JP2003081865A - 水不溶性徐放性組成物、その製剤及びその製造方法 - Google Patents

水不溶性徐放性組成物、その製剤及びその製造方法

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JP2003081865A JP2001276262A JP2001276262A JP2003081865A JP 2003081865 A JP2003081865 A JP 2003081865A JP 2001276262 A JP2001276262 A JP 2001276262A JP 2001276262 A JP2001276262 A JP 2001276262A JP 2003081865 A JP2003081865 A JP 2003081865A
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道夫 木村
Yutaka Mizushima
裕 水島
Toshisato Igarashi
理慧 五十嵐
Tetsuo Matsuishi
哲郎 松石
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡単でしかも高収率の製造方法により、G-CS
Fを沈殿化で安定化させるとともに徐放効果により生体
内で数日間に亘り薬効を保持する水不溶性の粒子製剤を
提供すること。 【解決手段】 亜鉛イオンと沈殿を形成する薬効を有す
る蛋白質あるいはペプチド、亜鉛イオンと沈殿を形成す
る主たる薬効をもたない蛋白質、亜鉛イオン、及び酸性
ムコ多糖体とからなる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、亜鉛イオンと沈殿
を形成する薬効を有する蛋白質あるいはペプチドと亜鉛
イオンと沈殿を形成するが主たる薬効を持たない蛋白質
を酸性ムコ多糖存在下において亜鉛塩の添加により共沈
させた水不溶性徐放性組成物、その製剤及びその製造
法、詳しくは亜鉛イオンと沈殿を形成するG-CSF等の蛋
白質あるいはペプチド、亜鉛イオンと沈殿を形成するが
主たる薬効を持たない蛋白質、酸性ムコ多糖体、及び亜
鉛イオンからなる水不溶性沈殿を用いた水不溶性徐放性
組成物、及びその製造法並びそれを用いた徐放性製剤に
関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、好中球の減少が伴う疾患や症状に
対して、G-CSF製剤が用いられている。その投与方法は
静脈注射、皮下注射、点滴などであるが、投与が1日1回
あるいは2回で連日投与となっている。これはG-CSFの血
中安定性が悪く半減期が短いうえに薬効を維持するため
にはある濃度以上のG-CSFが血中に存在する必要がある
からである。そのために患者は連日投与という負担を強
いられ、G-CSFの大量使用にもつながっている。従っ
て、G-CSFの血中濃度を維持するための製剤化が必要と
されている。
【０００３】現在、G-CSFのいくつかのアミノ酸を置換
し、半減期を延ばした変異体の製剤も使用されている
が、半減期は2倍程度で投与回数の改善には至っていな
い。また、G-CSFのリジン残基のいくつかにポリエチレ
ングリコール（PEG）を付加したPEG化G-CSFの開発もな
されているが、PEG化による活性の低下や抗原性、生産
コストなどを考慮するとさらに好ましいG-CSFの血中濃
度維持製剤の開発が望まれている。
【０００４】薬物の徐放化は生体内で長時間薬物濃度を
維持する良い手段であるが、蛋白質を用いる場合安定性
を考えるとあまり過激な条件は使えず、その徐放製剤の
作製には多くの制限を受ける。
【０００５】蛋白質の簡単な徐放化として穏やかな条件
で沈殿をつくり用いるという方法があるが、蛋白質の種
類により沈殿する条件が異なり、沈殿を形成する穏やか
な条件を探すのは非常に困難をきわめる。さらに、その
条件は高収率を約束するものでなければならない。蛋白
質を沈殿させる方法として、等電点沈殿、塩析、金属イ
オンとの沈殿などが応用でき、実際インスリンでは亜鉛
懸濁製剤が臨床で使われているが、生体内では沈殿の溶
解が早く数日間効果を持続させるものではない。従っ
て、数日薬効を維持させるには沈殿にした蛋白質をその
まま用いるのではなくさらに工夫を加えた徐放製剤が必
要となってくる。
【０００６】あるいは、ゼラチンやヒアルロン酸などを
用いたハイドロゲルをキャリアとする徐放剤も考えられ
るが、この場合、徐放効果を得るにはゲルと親和性をも
つ塩基性あるいはヘパリン結合性の蛋白質には期待する
効果は得られるが、G-CSFのように等電点が中性以下の
蛋白質ではゲルに巻き込ませても自然拡散のために望ま
しい徐放効果は得られないと考えられる。
【０００７】又先行技術文献として本出願人が平成１３
年６月１１日に出願した特願２００１−１７７５４８号
があるが、この文献にはG-CSFについての記載がない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】このように、G-CSFは
もっとも臨床使用されているサイトカインのひとつであ
りながら数日間血中濃度を維持する製剤が開発されてい
ないのが現状である。そこで、本発明は簡単でしかも高
収率の製造方法により、G-CSFを沈殿化で安定化させる
とともに徐放効果により生体内で数日間に亘り薬効を保
持する水不溶性の粒子製剤を提供することを目的とする
ものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、顆粒球コ
ロニー刺激因子（G-CSF）が金属イオン、たとえばカル
シウムイオン、で沈殿を形成することに注目し、その沈
殿性粒子による徐放製剤の開発を試みた。前述したよう
に蛋白質と多価金属イオンのみの沈殿は溶解し易く、そ
のままでは期待する徐放効果は得られないと予想され、
実際、本発明者らが行った実験でも確認された。
【００１０】そこで、本発明者らは、G-CSFと金属イオ
ンからなるこのような沈殿の溶解を抑える方法として、
沈殿の組成物にさらに沈殿性の物質を加えることが有効
でないかと考え、金属イオンを結合することが知られ薬
効がほとんど無い蛋白質、例えばヒト血清アルブミンや
γ−グロブリンなどをG-CSFの金属イオンとの沈殿に含
有させることを試みた。この場合、G-CSFとこれらの蛋
白質とを共に沈殿できる多価金属イオンを選択すること
が重要である。実際ヒト血清アルブミンとγ−グロブリ
ンはカルシウムイオンでは沈殿を形成しないことから、
本発明者らはいくつかの多価金属イオン、具体的には、
カルシウム、亜鉛、銅、鉄、アルミニウム、錫、ニッケ
ルの各イオンについて沈殿形成を調べた。結果として、
カルシウム、鉄、アルミニウム、ニッケルなどではまっ
たく沈殿を起こさず、亜鉛イオンがもっとも望ましいこ
とが分かった。使用する塩としては酢酸亜鉛あるいは塩
化亜鉛が望ましく、また、沈殿の収率をあげるためには
亜鉛の濃度は５ｍM以上が望ましいことがわかった。5ｍ
M以上の濃度の亜鉛イオンによりG-CSFは95％以上沈殿さ
せることができた。
【００１１】さらに、本発明においては酸性ムコ多糖体
を添加することにより、上記混合蛋白質をさらに効率よ
く沈殿でき、徐放性もさらに向上することを見出した。
ムコ多糖体とはコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘ
パリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸
およびこれらの塩などがあるが、コンドロイチン硫酸お
よびその塩が最も望ましい。
【００１２】たとえば、20 mg/mlのγ-グロブリンでは1
0ｍMの塩化亜鉛で80〜90％ほど沈殿するが、コンドロイ
チン硫酸を加えることにより99％が沈殿することを確認
した。また、10mg/mlのヒト血清アルブミンでは20ｍMの
塩化亜鉛では沈殿は10％程度であるが、コンドロイチン
硫酸を加えることにより95％以上沈殿させることができ
た。
【００１３】なお、前記文献（特願2001-177548号）に
は生物学的活性を有する蛋白質又はペプチド等に必要に
応じて血清蛋白質を添加することが記載されているが、
本発明ではG-CSF、後述のIL-2、エタナセプト又は抗体
と亜鉛イオンの沈殿に必ず亜鉛イオンと沈殿を形成する
主たる薬効をもたない蛋白質を含有させることが前述の
如く徐放効果を高めた沈殿を作製するのに不可欠なもの
である。
【００１４】このように、本発明者らはG-CSFの亜鉛イ
オンによる沈殿を含む溶液にさらに、γ-グロブリンや
ヒト血清アルブミンなどと酸性ムコ多糖体を加え、新た
な沈殿を形成させる方法においては、それらの相互作用
により沈殿形成が促進され99％以上G-CSFを沈殿させる
ことができることを見出し、本発明に至った。この沈殿
は注射針を通るのに十分な細かさであり、注射剤として
使用可能である。
【００１５】さらに、酸性ムコ多糖体を加えたγ-グロ
ブリンやヒト血清アルブミン沈殿形成の効果は、G-CSF
の亜鉛イオンによる沈殿形成の収率を高めるだけでなく
生体内での徐放効果も非常に高まることがマウスを使っ
た実験において確認され本発明を完成した。
【００１６】本発明はｐH4.5〜8.5の間で沈殿を形成さ
せることを特徴とする。すなわち、中性に近いpHである
ためG-CSFのように極端なｐHで活性を失うような蛋白質
においてもその活性を損なわずに製造が可能である。さ
らに、沈殿にG-CSFを高い割合で含ませることを特徴と
する。最適な条件では99％以上である。
【００１７】本発明の水不溶性徐放性組成物は各構成成
分を加える順番を気にせずに沈殿を形成させることも可
能であるが、高収率でG-CSFを沈殿に含ませるには、10
〜1000μg/mlのG-CSF溶液を5ｍM以上の最終濃度の酢酸
亜鉛あるいは塩化亜鉛でまずG-CSFを沈殿させることが
望ましい。次に、最終濃度が0.5〜20 mg/mlになるよう
ヒト血清アルブミンとアルブミンに対して１/2〜1/100
の最終濃度になるようにコンドロイチン硫酸を加えるこ
とで本発明の水不溶性徐放性組成物を作ることが望まし
い。
【００１８】さらに、遠心操作を行うことにより沈殿を
固めた後、亜鉛イオンを含む水溶液で再懸濁して用いる
こともできる。さらに、懸濁液にマンニトールなどを加
え凍結乾燥したものを注射用水で再懸濁し用いることが
できる。沈殿はEDTAに溶かし、非変性条件の電気泳動を
おこない、G-CSFが沈殿作成中に変性をおこしていない
ことが確認された。また、凍結乾燥した製剤では37℃で
1か月以上G-CSFは変性していないことが確認された。本
発明のG-CSF製剤は皮下注射あるいは筋肉注射で投与が
可能である。本発明のG-CSF製剤は、マウスにおいては
一回の投与で10日以上その薬効を維持するだけでなく、
その投与量はその薬効を維持するために連日投与で使用
されるG−CSF量の1/10以下で充分であった。また、本発
明のG-CSF製剤は、ラットにおいては一回の投与で6日以
上その薬効を維持し、その時の投与量はその薬効を維持
するために連日投与で使用されるG-CSF量の1/3以下で充
分であった。
【００１９】本発明の製造方法による徐放製剤はG-CSF
のみならず、亜鉛イオンと沈殿を作る薬効を持つ蛋白質
あるいはペプチドに応用可能である。例えば、ヒルジ
ン、インターロイキン-2（IL-2）、エタナセプト、モノ
クローナル抗体、γ-カルボキシグルタミン酸を持つ蛋
白質、His-タグをつけた組み換え体蛋白質製剤などが含
まれる。特に微量で薬効を示す因子は望ましい。
【００２０】例えば、モノクローナル抗体を本発明の方
法により徐放製剤化したものはin vitroの実験において
G-CSFと同様な徐放効果を示した。また、IL-2は塩化亜
鉛で沈殿するが、ヒト血清アルブミンとコンドロイチン
硫酸を添加して沈殿を形成させたほうがより沈殿に含ま
れることが確認された。
【００２１】
【実施例】以下に本発明の実施例について説明する。 （試験例１）G-CSFの各種金属イオンでの沈殿作成の試
み 150μg/ml G-CSF（中外製薬）溶液500μlに500mMの金属
塩（塩化錫、塩化アルミニウム、塩化銅、塩化鉄、塩化
亜鉛、塩化カルシウム、塩化ニッケル）20μlを加え撹
拌後静置して目視により沈殿形成を確認した。６種類す
べての金属塩に対して沈殿を形成した。
【００２２】（試験例２）ヒトγ-グロブリンおよびヒ
ト血清アルブミンの各種金属イオン形成の試みとムコ多
糖体が沈殿形成に与える効果 10mg/mlヒトγ-グロブリン（シグマ社）あるいは10mg/m
lヒト血清アルブミン（シグマ社）溶液500μlに500mMの
金属塩（塩化錫、塩化アルミニウム、塩化銅、塩化鉄、
塩化亜鉛、塩化カルシウム、塩化ニッケル）20μlを加
え撹拌後静置して目視により沈殿形成を確認した。両蛋
白質とも塩化錫および塩化亜鉛の添加により白濁した。
これらの溶液にさらに20mg/mlのコンドロイチン硫酸を
添加したところ、塩化カルシウム添加溶液以外のすべて
の溶液で沈殿が確認された。塩化錫および塩化亜鉛に関
してはさらに強く白濁した。塩化アルミニウム、塩化
鉄、塩化ニッケル添加溶液の沈殿は弱くしかも塩化アル
ミニウムと塩化鉄に関しては均一な沈殿ではなかった。
結果からγ-グロブリンやヒト血清アルブミンを沈殿さ
せる金属イオンとしては亜鉛が最適であることが分かっ
た。
【００２３】（試験例３）γ-グロブリンの塩化亜鉛と
コンドロイチン硫酸による沈殿作成 20mg/mlのγ-グロブリン（シグマ社）500μlに0.5M塩化
亜鉛（ｐH5.4）をそれぞれ20、10、5、2、1、0.5μl（2
0〜0.5ｍM）加えたものと20mg/mlのγ-グロブリン500μ
lに0.5M塩化亜鉛10μlと2０mg/mlコンドロイチン硫酸16
0μlを加えたものを撹拌後5分間室温に放置した。次に
約10,000 x gで10分間遠心分離し、上清のγ-グロブリ
ン濃度をProtein Assay試薬（バイオラッド社）を用い
た発色法により測定した。
【００２４】表１に示すようにγ-グロブリンは塩化亜
鉛濃度が高くなるにつれ沈殿量が多くなる。また、コン
ドロイチン硫酸は沈殿形成を促進している。
【００２５】（試験例４）γ-グロブリンの塩化亜鉛と
ヒアルロン酸による沈殿作成 20mg/mlγ-グロブリン300μlにミリQ水あるいは10mg/ml
ヒアルロン酸200μlを混ぜ、500μlとした溶液に0.5M塩
化亜鉛（ｐH5.4）を20、10、５、２、１μl（20〜1ｍ
M）加え撹拌後室温に5分間放置した。次に約10,000xgで
４℃、30分間遠心分離後、上清のγ-グロブリン濃度をP
rotein Assay試薬（バイオラッド社）を用いた発色法に
より測定した。表２に示すようにコンドロイチン硫酸同
様ヒアルロン酸も塩化亜鉛によるγ-グロブリンの沈殿
形成を促進した。
【００２６】（試験例５）γ-グロブリン・亜鉛・コン
ドロイチン硫酸沈殿におけるγ-グロブリンとコンドロ
イチン硫酸の濃度比 20mg/mlγ-グロブリン（シグマ社）200μlに20mg/mlコ
ンドロイチン硫酸（和光純薬）を100μl（２：１）、50
μl（４：１）、25μl（８：１）、12.5μl（16：1）あ
るいは10mg/mlコンドロイチン硫酸を40μl（10：１）、
20μl（20：１）、８μl（50：１）、４μl（100：１）
あるいは1mg/mlコンドロイチン硫酸を８μl（500：
１）、４μl（1000：１）を混合し、ミリQ水で400μlと
した溶液に0.5M塩化亜鉛（ｐH5.4）を8μl加え室温で5
分間放置した。次に約10,000xg、4℃で10分間遠心分離
し、上清のγ-グロブリン濃度をProtein Assay試薬（バ
イオラッド社）を用いた発色法により測定した。結果は
γ-グロブリンとコンドロイチン硫酸の比が2〜100：１
においては90％以上が沈殿していた。また最も沈殿して
いたのは比が8〜20：１の時であった。
【００２７】（試験例６）ヒト血清アルブミンの酢酸亜
鉛とコンドロイチン硫酸との沈殿作成 50 mg/mlヒト血清アルブミン（シグマ社）100μlに0.5M
酢酸亜鉛（pH6.0）を用いて亜鉛濃度が1、５、10、15、
20ｍMとなるように加え、ミリQ水で500μlとし撹拌後37
℃で10分間放置した。白濁したので約10,000ｘｇで室温
10分間遠心分離し、上清のヒト血清アルブミンの濃度を
Protein Assay試薬（バイオラッド社）を用いた発色法
により測定した。すべての亜鉛濃度で沈殿したヒト血清
アルブミンの割合は2〜10％のみであった。次に、50mg/
mlヒト血清アルブミン（シグマ社）100μl に0.5M酢酸
亜鉛（pH6.0）を用いて亜鉛濃度が1、５、10、20、40ｍ
Mとなるように加え、それぞれの亜鉛濃度でコンドロイ
チン硫酸の濃度が0.5、1、2.5、5、10mg/mlになるよう
に20ｍg/mlコンドロイチン硫酸とミリQを用いて500μl
の溶液に調製し撹拌後37℃で10分間放置した。沈殿が形
成されたので約10,000xg室温で10分間遠心分離後、上清
のアルブミン濃度をProtein Assay試薬（バイオラッド
社）を用いた発色法により測定した。表３に示すように
亜鉛濃度が20ｍM、コンドロイチン硫酸量が1mg/ml、つ
まりヒト血清アルブミン：コンドロイチン硫酸が10：１
の濃度で最もよく沈殿した。
【００２８】（実施例1）G-CSFのヒト血清アルブミン、
酢酸亜鉛、コンドロイチン硫酸混合物による沈殿徐放製
剤の作成とG-CSFのin vitroでの溶出試験 G-CSF(150μg/ml)20μl、酢酸亜鉛（0.5M）12μl、ミリ
Q水103μlを混ぜ懸濁させ、さらにヒト血清アルブミン
(20mg/ml)150μl、コンドロイチン硫酸（20mg/ml）15μ
lを加え撹拌後、37℃で10分間静置した。約10,000ｘ
ｇ、室温で10分間遠心後、上清をすて、150μlの20ｍM
酢酸亜鉛、0.5Mカルボキシメチルセルロース、5％マン
ニトールで再懸濁し徐放製剤とした。またコントロール
は20μl G-CSF(150μl/ml)をミリQ水で150μl溶液とし
た。沈殿からのG-CSFの溶出試験は24ウェル-セルカルチ
ャーインサートシステム（ファルコン社）を用いておこ
なった。3μｍのポアサイズの膜を持つインサートに100
μlの試料を入れた後、インサートを900μlの0.3％BS
A、PBSの入ったウェルにいれ、シェーカーで揺らした。
1時間毎にインサートを新しいウェルに移し変え、イン
サートの膜を通してウェルに溶出してきたG-CSFをELISA
で定量し、溶出量を1時間毎に8時間まで積算した。図1
に示すように8時間後の沈殿からの積算溶出量は約５％
程度でかなり徐放効果があることが示された。
【００２９】（実施例2）G-CSF徐放製剤投与正常マウス
におけるG-CSFの血中動態と薬効 167μlの150μg/ml G-CSF（中外製薬）に20μlの0.5M酢
酸亜鉛と25μlの20mg/mlのコンドロイチン硫酸を加えた
後50mg/mlヒト血清アルブミン100μlと注射用水188μl
を加え撹拌し37℃で5分間放置した。約10,000ｘｇで10
分間遠心分離後、上清を捨て、沈殿を250μlの20ｍM酢
酸亜鉛、0.5％カルボキシメチルセルロース含有５％マ
ンニトール溶液に懸濁した。この懸濁液100μlを体重約
25ｇの正常マウス（C3H）3匹に筋肉注射した。コントロ
ールとして33μlの150μg/ml G-CSFに50mg/mlヒト血清
アルブミン100μlと注射用水117μlを加え、５％マンニ
トールとした溶液の100μlを体重約25ｇの正常マウス
（C3H）3匹に筋肉注射した。投与前、および投与後4時
間、1、２、3、4、5、6、7、8、9、10、11、14日に採血
を行い、G-CSFの血中動態は6日までELISAで測定し、薬
効として14日まで血球計算盤にて白血球数を測定した。
図2に示すようにG-CSFそのものを投与したものは4時間
後ではかなり血中に存在しているが、24時間後は検出限
界以下であった。それに比べ、徐放製剤の方は6日後に
おいても数100pg/mlの濃度で血中に存在していた。薬効
に関しては11日間白血球を増加させる効果を維持してい
た。
【００３０】（実施例3）凍結乾燥G-CSF徐放製剤の作成
とその薬効および安定性 G-CSF(150μg/ml)1.334ｍl、酢酸亜鉛（0.5M）0.8ｍl、
注射用水12.866ｍlを混ぜ撹拌後、20mg/mlコンドロイチ
ン硫酸1ｍlと50mg/mlヒト血清アルブミンを4ｍl加え撹
拌し、10分間37℃で放置した。約10,000ｘｇで10分間遠
心後、上清をすて、18ｍlの20ｍM酢酸亜鉛で再懸濁し、
１ｇのマンニトールを添加し、撹拌した。撹拌しながら
1.2ｍlずつバイアルに分注し、凍結乾燥した。２週間37
℃においた凍結乾燥製剤を0.5％カルボキシメチルセル
ロースあるいは注射用水1ｍlで懸濁させた溶液300μlを
約25gのマウスに皮下注射した。投与前、および投与後
1、２、3、4、5、7、8、9、10、11日に採血を行い、血
球計算盤にて白血球数を測定した。図3に示すように両
凍結乾燥製剤において10日間薬効が観察された。バイア
ルに凍結乾燥したG-CSFを37℃で1か月保管し、１ｍlのE
DTA（100ｍM）で沈殿を溶かし10μlをマルチゲル2/15
（第１化学）を用いネイティブ電気泳動し、銀染色およ
びウェスターンブロティング後抗G-CSF抗体でG-CSFを検
出することによりG-CSFの変性、分解、凝集などを調べ
た。その結果、製剤のG-CSFの電気泳動における移動度
はまったく変わらず、分解や凝集に由来するようなバン
ドは認められなかった。結果からG-CSF凍結乾燥製剤は
非常に安定であることがわかった。
【００３１】（実施例4）G-CSF徐放製剤投与正常ラット
におけるG-CSFの薬効 32μlの780μg/ml G-CSF（中外製薬）に20μlの0.5M酢
酸亜鉛と25μlの20 mg/mlコンドロイチン硫酸を加えた
後50 mg/mlヒト血清アルブミンを100μlと注射用水323
μlを加え撹拌し37℃で5分間放置した。約10,000ｘｇで
10分間遠心後、上清を捨て、沈殿を500μlの20ｍM酢酸
亜鉛、0.5％カルボキシメチルセルロース含有５％マン
ニトール溶液に懸濁した。この懸濁液200μlを体重約12
0ｇの正常ラット（ウィスター）2匹に皮下注射した。対
照としてG-CSFを含まない沈殿懸濁液（vehicle）を単回
と25μg/ml G-CSF, 10mg/mlヒト血清アルブミン含有5％
マンニトール液200μlを連日5日、体重約120ｇの正常ラ
ット（ウィスター）２匹ずつに皮下注射した。投与前、
および投与後1、２、3、4、6、7、8日に採血を行い、薬
効として8日まで血球計算盤にて白血球数を測定した。
図４に示すように対照の連日投与のものは投与を止める
と白血球数はもとに戻るが、徐放製剤は1回の投与で6日
間白血球を増加させる効果を維持していた。
【００３２】(実施例5)抗TNF抗体の亜鉛イオン、ヒト血
清アルブミンコンドロイチン硫酸混合沈殿からの抗TNF
抗体のin vitroでの溶出 抗TNF抗体（10mg/ml）25μl、塩化亜鉛（0.5M）20μl、
ミリQ水180μlを混ぜ、攪拌し、さらにヒト血清アルブ
ミン（20mg/ml）250μl、コンドロイチン硫酸（20mg/m
l）25μlを加え攪拌し、10分間37℃で静置した。約10,0
00ｘｇ、室温で10分間遠心分離後、上清をすて、500μl
の20ｍM塩化亜鉛含有0.5Mカルボキシメチルセルロース
で再懸濁し徐放製剤とした。またコントロールは10μl
抗TNF(10mg/ml)と180μlヒト血清アルブミン(20mg/ml)
を加えた溶液とした。沈殿からの抗TNF抗体の溶出試験
は24ウェル-セルカルチャーインサートシステム（ファ
ルコン社）を用いておこなった。3μｍのポアサイズの
膜を持つインサートに100μlの試料をいれた後、インサ
ートを900μlの0.3％BSA、PBSの入ったウェルにいれ、
シェーカーで揺らした。1時間毎にインサートを新しい
ウェルに移し変え、インサートの膜を通してウェルに出
してきた抗TNF抗体をELISAで定量し、溶出量を1時間毎
に8時間まで積算した。図５に示すように8時間後の沈殿
からの溶出は10％以下でかなり徐放効果があることが示
された。
【００３３】(実施例6)IL-2の塩化亜鉛による沈殿形成
およびヒト血清アルブミンとコンドロイチン硫酸を含む
沈殿の形成 IL-2（100μg/ml）50μl、塩化亜鉛（0.5M）4μl、ミリ
Q水46μlを混ぜ攪拌し10分間室温に放置した。約10,000
ｘｇで室温10分間遠心分離後、上清を回収、沈殿は100
μlの50ｍM EDTAで溶かした。また、IL-2（100μg/ml）
50μl、塩化亜鉛（0.5M）4μlを混ぜ攪拌後、コンドロ
イチン硫酸（20mg/ml）5μl、ヒト血清アルブミン（50m
g/ml）20μl、ミリQ水21μlを混ぜ再度攪拌し10分間放
置した。約10,000ｘｇで10分間遠心後、上清を回収、沈
殿は100μlの50ｍMEDTAで溶かした。これらの上清及び
沈殿を溶かした液10μlを10μlの電気泳動サンプル処理
液と混ぜ、マルチゲル10/20（第１化学）を用いSDS電気
泳動をおこなった。クマシーブリリアントブルー染色を
行ない、IL-2を検出した。結果は、どちらの条件におい
てもIL-2は沈殿の方に検出され、上清の方には検出され
なかった。このことはIL-2もG-CSF同様の方法で徐放製
剤化が可能であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例７の製剤からG-CSFの溶出をin vitroの実
験でG-CSFの溶液と比べて示した図である。
【図2】実施例８の製剤をマウスに筋肉内注射後G-CSFの
血中濃度の推移とマウスの白血球数の変化を示す図であ
る。
【図3】実施例9の凍結乾燥製剤をマウスに皮下投与した
時、G-CSFの徐放により薬効が維持されていることを示
す図である。
【図4】実施例10の製剤をラットの皮下に注射し、対照
としてG-CSF溶液の連日投与との薬効の比較を示す図で
ある。
【図5】実施例７の製剤から抗TNF抗体の溶出をin vitro
の実験で抗TNF抗体の溶液と比べて示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/42 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １０７ 43/00 １０７ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 松石 哲郎 埼玉県所沢市小手指町１−25−１ヴィルセ ゾン小手指506 Ｆターム(参考） 4C076 AA22 AA29 BB15 BB16 CC27 DD21P EE30A EE41A FF31 FF35 GG06 GG47 4C084 AA02 AA03 BA44 DA14 DA19 MA01 MA05 MA23 MA44 MA66 NA12 ZB222 ZB262

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 亜鉛イオンと沈殿を形成する薬効を有す
    る蛋白質あるいはペプチド、亜鉛イオンと沈殿を形成す
    る主たる薬効をもたない蛋白質、亜鉛イオン、及び酸性
    ムコ多糖体とからなる水不溶性徐放性組成物。
  2. 【請求項２】 前記薬効を有する蛋白質あるいはペプチ
    ドがG-CSF、IL-2、エタナセプトあるいは抗体であるこ
    とを特徴とする請求項１記載の水不溶性徐放性組成物。
  3. 【請求項３】 薬効を有する蛋白質あるいはペプチドの
    水不溶性徐放性組成物中の含量が少なくとも0.01重量％
    であることを特徴とする請求項1記載の水不溶性徐放性
    組成物。
  4. 【請求項４】 前記主たる薬効を持たない蛋白質がヒト
    血清アルブミンあるいはγ-グロブリンであることを特
    徴とする請求項１記載の水不溶性徐放性組成物。
  5. 【請求項５】 前記主たる薬効を持たない蛋白質の水不
    溶性徐放性組成物中の含量が少なくとも1重量％である
    ことを特徴とする請求項１記載の水不溶性徐放性組成
    物。
  6. 【請求項6】 前記亜鉛イオンの水不溶性徐放性組成物
    中の含量が少なくとも1重量％であることを特徴とする
    請求項１記載の水不溶性徐放性組成物。
  7. 【請求項7】 前記酸性ムコ多糖体がコンドロイチン硫
    酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタ
    ン硫酸あるいはケラタン硫酸及びそれらの塩の少なくと
    もひとつであることを特徴とする請求項１記載の水不溶
    性徐放性組成物。
  8. 【請求項8】 前記酸性ムコ多糖体の水不溶性徐放性組
    成物中の含量が主たる薬効をもたない蛋白質含量の１/1
    00以上あることを特徴とする請求項１記載の水不溶性徐
    放性組成物。
  9. 【請求項9】 請求項１記載の水不溶性徐放性組成物が
    凍結乾燥されたものであることを特徴とする水不溶性徐
    放性組成物。
  10. 【請求項10】 前記水不溶性徐放性組成物が皮下注射、
    皮内注射、及び筋肉内注射に適した形態であることを特
    徴とする請求項１から請求項9のいずれかに記載の水不
    溶性徐放性組成物。
  11. 【請求項11】 請求項１記載の組成物に、必要に応じて
    製剤学的に受容可能な添加物を加えたことからなること
    を特徴とする水不溶性徐放性製剤。
  12. 【請求項12】 前記製剤学的に受容可能な添加物が乳酸
    グリコール酸重合体、乳酸重合体、界面活性剤、防腐
    剤、又は安定化剤であることを特徴とする請求項11記載
    の製剤。
  13. 【請求項13】 請求項11記載の製剤が凍結乾燥されたも
    のであることを特徴とする製剤。
  14. 【請求項14】 前記製剤が皮下注射、皮内注射、及び筋
    肉内注射に適した形態であることを特徴とする請求項11
    から請求項13のいずれかに記載の製剤。
  15. 【請求項15】 亜鉛イオンと沈殿を形成する薬効を有す
    る蛋白質あるいはペプチドの溶液、亜鉛イオンと沈殿を
    形成する主たる薬効をもたない蛋白質の溶液、亜鉛塩の
    溶液、酸性ムコ多糖体の溶液を混合して作製される水不
    溶性徐放性組成物の製造方法。
  16. 【請求項16】 （１）亜鉛イオンと沈殿を形成する薬効
    を有する蛋白質あるいはペプチドの溶液と亜鉛塩の溶液
    を混合し沈殿作成し、次いで（２）亜鉛イオンと沈殿を
    形成する主たる薬効をもたない蛋白質の溶液と酸性ムコ
    多糖体の溶液を混合することを特徴とする請求項１記載
    の水不溶性徐放性組成物の製造方法。
  17. 【請求項17】 請求項15又は請求項16記載の製造方法に
    よる水不溶性徐放性組成物を遠心分離により沈殿とし、
    その沈殿を亜鉛塩溶液で再懸濁することを特徴とする請
    求項１記載の水不溶性徐放性組成物の製造方法
  18. 【請求項18】 請求項17の遠心分離を少なくとも1,000
    x g で行うことを特徴とする請求項１記載の水不溶性徐
    放性組成物の製造方法。
  19. 【請求項19】 前記亜鉛イオンと沈殿を形成する薬効を
    有する蛋白質あるいはペプチドの溶液、亜鉛イオンと沈
    殿を形成する主たる薬効をもたない蛋白質の溶液、亜鉛
    塩の溶液、酸性ムコ多糖体の溶液の混合をｐH4.5〜8.5
    の条件で行うことを特徴とする請求項１記載の水不溶性
    徐放性組成物の製造方法。
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