JP7179894B2 - Ｔｉｒｆｍ対応顕微鏡、及びｔｉｒｆｍ対応顕微鏡の動作方法 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

［説明］
本発明は、ＴＩＲＦＭ対応顕微鏡、及びＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の動作方法に関する。
全反射蛍光顕微鏡法（ＴＩＲＦＭ）、つまりＴＩＲＦ照明を用いる顕微鏡法は、エバネッセント場を用いて試料またはサンプルの蛍光の励起を引き起こす。エバネッセント場を生成するために、光はサンプルとの界面にて反射要素、例えばカバーガラスの内側で全反射する。このことは、界面の法線から算出される入射角Θ_１の角度が、臨界角

を超えるとき、より低い屈折率ｎ_２の媒体との界面に浅い角度で入射する、より高い屈折率ｎ_１の媒体内の光は全反射するという事実を利用している。
これにより、光線場が界面を越えてガラス上のサンプル内に形成され、この光線場は、可視光の標準的なしみ出し深さ１００～２００ｎｍを有し、界面と垂直に指数関数的に減衰する。放射波長の光を吸収可能な蛍光分子がこの領域に位置する場合に、それらは励起され、蛍光を放射する。このような蛍光は、全反射蛍光（ＴＩＲＦ）として周知である。ＴＩＲＦは、生成される蛍光のガラス近傍の領域への非常に良好な制限を引き起こし、観測される層は、わずかに１００～２００ｎｍの薄さである。このことは、通常の蛍光顕微鏡法または、共焦点顕微鏡法の場合よりも光学軸に沿った大幅に良好な分解能を実現する。

多くのＴＩＲＦＭ対応（＝ＴＩＲＦ顕微鏡法対応）顕微鏡は、照明及び蛍光の集光の両方のために、１つの対物レンズを用いる。このため、対物レンズは、臨界角を超える角度でサンプルを照明するのに適さなければならない。それゆえに、対物レンズの開口数ＮＡは、より薄い媒体の屈折率ｎ_２よりも大きくなければならず、つまり、

である。
光が対物レンズの後焦点面を通過する位置は、

により、光が対物レンズの焦点面を通過する角度を決定し、ここで、ｒは対物レンズの後焦点面における、光学システムの中心ビーム経路からの光ビームの通過位置の半径方向の距離を示し、ｆは対物レンズの焦点距離または焦点長さを示す。エバネッセント光線場を生成するために、焦点面における光の角度は、臨界角を超えなければならず、光束の後焦点面の中心からの距離は、それに対応して臨界半径ｒ_ｃを超えなければならない。ＴＩＲＦＭ対応顕微鏡は、それゆえに、通常、油浸で、１．４５以上の非常に高い開口数（ＮＡ）を有する対物レンズを備える倒立光学顕微鏡（ｉｎｖｅｒｓｅ Ｌｉｃｈｔｍｉｋｒｏｓｋｏｐｅ）として設計される。この高い開口数は均一な照射角度を可能にし、励起光は、対物レンズの辺縁部にて結合されて、サンプルとの界面に全反射角で均一に接触する。

光が臨界角よりも小さな角度で界面に達すること、つまり光が界面で全反射しないことを防止するために、様々な可能性がある。インコヒーレント光源、例えば、ＬＥＤまたは電球を用いることによって、光の中央部を隠す環状絞りが、対物レンズの後焦点面（ＢＦＰ）と共役な点で、ビーム経路内において用いられ得る。このような配置は、例えば、ＵＳ６，５９７，４９９Ｂ２にて周知である。しかしながら、このような絞りを用いることは、光源によって放射される光の大部分が使用されないことをもたらし、これは、顕微鏡光学系によって広がる位相空間（エタンデュ）が、光源によって広がるエタンデュとほとんど一致していないという事実によっていっそう増幅され、それにより場合によっては、そもそも、放射される光の約１％しか励起のために使用できない。

この問題を回避する別の解決策は、レーザＴＩＲＦＭとして周知のレーザ光源を用いることであり、レーザＴＩＲＦＭは、レーザ光源によって生成される光がほぼ完全にサンプルとの界面に到達するように、顕微鏡のビーム経路に結合される。この解決策は、しかしながら、より高価であり、光が非常に狭いスペクトルのみを有し、画像を乱し得る回折効果及び干渉効果がレーザ光のコヒーレンスの結果として生じ得るといった光学的な欠点を有する。

この従来技術に基づいて、本発明の目的は、測定の高い自由度を可能にするＴＩＲＦＭ対応顕微鏡、及びＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の動作方法を提供することである。
本目的は、インコヒーレント励起光を生成し、第１投影レンズシステム、第１空間フィルタ装置、第２投影レンズシステム、及び対物レンズを順に有する第１光学経路に放射するように設計される第１光源を備えるＴＩＲＦＭ対応顕微鏡であって、第１投影レンズシステムが、第１空間フィルタ装置に励起光を投影するように設計され、第１空間フィルタ装置が、励起光に２次元パターンにて空間的にフィルタをかけるように設計され、第１空間フィルタ装置が、対物レンズの後焦点面（ＢＦＰ）と共役な面（ｃＢＦＰ）に第１の構成で位置し、対物レンズが、励起光をサンプルに向け、サンプルからの蛍光を受光するように設計、配置される対物レンズ（Ｏｂｊｅｋｔｉｖｌｉｎｓｅ）を備え、対物レンズの開口数ＮＡ_Ｏｂｊ及びサンプルの屈折率ｎ_ｓｐｅｃに対して、ＮＡ_Ｏｂｊ＞ｎ_ｓｐｅｃが適用され、第１制御ユニットを備え、第１制御ユニットが、様々な２次元パターンを選択または生成するために第１空間フィルタ装置を動作させ、サンプルのＴＩＲＦ照明が生成されるように、２次元、特に環状パターンの位置、形状、及び／または寸法を選択または調節するように設計される、ＴＩＲＦＭ対応顕微鏡によって実現される。

本発明によるＴＩＲＦＭ対応顕微鏡によって、対物レンズが集光及び照明のための両方に用いられる変形がさらに開発される。固定された環状絞りの代わりに、可変の空間フィルタ装置が用いられる。本発明によるサンプルのＴＩＲＦ照明は、パターンの中央部及び環の外側の光が遮断される一方で、光学ビーム経路内の光のみが、生成されるかまたは選択される環状絞り内に残る、環状２次元パターンを選択または生成することによって、本発明により用いられるインコヒーレント光にて実現される。環状パターンの寸法を調節することにより、特に、サンプルへのエバネッセント場のしみ出し深さを制御することが可能である。

ＴＩＲＦ照明を可能にする２次元パターンは、必ずしも環状である必要はない。中央部が臨界半径まで排除されれば十分である。臨界半径を超えるこの中央部の外側は、どのようなパターンでもＴＩＲＦ照明を引き起こすであろう。しかしながら、環状パターンは、照明の比較的高い光度及び均一性を確実にする。

実施形態において、制御ユニットは、ＴＩＲＦ照明と非ＴＩＲＦ照明とを切り替えるために、２次元パターンとして環状パターン及び円形パターンをもたらすよう、第１空間フィルタ装置を動作させるように設計される。励起光が臨界半径内も透過する円形パターンによって、ＴＩＲＦＭ対応顕微鏡は、いわゆる落射照明を用いる落射蛍光顕微鏡としても動作することができ、落射照明はＴＩＲＦ照明と同様に対物レンズを通過する。しかしながら、落射励起光（Ｅｐｉ－Ａｎｒｅｇｕｎｇｓｌｉｃｈｔ）は全反射せず、代わりに、界面を通って完全にサンプルに透過する。後者は、それゆえにその全体の厚さを照明され、励起して蛍光を発する。界面に近い層を選択することによって、空間分解能を犠牲にして、より大きな光収率がそれゆえに実現される。

好ましくは、環状パターンの外径は、対物レンズの後焦点面の延在部の最大値より小さいか、または等しく、環状パターンの内径は、対物レンズの焦点面における全反射のための臨界角と対応する、後焦点面の臨界半径より大きいか、または等しい。環状パターンの外径の制限は、通過可能な光の一部が顕微鏡のビーム経路内にとどまることを確実にし、それゆえに、光散乱によるいかなる乱れも生じず、一方、環状パターンの内径の制限は、臨界半径を下回らないことを確実にする。内径の調節により、サンプルへのしみ出し深さもまた制御される。

ＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の実施形態において、第２空間フィルタ装置は、第１光学経路において、対物レンズの焦点面（ＦＰ）と共役な面（ｃＦＰ）に配置され、励起光に複数の異なる２次元パターンにて空間的にフィルタをかけるように設計され、第１制御ユニットまたは第２制御ユニットは、一連の２次元パターンを選択または生成するよう第２空間フィルタ装置を動作させるように設計される。第２空間フィルタ装置は、第２空間フィルタ装置の２次元パターンが、焦点、つまり、サンプルまたは試料内の位置に、対応する照明光の空間分布をもたらすように、対物レンズの焦点面と共役な面（ｃＦＰ）に配置される。第１及び第２フィルタ装置を組み合わせることにより、構造化照明を用いるＴＩＲＦ顕微鏡法（全反射蛍光構造化照明顕微鏡法、ＴＩＲＦ－ＳＩＭ）が可能となる。この場合において、第１空間フィルタ装置は、ＴＩＲＦ照明を生成するために、対物レンズの後焦点面と共役な面において、励起光に環状パターンをインプリントし、一方、同時に第２空間フィルタ装置は、対物レンズの焦点面と共役な面において、励起光に一連の構造化パターンをインプリントし、このようにして、励起光によって照明されるサンプル内の位置を特定する。構造化照明を用いるＴＩＲＦ顕微鏡（ＴＩＲＦ－ＳＩＭ）は、ＴＩＲＦＭ対応顕微鏡でもある。

適切な可変の空間フィルタ装置の実施形態において、第１空間フィルタ装置は、複数の円形及び環状絞りを有する絞り変更装置、特に回転可能絞りリングとして、またはプログラム可能な空間光変調器、特に透過型空間光変調器または反射型空間光変調器として設計され、特に第２空間フィルタ装置は、プログラム可能な透過型または反射型空間光変調器として設計される。プログラム可能な空間光変調器（ＳＬＭ）は、一実施形態において、その個別の画素が、光透過状態と光不透過状態との間で切り替えられ得るように透過中に動作するＬＣＤマトリクスであり（透過型ＳＬＭ）、別の実施形態においては、回転可能なマイクロミラー要素のアレイまたはマトリクスを有するデジタルミラーデバイス（ＤＭＤまたは反射型ＳＬＭ）である。透過型ＳＬＭ及び反射型ＳＬＭは何れも、それらが、特定の２次元パターン、特に、例えば調節可能な内径及び調節可能な外径を有するリングを生成するように、目標を絞った方法で動作され得る。空間光変調器が自由にプログラム可能であるという事実は、ＴＩＲＦＭ対応顕微鏡が、複数の設定にて柔軟に構築され、動作することを可能にする。

ＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の実施形態は、第１投影レンズシステムが完全に、または部分的に、第２投影レンズシステムが完全に、または部分的に、且つ／または第１空間フィルタ装置が、第１空間フィルタ装置が第１の構成から、第１空間フィルタ装置が対物レンズの焦点面と共役な面に配置される第２の構成に可逆的にされ得るように、第１光学経路に沿って移動可能に配置される、ことによりＴＩＲＦ照明と位置選択的落射照明との切り替えの可能性を提供する。それにより、対物レンズの後焦点面と共役な面におけるＴＩＲＦのフィルタリングが排除されて、その結果、落射照明が自動的に設定され、第２の構成における第１空間フィルタ装置によって空間的にフィルタにかけられる。

実施形態において、第１空間フィルタ装置が対物レンズの焦点面に対して共役となるように設計、配置される第３投影レンズシステムを備え、切替光学ユニットが、第１空間フィルタ装置と対物レンズとの間に配置され、切替光学ユニットが、第２投影レンズシステムと第３投影レンズシステムとの間で光学経路を切り替えるように設計される場合に、ＴＩＲＦ照明と、位置選択的落射照明との切り替えのための代替えの、または、追加的な可能性が与えられる。

２つの異なる光源、例えば異なる色のスペクトルを用いる照明の可能性は、インコヒーレント励起光を生成し、放射するように設計される第２インコヒーレント光源を備え、第１光源及び第２光源が、それぞれ、デジタルミラーデバイスとして設計される第１空間フィルタ装置に向けて方向付けられ、デジタルミラーデバイスの回転可能なマイクロミラー要素が、第１回転位置において第１光源からの励起光を第１光学経路に向け、第２回転位置において第２光源からの励起光を第１光学経路に向ける場合に、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）として設計される第１空間フィルタ装置を用いる実施形態にて与えられる。このようにして、ＤＭＤを動作させることによって、光源が選択され、光源がそれらの間で切り替えられ得る。さらなる発展において、ビーム吸収体が２つの光源のそれぞれに与えられ、このビーム吸収体は、顕微鏡の光学ビーム経路に伝送されない、光源からの光の一部を受光し吸収する。

実施形態において、第１光源及び／または第２光源は、１つのＬＥＤまたは複数のＬＥＤ、電球と導光体との組み合わせ、またはレーザ光源とダイナミックディフューザー（ｄｙｎａｍｉｓｃｈｅｎ Ｄｉｆｆｕｓｏｒ）との組み合わせを備える。ダイナミックディフューザーは、例えば超音波領域の高周波運動で動作するディフューザーであり、それゆえに、レーザ光のコヒーレンスを乱す。その結果、特に、そうでなければＤＭＤのマイクロミラー要素上にかなりの程度で発生し得る干渉及び回折効果は、もはや発生しない。

本発明の目的は、上述の本発明によるＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の動作方法によっても実現され、本方法において、第１空間フィルタ装置上の２次元パターンの検索パターンシーケンスが、対物レンズの後焦点面の中心を求めるために用いられ、２次元パターンのそれぞれが、第１光学経路に励起光を伝送するための１つの小さなピクセルクラスタを有し、それが検索パターンシーケンスの間に、特に直線状の検索経路上を移動し、対物レンズから戻って来る蛍光の発光が最大値である位置が記録され、求められた複数の発光の最大値が位置する円の中心が、対物レンズの後焦点面の中心として特定される。

光度の最大値は、全反射のための臨界角に対応する円上に全て位置するので、本方法によりセンタリングを実施することが可能である。この中心上の環状絞りパターンのセンタリングは、顕微鏡の光学システムの空間配置に関連して、励起光の効果的なセンタリングを既に確実にしている。

複数の検索経路は、好ましくは、様々な角度で、第１空間フィルタ装置の端部から中心に向かう。光学システムのセンタリングが最適なセンタリングに近い場合、これらの放射状の検索経路は、臨界半径の円と基本的に垂直に交差し、それにより、求められる光度の最大値は光度曲線において特に鋭く示される。浅い角度で当たるような検索経路の軌道は、最大値の広がりを引き起こし、センタリングの精度が下がる。

全ての場合においてセンタリングを最適化するために、本方法の実施形態において、対物レンズの後焦点面の中心の最初の大まかな特定の後、精細さを増す検索パターンシーケンスが行われ、且つ／または検索パターンの制御が行われ、求められた円は、最大の鋭さで光度の最大値を特定し、それゆえに、中心の高精度な特定を行うために、様々な方向から半径方向にスキャンされる。

様々な実施形態において、本発明によるＴＩＲＦＭ対応顕微鏡は、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードで動作するか、または、複数の様々な光源間を切り替え可能な方法で動作して、ＴＩＲＦ照明と非ＴＩＲＦ照明とが切り替えられ得る。それはまた、これらの特徴を組み合わせるように、そして、ｃＢＦＰ面にある第１の構成から、ｃＦＰ面にある第２の構成への第１空間フィルタ装置の移行と同時に起こる光源の切り替えによって、複数の光源のうちの１つをＴＩＲＦ及び別の落射照明で動作させるように配置され得る。このようにして、例えば、ブロードバンド落射照明を用いる概要モードが、狭帯域のＴＩＲＦ照明を用いる詳細モードと切り替え可能に組み合わされ得る。

本発明のさらなる特徴は、特許請求の範囲及び添付の図面と共に、本発明による実施形態の説明から明らかになるであろう。本発明による実施形態は、個々の特徴または、いくつかの特徴の組み合わせにて実現し得る。

本発明の範囲において、「特に」または「好ましくは」によって指定される特徴は、任意の特徴として理解される。
本発明は、本発明の概念を制限することなく、例示的な実施形態に基づいて図面を参照して以下に説明され、これにより、文面にてより詳細に説明されない本発明による全ての詳細に関して、図面を明示的に参照するものとする。

ＴＩＲＦ照明の場合の光学系の原理の概略図を示す。 第１実施形態におけるＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の光学部品の概略図を示す。 ＴＩＲＦ－ＳＩＭ対応顕微鏡の光学部品を有する第２実施形態の概略図を示す。 ＴＩＲＦＭ対応顕微鏡を用いたセンタリング原理の概略図を示す。 第３実施形態におけるＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の光学部品の概略図を示す。 第４実施形態におけるＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の光学部品の概略図を示す。 検索経路を用いる発光測定の例を示す。 図７の検索経路に対応する発光曲線を示す。

図面において、同一または類似の要素、及び／または部品にはそれぞれの場合において同一の参照番号が与えられ、このため、再度の説明はそれぞれの場合において省略する。
図１は、ＴＩＲＦ照明の場合の光学系の原理の概略図を示す。ＴＩＲＦ顕微鏡法を可能にするために１つ以上の光学レンズを備えることができ、大きな開口数を有する顕微鏡の対物レンズ１０１が、ブラックボックスとして示される。光源（図示なし）からの励起光の伝播方向は、下から上へ向かう。対物レンズ１０１は、焦点面ＦＰ及び後焦点面ＢＦＰを有し、それらは、後方（図１の下）から対物レンズ１０１に当たる平行光ビーム束が焦点面ＦＰに集束し、一方、外側（図１の上）から対物レンズ１０１に当たる他方向の平行光ビーム束が後焦点面ＢＦＰに集束するように定義される。

光源（図示なし）から到来する２つのビーム束１０２，１０４が図１に示され、それらは、後焦点面ＢＦＰの２つの異なる点を通過する。ビーム束１０２はＢＦＰの中心を通過し、一方、ビーム束１０４は辺縁部の点を通過する。両方のビーム束１０２，１０４は、２つの点を異なる角度で通過する、つまりそれらがコリメートされていないビームを含む。対物レンズ１０１の光学特性は、中心ビーム束１０２の光ビームが、対物レンズ１０１と垂直に出射するビーム束１０３を形成するようコリメートされるようにされる。辺縁部ビーム束１０３もまたコリメートされるが、ビーム束のＢＦＰの中心からの距離または半径による角度Θ（ｒ）で、ビーム束１０５として出射する。この依存関係は、全反射が起こるべきＴＩＲＦ照明の場合に、ＢＦＰにおいて、ＢＦＰの中心から臨界半径を超える距離を有するこれらの光ビームのみを通過させる理由を説明する。

実際のＴＩＲＦＭ光学ユニットにおいて、この原理は、ＴＩＲＦ照明のための絞りが対物レンズ１０１の後焦点面ＢＦＰに直接配置されず、ＢＦＰと共役な面ｃＢＦＰに配置されるように、後に修正されている。ｃＢＰＦは、ビーム経路内のそれに続く光学要素によって、対物レンズ１０１のＢＦＰに写像されるので、適切な寸法の環状絞りのｃＢＦＰへの配置は、ＢＦＰにおける直接的なフィルタリングと同じ効果を有する。

図２は、第１実施形態におけるＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の光学システムの概略図を示す。インコヒーレント光源２０１は励起光を生成し、これは図１に示すように、前焦点面ＦＰ及び後焦点面ＢＦＰを有する対物レンズ２０６へ、ビーム経路を介して伝送される。ビーム経路は、第１投影レンズシステム２０２及び第２投影レンズシステム２０４、励起光が光源２０１から少なくとも部分的に対物レンズ２０６に向けられる、例えば、ダイクロイックミラーとして構成される偏向ユニット２０５も有する。第１投影レンズシステム２０２と第２投影レンズシステム２０４との間で対物レンズ２０６の後焦点面ＢＦＰと共役な面ｃＢＦＰに、第１光学フィルタ装置２０３が、励起光を空間的にフィルタにかけるように配置され、空間的なフィルタリングのために様々な２次元パターンを提供できるように設計される。起動は、制御ユニット（図示なし）によって行われる。第１光学フィルタ装置２０３は、本実施形態において、透過型ＳＬＭとして、つまりプログラム可能なＬＣＤマトリクスを用いて設計されてもよく、そのマトリクス点は、透過状態と非透過状態との間で切り替えられ得る。透過型ＳＬＭは、例えば環状絞りを生成するために起動されてもよく、環状絞りの内径は、対物レンズ２０６から始まる全反射のための臨界半径と等しいかまたは大きい。このような設定が、ＴＩＲＦ照明を生成する。

対物レンズ２０６の焦点面ＦＰに配置されるサンプルにて励起される蛍光は、対物レンズ２０６を通ってＴＩＲＦＭ対応顕微鏡に戻る。偏向ユニット２０５及び結像レンズ２０７を通過した後、検出器２０８に入射し、検出器２０８は蛍光を検出しそれを分析可能な電気信号に変換する。偏向ユニットは、その透過特性が励起光の波長と蛍光の波長との間に境界を有する、ビームスプリッタであっても、またダイクロイックミラーであってもよく、それにより、励起光はほぼ完全に偏向され、一方、蛍光はほぼ完全に検出器２０８へ透過される。

図３は、第１の例示的な実施形態の変形を示すＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の第２の例示的な実施形態を示す。インコヒーレント励起光は光源３０１によって生成され、第１投影レンズシステム３０２、第２投影レンズシステム３０４，３０６、及び偏向ユニット３０７を経由して対物レンズ３０８の焦点面ＦＰに向けられ、一方、蛍光は対物レンズ３０８、偏向ユニット３０７、及び結像レンズ３０９を通過し、検出器３１０に入射する。しかしながら、第１の例示的な実施形態と対照的に、第２投影レンズシステム３０４，３０６は２つに分離され、対物レンズ３０８の焦点面ＦＰと共役な面ｃＦＰが、第２投影レンズシステム３０４，３０６の第１部分３０４と、第２部分３０６との間に存在する。このｃＦＰに、これもまたプログラム可能な第２空間フィルタ装置３０５が配置される。

第１空間フィルタ装置３０３がｃＢＦＰに配置されるので、環状絞りと、それゆえにＴＩＲＦ照明とがそこで生成され得る。ｃＦＰにおける第２空間フィルタ装置は、焦点面ＦＰのどの領域が照明されるかを選択する。このようにして、構造化照明を用いるＴＩＲＦ顕微鏡法（ＴＩＲＦ－ＳＩＭ）が構築される。

ＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の動作の例示的な適用が、概略的に図４に示される。図４の左側に、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）の表面が空間フィルタ装置４０１の例として示され、これは、対物レンズの後焦点面ＢＦＰと共役な面ｃＢＦＰに配置される。ＤＭＤの代わりに、透過型ＳＬＭもまた用いられ得る。この面の上に重なるのは、対物レンズの前方のサンプルの位置での全反射のための臨界角に対応し、ｃＢＦＰの中心を中心とする円である。ピクセルクラスタ４０２もまた示され、これらは、互いに１２０°の角度をなしてデジタルミラーデバイスの端部から中心に向かう３つの検索経路上に配置され、部分的に臨界半径の外側に配置され、部分的に臨界半径の内側に配置される。ピクセルクラスタ４０２は、図４の右側に示される強度曲線にも見られ得る異なるテクスチャにて印が付けられる。臨界半径ｒの内側の励起された蛍光の強度または光度Ｉは、わずかにしか変化しない量であると、そこで認識されるであろう。臨界半径、または、臨界角のそれぞれに近づくにつれて、光度は急激に上昇し、その後臨界半径の外側で急激に低下して最終的に消滅する。

臨界角の中心の位置は、それゆえに、様々な検索経路に関して蛍光の光度の最大値を測定し、最大の光度でピクセルクラスタを通る円の中心点を計算することによって、特定され得る。

図３における第２の例示的な実施形態による非構造化照明は、このセンタリングのために必要であり、むしろ、構造化は、対物レンズの後焦点面ＢＦＰに共役な面にて行われる。それぞれのピクセルクラスタは、非コリメートビーム束を通過させ、これは、対物レンズの焦点面ＦＰを通過するとき、サンプルホルダとサンプルとの間の界面を、特定の角度で特定の方向（図１参照）に通過するコリメートビーム束に対応し、通過角度に応じて全反射するか、または全反射しない。

図５において、第３実施形態におけるＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の光学部品が概略的に示される。この例示的な実施形態において、顕微鏡は２つの異なるインコヒーレント光源５０１ａ，５０１ｂを備え、これらは、異なるスペクトルを生成することができ、それぞれは、それぞれの第１投影レンズシステム５０２ａ，５０２ｂを介して、対物レンズ５０７の後焦点面ＢＦＰと共役な面ｃＢＦＰに配置されるデジタルミラーデバイスとして設計される第１空間フィルタ装置５０４に向けて方向付けられる。他の部品５０５，５０６，５０７，５０８，５０９は、第１の例示的な実施形態の部品２０４，２０５，２０６，２０７及び２０８に対応する。それらの機能に関して、第１及び第２の例示的な実施形態の説明が参照される。

第１光源５０１ａと第２光源５０１ｂとの間の切替プロセスが以下に説明される。第１空間フィルタ装置５０４のマイクロミラー要素は、第１位置と第２位置との間で回転され得る。第１光源５０１ａからの励起光が用いられるとき、ＴＩＲＦ照明を生成するために必要とされるマイクロミラー要素は、第１光源からの励起光が第２投影レンズシステムに反射される第１位置に回転される。残りのマイクロミラー要素は第２位置に回転され、第１光源５０１ａからの励起光は放射吸収体（ビームダンプ）５０３ａに伝送される。このことは、極めて高いコントラストを容易にする。第２光源５０１ｂにも、放射吸収体５０３ｂが割り当てられる。光源５０１ａ，５０１ｂ及び放射吸収体５０３ａ，５０３ｂは、１つの光源を他方に切り替えるために、さらなるビーム経路に対して対称に配置され、全てのマイクロミラー要素の回転位置は、容易に反転されなければならず、第１光源５０１ａはオフにされなければならず、第２光源５０１ｂはオンにされなければならない。

落射照明のために、両方の光源５０１ａ，５０１ｂがオンのままにされることもでき、第１空間フィルタ装置５０４の全てのマイクロ要素は、切り替えのために、第１または第２の回転位置にもたらされる。

図６は、第４実施形態におけるＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の光学部品を概略的に示す。光源６０１、第１投影レンズシステム６０２、２つの部分からなる第２投影レンズシステム６０４，６０６、偏向ユニット６０７、対物レンズ６０８、結像レンズ６０９、検出器６１０、及び、第２投影レンズシステムの２つの部分６０４，６０６の間で対物レンズ６０８の焦点面ＦＰと共役な面ｃＦＰにおける第２空間フィルタ装置６０５は、図３の第２実施形態の配置及び部品に対応する。プログラム可能な透過型ＳＬＭの代わりに、第４実施形態においては、例えば、絞りリングの形の絞り変更装置６０３が設けられ、これは、複数の異なる絞り形状及び寸法をもたらす。これらは、落射照明とＴＩＲＦ照明との両方を、様々な臨界角の値に対して設定し得るような様々な寸法の環状絞り及び円形絞りを含み得る。

図７及び８は、本発明による方法によるセンタリングの例を示す。これは、第１、第２または第３の実施形態による配置、つまり、ｃＢＦＰ面の位置にプログラム可能な空間フィルタ装置を必要とする。図７において、反射型ＳＬＭまたはＤＭＤの場合における空間フィルタ装置の表面のｘ－ｙ位置が示される。それぞれが互いに６０°空けられる６つの検索経路が示され、それぞれは、端部からＤＭＤの中心ｘ＝０ｍｍ及びｙ＝０ｍｍに向かって直線状に延びる。これらの検索経路のそれぞれに沿って、小さな円形の領域が励起光を中継するために空けられ、励起光はその表面の残りの部分で遮断される。小さな空けられた領域は６つの検索経路に沿って通り（ｇｅｆｕｈｒｔ）、戻ってくる蛍光の光度が測定される。測定される光度は輝度として描画され、ここで、黒は消える信号、白は強い信号を意味する。ＤＭＤの中心から半径方向の個別の検索経路に沿った対応する軌道は、図８において、中心からの距離に対して描画される。

光度の最大値がそれぞれの検索経路上に見られるが、光度の最大値を有するそれぞれの位置の中心からの距離は、検索経路の角度によることが分かる。最大値は、後焦点面の臨界半径及び中心を描写する円上に位置する。これらの値は、センタリングのため、且つＴＩＲＦ照明のための適切な環状パターンの内径を特定するために用いられ得る。２回目の検索の実行は、検索経路がこのような方法で求められる円の中心に向かって延びるように実施され得る。このことは、最大値が図８におけるよりも良好に規定され、図８において１０５°と表示される曲線の最大値とそれぞれ同様に鋭いといった利点を有する。このことは、最適な分解能及びセンタリングを実現する。

図面のみから得られる特徴、及び他の特徴と組み合わせて開示される個々の特徴を含む全ての言及された特徴は、単独で、また組み合わせで、本発明にとって必須であると考えられる。本発明による実施形態は、個々の特徴またはいくつかの特徴の組み合わせによって実現され得る。

１０１…対物レンズ、１０２…ビーム束、１０３…コリメートビーム束、１０４…ビーム束、１０５…コリメートビーム束、２０１…光源、２０２…第１投影レンズシステム、２０３…第１空間フィルタ装置、２０４…第２投影レンズシステム、２０５…偏向ユニット、２０６…対物レンズ、２０７…結像レンズ、２０８…検出器、３０１…光源、３０２…第１投影レンズシステム、３０３…第１空間フィルタ装置、３０４…第２投影レンズシステムの前部分、３０５…第２空間フィルタ装置、３０６…第２投影レンズシステムの後部分、３０７…偏向ユニット、３０８…対物レンズ、３０９…結像レンズ、３１０…検出器、４０１…第１空間フィルタ装置、４０２…検索経路上のピクセルクラスタ、５０１ａ…第１光源、５０１ｂ…第２光源、５０２ａ…第１投影レンズシステム、５０２ｂ…第３投影レンズシステム、５０３ａ…第１ビーム吸収体、５０３ｂ…第２ビーム吸収体、５０４…第１空間フィルタ装置、５０５…第２投影レンズシステム、５０６…偏向ユニット、５０７…対物レンズ、５０８…結像レンズ、５０９…検出器、６０１…光源、６０２…第１投影レンズシステム、６０３…絞り変更装置、６０４…第２投影レンズシステムの前部分、６０５…第２空間フィルタ装置、６０６…第２投影レンズシステムの後部分、６０７…偏向ユニット、６０８…対物レンズ、６０９…結像レンズ、６１０…検出器、ＢＦＰ…後焦点面、ＦＰ…焦点面、ｃＢＦＰ…後焦点面と共役な面、ｃＦＰ…焦点面と共役な面、ｒ…半径、ｌ…光度

Claims (14)

1. ＴＩＲＦＭ対応顕微鏡であって、
   第１投影レンズシステム（２０２，３０２，５０２ａ，６０２）と、
   第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４，６０３）と、
   第２投影レンズシステム（２０４，３０４，３０６，５０５，６０４，６０６）と、
   対物レンズ（２０６，３０８，５０７，６０８）と、
   インコヒーレント励起光を生成する第１光源（２０１，３０１，５０１ａ，６０１）であって、前記第１投影レンズシステム（２０２，３０２，５０２ａ，６０２）、前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４，６０３）、前記第２投影レンズシステム（２０４，３０４，３０６，５０５，６０４，６０６）、及び前記対物レンズ（２０６，３０８，５０７，６０８）を順に有する第１光学経路に放射するように設計される第１光源（２０１，３０１，５０１ａ，６０１）と、を備え、
   前記第１投影レンズシステム（２０２，３０２，５０２ａ，６０２）は、前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４，６０３）に前記励起光を投影するように設計され、前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４，６０３）は、前記励起光に２次元パターンにて空間的にフィルタをかけるように設計され、
   前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４，６０３）は、前記対物レンズ（２０６，３０８，５０７，６０８）の後焦点面（ＢＦＰ）と共役な面（ｃＢＦＰ）に位置し、
   前記対物レンズ（２０６，３０８，５０７，６０８）は、前記励起光をサンプルに向け、前記サンプルからの蛍光を受光するように設計、配置される対物レンズ（Ｏｂｊｅｋｔｉｖｌｉｎｓｅ）を備え、前記対物レンズ（２０６，３０８，５０７，６０８）の開口数ＮＡＯｂｊ及び前記サンプルの屈折率ｎｓｐｅｃに対して、ＮＡＯｂｊ＞ｎｓｐｅｃが適用され、
   第１制御ユニットを備え、前記第１制御ユニットは、様々な前記２次元パターンを選択または生成するために前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４，６０３）を動作させ、前記サンプルのＴＩＲＦ照明が生成されるように、前記２次元パターンの位置、形状、及び／または寸法を選択または調節するように設計される、ＴＩＲＦＭ対応顕微鏡。
2. 前記制御ユニットは、ＴＩＲＦ照明と非ＴＩＲＦ照明とを切り替えるために、前記２次元パターンとして環状パターン及び円形パターンをもたらすよう、前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４，６０３）を動作させるように設計される、ことを特徴とする請求項１に記載のＴＩＲＦＭ対応顕微鏡。
3. 前記環状パターンの外径は、前記対物レンズ（２０６，３０８，５０７，６０８）の後焦点面の延在部の最大値より小さいか、または等しく、前記環状パターンの内径は、前記対物レンズ（２０６，３０８，５０７，６０８）の焦点面（ＦＰ）における全反射のための臨界角と対応する、後焦点面（ＢＦＰ）の臨界半径より大きいか、または等しい、ことを特徴とする請求項２に記載のＴＩＲＦＭ対応顕微鏡。
4. 第２空間フィルタ装置（３０５，６０５）は、前記第１光学経路において、前記対物レンズ（３０８，６０８）の焦点面（ＦＰ）と共役な面（ｃＦＰ）に配置され、前記励起光に複数の異なる２次元パターンにて空間的にフィルタをかけるように設計され、前記第１制御ユニットまたは第２制御ユニットは、一連の前記２次元パターンを選択または生成するよう前記第２空間フィルタ装置（３０５，６０５）を動作させるように設計される、ことを特徴とする請求項１～３の何れか１項に記載のＴＩＲＦＭ対応顕微鏡。
5. 前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４，６０３）は、複数の円形及び環状絞りを有する絞り変更装置として、またはプログラム可能な空間光変調器（２０３，３０３，５０４）として設計され、前記第２空間フィルタ装置（３０５，６０５）は、プログラム可能な透過型または反射型空間光変調器として設計される、ことを特徴とする請求項４に記載のＴＩＲＦＭ対応顕微鏡。
6. 前記第１投影レンズシステム（２０２，３０２，５０２ａ，６０２）は完全に、または部分的に、前記第２投影レンズシステム（２０４，３０４，３０６，５０５，６０４，６０６）は完全に、または部分的に、且つ／または前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４，６０３）は、前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４，６０３）が前記第１の構成から、前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４，６０３）が前記対物レンズ（２０６，３０８，５０７，６０８）の焦点面（ＦＰ）と共役な面に配置される第２の構成にされ得るように、前記第１光学経路に沿って移動可能に配置される、ことを特徴とする請求項１～５の何れか１項に記載のＴＩＲＦＭ対応顕微鏡。
7. 前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４，６０３）が前記対物レンズ（２０６，３０８，５０７，６０８）の焦点面（ＦＰ）に対して共役となるように設計、配置される第３投影レンズシステムを備え、切替光学ユニットは、前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４，６０３）と前記対物レンズ（２０６，３０８，５０７，６０８）との間に配置され、前記切替光学ユニットは、前記第２投影レンズシステム（２０４，３０４，３０６，５０５，６０４，６０６）と前記第３投影レンズシステムとの間で前記光学経路を切り替えるように設計される、ことを特徴とする請求項１～５の何れか１項に記載のＴＩＲＦＭ対応顕微鏡。
8. インコヒーレント励起光を生成し、放射するように設計される第２インコヒーレント光源（５０１ｂ）を備え、前記第１光源（５０１ａ）及び前記第２光源（５０１ｂ）は、それぞれ、デジタルミラーデバイスとして設計される前記第１空間フィルタ装置（５０４）に向けて方向付けられ、前記デジタルミラーデバイス（５０４）の回転可能なマイクロミラー要素は、第１回転位置において前記第１光源（５０１ａ）からの励起光を前記第１光学経路に向け、第２回転位置において前記第２光源（５０１ｂ）からの励起光を前記第１光学経路に向ける、ことを特徴とする請求項１～７の何れか１項に記載のＴＩＲＦＭ対応顕微鏡。
9. 前記第１光源（２０１，３０１，５０１ａ，６０１）及び／または前記第２光源（５０１ｂ）は、１つのＬＥＤまたは複数のＬＥＤ、電球と導光体との組み合わせ、またはレーザ光源とダイナミックディフューザー（ｄｙｎａｍｉｓｃｈｅｎ Ｄｉｆｆｕｓｏｒ）との組み合わせを備える、ことを特徴とする請求項８に記載のＴＩＲＦＭ対応顕微鏡。
10. 前記第１制御ユニットは、前記２次元パターンとして環状パターンの位置、形状、及び／または寸法を選択または調節するように設計される、請求項１～９の何れか１項に記載のＴＩＲＦＭ対応顕微鏡。
11. 前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４，６０３）は、複数の円形及び環状絞りを有する回転可能絞りリング（６０３）として、またはプログラム可能な透過型空間光変調器（２０３，３０３）あるいは反射型空間光変調器（５０４）として設計される、請求項５に記載のＴＩＲＦＭ対応顕微鏡。
12. 請求項１～１１の何れか１項に記載のＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の動作方法であって、前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４）上の２次元パターンの検索パターンシーケンスは、前記対物レンズ（２０６，３０８，５０７）の前記後焦点面（ＢＦＰ）の中心を求めるために用いられ、前記２次元パターンのそれぞれは、前記第１光学経路上に励起光を伝送するための１つの小さなピクセルクラスタを有し、それは前記検索パターンシーケンスの間に、直線状の検索経路上を移動し、前記対物レンズ（２０６，３０８，５０７）から戻って来る蛍光の発光が最大値である位置は記録され、求められた複数の発光の最大値が位置する円の中心は、前記対物レンズ（２０６，３０８，５０７）の前記後焦点面（ＢＦＰ）の中心として特定される、ことを特徴とするＴＩＲＦＭ対応顕微鏡の動作方法。
13. 複数の前記検索経路は、様々な角度で、前記第１空間フィルタ装置（２０３，３０３，５０４）の端部から中心に向かう、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 前記対物レンズ（２０６，３０８，５０７，６０８）の前記後焦点面（ＢＦＰ）の中心の最初の大まかな特定の後、精細さを増す検索パターンシーケンスが行われ、且つ／または検索パターンの制御が行われ、求められた前記円は、最大の鋭さで光度の最大値を特定し、それゆえに、中心の高精度な特定を行うために、様々な方向から半径方向にスキャンされる、ことを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。

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