TW505695B - Protein having ethylenediamine-n, n'-disuccinic acid: ethylenediamine lyase activity and gene encoding the same - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（1 ) -背景技~ 本發明爲有關具有乙二胺-N，N二破始酸：乙二胺裂 解酶活性之蛋白質及將其編碼之基因。 二胺伸燒基-N，N、二號靖酸不但爲醫農藥合成中間體 之重要化合物，且爲具有捕捉重金屬之特異性質之化合 物。該化合物之光學異構物可期待放出自然界後易受生物 分解等，故可望作爲螯合劑或清潔劑用助洗劑等。 二胺伸烷基-N，Ν’ -二琥珀鷗可由有機合成手法從各種 胺及馬來酸或富馬酸容易製造。但若爲光學活性二胺伸燒 基-Ν，Ν’ -二破珀酸時，作爲其有機合成之出發原料必須 爲光學活性天冬胺酸等。例如光學活性二胺伸燒基-Ν， Ν -二琥珀酸乃由L -天冬胺酸及二溴◊烷製造[J〇hn Α阶沮 等、無機化學7，2405(1968)]。但從L-天冬胺酸及二溴乙燒 製造時，製造原料較貴，難以廉價提供汎用性化合物δ 他方面，二胺伸烷基_Ν，啊，_二琥珀酸也由放線菌之培 養液分離鑑定[Τ· Nishkiori 等 J. Antibiotics 37，426(1984)]。但由此 放線菌之生產性極低、用此放線菌製造二·胺伸烷基、N， N1-二琥涵酸之方法不能成爲工業製法。 鑑此，本申請人先前提案利用微生物之觸媒作用而從馬 來酸或冨馬酸及各種二胺有效率地合成光學活性二胺伸垸 基_ N，N ’ -二琥珀酸之新穎方法（特開平9-14〇39〇號、歐洲專 利公開 0731171、0805211 號）。 本發明以更提高此微生物今觸媒作用爲課題。 發明之要旨 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準([NS )八4規格（210X297公趋） (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 裝·

、1T 5 9 6 5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 —.__ —_B7 五、發明説明（2 ) - — 本發明者選植乙二胺_ N，jsf，-二琥泊酸1乙二胺裂解酶 基因，藉基因重組使微生物之菌體内該基因以多複製存在 而使此微生物之觸媒能力驟增，成功地改善微生物菌體内 二胺伸烷基-N，N ’ ▲二琥珀酸之生產量，終於完成本發 明p 本發明提供一種含有將其有乙二胺/N，N，_二琥拍酸： 乙二胺裂解酶活性之多肽編碼的·驗基序列之DNA，係.該多 肽具有序列1示胺基酸序例或在該胺基酸序列至少一個胺 基酸·缺失、取代或加成之胺基酸序列之前述DNA。含有將 具有乙二胺-N，N ’ -二琥龙酸：乙二胺裂解酶活性之多肽 編碼的檢基序列之DNA可爲含有將序列1所示胺基酸序列之 多肽編碼之鹼基序列之DN A或基因碼同義性由來之其類緣 體。前述將多肽編碼之鹼基序列也可有序列2所示檢基序 列f 又本發明也提供含有序列2所示鹼基序列或與其片段雜 交，且將具有乙二胺-N，N，-二琥ίέι酸：乙二胺裂解酶活 性之多肽編碼之鹼基序列之DNA。至於序列2所示鹼基序列 之片段可爲由序列2所示驗基序列之驗基編號176〜501之範圍 内龄基數326之序列而成。雜交之條件可在25〜40 °C，甲醯胺 濃度10〜50 %進行。洗淨條件可配合檢出方法而設定。 本朋又提供由序列4及5所示驗基序列而成之合成DNA所 放大之太小爲200-350bp之DNA。此種DNA片段可用於取得與 乙二胺-N，N ’ ·二玻拍酸：乙二胺裂解酶同義之基因，或 判斷是否相同。 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) ---- (請先閱讀背面之注意事項本頁) .裝. 、11 505695 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（3 ) - 本發明又提供一種含有將具有乙二胺-N，Ν’-二琥拍 酸··乙二胺裂解酶活性之多肽編碼的檢基序列之DN Α之重 組-質體。 本發明又提供由前述重組質體來轉形-之宿主。宿主可爲 大腸样菌等微生物。用此轉形宿主可製造二胺亞烷基_N， N f -二琥珀綾，本發明也提供巧此轉形漪主可製造二胺亞 烷基-N，Ν’ -二琥珀酸之方法。 本發明又提供具有序列1所示胺基序列或該胺基序列中 至少一個胺基酸缺失、取代或加成之胺基酸序列，且具有 乙二胺-Ν，Ν’_二琥拍酸··乙二胺裂解酶活性之多肽。胺 基酸之缺失、取代或加成可由周知技術之部位專一性謗發 變異（參照如核酸研究，第10册，第20號，第6487-6500頁， 1982)來實施。 藉基因重組之方法選植乙二胺-Ν，Ν、二琥珀酸··乙二 胺裂解酶基因，而得以在微生物菌體内有同基因多重複存 在，故使微生物$觸媒能力驟增，提高二胺亞烷基-Ν， Ν’ -二琥珀酸之生產量。 發明之實施形態 圖1爲質體(pEDSOOl)之限制酶爵譜。 圖2爲質體(pEDS002)之限制酶圖譜。質體(pEDS002)爲將質 體(pEDSOOl)之限制酶K pnl、BamHI切斷所得之約3.9kb之片段 插入pUC18者。 圖3爲質體（pEDS003)之限制酶圖譜。質體（pEDS003)爲將質 體(pEDSOOl)之很制酶K pnl、BamHI切斯所得之約2 .6kb之片段 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) -裝· 、\呑 505695 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明$ ) — 插入pUC18者。 圖4爲質體(PEDS020}之限制酶圖譜。質體(pEDS020)爲將質 體(pEDS003)之限制酶K pnl、BamHI切斷所得之約2 .6kb之片段 插入pUC119者。 發明之適宜形_ 次詳細説明本發明。 本發明中「乙二胺-N，N ’ -二琥J白酸、：乙二胺裂解酶」 乃指具有由書馬酸及乙二胺可逆地生成乙二胺-N，Ν’ -二 琥珀酸之能力之酶，但依反應條件也可生成乙二胺-Ν -單 琥ίό酸。生成之二胺亞烷基-Ν，Ν ’ -二琥柏酸往往爲光學 活性體，但也有生成外消旋體之酶。 具有此種反應性之一群酶乃見於本發明者從天然界分離 鑑定之屬於多數屬之細菌類，此等細菌類記載於前述特開 平 9-140390 號、歐洲公開 0731171、0805211 號 τ 本發明爲關於記載於歐洲公開0805211號之短無胞菌 Brevundimonas sp. ΤΝ-3 株由來之乙二胺-Ν，Ν '-二琥 ίό 酸：乙 二胺裂解酶基因。 本發明之實施態樣如下。在下列工程可用業者周知之任 意適會之方法及材料。 ⑴ΤΝ-3株染色體DNA之調製 從ΤΝ-3妹分離、調製染色體DNA。 (2)精製酶之調製 從ΤΝ-3株精製乙二胺-Ν，Ν ’ -二琥珀酸：乙二胺裂解酶 f白質。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 装-- (請先閱讀背面之注意事項馬本百〇

、1T -^- 505695 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（5 ) ' (3)精製餘之N末端胺基酸序列及内部胜肽之胺基酸序列之 分析。 分析精製之乙二胺，Ν’-二琥拍酸：乙二胺裂解酶蛋 白賢活性之Ν末端胺基酸序列及·内部胜肽乏胺基酸序列。 ⑷探針之調製 由Ν末端胺基酸序列及内部胜肽之胺基酸序列推定驗基 序列而製作2種合成DNA。以此合成DNA引子，以ΤΝ-3株染 色體DNA爲模型進行聚合酶伸長反應，得乙二胺-Ν，Ν、 二琥珀酸：乙二胺裂解酶基因之一部分被放大之DN Α片 段。 (5) DNA庫之製作 染肥體DNA以限制酶切斷後，插入質體載體pUC18而作 DNA 庫。 ⑹大慮样菌轉形體之製作及重組體DNA之選別 製作依工程（5)製作之DNA庫之大腸桿菌轉形體，而依以 工程⑷製作之DNA片段爲探針之菌落雜交法來選別含有目 的重組DN A之轉形體 (7)重組質體之調製 由工程(6)選別之重組體製作質體。 ⑻限制酶圖譜之製作及乙二胺-Ν，N，-二琥珀酸：乙二胺 裂解酶基因領域之特定 就工程⑺所得重组質體製作限制酶圖譜，而特定探針雜 交之領域。 (9)驗基序列之決定 -8- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事續再本頁) •裝·

、1T 505695 A7 B7五、發明説明（6 ) ' 決定工程⑻所特定之領域周邊之鹼基序列。 (10)乙二胺-N，N、二琥拍酸之製造 由工程(7)調製之重組質體切取含有乙二胺-N，N ’ -二琥 珀酸··乙二胺裂解酶基因之領域，而插入大腸桿菌載體 pUC119。將此重組質體導入大腸桿菌JM1O9，此轉形大腸# 菌在適當之培養基以適當培養條件培養。由所得培養液分 離菌體，以富馬酸及乙二胺爲原料來反應而分離精製所生 成之乙二胺-N，N、二琥珀酸3 上述 T N - 3 株及以短無胞菌 Brevundimonas sp· TN-3(CCRC 910092) 寄存在食品工業發展研究所，其菌學性質如下。 TN-3株之菌學性質 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 形態 样菌 革蘭染色性 — 胞子 — 運動性 + 鞭毛 極毛 對氧之態度 嗜氣性 氧化酶 + 觸酶 + OF試驗 — 菌落之色調 無生成特徵色素 螢光色素之生成 一 PHB之蓄積 + 營養要求性 有 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 505695 A7 B7 五、發明説明（7 ) — 醌系 Q-10 硝酸鹽還原 + W嗓生成 了 精胺酸水解酶 — 尿素分解 - 七葉靈分解 - 明膠液化 - PNPG 一 同化啤 葡萄糖 - L -阿拉伯糖 -T· D-甘露糖 — D-甘露醇 - N -乙醯基-D -葡萄糖胺 — + ~Γ + + 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項马本頁) 麥芽糖 葡萄糖酸鉀 正癸酸 己二酸 dl-蘋杲酸 乙酸苯酯 以下舉實施例詳細説明，但本發明不限於此等實施例。 實施例1 (1) TN-3株染色體DNA之調製 ψ-3株在100ml之EDDS培養基（0.2 %乙二胺-N，N * -二琥 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 5 9 6 05 5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 五、發明説明（8 ) ' 5白酸、Ό·2 %葡萄糖、Ό.1 %細菌酵母汁、Ό.Ό5 % 0多腺、0.1% 硫酸鎂七水鹽、2.5 % (V/V)磷酸緩衝液(1Μ，ρΗ7·0)、0.5 % (V/V) 金屬鹽混·合物溶液（硫酸鈉·56克、氯化鎂六水鹽8克、氯化 鈣〇·8克。硫酸益四水鹽0.6克、氨化鐵六水鹽〇.12克、硫酸 鋅〇·Ό6克/100ml)中，於3〇 X：震盪培養4日後，收集菌體而懸 浮於食鹽水- EDTA 溶液(01M EDTA，15M Naa，ρΗ8·0) 4ml，加 溶菌酶8mg而在37 °C震盪1小時後，冷凍之。次於缓和震盪 下加 10ml 之 Tris-SDS 液(1%SDS，Ό.1Μ NaCl，01M Tris pH9.0)，再加 蛋白酶K (默克公司，最後濃度img)而於37。〇震盪卜〗、時。 次加等量T E飽和酚而授拌後（TE : lOmM Tris，ImM EDTA，pH -8·Ό)，離心，採集上層，加2倍量乙醇後，以玻璃棒捲取 DNA，以90 %、80 %、70 %之乙醇順次去除酚。次將DNA蹲 在3ml之Τ Ε緩衝液，加核糖核酸酶Α溶液（經15分100 Χ熱處 理）至10mg/ml而於37Ϊ：震盪30分。再加蛋白酶κ而於37°C震 堡30分後’加等量ΤΈ飽和紛而離心分離爲上下層。將上層 反覆此操成2次後，加同量氯仿（含有4%異戊醇）而反覆同 樣萃取操作（以下稱酚處理）。其後上層加2倍量乙醇而以玻 璃棒捲取DNA，得染色體DNA標準品。 (2)精製酶之調製 TN-3株在21之EDDS培養基中於3〇°C震盪培養4曰後集菌 而懸浮於10mM磷酸鋼緩衝液（pH8 〇，含有二蘇糖 醇）100ml，以超音波破碎機破碎菌體，以aooojpm離心2〇 分。所得上澄液中硫酸銨至30%飽和，於4°C放置30分後離 心。所得上澄液中硫酸銨至60 %飽和，於4 X放置30分後離 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格-- (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) -裝. 、νφ i % 9 6 5 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 A7 __B7 五、發明説明（9 ) * 心。所得沉澱溶在10ml之ΙΟπϊΜ磷酸鈉缓衝液（pH8.0，含有 ImM二蘇糖醇），作為部分精製酶液。將此部分精製酶液再精 製於離子交換層析。即此部分精製酶液通入以含有ImM二 蘇糖醇之10mM磷酸鈉緩衝液(ρΉ8.Ό)緩衝之DEAE-sephacryl(Pliarmacia公司製造）柱〇 10mm X 20cm)來吸附後，以同 缓衝液40ml通洗而以〇〜〇.6M KC1之直線梯度溶出本酶，分爲 2ml部分，收集有乙二胺-Ν，>Γ -二琥ί白酸··乙二胺裂解酶 活性之部分精製酶液之部分。將此部分由SDS -聚丙醯胺凝 膠電泳分析，則檢出分子量約6萬之大致均等之1支帶。 (3)精製酶之Ν末端胺基酸序列及内部胜肽之胺基酸序列之 分析 工程（2)所得精製酶直接或經胰蛋白酶消化後，由SDS -聚 丙醯胺凝膠電泳分離多肽，在PVDF膜（Immobilon Psq，Millipore 公司）電子墨潰。將墨潰之膜以庫馬西鮮藍染色，切取被染 色之帶，供胺基酸序列分析a胺基酸序列之分析乃由島津 製作所製造之PSQ-1型胺基酸分析裝置施行，如果如下。 a) 無處理酶之N末端胺基酸序列：（分子量約6萬）.； (Met-)Thr‘Pro-His-Asn-Pro-Asp-Aia b) 胰蛋白酶部分分解物：（分子量約5萬）； Glu-Ile-Gly-Ser-Val-Gly-Lys-Met-Glu-Ile^Gly-Arg-Xaa-Ala-Asn-Asp-Leu-Arg-Asn-Arg c) 胰蛋白橋部分分解物：（分子量約1萬）； Ala-Ser-Gly-Ala-Lys-Ala-Pro-Glu-Phe-Gln^Glu-Leu-Tyr-Asp-Phe-Glu- -12- * 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項頁) 裝·

、1T 505695 Α7 Β7 五、發明説明（19 ) _ 1 ()内乃示分離之胜肽之分子量，Xaa乃示分析上不能 特定之胺基酸] (4) 探針之調製 基於工程（3)所得之胺基酸f料，作成如序列4、5之合成 DNA而作爲引子（#1、#2)，以工程（1)所得之TN-3株之染色體 DNA爲模型，進行聚合酶鏈鎖反應。 即加TN-3株之染色體DNA 1// 1、1〇倍濃度反應緩衝液1〇β 1 - lOmM dNTP 4 μ 1、引子 #1、#2 各 1 " 1 (相當於 lOOpmol 濃 度）ExTaq (寶酒造公司）1"1而作成100"1。就此溶液進行95 °C 30秒（變性工程）、55 °C 30秒（黏結工程）、72 °C 2分（伸長 工）之保溫30循環。反應終了後，以氯仿萃取3次而回收由 乙醇沉澱放大之DNA。將此以1.0 %洋菜糖電泳分離後，取 得編碼TN-3株之乙二胺_ N，N ’ -二琥珀酸：乙二胺裂解酶 基因之約300bp之DNA片段。所得DNA片段用DIG DNA標識套 组（百靈隹公司）來標識，作爲探針。 (5) DNA庫之製作 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 於ΤΝ·3株染色體DNA10 a 1加10倍濃度限制酶反應用缓衝 液5/rl、滅菌水33/rl、限制酶KpnI2/rl，於37°C反應16小時 後，由乙醇沉殿回收DNA。進行洋菜糖電泳，從凝膠切取 ό·5〜5.5kb 之 DNA 片段，用 DNA PREP ( Daiatoron 公司）回收。此 DNA片段以連接套組（寶酒造公司）插入大腸样菌載體pUC18 之ΚρηΙ部位，作成重組體DNA庫。 連接所用pUC18片段之製作如下。對pUC18保存液2" 1加 10倍濃度限制酶用緩衝液5/n、滅菌水40/n、限制酶KpnI3 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 505695 A7 B7 五、發明説明（11 ) "1，於37 6C反應2小時後，予以紛處理、乙醇年澱後，乾 燥而溶解在50" 1滅菌水。次加驗磷酸酶(寶酒造公司）U1、 10倍限制酶用緩衝液10^1、滅菌水39y l，於65°C反應後， 予以酚處理、乙醇沉澱後，乾燥而溶解在滅菌水。 ⑹大腸桿菌轉形體之製作及重組體DNA之選別

大腸桿菌JM109株接種在LB培養基（1%細菌胰蛋白、 0.5 %細菌酵母汁、0.5 %食鹽）Iffil，在37 °0嗜氣地前培養5 小時。將此培養物100ml加入SOB培養基40ml (2 %細菌胰蛋 白、0.5 %細菌酵母汁、10mM食鹽，2.5mM KC1，ImM硫酸鎂 ImM氯化鎂），於18 °C培養20小時後，離心集菌而加冷TF溶 液（20mM PIPES-KOH(pH6.0)，200mM KC1，10mM 氯化舞，1 m Μ 氯 化叙）13ml，於0 °C放置10分後，再離心而除去上澄液，將 沉澱之大腸桿菌懸浮於冷TF溶液3.21111，加0.221111二曱亞颯， 於0 °C放置10分。於所得有能力細胞200//1加含有工程(5)製 作之重組體質體之溶液（DNA庫）10 // 1，於〇 °C放置30分 後，予以42 °C熱休克30秒，冷卻0 X： 2分後，加SOC培養基 (2〇mM葡萄糖、2 %細菌胰蛋白、Ό·5 %細菌酵母汁、l〇mM 食鹽，2.5mM KC1，ImM硫酸鎂，ImM氯化鎂）lml，於37 °C 震盪培養1小時。將此按200/rl播種在含有1〇〇v g/m]之洋菜 培養基而在37。(：培養。就成長於洋菜培養基之轉形體菌落 依菌落雜交法選別具有乙二胺-N，Ν’-二琥珀酸：乙二胺 裂解酶基因之轉形體。即將此成長於洋菜培養基之轉形體 移至对綸膜（BIODYNE A : PalLBiosupport) ★令菌體溶解而固定 DNA辑，將此以工程⑷製作之探針（約300bp )處理，用DIG -14- 度適用中國€^^( CNS ) A4規格（210X297公釐) ~ —.

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、1T 經濟部中央標準局負工消費合作社印繁 505695 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12 ) 發光檢出套組（百靈隹公司）選擇具有目的重組體DNA之菌 落f ⑺重組質體之調製 將工程⑹所選擇之轉形體於LB培養基100ml在37 Ό培養 一夜後，收集菌體而用滅菌水洗淨，將溶液I (2nM葡萄 糖，10mM EDTA ^ 25mM Tris-HCl(pH8 0)) 5ml，加溶菌酶 25 m g ?而於0 °C放置30分。次加溶液II (IN NaOH， 5%SDS)10ml，於0 °C放置5分，加溶液III (3M乙酸鈉 (pH4.8)7.5ml，於0 〇C放置30分。將此離心而於上澄液加50ml 乙醇，再離心而除去上澄液，加5ml溶液IV( lOmM乙酸鈉， 50mM Tris-HCl(pH8.0))及核酸核糖酶A溶液而於室溫放 置20分。次加12ml乙醇，離心回收質體，以7〇 %乙醇洗 淨，乾燥後溶解在0.4ml滅菌水。祈得重組體質體命名爲 pEDSOOl 〇 (8) 很制酶调譜之製作及乙二胺-N，Ν ’ -二琥珀酸：乙二胺 裂解酶基因領域之特定 工程（7)所得質體pEDSOOl用數種限制酶切斷來製作限制酶 圖譜（圖1)。更進行慣用之次選植Q即將此？£08001以限制 酶ΚρηΙ及BamHI切斷，與將pUC18以同限制S祭切斷者連接， 而用以轉形大腸桿菌JM109株，得插入約3.9Kb片段之質體 (pEDS002)(圖2)及插入約2.6Kb片段之赁體（pEDS003)(圖3 )。就 各質體以限封酶BamHI，EcoRI，SacI，Sail等切斷後，施行洋菜 糖電泳，依南方雜交法特定探針所雜交之段片。 (9) 鹼基序列之決定 -15- "_ _______ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本育) •裝_ 辦 505695 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製 A7 ____B7五、發明説明（13 ) 工程(8)所特定之領域周邊之鹼基序列用Pharmacia公司螢 光序列機ALFII來決定。結果得序列2所示鹼基序列，發見 具有序列1所示胺基酸序列之開讀框。輿胺基酸序列資料 NBRF(National Biomedical Research Foundation)比較之結果，本基因 具有與結結晶或精胺镰丁二酸鹽20〜30%之同質，已知雨 酶均有催化富馬酸及胺（胺基酸）之縮合或分解之活牲。將 此開讀框之驗基序列揭示在序列3。 實施例*2 對2 " 1實施例1工程（7)所得具有乙二胺-Ν，N f -二琥拍 酸··乙二胺裂解酶基因之重組體質體pEDS003加10倍濃度限 制酶用缓衝液2//1、滅菌水15y 1、很制酶ΚρηΙ 1// 1，於37'C 反應2小時後，予以乙醇沉澱而回收質體，乾燥而加17芦1 滅菌水、2 # 1之10倍濃度很制酶用缓衝液、1 // 1限制酶 BamHI，於37 °C反應2小時。從此反應液由洋菜糖電泳調製 約2.6Kb之片段而插入在大腸桿菌質體PUC119。用所製作之 連-接溶液使大腸桿菌JM109株轉形而得目的質體。所製作之 質體稱 PEDS020，轉形體稱 JM109/pEDS020。 將此JM109/pEDS020接種在含有安比西林50mg/L之LB培養基 lml，於37 Ό震盪培養8小時後，於40ml之LB培養基（含有 50mg/L安比西林、ImM異丙基--硫半乳芬）於37 °C培養30 小時。所得培養物以10mM騎酸鈉緩衝液（pH8.0)洗淨後’懸 浮於2ml同缓衝液。將所得菌體懸浮液之一部分懸浮於含# 342mM富馬酸及171mM乙二胺之pH8.0水溶液50ml而反應24小 時。從反應液離心除去菌體後，用HPLC 確認乙二胺-N’ -16- —-------—----- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項 本買) .裝· 、-口 泉- 505695 kl B7 五、發明説明（14 ) - N ’ -二琥ί白酸之存在（WAKOSDL 5C8 (和光純藥）[溶出液：含 有lOmM氫氧化四正丁基銨及0·4πίΜ硫酸銅之50mM磷酸 pH2])。結果得知生成50mM之$，S -乙二胺-N，N ’ -二琥珀 酸 含有乙二胺-N，N二號拍酸：乙二胺裂解酶基因之質 體 pEDS020 (爵4)乃以含有轉形體 pEDS020/E. coli JM109(CCRC940188) 寄存在食品工業發展研究所。 以上説明本發之一般性質及特例，但本發明之範圍乃如 下申1青專利範圍所示。 (請先閱讀背面之注意事項本頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 5ϋ5695 Α7 Β7 五、發明説明) — 序列表 (1)共同資料： <i)申請人： (A) 日東化學公司 (B) 丸之为甲丁卞5-1 (C) 千田區 (D )東京 (Έ)日本 (F) 郵遞區號(ZIP) : 100 (G) 電話號碼：81-3-3271-3081 (H) 傳眞號碼：81-3-3271-〇881 ⑼發明名稱：具有乙二胺-N，N、二琥拍酸：乙二胺裂 解酶活性之蛋白質及其基因 (iii) 序列數：5 (iv) COMPUTER READABLE FORM ： (A) MEDIUM TYPE ： Floppy disk (B) COMPUTER ： IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM ： PC-DOS/MS^DGS (D) SGFIWARE ： Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (vi) PRIOR APPLICATION DATA ： (A) APPLICATION NUMBER ： JP 333018/96 (B) FILING DATE ： 29-NOV-1996 (vi) PRIOR APPLICATION DATA ： (A) APPLICATION NUMBER ： JP 60077/97 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

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、Y'VJ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 505695 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(16 ) (B) FILING DATE ： 2-FEB-1997 (2)序列號碼：1 : (i)序列特徵： (A)長度：495胺基酸 (Β>型：胺基酸 (D)拓蹼直鏈 ⑼分子型：蛋白賀 (vi)來源： (A) 微生物：短無胞菌（Brevundimonas sp.) (B) 售株—· TN-3 (ix)特點： ⑼位罝：1 (D)其他:Xaa=Met或無 (xi)序列説明：序列ID號碼：1 : ---------- —.... .. -.—- · ------------— ' .丨丨· _ Xaa Thr Pro His Asn Pro Asp Ala Thr Arg lie Gly Arq Ala Lvs Ara 1 5 10 15 Ala Lys Ala Pro Glu Phe Gin Glu Leu Tyr Asp Phe Glu Ala Ala Ala 2〇 25 30 I^u Thr ku Thr Ser Ala Val Phe Pro Ίγτ Asp Sei: Lys lie His Arq 35 40 45 Ala His Val Val Met Leu Ala Gill Gin Asp lie Leu Thr Arq Asp Glu 5〇 55 60 Ala Ala Ser He Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ala Asp Glu Leu Ala Glv 65 70 75 Lys Asp Ala Ala Leu Arg Thr Tyr Leu Pro Tyr Glu Ala Ala Leu Lys 85 90 95 Arg Glu lie Gly Ser Val Ala Gly Lys Met His He Gly Arg Ser Ala 100 105 110 Asn Asp I^u Arg Asn Arg Val Asn Ala Cys Ser Qys Val Thr Ala Leu U5 120 125 ^ -19- (請先閲讀背面之注意事項 本頁) .裝· 、-0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（/210X 297公釐） 505695 A7 B7 五、發明説明（17 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Arg Hir Val Glu Ala Val He Ala Leu Arg Glu Ala Val Val Thr Lys 130 135 140 Ala Ala Asp His Leu Asp Thr Val Met Val Val iyr Thr Gin Arg Lys 145 150 155 160 Glu Ala Gin Pro lie Thr Leu Gly His Tyr Leu Met Ala lie Ser Glu 165 170 175 Asn Leu Gly Lys Asn Leu Ala Arg Tyr Arg Glu Leu His Pro Arg lie 180 185 190 Asn Gin Cys Pro Leu Gly Ala Ala Ala Thr Ala Gly Thr Gly Trp Pro 195 200 205 Leu Asp Arg Asp Arg Thr Ala Ala Leu Leu Gly Phe His Gly Leu Val 210 215 220 Val Asn Ser lie Glu Gly Val Ala Gly Trp Asp His Val Ala Glu Phe 225 230 235 240 Ala Phe Asp Asn Ala Val Phe Leu Ser Gly Leu Ser Arg Leu Ala Ser 245 250 255 Glu lie Gin Leu Trp Ser Thr Asp Glu T^r Gin Met Ala Glu Leu Asp 260 265 270 Ser Ala Phe Ale Gly Thr Ser Ser lie Met Pro Gin Lys Lys Asn Pro 275 280 285 Asp Ser Leu Glu Arg Ser Arg Lys Gly Ala Phe Ala Ala Met Gly Pro 290 295 300 Leu Val Ala lie Leu Thr Ser Leu Asn Gly lie Glu iyr Gin iyr Ser 305 310 315 320 Ala Ala Arg Val Glu Leu Glu Pro Arg Ser lie Asp Ala Leu lie Ala 325 330 335 Ala Thr His Ala Met Thr Gly Val Val Arg Thr Leu His Pro Asn Lys 340 345 350 Glu Gin Asp Ala (¾¾ Ala Met Arg Gin Glu Asn Tyr Ala Thr Met Thr 355 360 365 Asp Leu Thr Asp Leu Leu Val Arg Arg lie Gly lie Asp Tyr Arg Glu 370 375 380 Ala His Glu lie Val Ala Arg Val Val Met Thr Ala lie Glu Arg Gly 385 390 395 400 lie Lys Ala Asn Ala lie Gly Leu Asp Leu Val Gin Glu Ala Ala Val 405 410 415 .I Ala GJLn Thr Gly Asn Arg lie Glu lie Gly Ala Ala Asp lie Ala Asp ! 420 425 430 ： Ala Leu Asp Pro Val Gin Asn Val Ala Arg Arg Lys Gly Arg Gly Met 435 440 445 ,； ^-20- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） (請先閱讀背面之事項本頁} •裝·

、1T 505695 A 7 B7 五、發明説明w )

Pro Ala Pro Glu Ser Val Arg Ala Ala lie Ala Glu Ala Arg Gin Glu 450 455 460

Leu Asp Ala Asp Lys Ala Trp Leu Glu Asp Arg Arg Ala Gly Leu Ala 465 470 475 480

Asp Ala Asp Ala Ala Leu Glu Glu Ala Val Ala Gly He Thr Thr 485 490 495 (2)序列ID號碼·· 2 : (i)序列特徵： (A) 長度：1922鹼基數 (B) 型：核酸 (C) 股：雙 (D) 拓蹼：直鏈 ⑼分子型：DN A (基因型） (vi)來源： (A) 微生物：短無胞菌(Brevundimonas sp·) (B) 菌株：TN-3 (ix)特點：

(A) 名 / 鍵·· CDS (B) 位罝：176..1660 (xi)序列説明：序列ID號碼·· 2 : GGATCCTCAT CAGOGAGOGC TTTCOCTCOG GCACCOCTAT TCIGCTGGAA GTCCIGCACA 60 * GCAACCCCAA T3GCCECACC TIOQGGAGC GGATQQG3IT OGACCCCTAC GOGCTCTATC 120 TOGAGOGGOG OGCOGGCCCC CTCACCDGAC CCTCAGAOGA CTAG^GAAGA AOGOG ATG 178 他t 1 ! ACC COG CAT MC CCA GAT GCC ACC OCT ATC GGC CGT GCC MG OGC GOG 226 !

Thr Pro His Asn Pro Asp Ala Thr Arg lie Gly Arg Ala Lys Arg Ala 5 10 15 A^GQGOTGGAATTCCAGGAACIX：TATGACTlCGAAGCAGOGGCACTC 274

Lys Ala Pro Glu Phe Gin Glu Leu Tyr Asp Phe Glu Ala Ala Ala Leu 20 25 30 21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（ ^ΙΟΧ〕97公釐）

(請先閱讀背面之注意事項V -裝-- Γ本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 505695 A7 B7 五、發明説明（19 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ACX： CIG A03 GCC GTC TIT CCT TAC GAC AGC AAG ATT CAT OCT GCT 322 Thr Leu Thr Ser Ala Val Phe Pro Tyr Asp Sei: Lys lie His Arg Ala 35 40 45 CAC GIC GIC ATG CIG GCT GAA GAC ATC CIG ACX： OQG GAC GAG GCT 370 His Val Val Met Leu Ala Glu Gin Asp lie Leu Thr Arg Asp Glu Ala 50 55 60 65 GCC AGC ATC CTG MC GG3 CTG GCC MG GGG GAT GAA CTG GOG GGA AAG 418 Ala Ser lie Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ala Asp Glu Leu Ala Gly Lys 70 75 80 GAC GOT GQ3 CTG CGC A(X TAC CTX3 CCC TAT GAG GCC GOG CIG AAA CDGC 466 Asp Ala Ala Leu Arg Thr Tyr Leu Pro iyr Glu Ala Ala Leu Lys Arg 85 90 95 、G^GATCGGCTCCGITGCCGQGMGATGCATATCGGG(]GCAGTGCC MC 514 Glu lie Gly Ser Val Ala Gly Lys Met His lie Gly Arg Ser Ala Asn 100 105 110 GAC CTC OGC MT CGG GTA MC GCA TC^ TCC TCC GIG ACA GCT CIG OGC 562 Asp Leu Arg Asn Arg Val Asn Ala Cys Ser Cys Val Thr Ala Leu Arg 115 120 125 A(XGTCGAGGCTGIGATCGCATIGCGCGAGGCAGrCGrGACCAA3GCC 610 Thr Val Glu Ala Val lie Ala Leu Arg Glu Ala Val Val Thr Lys Ala 130 135 140 145 GCC GAC CAT CTC GAC AOG GIG ATS CTC CTC TAC ACC CAG OGC AAG G^G 658 Ala Asp His Leu Asp Thr Val Met Val Val Tyr Thr Gin Arg Lys Glu 150 155 160 GCC CAG CCDG ATC AOG CTC GGC CAT TAC CTA AIG GOG ATC AGC GAA AAT 706 Ala Gin Pro lie Thr Leu Gly His Tyr Leu Met Ala lie Ser Glu Asn 165 170 175 CIG GGC AAG MC GCC OGC TAT OGC GAG CTC CAT (XG OGC ATC AAC 754 Leu Gly Lys Asn Leu Ala Arg Tyr Arg Glu Leu His Pro Arg He Asn 180 185 190 CAATCTCCCCTCGGCGCCGCrGCCAOGGOGQGCAOGGGCTGGCOGCTG 802 Gin Cys Pro Leu Gly Ala Ala Ala Thr Ala Gly Thr Gly Trp Pro Leu 195 200 205 GAT OGC GAC OGC ACC GCA GCA CTG CIG GOT TTC CAC QQG CTC CTC CTC 850 Asp Arg Asp Arg Thr Ala Ala Leu Leu Gly Phe His Gly Leu Val Val 210 215 220 225 MCAGCATCGAGGGCGrGGCCGGCTOGGACCACGTCGOGGAATTCGCX： 898 Asn Ser He Glu Gly Val Ala Gly Trp Asp His Val Ala Glu Phe Ala 230 235 240 TrcGACMTGCCGTCTrcCIGAGCGXCrcAGCOGCCTCGCrTCCGAG 946 Phe Asp Asn Ala Val Phe Leu Ser Gly Leu Ser Arg Leu Ala Ser Glu 245 250 255 ATC CAG CTC TGG AGC AOG GAC GAG TAT CAG ATG GOG GAA CTC GAC TCC 994 lie Gin I^u Trp Ser Thr Asp Glu Tyr Gin Met Ala Glu Leu Asp Ser 260 265 270 '-22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（r'210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項真本頁) -5-¾ 505695 A 7 B7 五、發明説明（20 ) GCC TTC GCC GGC ACC AGC AGC ATC ATG COG CAG AAG MA MC COG GAT Ala Phe Ala Gly Thr Ser Ser He Met Pro Gin Lys Lys Asn Pro Asp 275 280 285 1042 TOTCIGGAGa^AGCQQGAAAGGCGCCTrCGOGGOGATG Ser Leu Glu Arg Ser Arg Lys Gly Ala Phe Ala Ala Met 290 295 300 GGG Gly 1090

Pro Leu 305 GTC GCC ATC CTC ACC TCT CTC MT GCT ATC GAG TAC CAG TAC AGC GCC Val Ala lie Leu Thr Ser Leu Asn Gly lie Glu Gin iyr Ser Ala 310 315 320 GCC^GTCGAGCTCGAACaSOGATCCATCGATGOGCrGATCGOSGCC Ala Arg Val Glu Leu Glu Pro Arg Ser lie Asp Ala Leu lie Ala Ala 1138 1186 325 330 335 ACC CAC GOG ATG AOG GGC GIC GIG CX9G AQG CIT CAT CCC MC AAG GAG Thr His Ala Met Thr Gly Val Val Arg Thr Leu His Pro Asn Lys Glu 340 345 350 CAA GAT GCT TGC GCT AIG COG CAA GAG MC TAC GCC ACC ATG ACC GAC Gin Asp Ala Cys Ala Met Arg Gin Glu Asn Tyr Ala Thr Met Thr Asp 355 360 365 1234 1282 -----------批衣—— (請先閱讀背面之注意事項本頁) GGC Gly CIG ACC GAC CIG CTC C Leu Thr Asp Leu Leu Val Arg Arg lie Gly lie Asp Tyr Arg Glu Ala 370 375 380 385 1330 CAT GAG ATC GTG GOG CGC GIG GIG ATG AOG GOG ATC His Glu He Val Ala Arg Val Val Met Thr Ala lie 390 395 GAG GGC GGC ATC Glu

Arg Gly lie 400 MGGCCMCGCCATCGGACIGGACCrCGIGCAGCaGGCCGGGGrCGOG Lys Ala Asn Ala lie Gly Leu Asp Leu Val Gin Glu Ala Ala Val Ala 405 410 415 ^ AOG GGC MC OGG ATC GAG ATC GOT GOG QX GAC ATC GCC GAT GOG Gin Thr Gly Asn Arg lie Glu lie Gly Ala Ala Asp lie Ala Asp Ala 420 425 430 1378 1426 1474

CTC GAT

MC

OCT OGC AAG AGG GGC ATG CCC Leu Asp Pro Val Gin Asn Val Ala Arg Arg Lys Gly Arg Gly Met Pro 1522 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 435 440 445 GOGCCCGAATCCGTCAQGGCCGCCATCGOGGAGGOGOCTCAGGAATIG Ala Pro Glu Ser Val Arg Ala Ala lie Ala Glu Ala Arg Gin Glu Leu 450 455 460 465 GAC GCC GAC GCC TOG CTA G^G GAC COG OGC GCC GGG CTG GCC GAT Asp Ala Asp Lys Ala Trp Leu Glu Asp Arg Arg Ala Gly Leu Ala Asp 470 475 480 GC3G GAT GO； GOG CIG GAG GAG GOG GIG GCC GGC ATC AOG ACC Ala Asp Ala Ala Leu Glu Glu Ala Val Ala Gly lie Thr Thr 485 490 495 1570 1618 1660 23 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（/2丨0>< 297公釐） 505695 A7 ______Β7 五、發明説明（21 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 _ TCAGGCCTGC TGCCTCCCIG COGAAAATCT C3GACTOGTGG TTCAAAAAAG AGGGGATAGC 1720 CATGAOGAAG AOGGITmT TCTATCIGCT GAC3GATGACT GC0GGO3XA TG^GQQGCIT 1780 GACQGGAGOG GOGCATQGCC AAGCCATCAC OOTCCQGCC GCXCTGAAGG AAAAAGGOGA 1840 GnOCTCTC GGOC?TCAAAT GCGACAOGCC GCCTGCCQGr TTCCTOGAOG AAAAQQCTM 1900 GCCCACOGGC ATOGATATOG AT 1922 (2)序列ID號碼：3 : (i)序列特徵： (A) 長度：1488鹼基教 (B) 型：核酸 (C) 股··雙 (D) 拓蹼：直鏈 ⑼分子型：DNA (墓因型） (vi)來源： (A) 微生物··短無胞菌(Brevundimonas sp) (B) 菌株：TN-3 (ix)特點： (A) 名 / 键：CDS (B) 位罝：1..1488 —眺序ϋ説明：序列ID號瑪：3 : AIG A(X 〇]G ώτ MC (XA GAT GCC ACC α?Γ ATC QGC OCT GCC AAG C3GC 48 _ Met Thr Pro His Asn Pro Asp Ala Thr Arg lie Gly Arg Ala Lys Arg 1 5 10 15 GOGAMGOGa^GAATTCCaGGAA CTC TAT GAC TTC GAA GCA GOG GCA 96 Ala Lys Ala Pro Glu Phe Gin Glu Leu Tyr Asp Phe Glu Ala Ala Ala 20 25 30 CTC A(X CTC AOG AGC GCC GTC TIT CCT TAC GAC AGC AAG ΑΊΤ CAT (DCT 144 Leu Ihr Leu Thr Ser Ala Val Phe Pro Tyr Asp Ser Lys lie His Arg 35 40 45 GCT CAC GTC GTC ATG CIG GCT GM CM GAC ATC CIG ACC OQG GAC GAG 192 Ala His Val Val Met Leu Ala Glu Gin Asp lie Leu Thr Arg Asp Glu 50 55 60 _ '24- 本紙張尺度適用巾酬家鮮（CNS ) Λ4規格（；1GX 297公f ) 一 ~ ~~ r (請先閱讀背面之注意裏再頁) -裝‘ 訂 .1 丨 505695 A7 B7 五、發明説明F ) GCT GCC AGC ATC CIG AAC GGG CIG GCC AAG GOG GAT GAA CTG GCG GGA 240

Ala Ala Ser lie Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ala Asp Glu Leu Ala Gly 65 70 75 80 MG GAC GOG GOG CIG OGC ACC TAC CTG CCC TAT GAG GCC GOG CTG MA 288

Lys Asp Ala Ala Leu Arg Thr Tyr Leu Pro Tyr GJLu Ala Ala Leu Lys 85 90 95 OGC GAG ATC GGC TCC GTT GCC GGG AAG ATG CAT ATC GGG GGC ACT GCC 336

Arg Glu lie Gly Ser Val Ala Gly Lys Met His lie Gly Arg Ser Ala 100 105 110 MC GAC CTC OGC MT OQG CTA MC GCA TCT TCC TGC GIG ACA GCT CTG 384

Asn Asp Leu Arg Asn Arg Val Asn Ala Cys Ser Cys Val Thr Ala Leu 115 120 125 aXACCGTCG^GCrGIGATCGCATTGOGCGAGGCAGrCGIGACCAAG 432

Arg Thr Val Glu Ala Val lie Ala Leu Arg Glu Ala Val Val Thr Lys 130 135 140 GCC GCC GAC CAT CTC GAC AOG GIG ATG GTC GTC TAC ACC CAG OGC AAG 480

Ala Ala Asp His Leu Asp Thr Val Met VaJL Val lyr Thr Gin Arg Lys 145 150 155 160 GAG GCC OVG COG ATC AOG CTC GGC CAT TAC CTA ATG GOG ATC AGC GAA 528

Glu Ala Gin Pro lie Thr Leu Gly His Tyr Leu Met Ala IJLe Ser Glu 165 170 175 MT CTG GGC AAG MC CTC GCC OGC TAT OGC GAG CTC CAT COG OGC ATC 576

Asn Leu Gly Lys Asn Leu Ala Arg iyr Arg Glu Leu His Pro Arg lie 180 185 190 MCCAATCTCCCCrCGGCGCCGCTGCCAOGGOGGGCAOGQGCTGGCXDG 624

Asn Gin Cys Pro Leu Gly Ala Ala Ala Thr Ala Gly Thr Gly Trp Pro 195 200 205 CIG GAT OGC GAC OGC ACC GCA GCA CTG CTG GCT TIC CAC GGG CTC GTC 672 I^u Asp Arg Asp Arg Thr Ala Ala Leu Leu Gly Phe His Gly Leu Val 210 215 220 GTC MC AGC ATC GAG GGC GIG GCC GGC TGG GAC CAC GTC GOG GAA TIC 720

Val Asn Ser lie Glu Gly Val Ala Gly Trp Asp His Val Ala Glu Phe 225 230 235 240 GCCTrCGACMTGCCCTCTrCCTGAGCGGCCTCAGCOGCCTGGCTTCC 768 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Ala Phe Asp Asn Ala Val Phe Lsu Ser Gly Leu Ser Arg Leu Ala Ser 245 250 255 ATC CAG CTC TGG AGC AOG GAC GAG TAT OG AIG GOG GAA CTC GAC 816

Glu lie Gin Leu Trp Ser Thr Asp Glu Tyr Gin Met Ala Glu Leu Asp 260 265 270 TCC GCC TTC GCC GGC A(X AGC AX ATC ATG (XG CAG AAG AAA MC COG 864

Ser Ala Phe Ala Gly Thr Ser Ser He Met Pro Gin Lys Lys Asn Pro 275 280 285 GATTOGCIGG^OGCAGCO^AMGGCGCCTrCGOGGOGATGGGGCOG 912 Asp Ser I^u Glu Arg Ser Arg Lys Gly Ala Phe Ala Ala Met Gly Pro 290 295 300 CIG GTC GCC ATC CIX： ACC TCT CTC MT GCT ATC GAG TAC CAG TAC AGC 960

Leu Val Ala lie Leu Thr Ser Leu Asn Gly lie Glu Tyr Gin Tyr Ser 305 310 315 320 /-25- — - _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格/ 210X 297公釐） 505695 A7 B7 五、發明説明（23 ) GCCGCCAQGGTCGAGCrCGAACOGOGATCCATCGATGOGCTCATCGOG 1008 .Ala Ala Arg Val Glu Leu Glu Pro Arg Ser lie Asp Ala Leu lie Ala 325 330 335 GCC ACC GOG AIG AOG GGC GTC GIG OGG ACG CIT CAT CCC AAC 1056

Ala Thr His Ala Met Ihr Gly Val Val Arg Thr Leu His Pro Asn Lys 340 345 350 GAG CM GAT GCT TGC GCT ATG OQG CAA GAG MC TAC GCC ACC ATG ACC 1104

Glu Gin Asp Ala Cys Ala Met Arg Gin Glu Asn Tyr Ala Thr Met Thr 355 360 365 GAC CTG ACC GAC CIG CTC GTC OCT OGC ATC GGC ATC GAC TAT OGC (»S 1152

Asp Leu Thr Asp Leu Leu Val Arg Arg lie Gly lie Asp Tyr Arg Glu 370 375 380 GCC CAT GAG ATC GTCQDGOGCGIGGrGATGAOGGOGATCGAGCDGCGGC 1200

Ala His Glu lie Val Ala Arg Val Val Met Thr Ala lie Glu Arg Gly 385 390 395 400 ATC AA3 GCC MC GTC ATC GGA CTG GAC CTC GIG CPG GAG GCC GOG GTC 1248 lie Lys Ala Asn Ala lie Gly Leu Asp Leu Val Gin Glu Ala Ala Val 405 410 415 GQ5 ACX3 GGC AAC OGG ATC GAG ATC GCT GOG GCC GAC ATC GCC GAT 1296

Ala Gin Thr Gly Asn Arg lie Glu He Gly Ala Ala Asp lie Ala Asp 420 425 430 GOGCTCGATCOGGITC»GAACGrCGCCOSr〇GCAAGGGCAGGGGCATG 1344

Ala Leu Asp Pro Val Gin Asn Val Ala Arg Arg Lys Gly Arg Gly Met 435 440 445 CCCGOGCCCGAATCCGrCAQGGCCGCCATCGOGGAGGOGOCTCAGGAA 1392

Pro Ala Pro Glu Ser Val Arg Ala Ala lie Ala Glu Ala Arg Gin Glu 450 455 460 TIGGACGCCGACAAGGCClX^CrAGPGGACaSGCGCGCCGQGCIGGCC 1440

Leu Asp Ala Asp Lys Ala Trp Leu Glu Asp Arg Arg Ala Gly Leu Ala 465 470 475 480 GAT GGG GAT GOG GOG CIG G?yG GftG GOG GIG GCC GGC ATC AOG A(X TGA 1488 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

Asp Ala Asp Ala Ala Leu Glu Glu Ala Val Ala Gly He Thr Thr 485 490 495 (2)序列ID號碼：4 : (i)序列特徵： (A)長度：23鹼基數 -26- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 〇X 297公釐） 505695 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（24 ) * (B) 型：核酸 (C) 股:單 (D) 拓鎮：直鏈 ⑼分子型：其他核酸 (A) 說明：/desc = ” 合成 DNA ” (ix)特點： 位罝：6 (D)其他資料：N =飢胺酸或A，C，G及T之任一個 (ix)特點： (B) 位罝：9 (D)其他資料：N =肌胺釀或A，C，G及T之任一個 (ix)特點： (B)位罝：18 (D)其他資料：N =肌胺酸或A，C，G及T之任一個 (xi)序列説明：序列ID號碼：4 : -二-, ___ _ . — _—— - — ' - - ATGACNCCNC ΑΥΜΥ(ΧΝ3Λ YGC 23 (2)序列ID號碼：5 ·· (i)序列特徵： (A) 長度：34驗基數 (B) 型··核酸 (C) 股：單 (D) 拓蹼：直鏈 ⑻分予型：其他核酸I、27 - (請先閱讀背面之注事項再6本頁) -裝· 線r 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（？10X 297公釐） f 505695 A7 B7 五、發明説明（25 ) - (A) 説明：/desc = ” 合成-DNA” (ix)特點： (B) 位直：14 (D)其他資料：N =肌胺酸或A，C，G及T之任一個 (ix)特點： (B)位罝：17 (D)其他資料：N二肌胺酸或A，C，G及T之任一個 (ix)特點： (B)位罝：23 (D)其他货料：N二肌胺酸或A，C，G及T之任一個 (ix)特點： (B)位罝：26 (D)其他資料：N二肌胺酸或A，C，G及T之任一個 (xi)序列説明：序列ID號碼：5 : CCDATYTCAT YTTNCCNGCR ACNGANCCDA TYTC 34 (請先閲讀背面之注意事項再m*本頁) •裝. 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 28 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（：21〇X 297公釐）

Claims (1)

1. 505695 A8 第86117867號專利申請案 g 中文申請專利範圍修f木（_9Q卑-K)职.漂

   1J範圍 告本 種含有將具有乙二胺-N，Ν’ -二琥珀酸 乙二胺裂解 酶活性之多肽編碼的鹼基序列之DNA，其中編碼該多肽 之鹼基序列為有如序列2所示鹼基序列： 序列I D號碼：2 : (aSStcrCAT C^CGAGOGC TTpXTCCG dCACCCCTAT TCTGCrGGM CTCCTCCACA 60 GCMCCCCAA TQGCOGCACC TTCTGC33AGC 03ΑΊΧΏ33ΓΙ a^CCCCTAC GCGCTCTATC 120 T0GAGO3G0G OGCCmXCC (^CACCTGkC CCTCAGACGA AOGCG ATC 178 . 1 ACC CCG CAT MC CX^ GAT GCC ACC (CT ATC OX OCT GCC AAG CX3C GCG 226 Thr Pro His Asn Pro Asp Ala Thr Arg He Gly Arg Ala Lys Arg Ala 5 10 15 AA3 GCG CCG GM TTC CAG GAA CTC TAT GAC TTC GAA GCA G03 GCA CrC 274 Lys Ala Pro Glu Phe Gin Glu Leu Tyr*Asp Phe Glu Ala Ala Ala Leu 20 25 30 TCIG AOG GOC ^ ΪΓΓ CCT TAC GAC A3C GCT 322 Thr Leu Thr Sei: Ala Val Phe Pro Tyr Asp Ser Lys lie His Arg Ala 35 40 45 CAC GIX： GTC ATG CIG GCT GAA GAC ATC CIG ACC 09G GAC G^G GCT 370 His Val Val Met Leu Ala Glu Gin Asp lie Leu Thr Arg Asp Glu Ala 50 55 60 65 GCC MC ATC CTG AAC GGG CIG &C AAG GOG GAT GAA CTC GCG G® AAG 418 Ala Ser lie Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ala Asp Glu Leu Ala Gly Lys . 70 75 80 GAC GCG GOG CTG OGC ACC TAC CTG CCC TAT GCC GOG CIG MA OGC \ 466 Asp Ala Ala Leu Arg Thr Tyr Leu Pro Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Arg 85 90 95 G^G ATC QGG TCC GIT GCC G3G AA3 ATG CAT ATC QGG CGC GCC AAC 514 Glu lie Gly Ser Val Ala Gly Lys His lie Gly Arg Ser Ala、Asn 100 105 110 GAC CIC OGC MT OGG GTA AAC GCA TCT TCC TCC GTG ACA GCT CIG OGC 562 Asp Leu Arg Asn Arg Val Asn Ala. Cys Ser Cys Val Thr Ala Leu Arg 115 120 125 ACCGTCGAGGCrGTGATCGCATrG9GCG^i3GCAGrCGIGACCA^；GCC 610 Thr Val Glu Ala Val lie Ma Leu Arg Glu Ala Val Val Thr Lys Ala 130 · 135 140 145 GCC GAC CAT CTC GAC AOG GTG ATG GTC GTC TAC ACC CGC G^G 658 Ala Asp His Leu Asp Thr Val Met Val Val Tyr Thr Gin Arg Lys Glu 150 155 160 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐） 505695 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 GCC CAG COG ATC AOG CTC GGC CAT TAC CTA ATG GOG ATC AGC GAA AAT Ala Gin Pro lie Thr Leu Gly His Tyr Leu i6et Ala lie Ser Glu Asn 165 170 175 CIG GGC AAG AAC CTC GCC CGC TAT CGC GAG CTC COG CGC ATC AAC Leu Gly Lys Asn 3Leu Ala Arg Tyr Arg Glu Leu His Pro Arg He Asn 180 185 190 CAA TGTCXCCICGGCGCCGCTGCCAOGGOGGGC ACG. GGC TOG CCG CIG Gin Cys Pro Leu Gly Ala Ala Ala Thr Ala Gly Thr Gly Trp Pro Leu 195 200 205 GAT OGC GAC OX ACC GCA GCA CIG CTG GCT TTC CAC* Q33 C£C GTC GIC ..Asp Arg Asp Arg Thr Ala Ala Leu Leu'Gly Phe His Gly Leu Val Val 210 215 . 220 · 225 AAC ^GC ATC GA3 GGC GIG GCC GGC TGG GAC CAC GTC GOG GAA TTC GCC Asn Ser lie Glu Gly Val Ala Gly Trp Asp His Val Ala Glu Phe Ala 230 235 240 TrCGACAATGCCCTCTrCCIG^GCGGCCrCftGCOGCCIGGCTTCCQ^ Phe Asp Asn Ala Val Phe Leu Ser Gly Leu Ser Arg Leu Ala Ser Glu 245 / 250 255 ATC OG CTC TGG ^GC ACG GAC G^G TAT* CPG NIG GOG GAA CK： GAC TCC lie Gin Leu Trp Ser Thr Asp Glu Tyr Gin Met Ala Glu Leu Asp Ser 260 265 270 - · · I ·, —..... ....................... gcc τϊ(Γο^^ζ~Α^~ρσ: ^"atc ϋσϊΓϋ aAa aac cog gat Ala Phe Ala Gly Thr Ser Ser lie tet Pro GJLn Lys Lys Asn Pro Asp 275 280 285 TOSCIGCaSCECAGCCGGMAGGCGCCTrCGOGGOGMGGGGCCGCTG Ser Leu Glu Arg Ser Arg Lys Gly Ala Phe Ala Ala Met Gly Pro Leu 290 , 295.· 300 305 GTC GCC ATC CTC ACC TCT CTC MT GCT ATC G^3 TAC C?G TAC AGC GCC Val Ala lie Leu Thr Ser Leu Asn Gly lie Glu Tyr Gin Tyr Ser Ala 310 315 320 GCC^GGGlCG^OX：GAA(XGOGATCCATCGATGCGCrGATCGCGGCC Ala Arg Val Glu Leu Glu Pro Arg Ser lie Asp Ala Leu lie Ala Ala 325 330 335 r一· ACC CAC ATG AOG GGC GTC GTC C3G3 AOG CIT CAT CCC AAC AA3 Thr His Ala Met Thr Gly Val Val Arg Thr Leu- His Pro Asn Lys'Glu 340 345 350 CAA GAT GCT TGC GCT ATG CGG CAA AAC TAC GCC ACC ATG ACC GAC Gin Asp Ala Cvs Ala Met Arg Gin Glu Asn .Tyr Ala Thr Met Thr Asd 355 ** 360 365 CTC ACT GAC CIG CTC GTC CCT CGC ATC GGC ATC GAC TAT GGC GCC Leu Thr Asp Leu Leu Val Arg Arg lie Gly lie Asp Tyr Arg Glu Ala 370 375 380 385 CAT G^G ATC GIG GCG CGC GTG GIG ATG AOG GOG ATC OGC GGC ATC His Glu lie Val Ala Arg Val Val Met Thr Ala lie Glu Arg Gly lie 390 395 400 -2- 本紙張又度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱) 706 754 802 850 898 946 994 1042 1090 1138 1186 1234 1282 1330 1378 505695 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 GCC MC GCC ATC GGA CIO GAC CTC GIG CAG Lys Ala Asn Ala lie Gly 3Leu Asp Leu Val Gin 405 410 GAG GCC GCG Glu Ala Ala 415 GIC GCG Val Ala ACG GGC AAC CGG ATC ATG GCT GCG GCC GAC ATC GCC Gin Thr Gly Asn Arg lie Glu lie Gly Ala Ala Asp He Ala 420 425 430 GAT G03 Asp Ala CTC GAT COG GIT CAG AAC GTC GCC Leu Asp Pro Val Gin Asn Val Ala 435 440 CGI Arg Arg Lys Gly Arg Gly 445 ATG CCC Pro GCGCCCGAATCCGrC^GGGCCGCCATCGCGQ^GCGCCTa^ Ala Pro Glu Ser Val Arg Ala Ala lie Ala Glu Ala Arg Gin 450 455 460 GAC GCC GAC AA^GCC Ί Asp Ala Asp Lys" Ala Trp Leu 470 CTA GAC CX3G OGC GCC GGG CTG Glu Asp Arg Arg Ala Gly Leu 475 GAA TIG Glu Leu 465 GCC GAT Ala Asp 480 GCGGATGOGGOSCIGG^GG^GGOG Ala Asp Ala Ala Leu Glu Glu Ala 485 490 GIG GCC GGC ATC AOG ACC Val AJLa Gly lie Thr Thr COGAAAATCT OGACTOGTQG CAIGAOSA^G ACGGITTITT TCTATCTGCT GAOSATGACr GACCGGAGOG GCGCATGGCC AAGCaTCAC GITGOCTCTC GGOCTCAMT GCGACAOGCC GCCCACOQGC ATCGATATQG AT

   AAAAAGG03A TTCCra^OG AAAAGGGTAA 495

   1426 1474 1522 1570 1618 1660 17¾ 1780 1840 1900 1922 2 · —種製造二胺亞烷基-N，N ’ -二琥珀酸之方法，係使用 JM109/pEDS020(CCRC940188)轉形宿主。 -3- 本紙張尺度適用中国國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝 m