CN109125264A - 一种抗感染抗肿瘤的粘膜免疫制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学领域，具体公开了一种抗感染、抗肿瘤的粘膜免疫制剂。所述制剂的有效成分为聚肌苷酸‑聚胞苷酸、非抗生素类氨基化合物和金属阳离子和PEG和/或PEI和/或PLGA和/或阳离子多聚物经氢键、化学键结合形成的粘膜免疫物质。所述制剂的剂型为喷雾剂或气雾剂，但作为优选，其不含有常规喷雾剂所用辅料或气雾剂所用的辅料和抛射剂。本发明所述粘膜免疫制剂能在局部或全身起到缓释作用，延长该粘膜免疫制剂的半衰期，增加药物的利用度和有效性并提高患者的依从性。其可经粘膜免疫途径促进机体粘膜免疫从而促进各种免疫细胞活化和增殖包括全身的非特异免疫、体液免疫、细胞免疫，而不是仅仅作用于病患局部，从而达到抗感染、抗肿瘤的预防和治疗效果。

Description

一种抗感染抗肿瘤的粘膜免疫制剂
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体地说，涉及一种抗感染、抗肿瘤的粘膜免疫制剂。
背景技术
抗肿瘤、抗病毒治疗是当前重大难题。抗肿瘤的手术、放疗、化疗三大疗法及免疫疗法如PD1/PD-L1、CTLA4针对的是肿瘤局部或局部环境治疗而对转移癌效果很差；当前的抗病毒疫苗都是预防性的，不能用于治疗。
粘膜免疫系统广泛分布于呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统的粘膜组织和一些外泌腺体，是引起局部或全身免疫应答的主要场所。粘膜免疫系统主要以分泌IgA抗体为主，还有一些IgD、IgE等，当然也有一些其他物质，但主要的还是这些抗体。
通常情况下，注射免疫诱导主要以系统免疫为主，产生多种类型的抗体，如IgG抗体，在病原体进入体内之后中和病原体，注射免疫不能诱导有效的局部粘膜免疫应答，这样通过粘膜感染的病原体，注射诱导的系统免疫就无法对病原体进行早期阻断，病原体进入体内后，系统免疫才能进行攻击病原体。但是，当佐剂能够促进系统性免疫反应时，仍无法认定该佐剂也一定能够促进粘膜免疫反应，如氢氧化铝佐剂与抗原组合后，通过粘膜途径方式给予时不能有效的促进粘膜免疫反应。另一方面，注射免疫容易引起注射部位的肌肉皮肤会有部分毛细血管破裂，致使皮下出血。肌肉注射时，药物剂量过大，推药速度过快或长期注射同一部位等均会使药液不能立即吸收而形成硬结。臀部肌肉注射次数过多，或已经出现硬结、感染还在此处注射等，均可引起臀肌挛缩而出现跛行。
聚肌苷酸-聚胞苷酸为人工合成的模拟病毒双链RNA的类似物，为TLR3、RIG-I和MDA5受体的配体，在动物体内或细胞培养内均能诱生高滴度的IFN-a，在人和猴子体内诱生作用较弱，因灵长类动物血液中有核酸酶降解聚肌苷酸-聚胞苷酸，因此，现有技术中有很多方式用于改进聚肌苷酸-聚胞苷酸的不足。
CN105396130A公开了一种新疫苗佐剂及其疫苗——皮氨钙佐剂 (聚肌胞-非抗生素氨基化合物-氯化钙佐剂)及含有皮氨钙佐剂的疫苗。将现有技术中常含有的卡那霉素成分换成非抗生素类氨基化合物。其主要成分聚肌苷酸-聚胞苷酸易被机体核酸酶降解；通过注射途径经血液稀释，粘液蛋白粘附，进入靶器官的有效成分被大大消耗。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种抗感染、抗肿瘤的粘膜免疫制剂。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种抗感染、抗肿瘤的粘膜免疫制剂，所述制剂的剂型为喷雾剂或气雾剂，所述制剂的有效成分为聚肌苷酸 -聚胞苷酸、非抗生素类氨基化合物和金属阳离子经氢键、化学键结合形成的粘膜免疫物质。
作为优选，所述制剂不同于现有技术中常规的喷雾剂或气雾剂，本发明所述制剂不含有常规喷雾剂所用的辅料或气雾剂所用辅料和抛射剂。
抛射剂是气雾剂的喷射动力来源，可兼做药物的溶剂或稀释剂。抛射剂多为液化气体，在常压沸点低于室温，蒸汽压高。当阀门开放时，压力突然降低，抛射剂急剧气化，借抛射剂的压力将容器内的药物以雾状喷出。理想的抛射剂在常温下的蒸汽压应大于大气压；应无毒、无致敏反应和刺激性；应无色、无臭、无味；应性质稳定，不易燃易爆，不与药物、容器发生相互作用；应廉价易得。抛射剂是气雾剂的组成部分之一，它有时也可作为主药的溶媒或稀释剂，抛射剂的性质和用量与气雾剂雾粒大小、干湿等有关。抛射剂可采用压缩气体如氮、二氧化碳或氧化亚氮等；但现在大多采用氯烷烃类等沸点低于室温的液化气体，如三氯一氟甲烷、二氟甲烷、三氯四氟乙烷等。
进一步优选，所述制剂的有效成分为聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)、非抗生素类氨基化合物、金属阳离子和PEG和/或PEI和/或PLGA经氢键、化学键结合形成的粘膜免疫物质。
其中，所述非抗生素类氨基化合物可选自以下成分的一种或多种：壳寡糖(COS)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二醇和壳寡糖的接枝物(PEG-g-COS)、PEG-g-CS、叶酸和壳聚糖的接枝物(FA-g-CS)、半乳糖和PEG和PEI的接枝物(GAL-g-PEG-g-PEI)、 COS-g-PEG-g-PEI、CS-g-PEG-g-PEI、PEI-g-PEG、PEI-g-COS、PEI-g-CS 等。
上述非抗生素氨基化合物中涉及到的接枝物可采用本领域技术人员已知的技术手段进行制备，例如可参考以下文献的方法进行：孙毅毅，候世祥，陈彤，何军，袁子雁.2005.壳聚糖—聚乙二醇接枝共聚物的合成与表征,四川大学学报，37(2)：76-79.；柳时，徐喆，罗智，项光亚.2006.叶酸偶联壳聚糖纳米粒的制备,医药导报，25(6)： 561-563.；孟凯歌，李作佳，陶凤，李瑛.2012.乳糖接枝聚乙烯亚胺壳聚糖的合成.化学研究与应用，24(4)：607-609.；张璇，潘仕荣，吕澎，胡海梅，张未.2006.聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物的制备及其表征.中山大学学报,45(6):53-57.。本发明仅使用所述非抗生素氨基化合物作为粘膜免疫制剂的原料，对其制备方法不另作限定。
本发明使用的非抗生素氨基化合物(如壳寡糖等)除稳定聚肌苷酸-聚胞苷酸的双链结构外，还具有一定的生物学特性和活性，壳寡糖还是TLR4受体的配体，与聚肌苷酸-聚胞苷酸复合在一起又进一步增强粘膜免疫功能。
所述金属阳离子包括但不限于Ca2+、Mg2+、Zn2+、铁离子、锂离子等，优选为Ca2+。
以上各成分是通过氢键、离子键、共价键、金属键等化学键有机结合在一起，所得产物不是混合物。
进一步地，所述非抗生素类氨基化合物优选为分子量小于3200 的壳寡糖。
在本发明的一个具体实施方式中，所述粘膜免疫制剂的制备方法包括如下步骤：
方案一：
(1)以聚肌苷酸和聚胞苷酸为原料，利用PBS缓冲液制备聚肌苷酸溶液和聚胞苷酸溶液；在30～60℃搅拌配制成0.5～10mg/mL的双链聚肌苷酸-聚胞苷酸溶液(PIC溶液)；
(2)利用PBS缓冲液将壳寡糖配制成浓度为1.6～12.8mg/mL的壳寡糖溶液(COS溶液)；
(3)将COS溶液滴加到步骤(1)所得的双链聚肌苷酸-聚胞苷酸溶液中，边搅拌边滴加，之后在搅拌下滴加PEI溶液，接着在搅拌下滴加CaCl2溶液，得到粘膜免疫物质样品溶液；
(4)将上述制备得到的粘膜免疫物质样品溶液，除菌过滤并分装至适应的喷雾剂瓶或气雾剂瓶中，即得；
或方案二：
(1)以聚肌苷酸和聚胞苷酸为原料，利用PBS缓冲液制备聚肌
苷酸溶液和聚胞苷酸溶液；在30～60℃搅拌配制成0.5～10mg/mL
的双链聚肌苷酸-聚胞苷酸溶液(PIC溶液)；
(2)利用PBS缓冲液将壳寡糖配制成浓度为1.6～12.8mg/mL的壳寡糖溶液(COS溶液)；
或利用PBS缓冲液将PEG-g-COS配制成浓度为1.6～51.2mg/mL的 PEG-g-COS溶液；
(3)将PEG-g-COS溶液或COS溶液滴加到步骤(1)所得的双链聚肌苷酸-聚胞苷酸溶液中，边搅拌边滴加，之后在搅拌下滴加CaCl2溶液，得到PIC-PEG-g-COS-CaCl2或PIC-COS-CaCl2复合物；
(4)在恒温磁力搅拌器上将PIC-PEG-g-COS-CaCl2或 PIC-COS-CaCl2复合物匀速搅拌，逐滴滴加浓度为0.4～6.0mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)水溶液，观察到明显的乳光立即停止，维持反应10～ 60分钟，通过离子交联自组装形成粘膜免疫物质，经高速离心获得粒径小于1000nm的粘膜免疫物质；
(5)将上述制备得到的粘膜免疫物质，经蒸馏水重悬浮，除菌过滤并分装至适应的喷雾剂瓶或气雾剂瓶中，即得。
进一步地，本发明所述制剂的有效成分还可为聚肌苷酸-聚胞苷酸、非抗生素类氨基化合物、金属阳离子和PEG和/或PEI和/或PLGA 和/或阳离子多聚物经氢键、化学键结合形成的粘膜免疫物质。所述阳离子多聚物如DEAE-葡聚糖、脂质体等。
再进一步地，本发明所述制剂的有效成分还可为聚肌苷酸-聚胞苷酸、非抗生素类氨基化合物、金属阳离子和三聚磷酸钠(TPP)、海藻酸钠、苯基硼酸、苯邻二酚中的至少一种物质制备成的粘膜免疫物质。
本发明所述制剂还包含联合RLR受体的配体和/或联合CLR受体的配体和/或联合NLR受体的配体和/或联合TLR受体的配体和/或免疫调节剂，以及至少一种抗原和/或化学药物和/或生物免疫药物。
联合TLR受体的配体有：如肽聚糖、二聚糖、甘露聚糖、脂肽、糖脂、非典型脂多糖、血清淀粉样蛋白、CPG DNA、dsRNA、ssRNA、 LPS、PGN、饱和脂肪酸、脂磷壁酸、抵抗素、乳铁蛋白、表面活性蛋白、透鞭毛蛋白、明质酸、RNA相关抗原、Profilin样分子等。
联合RLR受体的配体有：如RNA、PIC、PICLC、PIC12u等。
联合CLR受体的配体有：如真菌细胞壁表面的甘露糖和β-葡聚糖等。
联合NLR受体的配体有：如MDP、MesθDAP等。
联合的免疫调节剂有：细胞因子(白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化因子和生长因子)、矿物盐、悬浮微粒清洁剂、乳化剂、皂化剂、颗粒释放剂、趋化因子、活化配体、树突状细胞共刺激分子，细菌外毒素，阻断性抗体、激活T细胞制剂。
联合其他化学药物：(1)烷化剂是指：环磷酰胺、白消安、弹烯咪胺、顺氯氨铂、二氯甲二乙胺、苯丙氨酸氮芥、亚硝脲类和上述药物的衍生物；(2)抗代谢药是指：5-氟脲嘧啶、家氨蝶呤、阿糖胞苷、环胞苷、羟基脲和上述药物的衍生物；(3)抗肿瘤抗生素是指：放线菌素、丝裂霉素、黄胆素、阿霉素、红必霉素、更生霉素、博来霉素和上述药物的衍生物；(4)植物类抗癌药是指：长春碱类、鬼臼碱类、三尖杉酯碱类、美登素、榄香烯乳和上述药物的衍生物；(5) 激素类是指：性激素、皮质类固醇激素和上述药物的衍生物；(6) 杂类是指：左旋门冬酰胺酶、铂类(顺铂，卡铂，草酸铂)、氮烯咪胺、六甲嘧胺和上述药物的衍生物。
联合其他生物免疫疗法药物：(1)免疫细胞治疗药物是指：TIL、 DC、CIK、DC-CIK、NK、γδT细胞、CD3AK、CAR-T和TCR-T等； (2)抗体治疗药物是指：抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体和抗多种CD抗体等。
联合肿瘤抗原是指：骨、骨连接、肌肉、肺、气管、咽、鼻、心脏、脾脏、动脉、静脉、血液、毛细血管、淋巴结、淋巴管、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛门、兰尾、肝、胆、胰腺、腮腺、舌下腺、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、外阴部、阴囊、睾丸、输精管、阴茎、眼、耳、鼻、舌、皮肤、脑、脑干、延髓、瘠髓、脑瘠液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺、性腺、舌下腺、腮腺、肿瘤特异抗原、肿瘤相关抗原，肿瘤全细胞抗原、肿瘤囊泡、树突状细胞携带抗原和肿瘤多肽中的一种癌种抗原。
联合病毒抗原是指：DNA病毒、RNA病毒、蛋白质病毒(如：朊病毒)、真病毒和亚病毒(包括类病毒、拟病毒、朊病毒)、噬菌体 (细菌病毒)、植物病毒(如烟草花叶病毒)、动物病毒(如禽流感病毒、天花病毒)、温和病毒(如HIV)、烈性病毒(如狂犬病毒)和病毒多肽中的一种病毒抗原。
联合细菌抗原是指：葡萄球菌属、链球菌属、李式杆菌属、丹毒丝菌属、肾杆菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、分支杆菌属、放线菌属、奴卡菌属、棒状杆菌属、红球菌属、炭疽杆菌、丹毒杆菌、破伤风杆菌、李氏杆菌、产气荚莫杆菌、气肿疽杆菌结核杆菌、大肠杆菌外、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、产气夹膜杆菌、流感(嗜血)杆菌、副流感(嗜血)杆菌、卡他(摩拉)菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、副溶血性杆菌、和细菌多肽中的一种细菌抗原。
联合寄生虫抗原是指：消化道内寄生虫(如蛔虫、钩虫、绦虫、溶组织内阿米巴和雅尔氏鞭毛虫等)、腔道内寄生虫(如阴道毛滴虫)、肝内寄生虫(如肝吸虫、棘球蚴)、肺内寄生虫(如卫斯特曼氏并殖吸虫)、脑组织寄生虫(如猪囊尾蚴、弓形虫)、血管内寄生虫(如血吸虫)、淋巴管内寄生虫(如丝虫)、肌肉组织寄生虫(如旋毛虫幼虫)、细胞内寄生虫(如疟原虫、利什曼氏原虫)、骨组织寄生虫 (如包虫；皮肤寄生虫，如疥螨、毛囊螨)、眼内寄生虫(如吸吮线虫、猪囊虫)和寄生虫多肽中的一种寄生虫抗原。
促进粘膜免疫吸收或粘膜粘附的物质：表面活性剂：阴离子表面活性剂(如羧酸盐类、磺酸盐类、硫酸酯类、磷酸酯类等)、阳离子表面活性剂(如胺盐类、季铵盐类、杂环类、鎓盐类等)、两性离子表面活性剂(如羧酸盐型、磺酸盐型、磷酸酯型、甜菜碱型、咪唑啉型、氨基酸型等)、非离子表面活性剂(如烷基多苷型、聚氧乙烯型、多元醇型、烷醇酰胺型、嵌段聚醚型)、特种表面活性剂(如含氟型、含硅型、含硼型、高分子型等)。螯合剂：如多磷酸盐、氨基羧酸、 1,3-二酮，羟基羧酸、多胺等。粘合剂：水溶型粘合剂(如淀粉、糊精、聚乙烯醇、羧甲基纤维素等)、热熔型粘合剂(如聚氨酯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯共聚物等)、溶剂型粘合剂(如虫胶、丁基橡胶等)、乳液型粘合剂(如醋酸乙烯树脂、丙烯酸树脂、氯化橡胶等)、无溶剂液体粘合剂(如环氧树脂等)。其它物质：如 PLGA、右旋糖酐、多聚糖、脂质体等。
上述联合有多肽或蛋白抗原粘膜免疫物质的制备方法为：
方案1：多肽或蛋白抗原在上述粘膜免疫物质形成过程中加入：各成分进入到PEG-g-COS或COS基质中，多肽或蛋白抗原进入含有三聚磷酸钠(TPP)水相中结合。其中各成分需在合适比例并在一定pH 环境下，磁珠搅拌结合，形成粘膜免疫物质。例如，所述多肽或蛋白抗原与粘膜免疫物质的结合比例为1～100:1～100，搅拌结合时的pH环境为3～8。
方案2：多肽或蛋白抗原与上述预先形成的粘膜免疫物质孵育，使多肽或蛋白抗原结合在粘膜免疫物质表面。多肽或将多肽或蛋白抗原与上述粘膜免疫物质以1～100:1～100的比例混合，磁力搅拌1～10分钟，置室温0.5～2小时，在甘油基质下超速离心20000rcf(4℃)1～3 小时获得。
方案1/方案2粘膜免疫物质需经各项检定合格。
第二方面，本发明提供了前述粘膜免疫制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤包括但不限于颌下腺癌、肺腺癌或乳腺癌及其转移癌。
本发明还提供了前述粘膜免疫制剂在制备抗感染药物中的应用。
所述感染包括但不限于病毒感染、细菌感染或寄生虫感染。
本发明所述粘膜免疫制剂的应用对象可为人类，也可为其他动物。
本发明所提供的粘膜免疫制剂可单独或与肿瘤特异抗原或相关抗原包括肿瘤全细胞抗原、肿瘤囊泡、树突状细胞携带抗原及其他疫苗抗原多肽包括病毒类、细菌类、寄生虫类疫联合制备成吸入、滴入、消化道、泌尿生殖道或外用制剂以粘膜免疫方式给予宿主，但尤以滴鼻给药途径的治疗效果最佳。
本发明的粘膜免疫制剂是通过制备成吸入、滴入、呼吸道、消化道、泌尿生殖道、眼或外用制剂以粘膜免疫方式作用于机体，直接在局部发生免疫反应，避免了血液核酸酶降解和蛋白粘附，依从性好，副作用小，而且不仅在局部直接发生作用而且通过胸导管等通路能够把这些抗性物质输送到全身，达到抗感染、抗肿瘤的预防和治疗目的。
本发明的粘膜免疫制剂在小鼠实验上，滴鼻给药效果明显优于皮下注射。
本发明的粘膜免疫制剂在肿瘤志愿者上，滴鼻给药的安全性明显优于注射给药。
本发明的粘膜免疫制剂经鼻腔粘膜单独给药后，在晚期肿瘤志愿者应用证明无副作用、显著改善患者生活质量和延长生存期，证明其安全、有效。
本发明的粘膜免疫制剂经鼻腔粘膜联合化疗后，在晚期肿瘤志愿者应用证明能明显降低放化疗引起的副作用，显著改善患者生活质量和延长生存期，证明其安全、有效。
本发明的粘膜免疫制剂可以通过免疫细胞过量表达炎细胞因子并改变肿瘤细胞微环境，让免疫细胞攻击肿瘤细胞，促进肿瘤细胞凋亡；可以清除或逆转Treg细胞的免疫抑制作用，让免疫细胞攻击癌细胞，促进肿瘤细胞凋亡；能与肿瘤细胞表达的TLR3或TLR4或RIG-I 或MDA5受体结合，直接促触发肿瘤细胞凋亡，目前全世界还没有基于上述靶点对应的抗癌药物上市；还能与“被侵”靶器官细胞的TLR3 受体结合，与肿瘤外泌体RNA竞争结合“被侵”靶器官的TLR3受体，阻断肿瘤转移机制的形成并预防肿瘤转移，目前全世界还没有基于上述靶点防止肿瘤转移的抗癌药物上市；还能与“被侵”靶器官细胞的 TLR4受体结合，与肿瘤外泌体RNA竞争结合“被侵”靶器官的TLR4 受体，阻断肿瘤转移机制的形成并预防肿瘤转移，目前全世界还没有基于上述靶点防止肿瘤转移的抗癌药物上市；还能与“被侵”靶器官细胞的RIG-I受体结合，与肿瘤外泌体RNA竞争结合“被侵”靶器官的RIG-I受体，阻断肿瘤转移机制的形成并预防肿瘤转移，目前全世界还没有基于上述靶点防止肿瘤转移的抗癌药物上市；还能与“被侵”靶器官细胞的MDA-5受体结合，与肿瘤外泌体RNA竞争结合“被侵”靶器官的MDA-5受体，阻断肿瘤转移机制的形成并预防肿瘤转移，目前全世界还没有基于上述靶点防止肿瘤转移的抗癌药物上市。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品或自制产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种聚肌苷酸-聚胞苷酸-非抗生素类氨基化合物-至少一种金属阳离子(如Ca2+、Mg2+、Zn2+、铁离子、锂离子等)粘膜免疫物质，联合PEG能在局部或全身起到缓释作用，延长该粘膜免疫制剂的半衰期，增加药物的有效性并提高患者的依从性。
本发明所提供的粘膜免疫制剂经粘膜免疫途径促进机体粘膜免疫从而促进各种免疫细胞活化和增殖包括全身的非特异免疫、体液免疫、细胞免疫，而不是仅仅作用于病患局部，从而达到抗感染、抗肿瘤的预防和治疗效果的新思路，特别是经粘膜免疫完成这一新思路途径达到而将开启解决这些难题的大门。
本发明的粘膜免疫制剂经粘膜免疫途径已经有动物试验和晚期肿瘤志愿者成功的实例。本发明粘膜免疫制剂经动物实验和癌症志愿者使用，不仅引起局部免疫还可以通过局部免疫产生的抗性物质经血液达到靶器官具有全身抗肿瘤转移和抗感染效果。
本发明所提供的粘膜免疫制剂(喷雾剂或气雾剂)单独或联合疫苗经滴鼻途径模拟自然感染诱发的呼吸道粘膜免疫具有刺激机体产生系统和粘膜局部免疫应答反应，并诱发全身的系统免疫，有更好的交叉免疫保护效果以及具有安全性好、接种简便、患者依从性高等优势。
不仅如此，本发明所提供的粘膜免疫制剂(喷雾剂或气雾剂)还可经消化道粘膜免疫用于抗感染、抗肿瘤的预防和治疗。本发明喷雾剂或气雾剂单独或联合疫苗被M细胞摄取运送到Peyer结，经抗原递呈细胞(APC)加工并递呈给T淋巴细胞，淋巴滤泡被激活，产生致敏的T、B淋巴细胞和记忆型T、B淋巴细胞；致敏的T、B淋巴细胞经肠系膜淋巴集结进入血液，通过血液循环大部分被带到粘膜固有层，少部分进入其他外分泌组织。淋巴固有层中有免疫系统中的大多数成分：大量的B淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、树突状细胞和T淋巴细胞。肠上皮细胞中总细胞数的15％是淋巴细胞，淋巴细胞的90％是T 淋巴细胞，从而通过促进非特异免疫和特异性免疫达到抗感染、抗肿瘤的预防和治疗目的。
本发明所提供的粘膜免疫制剂(喷雾剂或气雾剂)还可经泌尿生殖道、眼睫膜或外用制剂以粘膜免疫方式用于抗感染、抗肿瘤的预防和治疗。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1粘膜免疫制剂及其制备方法
(1)以聚肌苷酸和聚胞苷酸为原料，利用PBS缓冲液制备聚肌苷酸溶液和聚胞苷酸溶液；在30～60℃搅拌配制成0.5～10mg/mL的双链聚肌苷酸-聚胞苷酸溶液(PIC溶液)；
(2)利用PBS缓冲液将壳寡糖配制成浓度为1.6～12.8mg/mL的壳寡糖溶液(COS溶液)；
(3)将COS溶液滴加到步骤(1)所得的双链聚肌苷酸-聚胞苷酸溶液中，边搅拌边滴加，之后在搅拌下滴加PEI溶液，接着在搅拌下滴加CaCl2溶液，得到粘膜免疫物质样品溶液；
(4)将上述制备得到的粘膜免疫物质样品溶液，除菌过滤并分装至适应的喷雾剂瓶或气雾剂瓶中，即得。
实施例2粘膜免疫制剂及其制备方法
(1)以聚肌苷酸和聚胞苷酸为原料，利用PBS缓冲液制备聚肌苷酸溶液和聚胞苷酸溶液；在30～60℃搅拌配制成0.5～10mg/mL的双链聚肌苷酸-聚胞苷酸溶液(PIC溶液)；
(2)利用PBS缓冲液将壳寡糖配制成浓度为1.6～12.8mg/mL的壳寡糖溶液(COS溶液)；
或利用PBS缓冲液将PEG-g-COS配制成浓度为1.6～51.2mg/mL的 PEG-g-COS溶液；
(3)将PEG-g-COS溶液或壳寡糖溶液滴加到步骤(1)所得的双链聚肌苷酸-聚胞苷酸溶液中，边搅拌边滴加，之后在搅拌下滴加 CaCl2溶液，得到PIC-PEG-g-COS-CaCl2或PIC-COS-CaCl2复合物；
(4)在恒温磁力搅拌器上将PIC-PEG-g-COS-CaCl2或 PIC-COS-CaCl2复合物匀速搅拌，逐滴滴加浓度为0.4～6.0mg/mL的三聚磷酸钠(TPP)水溶液，观察到明显的乳光立即停止，维持反应10～ 60分钟，通过离子交联自组装形成粘膜免疫物质，经高速离心获得粒径小于1000nm的粘膜免疫物质；
(5)将上述制备得到的粘膜免疫物质，经蒸馏水重悬浮，除菌过滤并分装至适应的喷雾剂瓶或气雾剂瓶中，即得。
实验例1滴鼻剂粘膜免疫制剂单独抗流感小白鼠保护试验
流感病毒：亚甲型鼠肺适应株FM1，购于中国预防医学科学院病毒病防治研究所。
病毒唑：阳性对照药，购于沈阳延风药厂。
小白鼠：昆明种，8～10g用于FM1病毒传代，14～20g用于如下正式实验。
将流感病毒FM1株病毒鼠肺悬液用5LD50/只通过对小白鼠滴鼻可造成致死性肺炎，试验时先感染再给药，按表1进行分组试验。
表1本发明粘膜免疫制剂滴鼻法抗流感小白鼠保护试验
该实验结果表明在小白鼠保护试验中本发明单独的滴鼻剂经粘膜免疫途径非特异性抗流感效果就优于公认的抗病毒药病毒唑，统计学分析具有显著的抗流感病毒效果。
实验例2
本实验例用于说明本发明所述粘膜免疫制剂(滴鼻剂)联合流感疫苗经鼻腔粘膜免疫与皮下注射免疫和完全弗氏佐剂比较对体液抗体IgA和对流感病毒繁殖滴度的影响。
实验方案如下：
流感病毒：亚甲型鼠肺适应株FM1，购于中国预防医学科学院病毒病防治研究所。
流感疫苗：流感病毒裂解疫苗华兰生物制品有限公司
完全弗氏佐剂：上海伟进生物科技有限公司
本发明的粘膜免疫佐剂：信福(北京)医药科技有限公司
小白鼠：昆明种，8～10g用于FM1病毒传代，14～20g用于如下正式实验。
完全弗氏佐剂流感疫苗：在离心管内，在漩涡混匀加入等体积的疫苗和完全弗氏佐剂呈油包水乳剂。
本发明联合流感疫苗的滴鼻剂：流感疫苗和本发明的粘膜免疫佐剂等量混合呈水溶剂。
流感疫苗：流感疫苗与PBS等量混合成水溶剂。
免疫方法：
皮下注射免疫：皮下0天、28天注射免疫小白鼠，0.1ml/只，第42 天，部分小白鼠抽血分离血清，检测抗体滴度，另部分小白鼠通过流感病毒FM1株病毒鼠肺悬液5LD50/滴鼻感染，感染后第5天，检测肺组织病毒滴度。
鼻腔免疫：滴鼻法0天、28天免疫小白鼠，0.1ml/只，第42天，部分小白鼠抽血分离血清，检测抗体滴度，另部分小白鼠通过流感病毒 FM1株病毒鼠肺悬液5LD50/滴鼻感染，感染后第5天，检测肺组织病毒滴度。
各组实验结果如表2：
表2本发明粘膜免疫制剂联合流感疫苗滴鼻法抗流感试验
完全弗氏佐剂是检测促进机体细胞免疫的金标准，试验结果表明皮下免疫本发明粘膜免疫制剂联合流感疫苗产生抗体较完全弗氏佐剂流感疫苗低10倍，但较完全弗氏佐剂流感疫苗降低流感病毒滴度 31.6倍；特别是通过小白鼠鼻腔粘膜免疫表明本发明粘膜免疫制剂与抗原结合后的滴鼻剂较单纯流感疫苗抗体高31.6倍，降低流感病毒滴度3100多倍，具有极其显著的效果。
实验例3
北京京蒙高科干细胞技术有限公司检测本发明对CIK细胞效靶实验的初步测试具有明确效果。
样本编号：JSCIK2016042614检测日期：2016.04.26报告日期： 2016.04.28
操作流程：按照CIK细胞效靶实验SOP进行培养和分析
靶细胞：A549效应细胞：培养JSCIK2016042614
结论：结合荧光显微镜和酶标仪检测方法以及实验本身误差，对JSCIK2016042614细胞杀伤能力进行综合分析，1:10的杀伤效果为中。
实验例4
本发明的粘膜免疫制剂对4名终末期晚期肿瘤志愿者挽救性治疗结果。
1.使用方法：本发明的抗肿瘤药物是非细胞毒类药物。隔天一次，每次2mg～6mg，鼻腔吸入，使用1～12个月不等，未见其他明显副作用。
2.临床效果：详见表3。
表3本发明的粘膜免疫制剂鼻腔免疫在终末期晚期肿瘤志愿者上的应用
3.从上表结果可以看到本发明的粘膜免疫制剂：(1)安全性良好； (2)能降低放化疗副作用；(3)临床效果显著：食量增加、体力增加，精神由悲观到乐观、有信心，总生存期与主任医生预期至少已延长数月；(4)在晚期肿瘤志愿者应用证明能明显降低放化疗引起的副作用，显著改善患者生活质量和延长生存期，证明其安全、有效。
4.从朱淑琴病例可以看到本品通过鼻腔喷雾不仅在局部产生抗癌效果，还可以经鼻腔粘膜免疫后产生全身免疫效果，对转移癌效果惊人出乎意料。
5.本发明治疗受试人群的选择：国家食品药品监督管理局发布的《抗肿瘤药物临床试验技术指导原则》提出对癌症患者选择的体力状况评分(Performance Status，PS)ECOG 0至1级或Karnofsky(卡氏) 评分>70分，详见表4和表5。
表4.ECOG体力状况评分标准
表5.Karnofsky体力状况评分标准
本发明治疗对象的选择是在癌症治疗无效或放弃治疗的患者并在知情同意后进行，对于体力要求远远低于上述标准，大部分患者ECOG 5级或卡氏评分>20分，即丧失自理能力，病情严重，需进行积极的支持治疗者都可以，也没有年龄的限制，都具有一定效果。
实验例5
本实验例用于说明本发明的粘膜免疫制剂中增加COS用量后出现沉淀，影响其给药的均一性，添加PEI后可避免出现沉淀，并增加 COS的用量，进一步增强其粘膜免疫效果。(见表6)。
表6配制
对比例1
CN105396130A专利申请文献中公开了一种“皮氨钙佐剂及含有皮氨钙佐剂的疫苗”，并公开了非抗生素氨基化合物可选为壳聚糖。
本对比例采用壳聚糖替换实施例1中的壳寡糖，以比较二者对给药均一性方面的影响，结果见表7。
研究发现，壳聚糖溶液的加入导致在配制过程中出现沉淀，影响其给药的均一性，而选用壳寡糖可以解决上述问题。(见表7)。
表7配制
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种抗感染抗肿瘤的粘膜免疫制剂，其特征在于，所述制剂的剂型为喷雾剂或气雾剂，所述制剂的有效成分为聚肌苷酸-聚胞苷酸、非抗生素类氨基化合物和金属阳离子经氢键、化学键结合形成的粘膜免疫物质。
2.根据权利要求1所述的粘膜免疫制剂，其特征在于，所述制剂不含有常规喷雾剂所用的辅料或气雾剂所用辅料和抛射剂。
3.根据权利要求2所述的粘膜免疫制剂，其特征在于，所述非抗生素类氨基化合物为壳寡糖。
4.根据权利要求3所述的粘膜免疫制剂，其特征在于，所述制剂的有效成分为聚肌苷酸-聚胞苷酸、非抗生素类氨基化合物、金属阳离子和PEG和/或PEI和/或PLGA经氢键、化学键结合形成的粘膜免疫物质。
5.根据权利要求3或4所述的粘膜免疫制剂，其特征在于，所述粘膜免疫制剂的制备方法包括如下步骤：
(1)以聚肌苷酸和聚胞苷酸为原料，利用PBS缓冲液制备聚肌苷酸溶液和聚胞苷酸溶液；在30～60℃搅拌配制成0.5～10mg/mL的双链聚肌苷酸-聚胞苷酸溶液；
(2)利用PBS缓冲液将壳寡糖配制成浓度为1.6～12.8mg/mL的COS溶液；
(3)将COS溶液滴加到步骤(1)所得的双链聚肌苷酸-聚胞苷酸溶液中，边搅拌边滴加，之后在搅拌下滴加PEI溶液，接着在搅拌下滴加CaCl2溶液，得到粘膜免疫物质样品溶液；
(4)将上述制备得到的粘膜免疫物质样品溶液，除菌过滤并分装至适应的喷雾剂瓶或气雾剂瓶中，即得；
或(1)以聚肌苷酸和聚胞苷酸为原料，利用PBS缓冲液制备聚肌苷酸溶液和聚胞苷酸溶液；在30～60℃搅拌配制成0.5～10mg/mL的双链聚肌苷酸-聚胞苷酸溶液(PIC溶液)；
(2)利用PBS缓冲液将壳寡糖配制成浓度为1.6～12.8mg/mL的COS溶液；
或利用PBS缓冲液将PEG-g-COS配制成浓度为1.6～51.2mg/mL的PEG-g-COS溶液；
(3)将PEG-g-COS溶液或COS溶液滴加到步骤(1)所得的双链聚肌苷酸-聚胞苷酸溶液中，边搅拌边滴加，之后在搅拌下滴加CaCl2溶液，得到PIC-PEG-g-COS-CaCl2或PIC-COS-CaCl2复合物；
(4)在恒温磁力搅拌器上将PIC-PEG-g-COS-CaCl2或PIC-COS-CaCl2复合物匀速搅拌，逐滴滴加浓度为0.4～6.0mg/mL的三聚磷酸钠水溶液，观察到明显的乳光立即停止，维持反应10～60分钟，通过离子交联自组装形成粘膜免疫物质，经高速离心获得粒径小于1000nm的粘膜免疫物质；
(5)将上述制备得到的粘膜免疫物质，经蒸馏水重悬浮，除菌过滤并分装至适应的喷雾剂瓶或气雾剂瓶中，即得。
6.根据权利要求1或2所述的粘膜免疫制剂，其特征在于，所述制剂还包含联合至少一种RLR受体的配体和/或联合CLR受体的配体和/或联合NLR受体的配体和/或联合TLR受体的配体和/或免疫调节剂和/或促进粘膜免疫吸收或粘膜粘附的物质。
7.根据权利要求6所述的粘膜免疫制剂，其特征在于，所述制剂还包含至少一种抗原和/或化学药物和/或生物免疫药物。
8.权利要求1～7任一项所述的粘膜免疫制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.权利要求1～7任一项所述的粘膜免疫制剂在制备抗感染药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述感染包括病毒感染、细菌感染或寄生虫感染。
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