉由一般式表示其特別期待之植 物皂素，則如前面所述者。鍵結於這此母核之28位的糖側 鏈基即使更進一步地藉由如醯基或糖側鍵基之任意取代基 而被取代亦可。做為醯基而可列舉者為單甲氧肉^酸側^ 基（monomethoxycinnamoyi，以MC表之）和三曱氧肉桂酸側 鏈基（himeth〇xycinnamoyl，以TC表之）。或者也能夠顯 示出藉由乳酸、丙酮酸、丁二酸等的有機酸，成油酸等的 ，級脂肪酸之敗代。更者，也魴夠舉例出此醯基自身藉由 氨基、經基、硝基、腈基、磷酸基、或鹵素等而被取代所 形成之化合物。此外也包括由醯基與糖側鏈基結合所形成 之化合物。另一方面，在做為取代基而能夠舉出之糖側鏈 基者，·可舉出如鼠李糖侧鏈基（以Rha表之）、芹糖側鏈基 (以AP\表之）、岩藻糖侧鏈基、阿拉伯糖側鏈基（以Ara表 之）、木糖侧鏈基、葡萄糖側鏈基（以Glc表之）、葡萄糖醛 酸側鏈基、半乳糖醛酸侧鏈基、甘露糖側鏈基、甘露糖醛 酸側鏈基，以及半乳糖制基。這些糖_基通f能夠鍵 結在母核28位之上述岩藻糖側鏈基之2位、3位及4位的任 二位置、或者複數的位置上。例如在上述的一般式上，κ 藉由醯基、然後匕藉由糖侧鏈基被取代所形成之化合物可 被舉例出。 :士述構造的植物皂素’其擁有高的佐劑活性之事無 别之文獻的記述中來預測。例如在有關qs_2i的構 造活性上之研究方面，如母核的23-醛基在活性發現上是 重要的之見解已有報告（s. S0ltysik，J Yi 見上疋

Recchia, D. A. Wheeler, M. J. Newman, R. T.

麵

586935 --鍵」81卿 车月 日 後, 五、發明說明（10) "" —— ----

Coughlin and C· R· Kensil， Vaccine， 13， 1403-1410 \995 )。但是本發明的植物皂素，雖然其23位並非醛基而’ 是羧基，但仍具有高的佐劑活性。此事藉由本發明者"們之 長年的研究，首次使其成為顯明且新的知識。 構成本發明佐劑之植物皂素為，具備因上述構造而被 特定的原遠志皂配基母核之化合物。做為具有在本發明中 所使用之原逆志皂配基母核之植物皂素者，若欲舉例出其 具體的物質名「則能夠舉出例如遠志植物皂素A、e、ρ及 G，這些化合物的構造和製造方法是公知的（s· sakuma and J, Shoji, Chemical and Pharmaceutical BULLETIN， 29， 2431-24441， 1981; S， Sakuma and J·

Shoji， Chemical and Pharmaceutical Bulletin， 30， 81 0 - 8 21，1 9 81)。但疋’至此在疫苗上之佐劑活性仍不為 所知。為了特定這些化合物的構造，將R1-R5的取代基整 理集中於表1。表中的略號表示上述的取代基。在此有關 顯示於表中的遠志植物皂素’若顯示如先前所使用之鍵結 於母核的28位之岩藻糖侧鏈基的取代數，將成為A: 4， E:3，F:3，然後G:3。

表1本發明的遠志植物皂紊的構造 遠志植物皂紊 R1 R2 R3 R4 R5 A MC Rha Api Η Gal E TC Η Η Η Gal F TC Η Api Ara Η G TC Η Api Η Η

2125-2781-PFl-ptc 第16頁 586935 MM 8811S79« 五、發明說明（11) #使用於本發明之植物皂素為天然物質，例如以生藥等 的某用植物做為原料，藉由公知方法的組合，即能夠萃 取二離精製、製造之。藉由合成化學的手段也能夠製 ie。若欲顯不其例，則如下所示。 將含有植物皂素之生藥的遠志（polygalae Radix)、 /、原種植物P〇lyg〇la tanuif〇lia wild.或其他的同屬植 乙醇、丁醇等的低級醇類’氣仿等的有機溶 媒，水來卒取，於蒸餾除去溶媒後，針對萃取物再藉由矽 膠官柱色層分析法等來進行精製，即能夠獲得使用於本發 j的，物皂素。或者基於狀況，在藉由含水有機溶媒進行 卒取後，使用已烷等之烴類化合物來脫脂，再藉由氣仿、 水和氯仿、水和丁醇等的混合溶媒使具分布，蒸餾 除去有機溶媒之可溶部的溶媒，其後針對萃取物再進行管 柱色層分析法亦可獲得使用於本發明的植物皂素。或者也 可能應其所需’使用甲醇等使其再結晶。 將本發明的佐劑做為疫苗的有效成分來使用之使用狀 ，並無特別地被限定。即是，公知的各種適當使用狀態是 :能的，而物理上的混合成與抗原蛋白進行化學上的結合 ^亦可。被内色於核糖核蛋白體等的載體上也可。構成本 的佐劑之植物4素可以僅使用一種類或者也可以混 複數種來使用。 更者，本發明的佐劑能多與公知佐劑的i種以上同時 ^使用。例如在實驗例5方面，顯示包括本發明的植物皂 ’、和鋁佐劑之百日咳白喉破傷風混合疫苗的例子。本發明 ^劑在與銘佐劑同時使用上可^發耗胺夕备游活桃。而 586935

$做為本發明之佐劑而採用之植物皂素的種類，或適宜組 之A知的佐劑’配合成為免疫原之抗原種類、接種之動 種類或安全性等應該考慮之條件，即能夠經驗地找出其 k切的組合。其結果將使抗原的量降低，另外也降低了一 J 佐h的量，並使非期待之副作用減低，故能夠增強戶斤 期待之免疫反應。 做為應該考慮之安全性指標之一者為植物皂素的溶血 ，性。特別是針對人類而使用的情況下，在上述植物皂素 中，例如做為遠志植物皂素E、F 所呈現的植物皂素， 在溶血活性低的情況下有利。這些植物皂素，在鍵結於Μ ::ίρ基ί糖側鏈基為岩藻糖、1更進一步地在岩藻糖側 鏈土的R2為虱時，為擁有共通構造之化合物。但是，如同 做為$志植物皂素Α所顯示的植物皂素之溶血活性未必為 $被容許之物。例如選擇很難直接轉移到血中之接種路徑 來使用，則佐劑的接種次數被限定而在能夠容許的水準^ f使用之事是可能的。其他，藉由公知的化學 導溶血活性低的成分（例如遠志植物皂素E)，其可做謂 =出其他誘導體之材料來制。以本發明的料劑為基本， 提供新規的疫苗製劑。本發明的製藥包括 苗。即是，"包括在人及動物的病毒、細菌、真】義；疫 屬―、由於其他微生物之感染體上有效用之狹義的度疫苗。 若不例其一部分，則可舉出如流感疫苗、百口咳疫 製白日咳白喉破傷風混合疫苗、日本腦炎疫苗、b型肝、月 疫苗、輪狀病毒疫苗、麻疹疫苗、風疹疫苗、腮腺炎疫 __療風合疫苗、麻療風療混合疫苗、以及 2125-2781-PF1·! 第18頁

^^111 586935

:血桿菌流感疫苗等的各種疫苗。更I、包 色葡萄狀球菌(MRSA)疫苗、小絨毛螺桿菌疫苗、：：卜 ?菌贿)疫苗，沙門菌疫苗、披衣體疫苗，黴=大 j、愛滋病疫苗、瘧疾疫苗、毒漿體疫苗、或住 2 二。2)做為更廣義的疫苗著包括在癌疫苗、不孕疫苗蛾f 項瘍疫苗、糖尿病疫苗及動脈硬化症疫苗等非感染症二 防和治療上有效用的疫苗。 ’預 ^這些疫苗包括藉由製造方法而被分類的種疫苗。即 是包括弱毒化生疫苗、不活化疫苗、成分（c〇mp〇nent) 疫田、基於DNA之疫苗等。在基於dna之疫苗中，除了含有 編士質^等的載體之DNA斷片的疫苗外，併用脂質體和3反 義寡核苷酸（anti sense 〇i igonucl e〇tide)等之疫苗也被 包括。此外，針對ΜΑ斷片、脂質體、或反義寡核苷酸藉 由本發明的植物皂素佐劑，其透過性的提昇可被期待的。 這些疫S做為治療用也可做為預防用也可。又，就疫苗的 效果而言’使用應用基因重組技術使重組生物細胞生產有 效的抗原成分之重組疫苗也被包括。這些疫苗可為單一疫 田也可為混合疫苗。若示例這些疫苗的製造方法和使用狀 態，則如下所示。 流感疫苗；藉由發育雞卵或Vero細胞等動物細胞培養 技術’在_與表面活性化劑等之下分解精製它增殖的病毒 而得’或藉由基因重組技術或化學合成而得到包括紅血球 凝集素（HA)、唾液酸苷酶（NA)、核蛋白質（NP)、複製蛋白 質（基體蛋白質）（M)或其一部分等之斷裂疫苗。又，含有 包括這些蛋白質基因的DN A斷片之鼻孔吸入接種用DN A疫

2125-2781-PFl-ptc 586935

___案號 88115728 五、發明說明（14) 苗。 百曰咳疫養液或菌體中萃取後、藉由甲醛而 化的不活化疫苗。或者，包括藉由基因重級 …、毋 處理所得做為已誘導人工變異株生產物之變里=或突變劑 菌毒素（PT)、紅血球凝集素（FHA)、69K唭蛋=哲的百日咳 分縮氨酸等之疫苗。 質、或其部 百曰咳白喉破傷風混合疫苗；在百日咳疫苗 嘴類毒素及廠破傷風類毒素之三種混合疫苗又。田此入白 曰本腦炎疫苗；使用超離心分離或乙醇等，

腦内增殖的病毒、或藉由Ver〇細胞等動物細 '在老鼠 增殖之病毒精製成病毒粒子後，再藉由甲醛 ^曰術月 化者，或者包括藉由基因重組技術或化學 ^不^ 抗原蛋白質之疫苗。 或專而獲得合 ^超離心分離等’分離精製HBS抗原所得的原生質衍 生（Plasma-derived)疫苗，或者含有藉由基因重組 化學合成等而獲得的抗原部位等之重組疫苗。 κ艺 麻疹疫苗；在雞胚胎細胞等的培養細胞或發育卵上增

殖之弱毒病毒生疫苗，或者是含有藉由病毒的一部分，^ f藉由基因重組技術或化學合成而得的感染防明 毒生疫苗。 羽 殄殁备·耳另災隹雞胚胎細胞等的培養細胞或發育 之病毒，或者其，，或藉由基因重組技； 或化子a成所得的感染防御抗原的疫苗。 灾疫备·含有在家兔細胞等的培養細胞或發育雞

2125-2781-FF1·ptc Ίϋ 第20頁 586935

i號；8sm7% 五、發明說明（15) 卵中增殖之病毒，劣甘 Α ,^ ^ 或其一部分，或者藉由基因重組技術戋 化學合成而仔的感染防御抗原的弱毒生疫苗。 衍成 混合S:風疹混合疫苗；混合麻疹疫苗、風疹疫苗之二種 苗Hit:腺ί混合疫苗；混合麻療疫苗、風療疫 田曰疾心田之二種混合疫苗。 輪狀病毒疫苗；含有在ΜΑ104細胞等培養細胞 病ί、或從患者的糞便中獲得的病毒或其-部分，^者$ 由土因重組技術或化學合成而得感染防紫抗原之疫苗9 =體疫苗；含有在徽裝體增瘦用培養基 部分，或藉由基因重組技術或化學合成而：： 的感&防示抗原之疫苗。 愛滋病疫苗；含有在培養細胞中增殖的病毒、或由串、 者得到的病毒或其一邻八 武去基^ ‘ 人士、&從α /刀，或者藉由基因重組技術成化學 口成而k侍的感染防禦抗體之疫苗；或者 片之DNA疫苗。 另双㈣A斷 ml、ΐ毛疫苗；以由培養的小絨毛菌體的破碎物或小絨 J =物中分離的脲酶、熱休克蛋白質、毒素等做為抗原 之疫田，或者從藉由基因重組技術而被生產的這些抗原蛋 白質所構成之注射用或口服、由鼻吸入接種用之&苗’。、 、 上述疫苗皆以液體狀或粉末狀被提供。在粉末狀的情 况下藉由/東結乾燥等的方法能夠使其變為粉末製藥。若 為液狀製藥，則大多較適用於鼻腔内接種（鼻腔喷霧器、 液商塗抹專）或注射的狀況。或者由鼻吸入接種的情況 ^可能採用粉末霧器的方式。又在本發明的疫苗製劑方

2125-2781-PFl-ptc 第21頁 586935 tm 88Π5728 修正 曰 Λ η 五、發明說明（16) 面、可配合公知的安定劑或防腐劑。在安定劑方面，約〇· 1〜0· 2%的明膠或葡聚糖、〇· 5〜丨· 〇%的穀氨酸鈉、或者約5% 的乳糖或2%的山梨糖醇等是被使用。做為防腐劑者，約〇· 0 1 °/°的乙基汞硫代水揚酸鈉或約0 · 1 %的泠-丙内酯是公知 的。 做為本發明的疫苗製劑的疫苗抗原和植物皂素的混合 比率’例如可示例為i : 〇 · 〇 〇 〇丨〜i :丨0 0 0 0 (重量比）。此範 圍始終為一般的範圍，且相應於疫苗的種類而決定適切的 比例來使用。為此必要的方法就此領域的專定而言，S 所皆知的。 疋 本發明的疫苗製劑藉由在上述免疫源中以所定的量比 混合t發明的佐劑來調製。調製必需在嚴密且無菌的情況 下進行。各個的原材料也必需是完全無菌的。當然，除了 疫苗作用夕卜，必需儘彳能也地預I除去如成為必 過敏源的雜蛋白質。就此領域的專家而言，為此必 法f眾所皆知的。本發明的疫苗製劑、藉由預先各 調t疫苗抗原和本發明的植物息t ’使其製藥化，而在使 用％，混合後接種成分別在大約同時間 發揮其效果。 &犯夠 疫苗的接種法 本發明的疫苗製劑的使用方法，可 法。接種量老鼠的情況下於鼻腔内接種5么口㈣= 人的情況下鼻腔内接種或注射之任一开0微升在 έΒ人士 X» » JL. f >克疫抗原的 組口方面、例如在如下所示的免疫 -------原上，以疫苗效果的

2125-2781-PFl.ptc 第22頁 升為適宜。這些量能夠適當地變更 二=1 10毫 ^ 又’在與免疫抗原的 ^^6935 案號 88Π5728

五、發明說明（17) 觀點或以接種操作的觀點來看，由魯 是被期許的。 田鼻吸入接種或口團接種 流感病毒、螺旋病毒、廠疹、 病、百日咳g、白喉、小絨毛二、聪腺炎、愛滋 衣體、激將μ、谨症；§ * φ 血性大腸菌（EHEC)、技 仅體Μ水肢、瘧疾原蟲、毒裝體 這些免疫抗原單獨接種的情^及住血及蟲。 °亥、白喉、破傷風三種混合疫；m也能採用如百曰 疫苗的形式來同時接種。由鼻接、風療-種混合 的理由是因為氣管與消化管的===接種被期許 為了誘導為感染途徑之局部枯膜嫌感乐途徑之故。 疫剌激活性的強力佐劑是被期待 =免 疫苗一般，在充分醫生或護士之專^ ^於否癔疾原蟲 種之所謂由鼻吸入接種或口服接的：種j術者也能夠接 的。 胝钱禋的接種途徑是被粉望 的簡單說明 圖1為’顯不在由鼻极入接m -jbv j. ^ 劑中做A^ ^ A广 接種使本發明的疫苗製 二ΐί苗之時的血清中之-次抗體產生的 為所使用佐劑的種類。 、表 圖2為，顯示在由鼻吸入接種使用於 2ΓΓ:之流感疫苗時的血清中之二次抗體二 使用：佐:丨:類縱轴表為接體價(2ηΗΙ單位)、橫轴表為‘ 麵 筚中ΓΛ’顯示在由鼻吸入接種使用於本發明的疫苗制 二^做為疫备之流感疫^時的鼻腔洗液中之二次抗體產生 ΙΜ

2125-2781-ΡΡ1 第23頁 586935 曰 tS 88n5728 五、發明說明（18) =用圖中’縱轴表為抗體效價（ELISA單位）、橫 袖表為所使用之佐劑種類。 圖4為，顯示在由鼻吸入接種使用於本發明 i-欠？ίί=百曰咳白喉破傷風混合疫苗時的血劑中之 (EUsI單位）Λ果之圖。圖中，縱轴表為抗體效價 、 仏軸表為所使用之佐劑種類。 圖5為，顯示在由鼻吸入接種使用於本發明 劑中做為疫苗之百日咳白破傷 衣 中的八+ 傷風合疫苗時的鼻腔洗液 (ELISiO 的結果之圖。圖中，縱軸表為抗體效價 (ELISA)、杈軸表為所使用之佐劑種類。 圖6為，顯示本發明佐劑的溶血活性之圖。 軸衣為所放出血紅黍白納旦（产 縱 為植物息素的最終濃度(微克/毫升）。 也、軸表 圖7為，顯示在由鼻吸入接種使用於 劑中做為疫苗之流残疫苗，及佶用柄用月的疫苗製 中之t科* 4· 里的佐劑時的血劑 (二一單果之圖。圖中、縱轴表為抗艘效價 C 早位）’ &軸表為所使用之佐劑種類。 圖8為，顯示在由鼻吸入接種使用於本發明 劑中做為疫苗之流残癌贫多_ 4 县 &田衣 洗液中之--欠量的佐劑時的鼻腔 无履甲之一久抗體產生的結果之圖。圖中，縱 效價（ELISA單位），橫軸表為所使用之佐劑種 …几 复施發明的悬#栌能 、 定於Γ匕以下顯示本發明的實驗例’然而本發明絲毫不被限 f驗例1·植物息素的

2125-2781-PFi-pt 第24頁 586935 案號 88115728 a 修正 五、發明說明（19) 顯示遠志植物皂素A、E、F及G的製造方法。遠志植物 皂素A、E、F及G是以庄司們的方法（S· Sakuma and J· Shoji, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 29, 2431-2441, 1981； S. Sakuma and J. Shoji, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 30， 810-821， 1981)為 標準製造而得。 即是，使用1公升甲醇回流遠志（5 0 0克），即得曱醇之 可溶性部分。關於殘渣重覆6次相同的操作，藉由減壓乾 燥固定曱醇可溶性部分而得到曱醇萃取物（所得重量丨5 〇 克，回收率30%)。將本萃取物溶解於精製水後，重覆3次 使用1公升苯之振盪萃取的操作，除去脂質部分。更進一 步地，重覆6次使用1 · 5公升和水之丁醇振盪萃取所得的水 層之操作，即得丁醇可溶性部分。減壓乾燥固定此丁醇可 溶性部分後，再次將其溶解於3公升丁醇中，減壓濃縮至 約1 / 5，將析出的沈澱做為粗植物皂素均分（所得重量4 〇 克，回收率8%)。使用飽和水丁醇在矽膠管柱色層分析法 上分割本粗植物皂素部分，即得遠志植物皂素D，E，j?及g 的混合物部分（Fr· 1)和遠志植物皂素Α、β及〇的混合物部 分（Fr· 2)。將此Fr· 1和Fr· 2各自藉由矽膠管柱色層分析法 分割之（洗脫液；氣仿-甲醇—乙醇—10%醋酸=8:4:丨：2 (使 用上層），從Fr.l得到粗精製遠志植物皂素F部分\G部分 及D、E混合物部分，又從Fr· 2得粗精製遠志植物皂素A部 分、B部分及C部分。更進一步地，藉由矽膠管柱色層分析 法分割遠志植物皂素D、E混合物部分之（洗脫液；丁醇〜乙 酸乙S旨-水= 4:1:2 (使用上層））’即得粗精製遠志植物息

2125-278卜PFl-pt( 第25頁 586935

案號 8811572ft 五、發明說明（20) 素D部分及E部分。更進一步地，使用葡聚糖凝膠精 製（洗脫液；甲醇）這些粗精製遠志植物皂素，即獲得各個 精製遠志植物皂素A (回收率〇· 52%)、B (回收率〇· 77%)、 C (回收率1· 07%)、D (回收率〇· 29°/。）、£ (回收率 〇 〇·28%)、F (回收率 〇·94%)及g (回收率 〇·11%)。 耋_驗例2 ·植物皂紊的調,—9 _當製造遠志植物皂素A、Ε、F及G之時，嘗試使用各種 高效能液相色層分析法（HPLC)之製造方法。 、=是，將溶於10公升精製水的500克遠志煎熬析出至 液體量成為一半後，使用不透鋼篩網過濾，關於殘渣再次 加入10公升的精製水進行同樣的操作。合併所有萃取液再 玻璃，維濾紙過濾，藉由凍結乾燥所得濾液即得到熱 1取之萃取物。將本熱水萃取之萃取物133· 9克溶解於 / I ίI的精製水中，藉由離心分離得到上層澄清液。在 曰=β液中加入4倍量的乙醇，藉由於室溫下攪拌一晚 二乙醇沈澱。為水區分沈澱，將此溶液靜置一日使沈 ^ irt ν來區分出上清液與沈澱，更進一步地對於不能區分 餾^ i進行離心分離。合併所得的上清液，再藉由減壓蒸 ^ =媒，即得乙醇沈澱之上清部分再以1公升的水溶 取，^ Ϊ沈澱之上清部分後，使用600毫升乙烷振盡萃 八升顧、月曰貝部分’關於水層方面，更進一步地先使用1 ΐ，i f、，、其次再使用3公升的飽和水正丁醇振盪萃取 可冰w： i減壓蒸餾除去容媒，即得氣仿可溶性部分及丁醇 j心性部分。 586935 修正 案號 88115728 五、發明說明（21) 後，使用透析膜（分子量篩1〇〇〇〇)，相對精製水透析1〇 ^，再藉由減壓蒸餾除去透析内液，即得氣仿可溶性及丁 醇可溶性的非透析性活性部分。所得的部分再藉由使用羥 基磷灰石管柱之HPLC以水和乙腈的混合溶媒做為溶解析^ 液分割之，即得遠志植物皂素A、E、F及^的混合物。 、更進一步地，藉由使用苯基管柱iHPLC，以水和乙腈 的混合溶媒做為洗脫液分割這些活性混合物部分，即得包 括遠志植物皂素A、E、F及G之部分。此外，在此精製法 中，即使未經過使用羥基磷石灰之HPLC的過程， 得遠志植物皂素A、E、F及G。 確認原遠志皂配基母核的植物皂素做為佐劑是有效之 方法，可藉由公知的生物學方法。 ^遠志植物皂素A、E、F及G，相對於各和疫苗具有增強 抗體產生之活性，以下將顯示確認其做為佐劑之有效性 實驗例。 ϋ相對H被經鼻吸八-接—種之流感H A疫苗之机體產生 JLi增強作用 --~

2125-2781-PFl-ptc 第27頁 匕使用乙醚處理從精製流感疫苗（A/PR/8/34株）中除去 脂質成分，藉由等量混合已調製之HA疫苗（HA量為〇·5毫克 /毫升）和、採用實驗例丨所記載的方法而精製的遠志植物 皂素A、Ε、F或G之生理食鹽水溶液（1毫克/毫升），調製接 種材料。此外，在此所使用的遠志植物皂素的各部分之純 度至常為約95%以上。以阿米妥麻醉BALB/c老鼠（7週大的 雖鼠）後’以微量吸量管在左側鼻腔内滴入2〇微升的接種 材料。4週後’在乙醚麻醉的條件下，藉由從老鼠心臟之 586935 _案號881157¾ —年 月 日___ 五、發明說明（22) 全血來回收血液，調製血清。首先、藉由RDE (receptor destroying enzyme，受體分解酵素）處理除去血清中的非 特異的紅金球凝集物質。將此血清於U型微量滴定盤 (microtitre plate)上進行2倍稀釋，再與16 HA單位的病 毒混合後，放置於室溫下3 0分鐘，再加入雞的紅血球，並 放置於室溫下1小時後，判定紅血球凝集抑制（ΗI)抗體效 價。 圖1雖然呈現出相對遠志植物皂素A、Ε、F及G的血清 中之HI抗體效價的影嚮，但是在進行經鼻吸入接種單— ha 疫苗時，僅可檢查出水平之ΗI抗體。但是，若將遠志植物4 皂素A、Ε及F與ΗΑ疫苗一起接種，則血清中的HI抗體效價 比單一的情形下上昇8〜1 4倍。又，植物皂素G也提高ΗI抗 體效價3〜5倍。以上的結果顯示，遠志植物皂素將增強相 對其共存之流感疫苗的抗體產生。 f 一驗 例4 ·相對於流感Η Α疫苗之二次抗體產生之增強作用 等量混合同於實驗例了之流感HA疫苗（1毫克/毫升）和 試料的生理食鹽水溶液（1毫克/毫升），調製接種材料。將 阿米妥鈉接種於雌性、7週大的BALB/c老鼠的腹腔内而麻 醉之。經鼻接種20微升接種材料於老鼠内。飼養老鼠3週 後，，更進一步地僅疫苗二次經鼻接種之。在飼養一週後，礓I 調製血清及鼻腔洗液。清中的抗流感抗體效價將丨抗體 效價測疋之。鼻腔洗液，將從放血的老鼠的左右鼻腔中， 以包括1毫升的〇· 1%牛血清白蛋白（BSA)之磷酸緩衝生理食 鹽水（PBS)兩次灌流來回收之。鼻腔洗淨液中的抗HA—IgA 及抗HA-IgG量可藉由酵素免疫測定法（EUSA)測定。在定 586935 __案號88115728_年月日 修正 五、發明說明（23)

置抗HA-IgA之時’首先將懸浮於附著緩衝液（OQi μ碳酸一 碳酸氫鈉緩衝液、pH 9· 6)之ΗΑ疫苗（5微克/毫升）1〇〇微 升注入96孔之EIA平盤（ICN Biomedicals Inc·製）的各孔 (w e 11 )中進行表面附著，放置於室溫下2小時後，以加添 tween20的PBS(以下記為PBS-Tween)清洗平盤。其次再將 含有1%BSA及0.1%NaN3之PBS 200微升注入各孔進行表面附 著。於4 °C下放置一晚後，再以PBS-Tween清洗，其次於各 孔中添加入100微升鼻腔洗淨液的蛋白質G-經壤脂糖4FF (Amersham Pharmacia Biotech AB 製）之未吸著分畫。在 室溫下放置2小時後’以P B S - T w e e η清洗，其次再於各孔中 添加100微升以含BSA及0· l%NaN3之PBS之稀驗性磷酸酶 (alkal iphosphatase)標識山羊抗老鼠IgA ( α特異性，1 : 1 000 )。放置於室溫下一晚後，以PBS-Tween清洗，在個孔 中加入溶解於10%二乙醇胺緩衝液化（pH 9· 8)之對硝基笨 基填酸鈉（1毫克/毫升；Sigma-Aldrich Japan Co·製）。 於室溫下放置20〜30分鐘後，使用平盤讀出器（MRX — MD、 Dynamics公司製）以0· D. (405 nm)測定其發光。定量抗 HA- I gG之時，使用做為材料之鼻腔洗淨液的蛋白質瓊脂 糖4 F F吸著分割，而二次抗體則使用驗性填酸酶標識兔子 抗IgG ( 7 特異性，1 : 1 000 )。 圖2顯示出，對於藉由遠志植物皂素A、E、F及G的二 次反應之血清中的抗流感病毒抗體產生之影響。植物皂素 A· E· F及G使血清中的HI抗體效價，比單-HA疫苗的情況下 提昇27〜50倍。又，這些遠志植物皂素的佐劑活性與，做 為正面對照所使用之同用量的傷寒毒素B亞型（CTB;公開特

2125-2781-PFl-ptc 第29頁 586935 __案號88115728_年月日 修正 五、發明說明（24) 許公報（A)平2-243633)相同。 圖3顯示出，對於藉由遠志植物皂素A、E、F及G的二 次反應之鼻腔洗液中的抗流感病毒I g A及I gG抗體產生之影 響。在一次經鼻吸入接種疫苗時，僅檢查出極低水平的抗 HA-IgA及IgG抗體。對此右一次經鼻接種遠志植物皂素a和 疫苗之族群方面與一次經鼻吸入接種CTB和疫苗之族群相 同’更強地使泉腔洗液中的抗HA-IgA及IgG抗體效價提 昇。又，雖然遠志植物皂素F也提昇HA-IgA及IgG之抗體產

生’然而遠志植物皂素E及G僅在提昇抗HA-IgA上有統計學 上的意義。 這些結果顯示，被使用於一次接慟的遠志植物皂素擁 有非常強力地誘導因二次接種所引發之抗體產生的作用。 即顯不出，遠志植物皂素擁有強力誘導相對於共存之HA疫 苗之記憶效果的作用。 於百日咳白喉破傷風混合疫苗之抗體產生的增 強作用

混合北里研究所製的百日咳白喉破傷風混合疫苗（包 括百日咳15微克/毫升、破傷風2 LF/毫升、白喉20 LF/毫 升、氫氧化銘凝膠）和使用於實驗例3之遠志植物皂素的生 理食鹽水溶液（1毫克/毫升），調製接種材料。將阿米妥鈉 接種於雌性，7週大的BALB/c老鼠的腹腔内而麻醉之。經 鼻吸人接種20微升接種材料於老鼠上5進一步地於4週後 僅再追加接種同量的疫苗。飼養老鼠2週後，採取其血清 及鼻腔洗液。藉由ELISA測定血清中的抗百日咳毒素 ^PT) IgG、抗白喉毒素（DT) —IgG、抗破傷風毒素（ττ)-IgG 586935

案1 88115728 五、發明說明（25) =效價及鼻腔洗液中的抗PT_IgA、DT，A、 效4貝。 圖4雖為顯示相對於植物皂素a、£ =g=IgG 'TT-IgG抗體效價㈣響之圖= 篆方；在僅接種百日咳白喉破傷風混合疫苗 二疋=平之情形，一次接種在疫苗中添加ctb(傷裳毒辛 B亞型）者之族群將以相同的水平更強地使血清中的抗… 血清中的抗PT_IgG ’抗及抗 TT效價，然而植物皂素6僅在提昇血清中的抗 UG抗體政價上有統計學上的意義。來源於皂樹皮、皂 的樹皮的植物皂素混合物凝膠4，即使使用與其他試料相 同的，在相對於全部血清中的抗PT_IgG抗體效價，抗 2-UG抗體效價，抗TT_IgG抗體效價上’並沒有顯示出佐 劑活性。 圖5顯示相對於遠志植物皂素a、e、ρ及g之鼻腔洗液 中方面，即使在其終濃度為200微克/毫升，其溶血性幾乎 沒，看到之事，在遠志植物皂素G方面、中間水平的溶血 性是被觀察到，而遠志植物皂素A报明顯地顯示出溶血 性。 物皂素的溶血性式驗 一般而言，植物皂素顯示出溶血活性之事是被知曉 的 因此’為了檢討本發明的活性植物皂素的溶企活性， 將測定如下的溶血性。將绵羊的紅血球以磷

2125-2T81-?Fl.ptc 第31頁 586935 --紐88115728_年月 Q 修正 五、發明說明（26) " ~ " " | 清洗3次後’以相同緩衝液稀2 · 5倍才使用於本實驗。在 分注了遠志物皂素A、E、F及G的溶液（200、1〇〇、50、

25、6、25、3、125微克/毫升-PBS溶液）1〇〇微升之96孔V 型底的微量平盤上添加25微升的綿羊紅血球懸浮液，放置 於室溫下30分鐘後，以1〇00轉/分鐘離心5分鐘。移5〇微升 其上清液於平底平盤，使甩微量平盤讀出器（ffl〇del 45〇，

Bio Rad Lab.製）測定490 run的吸光度。試驗化合物的溶 血活性，將藉由從綿羊紅血球中放出的血紅蛋白所引發之 490 rim的吸光度之上昇來判定。圖6為顯示遠志植物皂素 A、E、F及G的溶血活性之圖。在各化物之間在溶血性上的φ 極大差異是被看見。相對於在遠志植物皂素E及ρ素方面， 則是211. 6 。

混合流感HA疫苗（HA 1毫克/毫升）和，含有溶解於pjgs 且過濾滅囷過的遠志植物皂素E和F之部分，使其成為如在 〇·5毫升中含有5〜1〇微克流感HA疫苗和1〇微克遠志植物皂 素般來調製之。將此分注於容器中，做為流感ΗΑ疫苗一遠 志植物皂素注射劑。本品能夠保存於i 〇它以下的冷暗 所。

中、其抗PT-IgA抗體效價、抗DT-IgA抗體效價、抗TT—IgA

2125-2781-PFl-ptc 第32頁 將如上述调製的流感HA疫苗及植物皂素接種於老鼠 上，調查4週後的抗體產生。由實驗成績看來，相對於心在 僅接種流感HA疫苗的老鼠方面，血中的^抗體為28，而在 添加植物皂的抗PT-IgA、抗DT-IgA及抗TT-IgA抗體效價之 影響。相對於在僅接種百日咳白喉破傷風混合疫苗之族群 586935 修正 Μ號 881157邓 五、發明說明（27) 抗體效價階是低水平之事，在一起一次接種遠志植物皂素 Α或F和疫苗之族群方面，同於一起一次接種Mg和疫苗之 族群’將以相同的水平更強地使鼻腔洗液中的抗pT—IgA、 抗DT-IgA及抗TT-IgA提昇。又，遠志植物皂素g可提昇鼻 腔洗中的抗DT-IgA及抗TT-IgA抗體效價。雖然凝膠A可稍 ，地提昇鼻腔消液中的抗PT_IgA抗體效價，然而其相對於 抗DT-IgA及抗TT-IgA抗體效價方面不顯示其佐劑活性。 志植物皂素製藥（點卑拜p 66 , 混合百日咳疫苗和，溶解於PBS且過濾滅菌過的遠志 植物皂素F，使其成為在20微升中含有做為蛋白質之氮氣 的百日咳疫苗15微克和遠志植物皂素1〇微克一般來調製 之。添加防腐劑（〇· 005%乙基汞硫代水楊酸鈉），分注於容 态中’做為百日咳疫苗-遠志植物皂素經鼻吸入接種劑。 本品保存於1 〇 t：以下的冷暗場所。 將如上述調製的百日咳疫苗及植物皂素接種於老鼠的 鼻腔内’在4週後道加接種同量的疫苗，調查其抗體產 生。由試驗成績看來，相對於僅接種百日咳疫苗的老鼠， 其血中的抗PT-IgG為156.3 ELISA單位，而在添加植物皂 素者之方面，則為334· 2 ELISA單位。又，鼻腔洗液中的 抗PT-IgA抗體，相對於在僅接種百日咳疫苗的老鼠方面， 為6 ELISA單位，而在添加植物皂素疫苗方面，則為12 E LIS A單位。 型肝炎疫苗-诔志梢物皇^^^注射用）的镅〜 混合B型肝炎疫苗和，包括溶解於PBS且過滅菌過的遠 f植物息素F和G之部分’使其成為在i毫升中含有做為蛋 第33頁 586935 案號 88115728 五、發明說明（28) 白質之HBS抗原40微克和遠志植物皂素1〇微克一般來調製 之。添加防腐劑（0 · 0 1 %乙基汞硫代水揚酸鈉）及安定杳丨〔 歸製動物膠）於此，分注於容器中做為B型肝炎苗 1 志植物皂素注射劑。本品保存於1 0 t以下的冷暗場所。 將如上述調製的B型肝炎疫苗及植物皂素接種於老鼠 上，調查3週後之血中的抗體產生。由試驗成績看來，相 對於僅接種B型肝炎疫苗的老鼠，在受射紅血球凝集反雁 上為23· 6單位，而在添加楂物皂素昔的方面，則為22· 6 單位。 _倒!0 ·日本腦炎癌苗一羞.志植物皂製(注射用）的m ^混合日本腦炎疫苗和，包括溶解於PBS且過滅菌過的 迫心植物皂素F和G之部分5使其成為在1毫升中含有1QU PFU相當量的不活化日本腦炎病毒粒子和i 〇微克遠志植物 皂素般來調製之。添加安定劑2%豬製動物膠）於此，分 注於容器中做為日本腦炎疫苗—遠志植物皂素注射劑。本 品保存於lire以下的冷暗場所。將如上述調製的日本腦炎 疫苗，植物皂素每隔丨週接種2次於老鼠上，觀察其血中的 抗體量。由試驗成績看來，相對於僅接種日本腦帶疫苗情 況下所被產生的中和抗體效價為101·88，在添加植物皂素者^ 的方面則為l〇UQ。 _ 屋-M 1 1 ·綠_漫^^志__監物^^默抵、娜界糊m激 混合麻療疫苗和，溶解於PBS且過滅菌過的遠志植物 ^素E使其成為在20微升中含有相當於2〇微克的麻疹疫 病毒粒子和2· 5微克遠志植物皂素般來調製之。添加 f定劑（0.2¾豬1動物膠、〇1%榖氨酸鈉、5%乳糖）於此，

第34頁 586935

分注於容器做為麻疹疫苗—遠志植物皂素之點鼻劑。本品 保存於1 0 C以下的冷暗場所。 ^將如上述所調製的麻療疫苗和植物皂素每隔3週接種2 次於老鼠上，觀察血中的抗體產生。由試驗成績看來，相 對於僅接種麻疹疫苗的情況下所產生的ELISA抗體效價為 〇· 18 ’而添加植物皂素之疫苗的情況下則為〇· 25。 宜^例1 2·風轰志植物皂素製藥（點鼻劑）的镅f 混合風療疫苗和，溶解於PBS且過滅菌過約遠志植物 皂素E，使其成為在2〇微升中含有相當於2 〇微克的病毒粒 子和2」5微克的遠志植物皂素般來調製之。添加安定劑（〇· X If穀氨酸鈉，5%乳糖於此，分注於容器中做為風疹疫苗一 运心、植物皂素之點鼻劑。本品保存於1 Q它以下的冷暗 所。 將如上述所調製的風療疫苗及植物皂素每隔3週接種2 次於老鼠上，觀察其血中的抗體產生。由試驗成績看來， 相對於僅接種風疹疫苗的情況下所產生elisa抗體效價為 3.13 ’而添加植物皂素之疫苗的情況下則為〇85〇。

列13·勝睞炎疫苗-遠志植物皁素製藥（點鼻割）的碉g 混合腮腺炎疫苗和，溶解於PBS且過滅菌過的遠志植 物息素E ’成為在20微升中含有相當於2〇微克腮腺炎疫苗 的病毒粒子和2· 5微克遠志植物皂素般調製之。添加安定 劑（0· 2%豬製動物膠、〇· 1%穀氨酸鈉、乳糖）於此，分注 於容器中做為腮腺炎疫苗-遠志植物皂志之點鼻劑。本品 保存於1 0 °C以下的冷暗場所。 將如上述所調製的腮腺炎疫苗和植物皂素每隔3週接 11^1

_ 586935 Λ： 曰 修正 案號 88115728 五、發明說明（30) 種2次於老鼠上，觀察其血中的抗體產生。由試驗成績看 來’相業於僅接種疫贫的情況下所產生之ELISA抗體效價 為0.023、而添加植物皂素之疫苗者為〇〇45。 疹混合植物皂素1藥（點I密丨Π 的調製 ^ 混合麻疹風疹混合疫苗和，溶解於PBS且過滅菌過的 ，二植物皂素E，使其成為在2〇微升中含有相當於各個疫 苗1微克的病毒粒子和2· 5微克的遠志植物皂素般來調製 ，。添加安定劑（〇·2%豬製動物膠、〇· 1%穀氨酸鈉、5%乳 •唐’刀，主於各器中做為麻疹風疹混合疫苗—遠志植物皂素 之點鼻劑。本品保存於1〇t以下的冷暗場所。 3適接將上i ί: ?製的麻疹風疹混合疫苗及植物息素每隔 绩看來，二2軋上，觀察其血中的抗體產生。由試驗成 效严為，广六於僅接種疫苗的情況下所產生的乩1“抗體 劑製藥(口服』 混合螺旋病毒疫苗和，包括 遠志植物皂素E 之部八，麻甘^解PBS且過滅菌過的 於3· 3微克螺旋病毒其成為在20微升中含有相當 素般來調製之。八^ 病毒粒子和10微克遠志植物皂 植物皂素之口服、’ \备态中做為螺旋病毒疫苗—遠志 所。 _鼻劑。本品保存於1 0 °c以下的冷暗場 苗及植物急素每隔3週

2125-278卜PFl.ptc 第36頁 586935

案號881157效 五、發明說明（31) 接種2次於老鼠上，觀察其血中的抗體產生。由試驗成績 看來，相對於僅接種疫苗的情況下所產生的EUsa抗體& 價為，在經鼻吸入接種方面是〇·08 9而添加植物皂素之^ 苗者為0· 38，又在口服接種方面，相對於〇· 〇18則添加植 物皂素之疫苗者為〇.27。 黴裝1疫苗-遠志ϋ皂素製華 士混合黴漿體疫田和，包括溶解於PBS且過滅菌過的遠 志植物皂素E和F之部分，使其成為在丨毫升中含有相當於 2· 0x1 (P CFU(菌落形成的單位）的病毒粒子和1〇微克二遠 志jtj勿皂素般來調製之。分注此於容器中做為黴漿體疫苗 一遇志植物皂素之注射劑。本品保存於1〇t以下的冷暗場 所0 將如上述所調製的黴漿體疫苗和植物皂素每隔2週接 欠於老鼠上’觀察黴漿體感染攻擊後的病變。由試驗 ί績看纟’相對於僅接種疫苗的老鼠被認為10隻全都病變 :二ίΐ㈣4素者’在10隻中僅3隻被認為病變。在 2 J的平均值上’相對於僅疫苗者為27 素之疫苗者為142。 很视导 用量遠志楂物皁素的二次 強作用 - 病毒合’從藉由同於實驗例3的方法而精製之傷感 H ίΓ、/262/95株）所調製的傷感ΗΑ疫苗（ο· 1毫克/毫 ^材料^的生理食鹽水溶則以毫克/毫升^調製接 腹腔内淮〜，米妥鈉投與於雌性、7週大的BALB/c老鼠的 ----醉。經鼻吸^#種20微升接種材料於老鼠

2125-2781-PFl.pt 第37頁 586935 __88115728_年月曰 修正_ 五、發明說明（32) 上。飼養老鼠3週後，進一步地二次由鼻吸入接種疫苗和 試料的混合物。更進一步地在飼養老鼠1週後，調製血清 及鼻腔洗液。血清中的抗流感病毒抗體效價以ΗI抗體效價 來測定之。鼻腔洗液將從放血的老鼠之左右鼻腔中，以包 括1毫升的〇· 牛血清蛋白（BSA)之PBS二次灌流來回收 之。藉由ELISA測定鼻腔洗淨液中的抗HA-IgA及抗HA-IgG 量0

圖7顯示出，對邶藉由遠志植物皂素F的二次反應之血 清中的抗流感病毒的抗體產生之影響。遠志植物皂素F在 相當於一隻老鼠1微克的用量下，比起HA疫苗單獨使用 時，使血清中的ΗI抗體效價的上昇更有意義。又，遠志植 物皂素F之佐劑的活性，比起做不正面對照所使用之同用 量的CTB稍微呈現低水平。

圖8顯示出’對於藉由遠志植物皂素f的二次反應之鼻 腔洗液中的抗流感病毒I g Α及I gG抗體產生之影響。在僅由 鼻吸入接種疫苗時，只檢出低水平的抗HA-IgA及1§〇抗 體。相對於此’在接種遠志植物皂素F和疫苗之族群方 面，且其用量為1隻老鼠1微克下將使鼻腔洗液中的抗 HA-IgA及IgG抗體效價的提昇是有意義的。使遠志植物息 素F的抗HA-IgA抗體效價上昇之佐劑活性比同用量的CTB 低，然而相對於CTB完全不顯示使抗^—丨“抗體效價上昇 之佐劑活性而言’遠志植物皂素顯示出有意義的活性。 這些結果顯示出做為佐劑而使用的遠志植物皂素F， 即使在低用量下也擁有強力誘導在血清中及鼻腔中之抗體 產生的作用。 &

586935 —案號 88115728_年月 a 五、發明說明（33) 利用之可能性 根據以上的實驗例明示其次的事 1 ·由遠志植物皂素所構成的本發明之佐劑將增強針對 與其共存之流感Η A疫苗及百日咳白喉破傷風混合疫苗之抗 體產生。

2 ·若以鼻腔途徑一同接種疫苗抗原與本發明的佐劑， 將同時增強血中的抗體產生及局部（鼻腔洗淨液）的抗體產 生。換言之，藉由使用本發明的佐劑，能夠減少疫苗抗原 的接種量，而與副作用的減輕有關。 ” 3·含有遠志植物皂素之本發明的佐劑，在血中及局部 (鼻腔洗淨液）方面，因為顯示出比由來於皂樹皮，皂的^ 皮之植物皂素混合物凝膠A更高的抗體產生之增強 故為比凝膠A更強力的佐劑。 ^ ’ 本發明的佐劑，例如遠志植物皂素E ，

^質地檢出溶血活性之成分。1如同#由本發明的‘ 來明示的-1，-般被做為溶血活性之錢皂素者才： 物上不顯示溶血活性。在顯示不具有溶血= :息素可由其他的植物息素中㈣，且其同 t之方面上，本發明的成果是很大。 /、 劑 :=士的說明’含有本發明的佐劑之疫苗 =菌ί染的預防或治療方面是有效的，且做為 性的藥劑而被期待。 ’、優良安

Claims (1)

1. Ri為三甲氣其 半乳糠支鏈所槿A桂^支鏈，R2、R3、R4為氫，以及r5為 為三甲Hr物；及/或 為阿拉伯糖ΦK I支鏈’匕為氫’ R3為芹糖支鏈，R 3如Ϊΐΐ，以及R5為氫所構成之化合物。 為由生藥所調製之植物Γ/。所述之佐劑’其中該化合物 1項戶:·ϋ、夕種/ti田製齊1卜其特徵在於含有如申請專利範圍第 頁主所述之佐齊卜及做為免疫抗原成分之流感病毒、輪狀 ;丙t、麻疹病毒、風疹病毒、腮腺炎病毒、愛滋病毒、百 曰咳菌、白喉菌、小絨毛螺桿菌、出血性大腸菌（EHEC)、 披衣體原蟲、黴漿體原蟲癔疾原蟲、毒漿體原蟲以及住血 吸蟲所構成之族群中選出之單一或複數的病原微生物之抗 原者。 5·如申請專利範圍第4項所述之疫苗製劑，其為為了 鼻腔内接種或口服接種者。

   2125-2781-PF2.ptc 第41頁