TW496958B - Method and apparatus for laser cutting of microscopic specimens - Google Patents

Description

496958 五、發明説明（ 1) 詳 細 說 明 發 明 背 景 發 明 領 域 本 發 明 係 關 於 一 種 用 於雷 射 切割微小樣本之方法。 本 發 明 也 關 於 一 種 用 於雷 射 切割微小樣之裝置，該裝 置 係 包 括 :顯微鏡，係含有至少- -個用於觀測待切割樣 本 的 物 鏡 Μ 物 鑲 會 定 主 我 :出光 ；軸 1及物鏡孔徑；雷射，係用 於 產 生 雷 射 光 束 、及 、至少一 ‘個 1光學系統，係用於使雷 射 光 束 親 合 於 物 鏡 之 內 〇 相 關 技 術 說 明 長 久 以 來 對 諸 如 癌 症 之類 的 疾病的辨認係藉由執行 組 織 樣 本 之 切 片 以 辨 認 出不 正 常的細胞。藉由微切割 或 其 他 實 驗 方 法 依 手 動 或機 械 方式隔離出待檢驗的細 胞 〇 未 審 定 專 利 甲 Ξ主 δ円 案 第 DE 1 96 1 6 2 1 6.5號文件說明了 — 種 這 類 方 法 亦 即 所 三田 明 雷射 壓 力射出（LPC)方法，其係 藉 由 雷 射 從 裝 設 於 透 明 樣本 玻 片上的樣本切出樣本片 段 〇 以 這 種 方 法 ，藉由 1誘發式 :雷 ’射處理法完成從完整樣 本 移 除 所 切 出 樣 本 片 段 的作 業 。爲了這個目的，藉由支 持 臂 引 導 其 內 側 表 面 塗 覆有 黏 著劑的收集裝置使之越 過 切 出 樣 本 片 段 〇 妖 J \ \\ 後 使這 樣 樣本片段曝露在具有適 當 輸 出 之 二 維 雷 射 的 撞 擊作 用 下，結果從完整樣本中向 上 射 出 所 切 出 的 樣 本 片 段。 由 收集裝置上塗覆有黏著 劑 的 內 側 表 面 截 住 依 這 種方 -3 式 卸下的樣本片段，然後能 496958 五、發明説明（2) 夠將之送出以接受額外的檢驗。用來射出樣本片段的 雷射脈波可能對組織造成破壞。另外，能夠使因切割處 理從切割線卸下的樣本粒子澱積到待檢驗的樣本區域 之上。在使用倒置顯微鏡時特別會發生這樣問題。 於來自實際應用的已知系統中，能夠藉由修正雷射強 度及其聚焦位置而調整雷射的切割品質。於這類已知 系統中，係藉由物鏡孔徑定出用於雷射光包的孔徑，因 此該物鏡孔徑必須是儘可能愈大愈好以便得到最高的 影像品質。如同先前的說明，吾人很難以含現有設計的 裝置及方法達成一致的切割品質。切割品質一方面係 取決於標本的聚焦位置及其厚度，另一方面係取決於雷 射強度。後者可能因使用者而改變以便使切割品質最 佳化。 發之扼要說明 從這種現有習知技術出發，本發明的目的是建造一種 用於雷射切割微小樣本之裝置，其方式是保證在樣本之 寬廣波譜下都具有大槪一致的切割品質。 根據本發明，此目的係藉由提供有能夠產生經攔阻雷 射光束之光闌並由比物鏡孔徑更小之物鏡產生雷射孔 徑的事實達成的。 本發明的另一目的是揭示一種用於雷射切割微小樣 本之方法，以便能夠在樣本之寬廣波譜下都具有大槪一 致的切割品質。 此目的係藉由一種包括下列步驟的方法達成的： -4- 496958 五、發明説明（3) a) 將含有待檢驗樣本的樣本玻片引進包括至少一個 物鏡的顯微鏡之內； b) 以物鏡確定出樣本上將要切出的區域； c) 定義出圍繞該區域的切割線； d) 藉由光闌產生經攔阻雷射光束，以致減小其直徑其 方式是由比物鏡本身之物鏡孔徑更小之物鏡產生雷射 孔徑；以及 e) 沿著所定義出的切割線切割樣本。 本發明的一個優點是雷射光錐會因爲減小了雷射孔 徑而變得比較細長，造成場域深度的增加。因爲雷射光 具有較大的場域深度的必然結果，減低了對聚焦準確度 的要求，因此得到了均勻而窄小的切割通路。 根據本發明裝置之實施例的另一個優點是能夠於切 割作業期間維持其物鏡孔徑的尺寸。因此能夠在任何 時刻對樣本施行全物鏡孔徑的觀測。這會確保能夠對 樣本平面作出最佳化定義並確保有最高影像品質以便 對樣本進行評估。需要高達大槪0.8的物鏡孔徑以便 施行具有高細緻度的成像作用並明確地選出各樣本區 域。這自然會需要很淺的場域深度，以致能夠依受控制 方式聚焦於不同的樣本平面上。不過對以雷射光束進 行切割的作業而言，很淺的場域深度是吾人所不想要 的。現在本發明會使相當大的物鏡孔徑與經攔阻電射 光束結合，其方式是由比物鏡本身之物鏡孔徑更小之物 鏡產生其雷射孔徑。吾人能夠在不改變其開口下使用 496958 五、發明説明（4) 該物鏡，以便同時對樣本進行觀測及切割作業。 根據本發明的一實際實施例，光學系統係含有能夠反 射電射光並使之耦合於物鏡之內的雙色分光器，且該分 光器會同時允許落在觀則光束路徑上的光通過目鏡或 照相機。 爲了允許對雷射切割進行監視，特別是依切割品質的 形式，本發明也提出一種可同時藉由影像產生系統（照 相機）進行觀測的雷射切割方法。若在進行影像評估時 發現樣本未因雷射撞擊而完全切穿或其切割幾何形狀 不充分，則吾人能夠藉由電腦對這種雷射切割的同時監 視作出反應，以便調整例如雷射強度及/或雷射光束的 聚焦位置及/或雷射光束內的光闌尺寸之類的單獨系統 參數。這種同時監視作業縮短了整體的切割時間而改 良了其品質。 圖式簡述 本發明的這些及其他特徵及優點將會因爲以下對各 附圖的說明而變得更明顯，其中係藉由實例簡略地描繪 了一種根據本發明用於雷射切割微小樣本之裝置的解 釋用實施例。 第1圖係用以顯示一種用於雷射切割微小樣本之裝 置的示意側視圖； 第2圖顯示的是落在樣本之待切割區域內的光束路 徑；及 第3圖係依圖形方式以雷射光束孔徑的函數繪製出 -6- 496958 五'發明説明（5) 切割寬度。 較佳實施例的詳細說明 如第1圖所示用於雷射切割微小樣本的裝置，係包括 一種配備有用於收納樣本玻片1 0之工作平臺2的顯微 鏡1。待檢驗或待切割樣本係裝設於樣本玻片1 〇上。 同時提供有一種照明系統3以及會產生用來切割樣本 之雷射光束4a的雷射4。 如上所述的顯微鏡1係一種將照明系統3配置於工 作平臺2及樣本1 2以下之顯微鏡架5上的顯微鏡。顯 微鏡1的物鏡6係配置於工作平臺2及樣本1 2之上。 物鏡6會定義出光軸1 4,其中也配置有照明系統3。不 過，吾人也能夠以倒置顯微鏡執行雷射切割，其中則係 將照明系統3配置於工作平臺2之上且將至少一個物 鏡6配置於樣本1 2以下。 於如第1圖所示之解釋用實施例中，經由聚光透鏡7 從底下將發射自照明系統3的光指引到配置於工作平 臺2上的樣本玻片1 0及樣本1 2之上。貫穿到樣本1 2 之內的光會到達顯微鏡1的物鏡6。於顯微鏡1內部， 係經由各透鏡及鏡面（未標示）將光指引到顯微鏡1的 至少一個目鏡8上，使用者能夠透過此目鏡8觀測配置 於工作平臺2上的樣本。 光學系統1 6係提供於顯微鏡架5上物鏡6之光軸 內。該光學系統1 6可能是一種雙色分光器。也能夠想 像該光學系統1 6係包括數個光學元件，這指的是當雷 -7- 五、發明説明（6) 射4必需繞數個角落產生偏轉的例子。同時於雷射光 束4a內提供有光闌丨8，吾人能夠以光闌1 8對應地限制 雷射光束的直徑。吾人能夠將光闌1 8建造成一種固定 的光闌。於追種例子裡係依例如旋轉碟片之類的適當 方式配置有數個固定光闌以便使必要的光闌1 8位移到 光束路徑之內。此位移作業能夠由使用者依手動或是 馬達驅動方式加以執行。於如第1圖所示的實施例中， 係將光闌1 8建造成一種例如膜片光闌之類可經由馬達 2 0控制其直徑的可變光_丨8。馬達2 〇會從電腦2 2接 收必要的控制信號以便設定出必要的光闌直徑。 顯微鏡1也配備有用來記錄待切割樣本1 2之影像的 照相機24。能夠將那個影像顯示於連接於電腦22上 的監視器2 6上。吾人能夠使用由電腦2 2、照相器 24、及監視器26製作的系統以致能夠對藉由雷射4進 行的切割作業施行觀測及監控。另外，能夠在監視器26 上使用滑鼠點選器以便畫出圍繞該待切割樣本1 2的區 域。然後沿著如是標示出的切割線執行切割作業。 第2圖顯示的是落在樣本之待切割區域內的光束路 徑。來自雷射4的雷射光束4 a係因光闌1 8而使其直 徑受到限制。具有較小直徑之經攔阻雷射光束4b會在 光闌18之後冒出。雷射光束4b會遇上建造雙色分光 器的光學系統1 6，且因此透過物鏡6將之指引到待切割 樣本1 2之上。於第2圖中係象徵性地將物鏡6繪製成 透鏡。裝設於樣本玻片1 〇上的樣本1 2係經由聚光透 496958 五、發明説明（7 ) 鏡7受到照明。物鏡6會產生其寬度大於光闌1 8後之 雷射光束4 b寬度的成像光束路徑6 a。 第3圖顯示的是一種比成像光束路徑6 a更窄且比未 經攔阻雷射光束更窄之經攔阻雷射光束4 b ,會塡滿整個 物鏡開口 3 2且能夠定義出最大可能光束截面的優點。 樣本1 2具有可#大於所用物鏡6場域丨朵度的寬度 3 〇。使用者能夠聚焦在樣本1 2內的不同平面上以便找 出與進一步檢驗相關的點。 若以未經攔阻且其截面係對應到物鏡6之物鏡開口 3 2的雷射光束切割樣本1 2，物鏡6會產生等於物鏡孔 徑3 4的最大雷射孔徑。所產生的最大雷射孔徑會於樣 本12內產生具有寬度34a的最大切割通路34b。 不過，若根據本發明以經攔阻的雷射光束切割樣本 1 2，則藉由物鏡6產生了經攔阻雷射光束並於樣本1 2 內產生具有寬度3 6 a的已減小切割通路3 6 b。使用直 徑愈小之切割用雷射光束，則能夠執行愈準確的切割作 業。 在觀測光束路徑外側將光闌1 8配置於光學系統1 6 之前以限制其雷射光束截面的事實，會確保能夠切割作 業期間用於觀看樣本1 2之物鏡6場域深度維持不變， 無論所設定的雷射孔徑爲何。因此即使於切割作業期 間也能夠保持其影像品質。 爲了進一步使切割品質最佳化，必需使用來限制雷射 光束的光闌1 8順應待切割樣本1 2的厚度3 〇。第一種 -9- 496958 五、發明説明（8 ) 可能性從查閱表（未標示）定出施行最佳化切割所需要 的光闌8 .然後由使用者依手動方式設定出光闌。 於另一種解釋用實施例中，能夠藉由電腦2 2由查閱 表（未標示）確定施行最佳化切割所需要的光闌1 8。然 後藉由電腦2 2自動地設定出光闌1 8爲了這個目的，從 電腦2 2將會導致對光闌丨8進行調整之對應信送到馬 達20上。 另一種使切割作業最佳化的可能性，係經由影像分銜 系統（未標示）將電腦22連接到顯微鏡1上，其方式是將 例如雷射強度、雷射光束的聚焦位置、及雷射光束內 的光闌尺寸之類單獨系統參數自動地設定爲最佳化數 値。吾人也能夠於切割作業期間自動地修正各設定値 以便將樣本1 2厚度上的任何起伏列入考量。 本發明係參照各解釋用實施例加以說明的。然而任 何熟悉習知設計的人都能夠在不偏離本發明所附申請 專利範圍之精神及架構下作各種改變及修正。 符號說明 1 ...顯微鏡 2…工作平臺 3··.照明系統 4…雷射 4a··.雷射光束 4b·..經攔阻雷射光束 5…顯微鏡架 -10- ' — 496958 五、發明説明（9 ) 6 ...物鏡 6a...成像光束路徑 7 ...聚光透鏡 8 ...目鏡 1 0 ...樣本玻片 1 2 ...樣本 1 4 ...光軸 1 6 ...光學系統 1 8 ...光闌 2 0 ...馬達 22.. .電腦 2 4...照相機 26.. .監視器 30.. .樣本厚度 3 2 ...物鏡開口 34.. .物鏡孔徑 34a...最大切割通路寬路 34b...最大切割通路 36…雷射孔徑 3 6a...已減小切割通路寬度 36b...已減小切割通路 -11-

Claims (1)

1. 496958 六、申請專利範圍 1 _ 一種用於雷射切割微小樣本之方法，其特徵爲具有下 列步驟： a) 將含有待檢驗樣本（12)的樣本玻片（10)引進包括 至少一個物鏡（6)的顯微鏡（1)之內； b) 以物鏡（6)確定出樣本（12)上將要切出的區域； c) 定義出圍繞該區域的切割線； d) 藉由光闌（18)產生經攔阻雷射（4b)，以致減小其 直徑其方式是由比物鏡（6)本身之物鏡孔徑（34)更小 之物鏡（6)產生電射孔徑（3 6);以及 e) 沿著所定義出的切割線切割樣本（1 2)。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中能夠使用滑鼠游 標以便畫出圍繞該待切割樣本（12)的區域，在監視器 (26)上所顯示之樣本（12)影像上定義出切割線。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中能夠以照相機（24) 對藉由雷射（4)進行的切割作業施行觀測及監控。 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中從表中確定需要 光闌（1 8)以便施行最佳化切割；且使用者係藉由手動 方式設定出該光闌（18)。 5. 如申請專利範圍第3項之方法，其中將含有影像分析 系統的電腦（2 2)連接到顯微鏡（1)上，其方式是將例 如雷射強度、雷射光束的聚焦位置、及雷射光束內 的光闌（18)尺寸之類單獨系統參數自動地設定爲最 佳化數値。 6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中藉由電腦（22)從 -12- 496958 六、申請專利範圍 所儲存的表中確定需要光闌（1 8)以便施行最佳化切 割；且由電腦（22)利用馬達（20)自動地完成該光闌（18) 的設定。 7. —種用於電射切割微小樣本之裝置，其包括： 顯微鏡（1)，係含有至少一個用於觀測待切割樣本 (12)的物鏡（6)，該物鏡（6)會定義出光軸（14)及物鏡孔 徑（34); 雷射（4)，係用來產生雷射光束（4a);以及 至少一個光學系統（16),係用來使雷射光束（4a)耦 合於物鏡之內； 其特徵爲 提供有能夠產生經攔阻雷射光束（4b)之光闌（18)， 並由比物鏡（6)本身之物鏡孔徑（34)更小之物鏡（6)產 生雷射孔徑（36)。 8. 如申請專利範圍第7項之裝置，其中能夠利用可變光 闌（18)修正雷射光束（4a)直徑的尺寸。 9. 如申請專利範圍第7項之裝置，其中提供有用來照射 樣本（12)的照明系統（3)。 10. 如申請專利範圍第9項之裝置，其中照明系統（3)會 照穿樣本（1 2)。 Π .如申請專利範圍第7項之裝置，其中該光學系統（1 6) 包括至少一個雙色分光器 12.如申請專利範圍第7項之裝置，其中能夠以照相機 (24)對藉由雷射（4)進行的切割作業施行觀測及監 -13- 496958 六、申請專利範圍 控。 ▲ 1 3 ·如申g靑專利軔圍第丨2項之裝置，其中從表中確定需 定光闌（1 8)以便施行最佳化切割；且使用者係藉由手 動方式設定出該光闌（18)。 14·如申請專利範圍第12項之裝置，其中將含有影像分 析系統的電腦（22)連接到顯微鏡（1)上，其方式是將 例如雷射強度、雷射光束的聚焦位置，及雷射光束內 的光闌（1 8)尺寸之類單獨系統參數自動地設定爲最 · 佳化數値。 15.如申請專利範圍第14項之裝置，其中藉由電腦（22) 從所儲存的表中確定需要光闌（18)以便施行最佳化 - 切割；且由電腦（2 2)利用馬達（2 〇)自動地完成該光闌 (18)的設定。 -14-