TW577755B - Sustained-release alginate gels - Google Patents

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五、 發明説明（ 範圍 法 本發明係有關使用藻酸鹽膠珠之持續釋出配方與其方 背景 由於基因與細胞工程技術之進步，使有益I重组蛋白質 推展在使用蛋白質爲治療用途之藥劑。以醫藥蛋白質處理 <許多疾病或狀況均需持續之蛋白質量以獲得最有效之治 療：果。然而，如同多數之蛋白質藥劑，_般之短暫生： 半衣期需經常投藥^而不同，段所用重覆注射會造成浮動 之藥劑量而對病患有顯著之ϋ金錢之負擔。因許多病 況反應最好能控制醫藥含量，：因此需控制藥劑釋放以使較 長時段之同時釋出。此種持續釋放不只增加預防、治療或 4斷效果，亦能減少注射頻率與總花費。 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 目前試圖在人類或動物於劑量間能持續藥劑量包括使用 生物可分解之聚合物當爲基質以控制藥劑釋出。例如，英 國專利1，388,580揭示使用水凝膠以持續釋出胰島素。美國 專利4,789,550揭示使’用多離胺酸塗被之藻酸鹽微膠囊經包 :活細胞以運送蛋白質。持續釋出之企圖亦利用由相反電 荷之離子聚合物所環繞之陰離子或陽離子聚合物組成物， 以使包膠細胞能產生有生物活性之組成物。見美國專利 4,744,933。同樣地，陰離子或，離子交聯聚合物之多層塗 被亦已揭示獲得控制釋出之方冢。見美國專利第4,69〇,682 和4,789,516。此外，另外之方法揭示單獨使㈣酸鹽或塗 被其它生物可分解之聚合物的》菜酸鹽以控制多胜肤組成物 -4- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公楚 577755 A7 B7 五、發明説明（2) 或其陽離子沈澱物之釋出。見PCT WO 96/00081、PCT W0 95/29664和 PCT WO 96/031 16。 然而，此些嘗試未足以提供獲得所需蛋白質藥劑之持續 釋出傳送之方法。一般已知在活體内條件下，使用某些生 ---一 物可分解之聚合物，例如多交酯共乙交酯顯示高度之初始 爆出之藥劑釋出。見強森（Johnson)，0·等人，Nature Med/， 2/7: 795 (1996)。此外，一般已知與現型之持續釋出製劑使 用之蛋白質在曝露於包膠劑時會變性並失去生物活性。此 種使用有機溶劑之製劑會對所選蛋白質有f良影響。最 後，如下討論，單獨使用藻酸鹽不會提供需要有效治療結 果之所需控制蛋白質釋出。 17 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 一般而言，藻酸鹽爲熟知、自然產生、陰離子、含1，4-連接-点-D-甘露糖醛酸和古羅糖酸之多醣。見思米卓若 (Smidsrod)，0·等人，生物技術之趨勢（Trends in Biotechnology，8: 71-78 (1990);艾斯藍尼（Aslani)，P.等 人，微膠期刊（J. Microencapsulation)，13/5: 601-614 (1996)。藻酸鹽一般不同爲由70%甘露糖醛酸和30%古羅糖 酸至30%甘露糖醛酸和70%古羅糖酸。見前述思米卓若。 藻酸不溶於水，然而與單價離子，如鈉、鉀和銨形成鹽則 爲水溶性。見邁克道威爾（McDowell)，R.H.，n藻酸鹽之特 性（Properties of Alginates)·'(偷敦，藻酸鹽工業公司，第4 版1977)。已知多價陽離子與灰酸鹽反應而自然形成膠 藻酸鹽有廣泛之不同用途，例如食物添加劑、黏著劑、 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） kl B7 五、發明説明（3 ) ~ ~ -一 醫藥錠劑和傷Π敷料。藻酸鹽亦已被推薦用在蛋白質分離 技術。例如，見葛瑞（Gray)，C.J·等人，在生物技術與生物 工私，Uj 607-612 (1988)在鋅/鈣藻酸鹽膠捕取胰島素以 將胰島素與其它血清蛋白分離。 蕩酸鹽基質亦已被詳載爲藥劑傳送I统，例見美國專利 4:695,463，其揭示以藻酸鹽爲基質之口香糖傳送系統和醫 藥製劑。藻酸鹽珠已用爲控制釋出不同蛋白質，如在塗被 多陽離子之陽離子-藻酸鹽珠之腫瘤壞死因子受體，見威 (Wee)，S.F. Proceed· intern」Symp· Control. Rel. Bioact. Metet·，2Jj 730-31 (1994);包膠·在藻酸鹽珠之轉移生長因 子’見普拉坎尼，p A等人，胃腸學 (Gastroenterology)，JJ2·· 1319]326 (1994);封於鈣-藻酸鹽 珠之血管生成因子’見道式（D〇wns)，e.c.等人，細胞生理 學期刊（J· of Cellular Physiology)，152: 422-429 (1992);蛋 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 白質填裝於聚胺基葡糖·藥酸鹽微膠囊中，波克（p〇 Ik)，A. + 人’醫藥科學期刊（J· Pharmaceutical Sciences)，83/2: 178-185 (1994)，或以叉合物塗被之聚胺基葡糖藻酸鹽珠， 見歐克合馬（Okhamafe)，Α·0·等人，微包膠期刊（J. Microencapsulation), 13/5.: 497-508 (1996);血紅素以聚胺 基葡糖-鈣藻酸鹽珠包膠，見休奎特（Huguet)，M.L.等人， 應用聚合物科學期刊（J· Applied Polymer Science)，51: 1427-1432 (1994)，休奎特，mTL等人，加工生物化學 (Process Biochemistry)，U: 745-751 (1996);和將包膠在藻 酸鹽-聚胺基葡糖微球中，劉（Liu)，L.S.等人，Proceed· -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X297公漦） 577755

五、發明説明（4 ) ern· Symp. Control· Rel. Bioact· Mater，22. (1995)。 4· 542-543 使用藻酸鹽膠珠或藻酸鹽/鈣膠珠以填裝蛋白質之方法 會因蛋白質快速由藻酸鹽釋出而缺乏之任何#續釋出效果 而困擾。見劉，L·等人，j· Control. Rel·，ϋ: 65-74 (1997)。

爲避免此種快速釋放，許多上述方法試圖用多陽離子聚合 物塗被（例如，聚離胺酸，聚胺基葡糖）以減緩蛋白質藻酸 鹽珠之釋出。i，例如惠特利（Wheatley)，Μ·Α·等人，應 用聚合物科學期刊，2123:2135 (1991) ^ ^ S F 等人’ iL述.劉’ L.S.等人；威r，S.F.等人，控制釋出協 會 ’ 11_:566_567 (1995)與前述蘇（Lim)，等人。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 多陽離子，就如聚離胺酸爲正電荷之高分子電解質，其 與負電荷之藻酸鹽分子反應形成在珠面當爲滲透屏障之高 分子電解質複合物。使用多陽離子會產生數個問題：〇)由 於多陽離子因而此配方可能有毒（前述休奎特（Huguet)， M.L.等人；任莫門（zimmermann)，阿瑞奇（Ulrich)，電泳， 11: 269 (1992);柏革曼（Bergmann)，P·等人，臨床科學 (Clincial Science)，42: 35 (1984)) ; (2)多陽離子易於氧化； (3)有多陽離子被膜之珠不易於侵入體内並堆積；（4)製作 此種配方需經費力之塗被過程，而其包括多次塗被多陽離 子聚離胺酸（培多（Padol))，等^人，Pr〇ceed· Intern· Symp. Control· Rel· Bioact· Mater，2_: 216 (1986)和（5)蛋白質和多 陽離子間之離子交互作用會造成蛋白質活性消失或導致蛋 白質不穩定性。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公t ) A7 "________B7 五、發明説明（5 ) 因此，需要發展能獲得較佳持續釋出之方法以作爲臨床 藉用之醫藥配方。#多重组或天然蛋白質可因固定之長期 釋出而得利，因此而提供更有效之臨床結果。 本發明提供此種進步方式。本發明之醫藥組合物能提供 ，白質保護、降低分解作用並緩慢釋出而能；f加蛋白質穩 :性與潛能。另外，本發明之醫藥組合物提供簡單、快速 便苴之控制重組蛋白質釋出之法以有效防 診斷結果。 發明插要 本發明係有關使用藻酸鹽膠珠或顆粒之持續釋出與其方 法。尤其是持續釋出配方包含案豸鹽膠珠與生物活性劑之 共同沈殺。此方法在達到蛋白質保護、降低分解、増加傳 送物質之穩定性及潛能後，能提供良好之生產效能與在葉 酸鹽膠内生物活性劑之高貞載量以能有持續㈣之傳送。 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 因此，本發明一方面爲提供含親水性聚合物之持續釋出 组合物；生物活性劑；和至少一種沈澱劑。在組合物配方 中，生物活性劑與親氷性聚合物共同沈澱。此外，亦可添 加另外之沈澱劑至組合物中。此中所用共同沈澱一詞係指 使用藥劑以使生物活性劑親水性聚合物—起沈搬以形成、、: 澱之聚合物和藥劑之基質，例如，經由沈澱形成漠酸鹽膠 珠。此種沈澱可同時或相近時$ ^分子之沈澱或任何相^ 之沈澱劑對熟諳此技藝者爲熟。 另一面爲提供製造本發明持續釋出組合物之方法。其包 含步驟爲以溶劑溶解生物活性劑與親水性聚合物以形成第 -8 - 尺度適财關家縣（CNS ) A4規格（210X 297^7 577755 A7 B7 五、發明説明（6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 、種混口物二在/合劑中落解至少一種沈澱劑以形成第二種 /昆口 f，將第-種)昆合物之生物活性劑與親水性聚合物溶 液和第-種w 口物之沈澱劑和溶劑混加；而親水性聚合物 中共同沈殿生物活性劑。本方法亦可包括使用另外之沈澱 劑。此外，亦涵蓋分離持續釋出組合物之步石' ▲如同本文中所用，溶劑一詞係爲以水爲基質之溶劑，其 牝刀政或冷解所選之生物活性劑、親水性聚合物或沈澱 劑。此種溶劑對熟諳此技藝者爲熟悉的。第—種混合物與 第二種混合物混加形成共同沈^合物可由熟諳此技藝者 所熟成’其包括但㈣定於經由使用噴霧喷射 法、空氣噴射法、粉化法、和；^場而小滴添加分散、 霧或混合。本發明所用分散液—詞之目的可意指液體、叫 體或氣體分散液同本文中所用分離—詞係指分離本發 明持續釋出組合物之方法。此分離和純化步驟爲此技藝 所熟知的。 另-面爲本發明提供由上述方法所產生之持續釋出組 物。另外還包括在«上可接受之載劑或佐射之上述 合物之醫藥配方。 另-面爲本發明提供以含所需生物活性劑之持續釋出 合物以治療指示症狀之方法。 發明詳述 組合物 二 親水性聚合物包括藻酸鹽和其衍生物，其可得自商 自然或此技藝中所熟知之合成法。如同本文中所用之 品 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) ^衣. 太 噴 固 中 合 親水 、1Τ -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（2丨〇>< 297公楚） 577755 A7 B7 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（7 ) 性聚合物一詞係指水溶性聚合物或有吸收水之親和力的聚 合物。親水性聚合物對熟諳此技藝者爲熟悉的。此些包括 但非限定於多陰離子，含陰離子多醣，就如藻酸鹽、叛甲 基直鏈澱粉、聚丙烯酸鹽、聚甲基丙烯酸鹽二伸乙基馬來 肝共聚物（半酯）、羧甲基纖維素、葡聚糖硫酸鹽、肝素、 羧甲基葡聚糖、羧基纖維素、2,3-二羧基纖維素、三羧基 纖維素、羧基阿拉伯樹膠、羧基角叉菜、羧基果膠、羧基 黃蓍膠、羧基蒼耳烷植物膠、聚硫酸戊聚糖、羧基澱粉、 羧甲基幾丁質/聚胺基葡糖、見乳素、六硫吟肌醇、々-硫 酸環糊精、玻璃酸、軟骨素硫酸鹽、硫酸皮膚素、硫酸 肝素、羧甲基澱粉、角叉菜、架半乳糖醛酸鹽、羧基瓜爾 膠（guar gUm)、多磷酸鹽、多醛基碳酸、聚-^羥基·丨_硫酸 鹽-丙缔-2、共聚苯乙烯馬來酸、瓊脂糖、新多糖、續基 内醇鹽化之聚乙缔醇、硫酸纖維素、硫酸精朊、磷酸瓜爾 膠、聚穀胺酸、聚天冬胺酸、聚胺基酸、其衍生物或組合 劑。熟諳此技藝者將了解在本發明範圍内之其它不同之親 水性聚合物。 ’ · * 同樣地，沈澱劑可得自不同商品、天然的或此技藝中習 知法而合成。沈澱劑包括但不限於多價金屬離子、鹽類， 醋酸鹽、擰檬酸鹽、氣化物、碳酸鹽、氫氧化物：草酸 鹽、酒石酸鹽或其氫氧化物，$或水溶性聚合物。更特定 τ之’金屬離子可包括但不限孑鋁、鋇、鈣、鐵、錳、 鎂、鳃和鋅。較佳之金屬離子爲約和鋅或其鹽、如醋酸 鋅、醋_或氣鹽。亦可用水溶性小分子和鹽，如硫酸 -10- 私紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公梦 (請先閲讀背面之注意事項界填寫本頁) -HI衣. 訂 577755 kl 五、發明説明（8 ) 銨、丙酮、乙醇和甘油。 至於水溶性聚合物包括，但非限定於 * /丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚盖一醉、乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮、聚1，3-二呤茂烷、聚丨 ^乙烯醇、 /馬來酐共聚物、聚胺基酸、聚葡萄*、’ 下可K、乙晞 燒酮)聚乙二醇、丙二醇同元聚合物、聚=乙埽㈣ 締共聚物、聚氧化乙晞化之多元醇、聚===:乙 甘油、氧化乙缔、氧化丙缔、聚氣體、燒氧化之 :、 杯音八：： 参i^劑。水溶，聚合物可爲 任意刀子量且可爲分枝狀或非分枝狀。例如，較佳之聚乙 二醇之分子量爲介在約道耳-呑和約⑽仟道耳呑之間以 便於處理及有效沈澱。 其它可用沈澱劑之大小及型式則端賴於治療方式（例 如，所需持續釋出期間、效果、若須要則爲生物活性、操 作谷易度、^體原力之強度或缺乏之與其它已知户斤需沈澱 劑對治療蛋白質或類似物之效果）。熟諳此技藝者應了解 其它在本發明範圍内乏沈澱劑。 如文中所用’緩衝液或緩衝溶液一詞係指如同此技藝中 已知之無機或有機酸或其組合以製備成緩衝溶液。本發明 範圍内之典機敗包括氫函化物（如氫氯酸）、磷酸、硝酸或 硫酸。熟諳此技藝者應熟悉其^它無機酸，其涵蓋在本文 中。本發明範圍内之有機酸包f脂族羧酸和芳香酸，例如 甲酸、碳酸、醋酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、丙烯酸、 丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、馬來酸、富馬酸、甘 -11 - t紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇、χ 297公兹） 請 閱 讀 背 項 再 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 577755 A7 五、發明説明（9 ) 〜 胺酸或苯酚磺酸。熟諳此技藝者應熟悉其它有機酸。 明較佳之緩衝液包括甘胺酸和甘胺酸磷酸缓衝系。 發 如文中所用，生物活性劑係指重組或天然產生之蛋 質，其不論在人類或動物，可作爲預防、！療或診斷2 途。生物活性劑可爲天然、合成、半合成或其衍生物。本 發明之生物活性劑必須是可沈澱的。涵蓋大範圍之生物活 性劑。此些包括但不限於荷爾蒙、組織介素、造血因子: 生長因子、治肥胖因子、營養因子、抗發炎因子、和酵素 (亦見美國專利4,695,463號以獲得另外有用之生物活性 劑）。熟諳此技藝者將易於使所需生物活性劑適於本發明 組合物。 : 此種蛋白質將包括但不限於干擾素（直―美國專利 5’372,808、5,541，293、4,897,471 和4,695,623號，其包括圖 型併於本文供參考、介白素（見美國專利5.075-27.9練，其 匕括圖型併於本文供參考）、紅血球生成素（屋^美國專利 4,703,008、5,441，868、5,6 1 8,698、5,547,933、和5,621，080， 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 其包括圖型併於本文•供參考）、顆粒性細胞集落刺激因子 (i美國專利 4,810,643、4,999,291、5,581，476、5,582,823、 和PCT公告94/17185號，其包括圖型併於本文供參考、幹 細胞因子（PC丁公告91/05795，92/1 7505和95/17206號，其包 括圖型併於本文供參考）、和〇B蛋白質（JJPCT公告 96/40912、96/05309、97/00128、97/01010和97/06816，其包 括圖併於本文供參考）。此外，生物活性劑亦可包括但非 限定於治肥胖相關產物、胰島表、胃泌素、泌乳素、促腎 -12 - 本紙i尺度適用中關( CNS ) A4規格（210X297公釐)"" " 577755 . A7 B7 五、發明説明（10) 上腺皮質激素（ACTH)、甲狀腺皮質激素（TSH)、黃體激素 (LH)、濾泡刺激素（FSH)、人絨毛膜促性腺激素（Hcg)、螺 動素、干擾素（阿伐、貝它、加瑪）、介百素（IL-1至IL-12)、腫瘤壞死因子（TNF)、腫瘤壞死因子結合蛋白質（TNF-bp)、腦衍生之神經營養因子（BDNF)、神經膠質衍生之神 經營養因子（GDNF)、神經營養因子3 (NT3)、纖維母細胞生 長因子（FGF)、神經營養生長因子（NGF)、骨骼生長因子， 如骨蛋白素（OPG)、類胰島素生長因子（iGFs)、巨噬細胞集 落刺激因子（M-CSF)、顆粒今巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)、巨角化細胞衍生之_生長因子（MGDF)、血小板 生成素、血小板衍生之生長因> (PGDF)、集落刺激生長因 子（CSFs)、骨成形蛋白質（bmp)、超氧物岐化酶（S0D)、組 織胞漿素原活化劑（TPA)、尿激素、鏈菌激酶和卡利克連 (Kallikrein)。如文中所用蛋白質一詞包括胜肽、多胜肽、 同義分子、類似物、其衍生物或組合物。 經濟部中央標準局員工消f合作社印製 生物活性劑之衍生物可包括連接一或多個化學部份至蛋 白質郅份。咸發明生、物活性劑之化學修飾在某些環境下能 提供額外之益處，例如増加穩定性和治療蛋白質之循環時 間與降低免疫性。熟諳此技藝者將根據所需劑量、循環時 間對蛋白水解之柷性、治療用途和其它考量而能選_擇所 需化學修飾。 複合t 蛋白質、類似物或衍生物可複合式地形成結合組合物。 種〜合組合物可有延長蛋白質、類似物或衍生物之循環 -r—-13- ---— A7 、一_ B7 五、發明湖（11) ~~~ ~ 時間或促進生物活性劑之活性。此組合物可爲蛋白質（或 同類胜肽）、衍生物、類似物或組合物。例如，〇 B蛋白質 之結合蛋白質爲0B蛋白質受體或其部份，例如其可溶^ 伤。其它結合蛋白負可經由檢測在血清中之〇 B蛋白質或 所選蛋白質或者以經驗篩選所含之結合而確定〜。此種結合 —般將不會妨礙〇 B蛋白質或類似物或衍生物與内源〇 b蛋 白質受體結合之能力和/或影響訊息之轉導。除了 〇B蛋白 質’結合複合物將亦能應用於本發明其它治療蛋白質。熟 諳此技藝者將能確認用於本f^適當結合蛋白質。 醫藥奴合铷 一 本發明之持續釋出醫藥組舍物可爲經口投藥（如膠囊， 例如硬膠囊和軟膠囊、固體製劑如粒劑、錠劑、丸劑或片 劑、圓劑、扁囊劑、球丸劑、散劑和乾燥型，液體製劑如 懸浮液）與非經口製劑（如肌肉内、皮下、經皮、内臟、 IV(靜脈内）、ΙΡ(腹膜内）、動脈内、推管内、囊内、眶 内’可注射的、肺、鼻、直腸和子宮之經黏膜製劑。一般 本發明包含持續釋出·醫藥組合物，其含有效量之蛋白質或 付生產物’與本發明持續釋出組合物和投藥所需之醫藥上 可接受之稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或 載劑一起。見PCT 97/0133 1，其併於本文供參考。所-需生 物活性劑之適當醫藥配方依投寧途徑與所需劑量而由熟請 此技藝者訂定。醫藥組合物之例揭示於瑞明頓之醫藥科學 (Remington’s Pharmaceutical Sciences)(馬克出版公司 Mack

Publishing Co.)，第 18版，易斯頓（Easton)，賓州，i435_ -14- i紙張尺度適用巾關家準（CNS) Α4· (2丨Qx297公楚j A7 __________B7 五、發明説明（12) 1712 頁（1990)) 投藥可能需要之組份包括不同緩衝成份之稀釋劑（如， 三羥甲胺基甲烷_HC卜醋酸鹽）、pH和離子強度；添加物 如界面活性劑和增溶劑（如吐溫8〇(Tween 8〇)二Hc〇 6〇、聚 山梨酸酯80)、抗氧化劑（如，抗壞血酸、谷胱甘肽、焦亞 硫酸鈉）、添加之多醣（如羧甲基纖維素、漠酸鈉、玻璃酸 鈉、硫酸精朊、聚乙二醇）、防腐劑（如，硫柳汞、芊基 醇、曱基對氧苯甲㈣、丙基對氧苯甲酸醋）和建造物質 (如乳糖、甘露糖醋）；將物—質&聚合化合物之微粒製劑 中，如聚乳酸/聚羥基乙酸聚合物或共聚物等或與脂質體 組合。玻璃酸亦可用爲投藥組^份而其會有促進在循環系中 持續更長期間。另外，本發明持續釋出組合物亦可以油 (如芝麻油、玉米油、蔬菜油）分散，或其與磷酯（如卵磷 脂）混合物、或中型鏈脂肪酸三酸甘油醋（如米革里歐 (Migly〇l)812)以成爲油狀懸浮液。本發明組合物亦可以分 散劑分散，如水溶性多醣類（如甘露糖醇、乳糖、葡萄 糖、殿粉）、玻璃酸，、甘胺酸、纖維朊、膠原蛋白和無機 鹽（如氣化納）。 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 此外亦涵蓋用於投藥本發明持續釋出組合物者爲役計爲 肺傳送治療產物之機械設備，其包括但不限於喷霧器、叶 量劑量吸入器和粉劑吸入器，查些對熟諳此技藝者均爲熟 悉的。 投藥組份可影響身體狀沉、穩定性、釋放速率盘 清除所含蛋白質和衍生物速率。熟諳此技藝者將了' -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） B7 五、發明説明（13) 解投藥組份和/或所用適當機械設備端賴於治療用途、投 藥途徑、所需劑量、循環時間、對蛋白水解之抗性、蛋白 質穩定性和其它考量。 使用法 鱼治療用途端賴於所用生物活性劑。熟諳此技藝 者應易於由所需治療用途而能使所需生物活性劑適用於本 發明。因此將敘述較爲詳細之此種藥劑治療用途之以下公 告包括圖型併於本發明供參考。治療用途包括但非限定於 蛋白質用途，如干擾气(·見美國專利5,372,8〇8、 5,541，293、4,897,471和4,695,62~3號，其包括圖型併於本文 供參考）、介白素（美國專利亏，〇75,222號，其包括圖型併 於本文供參考）、紅血球生成素（美國專利4，703,008、 5,441，868、5,618,698、5,547,933 和 5,621，080號，其包括圖 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 型併於本文供參考）、顆粒性細胞集落刺激因子（i美國專 利 4,999,291、5,581，476、5,582,823、4,810,643 和 PCT公告 94/17185號，其包括圖型併於本文供參考）、幹細胞因子 (PCT公告91/05795，92/17505和95/17206號，其包括圖型併 於本文供參考）、和OB蛋白質（JJPCT公告96M0912、 96/05309、97/00128、97/01010和 97/06816 號，其包括圖型 併於本文供參考）。 此外，本發明治療用途包括生物活性劑之用途，其包括 但不限於治肥胖相關產物、膜I素、胃泌素、泌乳素、促 腎上腺皮質激素（ACTH)、甲狀腺刺激素（TSH)、黃體激素 (LH)、濾泡刺激素（FSH)、人碱毛膜促性腺激素（HCG)、蠕 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規桔（210X 297公釐） 577755 A7 B7 五、發明説明（14) 動素、干擾素（阿伐、貝它、加瑪）、介百素（ΙΙΜ至乩· Ϊ2)、腫瘤壞死因子（tnf)、腫瘤壞痄因子結合蛋白（tnf· bp)、腦衍生之神經營養因子（Bdnf)、神經膠質衍生之神 經營養因子（GDNF)、神經營養因子3 (NT3)、笔維母細胞生 長因子（FGF)、神經營養生長因子（NGF)、骨骼生長因子， 如骨蛋白素（OPG)、類胰島素生長因子（IGFs)、巨噬細胞群 刺激因子（M-CSF)、顆粒性細胞巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)、巨角化細胞衍生之生長因子（MGDF)、血小板 生成素、血小板衍生之生長因子（PGDF)、集落刺激生長因 子（CSFs)、骨成形蛋白質（BMp>、超氧物岐化酶（s〇D)、組 織胞漿素原活化劑（TPA)，尿鮝素、鏈球菌激酶、卡利克 連。如文中所用，蛋白質一詞包括胜肽、多胜肽、同義分 子、類似物、其衍生物或組合物。此外，本發明組合物亦 可用於製造一或多種藥劑以治療或改善生物活性劑欲於治 療之病症。 口 經由例子可知在未失去體重下，亦可得到血液中之氧合 作用與骨骼吸收之減、低或骨質疏鬆症之治療用途。 " 組合治瘵 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 本發明組合物和方法可與其它療法結合使用，例如改傲 .飲食和運動。其它藥劑，如用於治療糖尿病（如胰島素二 或者爲澱粉經絡質）、膽固醇和^降血壓劑（如降低血脂質量 或其t*心血管藥劑）、增進活性劑（如安非它明）、利尿 (用以降低脂質）、食慾抑制劑。此種投藥可用時或依序: 此外’本万法可與外科手術結合使㊉，例如用於改變身體 -17- 本紙張尺度剌巾關家標準（CNS ) Λ4ί^Τ^χ 297公楚） 577755 A7 B7 五、發明説明（15) 整體外觀之美容手術（如抽脂術或用以減少身體質量之鐳 射手術，或用以增進身體外觀之移植手術）。促進健康2 臟外科手術，如分流手術或其它用於因脂肪堆積導致血 管堵塞t破壞性病症如動脈斑之手術，其可，由與本發明 組合物和方法共同使用而增強。除去膽結石之_法?例^超 音波或鐳射法亦可在本發明治療法期間之前，之中或之後 使用。甚至本發明法可附加於骨折、肌肉毁損或其它治療 之手術或療法中，其可經由增加非脂肪之組織而改口·、 劑量 熟諳此技藝者將可經由投藥&察療效而能訂定有效劑 量。持續釋出製劑之劑量爲需:在給予之時間中能達到活^ =有效濃度之生物活性劑。持續釋出製劑之劑量與較佳^ 所 配 所 藥頻率因生物活性劑型態、所需釋出期間、標的疾病、又 需投藥頻率、主要物種和其它因素而不同。二圭爲：子 万介在約0.10微克/公斤/天與100毫克/公斤/天者= 需療效。 、座生 範 法 源 如 訂 有效劑量可使用診斷工具一段期間加以訂定 例，本發明提供0B蛋白質之劑量。例如，可先用： 經濟部中央標準局貝工消费合作社印 當持續定量内源貪外源0B蛋白質(=論 疋自身產生的或投藥之在體内發現之蛋白 、 生物)-段治療間時，即可測定出治療劑量。：：物：行 測出OB蛋白質在血液（或血漿或血清）中之量以定出 之OB蛋白質量。此診斷工具可爲抗體分析之 抗體三明治分析法。開始定量出内源〇b 始 -18 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS〉M規格（21〇><297公楚 577755 A7 --------B7 五、發明説明（16) 可能需相當高劑量，至看到治療效果後，即降低劑量以保 持治療效果。 製備法 i一白質/藻酸鑒劑。以下例説明一般製程，其使用 0B蛋白質或類胖素（ieptin)爲所選蛋白質。熟諳此技藝者 應了解並能將此方法應用於其它生物活性劑。 废束混合劑之^^。如文中所用’，滴液混合劑”一詞係指. 含親水性聚合物和生物活性劑之混合物。在丨〇毫升燒杯 (在冰浴中）中，將升之5 %.蕩酸鹽（l〇mM三經甲胺基甲 =;pH 8)混合物，以磁攪掉扣入4毫升類胖素〇〇〇毫克/ 寬升，10mM一羥甲胺基甲烷〜；pH 8)。混合物變爲雲稠 狀。再將4 0微升4mMNa〇H加入混合物中再持續攪拌。分 里（在冰上）’此合物變澄清而其最終p Η爲約8 · 6至8 · 8。藻 酸瓜濃度應至少爲〇.05%重量比。此外，藥酸鹽較佳應爲 至少30%古羅糖酸。 除了上述外，可如下述將聚乙二醇加入滴液混合劑中。 同時’緩衝液或賦·對所選蛋白質之穩定性有幫助。熟 請此技藝者將熟知依所選之傳送蛋白質而應加入之適當成 份加以穩定。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印^ 溶液混合物之舉備

如又中所用"溶液混合物"一巧係指混合物含用於共同沈 ;，活性劑與親水性聚合物亏沈毅劑。此溶液一般在5〇 笔^ Vc杯巾。由l〇〇mM CaC12和其它組份（見下文）組成之 1〇毫升混合物。PH較佳爲酸性以助於降低突爆效力。pH -19 - &張尺度剌㈣ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 577755 A7 __ B7 五、發明説明（17) 較佳應爲小於p Η 4。溶液中之緩衝液亦將端賴於所用蛋 白質。熟諳此技藝者將根據所用蛋白質而能調整缓衝容量 或強度。因此，端賴於蛋白質穩定性，若緩衝液濃度太 向’例如以G-CSF，則蛋白質顯然會較不穩定且會減少持 續釋出。 •一 ' 落液可含CaCl2、ZnCl2、聚乙二醇（"peg，，）和酸性緩衝 液。鋅與蛋白質反應因而使之沈澱以使珠之負載量增加， 降低突爆效力並減緩蛋白質由珠中釋出。鈣有助於形成讓 酸鹽沈澱並形成珠。鈣亦有助.於使珠成形，特別是因添加 如PEG之添加物而使溶液爲黏朝狀時。當黏稠度增加時， 可増加鈣以助於保持珠之形虼。鋅濃度應至t〇 lmM而鈣 濃度應至少1 OmM。 添加PEG有助於增加負載量。已知某些pEGs能沈澱蛋白 質。PEG亦可添加至蛋白質/藻酸鹽混合物中，即滴加至溶 液中以助於增大負載量與持續釋出。peg分子量範圍可由 700道耳吞至1〇〇〇仟道耳呑，但較佳爲7〇〇道耳呑_ι〇〇仟道 耳呑。熟諳此技藝者將了解加入溶液混合物中之pEG量， 但其可高如99%，較佳爲少於75%重量比。熟諳此技藝者 亦將明瞭PEG濃度會因溶液黏稠度而受限。 珠製劑 一般，將小滴之類胖素/藻酸鹽滴狀混合物噴霧、滴加 或分散至溶液混合物（如上述厂中，使類胖素/藻酸鹽混合 物沈澱或膠化。此外，靜電法可用於形成珠。 製造小珠，亦即直徑小於數百微米，可用由具有同軸空 -20- 本紙張尺度適用中國國I標準（CNS ) A4規格（210X297公兹^------- (請先閲讀背面之注惫事項再本頁)

•1T 577755 Α7 Β7 五、發明説明（18) 氧流之針狀物組成之流動室（喷嘴座）。二通口中之一與氣 流相連，而另一通口與用於抽取（約1毫升/分鐘）之蛋白質 /藻酸鹽混合物至溶液中之針筒（3毫升）相連。一般爲將2 亳升混合物注入1 〇毫升溶液混合物中。喷嘴，於離溶液 燒杯頂端約0.8公分。珠子大小主要由氣體流率而定，例如 流率爲8升/分鐘時，珠子大小直徑爲5〇-15〇微米。類胖素 /讓酸鹽流率對珠子大小有較小影響。 製造大（亦即直徑1-3毫米）珠，使用1毫升結核菌素針 筒’裝以24G針頭以將類胖素/·藻酸鹽混合物滴入溶液混合 物中。溶液中一般含1 .5% CaQ42與5至50mM ZnCl2。珠予 是經由將其倒過4 〇微米尼龍細^胞粗濾器而收集。珠子在粗 滤器上以5毫升無菌水輕洗並以清潔室擦拭紙（加馬擦拭紙 (gamma wipe 67))由底面輕吸。珠子貯存於無菌塑膠具螺 絲帽微管中。 珠子負盤景 复爆法一 ··所選擇之珠子群之藥劑負載量可經由稱重100 毫克水合負載珠子至1毫升0.5M擰檬酸鈉pH 8.5中而測 定。珠子懸浮液在室溫培育至珠子分散，而其通常會形成 經濟部中央標率局員工消费合作社印製 沈澱。懸浮以每分鐘1 4仟轉離心2分鐘（愛培朵夫 (eppendorf)，wise)。收集上清液並記錄280毫微米吸光 度。將沈澱物懸浮於1亳升7 Μ尿素而溶解。記錄混合物之 吸光度。水合負載珠之蛋白質貧載量以毫克蛋白質每毫克 珠或毫克蛋白質每毫升珠表示，並由此二吸光値之和訂 定。 -21 - 本紙張尺度適财關家縣（CNS ) Α4娜（1Τ^97公楚） 577755 Β7 五、發明説明（19) jAA:此法與活體外釋出研究—起使^合計包 九取後之突爆由珠子釋出之蛋白質量。詳見下文。 是體外釋出硏穿 稱重水合負載珠（100毫克山.5毫升微離心管（愛 ，毫升缓衝液(⑽福組胺酸pH 7.4)加入-:樣品；於夫3; C與每分鐘100_200轉之培育搖動器中。在所選之時 品由培育箱中移出，離心（愛培朵夫 '每分以嶋轉、2分 鐘），移出上ί青液並幻毫升新鮮緩衝液取代。蛋白質釋= 量由上清液吸光度測出。取出最終釋出樣品後，遣留在珠 子中之量以珠子負載量/突爆&定。特定時間之=出百 分比由釋出總蛋白質與實驗完二成後留在珠中之量的總和而 訂定。 活體内硏穿 止重量減輕:通常，小白鼠注射一次負載珠或無負 載珠懸浮液。使用6至8週大之雌性小白鼠（C57/BLC型）， 經濟部中央標隼局員工消费合作社印製 其一般爲2 0克重。珠子之樣品爲將35〇微升之緩衝液 (5〇1111^1^8卩116.7)加入1〇〇毫克水合珠中再攪動。以1毫 升針筒吸取懸浮液，而將所有珠子與3〇〇微升緩衝液皮下 注射（23G針頭）至小白鼠頸部。每日稱重小白鼠。 鼠藥物動力學之硏究:使用6至8週大之雌性大白鼠 (史柏華多利（Sprague Dawley)型），一般重250克。注射方 式同於小白鼠重量減輕之描述7在注射後不同時段以導管 收集血液樣品再以ELISA分析法分析樣品之類胖素。 範‘例 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公犮） 577755 經 濟 部 t 央 標 準 局 員 X. 消 費 合 作 社 印 製

A7 _________B7 五、發明説明（2〇) 以下範例用以更充份敘述本發明，但並非用於限定本發 明。此外，關於以上之揭示或以下範例，熟請此技藝者將 能因需要而改變揭示以製備更大量。 例1 此範例檢測珠中類胖素濃度對類胖素由鋅了類胖素共同 沈澱之藻酸鹽珠的影響。小珠以如上所描述，用溶液/中含 25mMZnCl2製備。製備較高濃度之珠子，亦即66毫克 升類胖素是以1%藻酸鹽中含84毫克/毫升類胖素，而製備 較低濃度之珠子，亦即2 1毫克./毫升類胖素是丨％藻酸鹽中 含28毫克/毫升類胖素。當類&在珠子中之濃度增加則 類胖素由珠子中之部份釋出降祝。對較高濃度類胖素在8〇 小時有25%釋出，而較低濃度則8〇小時有8〇%釋出。 例2 此例檢測溶液ZnC!2量對類胖素由鋅/類胖素共同沈澱之 藥酸鹽珠釋出之影響。如上述製備小珠，但溶液中ZnCl2 量爲0.5至25mM而類胖素在珠中濃度爲37毫克/毫升（以累 積法）。此例顯示當溶液中ZnC12量增加時，所得珠子突爆 性降低且類胖素之釋出率降低。在〇 5mM ZnCl2時，珠子 在40小時有20%突爆與5〇0/〇釋出；而在25mMZnCi2時，珠 子在4 0小時有少於5 %突爆與25%釋出。 例3 — 本例在組合之藥物動力/生物=法性實驗中比較鋅/類胖素 共同沈澱之藻酸鹽珠與對照之醋酸鹽緩衝液配方（2 〇毫克/ 毫升）。小珠含6 4毫克/毫升類.胖素（亦即每毫升小珠）並以 -23- )//755 )//755 五 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 B7 、發明説明（21) 二同上述在溶液中含17mM Zncl2製造。雌性大白鼠（220克 姐重）以5 0亳克/公斤劑量施行單一 s c (皮下）注射。血漿 中<珠子樣品之濃度相較於對照組爲持續性的。注射珠子 樣品之大白鼠相對於對照組動物之12_18小斤，其保有類 胖素在血漿渡度爲超過50微毫克/毫升超過112小時。在珠 子組中，較高者更能持續類胖素血液中之量，此與相較於 對照組，其有更大且更持續性之重量減輕互有關連。注射 珠子樣品之大白鼠繼續減輕重量丨2〇小時；在丨2〇小時總減 輕重量爲開始重量之9 %。g反地，對照組大白鼠在5 〇小 時失去7 %之開始重量，但經丨2_〇小時會再回復重量。 例4 : 此例顯示溶液中不同PEG除了 10mM ZnCl2，對負载量之 效率與活體外IL-lra釋出之影響。小珠以如上述法製備， 以IL-lra含於i〇mM PIPES pH 6 85中。第一種溶液⑷含 100mM CaCl2、10mM ZnCl2、20% IK PEG和20% 2K PEG。 第一種珠子溶液（B)所含同A，但無20% IK PEG。IL-lra在 珠子A和B之濃度爲5*8毫克/毫升，亦即由檸檬酸鈉之突爆 測得負載效率爲74%。B配方在1 8小時後有55%突爆和75% 釋出。A配方在1 8小時後有20%突爆和50〇/〇釋出。因此， 在溶液中添加PEG會導致高負載之珠子，其會持續釋出蛋 白質。而添加IK PEG會導致甚至較低之突爆與減緩蛋白質 釋出。 二 例5 此例顯示溶液中含PEGs但無鋅時，對比-]^由藻酸鹽珠 -24 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公犮）

577755 kl B7 五、發明説明（22) 之負載量與開始之突爆的影響。如上述法製備小珠，除了 溶液中除lOOmM CaCl2外含20% 1K和20% 2K PEG。負載效 率爲9 3 %，其在珠中含6 3毫克/毫升IL -1 r a。起始突爆率爲 3 5 %。因此，在溶液中添加pEGs而無鋅離子會導致高蛋 白質負量。 …^问 此例中’比較IL-lra在緩衝液中（i〇mM pipes，pH 6.85) 與IL-lra在例1之藻酸鹽珠中之丸劑注射的釋出效性。雌性 Balb/C小白鼠（體重2 0克）在時間零時s c (皮下）注射每一 者含10毫克IL-lra之不同配方一。在丨8小時一，將小白鼠以 iv(靜脈内）注射rhIL_1B(每隻小白鼠〇1微米）並在2小時之 後殺死以取血液樣品。分析血液樣品之葡萄糖濃度與淋巴 球數目。IL-1貝它一般會導致葡萄糖濃度和淋巴球數目之 降低，但疋含某些量之IL-Ira會保護並阻抗此種降低。實 驗結果顯示只有接受在珠中含IL_lra之小白鼠會受保護而 阻抗血液參數値之降低。此結果説明藻酸鹽珠持續釋出有 效量之IL-Ira至少1 8小時。 例7 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 訂

經 濟 部 中 央 標 準 Μ 工 消 费 合 作 社 印 製 此例爲對照實驗，説明蛋白質之製備與釋出，其含使用 GCSF之珠子，其中之沈澱溶液只以如 上述法製備大珠。針筒混合物爲1%藻酸鹽中含46毫克/毫 升GCSF(10mM TRIS ΡΗ7)。製^之珠子含16毫克/毫升 GCSF(來自檸檬酸鹽突爆）。因此溶液中只有CaC]^而負載 率爲35%。蛋白質之部份釋出各一天中顯示爲6〇%突爆和 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇X 297公犮） 577755 A7 B7 五、發明説明（23) 75%釋出。因此使用文獻中所描述之已知法可得低蛋白質 負載量和快速釋出。 例8 此例顯示溶液中ZnCl2對藻酸鹽珠中GCSF的負載與釋出 遂一一 ' 之影響。大珠以如上述法製備，除了將10mMZnCl2加入溶 液中。針筒混合物含1%藻酸鹽有46毫克/毫升GCSF。製備 所得珠子含28毫克/毫升GCSF(來自擰檬酸鹽突爆）。因此 將10mM ZnCl2加入溶液（除lOOmM CaCl2)中，負載率由 3 5%(例6)增加至61%。蛋白質·之部份釋出顯示降低40%突 爆與一天釋出55%。因此，將ZnCl2加入CaCl2溶液中會導 致較高負載率、較低突爆率和較緩之蛋白質釋出。 例9 此例顯示在溶液pH爲酸性中含PEG對藻酸鹽珠負載量與 GCSF釋出之影響。以如例7所描述之法製備大珠，只除了 在溶液中加入20% PEG(阿卓吉（Aldrich))且溶液pH爲1.7。 溶液亦含lOOmM CaCl2與10mM ZnCl2。對GCSF之負載率爲 54%而部份釋出率（珠r中有25毫克/毫升）顯示100小時後有 少於5%大量減少之突爆與40%之釋出。因此含PEG(除 CaCl2和ZnCl2外）之酸性溶液混合物導致低突爆率和蛋白質 緩慢釋出率。 _ 例1 0 此例顯示溶液中含PEGs與鋅以酸化劑降低pH對負載量 與GCSF由藻酸鹽珠中初突爆率之影響。以如上描述之法 製備大珠，只除了溶液中含25mM ZnCl2、lOOmM CaCl2、 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項-

Η 頁I 訂 經濟部中央標準局員工消f合作社印製 577755 經 濟 部 央 標 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 A7 五、發明説明（24) 與5 /❶PEG和IK 5% PEG 10K。以甘胺酸緩衝液和磷酸緩衝 液將落液pH降至pH 1.65。所得珠子（20毫克/毫升之負載量） 顯示少於5 %突爆率與在9 〇小時有4 〇 %之部份釋出。因此 在/谷液中組合PEGs與鋅和低ρ η導致低突爆率和低釋出 率。 一 λ 例1 1 此例顯示在低pH溶液中含PEG而無添加鋅離子以製備 GCSF含於藻酸鹽珠中。以如上述法製備小珠只除了溶液 中含5% 1K和5〇/〇 10K PEG。？酸和磷酸緩衝液將溶液 pH降至1.43。珠中有14毫克/毫身（由檸檬酸鹽突爆）之負載 率為42%。7 0小時後之部份釋蚤顯示32%突爆率與35%釋出 率0 例1 2 ，製備例12與以下例13_15之（}(：^1?/藻酸鹽珠是以類似於上 述I法，但是其爲更嚴格控制不同操作時間且以另外之法 測定負載量。更特定言之，將i毫升GCSF/莲酸鹽混合物 以、2刀叙滴入1 〇毫听之有磁攪拌之溶液中。過濾珠子並 以5毫升水洗滌。所有珠子花費約5分鐘。測定負載量（經 A280)疋由滴入溶液之藻酸鹽中蛋白質之量與未進入所形 成珠子中之蛋白質，亦即留在溶液混合物和洗滌液中之蛋 白質之量之差。進入珠子之蛋$質量除以丨毫升體積之加 入/谷液中足混合物即得以毫克/屬升表示之珠子負載量。

例12比較溶液中含PEG對GCSF進入珠子之負載量。以如 上述法製備珠子，除了溶液含2〇〇mM (：扎12與i5% pEG • 27 _ 本紙張尺度適用中2i〇x29W7y

A7 ------- B7 五、發明説明（25) 8K(pH 5-6);對照組珠子落液有2〇〇mM 。將顺加入 落液中能使負載量由21·8毫克/毫升(7〇%效率)增加至265 毫克/毫升（85%效率）。 例1 3 此例顯示低’合液pH對藻酸鹽珠負載量與釋出GCSF之影 響。珠子之形成與負載如含PEG之例12之測定法，除了溶 液中之二含〇」5M甘胺酸緩衝液PH 2.卜在pH 2<1之負載量 爲24.9¾克/¾升（80%效率），其與對照組類似。然而，相 較於對照組（各別爲92%和99%)，在一小時之開始釋出 (29%)較低而24小時之釋出較持續（32%)。一 例1 4 r 此例顯不添加鋅至含PEG之溶液對藻酸鹽珠負載GCSFi 影響。珠子之形成與負載如同含PEG之例丨2所測定。添加 10mM ZnCl2至溶液中會使負載量由26 5毫克/毫升（85%效 率）增加至30.3毫克/毫升（97%效率）。 例1 5 此例顯示低起始突|率與GCSF由藻酸鹽珠之持續釋出。 珠之形成、負載與釋出是以類似例丨3之法完成，除了溶液 中含 lOOmM CaCl2、5% PEG 1K和5% PEG 2K，和〇·5Μ甘胺 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 酸緩衝液（ρΗ2·1)。負載之珠子含24毫克/毫升（^817。在/ 小時，起始釋出率爲零，在1 9小時，釋出率爲13·6〇/〇而在 44小時釋出率爲24%。 二 -28- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公潑）

Claims (1)

1. 577755 A BCD Jii 第087105641號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(92年12月) 六、申^^利範圍 ^ 1· -種持續釋出組合物，其包含： )親水性水合物，其選自藻酸鹽及其衍生物或羧甲 基纖維素及其衍生物； b) —生物活性劑；與 c) 至少二種沈澱劑； 中至V種忒沈殿劑將該生物活性劑业沈丨殿。 2. 根據中請專利範圍第i項之组人物 ^ 1貝足組合物，其中至少一種沈澱 知J係選自包括多價金屬 、王屬離子或鹽，其醋酸鹽、檸檬酸 -、氯化物、碳酸鹽或氫氧化物。 3. 根據申請專利範圍第2項之人 甘+人w „ .,t ，、<、，且口物，其中金屬離子係選 自包括錳、鳃、鐵、鍰、鈣、鋇、鋁或鋅。 4·根據申請專利範圍第3項 人 ^ 負义、，且口物，其中沈澱劑包栝鈣 ’其中該親水性聚4 ’其中藻酸鹽含有J 其中由至少0.05重d 5·根據申請專利範圍第1項之組合物 物為藻酸鹽。 6·根據申請專利範圍第5項之組合物 少3 0%古羅糖酸。 7·根據申請專利範圍第5項之組合物， %之藻酸鹽組成。 &根據申請專利範圍第i項之 蛋白質。 卉中生物活性劑 9.根據中請專利範圍㈣之組合物， 升蛋白質組成。 王乂〇.〇1劣 10·根據申請專利範圍第8项之組 具中蛋白質係選ί 577755 六、申請專利範園 i括k血因子、集落刺激生長因子、治肥胖因子、生長 因子、營養因子、與抗發炎因子。 1·根據申μ專利範圍弟8項之組合物，其中蛋白質係選自 包括類胖素（leptin)、G-CSF、SCF、bdnf、GDNF、 NT3、GM-CSF、IL-lra、IL2、TNF-bp、MGDF、〇PG、干 擾素、紅血球生成素、KGF和類似物或其衍生物。 12.根據申請專利範圍第丨項之組合物，其中至少一種沈澱 劑係選自包括水溶性聚合物。 13·根據申請專利範圍第丨2項之組合物，其中水溶性聚合物 為聚乙二醇。 14· 一種製造持續釋出組合物之方法，其包括之步驟為： a) 以溶劑溶解一生物活性劑與一親水性聚合物，以形 成第一種混合物； b) 在溶劑中溶解至少二種沈澱劑，以形成第二種混合 物； c) 將第二種混合物添加至第一種混合物中；及 d) 共同沈澱生物活性劑與親水性聚合物，以形成共同 沈澱足顆粒，其中該親水性聚合物係選自藻酸鹽及其衍 生物或羧甲基纖維素及其衍生物。 15·根據申請專利範圍第14項之方法，其中沈澱劑係選自包 括多價金屬離子或鹽，其醋酸鹽、擰檬酸鹽、氯化物、 碳酸鹽或氫氧化物。 16.根據申請專利範圍第15項之組合物，其中金屬離子係選 自包括般、鳃、鐵、鍰、#5、鋇、銘或鋅。 -2-

   17.=據申請專利範圍第16項之方法，其中沈搬劑係為選自 G括鋅、鈣或其組合之多價離子。 18·根據中請專利範圍第17項之方法，其中在第二種混合物 中之沈派劑係由至少ImM鈣和O.OlmM鋅組成。 19· j據申請專利範圍第“項之方法，其中親水性聚合物 藻酸鹽。 … 2〇·根據申請專利範圍第1 9項之方法，纟中藻酸鹽含有至少 30°/。古羅糖酸。 21·:據申請專利範圍第20項之方法，纟中第一種混合物由 至少0.05重量％藻酸鹽組成。 22. 根據申請專利範圍第14項之方法，其中生物活性劑包本 蛋白質。 σ 23. 根據申請專利範圍第2 2項之方法，其中第一種混合物由 至少〇·〇1毫克/毫升蛋白質組成。 24. 根據申請專利範圍第22項之方法，其中蛋白質係選自包 括造血因子、集落刺激生長因子、治肥胖因子、生長因 子、營養因子與抗發炎因子。 25. 根據申請專利範圍第2 2項之方法，其中蛋白質係選自包 括類胖素、G-CSF、SCF、BDNF、OPG、GDNF、ΝΤ3、 GM-CSF、IL_lra、IL2、TNF-bp、MGDF、干擾素、紅血 球生成素與類似物或其衍生物。 26. 根據申請專利範圍第！ 4項之方法，其在第二種混合物中 更包含至少兩種沈澱劑。 27. 根據申請專利範圍第2 6項之方法，其中至少一種沈澱劑 -3 - 本紙張尺度逋用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) '、選自包括水溶性聚合物。 2δ.ϊ=ί專利範圍第27项之方法，其中水溶性聚合物為 29_ =申請專利範圍第14項之方法，其中係經由噴霧、靜 :馮加、分散、或混合，豸第一種混合物加二 ㈣合物，以形成共沈搬顆粒。 30. 根據申請專利範圍第〗4項 甘2 a —上 澱顆粒之步驟。 、万法’其另外包括分離共沈 31. 根：申請專利範圍第Η之醫藥組合物，其係在醫藥上可 接觉之載劑、稀釋劑或佐劑中。 32:m利範圍第1項之持續釋出組合物，係用於治 :選自包括過重、糖尿病、高血脂、動脈硬化、動脈 辛敏=形成膽結石、不足之痩組織量、對姨島 ::感度不足、與休克之病症，其係在醫藥上可接受之 =札稀釋劑或佐射且其中生物活性劑為類胖素 類似物或衍生物。 長 33. ==範圍第1項之持續釋出組合物，係用於治 療選自包括u血細胞缺乏、感染、嗜中性白血球減 ，其係在醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或佐劑中 且/、中生物活性劑為G-CSF、其類似物或衍生物。 34. 根據中請專利範圍第〗項持續釋出組合物，係用於 5炎’其係在醫藥上可接受之載劑'稀釋劑或佐劑= 其中生物活性劑為IL-1 ra、其類似物或衍生物。 35. 根據申請專利範圍第2項之組合物，其中|、一 劑為鋅。 、/ 一種沈澱