JP2001524084A - 持続放出性アルギネートゲル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はアルギネートゲルビーズを用いた持続放出性製剤とその方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 持続放出性アルギネートゲル 発明の分野 本発明はアルギネートゲルビーズを用いた持続放出性製剤とその方法に関する 。背景 遺伝子および細胞工学テクノロジーの進歩によって、組換え蛋白が容易に入手 でき、治療への適用のための医薬品としての蛋白の使用を促進させてきた。医薬 品としての蛋白によって治療される多くの疾病あるいは状態の、最も効果的な治 療成績を達成するためには、蛋白レベルの持続を必要としている。しかし、ほと んどの蛋白薬剤と同様に、通常の短い生物学的半減期のために頻回投与が必要で ある。繰り返しての注入は様々な間隔で行われ、その結果薬剤濃度の変動をもた らし、患者に大きな身体的および経済的負担を与えることになる。多くの状態が 制御されたレベルの薬剤に対してより良好に応答するため、長期間にわたって一 定の放出をもたらす薬剤の制御された放出が求められている。そのような持続放 出性薬剤は、患者に高い予 防、治療あるいは診断効果をもたらすだけでなく、注入頻度の減少ならびに全体 的なコストの低下も提供することになる。 ヒトあるいは動物において、それぞれの投与から投与までの間薬剤レベルを維 持するために現在行われている試みとして、薬剤放出を制御するための基質とし て生分解性ポリマーを使用することが含まれる。たとえば、英国特許第１，３８ ８，５８０号はインスリンの持続放出のためのヒドロゲルの使用を開示している 。米国特許第４，７８９，５５０号は、生体細胞を被包することによって蛋白を 供給送達するためのポリリシン被覆したアルギネートマイクロカプセルの使用を 開示している。持続放出の試みとして、生物学的に活性な組成物を生成すること ができる細胞を被包するために、反対に電荷したイオンポリマーによって取り巻 かれた陰イオンあるいは陽イオンポリマー組成物も使用されてきた。米国特許第 ４，７４４，９３３号。同様にアニオンあるいはカチオン架橋ポリマーの多層被 覆も、制御された放出を得るための手段として開示されている。米国特許第４， ６９０，６８２号および第４，７８９，５１６号。さらに、ポリペプチド組成物 あるいはそのカチオン沈殿物の制御放出のための、アルギネート単独あるいは他 の生分解性ポリマー で被覆したアルギネートを使用する試みも開示されている。ＰＣＴ特許願第ＷＯ ９６／０００８１号、第ＷＯ ９５／２９６６４号および第ＷＯ ９６／０３ １１６号。 しかしこれらの試みは、所望する蛋白製剤の持続放出送達を得るには不十分な 手段しか提供しなかった。ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で一部の生分解性ポリマー、た とえばポリラクチドコグリコリドを使用すると、薬剤放出の高い初期バーストを 示すことが一般に知られている。Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｏ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅ ｄ．，２／７：７９５（１９９６）。さらに、現在の形態の持続放出性製剤で使 用される蛋白は、被包物質と接触すると変性を受けて、生物活性を失う場合があ ることが一般に知られている。そのような製剤は有機溶媒を使用しており、これ は選択した蛋白に有害な作用を及ぼしうる。最後に、以下に論じるように、アル ギネート単独の使用は有効な治療成績を得るために必要な、所望する制御された 蛋白放出を提供しなかった。 一般に、アルギネートは１，４−架橋−β−Ｄ−マンヌロン酸とα−Ｌ−グル ロン酸から成る、周知の天然に生じるアニオン性多糖類である。Ｓｍｉｄｓｒｏ ｄ，Ｏ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,８：７１−７ ８(１９９０)； Ａｓｌａｎｉ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，１３／５ ：６０１−６１４（１９９６）。アルギネートは、代表的には７０％マンヌロン 酸と３０％グルロン酸から、３０％マンヌロン酸と７０％グルロン酸までの範囲 にわたる。Ｓｍｉｄｓｒｏｄ、前出。アルギン酸は水不溶性であるが、ナトリウ ム、カリウムおよびアンモニウムのような一価のイオンとともに形成される塩は 水溶性である。ＭｃＤｏｗｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．，「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ａｌｇｉｎａｔｅｓ」（Ｌｏｎｄｏｎ，Ａｌｇｉｎａｔｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ ｓ Ｌｔｄ．、第４版、１９７７）。多価カチオンはアルギネートと反応して自 然にゲルを形成することが知られている。 アルギネートは、食品添加物、接着剤、製薬錠剤および創傷包帯のように、広 い範囲で利用されている。アルギネートはまた蛋白の分離手法にも推奨されてき た。たとえば、Ｇｒａｙ，Ｃ．Ｊ．ら、ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａ ｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３１：６０７−６１２（１９８８）は、 他の血清蛋白からインスリンを分離するために亜鉛／カルシウムアルギネートゲ ル中にインスリンを包囲捕捉した。 アルギネート基質は薬剤供給送達系に関しても広汎に記述さ れている。たとえば、アルギネートベースのチューインガム供給送達系と薬剤を 開示している米国特許第４，６９５，４６３号参照。アルギネートビーズは次の ような様々な蛋白の制御放出のために使用されてきた：ポリカチオンで被覆した カチオン−アルギネートビーズ中の腫瘍壊死因子レセプタ、Ｗｅｅ，Ｓ．Ｆ．， Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａ ｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２１：７３０−３１（１９９４）；アルギネートビーズ中 に被包したトランスホーミング増殖因子、Ｐｕｏｌａｋｋａｉｎｅｎ，Ｐ．Ａ． ，ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０７：１３１９−１３２６（１９ ９４）；カルシウム−アルギネートビーズに包囲捕捉した血管新生因子、Ｄｏｗ ｎｓ，Ｅ．Ｃ．ら、Ｊ．ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１５ ２：４２２−４２９（１９９２）；キトサン−アルギネートマイクロカプセルに 包囲捕捉したアルブミン、Ｐｏｌｋ，Ａ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８３／２：１７８−１８５（１９９４）、あるいはポリ マーで被覆したキトサン−カルシウムアルギネートビーズ、Ｏｋｈａｍａｆｅ， Ａ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，１３／５： ４９７−５０８（１９９６）；キトサン−カルシウムアルギネートビーズで被包 したヘモグロビン、Ｈｕｇｕｅｔ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙ ｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５１：１４２７−１４３２（１９９４），Ｈｕｇｕｅ ｔ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：７４５− ７５１（１９９６）；およびアルギネート−キトサンミクロスフェア、Ｌｉｕ， Ｌ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅ ｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２２：５４２−５４３（１９９５）。 アルギネートゲルビーズあるいはアルギネート／カルシウムゲルビーズを用い て蛋白を包囲捕捉する系は、アルギネートビーズから蛋白が速やかに放出される ため、持続放出効果を欠くという問題がある。Ｌｉｕ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒ ｏｌ．Ｒｅｌ．，４３：６５−７４（１９９７）。そのような迅速な放出を避け るため、数多くの上記の系がポリカチオンポリマー被覆（たとえばポリリシン、 キトサン）を使用して蛋白アルギネートビーズの放出を遅延させることを試みて いる。たとえば、Ｗｈｅａｔｌｅｙ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌ ｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ,４３：２１２３−２１３５(１９９１)； Ｗｅｅ，Ｓ．Ｆ．ら、前出；Ｌｉｕ，Ｌ．Ｓ．ら、前出；Ｗｅｅ，Ｓ．Ｆ．ら、 Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２２：５６６−５６ ７（１９９５）およびＬｉｍ，ら、前出参照。 ポリリシンのようなポリカチオンは陽電荷した高分子電解質であり、陰電荷し たアルギネート分子と相互作用して、ビーズ表面で拡散バリアとして働く高分子 電解質複合体を形成する。ポリカチオンの使用に関して次のような問題が起こり うる：（１）そのような製剤はポリカチオンのために細胞毒性である可能性があ る（Ｈｕｇｕｅｔ，Ｍ．Ｌ．ら、前出；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｕｌｒｉｃｈ， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１３：２６９（１９９２）；Ｂｅｒｇｍａｎ ｎ，Ｐ．ら、Ｃｌｉｎｉｃｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６７：３５（１９８４）） ；（２）ポリカチオンは酸化を受けやすい；（３）ポリカチオン被覆したビーズ は侵食されす、体内で蓄積する傾向がある；（４）そのような製剤は、ポリカチ オンポリリシンの多層被覆を含めた手間のかかる被覆工程を通して作られる（Ｐ ａｄｏｌら、Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅ ｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２：２１６（１９ ８６）；ならびに（５）蛋白とポリカチオン間のイオン相互作用が蛋白活性の損 失をもたらし、蛋白の不安定性を生じさせることがある。 それ故、臨床適用のために持続放出のよりよい手段を達成する医薬製剤を開発 する必要がある。数多くの組換えあるいは天然蛋白が長期間の一定な放出から利 益を受け、それによってより効果的な臨床成績を提供することができるであろう 。 本発明はそのような改善を提供する。本発明の製薬組成物は、蛋白の安定性と 効力の増大を伴った蛋白の保護、分解の低下および緩徐な放出を提供することが できる。また本発明の製薬組成物は、有効な予防、治療あるいは診断成績を達成 するための制御された組換え蛋白放出の簡単且つ速やかで安価な手段を提供する 。発明の要旨 本発明は、アルギネートゲルのビーズあるいは粒子を用いた持続放出性製剤と その方法に関する。特に、持続放出性ゲルの生成は、生物活性物質によるアルギ ネートゲルビーズの共沈を含む。このアプローチは、蛋白の保護、分解の低下、 供給送達される物質の安定性と効力の増大を達成する一方で、持続放出 性供給送達のためにアルギネートゲル中に生物活性物質の効率的で高い充填を生 じさせるという利点を提供する。 従って、本発明のひとつの局面は、親水性ポリマー、生物学的に活性な物質、 および少なくともひとつの沈殿剤を含む持続放出性組成物を提供する。組成物の 製剤においては、生物学活性物質を親水性ポリマーと共沈させる。さらに、付加 的な沈殿剤を組成物に加えることもできる。ここで使用するとき、共沈という用 語は、沈殿したポリマーと生物活性物質の基質を生成するために、たとえばアル ギネートゲルビーズの生成は沈殿を通して行われるように、親水性ポリマーとと もに生物活性物質を沈殿させるための物質の使用をさす。そのような沈殿は同時 であってもよいし、互いに極めて近接していてもよい。分子の沈殿と関連する沈 殿剤は当業者には周知である。 もうひとつの局面は、本発明の持続放出性組成物を製造するための方法を提供 する。この方法は、生物活性物質と親水性ポリマーを溶媒で溶解して第一混合物 を形成する段階、少なくともひとつの沈殿剤を溶媒に溶解して第二混合物を形成 する段階、第一混合物の生物活性物質および親水性ポリマー溶液を第二混合物の 沈殿剤および溶媒に加える段階、および親水性ポリマー 内で生物活性物質を共沈させる段階、を含む。この方法は付加沈殿剤の使用も含 みうる。さらに、持続放出性組成物を分離するための段階も意図されている。 ここで使用するとき、溶媒という用語は、選択した生物活性物質、親水性ポリ マーあるいは沈殿剤を分散あるいは溶解することができる水ベースの溶媒をさす 。そのような溶媒は当業者には周知である。第一混合物と第二混合物を加えて共 沈組成物を形成することは、小滴添加、分散、スプレージェット、エアージェッ ト、アトマイジング（噴霧化）および電場を用いることによる噴霧あるいは混合 を含むがこれらに限定されない、当業者に周知の方法によって実施できる。本発 明のための分散という用語は、液体、固体あるいはガス分散を意味しうる。本文 中で使用するとき、分離という用語は、本発明の持続放出性組成物の分離のため の工程をさす。そのような分離と精製の工程は当該技術において周知である。 さらにもうひとつの局面では、本発明は上記の方法によって製造される持続放 出性組成物を提供する。さらなる局面は、製薬上許容される担体あるいはアジュ バント中の上記組成物の医薬製剤を含む。 さらにもうひとつの局面では、本発明は、所望する生物活性物質を含有する持 続放出性組成物によって適応症を治療する方法を提供する。発明の詳細な説明 組成物 アルギネートおよびその誘導体を含めた親水性ポリマーは、当該技術において 周知の様々な市販、天然あるいは合成ソースから入手することができる。ここで 使用するとき、親水性ポリマーという用語は、水を吸収するための親和性を持っ た水溶性の単数または複数のポリマーをさす。親水性ポリマーは当業者には周知 である。これらは、アルギネート、カルボキシメチルアミロース、ポリアクリル 酸塩、ポリメタクリル酸塩、エチレン無水マレイン酸コポリマー（半エステル） 、カルボキシメチルセルロース、硫酸デキストラン、ヘパリン、カルボキシメチ ルデキストラン、カルボキシセルロース、２，３−ジカルボキシセルロース、ト リカルボキシセルロース、カルボキシアラビアゴム、カルボキシカラゲナン、カ ルボキシペクチン、カルボキシトラガカントゴム、ペントサンポリスルフェート 、カルボキシデンプン、カルボキシメチルキチン／キトサン、カードラ ン、イノシトールヘキサスルフェート、β−シクロデキストリン硫酸、ヒアルロ ン酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、カルボキシ メチルデンプン、カラゲナン、ポリガラクツロネート、カルボキシグアーゴム、 ポリリン酸塩、ポリアルデヒド−炭酸、ポリ−１−ヒドロキシ−１−スルホネー ト−プロペン−２、コポリスチレンマレイン酸、アガロース、メソグリカン、ス ルホプロピル化ポリビニルアルコール、硫酸セルロース、硫酸プロタミン、ホス ホグアーゴム、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリアミノ酸、それら の誘導体あるいはそれらの組合せのような陰イオン性多糖類を含めたポリアニオ ンを含むが、それらに限定されない。当業者は、本発明の範囲内に含まれる他の 様々な親水性ポリマーを認識するであろう。 同様に、沈殿剤も当業者に周知の様々な市販、天然あるいは合成ソースから入 手することができる。沈殿剤は、多価金属イオン、塩、アセテート、シトレート 、塩化物、カーボネート、水酸化物、オキザレート、タータレートあるいはそれ らの水酸化物、酸あるいは水溶性ポリマーを含むが、それらに限定されない。特 に、金属イオンは、アルミニウム、バリウム、カルシ ウム、鉄、マンガン、マグネシウム、ストロンチウムおよび亜鉛を含みうるが、 それらに限定されない。好ましくは、金属イオンはカルシウムおよび亜鉛、ある いは酢酸亜鉛、酢酸カルシウムあるいは塩化物塩のようなそれらの塩である。硫 酸アンモニウム、アセトン、エタノールおよびグリセロールのような水溶性の小 さな分子および塩も使用できる。 水溶性ポリマーに関しては、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／ プロピレングリコールコポリマー、カルボキシルメチルセルロース、デキストラ ン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラ ン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、 ポリアミノ酸、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリ コール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレ ンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオル、琥珀酸ポリビニルアルコ ール、グリセリン、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ポロキサマー、ア ルコキシル化コポリマー、水溶性ポリアニオン、それらの誘導体あるいはそれら の組合せを含むが、それらに限定されない。水溶性ポリマーはどのような分子量 のものでもよ く、また分枝していてもしていなくてもよい。たとえば、ポリエチレングリコー ルの好ましい分子量は、取り扱いの容易さと沈殿の効率の点から、約７００Ｄａ から約１００ｋＤａである。 他の大きさや種類の沈殿剤も、所望する治療プロフィール（たとえば、所望す る持続放出の期間、もしあれば生物学的活性への影響、取り扱いの容易さ、抗原 性の程度あるいは抗原性の欠如、治療蛋白あるいは類似体への所望する沈殿剤の 他の既知の作用）に応じて使用できる。当業者は、本発明の範囲内に含まれる他 の沈殿剤を認識するであろう。 ここで使用するとき、緩衝剤あるいは緩衝液という用語は、当該技術において 既知であるように緩衝液を調製するための無機あるいは有機酸あるいはそれらの 組合せの使用をさす。本発明の範囲内に含まれる無機酸は、ハロゲン化水素（た とえば塩酸）、リン酸、硝酸あるいは硫酸を含む。他の無機酸は当業者には周知 であり、本文中で想定されている。本発明の範囲内の有機酸は、ギ酸、炭酸、酢 酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、アクリル酸、マロン酸、コハク 酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、グリシンあるいはフェノ ールスルホン酸のような脂肪族系カルボン酸および芳香族系酸 を含む。他の有機酸は当業者には周知である。本発明の好ましい緩衝剤は、グリ シンおよびグリシンリン酸緩衝系を含む。 ここで使用するとき、生物活性物質とは、ヒトあるいは動物の予防、治療ある いは診断適用のために有用な組換えあるいは天然に存在する蛋白をさす。生物活 性物質は天然、合成、半合成あるいはそれらの誘導体である。本発明の生物活性 物質は沈殿性でなければならない。広い範囲の生物活性物質が想定される。これ らは、ホルモン、サイトカイン、造血因子、成長因子、抗肥満因子、栄養因子、 抗炎症因子、および酵素を含むが、これらに限定されない（有用な生物活性物質 の追加例に関しては米国特許第４，６９５，４６３号も参照のこと）。当業者は 、所望する生物活性物質を本発明の組成物に容易に適合させることができるであ ろう。 そのような蛋白は、インターフェロン（図を含めて参照してここに組み込まれ る、米国特許第５，３７２，８０８号、第５，５４１，２９３号、第４，８９７ ，４７１号、および第４，６９５，６２３号参照）、インターロイキン（図を含 めて参照してここに組み込まれる、米国特許第５，０７５，２２２号参照）、エ リトロポイエチン（図を含めて参照してここに組 み込まれる、米国特許第４，７０３，００８号、第５，４４１，８６８号、第５ ，６１８，６９８号、第５，５４７，９３３号、および第５，６２１，０８０号 参照）、顆粒球コロニー刺激因子（図を含めて参照してここに組み込まれる、米 国特許第４，８１０，６４３号、第４，９９９，２９１号、第５，５８１，４７ ６号、第５，５８２，８２３号、およびＰＣＴ特許願公開番号第９４／１７１８ ５号参照）、幹細胞因子（図を含めて参照してここに組み込まれる、ＰＣＴ特許 願公開番号第９１／０５７９５号、第９２／１７５０５号および第９５／１７２ ０６号参照）、ならびにＯＢ蛋白（図を含めて参照してここに組み込まれる、Ｐ ＣＴ特許願公開番号第９６／４０９１２号、第９６／０５３０９号、第９７／０ ０１２８号、第９７／０１０１０号および第９７／０６８１６号参照）を含むが 、これらに限定されない。さらに、生物活性物質はまた、抗肥満関連物質である インスリン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、 甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン （ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、モチリン、インターフェロ ン（α、β、γ）、インターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ−１２）、腫瘍 壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因子結合蛋白（ＴＮＦ−ｂｐ）、脳由来神経栄養 因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子３（Ｎ Ｔ３）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経栄養発育因子（ＮＧＦ）、オステ オプロテゲリン（ＯＰＧ）のような骨成長因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコ ロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、メガケラチノサイト由来増殖因子（ＭＧＤＦ ）、トロンボポイエチン、血小板由来増殖因子（ＰＧＤＦ）、コロニー刺激増殖 因子（ＣＳＦ）、骨形態形成蛋白（ＢＭＰ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ ＳＯＤ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレ プトキナーゼおよびカリクレインも含みうるが、これらに限定されない。蛋白と いう用語は、本文中で使用するとき、ペプチド、ポリペプチド、コンセンサス分 子、類似体、誘導体あるいはそれらの組合せを包含する。 生物活性物質の誘導体は、その蛋白部分への１個またはそれ以上の化学成分の 連結を含みうる。生物活性物質の化学修飾は、特定の条件下で、治療蛋白の安定 性と循環時間を増大させたり、免疫原性を低下させるといった付加的な利点を提 供することが 認められている。当業者は、所望する投与量、循環時間、蛋白分解に対する抵抗 性、治療用途やその他の考慮事項に基づいて所望する化学修飾を選択することが できるであろう。複合体 蛋白、類似体あるいは誘導体は、結合組成物との複合体として投与することが できる。そのような結合組成物は、蛋白、類似体あるいは誘導体の循環時間を延 長する、あるいは生物活性物質の活性を高める作用を持つと考えられる。そのよ うな組成物は、蛋白（あるいは同義的にペプチド）、誘導体、類似体あるいは組 合せでありうる。たとえば、ＯＢ蛋白についての結合蛋白は、ＯＢ蛋白レセプタ 、あるいはその可溶性部分のような部分である。他の結合蛋白は、ＯＢ蛋白ある いは選択した蛋白を血清中で検査して確認するか、あるいは結合の存在に関して 経験的にスクリーニングすることができる。そのような結合は、代表的には、Ｏ Ｂ蛋白あるいは類似体あるいは誘導体が内因性ＯＢ蛋白レセプタに結合する能力 および／あるいはシグナル伝達を生じさせる能力に干渉しない。ＯＢ蛋白に加え て、結合複合体も本発明の他の治療蛋白に適用することができるであろう。当業 者は、本発明に関して使用するための適切な結合蛋白を確 認できるであろう。医薬組成物 本発明の持続放出性製剤は、経口製剤（たとえばハードカプセルやソフトカプ セルのようなカプセル、顆粒剤、錠剤、丸剤、トローチあるいはロゼンジのよう な固形製剤、カシェ剤、ペレット剤、粉末および凍結乾燥形態、懸濁液のような 液体製剤）および非経口製剤（たとえば筋肉内、皮下、経皮、内臓、ＩＶ（静脈 内）、ＩＰ（腹腔内）、動脈内、クモ膜下腔内、包内、眼窩内、注射用、肺動脈 、鼻、直腸、および子宮−経粘膜製剤）によって投与することができる。一般に 、製薬上許容される希釈剤、防腐剤、溶解補助剤、乳化剤、アジュバントおよび ／あるいは投与のために必要な担体とともに、本発明の持続放出性組成物と有効 量の蛋白あるいは誘導体産物を含む持続放出性製薬組成物は、本発明に包含され る。参照してここに組み込まれるＰＣＴ特許願第９７／０１３３１号参照。所望 する生物活性物質にとっての最適医薬製剤は、投与経路と所望する投与量に応じ て当業者によって決定される。例示としての製薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ ｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ.， 第１８版、Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｐ．１４３５−１７１２（１９９０））に開示 されている。 投与のために必要と考えられる成分は、様々な緩衝剤含有物（たとえばトリス −ＨＣｌ、アセテート）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤や溶解補 助剤のような添加剤（たとえばツイーン８０、ＨＣＯ−６０、ポリソルベート８ ０）、酸化防止剤（たとえばアスコルビン酸、グルタチオン、メタ重亜硫酸ナト リウム）、付加的な多糖類（たとえばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸 ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、硫酸プロタミン、ポリエチレングリコー ル）、防腐剤（たとえばチメロサール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、 プロピルパラベン）およびビルダー物質（たとえばラクトース、マンニトール） を含み；ポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーあるいはコポリマー等のような高 分子化合物の粒子製剤、あるいはリポソームと組合わせた粒子製剤中への当該物 質の組み込みを含む。ヒアルロン酸は投与成分としても使用することができ、こ れは循環中に保持される期間をさらに延長する作用を持つと考えられる。さらに 、本発明の持続放出性組成物は、油（たとえばゴマ油、トウモロコシ油、植物油 ）、あるいはそのリン 脂質（たとえばレシチン）との混合物、あるいは中鎖脂肪酸トリグリセリド（た とえばミグリオル８１２）で分散させて油性懸濁液を提供することもできる。本 発明の組成物はまた、水溶性多糖類（たとえばマンニトール、ラクトース、グル コース、デンプン）、ヒアルロン酸、グリシン、フィブリン、コラーゲンおよび 無機塩（たとえば塩化ナトリウム）のような分散剤で分散させてもよい。 さらに、いずれも当業者が熟知しているネブライザ、定量吸入器、および粉末 吸入器を含むがこれらに限定されない、治療物質の肺への供給送達のためにデザ インされた機械的装置も、本発明の持続放出性組成物の投与における使用が想定 されている。 投与成分は、本発明の蛋白および誘導体の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖ ｏでの放出速度およびｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスの速度に影響を及ぼしう る。当業者は、治療用途、投与経路、所望する投与量、循環時間、蛋白分解に対 する抵抗性、蛋白の安定性および他の考慮事項に応じて、使用する適切な投与成 分および／あるいは適切な機械的装置を認識するであろう。使用方法 治療。治療用途は使用する生物活性物質に依存する。当業者は、所望する生物 活性物質をその意図する治療用途に合わせて本発明に容易に適合させることがで きるであろう。そのような物質についての治療用途は、図を含めて参照してここ に組み込まれる以下の公表文献中で詳細に述べられている。治療用途は、インタ ーフェロン（図を含めて参照してここに組み込まれる、米国特許第５，３７２， ８０８号、第５，５４１，２９３号、第４，８９７，４７１号、および第４，６ ９５，６２３号参照）、インターロイキン（図を含めて参照してここに組み込ま れる、米国特許第５，０７５，２２２号参照）、エリトロポイエチン（図を含め て参照してここに組み込まれる、米国特許第４，７０３，００８号、第５，４４ １，８６８号、第５，６１８，６９８号、第５，５４７，９３３号、および第５ ，６２１，０８０号参照）、顆粒球コロニー刺激因子（図を含めて参照してここ に組み込まれる、米国特許第４，９９９，２９１号、第５，５８１，４７６号、 第５，５８２，８２３号、第４，８１０，６４３号、およびＰＣＴ特許願公開番 号第９４／１７１８５号参照）、幹細胞因子（図を含めて参照してここに組み込 まれる、ＰＣＴ特 許願公開番号第９１／０５７９５号、第９２／１７５０５号および第９５／１７ ２０６号参照）、ならびにＯＢ蛋白（図を含めて参照してここに組み込まれる、 ＰＣＴ特許願公開番号第９６／４０９１２号、第９６／０５３０９号、第９７／ ００１２８号、第９７／０１０１０号および第９７／０６８１６号参照）のよう な蛋白のための用途を含むが、これらに限定されない。 さらに、本発明の治療用途は、抗肥満関連物質であるインスリン、ガストリン 、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（Ｔ ＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性 ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、モチリン、インターフェロン（α、β、γ）、イン ターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因 子結合蛋白（ＴＮＦ−ｂｐ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神 経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ３）、線維芽細胞増殖因子（Ｆ ＧＦ）、神経栄養発育因子（ＮＧＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）のよう な骨成長因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激 因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロフアージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ） 、メガケラチノサイ ト由来増殖因子（ＭＧＤＦ）、トロンボポイエチン、血小板由来増殖因子（ＰＧ ＤＦ）、コロニー刺激増殖因子（ＣＳＦ）、骨形態形成蛋白（ＢＭＰ）、スーパ ーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼおよびカリクレインを含むがこれらに限 定されない、生物活性物質の用途を含む。蛋白という用語は、本文中で使用する とき、ペプチド、ポリペプチド、コンセンサス分子、類似体、誘導体あるいはそ れらの組合せを包含する。さらに、本発明の組成物は、生物活性物質が治療する ことを意図されている状態の治療あるいは改善のための１つまたはそれ以上の医 薬品の製造にも使用しうる。 例として、血液中の酸素付加や骨吸収あるいは骨粗しょう症の低下などの治療 用途も、体重減少を伴わずに達成されうる。 併用療法。本発明の組成物および方法は、食事療法や運動のような他の療法と 組合わせて使用することができる。糖尿病の治療に有用な薬剤（たとえばインス リンおよび可能性としてアミリン）、コレステロールや血圧低下薬剤（血中脂質 レベルを低下させる薬剤あるいは他の心臓血管系薬剤など）、活性上昇薬剤（た とえばアンフェタミン）、利尿薬（脂質除去のため）、 および食欲抑制剤のような他の薬剤。そのような投与は同時にあるいは連続的に 行うことができる。さらに、本発明の方法は、身体の全体的外観を変化させるよ うにデザインされた美容整形術（たとえば体重を減らすためにデザインされた脂 肪吸引法あるいはレーザー手術、あるいは体重の見かけを増やすための移植手術 のような手術処置）と組合わせて使用しうる。動脈斑のような脂肪沈着物による 血管の遮断が引き起こす有害な状態を軽減するようにデザインされたバイパス手 術やその他の手術のような心臓手術の健康上の恩恵が、本発明の組成物および方 法を併用することによって高められると考えられる。超音波あるいはレーザー法 のような胆石を除去するための方法も、本発明の治療法の実施前、実施中あるい は実施後に使用することができる。さらに、本発明の方法は、骨の破砕、筋損傷 のための手術あるいは治療、あるいは脂肪なし組織重量の増加によって改善され る他の治療の補助として使用してもよい。投与量 当業者は、投与と所望する治療効果の観察によって有効な投与量を確認するこ とができるであろう。持続放出性製剤の投与量は、所定の期間、ｉｎ ｖｉｖｏ で生物活性物質の有効濃度 を達成するために必要な量である。持続放出性製剤の投与量と好ましい投与頻度 は、生物活性物質の種類、所望する放出期間、標的疾患、所望する投与頻度、対 象動物種およびその他の因子によって変化する。当該分子の製剤は、約０．１０ μｇ／ｋｇ／日から１００ｍｇ／ｋｇ／日が所望する治療効果を生じるようなも のが好ましい。 有効用量は、経時的な診断ツールを用いて決定しうる。例として、本発明はＯ Ｂ蛋白の投与量を提供する。たとえば、ＯＢ蛋白の内因性レベルを定量するには 、最初に血液（あるいは血漿あるいは血清）中のＯＢ蛋白の量を測定するための 診断が使用できる。そのような診断ツールは、抗体サンドイッチアッセイのよう な抗体アッセイの形態でありうる。最初に内因性ＯＢ蛋白の量を定量し、基線値 を測定する。治療期間を通じて内因性および外因性ＯＢ蛋白（すなわち自己産生 されたあるいは投与された身体内で検出される蛋白、類似体あるいは誘導体）の 定量を継続して、治療用量を決定する。たとえば、治療効果が認められるまで最 初は比較的高い用量が必要であり、その後治療効果を維持するにはより低い用量 が使用されると考えられる。調製方法 蛋白／アルギネートビーズの調製。ＯＢ蛋白あるいはレプチンを選択蛋白とし て使用して、以下の例によって代表的方法を示す。当業者はこれらの方法を理解 し、他の生物活性物質に適用することができるであろう。ドロップ混合物の調製。ここで使用するとき「ドロップ混合物」という用語は 、親水性ポリマーと生物活性物質を含有する混合物をさす。１０ｍＬのビーカー において（氷浴中）、５％アルギネートの混合物１ｍＬ（１０ｍＭトリス；ｐＨ ８）を磁気撹拌しながらレプチン４ｍＬ（１００ｍｇ／ｍＬ：１０ｍＭトリス； ｐＨ８）に加える。混合物は混濁する。次に４ｍＭＮａＯＨ ４０ｍｃＬを混合 物に加え、１５分間撹拌を続ける（氷上で）。混合物は清澄化し、その最終ｐＨ は約８．６〜８．８である。アルギネート濃度は少なくとも０．０５％重量でな ければならない。さらに、アルギネートは好ましくは少なくとも３０％グルロン 酸でなければならない。 上記に加えて、以下に述べるようにポリエチレングリコールをドロップ混合物 に加えることができる。同様に、緩衝剤あるいは賦形剤は選択蛋白の安定性に有 用である。当業者は、供給 送達のために選択される蛋白に応じて安定性のために加えるべき適切な成分を十 分に認識するであろう。 バス混合物の調製。ここで使用するとき「バス混合物」という用語は、生物活 性物質と親水性ポリマーの共沈のために使用される沈殿剤を含む混合物をさす。 バスは代表的には、５０ｍＬビーカー中に１００ｍＭ ＣａＣｌ２プラス他の成 分から成る混合物１０ｍＬを含む（下記参照）。ｐＨは、好ましくはバースト作 用を低下させるのを助けるため酸性である。ｐＨは好ましくはｐＨ４未満とすべ きである。バス中の緩衝剤は使用する蛋白にも依存する。当業者は、使用する蛋 白に基づいて緩衝剤の容量あるいは強度を調整することができるであろう。従っ て蛋白の安定性に依存して、緩衝剤濃度が高すぎる場合には、たとえばＧ−ＣＳ Ｆであれば、かかる蛋白は安定性が低いと思われ、持続放出を低下させるであろ う。 バスはＣａＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）およ び酸性緩衝剤で構成しうる。亜鉛は蛋白と相互作用して蛋白を沈殿させ、それに よってビーズの充填を高め、バースト作用を低下させ、ビーズからの蛋白の放出 を緩徐化するのを助ける。カルシウムはアルギネート沈殿物の形成と ビーズの形成を助ける。カルシウムはまたビーズの成形、特にＰＥＧのような他 の添加剤を加えることによりバスが粘性である場合に、ビーズを成形するのに役 立つ。ビーズの形の維持を助けるため粘度を上昇させるときには、カルシウムを 増加することができる。亜鉛濃度は少なくとも０．１ｍＭ、カルシウム濃度は少 なくとも１０ｍＭでなければならない。 ＰＥＧの添加は充填を増大させるのに役立つ。一部のＰＥＧは蛋白を沈澱させ ることが既知である。ＰＥＧは、充填と持続放出を最大にするのを助けるため、 バスに滴下する蛋白／アルギネート混合物に加えることもできる。ＰＥＧの分子 量は７００Ｄａから１０００ｋＤａの範囲をとりうるが、好ましくは７００Ｄａ −１００ｋＤａである。当業者はバス混合物に加えるべきＰＥＧの量を認識する であろうが、９９％の高さまで可能であり、好ましくは７５％重量未満である。 当業者また、ＰＥＧ濃度がバスの粘度によって制限される場合があることも認識 するであろう。ビーズの調製 。 一般にレプチン／アルギネート混合物の小滴をバス混合物（上述したような） 中に噴霧、滴下あるいは分散し、レプチン ／アルギネート混合物を沈殿あるいはゲル化させる。さらに、静電的手段がビー ズ形成に使用できる。 小さなビーズ、すなわち直径数１００ミクロン以下のビーズを作るためには、 同心気流付き針から成るフローチェンバー(ノズルホルダー)を使用する。２つの 口の１つをガス系統に接続し、他の口は注射器（３ｍＬ）に接続して蛋白／アル ギネート混合物をバスに送り込む（約１ｍＬ／分）のに使用する。代表的には、 混合物２ｍＬをバス混合物１０ｍＬに注入する。ノズルをバスビーカーの上部か ら約０．８ｃｍのところに位置付ける。ビーズの大きさは主としてガス流量によ って決定され、たとえば８Ｌ／分の流量ではビーズの大きさは直径５０−１５０ ミクロンの範囲である。レプチン／アルギネート流量のビーズの大きさへの影響 ははるかに少ない。 大きな（すなわち直径１−３ｍｍ）ビーズを作るためには、２４Ｇの針を付け た１ｃｃツベルクリン注射器を用いてレプチン／アルギネート混合物をバス混合 物中に滴下する。バスは代表的には１．５％ＣａＣｌ２と５−５０ｍＭ ＺｎＣ ｌ２を含む。４０ミクロンのナイロンセルストレーナーを通して注ぎ入れてビー ズを採集する。ビーズをストレーナー上で滅菌水５ｍＬ で洗浄し、クリーンルームワイパー（ガンマワイプ６７）でストレーナーの下側 から静かにブロットする。ビーズは滅菌プラスチック製のねじ栓付きマイクロチ ューブ中で保存する。ビーズの充填 バースト法：選択した群のビーズの薬剤充填は、０．５Ｍクエン酸ナトリウム ｐＨ８．５ １ｍＬ中に水和充填したビーズ１００ｍｇを正確に計量して決定す る。ビーズが、通常沈殿物を形成しながら崩壊するまで、ビーズ懸濁液を室温で インキュベートする。懸濁液を１４Ｋ ｒｐｍで２分間遠心分離する(エッペン ドルフ、５４１５Ｃ)。上清を採集し、２８０ｎｍでの吸光度を記録する。沈殿 物を７Ｍ尿素１ｍＬに懸濁して溶解する。この混合物の吸光度を記録する。水和 充填ビーズの蛋白充填は、ｍｇビーズ当りのｍｇ蛋白あるいはｍＬビーズ当りの ｍｇ蛋白として表し、２つの吸光度の合計から決定する。 累積法：この方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ放出試験と組み合わせて使用する。試験 終了時のバースト含めてビーズから放出される蛋白の量を合計する。詳細につい ては下記参照。ｉｎ ｖｉｔｒｏ放出試験 水和充填ビーズ（１００ｍｇ）を計量して１．５ｍＬ微小遠 心分離管（エッペンドルフ）に入れ、緩衝液１ｍＬ（１０ｍＭヒスチジンｐＨ７ ．４）を加える。サンプルを３７℃、１００−２００ｒｐｍのインキュベータシ ェーカーに入れる。選択した時間間隔を置いて、サンプルをインキュベータから 取出し、速心分離して（エッペンドルフ、１０００ｒｐｍ、２分間）、上清を採 取し、新鮮緩衝液１ｍＬと取り換える。上清の吸光度から放出された蛋白の量を 決定する。最終的に放出されたサンプルを採取したあと、ビーズ中に残った量を ビーズ充填／バースト法によって測定する。放出された総蛋白の合計と実験終了 時にビーズに残っている合計から、所定時間に放出されたパーセントを決定する 。ｉｎ ｖｉｖｏ試験 マウスの体重減少：一般に、充填したビーズあるいは充填していないビーズの 懸濁液をマウスに１回注射する。代表的には体重２０グラムの６−８週齢の雌性 マウスを使用する（Ｃ５７／ＢＬＣ型)。ビーズサンプルの場合には、緩衝液(５ ０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．７)３５０ｍｃＬを水和ビーズ１００ｍｇに加えて渦 状撹拌する。懸濁液を１ｃｃ注射器に取り、すべてのビーズと緩衝液３００ｍｃ Ｌをマウスの頚部に皮下注射（２３Ｇ 針）する。マウスの体重を毎日計量する。 ラット薬物動態試験：代表的には体重２５０グラムの６−８週齢の雌性ラット を使用する（ＳＤ型）。マウスの体重減少実験で述べたのと同様にして注射を実 施する。注射後様々な時間間隔でカテーテル採取によって採血し、サンプルをＥ ＬＩＳＡアッセイによってレプチンに関して分析する。実施例 以下の実施例は本発明をより詳しく例示するために提示するものであり、本発 明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。さらに、上記の開示内容あ るいは以下の実施例に関して、当業者は大規模生産のために開示内容に必要な変 更を加えることができるであろう。実施例１ この実施例では、亜鉛／レプチン共沈アルギネートビーズからのレプチンの放 出に対するビーズ中のレプチン濃度の影響を検討する。バス中２５ｍＭ ＺｎＣ ｌ２を用いて上述したように小さなビーズを調製する。１％アルギネート中８４ ｍｇ／ｍＬのレプチンを使用して高濃度ビーズ、すなわち６６ｍｇ／ｍＬレプチ ンのビーズを調製し、一方１％アルギネート中２８ｍｇ ／ｍＬレプチンから低濃度ビーズ、すなわち２１ｍｇ／ｍＬレプチンのビーズを 調製する。ビーズ中のレプチンの濃度が高くなるとともに、ビーズからのレプチ ンの分画放出は低下する。高濃度レプチンに関しては８０時間で２５％が放出さ れ、一方低濃度では８０時間で８０％が放出される。実施例２ この実施例は、亜鉛／レプチン共沈アルギネートビーズからのレプチンの放出 に対するバスのＺｎＣｌ２レベルの影響を検討する。上述したように小さなビー ズを調製するが、バス中のＺｎＣｌ２レベルは０．５および２５ｍＭであり、ビ ーズ中のレプチン濃度は３７ｍｇ／ｍＬ（累積法による）である。この実施例は 、バス中のＺｎＣｌ２が高くなるとともに生じるビーズのバーストが低下し、レ プチンの放出速度が低下することを示している。０．５ｍＭ ＺｎＣｌ２ではビ ーズのバーストは２０％、４０時間で５０％の放出であるのに対し、２５ｍＭ ＺｎＣｌ２ではビーズのバーストは５％以下で、４０時間で２５％の放出である 。実施例３ この実施例は、亜鉛／レプチン共沈アルギネートビーズと対 照アセテート緩衝製剤（２０ｍｇ／ｍＬ）を結合薬物動態／生物活性実験におい て比較する。６４ｍｇ／ｍＬ（すなわちビーズ１ｍＬ当り）レプチンを含む小さ なビーズを、バス中１７ｍＭ ＺｎＣｌ２を用いて上述したように製造する。雌 性ラット（体重２２０ｇ）に５０ｍｇ／ｋｇ用量の単回ＳＣ（皮下）注射を行う 。ビーズサンプルの血漿濃度は対照に比べて持続される。ビーズサンプルを注射 したラットは１１２時間にわたって５０ｎｇ／ｍＬ以上のレプチンの血漿濃度を 維持したのに対し、対照動物に関しては１２−１８時間である。ビーズ群でのよ り高い、より持続的な血中レプチンレベルは、対照群と比較してより著明で、よ り持続的な体重減少と相関していた。ビーズサンプルを注射したラットは１２０ 時間、継続的に体重減少する；１２０時間目での総体重減少は初期体重の９％で ある。これに対し、対照ラットは５０時間で初期体重の７％減少するが、１２０ 時間までに体重が回復する。実施例４ この実施例は、１０ｍＭ ＺｎＣｌ２に加えてバス中の様々なＰＥＧが、ＩＬ −１ｒａの充填効率およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの放出に及ぼす影響を示す。１０ ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ ６．８５中ＩＬ−１ｒａを用いて上述したように小さなビーズを調製する。１つ のビーズバスは、（Ａ）１００ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＺｎＣｌ２、２０ ％１Ｋ ＰＥＧおよび２０％２Ｋ ＰＥＧを含む。第二のビーズバスは、（Ｂ） Ａと同じものを含むが２０％１Ｋ ＰＥＧを含まない。ビーズＡおよびＢ中のＩ Ｌ−１ｒａの濃度は５８ｍｇ／ｍＬ、すなわちクエン酸ナトリウムバーストから 算定すると７４％の充填効率である。Ｂ製剤は５５％バーストで、１８時間後に ７５％放出された。Ａ製剤は２０％バーストで、１８時間後に５０％放出された 。従って、バス中へのＰＥＧの添加は、蛋白の放出を持続させる高度に充填され たビーズをもたらす。同様に、１Ｋ ＰＥＫの添加はさらに低いバーストを導き 、蛋白の放出を緩徐化する。実施例５ この実施例は、バス中にＰＥＧを含むが亜鉛を含まないことが、ＩＬ−１ｒａ の充填およびアルギネートビーズからの初期バーストに及ぼす影響を示す。バス が１００ｍＭ ＣａＣｌ２に加えて２０％１Ｋおよび２０％２Ｋ ＰＥＧを含む ことを除いて、上述したように小さなビーズを調製する。ビーズ中６３ｍｇ／ｍ ＬのＩＬ−１ｒａに関して充填効率は９３％である。 初期バーストは３５％である。従って、バスへのＰＥＧの添加は、亜鉛イオンの 存在なしに高い蛋白充填を導くことができる。実施例６ この実施例では、緩衝液（１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．８５）中のＩＬ− １ｒａと実施例１のアルギネートビーズ中のＩＬ−１ｒａのボーラス注射の放出 効率を比較する。雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウス（体重２０ｇ）に、それぞれ２０ｍｇ のＩＬ−１ｒａを含む種々の製剤をゼロの時点でＳＣ（皮下）注射する。１８時 間目にマウスにｒｈＩＬ−１β（０．１ｍｃｇ／マウス）をＩＶ（静脈内）注射 し、その２時間後に屠殺して血液を採取する。グルコース濃度とリンパ球数に関 して血液を分析する。ＩＬ−１βは通常、グルコース濃度とリンパ球数の低下を 生じさせるが、特定レベルのＩＬ−１ｒａの存在はそのような損失から保護する 。実験の結果は、ビーズ中に含まれるＩＬ−１ｒａを摂取したマウスだけが血液 パラメータの値の損失から保護されることを示している。この結果は、アルギネ ートビーズが少なくとも１８時間、有効なレベルでＩＬ−１ｒａの放出を持続さ せることを明らかにしている。実施例７ この実施例は、沈殿バスがＣａＣｌ２（１００ｍＭ）だけを含む、ＧＣＳＦを 用いた蛋白含有ビーズの調製と放出を例示する対照実験である。上述したように 大きなビーズを調製する。注射器混合物は１％アルギネート中４６ｍｇ／ｍＬの ＧＣＳＦ（１０ｍｍＭトリスｐＨ７）を含む。調製したビーズは１６ｍｇ／ｍＬ のＧＣＳＦ（クエン酸塩のバーストから）を含む。従って、バス中にＣａＣｌ２ だけの場合の充填効率は３５％である。蛋白の分画放出は、６０％バーストと１ 日で７５％の放出を示す。従って、文献中に述べられている既知の手法を用いる と、低い蛋白充填と迅速な放出が生じる。実施例８ この実施例は、バス中のＺｎＣｌ２がアルギネートビーズ中のＧＣＳＦの充填 と放出に及ぼす影響を示す。１０ｍＭ ＺｎＣｌ２をバスに加えることを除いて 、上述したように大きなビーズを調製する。注射器混合物は１％アルギネート中 ４６ｍｇ／ｍＬのＧＣＳＦを含む。調製したビーズは２８ｍｇ／ｍＬのＧＣＳＦ （クエン酸塩のバーストから）を含む。従って、１０ｍＭ ＺｎＣｌ２のバスへ の添加（１００ｍＭ ＣａＣｌ２に 加えて）により、充填効率は３５％（実施例６）から６１％に上昇する。蛋白の 分画放出は、４０％という低いバーストと５５％の１日放出を示す。このように 、ＣａＣｌ２のバスにＺｎＣｌ２を加えると、より高い充填効率、より低いバー ストならびに蛋白のより緩徐な放出を導く。実施例９ この実施例は、バスのｐＨが酸性であり、バス中にＰＥＧを含むことが、アル ギネートビーズによるＧＣＳＦの充填と放出に及ぼす影響を示す。バスに２０％ ＰＥＧ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えることおよびバスのｐＨが１．７であることを 除いて、実施例７で述べたように大きなビーズを調製する。バスは同時に１００ ｍＭ ＣａＣｌ２と１０ｍＭ ＺｎＣｌ２も含む。ＧＣＳＦに関する充填効率は ５４％で、分画放出（ビーズ中２５ｍｇ／ｍＬ）は、５％未満のはるかに低いバ ーストと１００時間後で４０％の放出を示す。従って、ＰＥＧを含む（ＣａＣｌ ２とＺｎＣｌ２に加えて）酸性バス混合物は、低いバーストと蛋白の緩徐な放出 を導く。実施例１０ この実施例は、バス中にＰＥＧと亜鉛を含み、酸性化剤でバ スのｐＨを低下させることが、ＧＣＳＦの充填とアルギネートビーズからのＧＣ ＳＦの初期バーストに及ぼす影響を示す。バスが２５ｍＭ ＺｎＣｌ２、１００ ｍＭ ＣａＣｌ２、および５％ＰＥＧ １Ｋと５％ＰＥＧ １０Ｋを含むことを 除いて、上述したように大きなビーズを調製する。バスのｐＨをグリシン緩衝液 とリン酸でｐＨ１．６５に低下させる。生じるビーズ（２０ｍｇ／ｍＬ充填）は 、５％未満のバーストと９０時間で４０％の分画放出を示す。従って、バス中の ＰＥＧと亜鉛および低いｐＨの組合せは低いバーストと緩徐な放出を導く。実施例１１ この実施例は、亜鉛イオンを添加していない低いｐＨのバス中のＰＥＧを用い たアルギネートビーズ中のＧＣＳＦの調製を示す。バスが５％１Ｋと５％１０Ｋ ＰＥＧを含むことを除いて、上述したように小さなビーズを調製する。グリシ ンおよびリン酸緩衝液を用いてバスのｐＨを１．４３に低下させる。充填効率は 、ビーズ中１４ｍｇ／ｍＬで４２％（クエン酸塩バーストから）である。分画放 出は、３２％のバーストと７０時間後で３５％の放出を示す。実施例１２ 実施例１２および以下の実施例１３−１５の大きなＧＣＳＦ／アルギネートビ ーズは、上述したのと同様であるが、種々の操作のタイミングをより厳密に制御 し、充填の測定に異なる方法を用いて調製する。特に、ＧＣＳＦ／アルギネート 混合物１ｍＬを磁気撹拌したバス１０ｍＬ中に約２分間かけて滴下する。ビーズ を濾過し、水５ｍＬで洗浄する。ビーズ製造工程全体で約５分間要する。充填は 、バス中に滴下したアルギネート混合物中の蛋白の量と、形成されたビーズ中に 組み込まれていない蛋白、すなわちバス混合物と洗浄液中に残存している蛋白の 量との差から算定する（Ａ２８０による）。このビーズ中に組み込まれた蛋白の 量をバスに加えた混合物の１ｍＬ容量で除して、ｍｇ／ｍＬビーズで表した充填 を得る。 実施例１２は、バス中のＰＥＧの存在がビーズ中へのＧＣＳＦの充填に及ぼす 影響を比較する。バスが２００ｍＭ ＣａＣｌ２と１５％ＰＥＧ ８Ｋ（ｐＨ５ −６）を含むことを除いて、上述したように大きなビーズを調製する；対照ビー ズのバスは２００ｍＭ ＣａＣｌ２を含む。バスへのＰＥＧの添加は充填を２１ ．８ｍｇ／ｍＬ（効率７０％）から２６．５ｍｇ／ｍＬ （効率８５％）に上昇させる。実施例１３ この実施例は、バスの低いｐＨがアルギネートビーズによるＧＣＳＦの充填と 放出に及ぼす影響を示す。ビーズの形成と充填は、バスのひとつが０．５Ｍグリ シン緩衝液ｐＨ２．１を含むことを除き、ＰＥＧを用いて実施例１２におけるよ うに測定する。ｐＨ２．１での充填は２４．９ｍｇ／ｍＬ（効率８０％）で、対 照と同様である。しかし、１時間目の初期放出（２９％）は対照よりも低く、２ ４時間目の放出（３２％）はより持続される（対照はそれぞれ９２％と９９％） 。実施例１４ この実施例は、ＰＥＧを含むバスに亜鉛を加えることがアルギネートビーズ中 へのＧＣＳＦの充填に及ぼす影響を示す。ビーズの形成と充填は、ＰＥＧを用い て実施例１２におけるように測定する。バスへの１０ｍＭ ＺｎＣｌ２の添加は 充填を２６．５ｍｇ／ｍＬ（効率８５％）から３０．３ｍｇ／ｍＬ（効率９７％ ）に上昇させた。実施例１５ この実施例は、アルギネートビーズからのＧＣＳＦの低い初 期バーストと持続放出を示す。ビーズの形成、充填および放出は、バスが１００ ｍＭ ＣａＣｌ２、５％ＰＥＧ １Ｋと５％ＰＥＧ ２Ｋ、および０．５Ｍグリ シン緩衝液（ｐＨ２．１）を含むことを除いて、実施例１３と同様に実施する。 充填したビーズは２４ｍｇ／ｍＬ ＧＣＳＦを含む。３０分目での初期放出はゼ ロに近く、１９時間目での放出は１３．６％、４４時間目での放出は２４％であ る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ビークマン，アリス・シー アメリカ合衆国、カリフオルニア・91361、 サウザンド・オークス、ローリング・オー クス・ドライブ・300、アパートメント・ ナンバー・184

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）親水性ポリマー； ｂ）生物活性物質；および ｃ）少なくとも１つの沈殿剤、 を含み、生物活性物質を親水性ポリマー内で共沈させることを特徴とする、持続 放出性組成物。 ２．沈殿剤が多価金属イオンあるいはその塩、アセテート、シトレート、塩化物 、カーボネートあるいはそれらの水酸化物から成る群から選択される、請求項１ に記載の組成物。 ３．金属イオンがマンガン、ストロンチウム、鉄、マグネシウム、カルシウム、 バリウム、アルミニウムあるいは亜鉛から成る群から選択される、請求項２に記 載の組成物。 ４．沈殿剤が、亜鉛、カルシウムあるいはその組合せから成る群から選択される 多価イオンである、請求項３に記載の組成物。 ５．親水性ポリマーがポリアニオンである、請求項１に記載の組成物。 ６．親水性ポリマーが多糖類である、請求項１に記載の組成物。 ７．多糖類が酸性多糖類である、請求項６に記載の組成物。 ８．多糖類がアルギネートである、請求項７に記載の組成物。 ９．アルギネートが少なくとも３０％のグルロン酸を含む、請求項８に記載の組 成物。 １０．アルギネートが少なくとも０．０５％重量を占める、請求項８に記載の組 成物。 １１．生物活性物質が蛋白を含む、請求項１に記載の組成物。 １２．蛋白が少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌを占める、請求項１１に記載の組成 物。 １３．蛋白が造血因子、コロニー刺激因子、抗肥満因子、成長因子、栄養因子、 および抗炎症因子から成る群から選択される、請求項１１に記載の組成物。 １４．蛋白がレプチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ３、Ｇ Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ２、ＴＮＦ−ｂｐ、ＭＧＤＦ、ＯＰＧ、インタ ーフェロン、エリトロポイエチン、ＫＧＦおよびその類似体あるいは誘導体から 成る群から選択される、請求項１１に記載の組成物。 １５．少なくとも２つの沈殿剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。 １６．沈殿剤の少なくとも１つが水溶性ポリマーから成る群か ら選択される、請求項１５に記載の組成物。 １７．水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項１６に記載の組 成物。 １８．ａ）生物活性物質と親水性ポリマーを溶媒で溶解して第一混合物を形成す る段階； ｂ）少なくとも１つの沈殿剤を溶媒に溶解して第二混合物を形成する段階； ｃ）第一混合物を第二混合物に加える段階；および ｄ）生物活性物質と親水性ポリマーを共沈させて共沈粒子を形成する段階、を含 む、持続放出性組成物を製造する方法。 １９．沈殿剤が多価金属イオンあるいはその塩、アセテート、シトレート、塩化 物、カーボネートあるいはそれらの水酸化物から成る群から選択される、請求項 １８に記載の方法。 ２０．金属イオンがマンガン、ストロンチウム、鉄、マグネシウム、カルシウム 、バリウム、アルミニウムあるいは亜鉛から成る群から選択される、請求項１９ に記載の組成物。 ２１．沈殿剤が、亜鉛、カルシウムあるいはその組合せから成る群から選択され る多価イオンである、請求項２０に記載の方法。 ２２．第二混合物中の沈殿剤が、少なくとも１ｍＭのカルシウムと０．１ｍＭの 亜鉛を含む、請求項２１に記載の方法。 ２３．親水性ポリマーがポリアニオンである、請求項１８に記載の方法。 ２４．親水性ポリマーが多糖類である、請求項１８に記載の方法。 ２５．多糖類が酸性多糖類である、請求項２４に記載の方法。 ２６．多糖類がアルギネートである、請求項２５に記載の方法。 ２７．アルギネートが少なくとも３０％のグルロン酸を含む、請求項２６に記載 の方法。 ２８．第一混合物が少なくとも０．０５％重量のアルギネートを含む、請求項２ ７に記載の方法。 ２９．生物活性物質が蛋白を含む、請求項１８に記載の方法。 ３０．第一混合物が少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌの蛋白を含む、請求項２９に 記載の方法。 ３１．蛋白が造血因子、コロニー刺激因子、抗肥満因子、成長因子、栄養因子、 および抗炎症因子から成る群から選択される、請求項２９に記載の方法。 ３２．蛋白がレプチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＢＤＮＦ、ＯＰ Ｇ、ＧＤＮＦ、ＮＴ３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ２、ＴＮＦ−ｂｐ、 ＭＧＤＦ、インターフェロン、エリトロポイエチン、ＫＧＦおよびその類似体あ るいは誘導体から成る群から選択される、請求項２９に記載の方法。 ３３．第二混合物中に少なくとも２つの沈殿剤をさらに含む、請求項１８に記載 の方法。 ３４．沈殿剤の少なくとも１つが水溶性ポリマーから成る群から選択される、請 求項３３に記載の方法。 ３５．水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項３４に記載の方 法。 ３６．共沈粒子を形成するために、第一混合物の第二混合物への添加が噴霧、静 電場、滴下、分散、あるいは混合によって行われる、請求項１８に記載の方法。 ３７．共沈した粒子を分離する段階をさらに含む、請求項１８に記載の方法。 ３８．請求項１８、３６および３７の方法によって製造される持続放出性製品。 ３９．製薬上許容される担体、希釈剤あるいはアジュバント中の、請求項１また は１５に記載の医薬製剤。 ４０．製薬上許容される担体、希釈剤あるいはアジュバント中の請求項１または １５に記載の持続放出性組成物で適応症を治療する方法。 ４１．体重過剰、糖尿病、高い血中脂質レベル、動脈硬化症、動脈斑、胆石形成 の低下あるいは予防、不十分な脂肪なし組織重量、インスリンに対する不十分な 感受性、および卒中から成る群から選択される疾患を、生物活性物質がレプチン 、その類似体あるいは誘導体である、製薬上許容される担体、希釈剤あるいはア ジュバント中の請求項１または１５に記載の持続放出性組成物で治療する方法。 ４２．造血細胞欠損症、感染、および好中球減少症から成る群から選択される疾 患を、生物活性物質がＧ−ＣＳＦ、その類似体あるいは誘導体である、製薬上許 容される担体、希釈剤あるいはアジュバント中の請求項１または１５に記載の持 続放出性組成物で治療する方法。 ４３．生物活性物質がＩＬ−１ｒａ、その類似体あるいは誘導体である、製薬上 許容される担体、希釈剤あるいはアジュバント中の請求項１または１５に従った 持続放出性組成物で炎症を治療する方法。