PT975333E

PT975333E - Géis de alginato de libertação sustentada.

Info

Publication number: PT975333E
Application number: PT98915592T
Authority: PT
Inventors: Merrill Seymour Goldenberg; Alice C Beekman
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1997-04-17
Filing date: 1998-04-14
Publication date: 2007-05-31
Also published as: JP2001524084A; DE69837140D1; AU6973498A; CA2286092A1; ES2283052T3; DE69837140T2; EP0975333A1; WO1998046211A1; US20020001619A1; DK0975333T3; TW577755B; ZA983089B; CA2286092C; US6656508B2; EP0975333B1; ATE354351T1

Description

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DESCRIÇÃO "GEIS DE ALGINATO DE LIBERTAÇÃO SUSTENTADA"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a formulações de libertação sustentada que usam gotas de gel de alginato e os seus métodos.

ANTECEDENTES

Com os avanços nas tecnologias de engenharia celular e genética, a disponibilidade de proteínas recombinantes engendrou avanços na utilização de proteínas como medicamentos para aplicações terapêuticas. Muitas doenças ou as condições tratadas com proteínas farmacêuticas necessitam níveis de proteínas sustentados para se conseguir o resultado terapêutico mais eficaz. No entanto, como com a maior parte de farmacêuticos de proteínas, a meia vida biológica geralmente curta necessita de administração frequente. Estas injecções repetidas são dadas a vários intervalos que resultam em níveis de medicação flutuantes a uma sobrecarga física e monetária significativa nos pacientes. Uma vez que muitas condições respondem melhor a níveis controlados de um farmacêutico, existe uma necessidade para a libertação controlada de um medicamento para fornecer períodos mais longos de libertação consistente. Tais medicamentos de libertação sustentada forneceriam o paciente não só com efeitos diagnóstico de profilático ou terapêutico, profilático, mas também com uma redução na frequência das injecções bem como nos 2 custos totais.

As tentativas correntes para suster níveis de medicação em seres humanos ou animais entre doses incluíram a utilização de polímeros biodegradáveis como matrizes para controlar a libertação de medicamento. Por exemplo, a Patente da Grã-Bretanha No. 1 388 580 divulga a utilização de hidrogéis para a libertação sustentada da insulina. A Patente norte americana No. 4 789 550 divulga a utilização de microcápsulas de alginato revestidas com polilisina para a libertação da proteína por se encapsularem células vivas. As tentativas de libertação sustentada também utilizaram composições de polímero anióníco ou catiónico rodeadas por polímeros iónicos da carga oposta para a encapsulação de células capazes da produção de composições biologicamente activas. Patente norte americana No. 4 744 933. De mesmo modo, múltiplos revestimentos de polímeros de ligação transversal aniónicos ou catiónicos também foram divulgados como meios para se obter a libertação prolongada. Patentes norte americanas Nos. 4 690 682 e 4 789 516. Além do mais, as tentativas adicionais divulgam a utilização de alginatos sozinhos, ou de alginatos revestidos com outros polímeros biodegradáveis, para a libertação controlada de composições de polipéptido ou dos seus precipitados de catião. PCT WO 96/00081, PCT WO 95/29664 e PCT WO 96/03116.

Estas tentativas, no entanto, forneceram meios insuficientes para se obter a distribuição da libertação sustentada de farmacêuticos de proteína desejados. É geralmente conhecido que a utilização de certos polímeros biodegradáveis, por exemplo, co-glycólido de poliláctido, sob condições in vivo, apresentam elevadas explosões iniciais de libertação de medicamento. Johnson, O. et al., Nature Med., 2/7: 795 (1996). Além disso, é geralmente conhecido que as 3 proteínas usadas com formas correntes de preparações de libertação sustentada podem sofrer de desnaturação e perder a sua bíoactividade em exposição aos agentes de encapsulação. Tais preparações usam solventes orgânicos que podem ter efeitos deletérios na proteína de escolha. Finalmente, como discutido a seguir, a utilização de alginato sozinho não forneceu a libertação de proteína controlada desejada necessária para resultados terapêuticos eficazes.

Em geral, os alginatos são polissacáridos bem conhecidos, que ocorrem naturalmente, aniónicos, compreendidos de ácido 1,4-ligado-β-D-manurónico e de ácido α-L-gulurónico. Smidsrod, 0. et al., Trends in Biotechnology, 8: 71-78 (1990); Aslani, P. et al., J. Micsroencapsulation, 13/5: 601-614 (1996). Os alginatos variam tipicamente de 70 % de ácido manurónico e 30 % de ácido gulurónico, a 30 % de ácido manurónico e 70 % de ácido gulurónico. Smidsrod, supra. 0 ácido algónico é insolúvel em água ao passo que os sais formados com iões monovalentes como sódio, potássio e o amónio são solúveis em água. McDowell, R.H., "Properties of Alginates" (London, Alginate Industries Ltd, 4a edição 1977). Os catiões polivalentes são conhecidos como reagindo com os alginatos e como formando espontaneamente géis.

Os alginatos têm uma larga variedade de aplicações tais como aditivos de alimentos, adesivos, pastilhas farmacêuticas e compressas para feridas. Os alginatos também têm sido recomendados para as técnicas de separação de proteínas. Por exemplo, Gray, C. J. et al., em Biotechnology and Bioengineering, 31: 607-612 (1988) capturaram insulina em géis de alginato de zinco/cálcio para a separação de insulina de outras proteínas de soro. 4

As matrizes de alginato também têm sido bem documentadas para os sistemas de libertação de fármacos, ver por exemplo a Patente norte americana No. 4 695 4 63 que divulga um sistema de libertação em chicletes baseado em alginato e preparações farmacêuticas. As gotas de alginato foram usadas para a libertação controlada de várias proteínas tais como: o receptor de factor de necrose de tumor em gotas de catião-alginato revestidas com policatiões, Wee, S.F, Proceed. Intern Symp. Control. Rei. Bioact. Mater., 21: 730-31 (1994); a transformação do factor de crescimento encapsulado em gotas de alginato, Puolakkainen, P.A. et al., Gastroenterology, 107: 1319-1326 (1994); os factores angiogénicos capturados em gotas de cálcio-alginato, Downs, E. C. et al., J. of Cellular Physiology, 152: 422-429 (1992); albumina capturada colaço em microcápsulas de chitosano-alginato, Polk, A. et al., J. Pharmaceutical Sciences, 83/2: 178-185 (1994), ou gotas de alginato de chitosano-cálcio revestidas com polímeros, Okhamafe, A. O. et al., J. Microencapsulation, 13/5: 497-508 (1996); hemoglobulina encapsulada com gotas de alginato de chitosano-cálcio, Huguet, M. L. et al., J. Applied Polymer Science, 51: 1427-1432 (1994), Huguet, M. L. et al., Process Biochemistry, Jl: 745-751 (1996); e interleucina-2 encapsulada em microesferas de alginato-chitosano, Liu, L. S. et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater, 22: 542-543 (1995).

Os sistemas que usam gotas de gel de alginato, ou gotas de gel de alginato/cálcio, para capturar proteínas sofrem por falta de qualquer efeito de libertação sustentada devido à libertação rápida da proteína a partir das gotas de alginato. Liu, L. et al., J. Control. Rei., 43): 65-74 (1997). Para evitar uma tal libertação rápida, vários dos sistemas acima tentam usar revestimentos de polímero de policatião (por exemplo, polilisina, chitosano) para 5 retardar a libertação das gotas de alginato de proteína. Ver, por exemplo, Wheatley, Μ. A. et al., J. Applied Polymer Science, 43: 2123-2135 (1991); Wee, S.F. et al. supra; Liu, L.S. et al. supra; Wee, S. F. et al., Controlled Release Society, Ζ2: 566-567 (1995) e Lim, et al. supra.

Os policatiões, tais como a polilisina, são polielectrólitos positivamente carregados que interagem com as moléculas de alginato negativamente carregadas para formarem uns complexos de polielectrólito que atuam como barreiras de difusão na superfície da gota. Podem ocorrer problemas com a utilização de policatiões em que: (1) tais formulações podem ser citotóxicas devido aos policatiões (Huguet, M. L. et al., supra; Zimmermann, Ulrich, Electrophoresis, _13: 269 (1992); Bergmann, P. et al., Clincial Science, 6]_\ 35 (1984)); (2) os policatiões são propensos à oxidação; (3) as gotas com revestimentos de policatiões tendem a não ser passíveis de erosão e acumulados no corpo(4) tais formulações são feitas através de procedimentos de revestimento laboriosos que incluem múltiplos revestimentos da polilisina de policatião (Padol, et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater, 2: 216 (1986) e (5) as interacções iónicas entre a proteína e os policatiões podem resultar na perda da actividade de proteína ou causar a instabilidade de proteína.

Por consequência, existe uma necessidade para desenvolver formulações farmacêuticas as quais alcançam um melhor meio de libertação sustentada para aplicações clínicas. Numerosas proteínas recombinantes ou naturais podem beneficiar da libertação constante a longo prazo e por esse meio fornecerem resultados clínicos mais eficazes. 6 A presente invenção fornece tais avanços. As composições farmacêuticas da presente invenção são capazes de fornecer a protecção da proteína, diminuindo a degradação e a libertação lenta com estabilidade e potência da proteína aumentada. Também, as composições farmacêuticas da presente invenção fornecem um meio simples, rápido e não dispendioso da libertação da proteína recombinante controlada para resultados de diagnóstico, profiláticos ou terapêuticos eficazes. Os documentos WO-A-9008551 e WO-A-9011757 referem-se a dispositivos de libertação sustentada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a formulações de libertação sustentada que usam gotas ou partículas de gel de alginato, e aos seus métodos. Em particular, a formação dos géis de libertação sustentada inclui a co-precípitação de gotas de gel de alginato com um agente biologicamente activo. Esta abordagem fornece uma vantagem de produzir o carregamento eficiente e elevado do agente biologicamente activo dentro do gel de alginato para a distribuição da libertação sustentada enquanto se consegue a protecção da proteína, a diminuição da degradação, o aumentou da estabilidade e da potência do agente a ser libertado.

Por consequência, um aspecto da presente invenção fornece uma composição de libertação sustentada, que compreende um polímero hidrofílico; um agente biologicamente activo; e pelo menos um agente de precipitação. Durante a formulação da composição o agente biologicamente activo é co-precipitado com o polímero hidrofílico. Além do mais, os agentes de precipitação adicionais também podem ser adicionados à composição. Tal como aqui utilizado, o termo co-precipitação refere-se à utilização de agente(s) para a 7 precipitação do agente biologicamente activo em conjunto com o polímero hidrofílico para assim formar uma matriz do polímero e do agente precipitado, por exemplo, a formação de gotas de gel de alginato seria através de precipitação. Tal precipitação pode ser simultânea ou nessa proximidade. A precipitação de moléculas e quaisquer agentes de precipitação relacionados são bem conhecidos dos especialistas na técnica.

Outro aspecto provê métodos para produzir as composições de libertação sustentada da presente invenção, compreende os passos de se dissolver um agente biologicamente activo e um polímero hidrofílico com um solvente para formar uma primeira mistura; a dissolução pelo menos de um agente de precipitação num solvente para formar uma segunda mistura; a adição do agente biologicamente activo e a solução de polímero hidrofílico da primeira mistura com o agente de precipitação e o solvente da segunda mistura; e a co-precípitação do agente biologicamente activo dentro do polímero hidrofílico. Os métodos presentes também podem incluir a utilização de agentes de precipitação adicionais. Além do mais, um passo para isolar a composição de libertação sustentada também é contemplado.

Tal como aqui utilizado, o termo solvente refere-se a solventes de base aquosos capazes de dispersar ou dissolver os agentes biologicamente activos, os polímeros hidrofílicos ou os agentes de precipitação de escolha. Tais solventes são bem conhecidos de um especialista na técnica. A adição da primeira mistura com a segunda mistura para formar a composição de co-precipitação pode ser feita por métodos bem conhecidos de um especialista na técnica, incluindo mas não limitado à adição de gotículas, dispersão, pulverização ou mistura por se utilizarem jactos de pulverização, jactos de ar, atomízação, e campos eléctricos. 0 termo dispersão para os objectivos desta invenção pode significar umas dispersões liquidas, sólidas ou gasosas. Tal como aqui utilizado, o termo isolamento, refere-se ao processo para o isolamento da composição de libertação sustentada da presente invenção. Tais procedimentos de isolamento e de purificação são bem conhecidos na técnica.

Ainda num outro aspecto, a presente invenção provê uma composição de libertação sustentada produzida pelos métodos acima mencionados. Os aspectos adicionais incluem formulações farmacêuticas das composições acima mencionadas num portador ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

Ainda em outros aspectos, a presente invenção provê métodos para tratar indicações com composições de libertação sustentada que contêm agentes biologicamente activos desejados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Composições

Os alginatos e os seus derivados, podem ser obtidos a partir de várias fontes comerciais, naturais ou sintéticas bem conhecidas na técnica.

De mesmo modo, os agentes de precipitação podem ser obtidos a partir de várias fontes comerciais, naturais ou sintéticas que são bem conhecidas na técnica. Os agentes de precipitação incluem mas não são limitados a iões de metal polivalentes, sais, acetatos, citratos, cloretos, carbonatos, hidróxidos, oxalatos, tartaratos ou os seus hidróxidos, ácidos ou polímeros solúveis em água. Em particular, os iões de metal podem incluir mas não são limitados a 9 alumínio, bário, cálcio, ferro, magnésio de manganês, estrôncio e zinco. De um modo preferido os iões de metal são cálcio e zinco cu os seus sais, como acetato de zinco, acetato de cálcio ou sais de cloreto. As pequenas moléculas solúveis em água e os sais também podem ser usados como sulfato de amónio, acetona, etanol e glicerol.

Outros tamanhos e tipos de agentes de precipitação, podem ser usados, dependendo do perfil terapêutico desejado (por exemplo, a duração da libertação sustentada desejada, os efeitos, se algum na actividade biológica, a facilidade de manuseamento, o grau ou a falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos de um agente de precipitação desejado para uma proteína terapêutica ou análogo) . Um especialista na técnica apreciará outros agentes de precipitação que estão dentro do âmbito da invenção.

Como aqui utilizado, o temo tampão ou solução de tampão refere-se à utilização de ácidos inorgânicos ou orgânicos ou a uma sua combinação para preparar uma solução de tampão como conhecido na técnica. Os ácidos inorgânicos dentro do âmbito da presente invenção incluem o haleto de hidrogénio (por exemplo, ácido clorídrico), fosfórico, nítrico ou sulfúrico. Outros ácidos inorgânicos seriam berti conhecidos de um especialista na técnica e são aqui contemplados. Os ácidos orgânicos dentro do âmbito da invenção incluem ácidos carboxílicos alifáticos e ácidos aromáticos tais como ácido fórmico, carbónico, acético, propiónico, butírico, valérico, capróico, acrílico, malónico, succínico, glutárico, adípico, maleico, fumárico, sulfónico de fenol ou de glicina. Outros ácidos orgânicos seriam bem conhecidos de um especialista na técnica. 0 tampão preferido da presente invenção inclui glicina e os sistemas de tampão de ácido fosfórico de glicina. Como aqui 10 utilizado, os agentes biologicamente activos referem-se a proteínas recombinantes ou que ocorrem naturalmente, se humanas ou animais, úteis para a aplicação profilática, terapêutica ou de diagnóstico. 0 agente biologicamente activo pode ser natural, sintético, semi-sintético ou os seus derivados. Os agentes biologicamente activos da presente invenção devem ser precipitáveis. Uma larga variedade de agentes biologicamente activos são contemplados. Estes incluem mas não são limitados a hormonas, citoquinas, factores hematopoiéticos, factores de crescimento, factores de anti-obesidade, factores troficos, factores anti-inflamatórios, e enzimas (ver também a patente norte americana no. 4 695 463 para os exemplos adicionais de agentes biologicamente activos úteis). Um especialista na técnica será rapidamente capaz de adaptar um agente biologicamente activo desejado às composições da presente invenção.

Tais proteínas incluiriam mas não são limitadas a interferões (ver, as Patentes norte americanas Nos. 5 372 808, 5 541 293 4 897 471, e 4 695 623), as interleucinas (ver, a Patente norte americana No. 5 075 222), as eritropoietinas (ver, as Patentes norte americanas Nos. 4 703 008, 5 441 868, 5 618 698 5 547 933, e 5 621 080 incorporadas por meio disto por referência incluindo os desenhos), os factores de estimulação de colónia de granulócitos (ver, as Patentes norte americanas Nos. 4 810 643, 4 999 291, 5 581 476, 5 582 823, e a Publicação PCT No. 94/17185), o factor de célula estaminal (Publicações PCT Nos. 91/05795, 92/17505 e 95/17206), e a proteína de OB (ver as publicações PCT Nos. 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 e 97/06816). Além do mais os agentes biologicamente activos também podem incluir mas não são limitados a produtos relacionados com a anti-obesidade, insulina, gastrina, prolactina, a hormona adrenocorticotrópica (ACTH), a hormona que estimula a tiróide (TSH), a hormona luteinizante (LH) , a hormona 11 que estimula o folículo (FSH), gonadotrofína corióníca humana (HCG), motílina, interferõess (alfa, beta, gama), interleucinas (IL—1 a IL-12) o factor da necrose de tumor (TNF) , o factor da necrose de tumor-proteína de ligação (TNF-bp), o factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), o factor neurotrófico derivado glial (GDNF), o factor neurotrófico 3 (NT3), os factores de crescimento dos fibroblastos (FGF), o factor de crescimento neurotrófico (NGF), os factores de crescimento dos ossos tais como a osteoprotegerina (OPG), os factores de crescimento como a insulina (IGFs), o factor de estimulação da colónia de macrófago (M-CSF), o factor de estimulação da colónia de granulócito (GM-CSF), o factor de crescimento derivado do megaqueratinócito (MGDF), a trombopoietina, o factor de crescimento derivado de plaquetas (PGDF), os factores de crescimento que simulam a colónia (CSFs), a proteína morfogenética dos ossos (BMP), a dismutase de superóxido (SOD), activador plasminogénio de tecido (TPA), uroquinase, estreptoquíinase e calicreína. O termo proteínas, como aqui utilizado, inclui péptidos, polipéptidos, moléculas de consenso, análogos, derivados ou as suas combinações.

Os derivados de agentes biologicamente activos podem incluir a ligação de uma ou mais fracções químicas à fracção de proteína. A modificação química de agentes biologicamente activos tem sido verificada como fornecendo vantagens adicionais sob certas circunstâncias, tal como o aumento da estabilidade e tempo de circulação da proteína terapêutica e a diminuição da imunogenicidade. Um especialista na técnica será capaz de seleccionar a modificação química desejada baseada na dosagem desejada, no tempo de circulação, na resistência à proteólise, utilizações terapêuticas e outras considerações. 12

Complexos

As proteínas, análogo ou derivado podem ser administrados complexados a uma composição de ligação. Tal composição de ligação pode ter o efeito de prolongar o tempo de circulação da proteína, análogo ou derivado ou aumentar a actividade do agente biologicamente activo. Tal composição pode ser uma proteína (ou sinonimamente, péptido), derivado, análogo ou combinação. Por exemplo, uma proteína de ligação para a proteína de OB é um receptor de proteína de OB ou uma sua porção, tal como uma sua porção solúvel. Outras proteínas de ligação podem ser determinadas por se examinar proteína de OB, ou a proteína de escolha, em soro, ou ser empiricamente examinada para a presença de ligação. Tal ligação tipicamente não interferirá com a capacidade da proteína de OB ou análogo ou derivado de se ligarem a um receptor de proteína de OB endógeno e/ou de transdução do sinal de efeito. Além da proteína de OB, a ligação de complexos também será aplicável a outras proteínas terapêuticas da presente invenção da mesma maneira. Os bem especializados na técnica serão capazes de determinar as proteínas de ligação apropriadas para a utilização com a presente invenção.

Composições Farmacêuticas

As composições farmacêuticas de libertação sustentada da presente invenção podem ser administradas através de preparações orais (por exemplo, cápsulas tais como cápsulas duras e cápsulas macias, preparações sólidas tais como grânulos, comprimidos, pílulas, pastilhas ou losangos, cápsulas, bolinhas, formas de pó e liofizadas, preparações líquidas tais como suspensões) e não orais (por exemplo preparações intramusculares, subcutâneas, 13 transdermais, viscerais, IV (intravenosa), IP (intraperitoneal), intra-arteriais, intratecais, intracapsulares, intraorbitais, injectáveis, pulmonares, nasais, rectais, e uterino-transmucosais). Em geral, compreendido pela invenção são as composições farmacêuticas de libertação sustentada que compreendem quantidades eficientes de proteína, ou produtos derivados, com as composições de libertação sustentada da invenção em conjunto com diluentes farmaceuticamente aceitáveis, conservantes, solubilizantes, emulsificantes, adjuvantes e/ou portadores necessários para administração. Ver o documento PCT 97/01331. A formulação farmacêutica ideal para um agente activo biologicamente desejado será determinada por um especialista na técnica dependendo da via de administração e dosagem desejadas. As composições farmacêuticas exemplares são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., 18a edição, Easton, PA, páginas 1435-1712 (1990)).

Os componentes que podem ser necessários para administração incluem diluentes de vários conteúdos de tampão (por exemplo, Tris-HCL, acetato), pH e força íónica; aditivos tais como agentes tensioactivos e agentes de solubilízação (por exemplo, Tween 80, HCO-60, Polisorbato 80) , anti-oxidants (por exemplo, ácido ascórbico, glutationa, metabissulfito de sódio), polisacáridos adicionais (por exemplo, carboximetilcelulose, alginato de sódio, hialuronato de sódio, sulfato de protamina, polietileno glicol), conservantes (por exemplo, timersol, álcool de benzilo, parabeno de metilo, parabeno de propilo) e substâncias de construção (por exemplo, lactose, manitol); a incorporação do material em preparações particuladas de compostos poliméricos tais como polímeros de ácido poliláctico/poliglicólico ou copolímeros, etc. ou combinados com liposomas. 0 ácido hilaurónico também pode ser 14 usado como um componente de administração e isto pode ter o efeito de promover mesmo adicionalmente a duração sustentada na circulação. Adicionalmente, as composições de libertação sustentada da presente invenção também podem ser dispersas com óleos (por exemplo, óleo de sésamo, óleo de milho, vegetais), ou uma sua mistura com um fosfolipido (por exemplo, lecitina), ou triglicéridos de ácido gordo de meia cadeia (por exemplo, Migliol 812) para fornecer uma suspensão oleosa. As composições da presente invenção também podem ser dispersas com agentes de dispersão tais como polissacáridos solúveis em água (por exemplo, manitol, lactose, glicose, amidos), ácido hialurónico, glicina, fibrina, colagénio e sais inorgânicos (por exemplo, cloreto de sódio).

Além do mais, também contemplado para uso na administração das composições de libertação sustentada da presente invenção são dispositivos mecânicos designados para libertação pulmonar de produtos terapêuticos, incluindo mas não limitados a nebulizadores, inaladores de dose medida, e inaladores de pó, todos os quais são familiares aos especialistas na técnica.

Os componentes de administração podem influenciar o estado físico, a estabilidade, o índice de libertação in vivo, e o índice de tolerância in vivo das proteínas presentes e derivados. Um especialista na técnica apreciará os componentes de administração apropriados e/ou os dispositivos mecânicos apropriados a usar dependendo da utilização terapêutica, da via de administração, da dosagem desejada, do tempo de circulação, da resistência à proteólise, da estabilidade da proteína e de outras considerações. Métodos de Utilização 15

Terapêutica

As utilizações terapêuticas dependem do agente biologicamente activo usado. Um especialista na técnica rapidamente será capaz de adaptar um agente biologicamente activo desejado à presente invenção para as suas utilizações terapêuticas pretendidas. As utilizações terapêuticas para tais agentes são delineadas em grande detalhe nas publicações seguintes aqui incorporadas por meio de referência incluindo os desenhos. As utilizações terapêuticas incluem mas não são limitadas a utilizações para proteínas como os interferões (ver, as patentes norte americanas Nos. 5 372808, 5 541 293 4 897 47, e 4 695 623), e as interleucinas (ver, a patente norte americana Nos. 5 075 222), as eritropoietinas (ver, as patentes norte americanas Nos. 4 703 008, 5 441 868, 5 618 698 5 547 933, e 5 621 080), os factores de estimulação de colónias de granulócitos (ver, as patentes norte americanas Nos. 4 999 291, 5 581 476, 5 582 823, 4 810 643 e o pedido de patente PCT No. 94/17185), o factor de célula estaminal (pedidos de patentes PCT Nos. 91/05795, 92/17505 e 95/17206), e a proteína de OB (ver por meio disto os pedidos de patentes PCT 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 e 97/06816).

Além do mais, as utilizações terapêuticas da presente invenção incluem as utilizações de agentes biologicamente activos incluindo mas não limitados aos produtos relacionados com a anti-obesidade, insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona que estimula a tiróide (TSH), hormona de luteinização (LH), que estimula o folículo (FSH), gonadotrofina coriónica humana (HCG), motilina, interferõess (alfa, beta, gama), interleucinas (IL-1 a IL-12), factor de necrose de tumor (TNF), proteína de ligaççâo do factor de necrose de tumor (TNF-bp), factor 16 neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), factor neurotrófico derivado do glial (GDNF), factor de neurotrófico 3 (NT3), factores de crescimento do fibroblasto (FGF), factor de crescimento neurotrófico (NGF), factores de crescimento dos ossos tal como osteoprotegerina (OPG), factores de crescimento como a insulina (IGFs), factor que estimula a colónia de macrófagos (M CSF), factor que estimula a colónia de granulócitos (GM-CSF), factor de crescimento derivado de megaqueratinócitos (MGDF), trombopoietina, factor de crescimento derivado das plaquetas (PGDF), factores de crescimento que simulam as colónias (CSFs), proteína morfogenética dos ossos (BMP), dismutase de superóxido (SOD), activador plasminogénio de tecido (TPA), uroquinase, estreptoquinase e calicreína. 0 termo proteínas, tal como aqui usado, inclui péptidos, polipéptidos, moléculas de consenso, análogos, derivados ou as suas combinações. Além do mais, as presentes composições também podem ser usadas para a fabricação de um ou mais medicamentos para o tratamento ou melhoramento das condições do agente biologicamente activo que é pretendido tratar.

Por meio de exemplo, a oxigenação das utilizações terapêuticas no sangue e uma diminuição na reabsorção do osso ou a osteoporose também podem ser alcançadas na ausência de perda de peso.

Terapias de combinação. As composições e métodos presentes podem ser utilizados em conjunto com outras terapias, tais como a dieta alterada e o exercício. Outros medicamentos, tais como os úteis para o tratamento de diabetes (por exemplo, insulina, e talvez amilina), os medicamentos que baixam o colesterol e a pressão sanguínea (tais como os que reduzem os níveis de lípidos no sangue ou outros medicamentos cardiovasculares), os medicamentos que aumentam a actividade (por exemplo, anfetaminas), diuréticos (para 17 a eliminação de líquidos), e os inibidores do apetite. Tal administração pode ser simultânea ou pode ser em série. Além do mais, os presentes métodos podem ser usados em conjunto com procedimentos cirúrgicos, tais como as cirurgias plásticas designadas para alterar a aparência total de um corpo (por exemplo, a lipoaspiração ou as cirurgias a laser designadas para reduzir a massa do corpo, ou as cirurgias de implante designadas para aumentar a aparência da massa do corpo). Os benefícios de saúde das cirurgias cardíacas, tais como cirurgias de bypass ou outras cirurgias designadas para aliviar uma condição deletéria causada pelo bloqueio dos vasos sanguíneos por depósitos gordos, tais como as placas arteriais, podem ser aumentados com a utilização concomitante das composições e métodos presentes. Os métodos para eliminar os cálculos is como os métodos ultrasónicos ou a laser, também podem ser usados quer antes de, durante ou depois de um curso dos métodos terapêuticos presentes. Além do mais, os métodos presentes podem ser usados como um adjunto para as cirurgias ou para as terapias para ossos quebrados, músculos danificados, ou outras terapias as quais seriam melhoradas por um aumento em massa de tecido magro.

Dosagens

Um especialista na técnica será capaz de determinar dosagens eficientes por através de administração e observar o efeito terapêutico desejado. A dosagem da preparação de libertação sustentada é a quantidade necessária para se conseguir a concentração eficaz do agente biologicamente activo in vivo, durante um dado período de tempo. A dosagem e a frequência de administração preferida das preparações de libertação sustentada varia com o tipo do agente biologicamente activo, da duração 18 desejada da libertação, da doença alvo, da frequência de administração desejada, da espécie animal sujeita e de outra factores. De um modo preferido, a formulação da molécula será tal que entre cerca de 0,10 pg/kg/dia e 100 mg/kg/dia vai render o efeito terapêutico desejado.

As dosagens eficazes podem ser determinadas por se utilizarem ferramentas de diagnóstico ao longo do tempo. Por meio de exemplo, a presente invenção fornece as dosagens de proteína de OB. Por exemplo, um diagnóstico para a medição da quantidade de proteína de OB no sangue (ou plasma ou soro) pode primeiramente ser usado para determinar os níveis endógenos de proteína de OB. Tal ferramenta de diagnóstico pode estar na forma de um ensaio de anticorpo, tal como um ensaio de sanduíche de anticorpo. A quantidade de proteína de OB endógena é quantificada inicialmente, e uma linha de base é determinada. As dosagens terapêuticas são determinadas como a quantificação de proteína de OB endógena e exógena (isto é, proteína, análogo ou derivado encontrado dentro do corpo, quer auto-produzido ou administrado) é continuada ao longo do curso da terapia. Por exemplo, uma dosagem relativamente elevada pode ser necessária inicialmente, até os benefícios terapêuticos serem vistos, e depois doses mais baixas usadas para manter os benefícios terapêuticos. Métodos de Preparação

Preparação de Gota de Proteína/Alqinato. Um procedimento típico é ilustrado pelo exemplo seguinte que usa a proteína de OB ou a leptina como a proteína da escolha. Um especialista na técnica entenderá e será capaz de aplicar estes procedimentos a outros agentes biologicamente activos. 19

Preparação da Mistura de Gota. 0 termo "mistura de gota" como aqui usado refere-se à mistura que contém o polímero hidrofílico e o agente biologicamente activo. Um mL de mistura de 5 % de alginato (10 mM de TRIS; pH 8) é adicionado com agitação magnética a 4 mL de Leptina (100 mg/mL; 10 mM de TRIS; pH 8) num copo grande de 10 mL (num banho de gelo). A mistura fica turva. Depois 40 mcL de 4 mM de NaOH é adicionado à mistura e a agitação é continuada durante 15 minutos (em gelo) . A mistura clarifica-se e o seu pH final está entre aproximadamente 8,6 a 8,8. A concentração de alginato deve ser pelo menos de 0,05 % em peso. Além do mais, o alginato deve ser de um modo preferido pelo menos de 30 % de ácido gulurónico.

Além do acima mencionado, o polietileno glicol pode ser adicionado à mistura de gota como debatido a seguir. Do mesmo modo, os tampões ou excipientes são úteis com a estabilidade da proteína de escolha. Um especialista na técnica será bem consciente dos ingredientes apropriados que devem ser adicionados para a finalidade de estabilidade dependendo da proteína escolhida para a libertação.

Preparação da Mistura de Banho. O termo "mistura de banho" como aqui usado refere-se à mistura que contém o agente(s) de precipitação usados para a co-precipitação do agente biologicamente activo e do polímero hidrofílico. O banho contém tipicamente 10 mL de mistura num copo grande de 50 mL que consiste de 100 mM de CaCl2 mais outros ingredientes (veja abaixo). O pH é de um modo preferido acídico para ajudar a reduzir o efeito de explosão. O pH deve ser de um modo preferido menor do que pH 4. O tampão no banho também vai depender da proteína usada. Um especialista na técnica será capaz de ajustar a capacidade do tampão ou a força baseada na proteína usada. Assim dependendo da estabilidade da proteína, se a concentração de tampão for demasiado alta, por exemplo com G-CSF, a 20 proteína pode parecer ser menos estável e vai diminuir a libertação sustentada. 0 banho pode ser compreendido de CaCÍ2, ZnCl2, polietileno glicóis ("PEG") e tampões acídicos. 0 zinco interage com a proteína na sua precipitação por meio disso ajudando a aumentar a carga da gota, reduzir o efeito de explosão e abrandar a libertação da proteína da gota. O cálcio ajuda a formar o precipitado de alginato e a formação da gota. O cálcio também ajuda a formar a gota, especialmente se o banho for viscoso por causa da adição de outros aditivos como o PEG. O cálcio pode ser aumentado quando se aumenta a viscosidade para ajudar a manter a forma de gota. As concentrações de zinco devem ser pelo menos de 0,1 mM e a concentração de cálcio deve ser pelo menos de 10 mM. A adição de PEG ajuda a aumentar a carga. Certos PEGs são conhecidos para precipitar a proteína. O PEG também pode ser adicionado à mistura de proteína/alginato que é vertida no banho para ajudar a maximizar a carga e o a libertação sustentada. O peso molecular do PEG pode variar de 700 Da a 1000 kDa, mas de um modo preferido de 700 Da ~ 100 kDa. Um especialista na técnica será consciente da quantidade de PEG a adicionar à mistura de banho mas pode ser tão alta como 99 %, de um modo preferido menos do que 75 % em peso. Um especialista na técnica também será consciente que a concentração de PEG pode ser limitada pela viscosidade do banho.

Preparação de Gota.

Em geral, as gotinhas de uma mistura de gota de leptina/alginato são pulverizadas, gotejadas ou dispersas numa mistura de banho (como descrito em cima) que precipitam ou os géis da mistura de 21 leptina/alginato. Além do mais, os meios electrostáticos podem ser usados para a formação de gota.

Para fazer pequenas gotas, isto é menores do que algumas centenas de mícrones em diâmetro, uma câmara de fluxo (detentor de bocal) que consiste de uma agulha com o fluxo de ar coaxial é usada. Uma de duas portas é conectada a uma linha de gás e a outra porta a uma seringa (3 mL) usado para bombear (a aproximadamente 1 mL/min) a mistura de proteina/alginato no banho. Tipicamente 2 mL da mistura são injectados em 10 mL de mistura de banho. O bocal é posicionado aproximadamente a 0,8 cm do topo do copo grande de banho. O tamanho de gota é primeiramente determinado pela taxa de fluxo de gás, por exemplo, a uma taxa de fluxo de 8 L/min o tamanho de gota varia de 50-150 mícrones em diâmetro. A taxa de fluxo de leptina/alginato tem um efeito muito menor no tamanho de gota.

Para fazer gotas grandes (isto é, com um diâmetro de 1-3 mm), uma seringa de 1 centímetro cúbico de tuberculina, ajustada com uma agulha de 24G é usada para gotejar a mistura de leptina/alginato na mistura de banho. O banho tipicamente contém 1,5 % de CaCl2 e de 5 a 50 mM de ZnCl2. As gotas são reunidas por verte-las através de um coador de célula de náilon de 40 mícron. As gotas são enxaguadas no coador com 5 mL de água esterilizada e suavemente manchadas do lado inferior do coador com um pano de limpeza (gama wipe 67). As gotas são armazenadas num microtubo de cápsula de parafuso plástico esterilizado.

Carqa da Gota Método de Explosão: a carga do fármaco de um grupo seleccionado de gotas é determinada por se pesar exactamente 100 mg das gotas 22 carregadas hidratadas em 1 mL de 0,5 M de citrato de sódio pH 8.5. A suspensão da gota é incubada a temperatura ambiente até que as gotas se desintegrem formando normalmente um precipitado. A suspensão é centrifugada a 14 KB rpm durante 2 minutos (eppendorf, 5415 C) . O sobrenadante é reunido e a absorvência a 280 nm é registada. 0 precipitado é dissolvido através da sua suspensão em 1 mL de 7M de ureia. A absorvência desta mistura é registada. A carga de proteína das gotas carregadas hidratadas é expressa como mg de proteína por mg de gota ou mg de proteína por mg de gota e determinada a partir da soma das duas absorvências. Método Cumulativo: Este método é usado em conjunto com os estudos de libertação ín vítro. A quantidade da proteína libertada a partir das gotas incluindo a explosão no fim do estudo é somada. Para detalhes, veja abaixo.

Estudos de Libertação In Vitro

As gotas carregadas hidratadas (100 mg) são pesadas num tubo de micro-centrifugação de 1,5 mL (eppendorf) e 1 mL de tampão (10 mM de histidina pH 7,4) adicionado. A amostra é colocada numa agitadora incubadora a 37 °C e a 100-200 rpm. Em intervalos de tempo seleccionados, a amostra é retirada da incubadora, centrifugada (eppendorf, 1000 rpm, 2 minutos) e o sobrenadante é retirado e substituído com 1 mL do tampão fresco. A quantidade da proteína libertada é determinada a partir da absorvência do sobrenadante. Depois da mostra libertada final ter sido tomada a quantidade deixada na gota é determinada pelo Método de Carregamento de Gota/Explosão. A percentagem libertada a um dado período é determinada a partir da soma da proteína total libertada e que permanece na gota na finalização da experiência. 23

Estudos In Vivo

Perda de Peso no Rato: em geral, os ratos são injectados uma vez com uma suspensão das gotas carregadas ou das gotas não carregadas. Ratos fêmeas com seis a oito semanas são usados (tipo C57/BLC), tipicamente pesando 20 gramas. No caso de amostras de gota, 350 mcL de tampão (50 mM de MES pH 6,7) são adicionados a 100 mg de gotas hidratadas e vortexadas. A suspensão é redigida numa seringa de 1 cc e todas as gotas e 300 mcL de tampão são injectados (agulha de 23G) subcutaneamente no pescoço do rato. Os ratos são pesados diariamente.

Estudo Farmacocinético do Rato: os ratos fêmea com seis a oito semanas são usados (tipo Sprague Dawley), pesando tipicamente 250 gramas. As injecções são executadas de uma maneira semelhante à descrita nas experiências da perda de peso do rato. 0 sangue é tirado para amostra por colheita com cateter em vários intervalos de tempo depois da injecção e as amostras analisadas para a leptina por um ensaio de ELISA.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar mais completamente a invenção, mas não devem ser interpretados como limitando o seu âmbito. Além do mais, no que se refere à divulgação acima mencionada ou aos exemplos a seguir, um especialista na técnica será capaz de fazer as modificações necessárias às divulgações para uma produção de grande escala.

Exemplo 1 24

Este exemplo examina o efeito da concentração de leptina na gota na libertação de leptina das gotas de alginato co-precípitatadas de zinco/leptina. As gotas pequenas são preparadas como descrito acima utilizando 25 mM de ZnCl2 no banho. A gota de concentração mais alta, isto é 66 mg/mL de leptina, é preparada usando 84 mg/mL de leptina em 1 % de alginato enquanto que a gota de concentração mais baixa, isto é 21 mg/mL de leptina é preparada a partir de 28 mg/mL de leptina em 1 % de alginato. À medida que a concentração de leptina na gota aumenta a libertação fraccional de leptina da gota reduz. Para a concentração mais alta de leptina 25 % é libertado em 80 horas, enquanto que na concentração mais baixa 80 % é libertado em 80 horas.

Exemplo 2

Este exemplo examina o efeito do nível de ZnCl2 do banho na libertação de leptina a partir das gotas de alginato co-precipitadas de zinco/leptina. As gotas pequenas são preparadas como descrito em cima mas o nível de ZnCl2 no banho está a 0,5 e 25 mM e a concentração de leptina nas gotas é de 37 mg/mL (pelo método cumulativo) . Este exemplo mostra que à medida que o nível de ZnCl2 no banho aumenta as gotas resultantes têm uma explosão reduzida e a taxa de libertação reduzida de leptina. A 0,5 mM de ZnCl2, as gotas têm uma explosão de 20 % e uma libertação de 50 % em 40 horas; enquanto que a 25 mM de ZnCl2 as gotas têm menos de 5 % de explosão e 25 % de libertação em 40 horas.

Exemplo 3

Este exemplo compara uma gota de alginato co-precipitada de zinco leptina com uma formulação de tampão de acetato de controlo (20 25 mg/mL) numa experiência farmacocinética/bioactividade combinada. As gotas pequenas contêm 64 mg/mL de leptina (isto é, por mL de gotas) e são fabricadas como descrito em cima com 17 mM de ZnCl2 no banho.

Ais ratos fêmea (220g de peso de corpo) é dada uma injecção única SC (subcutânea) a uma dose de 50 mg/kg. As concentrações de plasma da amostra de gota são sustentadas quanto às do controlo. Os ratos injectados com amostras de gotas mantêm uma concentração de plasma de leptina de mais de 50 ng/mL durante mais de 112 h em contraste com as de 12-18 h dos animais de controlo. Quanto mais altos os níveis no sangue de leptina sustentada no grupo de gota correlacionados com a sua perda de peso mais pronunciada e sustentada em comparação com o grupo de controlo. Os ratos injectados com amostras de gotas perdem constantemente peso durante 120 horas; em 120 horas a perda de peso total é de 9 % do peso inicial. Ao contrário os ratos de controlo perdem 7 % do seu peso inicial em 50 horas mas recuperam o peso em 120 horas.

Exemplo 4

Este exemplo mostra o efeito de vários PEGs no banho, em adição a 10 mM de ZnCl2, na eficiência do carregamento e na libertação in vitro de IL-1 ra. As gotas pequenas são preparadas como descrito em cima com IL-1 ra em 10 mM de PIPES pH 6,85. Um banho de gota (A) contém 100 mM de CaCl2, 10 mM de ZnCl2, 20 % de 1 KB de PEG e 20 % de 2 KB de PEG. Um segundo banho de gota (B) contém o mesmo como A mas sem 20 % de 1 KB de PEG. A concentração de IL-1 ra nas gotas A e B é de 58 mg/mL, isto é uma eficiência de carregamento de 74 % como determinado a partir da explosão de citrato de sódio. A formulação B tem uma explosão de 55 % e 75 % libertado depois de 18 horas. A formulação A tem uma explosão de 20 % e 50 % libertado depois de 18 horas. Assim a adição de PEGs no banho leva a gotas 26 altamente carregadas que sustentam a libertação na proteína. Também, a adição de 1 KB PEK leva a uma explosão mesmo mais baixa e a libertação mais lenta da proteína.

Exeroplo 5 (não de acordo com a invenção)

Este exemplo mostra o efeito de ter PEGs, mas nenhum zinco, no banho no carregamento de e na explosão inicial de IL-l ra de gotas de alginato. As pequenas gotas são preparadas como descrito em cima excepto o facto do banho conter 20 % de 1 KB e 20 % de 2 KB de PEG em adição a 100 mM de CaCl2. A eficiência do carregamento é de 93 % com 63 mg/mL de IL-1 ra na gota. A explosão inicial é de 35 %. Assim, a adição de PEGs ao banho pode levar ao alto carregamento de proteína sem a presença de iões de zinco.

Exemplo 6

Neste exemplo é feita uma comparação da eficácia da libertação de uma injecção de bolus de 11-1 ra no tampão (10 mM de PIPES, pH 6,85) e IL-1 ra em gotas de alginato do Exemplo 1. Os ratos fêmea Balb/C (20 g de peso de corpo) são injectados com SC (subcutaneamente) no tempo zero com várias formulações cada uma contendo 10 mg de IL-1 ra. Às 18 horas os ratos são injectados IV (intravenosamente) com rhIL-lB (0,1 mcg por rato) e depois mortos 2 horas depois disso para a amostragem de sangue. 0 sangue é analisado para a concentração de glicose e números de linfócitos. O IL-lbeta normalmente causa uma baixa na concentração de glicose e nos números de linfócitos mas a presença de um certo nível de IL-1 ra protege contra tal perda. 0 resultado da experiência mostra que só os ratos que recebem o IL-1 ra contido nas GOTAS são protegidos contra a perda em. valor dos parâmetros de sangue. Estes resultados 27 demonstram que as gotas de alginato sustentam a libertação do IL-1 ra a um nível eficaz durante pelo menos 18 horas.

Exemplo 7 de Controlo

Este exemplo é uma experiência de controlo que ilustra a preparação e a libertação da proteína que contém as gotas que usam GCSF em que o banho de precipitação só contém CaCl2 (100 mM). As gotas grandes são preparadas como descrito em cima. A mistura de seringa contém 46 mg/mL de GCSF (10 mmM de TRIS pH 7) em 1 % de alginato. As gotas preparadas contêm 16 mg/mL de GCSF (da explosão de citrato). Assim só com CaCl2 no banho a eficiência do carregamento é de 35 %. A libertação fraccional da proteína mostra uma explosão de 60 % e a libertação de 75 % num dia. Assim usando um procedimento conhecido descrito na literatura obtém-se o carregamento baixo de proteína e a libertação rápida.

Este exemplo mostra o efeito de ZnCl2 no banho no carregamento e na libertação de GCSF em gotas de alginato. As gotas grandes são preparadas como descrito em cima excepto o facto de 10 mM de ZnCl2 ser adicionado ao banho. A mistura de seringa contém 46 mg/mL de GCSF em 1 % de alginato. As gotas preparadas contêm 28 mg/mL de GCSF (da explosão de citrato). Assim com a adição de 10 mM de ZnCl2 ao banho (em adição a 100 mM de CaCl2) a eficiência do carregamento aumenta de 35 % (Exemplo 6) a 61 %. A libertação fraccional da proteína mostra uma explosão reduzida de 40 % e uma libertação de dia de 55 %. Assim a adição de ZnCl2 ao banho de CaCl2 leva a uma eficiência de carregamento mais alta, explosão mais baixa e libertação mais lenta da proteína. 28

Exemplo _9

Este exemplo mostra o efeito de ter PEG no banho com o pH do banho a ser acídico no carregamento e na libertação de GCSF com as gotas de alginato. As gotas grandes são preparadas como descrito nc Exemplo 7 excepto no facto de 20 % de PEG (Aldrich) ser adicionado ao banho e o pH do banho ser de 1,7. O banho também contém 100 mM de CaCl2 e 10 mM de ZnCl2. A eficiência de carregamento de GCSF é de 54 % e a libertação fraccional (25 mg/mL nas gotas) mostra uma explosão muito reduzida de menos de 5 % e de 40 % da libertação depois de 100 horas. Assim uma mistura de banho acidica que pode conter o PEG (em adição a CaCl2 e ZnCl2) leva à baixo explosão e libertação lenta da proteína.

Exemplo 10

Este exemplo mostra o efeito de ter PEGs e zinco no banho e o pH do banho baixou com o agente(s) de acidificação no carregamento de e a explosão inicial de GCSF de gotas de alginato. As gotas grandes são preparadas como descrito em cima excepto o facto do banho conter 25 mM de ZnCl2, 100 mM de CaCl2, e 5 % de 1 KB de PEG e 5 % de 10 K de PEG. 0 pH do banho é abaixado com tampão de glicina e ácido fosfórico a um pH de 1,65. As gotas resultantes (20 mg/mL de carregamento) apresentam menos de 5 % de explosão e uma libertação fraccional de 40 % em 90 horas. Assim uma combinação de PEGs e zinco e pH baixo no banho leva a uma explosão baixa e libertação lenta.

Exemplo 11 (não de acordo com a invenção)

Este exemplo mostra a preparação de GCSF em gotas de a Lginato com 29 PEGs num banho de pH baixo sem a adição de iões de zinco. As gotas pequenas são preparadas como descrito em cima excepto o facto do banho conter 5 % de 1 K e 5 % de 10 K de PEG. O pH do banho é abaixado a 1,43 utilizando glicina e tampão de ácido fosfórico. A eficiência do carregamento é de 42 % com 14 mg/mL nas gotas (da explosão de citrato) . A libertação fraccional mostra uma explosão de 32 % e a libertação de 35 % depois de 70 horas.

Exemplo 12 (não de acordo com a invenção)

As gotas grandes de GCSF/alginato as do Exemplo 12, e dos Exemplos 13-15 a seguir, são preparadas de uma maneira semelhante à descrita em cima mas com o controlo mais estrito da regulação de tempo de várias operações e um método alternativo para determinar o carregamento. Mais especificamente, 1 mL de uma mistura de GCSF/alginato é gotejada em 10 mL do banho magneticamente agitado em aproximadamente 2 minutos. As gotas são filtradas e lavadas com 5 mL de água. A gota total que faz o procedimento leva aproximadamente 5 minutos. O carregamento é determinado (por A280) da diferença na quantidade de proteína na mistura de alginato gotejada no banho e a proteína que não se incorpora nas gotas formadas, isto é a proteína que permanece na mistura de banho e nas lavagens. Esta quantidade de proteína incorporada nas gotas é dividida por 1 mL em volume de mistura adicionada ao banho para se obter o carregamento expresso em mg/mL de gotas.

O exemplo 12 compara a presença de PEG no banho no carregamento de GCSF nas gotas. As gotas grandes são preparadas como descrito em cima excepto o facto do banho conter 200 mM de CaCl2 e 15 % de PEG de 8 K (pH 5-6); o banho das gotas de controle tem 200 mM de CaCl2-A adição de PEG ao banho aumenta o carregamento de 21,8 mg/mL 30 (eficiência de 70 %) a 26,5 mg/mL (eficiência de 85 %).

Exemplo 13 (não de acordo com a invenção)

Este exemplo mostra o efeito do pH baixo no banho no carregamento e na libertação de GCSP com gotas de alginato. A formação de gota e o carregamento são determinados como no Exemplo 12 com o PEG excepto o facto de um dos banhos conter 0,5 M de tampão de glicina pH 2,1. 0 carregamento a pH 2,1, 24,9 mg/mL (eficiência de 80 %), é semelhante à do controlo. No entanto, a libertação inicial de uma hora (29 %) é mais baixa e a libertação de 24 horas mais sustentada(32 %) do que a do controlo (92 % e 99 % respectivamente) .

Exemplo 14

Este exemplo mostra o efeito da adição de zinco a um banho que contém PEG no carregamento de GCSF em gotas de alginato. A formação de gota e o carregamento são determinados como no Exemplo 12 com o PEG. A adição de 10 mM de ZnCl2 ao banho aumentou o carregamento de 26,5 mg/mL (eficiência de 85 %) a 30,3 mg/mL (eficiência de 97 %).

Exemplo 15 (não de acordo com a invenção)

Este exemplo mostra uma explosão inicial baixa e a libertação sustentada de GCSF de gotas de alginato. A formação de gota, carregando e libertação é executado de uma maneira semelhante à do EXEMPLO 13 excepto o facto do banho conter 100 mM de CaCl2, 5 % de

PEG de 1 K e 5 % de PEG de 2 K, e 0,5 M de tampão de glicina (pH 2,1). As gotas carregadas contêm 24 mg/mL de GCSF. À 1/2 h a libertação inicial está perto de zero, às 19 h a libertação é de 13,6 % e às 44 h a libertação é de 24 %.

Lisboa, 30 de Abril de 2007

Claims

REIVINDICAÇÕES Composição de gota de gel de libertação sustentada, que compreende: a) um polímero hidrofílico; b) um agente biologicamente activo; e c) pelo menos dois agentes de precipitação; em que pelo menos um dos agentes de precipitação compreende zinco e co-precipitam o agente biologicamente activo com o polímero hidrofílico, em que o polímero hidrofílico é o alginato. Composição de acordo com a reivindicação 1 em que pelo menos um dos agentes de precipitação é seleccionado a partir do grupo que consiste de iões ou sais de metal polivalentes, acetatos, citratos, cloretos, carbonatos ou os seus hidróxidos. Composição de acordo com a reivindicação 2 em que os iões de metal são seleccionados a partir do grupo que consiste de manganês, estrôncio, ferro, magnésio, cálcio, bário ou alumínio e as suas misturas. Composição de acordo com a reivindicação 3 em que os agentes de precipitação compreendem zinco e cálcio. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 em que o alginato contém pelo menos 30 % de ácido gulurónico. 2
6. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 em que o alginato consiste de pelo menos 0,05 % em peso.
7. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 em que o agente biologicamente activo compreende uma proteína.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7 em que a proteína consiste de pelo menos 0,01 mg/mL.
9. Composição de acordo com a reivindicação 7 em que a proteína é seleccionada a partir do grupo que consiste de factores hematopoiéticos, factores de estimulação de colónia, factores de anti-obesidade, factores de crescimento, factores tróficos, e factores anti-inflamatórios.
10. Composição de acordo com a reivindicação 7 em que a proteína é seleccionada a partir do grupo que consiste de leptina, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-1 ra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferões, eritropeietina, KGF e os seus análogos ou derivados.
11. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10 em que pelo menos um dos agentes de precipitação é seleccionado a partir do grupo que consiste de polímeros solúveis em água.
12. Composição de acordo com a reivindicação 11 em que o polímero solúvel em água é o polietileno glicol.
13. Método para a produção de uma composição de gota de gel de libertação sustentada, que compreende os passos de a) dissolver um agente biologicamente activo e um polímero 3 hidrofílico com um solvente para formar uma primeira mistura; b) dissolver pelo menos dois agentes de precipitação num solvente para formar uma segunda mistura; c) adicionar a primeira mistura com. a segunda mistura; e d) co-precipitar o agente biologicamente activo com o polímero hidrofílico para formar uma partícula co-precipitada, em que pelo menos um dos agentes de precipitação é o zinco e co-precipíta o agente biologicamente activo, em que o polímero hidrofílico é o alginato.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que pelo menos um agente de precipitação é seleccionado a partir do grupo que consiste de iões ou sais de metal polivalentes, acetatos, citratos, cloretos, carbonatos ou os seus hidróxidos.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o ião de metal é seleccionado a partir do grupo que consiste de manganês, estrôncio, ferro, magnésio, cálcio, bário, alumínio ou as suas misturas.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que os agentes de precipitação compreendem zinco e cálcio.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o agente de precipitação na segunda mistura consiste de pelo menos 1 mM de cálcio e 0,1 mM de zinco.
18. Método de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 17 em que a segunda mistura tem um pH de menos do que 4. 4
19. Método de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 18 em que o alginato contém pelo menos 30 % de ácido gulurónico.
20. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a primeira mistura consiste pelo menos de 0,05 % de alginato em peso.
21. Método de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 20 em que o agente biologicamente activo compreende uma proteína.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a primeira mistura consiste pelo menos de 0,01 mg/mL de proteína.
23. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a proteína é seleccionada a partir do grupo que consiste de factores hematopoiéticos, factores de estimulação de colónia, factores de anti-obesidade, factores de crescimento, factores tróficos, e factores anti-inflamatórios.
24. Método de acordo com a reivindicação 21, em que a proteína é seleccionada a partir do grupo que consiste de leptína, G-CSF, SCF, BDNF, OPG, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-1 ra, IL2, TNF-bp, MGDF, interferões, eritropeietina, KGF e os seus análogos ou derivados.
25. Método de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 24 em que pelo menos um dos agentes de precipitação é seleccionado a partir do grupo que consiste de polímeros solúveis em água.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o polímero solúvel em água é o polietileno glicol. 5
27. Método de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 26 em que a adição da primeira mistura a uma segunda mistura ocorre através de pulverização, campos electrostáticos, adição de gotinhas, dispersão, ou mistura, para formar as partículas co-precipitadas.
28. Método de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 27 que compreende adicionalmente o passo de isolamento da partícula co-precipitada.
29. Produto de libertação sustentada produzido através do método de qualquer uma das reivindicações 13 a 28.
30. Formulação farmacêutica que compreende uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 29 num portador, diluente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
31. Composição de libertação sustentada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 29 num portador, diluente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável, para utilização num método de tratamento.
32. Utilização de uma composição de libertação sustentada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 29 ou uma formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 30 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma perturbação seleccionada a partir do grupo que consiste de excesso de peso, diabetes, elevado nivel de lípidos no sangue, esclerose arterial, placa arterial, a redução ou prevenção da formação de cálculos biliares, massa de tecido magro insuficiente, sensibilidade insuficiente à insulina, e 6 apoplexia, em que o agente biologicamente activo é a leptina, um análogo ou um seu derivado.
33. Utilização de uma composição de libertação sustentada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 29 ou uma formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 30 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma perturbação seleccionada a partir do grupo que consiste de deficiências de células hematopoiéticas, infecção, e neutropenia, em que o agente biologicamente activo é o G-CSF um análogo ou um seu derivado.
34. Utilização de uma composição de libertação sustentada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou 29 ou uma formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 30 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma inflamação, em que o agente biologicamente activo é um IL-1 ra, um análogo ou um seu derivado.
35. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 34 em que o medicamento é para libertação através de injecção. Lisboa, 30 de Abril de 2007